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WO2008019729A1 - Mikroskop mit interferometeranordnung zur durchlichtuntersuchung transparenter objekte mittels interferenzkontrast und polarisationskontrast - Google Patents

Mikroskop mit interferometeranordnung zur durchlichtuntersuchung transparenter objekte mittels interferenzkontrast und polarisationskontrast Download PDF

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WO2008019729A1
WO2008019729A1 PCT/EP2007/005720 EP2007005720W WO2008019729A1 WO 2008019729 A1 WO2008019729 A1 WO 2008019729A1 EP 2007005720 W EP2007005720 W EP 2007005720W WO 2008019729 A1 WO2008019729 A1 WO 2008019729A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
interferometer
polarization
microscope
partial beams
iii
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2007/005720
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English (en)
French (fr)
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WO2008019729A8 (de
Inventor
Daniel Martin Mahlmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Original Assignee
Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH filed Critical Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Publication of WO2008019729A1 publication Critical patent/WO2008019729A1/de
Publication of WO2008019729A8 publication Critical patent/WO2008019729A8/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G01B2290/00—Aspects of interferometers not specifically covered by any group under G01B9/02
    • G01B2290/70—Using polarization in the interferometer

Definitions

  • the invention relates to a microscope for the transmitted light examination of objects with a beam path between a lighting device and a device for viewing / capturing an object image, in particular a camera.
  • the invention further relates to a method for transmitted light microscopy of objects, in particular with an aforementioned device.
  • Microscopes for the transmittance of objects are well known in the art.
  • the mode of action of a microscope is essentially based on the fact that the light of a lighting device is directed to an object to be observed, usually to increase the light intensity of the incident light is focused by means of a so-called condenser, usually a lens or lens assembly in the direction of the object.
  • a condenser usually a lens or lens assembly in the direction of the object.
  • a lens which usually also consists of a lens or lens arrangement, an image of the object is projected from the plane of the object, which represents a real image and can be viewed either directly or after a further magnification.
  • an additional eyepiece is available for further enlargement, by means of which the real image is further enlarged in order subsequently to be detected by the eye of the observer or by means of a camera.
  • Essential for a good image quality is that an object produces sufficient contrast in this examination.
  • the ratio of the intensities of the light which transilluminates the object and the ambient light is understood as a contrast.
  • an amplitude change of the light due to the transmission through the object which is reduced by the object is evaluated in microscopes.
  • just small transparent structures such as those that occur in living cells, can be observed and examined microscopically only with great difficulty, since such living cells often only produce an insufficient amplitude contrast due to their high transparency.
  • the object of the invention is to provide a microscope for transmitted light examinations as well as a method for microscopy, by means of which the aforementioned disadvantages are overcome and which improves the limits in the observation of highly transparent objects, in particular of living cells. It is a further object of the invention to obtain maximum information from an examined object by means of as little effort as possible, to examine living cells directly, without having an influence on the vital processes of the cells and, in particular, also allowing long-term investigations.
  • the object is achieved by a microscope for transmitted light examination, which has a beam path between a lighting device and a device for viewing / capturing an object image, in particular a camera, wherein in the beam path an interferometer is arranged, which means for changing the polarization and independent means for varying the relative phase in at least one of the partial beams of the interferometer.
  • the object is further achieved by a method for transmitted-light microscopy of objects, in which the beam path between an illumination device and a device for viewing / capturing an object image by an interferometer and at least one image of an object, in particular a series of images, by means of a camera is received, in particular in dependence on a position of the polarization and / or the phase of the light in at least one of the partial beams of the interferometer.
  • An interferometer is understood to mean a device which splits a light beam originating from a lighting device, optionally after a previous spatial filtering, into two partial beams which, after passing through a predetermined path in two independent arms of the interferometer and optionally after influencing phase and polarization is brought together in a device for beam merging into a light beam, in which due to the superposition interference effects and polarization effects can be made visible, resulting in a different influence of the light beams in the two partial beam paths.
  • influences can be made in particular by changes in the polarization and the relative phase position.
  • the structure of a so-called Mach-Zehnder interferometer can be used.
  • the invention is not limited to the use of such an interferometer arrangement and basically any interferometer arrangement can be used which, after a split of a light beam into two partial beams and the possibility of independent manipulation of phase and polarization, bring the partial beams back together into a bundle.
  • An essential core idea of the invention is that by means of a microscope or method according to the invention, in addition to the evaluation of amplitude contrast images, it is also possible to record images of objects that are dependent on the one hand the polarization of the set light, which serves to illuminate the object and also from the phase. It is essential for the invention that both the polarization and the phase can be changed independently of each other by means of the same device, without having to influence the sample to be examined or the object to be examined in the meantime. Thus, it is possible to evaluate the interference contrast as well as the polarization contrast in addition to the aforementioned amplitude contrast and in particular to distinguish these two contrast types in the images.
  • phase-shifting effects can arise, for example, due to different optical densities or different thicknesses of an examined object, wherein For example, changes in polarization may arise due to birefringent effects of cell structures.
  • Such optically active effects of objects can not be evaluated by means of conventional amplitude contrast microscopy, however, by means of the microscope according to the invention or a method for carrying out microscopic examinations, since in this case by means of one and the same interferometer both the polarization and the relative phase in the partial beams in the interferometer independently can be changed from one another, so that due to the independent changeability conclusions can be drawn on whether a contrast occurring in an observed object due to a polarization rotation or a phase shift.
  • both the microscope and the method according to the invention make do without any further influence on the sample to be examined or the object to be observed, so that uninfluenced examinations and, in particular, long-term examinations are possible without examined sample in any way and thereby possibly even falsify a test result.
  • an interferometer arrangement in a microscope according to the invention for example by means of a Mach-Zehnder interferometer, it is possible to obtain significantly higher contrasts than is possible with conventional amplitude microscopy.
  • the detected image can be adjusted by means of an interferometer structure and a corresponding adjustment such that initially by interference effects and / or polarization effects, the unadulterated by the object illuminating light in the image plane results in a dark background and only by phase or polarization-shifting effects of the observed object lighter structures appear in the image, especially where the brightness is above the strength of the effect.
  • an inverse adjustment is possible for this purpose.
  • the partial beams in the interferometer can preferably be set unpolarized or equally polarized, e.g. by selecting a suitable illumination device and / or by selecting polarizing beam splitters and / or polarization-changing elements.
  • the effective optical lengths of the two interferometer arms are to be matched, at least to an accuracy below the coherence length of the illumination device used.
  • Fine adjustments of the phase angle can be realized by at least one phase-shifting element in at least one of the interferometer arms, e.g. by means of so-called wedge compensators. Changes in the interference caused by an object can then be used to draw conclusions about phase-shifting effects of the object or object areas.
  • the light after the interferometer by appropriate adjustment of the interferometer, i. is adjusted by influencing the polarization and the relative phase of the light in the two partial beam paths such that the polarization assumes a defined desired position, e.g. circular or linear. It may then be positioned in front of an observing camera or in front of the observer's eye an array that filters that light, i. completely blocked, so that without the insertion of an object into the microscope, a completely dark image is formed.
  • the analyzer arrangement which is necessary for the polarization contrast measurement can be omitted, e.g. be pushed out of the beam path when a measurement is made to interference contrast. If necessary, it can also be adjusted so that it transmits the light of the polarization used and thus does not distort a measurement.
  • a microscope according to the invention can be constructed, for example, in such a way that a microscope optics for generating an image of an object outside the interferometer is arranged according to an arrangement for beam collation. This results in the possibility, for example, to generate polarized or unpolarized light by means of a lighting device and to split the generated light beam by means of a polarizing beam splitter into two partial beams with mutually perpendicular polarization direction.
  • a relative Phase of the two beams is set to each other that the re-merged beam due to the vector addition with the set phase shift and the vertical polarizations generates circularly polarized light, for example, right or left circular light depending on the adjusted phase.
  • polarization adjustment and phase shift in the interferometer arms also any other desired polarization can be adjusted. It is important that a desired polarization is available, eg circular.
  • the phase shift can be effected by corresponding phase-shifting means in at least one of the two partial beam paths of the interferometer, for example by an arrangement with a wedge prism / wedge compensator, which is inserted more or less far into the beam path.
  • a corresponding transparent body such as a glass block of the same or a similar material to compensate for the effective change in length of the interferometer by the use of this phase-shifting element.
  • a microscope arrangement essentially means that a condenser, in particular a lens or lens arrangement, is provided for illuminating an object, as well as an objective for projecting an image of the illuminated object, optionally with the creation of an intermediate image continues to be viewed enlarged by an eyepiece.
  • the microscope optics for generating an image and within arranged the microscope optics sample or the object outside the interferometer.
  • the analyzer arrangement is adjusted in front of the eye of the observer or the detector / camera such that the chosen polarization is e.g. filtered out purely circular light and thus leads to a completely dark image
  • the chosen polarization is e.g. filtered out purely circular light and thus leads to a completely dark image
  • the object considered either phase-shifting or polarization-rotating effect, so that it over the cross section of the considered Object to different changes of light from the selected, eg pure circular polarization, e.g. these changes cause the pure circular polarization to change into an elliptical polarization, so that correspondingly elliptically polarized light portions can at least partially pass through the analyzer arrangement and result in a bright image.
  • phase and interference and polarization contrast can be recorded.
  • phase and interference and polarization contrast can be recorded.
  • Phase-contrast microscopy is then performed with this device as described above.
  • the adjustment of the relative phase as mentioned above, for example, by a phase-shifting element such as a wedge prism can be effected, wherein it can be provided, the Polarization by a corresponding means for polarization change, such as make a lambda-half plate or by similarly acting elements.
  • the aforementioned second series of images is recorded when the partial beams in the interferometer are unpolarized or identically polarized with respect to a photograph of the first series, where the partial beams are linearly polarized in the interferometer, in particular wherein both partial beams are polarized perpendicular to one another are. This precludes the inclusion of the second series of effects that may be due to polarized light.
  • a change of polarized light in the sub-beams of the interferometer to unpolarized light in the sub-beams of the interferometer can be achieved, for example, by appropriate selection of the device for beam splitting.
  • beam splitter cube can be used, which act polarizing or non-polarizing. Such beam splitter cubes may then be exchanged by a displacement mechanism to change the interferometer to polarized or unpolarized operation.
  • the sub-beams are adjusted relative to an adjustment in which they are exactly parallel to one another, in such a way that the sub-beams from the Interferometerarmen are superimposed in the device for beam convergence at an angle not equal to 0.
  • a beam offset it can then be provided that in the beam path after the object to be observed, a device for compensating for this beam offset is arranged to offset the two Bring rays back together.
  • an at least temporarily arranged mask element may be provided after the illumination device and in front of the interferometer, which spatially modulates the intensity of a light beam emitted by the illumination device over its cross section.
  • a mask element may be an optical grating or pinhole or a similar mask.
  • Such a mask causes the mask structure to become visible in the image of the object as well, with two images of the masks relative to the two incompletely superimposed partial beams resulting in insufficient adjustment, so that for optimum adjustment and adaptation of the tilting of the two partial beams and the Device for compensating the tilting the two partial beams can be adjusted to each other in a simple manner, namely the fact that the two separate mask images are brought to coincide.
  • the mask element is tilted out of the beam path, so that it does not disturb the microscopy examination further.
  • the illuminated object and the microscope assembly ie, condenser and lens, arranged in the beam path to the interferometer.
  • the arrangement of lighting device and interferometer can thus be understood as a special lighting device according to the invention, which can optionally also be used with conventional classical transmitted-light microscopes. Accordingly, a device comprising a lighting device and an interferometer can be used to illuminate the microscope slide of a conventional microscope, in which the setting of a desired, in particular simple way, by the interferometer arrangement and the means for phase shifting and polarization rotation provided therein. eg allow the circular polarization in the illuminated light.
  • a microscope optics may be arranged in each beam path of the interferometer before beam collimation, wherein an object to be observed may be inserted in a microscope optic and a reference object may be inserted into the other microscope optics. Accordingly, a beam combination of the two partial beams of the interferometer only takes place after the two partial beams each have passed through an associated microscope optics. Thus, there is an interference of these partial beams in an area after the interferometer, so that a change in the interference can be directly influenced by an object which is located in one of the microscope optics of a partial beam of the interferometer.
  • the microscope optics are again understood to mean, in essence, the condenser and the objective as well as a slide for holding an object.
  • the microscope optics are again understood to mean, in essence, the condenser and the objective as well as a slide for holding an object.
  • microscope optics with the reference object are omitted.
  • an object in the object plane of one of the two microscope arrangements in the one partial beam by an optically active effect, ie either by a polarization rotation or a phase shift this selected, eg circular polarization outside of the interferometer after the superposition of the partial beams in a modified, eg elliptical polarization , so polarized portions can pass through the above-described analyzer and lead to an image of the object in the camera or in the eye of the beholder, as viewed over the cross section, different areas of the Object lead to different degrees of deviations from the selected, eg circular polarization.
  • the intensity of the birefringence depends on how a linear polarization is oriented with an illuminating light relative to the birefringent structure.
  • the strength of the polarization-rotating effect of such a birefringent region is thus dependent on the direction of the linear polarization in the illumination.
  • the same amounts of a change in polarization can then be adjusted, for example, by an operative connection of two means for influencing the polarization in the two respective sub-beams, the polarizations in the sub-beams after the polarization-changing means, such as lambda half-plates, preferably still being perpendicular to one another, or in the case of a change, the relative bearings of the polarizations in the partial beams are retained and, by means of a corresponding phase shift adjustment, independent of the set polarization direction of a partial beam at Output of the interferometer repeatedly the desired polarized, eg circularly polarized light is obtained.
  • the desired polarized eg circularly polarized light
  • the means for influencing the polarization are operatively connected to one another, for example such that a rotation of a polarization-changing element in one of the interferometer arms automatically leads to a rotation of the other polarization-changing element by the same amount in the other interferometer arm.
  • Such an active compound may e.g. be realized by a transmission with a 1 to1 translation.
  • a beam splitter at the input of an interferometer either form polarizing or non-polarizing and such beam splitter, for example, form as a beam splitter cube and to replace each other by means of a displacement mechanism.
  • it may be provided in principle to analyze not only circular polarization in the superimposed beams outside of the interferometer, but optionally any type of polarization by appropriate selection or setting an analyzer, such as a Lamdaviertelplatte and a Linearpolarisators.
  • Such a microscope of the aforementioned type according to the first or the second alternative or any other arrangement according to the invention may preferably be characterized in that the optical elements for influencing the beam path or the means for changing the polarization and / or the means for changing the relative phase are each adjustable by means of at least one actuator.
  • the means for changing the polarization such as lambda half-plates, are selectively rotatable by means of actuators and that means for relative phase shift, such as wedge prisms, by means of actuators in the beam path or are moved out.
  • the microscope has a control, in particular a software control, which is implemented on a data processing system, by means of the desired parameters, such. B. polarization, phases or adjustment are automatically adjustable.
  • a control in particular a software control, which is implemented on a data processing system, by means of the desired parameters, such. B. polarization, phases or adjustment are automatically adjustable.
  • a user can easily, for example by means of a user interface of a program, make a selection of parameters, which are then set automatically by the higher-level controller and the actuators.
  • control may assist in adjusting the interferometer with respect to the desired type of interference, which experience has shown to be manually cumbersome.
  • an evaluation of the interference pattern caused by the adjustment can be evaluated by the recording by means of a downstream camera, so as to arrive at an optimal adjustment.
  • an adjustment of the interferometer takes place in such a way that the superposed partial beams form an interference fringe pattern outside the interferometer. This can be done, for example, by adjusting the two partial beams from the interferometer arms at a slight angle to one another, so that angle-dependent interference fringes result more or less closely.
  • a lateral distortion of the interference fringe pattern will occur if an object is present in the object plane of the microscope arrangement. If no object is present, the result is an ideal adjustment of the arrangement only just aligned interference fringes.
  • a lateral distortion of the interference fringes can thus be evaluated to the effect that an object is present in the object plane, wherein it should be taken into account here that in the second interferometer arm Reference object is present, which consists for example only of an empty slide, or - as mentioned above - a null image is taken into account.
  • This check can also be carried out with an exactly parallel adjustment of the partial beams in the superimposition, if they are adjusted in such a way that e.g. negative interference over the entire image plane occurs when no object exists. , If an object interferes with the interference, brighter picture parts occur, which allows conclusions about the existence of an object in the slide. This method is also analog and equivalent possible when maximum positive interference is adjusted.
  • an undisturbed interference pattern is detected with a camera, this indicates a non-occupancy of the object carrier, whereas a disturbed interference pattern indicates an occupancy of the object carrier with an object.
  • the microscope arrangement is traversed with respect to the position of the objective in order to drive through different planes in the slide, such as microtiter plates, and to microscopically examine different levels of the slide if an occupancy of the slide has previously been determined.
  • automated microscopy examinations can be performed on any number of slides.
  • This method also makes it possible to track moving objects on or in a slide.
  • a feedback may be provided, from a detector or a camera to a translating device for the slide at least in X-Y, preferably in X-Y-Z plane, to keep the moving object in the field of view or focus.
  • Field of application of the microscope arrangement according to the invention or of the method can be seen for example in the field of cancer research, stem cell research or even immunology.
  • proteins that occur in stem cells or viruses can be detected by means of interference effects and the inventive arrangement with high contrasts.
  • Fig. 1 An embodiment with microscope assemblies in each
  • Fig. 2 An embodiment as in Figure 1, but only with one
  • Fig. 3 An embodiment with a microscope optics outside the
  • Fig. 4 An embodiment as in Fig. 2, but with each other tilted
  • Fig. 5 Picture of a mouse fibroblast
  • FIG. 1 shows a microscope setup in which a microscope arrangement is provided in each arm of the interferometer.
  • a microscope arrangement for observing an object and the other for the consideration of a reference object so that the beam paths are identical in both interferometer arms except for the observed object.
  • Light is generated by the light source 1, e.g. by means of a thermal illuminant, such as halogen, mercury vapor, xenon vapor, sodium vapor or by means of a laser, e.g. Diode laser, gas laser, solid-state laser, tunable diode laser, optical parametric oscillator.
  • a laser e.g. Diode laser, gas laser, solid-state laser, tunable diode laser, optical parametric oscillator.
  • the use of a laser has the advantage of a higher coherence length, so that the length adaptation in the interferometer arms is less critical than e.g. with thermal light sources.
  • the length of the two interferometer arms is set exactly identically, at least within the respective coherence length to be considered.
  • a widening or collimating lens 2 may be provided in the beam path, e.g. a telescope for expanding the light beam, e.g. the laser radiation.
  • a spatial filter can be arranged in the telescope, e.g. through a pinhole in the focus of the telescope.
  • a collector may be provided for bundling light from thermal sources.
  • a beam splitter 3 which can be designed as a beam splitter cube with a) polarizing effect for polarization optical measurements (birefringence and optical activity in the object, generation of polarization contrast)) or b) non-polarizing effect for interferometric measurements (refractive index , Thickness, optical density, path differences, phase boundaries, generation of the interference contrast and an interference fringe pattern), in particular at which polarization effects should be excluded.
  • the same component 3 can serve at the output of the interferometer to bring together the two partial beams of the interferometer.
  • the light beam I is split into the two partial beams II and III, which are e.g. can be polarized perpendicular to each other, or have no polarization in non-polarizing beam splitters 3.
  • Both partial beams II and III pass through the same path length in the interferometer arms until they are combined in the device for beam convergence 3 at the output of the interferometer, at least exactly up to the coherence length.
  • each of the interferometer arms is followed by a polarization-optical element 4, e.g. a rotatable, in particular automatically rotatable polarization-optical element 4 to polarize linearly or circularly or to rotate the incident polarization.
  • a polarization-optical element 4 e.g. a rotatable, in particular automatically rotatable polarization-optical element 4 to polarize linearly or circularly or to rotate the incident polarization.
  • It can be e.g. a polaroid, polarizing prism (Rochon, Glen-Thomson, Wollaston, ...), a grating, a lambda-half plate, lambda-quarter plate, liquid crystal filter for the measurement of randomly distributed in the sample birefringent or directed or optically active structures or Act like that.
  • the two elements 4 may be coupled in the two interferometer arms, e.g. to be able to tune them simultaneously.
  • deflecting elements 5 are provided in the beam path, for example 90 ° deflecting mirrors, prisms or surface mirrors, each with adjustment options and / or with motorized adjustment option (driven fine-thread screws).
  • the deflecting elements 5 allow the wavefronts from the two interferometer arms to be aligned with one another, in particular for generating an interference fringe pattern.
  • an optical element 6 is provided for adjusting the relative phases between the partial beams II and III. In one embodiment, for example, it may be a wedge compensator made of glass wedges (quartz).
  • the interference contrast can be changed by the path difference in unpolarized partial beams II and III or in polarized partial beams II and III the retardation to set a desired polarization at the superposition of the partial beams II and III at the output of the interferometer, in particular one circular polarization.
  • the wedges can be pulled apart perpendicular to the optical axis or pushed into each other, so that the glass path is shorter or longer.
  • Pockels cells or Kerr cells can be used for the element 6, for example.
  • an optical element 7 for compensating the path extension through the element 6 is arranged in the upper arm.
  • the compensation element 7 is preferably made of the same material as the phase-shifting element 6 for obtaining the phase relationship and the coherence of the partial beams.
  • it may be made of quartz glass, if e.g. a wedge compensator made of quartz glass at element 6 is used.
  • a microscope arrangement each before the element 3 for beam merging comprising a condenser 10, e.g. a converging lens or lens arrangement for focusing the illuminating light onto the specimen or object to be observed and an objective 11, e.g. also a lens or lens arrangement, e.g. a dry lens, water immersion, oil immersion objective).
  • This lens produces a real intermediate image behind the beam merge 3, e.g. in the tube of the microscope assembly.
  • a slide 8 with an object to be observed and in upper part of the beam III a reference object 9, which may for example comprise only the same slide, but without an object. This ensures that both partial beam paths are identical except for the object to be examined.
  • Both sub-beams II and III are superimposed again in the arrangement for beam combination 3 and subsequently through an optical system 12, e.g. a lens for an infinity corrected microscope, imaged onto a detector 14.
  • the detector may e.g. be designed as a camera with CCD or CMOS chip or as a photomultiplier, photodiode, video camera, digital camera.
  • a polarization filtering arrangement may be arranged, e.g. filters a desired polarization, i. blocks, e.g.
  • the array may be set so that circularly or linearly polarized light can not pass.
  • a combination of a quarter-wave plate 13 and a linear polarizer 4 can be used. It may also be a liquid crystal filter, in particular an electronically programmable liquid crystal filter or a prism.
  • two glass plates 16 can each still be used in order to allow a wavefront tip tilting.
  • the axes of rotation are preferably offset parallel to the optical axis.
  • the plates may serve to adjust an interference fringe pattern or to align the wavefronts in parallel and, like all other optical elements, may be motorized for automatic adjustment and automated measurement.
  • FIG. 1 The described arrangement of FIG. 1 can be used as follows:
  • an interference pattern by interference in particular which can be adjusted at plane wavefront so by phase shift at the element 6, that the background light is extinguished.
  • Phase retardations in the object wave II caused by the distribution of the optical density in the object 8 to be observed in the sample, produce brightness differences in the interference image or, in the case of thermal no or less coherent illumination, in particular with higher bandwidth, characteristic interference colors.
  • An object of different optical density can thus produce strong contrast by a bright image against a dark background. In this case, it is advantageous that the object does not even have to be completely focused, since the interference also occurs without sharp object imaging in the image plane of the detector.
  • polarization of object wave II and reference wave III in the superposition after the beam merging 3, e.g. circular, (or linear) polarized light can be generated, which can be blocked by the Analyzeranorndung 13/4, so that no signal at the detector or only a dark image is formed on the camera.
  • All structures in the object sample which rotate the polarization of the object beam II or reduce the corresponding E field component, provide a deviation from the undisturbed circular (or linear) polarization after the superimposition of the partial beams. These disturbed portions of the wave may pass through the analyzer 13/4 and produce a signal on the detector or the camera.
  • the elements 4 can be operatively connected to the polarization rotation in the interferometer arms, for example by a 1: 1 transmission.
  • the contrast types can be distinguished by knowing the set parameters and in particular can be drawn differently in the image. If all polarizing structures and refractive indices and phase boundaries are recorded with a series of images, a complete image can be compiled in which refractive indices, boundaries of regions of different densities, directed structures, and concentrations of optically active substances can be clearly and contrastingly recognized.
  • an arrangement according to the invention of the type described provides the possibility to record different contrast types without prior manipulation on the object sample, to differentiate one another and to display them differently in recorded image series, since both polarization effects and phase effects can be measured with one and the same structure.
  • an automatic detection of objects due to the interference contrast can be done.
  • the brightness difference in the image, between the sample and its surroundings is so large that it can be used for automatic detection.
  • mobile cells can be detected in the object sample and retained in the field of view by feedback with a motorized slide, or object manipulator or sample tray.
  • sample volume e.g. of microtiter plates are automatically examined to see if an object is included in the sample volume or not.
  • Cells can be found automatically since the generated path difference deflects the interference fringe pattern. So the sample can be found in the x-y plane.
  • the focal plane can be found by searching for the greatest contrast. So the largest bright area against a dark background, or vice versa. Or the boundary between light and dark areas with the steepest increase in intensity is sought, which can be done automatically, e.g. by image processing, for example software.
  • All degrees of freedom for aligning the wavefronts to each other, for tuning the relative phase of the partial beams and for rotation of the polarization direction may preferably be motorized. If necessary, the interferometer can automatically compensate for mechanical and thermal influences and maintain an adjustment.
  • the optical components for phase matching such as a wedge compensator and polarization rotation, for example, in software rotated in defined positions and it can then be generated from each corresponding position an image become.
  • the software also contains the algorithm for breaking down the image information into phases and polarization contrast, whereby it can be provided that the software optimally assembles the images.
  • FIG. 2 shows an alternative in which the reference microscope arrangement in sub-beam III has been omitted.
  • it may be provided to first record at least one null image from an insertion of an object into the microscope and to subsequently subtract these from the recorded images.
  • FIG. 3 shows an alternative arrangement of a microscope according to the invention, in which the microscope optics is arranged outside the interferometer. Otherwise, all other components and their configuration, which have been described for Figure 1, are also provided in this embodiment.
  • the process possibilities mentioned for carrying out microscopic examinations, i. In particular, the interference contrast microscopy with unpolarized light in the interferometer and the polarization contrast microscopy with polarized light can be carried out exactly the same.
  • FIG. 4 shows a modification of the embodiment according to FIG. 2. Here too, they may or may not. be all realized to the figures 1 or 2 features.
  • the embodiment according to FIG. 3 differs from FIG. 2 in that, when merging with the partial beam III in the element 3, the partial beam II does not run parallel to one another but at an angle to one another.
  • the element 18 may be e.g. to act a Wollaston or Nomarski prism, which can merge the laterally offset sub-beams and / or align the polarization directions equal to each other.
  • a differential interference contrast microscope can be realized, in which at the same time without manipulation of the object sample measurements on different phases and polarizations can be performed, as well as in the other possible embodiments, in particular as already described there has been.
  • a wedge compensator or other element 6 is used for phase shifting to distinguish polarization contrast from the phase contrast in the recorded images or measured data can.
  • both sub-beams are intensity-modulated with the pattern of the mask across the cross-section and it is possible to precisely adjust the sub-beams, e.g. by tilting of the element 5 in the lower interferometer, when the patterns of the two partial beams after the element 18 come exactly to coincide.
  • FIG. 5 shows for clarification the differences between conventional amplitude-contrast microscopy and interference microscopy according to the invention.
  • a mouse fibroblast in normal transmitted-light amplitude microscopy can be seen in the upper left representation of FIG.
  • the presentation shows little contrast and the cell structures are thus only inaccurately recognizable.
  • Recordings with the The arrangement according to the invention and the method according to the invention show the images in the center and on the right in zeroth interference order, shifted in the phase between the two images by Pi.
  • a bright cell area is clearly visible in the middle image, and the same cell area in the right image shows a darker image which identifies an optically active region, which thus acts either polarization-rotating or phase-shifting, so that further conclusions can be drawn from this area pure amplitude contrast microscopy did not result.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop zur Durchlichtuntersuchung von Objekten mit einem Strahlengang zwischen einer Beleuchtungsvorrichtung und einer Vorrichtung zur Betrachtung/Erfassung eines Objektbildes, insbesondere einer Kamera, bei dem im Strahlengang ein Interferometer angeordnet ist, welches Mittel zur Veränderung der Polarisation (4) und davon unabhängige Mittel zur Veränderung der relativen Phase (6) in wenigstens einem der Teilstrahlen (II) des Interferometers aufweist. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Durchlichtmikroskopie von Objekten (8, 9), bei dem der Strahlengang zwischen einer Beleuchtungsvorrichtung (1 ) und einer Vorrichtung (15) zur Betrachtung/Erfassung eines Objektbildes durch ein Interferometer (II, III) führt, wobei wenigstens ein Abbild eines Objektes (8, 9), insbesondere eine Serie von Abbildern mittels einer Kamera (15) aufgenommen wird, insbesondere in Abhängigkeit von einer Lage der Polarisation und/oder der Phase des Lichtes in wenigstens einem der Teilstrahlen (II, III) des Interferometers.

Description

Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen BO/de 660205
Templergraben 55 17.08.2006
52062 Aachen
MIKROSKOP MIT INTERFEROMETERANORDNUNG ZUR DURCHLICHTUNTERSUCHUNG TRANSPARENTER OBJEKTE MITTELS INTERFERENZKONTRAST UND POLARISATIONSKONTRAST
Die Erfindung betrifft ein Mikroskop zur Durchlichtuntersuchung von Objekten mit einem Strahlengang zwischen einer Beleuchtungsvorrichtung und einer Vorrichtung zur Betrachtung/Erfassung eines Objektbildes, insbesondere einer Kamera. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Durchlichtmikroskopie von Objekten, insbesondere mit einer vorgenannten Vorrichtung.
Mikroskope zur Durchlichtuntersuchung von Objekten sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Die Wirkungsweise eines Mikroskops beruht dabei im Wesentlichen darauf, dass das Licht einer Beleuchtungsvorrichtung auf ein zu betrachtendes Objekt gerichtet wird, wobei üblicherweise zur Erhöhung der Lichtintensität das einfallende Licht mittels eines sogenannten Kondensors, üblicherweise einer Linse oder Linsenanordnung, in Richtung des Objekts gebündelt wird. Mittels eines Objektivs, welches üblicherweise ebenso aus einer Linse oder Linsenanordnung besteht, wird aus der Ebene des Objektes ein Abbild des Objektes projeziert, welches ein reelles Bild darstellt und entweder unmittelbar oder nach einer weiteren Vergrößerung betrachtet werden kann.
Hierbei steht für eine weitere Vergrößerung ein Okkular zur Verfügung, mittels dem das reelle Bild weiter vergrößert wird, um anschließend mit dem Auge des Betrachters oder mittels einer Kamera erfasst zu werden. Wesentlich für eine gute Abbildungsqualität ist es, dass ein Objekt einen ausreichenden Kontrast in dieser Durchiichtuntersuchung erzeugt. Hierbei wird als Kontrast das Verhältnis der Intensitäten des Lichtes, welches das Objekt durchleuchtet und des Umgebungslichtes verstanden. Üblicherweise wird dabei in Mikroskopen eine Amplitudenänderung des Lichtes aufgrund der durch das Objekt reduzierten Transmission durch das Objekt ausgewertet. Hierbei ergibt sich jedoch das Problem, dass gerade kleine transparente Strukturen, wie sie z.B. bei lebenden Zellen auftreten, nur mit großer Schwierigkeit mikroskopisch beobachtet und untersucht werden können, da derartige lebende Zellen aufgrund ihrer hohen Transparenz oftmals nur einen ungenügenden Amplitudenkontrast erzeugen.
Es ist daher im Stand der Technik weiterhin bekannt, zu untersuchende Objekte, also beispielsweise lebende Zellen, mittels Farbstoffen, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffen, zu präparieren und sodann die Farbstoffe mittels daran angepassten Lichtwellenlängen anzuregen und das Fluoreszenzlicht auszuwerten. Dies führt jedoch gerade bei lebenden Zellen zu der Problematik, dass eine Fluoreszenzfärbung biochemische Abläufe in den Zellen empfindlich stören kann und oftmals die untersuchten Zellen frühzeitig absterben. Auch ist der Informationsgehalt in den so erhaltenen Bildern begrenzt, da die Färbung oftmals nur gezielte einzelne Strukturen sichtbar machen kann. Wegen der Lebensdauer des Farbstoffes zum einen und der mitunter begrenzten Lebensdauer der präparierten lebenden Zellen sind darüber hinaus Langzeitbeobachtungen derart präparierter Zellen kaum möglich.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mikroskop für Durchlichtuntersuchungen sowie auch ein Verfahren zur Mikroskopie zur Verfügung zu stellen, mittels dem die vorgenannten Nachteile überwunden werden und welches die Grenzen bei der Beobachtung hochtransparenter Objekte, insbesondere von lebenden Zellen, verbessert. Es ist dabei weiterhin Aufgabe der Erfindung, mittels eines möglichst geringen Aufwandes ein Maximum an Informationen aus einem untersuchten Objekt herauszuholen, lebende Zellen direkt zu untersuchen, ohne einen Einfluss auf die Lebensprozesse der Zellen zu nehmen und insbesondere auch Langzeituntersuchungen zu ermöglichen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Mikroskop zur Durchlichtuntersuchung gelöst, welches einen Strahlengang zwischen einer Beleuchtungsvorrichtung und einer Vorrichtung zur Betrachtung/Erfassung eines Objektbildes, insbesondere eine Kamera aufweist, wobei im Strahlengang ein Interferometer angeordnet ist, welches Mittel zur Veränderung der Polarisation und davon unabhängige Mittel zur Veränderung der relativen Phase in wenigstens einem der Teilstrahlen des Interferometers aufweist.
Die Aufgabe wird weiterhin durch ein Verfahren zur Durchlichtmikroskopie von Objekten gelöst, bei dem der Strahlengang zwischen einer Beleuchtungsvorrichtung und einer Vorrichtung zur Betrachtung/Erfassung eines Objektbildes durch ein Interferometer führt und wobei wenigstens ein Abbild eines Objektes, insbesondere eine Serie von Abbildern, mittels einer Kamera aufgenommen wird, insbesondere in Abhängigkeit von einer Lage der Polarisation und/oder der Phase des Lichtes in wenigstens einem der Teilstrahlen des Interferometers.
Hierbei können für die Erfindung im Wesentlichen jegliche Art von Interferometer zum Einsatz kommen. Unter einem Interferometer wird dabei eine Vorrichtung verstanden, die ein von einer Beleuchtungsvorrichtung stammendes Lichtstrahlenbündel, gegebenenfalls nach einer vorherigen Raumfilterung, aufspaltet in zwei Teilstrahlen, die nach Durchlaufen einer vorbestimmten Wegstrecke in zwei unabhängigen Armen des Interferometers und gegebenenfalls nach einer Beeinflussung von Phase und Polarisation wieder in einer Vorrichtung zur Strahlenzusammenführung zu einem Lichtstrahlenbündel zusammengeführt wird, in welchem aufgrund der Überlagerung Interferenzeffekte und Polarisationseffekte sichtbar gemacht werden können, die auf einer unterschiedlichen Beeinflussung der Lichtstrahlen in den beiden Teilstrahlengängen resultieren.
Hierbei können Beeinflussungen insbesondere durch Änderungen der Polarisation und der relativen Phasenlage vorgenommen werden. Beispielsweise kann erfindungsgemäß der Aufbau eines sogenannten Mach-Zehnder-Interferometers verwendet werden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf den Einsatz einer derartigen Interferometeranordnung beschränkt und es kann grundsätzlich jegliche Interferometeranordnung verwendet werden, die nach einer Aufspaltung eines Lichtbündels zu zwei Teilstrahlen und der Möglichkeit der unabhängigen Manipulierung von Phase und Polarisation die Teilstrahlen wieder zu einem Bündel zusammenführen.
Wesentlicher Kerngedanke der Erfindung ist es dabei, dass mittels eines erfindungsgemäßen Mikroskops bzw. Verfahrens neben der Auswertung von Amplitudenkontrastbildern auch die Möglichkeit besteht, Abbilder von Objekten aufzunehmen, die abhängig sind von einerseits der Polarisation des eingestellten Lichtes, welches zur Beleuchtung des Objektes dient sowie auch von der Phase. Hierbei ist es wesentlich für die Erfindung, dass sowohl die Polarisation als auch die Phase unabhängig voneinander mittels derselben Vorrichtung verändert werden können, ohne dass zwischenzeitlich ein Einfluss auf die zu untersuchende Probe bzw. das zu untersuchende Objekt genommen werden muss. Es besteht somit die Möglichkeit, neben dem vorgenannten Amplitudenkontrast auch den Interferenzkontrast sowie den Polarisationskontrast auszuwerten und insbesondere diese beiden Kontrastarten in den Bildern zu unterscheiden.
Dies kann einerseits dadurch erfolgen, dass ein Betrachter die entstandenen Bilder unmittelbar mit dem Auge wahrnimmt und auswertet oder aber bevorzugterweise, dass die Bilder mittels eines Detektors, z.B. einer Kamera erfasst und anschließend weiter ausgewertet werden. Die Möglichkeit, unterschiedliche Kontrastinformationen auszuwerten, ist insbesondere vorteilhaft bei transparenten lebenden Zellen, da bei diesen oftmals eine optische Aktivität vorliegt, was bedeutet, dass derartige Objekte sowohl Polarisation als auch phasenschiebende Wirkungen aufweisen können. Hierbei können phasenschiebende Wirkungen z.B. durch unterschiedliche optische Dichten oder unterschiedliche Dicken eines untersuchten Objektes entstehen, wobei beispielsweise Veränderungen in der Polarisation durch doppelbrechende Wirkungen von Zellstrukturen entstehen können.
Derartige optisch aktive Wirkungen von Objekten können mittels üblicher Amplitudenkontrastmikroskopie nicht ausgewertet werden, hingegen mittels des erfindungsgemäßen Mikroskops bzw. eines Verfahrens zur Durchführung mikroskopischer Untersuchungen, da hierbei mittels ein- und derselben Interferometeranordnung sowohl die Polarisation als auch die relative Phase bei den Teilstrahlen im Interferometer unabhängig voneinander geändert werden können, so dass aufgrund der unabhängigen Änderbarkeit Rückschlüsse darauf gezogen werden können, ob ein auftretender Kontrast in einem beobachteten Objekt auf eine Polarisationsdrehung oder eine Phasenverschiebung zurückgeht.
Hierbei wird es als besonders vorteilhaft für die Erfindung empfunden, dass sowohl das Mikroskop als auch das erfindungsgemäße Verfahren ohne jegliche weitere Einflussnahme auf die zu untersuchende Probe bzw. das zu beobachtende Objekt auskommt, so dass unbeeinflusste Untersuchungen und insbesondere auch Langzeituntersuchungen möglich sind, ohne die untersuchte Probe in irgendeiner Art und Weise zu stören und hierdurch gegebenenfalls sogar ein Untersuchungsergebnis zu verfälschen.
Mittels einer Interferometeranordnung in einem erfindungsgemäßen Mikroskop, beispielsweise mittels eines Mach-Zehnder-Interferometers, besteht die Möglichkeit, deutlich höhere Kontraste zu erwirken, als dies mit einer üblichen Amplitudenmikroskopie möglich ist. Dies beruht auf der Möglichkeit, dass mittels eines Interferometeraufbaus und einer entsprechenden Justage das erfasste Abbild derart eingestellt werden kann, dass zunächst durch Interferenzeffekte und/oder Polarisationseffekte das durch das Objekt unverfälschte beleuchtende Licht in der Bildebene einen dunklen Hintergrund ergibt und lediglich durch phasen- oder polarisationsschiebende Effekte des beobachteten Objektes hellere Strukturen im Abbild erscheinen, insbesondere wobei die Helligkeit über die Stärke des Effektes gibt. Ebenso ist eine hierzu inverse Justage möglich. Hierfür kann es in einer Ausführung vorgesehen sein, den lnterferometeraufbau durch Auswahl von Polarisation und relativer Phasenverschiebung der Teilstrahlen im Interferometer derart zu justieren, dass in der Bildebene im Wesentlichen eine ebene Wellenfront senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Lichtstrahlen vorliegt, und bei den beiden überlagerten Teilstrahlen aus den jeweiligen Interferometerarmen eine sich gegenseitig auslöschende Interferenz gegeben ist.
Hierfür können die Teilstrahlen im Interferometer bevorzugt unpolarisiert oder gleich polarisiert eingestellt werden, z.B. durch Auswahl einer geeigneten Beleuchtungsvorrichtung und/oder durch Auswahl polarisierend wirkender Strahlteiler und/oder polarisationsändernder Elemente. Die effektiven optischen Längen der beiden Interferometerarme sind aneinander anzupassen, zumindest bis zu einer Genauigkeit unterhalb der Kohärenzlänge der verwendeten Beleuchtungsvorrichtung. Feineinstellungen der Phasenlage können durch wenigstens ein phasenverschiebendes Element in wenigsten einem der Interferometerarme realisiert werden, z.B. mittels sogenannter Keilkompensatoren. Änderungen der Interferenz durch ein Objekt lassen sodann Rückschlüsse zu auf phasenverschiebende Wirkungen des Objektes bzw. von Objektbereichen.
Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass das Licht nach dem Interferometer durch entsprechende Einstellung des Interferometers, d.h. durch Beeinflussung der Polarisation und der relativen Phase des Lichtes in den beiden Teilstrahlengängen derart eingestellt wird, dass die Polarisation eine definierte gewünschte Lage einnimmt, z.B. zirkulär oder linear ist. Es kann sodann vor einer beobachtenden Kamera oder vor dem Auge des Betrachters eine Anordnung positioniert werden, die dieses Licht filtert, d.h. vollständig abblockt, so dass ohne die Einfügung eines Objektes in das Mikroskop ein vollständig dunkles Abbild entsteht.
Erst durch die Einführung eines Objektes erfolgt aufgrund polarisations- und/oder phasenverschiebender Effekte eine über den Querschnitt des Objektes abhängige unterschiedliche Änderung der zirkulären Polarisation in eine von der eingestellten Polarisation abweichende Polarisation, z.B. also von der rein zirkulären in eine elliptische Polarisation, so dass die Anordnung, welche durch das Objekt ungestörtes Licht ausfiltert, für derartige geänderte, z.B. elliptische Polarisationsanteile zumindest teilweise durchlässig wird und somit im Abbild, welches von einem Detektor, z.B. einer Kamera erfassbar ist oder auch von dem Auge eines Betrachters, derartige polarisations- oder phasenverschiebende Objektanteile heller erscheinen.
Durch Vergleich der Ergebnisse, die aus diese Arten und Weisen der Bildaufnahme erstellt wurden, können Rückschlüsse darauf gezogen werden, ob ein Objekt, bzw. ein Objektbereiche polarisationsdrehend ist oder phasenverschiebend. Dabei kann die Analysatoranordnung, die für die Polarisations-Kontrast-Messung nötig ist entfallen, z.B. aus dem Strahlengang geschoben werden, wenn eine Messung zum Interferenzkontrast vorgenommen wird. Ggfs kann sie auch so eingestellt werden, dass sie das Licht der verwendeten Polarisation durchlässt und somit ein Messung nicht verfälscht.
Neben dieser vorgenannten Art und Weise, eine Mikroskopie durchzuführen, ergeben sich beliebige viele andere Möglichkeiten, aufgrund der unabhängigen Einstellung von Polarisation und Phase in wenigstens einem der Teilstrahlengänge des Interferometers, wobei es bevorzugt sein kann, dass polarisationsändernde Mittel auch in beiden Teilstrahlengängen des Interferometers vorgesehen sind.
Ein erfindungsgemäßes Mikroskop kann in einer bevorzugten ersten Alternative beispielsweise derart aufgebaut sein, dass eine Mikroskopoptik zur Erzeugung eines Abbildes eines Objektes außerhalb des Interferometers nach einer Anordnung zur Strahlenzusammenführung angeordnet ist. Hierdurch ergibt sich die Möglichkeit, z.B. mittels einer Beleuchtungsvorrichtung polarisiertes oder auch unpolarisiertes Licht zu erzeugen und mittels eines polarisierend wirkenden Strahlteilers den erzeugten Lichtstrahl aufzuspalten in zwei Teilstrahlen mit zueinander senkrecht stehender Polarisationsrichtung. Vor der Zusammenführung der beiden Teilstrahlen können diese derart manipuliert werden, dass eine relative Phase der beiden Strahlen zueinander eingestellt wird, dass das wieder zusammengeführte Strahlenbündel aufgrund der vektoriellen Addition mit der eingestellten Phasenverschiebung und den senkrechten Polarisationen zirkulär polarisiertes Licht erzeugt, beispielsweise rechts- oder linkszirkulares Licht je nach eingestellter Phase. Durch Polarisationseinstellung und Phasenverschiebung in den Interferometerarmen kann auch jegliche andere gewünschte Polarisation eingestellt werden. Wichtig, ist dass ein gewünschte Polarisation zur Auswahl kommt, z.B. zirkulär.
Die Phasenverschiebung kann durch entsprechende phasenschiebende Mittel in wenigstens einem der beiden Teilstrahlengänge des Interferometers erfolgen, beispielsweise durch eine Anordnung mit einem Keilprisma / Keilkompensator, welches mehr oder weniger weit in den Strahlengang eingeschoben wird. Zur Kompensation des eingeschobenen Glasweges kann es dabei vorgesehen sein, in dem anderen Interferometerarm einen entsprechenden transparenten Körper, beispielsweise einen Glasblock aus dem gleichen oder einem ähnlichen Material einzufügen, um die effektive Längenänderung der Interferometerarme durch den Einsatz dieses phasenverschiebenden Elementes auszugleichen.
Es besteht bei dieser Ausführung so wie eingangs genannt die Möglichkeit, durch Vorschaltung eines Analysators vor einer beobachtenden Kamera oder dem Auge eines Betrachters, das z.B. rein zirkulär polarisierte Licht bzw. die gewählte Polarisation des Licht, welches zur Beleuchtung eines Objektes in einer Mikroskopanordnung dient, vollständig zu blockieren bzw. auszufiltern.
Unter einer Mikroskopanordnung wird hierbei und bei allen anderen Ausführungen im Wesentlichen verstanden, dass ein Kondensor, insbesondere eine Linse oder Linsenanordnung, zur Beleuchtung eines Objektes vorgesehen ist sowie ein Objektiv, um eine Abbildung des beleuchteten Objektes zu projezieren, gegebenenfalls unter Erstellung eines Zwischenbildes, welches weiterhin vergrößert durch ein Okular betrachtet wird. Bei einer derartigen Anordnung ist demnach die Mikroskopoptik zur Erzeugung eines Abbildes sowie die innerhalb der Mikroskopoptik angeordnete Probe bzw. das Objekt außerhalb des Interferometers angeordnet.
Wird demnach die Analysatoranordnung vor dem Auge des Betrachters oder des Detektors / der Kamera derart einjustiert, dass die gewählte Polarisation z.B. rein zirkuläres Licht ausgefiltert wird und somit zu einem vollständig dunklen Abbild führt, so ist es ersichtlich, dass helle Strukturen in einem Abbild des Objektes darauf zurückzuführen sind, dass das betrachtete Objekt entweder phasenschiebend oder aber polarisationsdrehend wirkt, so dass es über den Querschnitt des betrachteten Objektes zu unterschiedlichen Änderungen des Lichtes aus der gewählten, z.B. reinen zirkulären Polarisation heraus kommt, z.B. wobei diese Änderungen dazu führen, dass sich die reine zirkuläre Polarisation in eine elliptische Polarisation ändert, so dass entsprechend elliptisch polarisierte Lichtanteile die Analysatoranordnung wenigstens teilweise passieren können und zu einem hellen Abbild führen.
Es wird somit deutlich, dass neben der reinen Mikroskopie des Amplitudenkontrastes mittels einer derartigen Vorrichtung auch Phasen- bzw. Interferenz- und Polarisationskontraste aufgenommen werden können. Um eine Unterscheidung zwischen einer polarisationsdrehenden oder phasenschiebenden Wirkung des Objektes bzw. von Objektbereichen unterscheiden zu können.
Die Phasenkontrast-Mikroskopie wird mit dieser Vorrichtung sodann ebenso, wie zuvor beschrieben durchgeführt.
Es kann verfahrensgemäß vorgesehen sein, eine erste Serie von Abbildern eines Objektes aufzunehmen, bei der zwischen der Aufnahme zweier Abbilder die Polarisation in wenigstens einem der Teilstrahlen geändert wird und eine zweite Serie, bei der zwischen der Aufnahme zweier Abbilder die relative Phase in wenigstens einem der Teilstrahlen geändert wird. Hierbei kann die Einstellung der relativen Phase wie vorgenannt z.B. durch ein phasenverschiebendes Element wie ein Keilprisma bewirkt werden, wobei es vorgesehen sein kann, die Polarisation durch ein entsprechendes Mittel zur Polarisationsänderung, wie beispielsweise eine Lambda-Halbe Platte vorzunehmen oder durch ähnlich wirkende Elemente.
Es besteht so nachträglich durch Auswertung der aufgenommenen Abbildungen die Möglichkeit, Rückschlüsse dahingehend zu ziehen, welche Bereiche eines Objektes phasenschiebend bzw. polarisationsdrehend wirken. Dies lässt somit Rückschlüsse dahingehend zu, ob Objektbereiche gegebenenfalls doppelbrechend sind, beispielsweise wenn sie polarisationsdrehend wirken oder aber unterschiedliche Brechungsindices bzw. unterschiedliche Dicken bei dem Objekt vorliegen, wenn diese Objektbereiche als phasenschiebend erkannt werden.
Hierbei kann es vorgesehen sein, dass die vorgenannte zweite Serie von Abbildern aufgenommen wird, wenn die Teilstrahlen in dem Interferometer unpolarisiert oder gleich polarisiert sind gegenüber einer Aufnahme der ersten Serie, wo die Teilstrahlen im Interferometer linear polarisiert sind, insbesondere wobei beide Teilstrahlen senkrecht zueinander polarisiert sind. Dies schließt bei der Aufnahme der zweiten Serie aus, dass sich Effekte ergeben, die gegebenenfalls auf polarisiertes Licht zurückzuführen sind.
Eine Änderung von polarisiertem Licht in den Teilstrahlen des Interferometers zu unpolarisiertem Licht in den Teilstrahlen des Interferometers kann beispielsweise durch entsprechende Auswahl der Vorrichtung zur Strahlteilung erreicht werden. Beispielsweise können Strahlteilerwürfel eingesetzt werden, die polarisierend bzw. nicht polarisierend wirken. Derartige Strahlteilerwürfel können sodann mittels eines Verschiebemechanismus ausgetauscht werden, um das Interferometer auf polarisierten bzw. unpolarisierten Betrieb umzustellen.
In dieser vorgenannten Anordnung kann es beispielsweise auch vorgesehen sein, dass die Teilstrahlen gegenüber einer Justage, bei der diese exakt parallel zueinander verlaufen, derart justiert werden, dass die Teilstrahlen aus den Interferometerarmen in der Vorrichtung zur Strahlzusammenführung unter einem Winkel ungleich 0 überlagert sind. Hierdurch kann sich in der Ebene des zu beobachtenden Objektes, welches sich außerhalb des Interferometers befindet, ein Strahlversatz ergeben, wobei es sodann vorgesehen sein kann, dass im Strahlengang nach dem zu beobachtenden Objekt eine Vorrichtung zur Kompensation dieses Strahlversatzes angeordnet ist, um die beiden versetzten Strahlen wieder aufeinanderzuführen. Es besteht so die Möglichkeit, eine sogenannte differentielle Interferenzmikroskopie durchzuführen, da beide Teilstrahlen das Objekt an unterschiedlichen Orten durchleuchten und anschließend wieder überlagert werden, so dass insbesondere Brechungsindexänderungen oder Dickenänderungen, mithin große Gradienten dieser Parameter in dem erzeugten Abbild dargestellt werden können.
Hierbei kann es insbesondere für eine Vereinfachung der Justage vorgesehen sein, dass nach der Beleuchtungsvorrichtung und vor dem Interferometer ein zumindest temporär angeordnetes Maskenelement vorgesehen ist, welches einen von der Beleuchtungsvorrichtung emitierten Lichtstrahl über dessen Querschnitt räumlich in der Intensität moduliert. Beispielsweise kann es sich bei einem solchen Maskenelement um ein optisches Gitter oder Lochblenden oder eine ähnliche Maske handeln. Eine derartige Maske bewirkt, dass in der Abbildung des Objektes ebenso die Maskenstruktur sichtbar wird, wobei sich bei ungenügender Justage zwei Abbildungen der Masken bezogen auf die beiden unvollständig überlagerten Teilstrahlen ergeben, so dass für eine optimale Justage und Anpassung der Verkippung der beiden Teilstrahlen und der Vorrichtung zur Kompensation der Verkippung die beiden Teilstrahlen auf einfache Weise aufeinander justiert werden können, nämlich dadurch, dass die beiden separaten Maskenbilder zur Deckung gebracht werden. Für die sodann eigentliche Untersuchung kann es vorgesehen sein, dass das Maskenelement aus dem Strahlengang herausgekippt wird, so dass dieses die Mikroskopieuntersuchung nicht weiter stört. Bei dieser vorbeschriebenen Anordnung ist wie eingangs genannt das beleuchtete Objekt sowie die Mikroskopanordnung, d.h. Kondensor und Objektiv, im Strahlengang nachgeschaltet zum Interferometer angeordnet.
Die Anordnung aus Beleuchtungsvorrichtung und Interferometer kann somit als eine spezielle erfindungsgemäße Beleuchtungsvorrichtung verstanden werden, die gegebenenfalls auch mit üblichen klassischen Durchlichtmikroskopen zum Einsatz kommen kann. Es kann demnach eine Vorrichtung, umfassend eine Beleuchtungsvorrichtung und ein Interferometer, verwendet werden, um den Objektträger eines üblichen Mikroskops zu beleuchten, wobei hier insbesondere durch die Interferometeranordnung und die darin vorgesehenen Mittel zur Phasenschiebung und Polarisationsdrehung auf einfache Art und Weise die Einstellung einer gewünschten, z.B. der zirkulären Polarisation bei dem beleuchteten Licht ermöglichen.
In einer anderen bevorzugten und alternativen Anordnung eines erfindungsgemäßen Mikroskops kann es vorgesehen sein, dass in beiden Teilstrahlengängen des Interferometers vor einer Strahlzusammenführung jeweils eine Mikroskopoptik angeordnet ist, wobei in einer Mikroskopoptik ein zu beobachtendes Objekt und in die andere Mikroskopoptik ein Referenzobjekt einsetzbar ist. Es erfolgt hier demnach eine Strahlenzusammenführung der beiden Teilstrahlen des Interferometers erst, nachdem die beiden Teilstrahlen jeweils eine zugehörige Mikroskopoptik durchlaufen haben. Es erfolgt somit eine Interferenz dieser Teilstrahlen in einem Bereich nach dem Interferometer, so dass eine Änderung der Interferenz unmittelbar beeinflusst werden kann durch ein Objekt, welches sich in einer der Mikroskopoptiken des einen Teilstrahles des Interferometers befindet.
Hierbei wird, wie vorgenannt unter der Mikroskopoptik im Wesentlichen wiederum Kondensor und Objektiv sowie ein Objektträger zur Aufnahme eines Objektes verstanden. Erfindungsgemäß ist es dabei vorgesehen, dass nur einer der Objektträger in den beiden Mikroskopoptiken der beiden Teilstrahlen ein Objekt trägt, so dass der jeweils andere Objektträger lediglich als Referenzobjekt dient, so dass grundsätzlich beide Teilstrahlen, abgesehen von dem Objekt, identisch beeinflusst werden hinsichtlich Polarisation, Phasenschiebung und Amplitudenänderung und somit klar ist, dass eine Änderung in der Interferenz / der Polarisation auf das Objekt selbst zurückzuführenist.
Alternativ kann hier auch nur eine Mikroskopoptik in einem der Interferometerarme zum Einsatz kommen, d.h. die Mikroskopoptik mit dem Refrenzobjekt kommt in Entfall. Um hier einen Einfluß der Mikroskopoptik bei der Auswertung auszuschließen, kann es vorgesehen sein, zunächst wenigsten ein Nullbild aufzunehmen, dass ein Bild ohne Objekt. Diese Nullbild kann dann von späteren Aufnahmen mit Objekt abgezogen / subtrahiert werden, um den Einfluss der Mikroskopoptik in den Bildern zu eliminieren.
Diese Anordnungen können beispielsweise so justiert werden, dass sich nach der Strahlenzusammenführung durch entsprechende Auswahl der Polarisation in den beiden Teilstrahlen und Einflussnahme auf die relative Phase der Teilstrahlen zueinander am Ausgang des Interferometers ein definiert polarisiertes, z.B. zirkuläres Licht ergibt, welches wiederum, wie auch bei der ersten Ausführung, mittels einer Analysatoranordnung, beispielsweise aus Lambdaviertelplatte und Linearpolarisator, vollständig gefiltert bzw. geblockt werden kann, so dass sich außerhalb des Interferometers eine dunkle Abbildung bei der Beobachtung durch das Auge des Betrachters oder eine Kamera ergibt.
Ändert nun ein Objekt in der Objektebene einer der beiden Mikroskopanordnungen in dem einen Teilstrahl durch eine optisch aktive Wirkung, d.h. entweder durch eine Polarisationsdrehung oder eine Phasenschiebung diese ausgewählte, z.B. zirkuläre Polarisation außerhalb des Interferometers nach der Überlagerung der Teilstrahlen in eine geänderte, z.B. elliptische Polarisation, so können derart polarisierte Anteile den vorbeschriebenen Analysator passieren und zu einem Abbild des Objektes in der Kamera oder im Auge des Betrachters führen, da über den Querschnitt betrachtet, unterschiedliche Bereiche des Objektes zu unterschiedlich starken Abweichungen von der gewählten, z.B. Zirkularen Polarisation führen. Es ergibt sich somit auch bei dieser Anordnung eine Überlagerung von Interferenz und Polarisationskontrastbildern, so dass äquivalent mit dem vorbeschriebenen Verfahren auch bei dieser Anordnung durch verschiedene Messserien, bei denen zum einen die Polarisation zwischen verschiedenen Aufnahmen geändert wird und zum anderen die Phasenverschiebung zwischen verschiedenen Aufnahmen geändert wird, Rückschlüsse darauf zulässt, ob die untersuchten Strukturen phasenschiebend oder polarisationsdrehend sind.
Insbesondere bei einer optischen Aktivität, die auf eine Doppelbrechung von Objektbereichen zurückzuführen ist, ist es bekannt, dass die Stärke der Doppelbrechung abhängig davon ist, wie eine lineare Polarisation bei einem beleuchtenden Licht relativ zu der doppelbrechenden Struktur orientiert ist. Die Stärke der polarisationsdrehenden Wirkung eines derartigen doppelbrechenden Bereichs ist somit abhängig von der Richtung der linearen Polarisation bei der Beleuchtung.
Um einen derartigen Effekt ausmessen zu können, kann es verfahrensmäßig vorgesehen sein, dass in beiden Interferometerarmen, d.h. beiden Teilstrahlen des Interferometers jeweils Mittel zur Änderung der Polarisation des jeweils linear polarisierten Lichtes vorgesehen ist, insbesondere wobei es vorgesehen sein kann, dass in den beiden Teilstrahlen die linearen Polarisationen senkrecht zueinander ausgerichtet sind. Verfahrensgemäß können dann z.B. durch eine Wirkverbindung von zwei Mitteln zur Polarisationsbeeinflussung in den beiden jeweiligen Teilstrahlen betragsmäßig die gleichen Beträge einer Polarisationsänderung eingestellt werden, wobei jeweils immer die Polarisationen in den Teilstrahlen nach den polarisationsändernden Mitteln, wie z.B. Lambdahalbeplatten, bevorzugt weiterhin senkrecht zueinander stehen, bzw. die bei einer Änderung die relative Lager der Polarisationen in den Teilstrahlen erhalten bleibt und durch eine entsprechende Phasenschiebereinstellung unabhängig von der eingestellten Polarisationsrichtung eines Teilstrahles am Ausgang des Interferometers immer wieder das gewünscht polarisierte , z.B. zirkulär polarisiertes Licht erhalten wird.
Dies bedeutet, dass unabhängig von der Einstellung der polarisationsändernden Mittel in den Teilstrahlen bei einer erfassenden Kamera bzw. bei dem Auge des Betrachters ohne Berücksichtigung eines beobachteten Objektes immer ein dunkles Bild aufgrund der filternden Wirkung des vorbeschriebenen Analysators entsteht, welcher die gewünschte Polarisation, z.B. rein zirkulär polarisiertes Licht blockiert. Durch die Änderung der linearen Polarisation in den beiden Interferometerarmen wird dabei jedoch die Ausrichtung der linearen Polarisation relativ zu einem betrachteten Objekt geändert, so dass in Abhängigkeit von der Änderung der linearen Polarisation desjenigen Lichtes, welches das Objekt in einem der Interferometerarme beleuchtet, eine Serie von Abbildungen des Objektes, z.B. mittels einer Kamera aufgenommen werden kann, um die Stärke der doppelbrechenden Wirkung in Abhängigkeit des Winkels der linearen Polarisation relativ zum Objekt auszumessen. So können doppelbrechende Strukturen, insbesondere hinsichtlich ihrer Ausrichtung in der Probe, näher untersucht werden, ohne dass die Probe selbst bewegt werden muss.
Hierfür ist es wie vorbeschrieben bevorzugt vorgesehen, dass die Mittel zur Polarisationsbeeinflussung untereinander wirkverbunden sind, beispielsweise derart, dass eine Drehung eines polarisationsändernden Elementes in einem der Interferometerarme automatisch zu einer Drehung des anderen polarisationsändernden Elementes um den gleichen Betrag in dem anderen Interferometerarm führt. Eine solche Wirkverbindung kann z.B. durch ein Getriebe mit einer 1 zu1 Übersetzung realisiert sein.
Auch bei dieser Anordnung kann es vorgesehen sein, vergleichende Aufnahmen von Abbildungen durchzuführen, um Abbildaufnahmen mit einer polarisierten Beleuchtung eines Objektes gegenüber Abbildungen mit einer unpolarisierten Beleuchtung eines Objektes gegenüberstellen zu können. Auch hier kann es vorgesehen sein, einen Strahlteiler am Eingang eines Interferometers entweder polarisierend bzw. nicht polarisierend auszubilden und derartige Strahlteiler, beispielsweise als Strahlteilerwürfel auszubilden und mittels eines Verschiebemechanismus gegeneinander zu ersetzen. Neben den vorgenannten Ausführungen kann es grundsätzlich vorgesehen sein, hier nicht nur zirkuläre Polarisation bei den überlagerten Strahlen außerhalb des Interferometers zu analysieren, sondern gegebenenfalls jede beliebige Art der Polarisation durch entsprechende Auswahl bzw. Einstellung einer Analysatoranordnung, wie beispielsweise einer Lamdaviertelplatte und eines Linearpolarisators.
Ein derartiges Mikroskop der vorgenannten Art gemäß der ersten oder auch der zweiten Alternative oder jeder anderen erfindungsgemäßen Anordnung kann sich bevorzugt dadurch auszeichnen, dass die optischen Elemente zur Beeinflussung des Strahlenganges oder die Mittel zur Änderung der Polarisation und/oder die Mittel zur Änderung der relativen Phase mittels jeweils wenigstens eines Aktuators justierbar sind. Es ergibt sich so die Möglichkeit, beispielsweise bei umlenkenden Spiegeln, Aktuatoren vorzusehen bezüglich wenigstens zweier Achsen, um eine automatische Justierbarkeit zu ermöglichen. Ebenso kann es vorgesehen sein, dass die Mittel zur Änderung der Polarisation, wie beispielsweise Lamda-halbe- Platten, mittels Aktuatoren gezielt drehbar sind und dass Mittel zur relativen Phasenschiebung, wie beispielsweise Keilprismen, mittels Aktuatoren in den Strahlgang hinein- oder herausfahrbar sind.
Hierbei wird es als besonders vorteilhaft empfunden, wenn das Mikroskop eine Steuerung aufweist, insbesondere eine Softwaresteuerung, die auf einer Datenverarbeitungsanlage realisiert ist, mittels der der gewünschte Parameter, wie z. B. Polarisation, Phasen oder Justierung automatisch einstellbar sind. So kann durch einen Benutzer einfacherweise, beispielsweise mittels einer Bedienoberfläche eines Programms, eine Auswahl von Parametern vorgenommen werden, die sodann durch die übergeordnete Steuerung und die Aktuatoren automatisch eingestellt werden. Insbesondere kann eine derartige Steuerung behilflich sein, um das Interferometer hinsichtlich der gewünschten Art der Interferenz zu justieren, welches erfahrungsgemäß manuell aufwendig ist. Hierbei kann gerade eine Auswertung der bei der Justage bewirkten Interferenzmuster durch die Aufnahme mittels einer nachgeschalteten Kamera ausgewertet werden, um so zu einer optimalen Justage zu kommen.
Es besteht so auch weiterhin die Möglichkeit, mittels einer vorgenannten Steuerung einer Kamera, die bei Mikroskopanordnung vorgesehen sein kann, automatisch eine Folge von einzelnen Aufnahmen eines Objektes zu erfassen, insbesondere wobei zwischen zwei Aufnahmen eine automatische, insbesondere vorprogrammierte Änderung wenigstens eines Parameters, wie z. B. eine Änderung der Phase und eine Änderung der Polarisation vorgenommen wird. Der gesamte Messvorgang bzw. die Durchführung einer Messserie kann somit voll automatisch, insbesondere nach einer vorherigen Programmierung erfolgen, ohne dass ein Nutzer bei der Durchführung der mikroskopischen Untersuchung manuell eingreifen muss.
In einer bevorzugten Anwendung der vorgenannten Mikroskopanordnungen kann es vorgesehen sein, dass eine Justage des Interferometers derart erfolgt, dass die überlagerten Teilstrahlen außerhalb des Interferometers ein Interferenzstreifenmuster ausbilden. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass die beiden Teilstrahlen aus den Interferometerarmen unter einem leichten Winkel zueinander justiert werden, so dass sich winkelabhängig mehr oder weniger eng beieinanderliegende Interferenzstreifen ergeben.
Insbesondere bei einer Mikroskopanordnung, bei der ein Mikroskobjektiv mit einem zu betrachtenden Objekt innerhalb eines Interferometerarmes, d.h. eines Teilstrahlenweges angeordnet ist, wird es sodann zu einer lateralen Verzerrung des Interferenzstreifenmusters kommen, wenn ein Objekt in der Objektebene der Mikroskopanordnung vorhanden ist. Ist kein Objekt vorhanden, so ergeben sich bei idealer Justage der Anordnung lediglich gerade ausgerichtete Interferenzstreifen. Eine laterale Verzerrung der Interferenzstreifen kann also dahingehend ausgewertet werden, dass ein Objekt in der Objektebene vorhanden ist, wobei hier zu berücksichtigen ist, dass in idem zweiten Interferometerarm ein Referenzobjekt vorhanden ist, welches beispielsweise lediglich aus einem leeren Objektträger besteht, oder - wie vorgenannt - ein Nullbild berücksichtigt wird.
Dies Überprüfung kann auch bei einer exakt parallelen Justage der Teilstrahlen bei der Überlagerung erfolgt, wenn diese so justiert werden, dass z.B. negative Interferenz über die ganze Bildebene auftritt, wenn kein Objekt vorhanden ist. . Stört ein Objekt die Interferenz, so kommt es zu helleren Bildanteilen, was Rückschlüsse zulässt auf die Existenz eines Objektes im Objektträger. Diese Verfahren ist ebenso analog und äquivalent möglich, wenn maximal positive Interferenz einjustiert wird.
Es kann somit auf Grund dieser Erkenntnis ein Verfahren realisiert werden, bei dem beispielsweise automatisiert nacheinander Objektträger, beispielsweise mittels eines Scanverfahrens in die Objektebene eingefahren werden, um zu untersuchen, ob auf bzw. in einem Objektträger ein zu untersuchendes Objekt vorhanden ist oder ob es sich um einen leeren Objektträger handelt. So können beispielsweise automatisiert Scans durchgeführt werden, um die Belegung von Objektträgern, wie beispielsweise Mikrotiterplatten, festzustellen. Hierbei können eine Vielzahl von Objektträger z.B. auf einem Tisch angeordnet sein, der verfahrbar ist und so die Möglichkeit bietet nacheinander verschiedene Objektträger in die Objektebene des Mikroskopes zu fahren, z.B. mittels einer x-y- Schrittsteuerung.
Wird somit beispielsweise mit einer Kamera ein ungestörtes lnterferenz-(streifen) muster festgestellt, so lässt dies auf eine Nichtbelegung des Objektträgers schließen, wohingegen ein gestörtes lnterferenz-(streifen)-muster eine Belegung des Objektträgers mit einem Objekt anzeigt.
Hierbei wird es als besonders vorteilhaft empfunden, dass eine Veränderung der Interferenz selbst dann vorkommt, wenn sich ein beobachtetes Objekt nicht exakt in der Brennebene des Objektives einer Mikroskopanordnung befindet und somit keine scharfe Abbildung des Objektes bei dieser Überprüfung erfolgt. Es kann sodann ergänzend auch vorgesehen sein, dass bei der Feststellung, dass ein Objekt im Objektträger vorhanden ist, die Mikroskopanordnung hinsichtlich der Lage des Objektives durchgefahren wird, um unterschiedliche Ebenen im Objektträger, wie beispielsweise bei Mikrotiterplatten, durchzufahren und so verschiedene Ebenen des Objektträger mikroskopisch zu untersuchen, wenn eine Belegung des Objektträgers zuvor festgestellt wurde. Es können so beispielsweise automatisierte Mikroskopieuntersuchungen an beliebigen Anzahlen von Objektträgern durchgeführt werden.
Durch dieses Verfahren besteht auch die Möglichkeit, bewegte Objekte, auf oder in einem Objektträger zu verfolgen. Hierfür kann eine Rückkopplung vorgesehen sein, von einem Detektor bzw. einer Kamera zu einer Translationsvorrichtung für den Objektträger wenigstens in X-Y, bevorzugt in X-Y-Z-Ebene, um das bewegte Objekt im Sehfeld oder Fokus zu halten.
Anwendungsgebiet der erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung bzw. des Verfahrens sind beispielsweise im Bereich der Krebsforschung, Stammzellenforschung oder auch der Immunologie zu sehen. Insbesondere Proteine, die in Stammzellen oder Viren vorkommen, können mittels Interferenzeffekten und der erfindungsgemäßen Anordnung mit hohen Kontrasten nachgewiesen werden.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind den Figuren dargestellt. Es zeigen:
Fig. 1 : Eine Ausführung mit Mikroskopanordnungen in jedem
Interferometerarm
Fig. 2: Eine Ausführung wie in Figur 1 , aber nur mit einer
Mikroskopanordnung in einem der Interferometerarme
Fig. 3: Eine Ausführung mit einer Mikroskopoptik ausserhalb des
Interferometers; Fig. 4: Eine Ausführung wie in Fig. 2, aber mit zueinander verkippten
Teilstrahlengängen des Interferometers;
Fig. 5: Bilddarstellung eines Mausfibroplast
Die Figur 1 zeigt einen Mikroskopaufbau, bei dem in jedem Arm des Interferometers eine Mikroskopanordnung vorgesehen ist. Hierbei dient eine Mikroskopanordnung zur Beobachtung eines Objektes und die andere zur Berücksichtigung eines Referenzobjekts, damit die Strahlengänge in beiden Interferometerarmen bis auf das beobachtete Objekt identisch sind.
Durch die Lichtquelle 1 wird Licht erzeugt, z.B. mittels einem thermischen Leuchtmittel, wie Halogen-, Quecksilberdampf-, Xenondampf-, Natriumdampf- Leuchte oder mittels eines Lasers, wie z.B. Diodenlaser, Gaslaser, Festköperlaser, durchstimmbarer Diodenlaser, Optisch parametrischer Oszillator. Die Anwendung eines Laser hat dabei den Vorteil einer höheren Kohärenzlänge, so dass die Längenanpassung in den Interferometerarmen unkritischer ist als z.B. bei Thermischen Leuchtmitteln. Insbesondere bei letzteren wird die Länge der beiden Interferometerarme exakt identisch eingestellt, zumindest innerhalb der jeweils zu berücksichtigenden Kohärenzlänge.
Nach der Lichtquelle 1 kann im Strahlengang eine Aufweitungs- oder Kollimationsoptik 2 vorgesehen sein, z.B. ein Teleskop zum Aufweiten des Lichtbündels, z.B. der Laserstrahlung. Hierbei kann ein Raumfilter im Teleskop angeordnet sein, z.B. durch ein Pinhole im Fokus des Teleskops. Alternativ kann ein Kollektor zum Bündeln von Licht thermischer Quellen vorgesehen sein.
Im Strahlengang folgt sodann am Eingang zum Interferometeraufbau ein Strahlteiler 3, der als Strahlteilerwürfel ausgebildet sein kann mit a) polarisierender Wirkung für polarisationsoptische Messungen (Doppelbrechung und optische Aktivität im Objekt, Erzeugung des Polarisationskontrastes)) oder b) nicht polarisierender Wirkung für interferometrische Messungen (Brechungsindex, Dicke, optische Dichte, Gangunterschiede, Phasengrenzen, Erzeugung des Interferenzkontrastes und eines Interferenzstreifenmusters), insbesondere bei denen Polarisationseffekte ausgeschlossen werden sollen. Das gleiche Bauteil 3 kann am Ausgang des Interferometers zu Zusammenführung der beiden Teilstrahlen des Interferometers dienen.
Durch den Strahlteiler 3 wird der Lichtstrahl I aufgespalten in die beiden Teilstrahlen Il und III, die z.B. senkrecht zueinander polarisiert sein können, oder bei nicht polarisierenden Strahlteilern 3 keine Polarisation aufweisen. Beide Teilstrahlen Il und III durchlaufen in den Interferometerarmen bis zur Zusammenführung im In der Vorrichtung zur Strahlzusammenführung 3 am Ausgang des Interferometers dieselbe Weglänge, zumindest bis auf die Kohärenzlänge genau.
Nach der Strahlaufteilung folgt in jedem der Interferometerarme ein polarisationsoptisches Element 4, z.B. ein rotierbares, insbesondere automatisch rotierbares polarisationsoptisches Element 4 um linear oder zirkulär zu polarisieren oder um die eingestrahlte Polarisation zu drehen. Es kann sich z.B. um ein Polaroid, Polarisationsprisma (Rochon, Glen-Thomson, Wollaston,...), ein Gitter, eine Lambda-Halbe Platte, Lambda-Viertel Platte, Flüssigkristallfilter für die Messung von statistisch in der Probeverteilten doppelbrechenden oder gerichteten oder optisch aktiven Strukturen oder Ähnliches handeln. Zur richtungsunabhängigen Untersuchung können die beiden Elemente 4 in den beiden Interferometerarmen Armen gekoppelt sein, z.B. um sie simultan durchstimmen zu können.
Zur Umlenkung, um die spätere Zusammenführung der Teilstrahlen Il und III zu ermöglichen sind im Strahlengang Umlenkelemente 5 vorgesehen, z.B. 90° Umlenkspiegel, Prismen oder Oberflächenspiegel, jeweils mit Justagemöglichkeiten und/oder mit motorisierter Justagemöglichkeit (angetriebene Feingewindeschrauben). Durch die Umlenkelemente 5 lassen sich die Wellenfronten aus den beiden Interferometerarmen zueinander ausrichten, insbesondere zur Erzeugung eines Interferenzstreifenmusters. Im unteren Interferometerarm ist ein optisches Element 6 zur Einstellung der relativen Phasen zwischen den Teilstrahlen Il und III vorgesehen. Es kann sich in einer Ausführung z.B. um einen Keilkompensator aus Glaskeilen (Quarz) handeln. Mit diesem Phasenschiebenden Element 6 kann z.B. der Interferenzkontrast durch den Gangunterschied bei unpolarisierten Teilstrahlen Il und III verändert werden oder bei polarisierten Teilstrahlen Il und III der Gangunterschied, um bei der Überlagerung der Teilstrahlen Il und III am Ausgang des Interferometers eine gewünschte Polarisation einzustellen, insbesondere eine zirkuläre Polarisation. Hierzu können bei einem Keilkompensator die Keile senkrecht zur optischen Achse auseinander gezogen oder ineinander geschoben werden, damit der der Glasweg kürzer oder länger wird. Alternativ können für das Element 6 z.B. auch Pockelszellen oder , Kerrzellen eingesetzt werden.
Im oberen Arm ist ein optisches Element 7 zur Kompensation der Wegverlängerung durch das Element 6 angeordnet. Hierdurch kann z.B. der Glasweg eines Keilkompensators kompensiert werden, so dass beide Interferometerarme dieselbe effektive optische Länge haben. Das Kompensationselement 7 ist bevorzugt aus demselben Material wie das phasenschiebende Element 6 zum Erhalt der Phasenbeziehung und der Kohärenz der Teilstrahlen. Z.B. kann es aus Quarzglas sein, wenn z.B. ein Keilkompensator aus Quarzglas beim Element 6 eingesetzt wird.
In beiden Teilstrahlengängen des Interferometers folgt noch vor dem Element 3 zur Strahlzusammenführung je eine Mikroskopanordnung, umfassend einen Kondensor 10, z.B. eine Sammellinse oder Linsenanordnung zur Bündelung des Beleuchtungslichtes auf die Probe bzw. das zu beobachtende Objekt und ein Objektiv 11 , z.B. ebenfalls eine Linse oder Linsenanordnung, z.B. ein Trockenobjektiv, Wasserimmersions-, Ölimmersionsobjektiv). Diese Objektiv erzeugt ein reelles Zwischenbild hinter der Strahlzusammenführung 3, z.B. im Tubus der Mikroskopanordnung.
Zwischen Kondensor und Objektiv befindet sich im unteren Interferometerarm mit dem Teilstrahl Il ein Objektträger 8 mit einem zu beobachtenden Objekt und im oberen Teilstrahl III ein Referenzobjekt 9, welches z.B. lediglich denselben Objektträger umfassen kann, jedoch ohne Objekt. So ist sichergestellt, dass beide Teilstrahlengänge bis auf das zu untersuchende Objekt identisch sind.
Beide Teilstrahlen Il und III werden in der Anordnung zur Strahlzusammenführung 3 wieder überlagert und anschließend durch eine Optik 12, z.B. eine Linse für ein unendlich korrigiertes Mikroskop, auf einen Detektor 14 abgebildet. Der Detektor kann z.B. als Kamera mit CCD oder CMOS- Chip oder als Photomultiplier, Photodiode, Videokamera, Digitalkamera ausgebildet sein.
Vor dem Detektor 14 oder alternativ dem Okular für das Auge eines Betrachters kann eine Anordnung zur Polarisationsfilterung angeordnet sein, die z.B. eine gewünschte Polarisation filtert, d.h. blockt, z.B. kann die Anordnung so eingestellt sein, dass zirkulär oder linear polarisiertes Licht nicht passieren kann. Hierfür kann eine Kombination aus einer Lambda-Viertel-Platte 13 und eines Linear- Polarisators 4 eingesetzt werden. Ebenso kann es sich um ein Flüssigkristallfilter, insbesondere ein elektronisch programmierbares Flüssigkristallfilter oder ein Prisma handeln.
Im Strahlengang beider Teilstrahlen Il und III können je noch zwei Glasplatten 16 eingesetzt sein, um ein Wellenfrontonverkippung zu ermöglichen. Hierfür sind die Rotationsachsen bevorzugt parallel versetzt zur optischen Achse. Die Platten können zur Einstellung eines Interferenzstreifenmusters oder zur parallelen Ausrichtung der Wellenfronten dienen, und ebenso wie alle andere optischen Element motorisiert sein für eine automatische Justage und automatisierte Messung.
Die beschriebene Anordnung der Figur 1 kann wie folgt eingesetzt werden:
Die bevorzugt kohärenten, jedoch durch Auswahl des Strahlteilers 3 unpolarisierten Objekt- und Referenzwelle Il und III überlagern sich und erzeugen durch Interferenz ein Interferenzmuster, insbesondere welches bei ebener Wellenfront so eingestellt werden kann durch Phasenschiebung am Element 6, dass das Hintergrundlicht sich auslöscht. So kann ein hoher Interferenzkontrast erzeugt werden.
Phasenretardierungen in der Objektwelle II, hervorgerufen durch die Verteilung der optischen Dichte in dem zu beobachtenden Objekt 8 der Probe, erzeugen im Interferenzbild Helligkeitsunterschiede bzw. bei thermischer nicht oder weniger kohärenter Beleuchtung, insbesondere mit höherer Bandbreite charakteristische Interferenzfarben. Ein Objekt unterschiedlicher optischer Dichte (Phasenobjekt) kann auf diese Weise starken Kontrast erzeugen durch ein helles Bild vor dunklem Hintergrund. Hierbei ist vorteilhaft, dass das Objekt nicht einmal vollständig fokussiert sein muss, da die Interferenz auch ohne scharfe Objektabbildung in der Bildebene des Detektors entsteht.
Durch Polarisation von Objektwelle Il und Referenzwelle III kann bei der Überlagerung nach der Strahlzusammenführung 3 z.B. zirkulär, (bzw. linear) polarisiertes Licht erzeugt werden, welches durch die Analysatoranorndung 13/4 geblock werden kann, so dass kein Signal am Detektor bzw. nur ein dunkeles Bild an der Kamera entsteht. Alle Strukturen in der Objekt-Probe, die die Polarisation des Objektstrahles Il drehen oder die entsprechende E-Feldkomponente verkleinern, sorgen für eine Abweichung aus der ungestörten zirkulären (oder linearen) Polarisation nach der Überlagerung der Teilstrahlen. Diese gestörten Anteile der Welle können den Analysator 13/4 passieren und erzeugen ein Signal auf dem Detektor oder der Kamera.
Um alle Strukturen, deren Ausrichtungen statistisch in der Objekt-Probe verteilt sein können, polarisationsoptisch zu erfassen, ist es bevorzugt vorgesehen die Rotation der Polarisation der eingestrahlten Objektwelle Il stufenweise oder kontinuierlich zwischen 0° und 90° zu drehen. Unabhängig von der Lage der Struktur wird es somit eine Einstellung geben, in der diese Struktur ein Signal erzeugt, sofern sie polarisationsdrehend wirkt. Hierbei kann es vorgesehen sein, dass simultan mit einer Änderung der Polarisation in der Objektwelle Il auch die Polarisation in der Referenzwelle III gedreht wird, um zu gewährleisten, dass diese Polarisationen immer senkrecht zueinander stehen und immer nach der Überlagerung zirkulär polarisiertes Licht entsteht. Hierzu können die Elemente 4 zur Polarisationsdrehung in den Interferometerarmen wirkverbunden sein, z.B. durch ein 1 :1 Getriebe.
Um den Kontrast der durch die Änderung der Polarisation entsteht von dem Kontrast der durch Phasenretardierung entsteht, unterscheiden zu können, ist die Aufnahme einer Bilderserie erforderlich, bei der in jedem Bild eine andere Einstellung der relativen Phase und der relativen Polarisation vorgenommen wird. Durch Vergleich können die Kontrastarten unter Kenntnis der eingestellten Parameter unterschieden und insbesondere unterschiedlich im Bild eingezeichnet werden. Sind alle polarisierenden Strukturen und Brechungsindizes und Phasengrenzen mit einer Bilderserie erfasst, kann ein vollständiges Bild zusammengestellt werden, in welchem Brechungsindizes, Grenzen von Bereichen unterschiedlicher Dichte, gerichtete Strukturen, und Konzentrationen von optisch aktiven Substanzen deutlich und kontrastreich zu erkennen sind.
So liefert eine erfindungsgemäße Anordnung der beschriebenen Art die Möglichkeit ohne vorherige Manipulation an der Objektprobe verschiedenste Kontrast-Arten aufzunehmen, voneinander zu unterscheiden und in aufgenommenen Bilderserien unterschiedlich darzustellen, da mit ein und demselben Aufbau sowohl Polarisationseffekte als auch Phaseneffekte ausgemessen werden können.
Bei einer Ausfilterung der zirkulären Polarisation kann es auch vorgesehen sein, die Polarisation der Objektwelle Il und Referenzwelle III so einzustellen, dass die Überlagerung eine bestimmte bekannte elliptische Polarisation bildet. Bereiche im Objekt, die eine eingestellte elliptische Polarisation exakt in die zirkuläre Polarisation zurückdrehen, erzeugen dann ein Minimum im Signal. So kann auf einfache Weise festgestellt werden, um welchen Betrag der untersuchte Objektbereich die Polarisation dreht.
Z.B. mit der zu Figur 1 beschriebenen Anordnung kann auch eine Automatische Detektion von Objekten aufgrund des Interferenzkontrast erfolgen. Bei paralleler Ausrichtung der unpolarisierten Wellen Il und III nach der Überlagerung, ist der Helligkeitsunterschied im Bild, zwischen Probe und deren Umgebung so groß, daß er für eine automatische Erkennung genutzt werden kann. Mit einem Videosystem können so z.B. in der Objektprobe mobile Zellen erfasst und durch Rückkoppelung mit einem motorisierten Objektträger, bzw. Objektmanipulator oder Probenteller im Sehfeld behalten werden.
Es kann ebenso das Probenvolumen z.B. von Mikrotiterplatten automatisch daraufhin untersucht werden, ob ein Objekt im Probenvolumen enthalten ist oder nicht. Z.B. Zellen können automatisch gefunden werden, da der erzeugte Gangunterschied das Interferenzstreifenmuster auslenkt. So kann die Probe in der x-y-Ebene gefunden werden. Durch Verfahren der z-Achse bei parallelen Wellenfronten der Teilstrahlen Il und III kann die Fokusebene gefunden werden, indem nach dem größten Kontrast gesucht wird. Also der größten hellen Fläche vor einem dunklen Hintergrund, oder umgekehrt. Oder es wird die Grenze zwischen hellem und dunklem Gebiet mit dem steilsten Intensitätsanstieg gesucht, was automatisch erfolgen kann, z.B. durch eine Bildverarbeitung, beispielsweise softwaretechnisch.
Bei kohärenter Beleuchtung kann nach Aufnehmen einer Bilderserie und einem Durchstimmen der Phase durch Bildanalyse und eine mathematische Rücktransformation des Beugungsbildes aus dem Fourier- in den Realraum die relative Lage und Größe der beugenden Strukturen in drei Richtungen rekonstruiert werden.
Alle Freiheitsgrade zur Ausrichtung der Wellenfronten zueinander, zum Durchstimmen der relativen Phase der Teilstrahlen und zur Rotation der Polarisationsrichtung können bevorzugt motorisiert sein. Das Interferometer kann so mechanische und thermische Einflüsse ggfs. automatisch kompensieren und eine Justage beibehalten. Zur Aufnahme von Bilderserien werden die optischen Komponenten zur Phasenanpassung, z.B. ein Keilkompensator und zur Polarisationsdrehung beispielsweise softwaremäßig in definierte Positionen gedreht und es kann dann von jeder entsprechenden Position ein Bild erzeugt werden. Die Software enthält darüber hinaus den Algorithmus zur Aufschlüsselung der Bildinformation in Phasen und Polarisationskontrast, wobei es vorgesehen sein kann, dass die Software die Bilder optimiert zusammensetzt.
Die Figur 2 zeigt eine Alternative, bei der die Referenzmikroskopanordnung im Teilstrahl III in Entfall gekommen ist. Um hier Einflüsse in den Bildserien durch die Mikroskopoptik auszuschließen kann es vorgesehen sein, zunächst von einer Einfügung eines Objektes in das Mikroskop wenigstens ein Nullbild aufzunehmen und diese später von den aufgenommenen Bildern zu subtrahieren.
Die Figur 3 zeigt eine alternative Anordnung eines erfindungsgemäßen Mikroskops, bei dem die Mikroskopoptik ausserhalb des Interferometers angeordnet ist. Ansonsten sind oder können alle anderen Komponenten und deren Ausgestaltung, die zur Figur 1 beschrieben wurden, auch bei dieser Ausführung vorgesehen sein. Die zur Durchführung mikroskopischer Untersuchungen genannten Verfahrensmöglichkeiten, d.h. insbesondere die Interferenz-Kontrast-Mikroskopie mit unpolarisiertem Licht im Interferometer und die Polarisations-Kontrast-Mikroskopie mit polarisiertem Licht können hier genauso durchgeführt werden.
Die Figur 4 zeigt eine Abwandlung der Ausführung nach Figur 2. Auch hier sind oder können. alle zu den Figuren 1 oder 2 genannten Merkmale realisiert sein. Die Ausführung nach Figur 3 unterscheide sich von der Figur 2 dadurch, dass der Teilstrahl Il bei der Zusammenführung mit dem Teilstrahl III im Element 3 nicht parallel zueinander, sondern unter einem Winkel zueinander verlaufen.
Hierdurch ergibt sich in der Ebene des zu beobachtenden Objektes 8 ein Strahlversatz zwischen den Teilstrahlen Il und III, so dass diese unterschiedliche nebeneinanderliegende Bereich des Objektes 8 durchleuchten. Beide Teilstrahlen werden also in dem Objekt unterschiedlich hinsichtlich Phasenschiebung oder Polarisationsdrehung beeinflusst. Zwischen der Mikroskopoptik 10,11 und der Kameraoptik 12,14 kann sodann ein optisches Element 18 vorgesehen sein, mit dem der einjustierte Strahlversatz, bzw. der eingestellte Winkel zwischen den Teilstrahlen Il und III kompensiert wird, so dass die Teilstrahlen nach dem Element 18 parallel zueinander verlaufen und übereinander liegen.
Bei dem Element 18 kann es sich z.B. um ein Wollaston- oder Nomarski-Prisma handeln, welche die lateral versetzten Teilstrahlen zusammenführen können und/oder die Polarisationsrichtungen gleich zueinander ausrichten.
Mit dieser Anordnung kann ein Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskop realisiert werden, bei welchem wiederum ohne Manipulation an der Objektprobe gleichzeitig Messungen zu unterschiedlichen Phasen und Polarisationen durchgeführt werden können, wie auch bei den anderen möglichen Ausführungen, insbesondere so, wie es dort bereits beschrieben wurde. Auch hier wird ein Keilkompensator oder ein anderes Element 6 zur Phasenschiebung eingesetzt, um Polarisationskontrast vom Phasenkontrast in den aufgenommenen Bilder oder gemessenen Daten unterscheiden zu können.
Um bei der Justage zugehörige Wellenanteile miteinander zu Überlagern, insbesondere die Winkeleinstellung zwischen den Teilstrahlen Il und III an den Versatz anzupassen, der durch das Element 18 erzeugt wird, kann es vorgesehen sein, ein Maske 17, z.B. ein optisches Gitter 17 vor dem Eingang in das Interferometer vorzusehen. So werden beide Teilstrahlen mit dem Muster der Maske über den Querschnitt intensitätsmoduliert und es besteht die Möglichkeit die Teilstrahlen exakt zu justieren, z.B. durch Verkippung des Element 5 im unteren Interferometerarm, wenn die Muster der beiden Teilstrahlen nach dem Element 18 exakt zur Deckung kommen.
Die Figur 5 zeigt zur Verdeutlichung die Unterschiede zwischen üblicher Amplituden-Kontrast-Mikroskopie und der Interferenz-Mikroskopie nach der Erfindung.
Erkennbar ist in der linken oberen Darstellung der Figur 4 ein Mausfibroblast in normaler Durchlicht-Amplitudenmikroskopie. Die Darstellung zeigt wenig Kontrast und die Zellstrukturen sind somit nur ungenau zu erkennen. Aufnahmen mit der erfindungsgemäßen Anordnung und dem erfindungsgemäßen Verfahren zeigen die Bilder mittig und rechts in nullter Interferenzordnung, in der Phase zwischen den beiden Bildern um Pi verschoben.
Deutlich ist im mittleren Bild ein heller Zellbereich und im rechten Bild derselbe Zellbereich in dunkler Darstellung zu erkennen, der einen optisch aktiven Bereich kennzeichnet, der also entweder polarisationsdrehend oder phasenschiebend wirkt, so dass weitere Rückschlüsse auf diesen Bereich gezogen werden können, die sich aus der reinen Amplituden-Kontrast-Mikroskopie nicht ergeben.

Claims

BO 660205 16.08.2006Patentansprüche
1. Mikroskop zur Durchlichtuntersuchung von Objekten mit einem Strahlengang zwischen einer Beleuchtungsvorrichtung und einer Vorrichtung zur Betrachtung/Erfassung eines Objektbildes, insbesondere einer Kamera, dadurch gekennzeichnet, dass im Strahlengang ein Interferometer angeordnet ist, welches Mittel zur Veränderung der Polarisation (4) und davon unabhängige Mittel zur Veränderung der relativen Phase (6) in wenigstens einem der Teilstrahlen (II) des Interferometers aufweist.
2. Mikroskop nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass eine Mikroskopoptik (10,11) zur Erzeugung eines Abbildes eines Objektes ausserhalb des Interferometers nach einer Anordnung zur Strahlzusammenführung (3) angeordnet ist.
3. Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilstrahlen (II, III) aus den Interferometerarmen in der Vorrichtung zur Strahlzusammenführung (3) unter einem Winkel ungleich Null überlagert sind zur Ausbildung eines Strahl Versatzes in der Ebene des zu beobachtenden Objektes (8) , wobei im Strahlengang nach dem Objekt eine Vorrichtung (18) zur Kompensation des Strahlversatzes angeordnet ist.
4. Mikroskop nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es, insbesondere zur Justage, nach der Beleuchtungsvorrichtung (1) und vor dem Interferometer ein zumindest temporär angeordnetes Maskenelement (17) umfasst, welches einen von der Beleuchtungsvorrichtung (11) emittierten Lichtstrahl über dessen Querschnitt räumlich in der Intensität moduliert.
5. Mikroskop nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in beiden Teilstrahlengängen (II, IM) des Interferometers vor einer Strahlzusammenführung (3) jeweils eine Mikroskopoptik (10,11) angeordnet ist, wobei in eine Mikroskopoptik (11 ,10) ein zu beobachtendes Objekt (8) und die andere Mikroskopoptik (10,11) ein Referenzobjekt (9) einsetzbar ist.
6. Mikroskop nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur Veränderung der Polarisation (4) in beiden Teilstrahlen (II, III) angeordnet sind, insbesondere wobei die Mittel derart wirkverbunden sind, dass eine Änderung der Polarisation um einen bestimmten Betrag in einem der Teilstrahlen (II) eine Änderung der Polarisation um den gleichen Betrag in dem anderen Teilstrahl (III) bewirkt.
7. Mikroskop nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteiler (3) am Eingang des Interferometers für beide Teilstrahlen (II, III) polarisierend ausgebildet ist, insbesondere wobei dieser Strahlteiler (3) durch einen Verschiebemechanismus durch einen nicht polarisierend wirkenden Strahlteiler (3) ersetzbar ist.
8. Mikroskop nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach einer Anordnung zur Strahlzusammenführung (3) am Ausgang des Interferometers und vor einer Vorrichtung (15) zur Betrachtung / Erfassung eines Objektsbildes eine Vorrichtung (13,4) zur Filterung einer einstellbaren Polarisation angeordnet ist, insbesondere wobei die Vorrichtung (13,4) eingestellt ist eine zirkuläre Polarisation auszufiltern.
9. Mikroskop nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Elemente (3,5,10,11 ,16) zur Beeinflussung des Strahlenganges und/oder die Mittel zur Änderung der Polarisation (4) und/oder die Mittel zur Änderung der relativen Phase (6) und /oder übrige verstellbare optische Elemente mittels jeweils wenigstens einem Aktuator justierbar sind.
10. Mikroskop nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Steuerung, insbesondere eine Softwaresteuerung umfasst, mittels der gewünschte Parameter, insbesondere eine Justage auf gewünschte Parameter automatisch einstellbar ist/sind.
11. Mikroskop nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass mittels der Steuerung und einer Kamera (15) automatisch eine Folge von einzelnen Aufnahmen eines Objektes erfassbar ist, insbesondere wobei zwischen zwei Aufnahmen eine automatische, insbesondere vorprogrammierte Änderung wenigstens eines Parameters erfolgt.
12. Mikroskop nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsvorrichtung (1 ) als Laser ausgebildet ist.
13. Verfahren zur Durchlichtmikroskopie von Objekten, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlengang zwischen einer Beleuchtungsvorrichtung (1) und einer Vorrichtung (15) zur Betrachtung/Erfassung eines Objektbildes durch ein Interferometer (II, III) führt, wobei wenigstens ein Abbild eines Objektes, insbesondere eine Serie von Abbildern mittels einer Kamera (15) aufgenommen wird, insbesondere in Abhängigkeit von einer Lage der Polarisation und/oder der Phase des Lichtes in wenigstens einem der Teilstrahlen (II, III) des Interferometers.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste Serie von Abbildern aufgenommen wird, bei der zwischen der Aufnahme zweier Abbilder die Polarisation in wenigstens einem der Teilstrahlen (II) geändert wird und eine zweite Serie, bei der zwischen der Aufnahme zweier Abbilder die relative Phase in wenigstens einem der Teilstrahlen (II) geändert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Serie mit in den Teilstrahlen (II, III) des Interferometers unpolarisiertem Licht aufgenommen wird.
16. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass in beiden Teilstrahlen (II, III) gleichzeitig die Polarisation geändert wird zur Beibehaltung einer zirkulären Polarisation der überlagerten Teilstrahlen am Ausgang des Interferometers, so dass ein innerhalb eines Teilstrahls (II, III) angeordnetes Objekt mittels Licht von unterschiedlicher linearer Polarisation beleuchtet wird.
17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass zur Anpassung der Verkippung der beiden Teilstrahlen (M1 III) in der Vorrichtung zur Strahlzusammenführung (3) an eine Vorrichtung (18) zur Kompensation der Verkippung vor dem Interferometer ein Maskenelement (17) angeordnet wird und nach der Vorrichtung zur Kompensation der Verkippung (18) die realen Bilder oder Fourierbilder des Maskenelementes (17) in beiden Teilstrahlen (II, III) aufeinander justiert werden, insbesondere entweder durch eine Änderung der Verkippung oder eine Änderung an der Vorrichtung (18) zur Kompensation.
18. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Justage des Interferometers derart erfolgt, das die überlagerten Teilstrahlen (II, III) ausserhalb des Interferometers ohne ein Objekt ein definierte Interferenzmuster, insbesondere ein Interferenzstreifenmuster ausbilden.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass aus einer Änderung des Interferenzmusters, insbesondere einer zumindest teilweisen lateralen Verzerrung des Interferenzstreifenmusters auf das Vorhandensein eines Objektes in der Objektebene geschlossen wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass mittels eines automatisierten Scannens nacheinander Objektträger in die Objektebene gefahren werden, um eine Information zu erhalten, ob ein Objektträger ein Objekt umfasst oder nicht.
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