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WO2008009868A2 - Procedes et outils pour la therapie de pathologies neurodegeneratives - Google Patents

Procedes et outils pour la therapie de pathologies neurodegeneratives Download PDF

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WO2008009868A2
WO2008009868A2 PCT/FR2007/051706 FR2007051706W WO2008009868A2 WO 2008009868 A2 WO2008009868 A2 WO 2008009868A2 FR 2007051706 W FR2007051706 W FR 2007051706W WO 2008009868 A2 WO2008009868 A2 WO 2008009868A2
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WO
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sappalpha
pyrazolo
sample
treatment
pyridine
Prior art date
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PCT/FR2007/051706
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WO2008009868A3 (fr
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Fabien Schweighoffer
Laurent Desire
Jérôme BOURDIN
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Original Assignee
ExonHit Therapeutics SA
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Publication date
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Priority to US12/309,492 priority patent/US20090317842A1/en
Priority to EP07823624A priority patent/EP2047277A2/fr
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to compositions and methods for the treatment of neurodegenerative pathologies in which cognitive functions are impaired, as observed in Alzheimer's disease. More particularly, the invention presents a strategy for monitoring in human clinical the activity and / or the efficacy of neuroprotective treatments, based on the biochemical assay of certain platelet parameters, and therefore achievable from blood samples. The invention also relates to methods, tools, constructions and compositions adapted to the implementation of these strategies.
  • Alzheimer's disease is the leading cause of dementia and the most common neurodegenerative disease. This progressive disease is characterized by memory loss and impaired language, orientation and judgment skills. Examination of the brains of patients with this disease reveals a loss of neurons from the hippocampus, an important center of memory, and the cerebral cortex, involved in reasoning, language and memory. Cholinergic neurons are particularly affected by this depletion.
  • a major abnormality observed in the brains of patients with Alzheimer's disease is the accumulation of intracellular and extracellular aggregates of proteins.
  • Other intracellular, fibrous neuro aggregates of tau protein appear to correlate well with the severity of dementia.
  • the A ⁇ peptide is a fragment of 40/42 residues that is produced in the amyloidogenic pathway via sequential cleavage of the APP protein by two proteases called ⁇ -secretase (BACE) and ⁇ -secretase (presenilins).
  • BACE ⁇ -secretase
  • Presenilins ⁇ -secretase
  • the sequence of the A ⁇ peptide is located at the junction between the intramembrane and extracellular domains of APP.
  • APP is cleaved in the A ⁇ domain by an ⁇ -secretase between amino acids 16 (Lys) and 17 (Leu) of the A ⁇ region, generating the soluble APP part ⁇ (sAPP ⁇ , 105- 125 kDa, residues 1-688 of the APP770 form) released into the extracellular medium and a fragment retained at the membrane (containing part of the transmembrane domain and the intracellular C-terminal portion) called C83 (10 kDa), itself cleaved by the ⁇ -secretase to generate the APP IntraCellular Domain peptide (AICD) and the P3 peptide (3 kDa).
  • AICD IntraCellular Domain peptide
  • ⁇ -secretase thus prevents not only the formation of the amyloid peptide, but also stimulates the generation of the large N-terminal extracellular fragment (ectodomain) of APP.
  • the N-terminal soluble fragments of APP generated by ⁇ -secretase, or sAPP ⁇ are constitutively released into the vesicular lumen and the surface of the cell.
  • Such APP species are secreted, in vitro, into the culture medium conditioned by the cells expressing APP, and are found in vivo in plasma and cerebrospinal fluid.
  • G-protein coupled receptors such as P2Y2 nucleotide receptors, PACAP PAC1 receptor, or receptors of various neuro-receptors.
  • transmitters such as muscarinic receptors, the metabotropic glutamate receptor or the serotonin receptors (ref iii for review).
  • Neurotransmitter-stimulated pathways involve protein kinase C (PKC) and phospholipase C, as well as MAP kinases, well described in the literature as modulators of sAPP ⁇ production, such as the stimulation of PKC-dependent pathways by phorbol esters or with serotonin 5-HT2a and 2c receptor agonists.
  • PKC protein kinase C
  • MAP kinases well described in the literature as modulators of sAPP ⁇ production, such as the stimulation of PKC-dependent pathways by phorbol esters or with serotonin 5-HT2a and 2c receptor agonists.
  • Other routes involve the serotonin 5-HT (4) receptor, known to play a role in cognition and memory, via the production of cAMP and the recruitment of GTPase Racl or inhibitors of acetylcholine acting via PKC and / or MAP-kinases, estrogens such as 17 ⁇ -estradiol or testosterone.
  • PKA cAMP-protein kinase A
  • a PKC / MAP -kinase pathway such as forskolin
  • nonsteroidal anti-inflammatory agents such as inhibitors of cyclooxygenase COX (Ibuprofen), statins inhibiting HMG-CoA reductase (lovastatin), derivatives of rasagiline or polyphenols such as (-) - epigallocatechin-3-gallate.
  • the present invention provides a rationale for the use of pharmacological agents such as pyrazolopyridine-containing chemicals, including etazolate, to stimulate the production of the sAPP ⁇ fragment.
  • the present invention also describes the link between the increase in sAPPalpha production and the ability of etazolate to inhibit ROS ("Reactive Oxygen Species") effects, i.e., oxidative stress. .
  • ROS reactive Oxygen Species
  • This phenomenon of oxidative stress plays an essential role in several aspects of Alzheimer's disease: not only neuronal degeneration and astrocytic inflammation but also activation and platelet aggregation. These latter phenomena participate in the vascular complications of Alzheimer's disease and are at the origin of vascular dementia.
  • the present invention makes it possible to propose, for the first time, the measurement of any biological phenomenon related to activation or platelet aggregation for clinical or therapeutic monitoring of the efficacy of neuroprotective compounds.
  • the ability to generate Abeta and sAPPalpha peptides from APP is shared by the nervous system and platelets. Therefore, the inhibitory action of etazolate on oxidative stress resulting in increased production of sAPPalpha, the present invention provides a rational for tracking the action of etazolate on APP maturation from platelet samples or more generally blood samples.
  • the present invention also claims the measurement of any biological phenomenon related to activation or platelet aggregation for clinical or therapeutic monitoring of the efficacy of any compound of the pyrazolopyridine family.
  • this invention allows to claim the measurement of any modification of the maturation of APP in the blood, including the assay of sAPPalpha, from blood samples or platelet preparations to ensure the clinical and therapeutic follow-up of the efficiency of any compound of the pyrazolopyridine family.
  • an object of the invention resides in a method for evaluating or monitoring the efficacy of a neuroprotective treatment in a mammal, comprising a step of measuring (preferably in vitro or ex vivo) the production of sAPPalpha in a sample of the mammal receiving said treatment, said sample containing platelets, the production of sAPPalpha being an indication of the efficacy of the treatment.
  • Another object of the invention resides in a method for the immunological assay of sAPPalpha in a sample, comprising a step of heat treatment of the sample (to unmask sAPPalpha), and an immunoassay step.
  • the method is suitable for assaying sAPPalpha from any sample, including blood or blood derived samples (serum, platelets, etc.), other biological fluids.
  • the sample can be pre-treated, especially by dilution, enrichment, filtration, etc.
  • neuroprotective treatment is understood to mean any treatment that can be used or used in the treatment of diseases affecting the nervous system, in particular neurodegenerative diseases.
  • diseases affecting the nervous system in particular neurodegenerative diseases.
  • a compound of the pyrazolopyridine family advantageously denotes any compound of the following formula (I), which may or may not be substituted, at any of the positions.
  • the compounds of the pyrazolopyridine family used in the present invention are in particular chosen from the following compounds:
  • the neuroprotective compound is chosen from etazolate, tracazolate or cartazolate, more preferably etazolate.
  • the modulating agent of GABA can be any chemical compound, of natural or synthetic origin, in particular an organic or inorganic molecule, of plant, bacterial, viral, animal, eukaryotic, synthetic or semi-synthetic origin, capable of modulate the expression or activity of free radicals (ROS).
  • ROS free radicals
  • the compounds or treatments used in the context of the present invention can be formulated and administered in different ways.
  • the administration can be carried out by any method known to those skilled in the art, preferably orally or by injection, systemic or local.
  • the injection is typically performed intra-ocularly, intraperitoneally, intra-cerebrally, intravenously, intra-arterially, subcutaneously or intramuscularly. Oral or systemic administration is preferred.
  • the doses administered may be adapted by those skilled in the art. Typically from about 0.01 mg to about 100 mg / kg are injected for compounds of a chemical nature. Particular unit dosages are for example 0.5 to 40 mg per administered dose. It is understood that repeated injections may be performed, optionally in combination with other active agents or any pharmaceutically acceptable carrier (eg, buffers, saline, isotonic, in the presence of stabilizing agents, etc.).
  • any pharmaceutically acceptable carrier eg, buffers, saline, isotonic, in the presence of stabilizing agents, etc.
  • the pharmaceutically acceptable carrier or excipient may be selected from buffer solutes, solvents, binders, stabilizers, emulsifiers, and the like.
  • Buffer or diluent solutes include calcium phosphate, calcium sulfate, lactose, cellulose, kaolin, mannitol, sodium chloride, starch, powdered sugar and hydroxy propyl methyl cellulose (HPMC) (for delayed release).
  • Binders are, for example, starch, gelatin and filling solutes such as sucrose, glucose, dextrose, lactose, etc. Natural or synthetic gums can also be used, such as alginate, carboxymethylcellulose, methylcellulose, polyvinyl pyrrolidone, etc.
  • excipients are, for example, cellulose and magnesium stearate.
  • Stabilizers may be included in the formulations, such as for example polysaccharides (acacia, agar, alginic acid, guar gum and tragacanth, chitin or its derivatives and cellulose ethers).
  • Solvents or solutes are, for example, Ringer's solution, water, distilled water, phosphate buffers, phosphated salt solutions, and other conventional fluids.
  • the invention indeed shows that neuroprotective compounds are capable of inducing the production of sAPPalpha in platelets.
  • the efficacy of the treatment can be evaluated and monitored by a sAPPalpha assay in any sample containing platelets.
  • the biological sample is a sample of blood or blood derivative.
  • blood sample is meant any sample of blood treated, for example by dilution, filtration, purification, etc., for example to enrich the sample in platelets, to eliminate other cell populations, inactivate potential pathogens, calibrate a dosage, etc.
  • the above method is applicable to all mammals, preferably in humans, particularly those with neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, ALS, Huntigton's disease, etc.
  • the specificity of the antibodies can then be confirmed by determining the antibody binding assays to the entire APP protein and / or to other peptides derived from the APP protein, such as the C83 fragment, the AICD peptide and the P3 peptide.
  • antibodies capable of specifically binding sAPPalpha and incapable of specifically binding the C 83 fragment, the AICD peptide and the P3 peptide are used.
  • the "specificity" of binding indicates that binding to sAPPalpha can be discriminated from eventual binding to other proteins or peptides.
  • the method of measuring the production of sAPPalpha can involve an ELISA technique, RIA, the use of substrates coated with specific antibodies, magnetic beads, columns, several antibodies (capture antibodies and revealing antibodies), etc. In a preferred manner, an ELISA type test is used.
  • measured sAPPalpha production is compared to a baseline or a measured value prior to treatment, or at an earlier stage of treatment, in said mammal.
  • a baseline or a measured value prior to treatment or at an earlier stage of treatment, in said mammal.
  • the inventors have developed an improved immunoassay method for sAPPalpha, applicable to any sample.
  • the method relies in particular on a sample processing step, making it possible to unmask (and thus make available) specific epitopes of the sAPPalpha soluble fragment.
  • the results presented by the inventors show that, without a suitable protocol, sAPPalpha can not be detected in a quantifiable and specific manner in ELISA.
  • another object of the invention resides in a method for the immunological assay of sAPPalpha in a sample, comprising a step of heat treatment of the sample (to unmask epitopes of sAPPalpha), and an immunoassay step.
  • the method is suitable for assaying sAPPalpha from any sample, including blood or blood derived samples (serum, platelets, etc.), other biological fluids, culture supernatants.
  • the sample can be pre-treated, especially by dilution, enrichment, filtration, etc.
  • the heat treatment step comprises a treatment of the sample at a temperature between 60 0 C and 70 0 C, for a period of time sufficient to unmask epitopes of sAPPalpha, typically for a period of time between 30 seconds and 10 minutes, approx.
  • a treatment of the sample at a temperature between 60 0 C and 70 0 C, for a period of time sufficient to unmask epitopes of sAPPalpha, typically for a period of time between 30 seconds and 10 minutes, approx.
  • the immunoassay can be carried out by various techniques known per se, such as in particular ELISA, with any reagent specific for sAPPalpha, in particular any specific antibody as described above.
  • ELISA ELISA
  • any reagent specific for sAPPalpha in particular any specific antibody as described above.
  • antibodies or kits are commercially available, such as the ELISA APP kit, sold by Sigma or Biosource, or certain antibodies specific for sAPP ⁇ (at the level of the cleavage of APP) or recognizing sAPP ⁇ and 'APP:
  • monoclonal antibody 6E10 (specific for sAPP ⁇ )
  • monoclonal antibody 2B3 (included in the IBL kit for the detection of sAPP ⁇ ), specific for sAPP ⁇
  • Polyclonal polyCl 1 (Upstate / Millipore, Cat # AB5368, produced by Chemicon)
  • an object of the invention resides in the use of a compound selected from pyrazolopyridines and GABA (A) receptor modulating agents for the preparation of a medicament for stimulating or inducing the production of sAPPalpha by platelets in a mammal.
  • a compound selected from pyrazolopyridines and GABA (A) receptor modulating agents for the preparation of a medicament for stimulating or inducing the production of sAPPalpha by platelets in a mammal.
  • the invention also relates to the use of a compound selected from pyrazolopyridines and GABA (A) receptor modulating agents for the preparation of a medicament for reducing the risk of thrombus formation in a mammal.
  • a compound selected from pyrazolopyridines and GABA (A) receptor modulating agents for the preparation of a medicament for reducing the risk of thrombus formation in a mammal.
  • the invention also relates to the use of a compound selected from pyrazolopyridines and GABA (A) receptor modulating agents for the preparation of a medicament for reducing vascular complications in patients with neurodegenerative diseases.
  • a compound selected from pyrazolopyridines and GABA (A) receptor modulating agents for the preparation of a medicament for reducing vascular complications in patients with neurodegenerative diseases.
  • the invention further relates to the use of a compound selected from pyrazolopyridines and GABA (A) receptor modulating agents for the preparation of a medicament for inhibiting platelet aggregation in a mammal, particularly in patients suffering from neurodegenerative diseases.
  • a compound selected from pyrazolopyridines and GABA (A) receptor modulating agents for the preparation of a medicament for inhibiting platelet aggregation in a mammal, particularly in patients suffering from neurodegenerative diseases.
  • Figure 8 Effect of etazolate on amyloid peptide toxicity and effect of GABA A receptor inhibitors on etazolate-induced neuroprotection.
  • Figure 9 Effect of alpha secretase inhibitors on etazolate-induced neuroprotection.
  • Figure 10 Effect of an anti-sAPP ⁇ neutralizing antibody on etazolate-induced neuroprotection.
  • the soluble fragment of APP (sAPP ⁇ ) circulating in the blood is derived from platelet cells and associated ⁇ -secretase activity. It has been shown to decrease with age and during the pathophysiological process of Alzheimer's disease (AD).
  • the sAPP ⁇ circulating in the blood can therefore be considered as a bio-marker for monitor the changes in the processing of APP that occur with age and during the pathophysiological process of Alzheimer's disease and that can be corrected after taking medication.
  • the method described below was developed in order to unmask and make accessible the specific epitope of the sAPP ⁇ soluble fragment for high affinity antibody-antigen detection according to the ELISA double sandwich technique.
  • sAPP ⁇ can not be detected in a quantifiable and specific manner by ELISA.
  • the serum alone without prior treatment shows a detection of sAPP ⁇ which is very clearly quantifiable (3.5 ng / mL), but which does not seem to be additive to the added recombinant sAPP ⁇ (+10 ng / mL), whereas the same amount of sAPP ⁇ added shows detection (8.7 ng / mL) around the expected amount (10 ng / mL).
  • ELISA detection in pure serum without any particular treatment does not seem to be specific to soluble and circulating sAPP ⁇ .
  • the serum samples are initially diluted in Dulbecco's phosphate buffered saline buffer (PBS) pH 7.4 (Sigma # D8537), 5% BSA, 0.05% Tween-20.
  • the diluted samples are then heat-treated at 66 ° C for 10 minutes and then cooled to 4 ° C.
  • the recovery (expressed in% of the expected value) of the recombinant sAPP ⁇ in the serum with 3 increasing amounts is within acceptable limits 100% ⁇ 25%.
  • the FDA defines the performance criteria for ELISA assays applied to diagnostic procedures in the US Food And Drug Administration Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation, May 2001.
  • the following documents specify the criteria for acceptance and validation of immunoassays.
  • Stably transfected HEK293 cells overexpressing human APP were maintained in modified Eagle medium containing Earle salt and supplemented with 10% fetal calf serum (FBS), 2mM L-glutamine (Sigma, Lyon, France). ), IX Non Essential Amino Acids and antibiotics.
  • FBS fetal calf serum
  • 2mM L-glutamine Sigma, Lyon, France
  • IX Non Essential Amino Acids antibiotics.
  • the cells were treated 48 hours after plating on 10cm plates with varying concentrations of the indicated molecules, or with DMSO as the vehicle, for 24 hours.
  • SAPPalpha was measured by ELISA and Western blot using commercially available antibodies.
  • Example 3 Etazolate stimulates the production of sAPPalpha by cortical neurons SAPPalpha production was measured on cortical neurons isolated from 17-day-old Wistar rat embryos.
  • Cells are obtained from cortical structures that are dissected in a solution containing 0.25% trypsin. The dissociated cells are seeded at the density of 500,000 per cm 2 in Neurobasal medium containing additives (IX B27, 2mM L-glutamine, 0.6% glucose, antibiotics and antimycotics as well as 2% horse serum) in culture dishes coated with 6 ⁇ g / ml of polyornithine The cells are maintained at 37 ° C. and 5% CO 2.
  • additives IX B27, 2mM L-glutamine, 0.6% glucose, antibiotics and antimycotics as well as 2% horse serum
  • the cells are treated with 5 ⁇ M AraC (5 Cytosine arabinofuranoside) as antimitotic. After 4 days in vitro, half of the medium is changed with medium without horse serum and the culture is maintained for ripening in this medium for 7 to 10 days.
  • AraC Cytosine arabinofuranoside
  • the sAPPalpha was measured by Western blot using commercially available antibodies after medium change and accumulation in fresh medium for 24 hours. The quantifications were performed from densitometry analyzes of the scanned autoradiographic images. As shown in Figure 6, etazolate (0.2 and 2 ⁇ M for 24h) stimulates the release of sAPPalpha from cortical neurons. The results presented are the mean ⁇ SEM of three independent experiments performed in duplicate and are expressed as the percentage of control (untreated cultures).
  • sAPPalpha The production of sAPPalpha has been studied in vivo in guinea pigs, a physiological model of APP processing in the brain.
  • Etazolate or vehicle physiological saline
  • the cortex was homogenized at 4 ° C. in a Tris base solution of 20 mM.
  • Soluble sAPPalpha was measured by a test ELISA and normalized results compared to the amount of protein present in the extracts.
  • Figure 7 shows the increase in the amount of sAPPalpha measured in the brains of animals treated with etazolate, compared to the control animals treated with the vehicle.
  • the etazolate-induced three-fold increase is statistically highly significant (***: p ⁇ lE-4 according to the Wilcoxon test).
  • Example 5 The neuroprotective effect of etazolate requires the production of sAPPalpha in vivo
  • the A ⁇ 25-35 peptide contains the neuro-toxic fragment of the amyloid peptide and is a tool conventionally used to study the neuroprotective effects of compounds.
  • the 7-10 day old neuronal cultures are changed with fresh culture medium and treated with the etazolate inhibitor compound, six hours before the addition of the amyloid A ⁇ 25-35 peptide at the concentration of 33.5 ⁇ M. In a conventional and reproducible manner, this concentration generates 30 to 40% toxicity in neuronal cultures.
  • sAPP ⁇ has neurotrophic and neuroprotective properties, particularly against amyloid peptide in vitro and in vivo, suggesting that etazolate could mediate its neuroprotective effects via the alpha secretase pathway.
  • an anti-sAPP ⁇ neutralizing antibody (3E9 antibody) and alpha secretase inhibitors are used respectively.
  • the antibody 3E9 5 ⁇ g / ml is added to the cortical cells at the same time as etazolate.
  • Furin Inhibitor I compound Two alpha inhibitors secretases, the Furin Inhibitor I compound (Hwang EM, Kim SK, Sohn JH, Lee JY, Kim Y, YS Kim, Mook-Jung I. Furin is an endogenous regulator of alpha-secretase associated processing APP., Biochem Biophys Res Commun 2006 Oct. 20; 349 (2): 654-9) and TAPI (Slack BE, Ma LK, Seah CC.) Constitutive shedding of the amyloid precursor protein ectodomain is up-regulated by tumor necrosis factor-alpha converting enzyme. 2001 Aug 1; 357 (Pt 3): 787-94) are used pretreatment one hour before the addition of the etazolate.
  • Toxicity is measured using the MTT test. After incubation with the compounds, MTT is added at a final concentration of 0.5 mg / ml per well. The plates are then incubated for 30 minutes at 37 ° C. in the dark. The medium is aspirated and the crystals are resuspended in 500 ⁇ l of DMSO (dimethylsulfoxide). The absorbance at 550 nm is read and the percentage of viability is calculated.
  • FIG. 8 a dose-dependent protective effect is observed (FIG. 8) with in particular 90% of cell viability obtained for the dose of 0.2 ⁇ M.
  • This effect is blocked by the use of the three GABA A receptor inhibitory agents and the statistical analysis indicates that this effect is largely significant (p ⁇ le-4 with the Wilcoxon test after comparison 0.2 ⁇ M EHT 0202 versus 0.2 ⁇ M microM EHT 0202 plus antagonists).
  • the results correspond to the averages +/- wk of seven independent experiments.
  • Figures 9 and 10 show results obtained with etazolate on cortical neurons in the presence of inhibitors of the production of sAPP ⁇ or its activity.
  • the results presented show that etazolate achieves a protective effect on these cells which is inhibited by treatment with two alpha secretase inhibitors, Furin Inhibitor I and TAPI (FIG. 9).
  • Furin Inhibitor I and TAPI two alpha secretase inhibitors
  • FIG. 10 shows that the etazolate-induced neuroprotection requires the production of sAPP ⁇ , since the neuroprotective effect of etazolate is lost when an anti-sAPP ⁇ neutralizing antibody is added to the culture medium.
  • the present invention documents the neuroprotective effect of etazolate on amyloid peptide-induced toxicity as acting via the GABA A receptor. This neuroprotective effect is associated with the activation of the alpha secretase pathway and the production of sAPP ⁇ .

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Abstract

La présente invention concerne des compositions et méthodes pour le traitement de pathologies neurodégénératives dans lesquelles les fonctions cognitives sont altérées, comme observé dans la maladie d'Alzheimer. Plus particulièrement, l'invention présente une stratégie pour suivre en clinique humaine l'activité et/ou l'efficacité de traitements neuro-protecteurs, basée sur le dosage biochimique de certains paramètres des plaquettes, plus particulièrement la forme APP soluble alpha (sAPPalpha) de la protéine précurseur amyloïde, et donc réalisable à partir de prélèvements sanguins. L'invention concerne également des méthodes, outils, constructions et compositions adaptées à la mise en oeuvre de ces stratégies.

Description

PROCEDES ET OUTILS POUR LA THERAPIE DE PATHOLOGIES NEURODEGENERATIVES
La présente invention concerne des compositions et méthodes pour le traitement de pathologies neurodégénératives dans lesquelles les fonctions cognitives sont altérées, comme observé dans la maladie d'Alzheimer. Plus particulièrement, l'invention présente une stratégie pour suivre en clinique humaine l'activité et/ou l'efficacité de traitements neuro -protecteurs, basée sur le dosage biochimique de certains paramètres des plaquettes, et donc réalisable à partir de prélèvements sanguins. L'invention concerne également des méthodes, outils, constructions et compositions adaptées à la mise en œuvre de ces stratégies.
La maladie d'Alzheimer représente la principale cause de démence et la maladie neurodégénérative la plus fréquente. Cette maladie, d'évolution progressive, est caractérisée par la perte de mémoire et par une dégradation des aptitudes au langage, à l'orientation et au jugement. L'examen de cerveaux de patients atteints de cette maladie révèle une perte de neurones de l'hippocampe, centre important de la mémoire, et du cortex cérébral, impliqué dans le raisonnement, le langage et la mémoire. Les neurones cholinergiques sont particulièrement affectés par cette déplétion.
Une anomalie majeure observée dans les cerveaux des malades atteints de la maladie d'Alzheimer est l'accumulation d'agrégats intracellulaires et extracellulaires de protéines. Des plaques séniles formées par agrégation intra et extracellulaire de peptide beta-amyloïde (Aβ), résultant du clivage de l'APP (Amyloid Precursor Protein), caractérisent des régions d'altérations impliquant des neurones et des cellules gliales. D'autres agrégats intracellulaires, neuro fibrillaires, de la protéine tau semblent bien corrélés avec la gravité de la démence.
Les études génétiques menées sur les formes familiales ont montré que 4 gènes sont associés au développement de la maladie. L'APP, les présénilines 1 et 2 (PSl et PS2) et l'apo lipoprotéine E (Apo E). Bien que des mutations ou polymorphismes dans chacun de ces gènes aboutissent à une production accrue de peptide Aβ, les mécanismes qui président aux pertes synaptiques et neuronales restent mal connus. Plusieurs hypothèses et mécanismes semblent ainsi coexister, qui impliquent des phénomènes tels que le stress oxydatif, qui peut être induit notamment par le peptide Aβ, les phénomènes inflammatoires et immunitaires ou encore les défauts d'hormones sexuelles, les défauts d'insuline et l'hypothyroïdisme. D'autres hypothèses soulignent le rôle des modifications des influx de calcium et de l'excito toxicité. Toutefois, aucun élément ne permet de rentre compte de la vulnérabilité particulière des neurones cholinergiques. Les traitements actuellement disponibles, basés sur l'utilisation d'inhibiteurs d'acétylcholinestérase, ne font qu'améliorer de façon transitoire les fonctions cognitives des patients et ne représentent pas une approche thérapeutique susceptible de ralentir la progression de la maladie d'Alzheimer et encore moins de la guérir.
Si de récentes observations soulignent la possibilité d'intervenir pharmacologiquement par des approches d'immunothérapie dirigée contre le peptide Aβ, il est encore plus pertinent de cibler directement les sécrétases qui sont les protéases impliquées dans le métabolisme de l'APP et la production du peptide Aβ.
Le peptide Aβ est un fragment de 40/42 résidus qui est produit, dans la voie amyloïdogénique, via un clivage séquentiel de la protéine APP par deux protéases appelées β-secretase (BACE) et γ-secretase (présénilines). La séquence du peptide Aβ est localisée à la jonction entre les domaines intramembranaire et extracellulaire de l'APP. Dans la voie non- amyloïdogénique, l'APP est clivé dans le domaine Aβ par une α-secretase entre les acides aminés 16(Lys) et 17(Leu) de la région Aβ, générant la partie APP soluble α (sAPPα, 105-125 kDa, résidus 1-688 de la forme APP770) relarguée dans le milieu extracellulaire et un fragment retenu à la membrane (contenant une partie du domaine transmembranaire et la partie intracellulaire C terminale) appelé C83 (10 kDa), lui-même clivé par la γ-secrétase pour générer le peptide « APP IntraCellular Domain » (AICD) et le peptide P3 (3 kDa). L'action de l'α-secretase empêche donc non seulement la formation du peptide amyloide, mais stimule aussi la génération du grand fragment extracellulaire N-terminal (ectodomaine) de l'APP. Les fragments so lubies N-terminaux de l'APP générés par l' α-secretase, ou sAPPα sont relargués de façon constitutive dans le lumen vésiculaire et à la surface de la cellule. De telles espèces de l'APP sont sécrétées, in vitro, dans le milieu de culture conditionné par les cellules exprimant l'APP, et sont retrouvées in vivo dans le plasma et le liquide céphalorachidien.
Les approches décrites pour stimuler l'activité α-secretase, et augmenter les niveaux de sAPPα mettent en jeu l'activation de récepteurs couplés aux protéines G tels que les récepteurs aux nucléotides P2Y2, le récepteur au PACAP PACl, ou les récepteurs de divers neuro transmetteurs comme les récepteurs muscariniques, le récepteur métabotropique au glutamate ou encore les récepteurs de la sérotonine (ref iii pour revue). Les voies stimulées par les neurotransmetteurs mettent en jeu les systèmes protéine kinase C (PKC) et phospholipase C, ainsi que les MAP kinases, bien décrits dans la littérature comme modulateurs de la production de sAPPα, comme la stimulation de voies PKC-dépendantes par les esters de phorbol ou encore par des agonistes des récepteurs de la sérotonine 5-HT2a et 2c. D'autres voies mettent en jeu le récepteur de la sérotonine 5-HT(4), connu pour jouer un rôle dans la cognition et la mémoire, via la production d'AMPc et le recrutement de la GTPase Racl ou encore des inhibiteurs d'acétylcholine agissant via la PKC et ou les MAP -kinases, les oestrogènes tels le 17 β oestradiol ou encore la testostérone. Certaines hormones et facteurs de croissance tels l'EGF et l'insuline sont également connus pour stimuler la production de sAPPα via la PKC ou la PBK, respectivement. D'autres agents pharmacologiques ont été récemment décrits comme stimulant la production de sAPPα, selon une voie cAMP- Protéine kinase A (PKA) comme la forskoline, ou selon une voie PKC/MAP -kinase, comme les agents anti-inflammatoires non stéroïdiens tels les inhibiteurs des cyclooxygénase COX (Ibuprofen), les statines inhibiteurs de la HMG-CoA réductase (lovastatine), les dérivés de la rasagiline ou encore les polyphénols tels le (-)- epigallocatechin-3-gallate. Mais toutes ces approches, si elles ont permis de valider la pertinence de la stratégie visant à stimuler la production de sAPPalpha à l'aide d'outils pharmacologiques, n'ont pas abouti à de nouveaux composés adaptés à la clinique humaine. La présente invention fournit un rationnel à l'utilisation d'agents pharmacologiques comme des composés chimiques appartenant à la classe des pyrazolopyridines, dont l'étazolate, destinés à stimuler la production du fragment sAPPα.
La présente invention décrit également le lien entre l'augmentation de la production de sAPPalpha et la capacité de l'étazolate à inhiber les effets induits par les ROS ("Reactive Oxygen Species"), c'est-à-dire par le stress oxydatif.
Ce phénomène de stress oxydatif joue un rôle essentiel dans plusieurs aspects de la maladie d'Alzheimer : non seulement la dégénéresence neuronale et l'inflammation astrocytaire mais également l'activation et l'agrégation plaquettaire. Ces derniers phénomènes participent aux complications vasculaires de la maladie d'Alzheimer et sont à l'origine des démences vasculaires.
Il est par conséquent possible de suivre un effet inhibiteur de l'étazolate sur les voies initiées par le stress oxydatif au niveau de l'activation plaquettaire. Plus généralement, il est possible de suivre l'effet inhibiteur de composés neuroprotecteurs au niveau de l'activation plaquettaire.
Ainsi, la présente invention permet de proposer, pour la première fois, la mesure de tout phénomène biologique relié à l'activation ou à l'agrégation plaquettaire pour le suivi clinique ou thérapeutique de l'efficacité de composés neuroprotecteurs. La capacité de générer à partir de l'APP les peptides Abeta et sAPPalpha est partagée par le système nerveux et les plaquettes. Par conséquent, l'action inhibitrice de l'étazolate sur le stress oxydatif se traduisant par une augmentation de la production de sAPPalpha, la présente invention fournit un rationnel pour suivre l'action de l'étazolate sur la maturation de l'APP à partir d'échantillons plaquettaires ou plus généralement d'échantillons sanguins.
La présente invention revendique également la mesure de tout phénomène biologique relié à l'activation ou à l'agrégation plaquettaire pour le suivi clinique ou thérapeutique de l'efficacité de tout composé de la famille des pyrazolopyridines. De plus, la présente invention permet de revendiquer la mesure de toute modification de la maturation de l'APP dans le sang, notamment le dosage de la sAPPalpha, à partir d'échantillons de sang ou de préparations de plaquettes afin d'assurer le suivi clinique et thérapeutique de l'efficacité de tout composé de la famille des pyrazolopyridines.
Ainsi, un objet de l'invention réside dans une méthode pour évaluer ou suivre l'efficacité d'un traitement neuroprotecteur chez un mammifère, comprenant une étape de mesure (de préférence in vitro ou ex vivo) de la production de sAPPalpha dans un échantillon biologique du mammifère ayant reçu ledit traitement, ledit échantillon contenant des plaquettes, la production de sAPPalpha étant une indication de l'efficacité du traitement.
Un autre objet de l'invention réside dans un procédé de dosage immunologique de la sAPPalpha dans un échantillon, comprenant une étape de traitement thermique de l'échantillon (pour démasquer la sAPPalpha), et une étape de dosage immunologique. Le procédé est adapté au dosage de la sAPPalpha à partir de tout échantillon, et notamment d'échantillons de sang ou dérivé de sang (sérum, plaquettes, etc.), d'autres fluides biologiques. L'échantillon peut être pré-traité, notamment par dilution, enrichissement, filtration, etc.
Traitement neuroprotecteur
L'invention peut être utilisée pour évaluer ou suivre l'efficacité de tout traitement neuroprotecteur chez un mammifère. Au sens de l'invention, on entend par traitement neuroprotecteur tout traitement utilisable ou utilisé dans le traitement des maladies affectant le système nerveux, notamment de maladies neurodégénératives. Dans ce contexte, on peut citer notamment les composés choisis parmi les pyrazolopyridines et les agents modulateurs des récepteurs GABA(A).
Au sens de l'invention, un composé de la famille des pyrazolopyridines désigne avantageusement tout composé de formule (I) suivante, qui peut être substitué ou non, sur l'une quelconque des positions.
Figure imgf000007_0001
Les composés de la famille des pyrazolopyridines utilisés dans la présente invention sont en particulier choisis parmi les composés suivants :
- L'étazolate de formule (II) suivante :
Figure imgf000007_0002
l'étazolate constituant un mode de mise en œuvre préféré de l'invention,
- Ester éthylique de l'acide 4-butylamino-l-ethyl-6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine- 5-carboxylique (tracazolate),
- Ester éthylique de l'acide 4-butylamino-l-ethyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- carboxylique,
- 1 -(4-amino-pyrazolo[3,4-ό]pyridin- 1 -yl)-β-Z)- 1 -deoxy-ribofuranose
- Ester éthylique de l'acide l-ethyl-4-(N'-isopropylidene-hydrazino)-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique (SQ 20009),
- 4-amino-6-methyl-l-n-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine - Ester éthylique de l'acide 4-Amino-l-ethyl-6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- carboxylique (desbutyl tracacolate),
- 4-amino-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-carboxamide,
- Ester éthylique de l'acide l-ethyl-6-methyl-4-methylamino-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique,
- Ester éthylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-propyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- carboxylique,
- Ester éthylique de l'acide l-ethyl-4-ethylamino-6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine- 5-carboxylique,
- Ester éthylique de l'acide 4-amino-l-butyl-6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- carboxylique,
- 5-(4-amino-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-l-yl)-2-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-3-ol,
- ester allylique de l'acide l-allyl-4-amino-6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- carboxylique,
- acide 4-amino-6-methyl-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester éthylique de l'acide 4-amino-l-ethyl-3,6-dimethyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine- 5-carboxylique,
- ester éthylique de l'acide 4-dimethylamino-l-ethyl-6-methyl-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester éthylique de l'acide l-ethyl-6-methyl-4-propylamino-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique, - ester éthylique de l'acide 4-amino-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- carboxylique,
- ester éthylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-pent-4-ynyl-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique,
- 4-amino- 1 -but-3-enyl- lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-allylamide,
- 4-amino-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-isopropylamide,
- 4-amino-l-pentyl-N-n-propyl-lH-pyrazolo-[3,4-ό]pyridine-5-carboxamide,
- ester allylique de l'acide 4-amino-l-butyl-6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- carboxylique,
- ester éthylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-pent-3-ynyl-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique,
- 4-amino-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-prop-2-ynylamide
- ester allylique de l'acide 4-amino-l-(3-methyl-butyl)-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- carboxylique,
- 4-amino-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-N-(2-propenyl)carboxamide,
- ester allylique de l'acide 4-amino-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- carboxylique,
- 4-amino-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-butylamide, - ester allylique de l'acide 4-amino-l-but-3-ynyl-6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine- 5-carboxylique,
- ester allylique de l'acide 4-amino-l-but-3-enyl-6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine- 5-carboxylique,
- 4-amino-6-methyl-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-allylamide,
- ester allylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- carboxylique,
- ester allylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-(3-methyl-butyl)-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester isobutylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine- 5-carboxylique,
- 4-amino-6-methyl-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-butylamide,
- ester allylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-(3-methyl-but-2-enyl)-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique,
- 4-amino-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-cyclopropylamide,
- ethyl 4-amino-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-b]pyridine-5-hydroxamate,
- ester prop-2-ynylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester allylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-pent-4-ynyl-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique, - ester allylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-pent-4-enyl-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique,
- 4-amino-l-pent-3-ynyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-propylamide,
- 4-amino-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridme-5-cyclopropylmethyl-amide,
- ester 2-méthyl-allylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique,
- 4-Amino-l-pent-3-ynyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-allylamide (ICI 190,622),
- 4-amino-l-pent-4-ynyl-Λ/-2-propenyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-carboxamide,
- 4-amino-l-pent-3-ynyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-prop-2-ynylamide,
- 4-amino-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-but-2-ynylamide,
- ester allylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-pent-3-ynyl-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester allylique de l'acide 4-amino-l-(2-cyclopropyl-ethyl)-6-methyl-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester allylique de l'acide 4-amino-l-hex-5-ynyl-6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine- 5-carboxylique,
- 4-amino-l-pent-3-ynyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-cyclopropylmethyl-amide,
- ester but-3-énylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique, - ester cyclopropylméthylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique,
- 4-butylamino-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-allylamide,
- ester 2-cyclopropyl-éthylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester cyclopropylméthylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-pent-3-ynyl-lH- pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester cyclopropylméthylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-pent-4-ynyl-lH- pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester éthylique de l'acide 4-amino-l-benzyl-6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- carboxylique,
- 4-amino-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-benzylamide,
- 4-amino-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-phenylamide,
- ester benzylique de l'acide 4-amino-6-methyl-l-pentyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- carboxylique,
- 4-Azido-l-β-D-ribofuranosylpyrazolo[3,4-ό]pyridine,
- l-pent-3-ynyl-Λ/-2-propenyl-4-propionamido-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- carboxamide,
- 2-(4-amino-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-l-yl)-5-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-3,4-diol,
- 2-(6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-ylamino)-éthanol, - 3-(6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-ylamino)-propan-l-ol,
- ester propylique de l'acide 3-(6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-ylamino)- acétique,
- ester éthylique de l'acide 2-(6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-ylamino)- propionique,
- ester éthylique de l'acide 2-(6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-ylamino)- pentanoique,
- ester éthylique de l'acide 2-(6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-ylamino)- benzoique,
- ester propylique de l'acide 3-(6-methyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-ylamino)- pentanoïque,
- Λ/-benzylidene-Λ/"-(3 -methyl- 1 -phenyl- 1 H-pyrazolo [3 ,4-ό]pyridin-4-yl)-hydrazine,
- Λ/-furan-2-ylmethylene-Λ/'-(3 -methyl- 1 -phenyl- 1 H-pyrazo Io [3 ,4-ό]pyridin-4-yl)- hydrazine,
- Λ/-(4-fluoro-benzylidene)-Λ/'-(3 -methyl- 1 -phenyl- lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-yl)- hydrazine,
- Λ/-(3-furan-2-yl-allylidene)-Λ/'-(3-methyl-l-phenyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-yl)- hydrazine,
- Λ/-(4-methoxy-benzylidene)-Λ/'-(3 -methyl- 1 -phenyl- lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-yl)- hydrazine, - 4-[(3-methyl-l-phenyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-yl)-hydrazonomethyl]- benzonitrile,
- N-benzo [ 1 ,3 ] dioxo 1-5 -ylmethylene-Λ/'-(3 -methyl- 1 -phenyl- lH-pyrazolo [3 ,4-ό]pyridin- 4-yl)-hydrazine,
- Λ/-(3-methyl-l -phenyl- lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-yl)-Λ/'-(4-nitro-benzylidene)- hydrazine,
- Λ/-(3-methyl-l-phenyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-yl)-Λ/'-(2-nitro-benzylidene)- hydrazine,
- Λ/-(3-methyl-l-phenyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-yl)-Λ/'-(4-trifluoromethyl- benzylidene)-hydrazine,
- 7V-(3-methyl-l -phenyl- lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-yl)-Λ/'-(5-nitro-furan-2- ylmethylene)-hydrazine,
- Λ/-(3-methyl-l-phenyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridin-4-yl)-Λ/'-(2-trifluoromethyl- benzylidene)-hydrazine,
- Λ/-(3-methyl-l -phenyl- lH-pyrazolo[3,4-b]pyridin-4-yl)-7V-(6-nitro-benzo[l,3]dioxol- 5 -ylmethylene)-hydrazine,
- Acide 4-(3-chloro-4-methoxy-benzylamino)-l-ethyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- carboxylique,
- 4-(3-chloro-4-methoxy-benzylamino)-l-ethyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- (pyridin- 4-ylmethyl)-amide,
- 4-(3-chloro-4-methoxy-benzylamino)-l-ethyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5- (tetrahydro-furan-2-ylmethyl)-amide, - 4-(3-chloro-4-methoxy-benzylamino)-l-ethyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridme-5-(5- hydroxy-pentyl)-amide,
- 4-(3-chloro-4-methoxy-benzylamino)-l-ethyl-lH-pyrazolo[3,4-ό]pyridme-5-[3-(2- oxo-pyrrolidin- 1 -yl)-propyl]-amide,
- ester éthylique de l'acide 4-tert-butylamino-l-(2-chloro-2-phenyl-ethyl)-lH- pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester éthylique de l'acide l-(2-chloro-2-phenyl-ethyl)-4-cyclopropylamino-lH- pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester éthylique de l'acide l-(2-chloro-2-phenyl-ethyl)-4-propylamino-lH- pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester éthylique de l'acide l-(2-chloro-2-phenyl-ethyl)-4-phenylamino-lH- pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester éthylique de l'acide 4-butylamino-l-(2-chloro-2-phenyl-ethyl)-lH-pyrazolo[3,4- ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester éthylique de l'acide l-(2-chloro-2-phenyl-ethyl)-4-(2-ethoxy-ethylamino)-lH- pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester éthylique de l'acide 4-benzylamino-l-(2-chloro-2-phenyl-ethyl)-lH- pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-carboxylique,
- ester éthylique de l'acide l-(2-chloro-2-phenyl-ethyl)-4-phenethylamino-lH- pyrazolo[3,4-ό]pyridine-5-carboxylique. Ces composés peuvent être sous forme de sel, ester, racémique, isomère actif, etc. Dans un mode particulier de mise en œuvre, le composé neuroprotecteur est choisi parmi l'étazolate, le tracazolate ou le cartazolate, plus préférentiellement l'étazolate.
L'agent modulateur du GABA(A) peut être tout composé chimique, d'origine naturelle ou synthétique, notamment une molécule organique ou inorganique, d'origine végétale, bactérienne, virale, animale, eucaryote, synthétique ou semi-synthétique, capable de moduler l'expression ou l'activité des radicaux libres (ROS). A titre d'exemple particulier, on peut citer notamment les benzodiazépines.
Les composés ou traitements utilisés dans le cadre de la présente invention peuvent être formulés et administrés de différentes façons. L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par voie orale ou par injection, systémique ou locale. L'injection est typiquement réalisée par voie intra- oculaire, intra-péritonéale, intra-cérébrale, intra-veineuse, intra-artérielle, sous-cutanée ou intra-musculaire. L'administration par voie orale ou systémique est préférée. Les doses administrées peuvent être adaptées par l'homme de l'art. Typiquement, de 0,01 mg à 100 mg / kg environ sont injectés, pour des composés de nature chimique. Des dosages unitaires particuliers sont par exemple de 0,5 à 40 mg par dose administrée. Il est entendu que des injections répétées peuvent être réalisées, éventuellement en combinaison avec d'autres agents actifs ou tout véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique (ex., tampons, solutions saline, isotonique, en présence d'agents stabilisants, etc.).
Le véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique peut être choisi parmi des solutés tampons, solvants, liants, stabilisants, émulsifiants, etc. Des solutés tampons ou diluant sont notamment le phosphate de calcium, sulfate de calcium, lactose, cellulose, kaolin, mannitol, chlorure de sodium, amidon, sucre en poudre et hydroxy propyl méthyl cellulose (HPMC) (pour libération retard). Des liants sont par exemple l'amidon, la gélatine et des solutés de remplissage comme le sucrose, glucose, dextrose, lactose, etc. Des gommes naturelles ou synthétiques peuvent aussi être utilisées, comme notamment l'alginate, la carboxyméthylcellulose, la méthylcellulose, la polyvinyl pyrrolidone, etc. D'autres excipients sont par exemple la cellulose et du stéarate de magnésium. Des agents stabilisants peuvent être incorporés aux formulations, comme par exemple des polysaccharides (acacia, agar, acide alginique, gomme guar et tragacanth, la chitine ou ses dérivés et des éthers de cellulose). Des solvants ou solutés sont par exemple la solution Ringer, l'eau, l'eau distillée, des tampons phosphates, des solutions salines phosphatées, et autres fluides conventionnels.
Echantillon
Pour la mise en œuvre de la méthode décrite ci-dessus, il est possible d'utiliser tout échantillon contenant des plaquettes, provenant du sujet traité. L'invention montre en effet que des composés neuroprotecteurs sont capables d'induire la production de sAPPalpha dans les plaquettes. Ainsi, l'efficacité du traitement peut être évaluée et suivie par un dosage de sAPPalpha dans tout échantillon contenant des plaquettes.
Dans un mode particulier de mise en œuvre, l'échantillon biologique est un échantillon de sang ou dérivé de sang. On entend par échantillon "dérivé" de sang tout échantillon de sang traité, par exemple par dilution, filtration, purification, etc., afin par exemple d'enrichir l'échantillon en plaquettes, d'éliminer d'autres populations cellulaires, d'inactiver des pathogènes éventuels, de calibrer un dosage, etc.
La méthode ci-dessus est applicable chez tous mammifères, de préférence chez les humains, en particulier atteints de maladies neurodégénératives, telles que la maladie d'Alzheimer, de Parkinson, la SLA, la maladie de Huntigton, etc.
Dosage de la sAPPalpha
Différentes techniques connues en soi de l'homme du métier peuvent être utilisées pour doser la sAPPalpha. Ainsi notamment, on peut mentionner des techniques immunologiques, basées sur l'utilisation d'anticorps spécifiques de la sAPPalpha. De tels anticorps sont disponibles dans la littérature (Exp. Neurol. 2003 Sep;183(l):74-80), ou peuvent être produits par des techniques connues en soi de l'homme du métier. Ainsi, il est possible de produire de tels anticorps par immunisation d'un mammifère non humain avec la sAPP alpha ou tout épitope ou fragment de celle-ci, puis isolement et/ou sélection des anticorps polyclonaux ou monoclonaux capables de lier la sAPPalpha in vitro. La spécificité des anticorps peut ensuite être confirmée par détermination des tests de liaison des anticorps à la protéine APP entière et/ou à d'autres peptides dérivés de la protéine APP, tels que le fragment C83, le peptide AICD et le peptide P3. De préférence, on utilise des anticorps capables de lier spécifiquement la sAPPalpha et incapables de lier de manière spécifique le fragment C 83, le peptide AICD et le peptide P3. La "spécificité" de liaison indique que la liaison à la sAPPalpha peut être discriminée d'une liaison éventuelle à d'autres protéines ou peptides.
La méthode de mesure de la production de sAPPalpha peut impliquer une technique ELISA, RIA, l'emploi de substrats revêtus d'anticorps spécifiques, de billes magnétiques, de colonnes, de plusieurs anticorps (anticorps de capture et anticorps de révélation), etc. De manière préférée, on utilise un test de type ELISA.
Typiquement, la production de sAPPalpha mesurée est comparée à un niveau de référence ou à une valeur mesurée avant le traitement, ou à un stade antérieur de traitement, chez ledit mammifère. Ainsi, il est possible déterminer si le niveau de production de la sAPPalpha évolue chez le patient consécutivement au traitement, ou au cours du traitement. Un maintien ou une augmentation du niveau de sAPPalpha constitue une indication de l'efficacité du traitement.
Par ailleurs, les inventeurs ont mis au point un procédé amélioré de dosage immunologique de la sAPPalpha, applicable à tout échantillon. La méthode repose notamment sur une étape de traitement de l'échantillon, permettant de démasquer (et ainsi de rendre accessible) des épitopes spécifiques du fragment soluble sAPPalpha. En effet, les résultats présentés par les inventeurs montrent que, sans un protocole adapté, la sAPPalpha ne peut être détectée de manière quantifiable et spécifique en ELISA.
Ainsi, un autre objet de l'invention réside dans un procédé de dosage immunologique de la sAPPalpha dans un échantillon, comprenant une étape de traitement thermique de l'échantillon (permettant de démasquer des épitopes de la sAPPalpha), et une étape de dosage immunologique. Le procédé est adapté au dosage de la sAPPalpha à partir de tout échantillon, et notamment d'échantillons de sang ou dérivé de sang (sérum, plaquettes, etc.), d'autres fluides biologiques, des surnageants de culture. L'échantillon peut être pré-traité, notamment par dilution, enrichissement, filtration, etc.
De préférence, l'étape de traitement thermique comprend un traitement de l'échantillon à une température comprise entre 600C et 700C environ, pendant une période de temps suffisante pour démasquer des épitopes de la sAPPalpha, typiquement pendant une période comprise entre 30 secondes et 10 minutes, environ. Comme le montrent les exemples, une telle méthode permet un dosage fiable, reproductif et spécifique de la sAPPalpha à partir d'échantillons sanguins humains.
Le dosage immunologique peut être réalisé par différentes techniques connues en soi, telles que notamment ELISA, avec tout réactif spécifique de la sAPPalpha, notamment tout anticorps spécifique comme décrit ci-dessus. Parmi ces anticorps, on peut citer notamment tout anticorps reconnaissant un épitope contenu dans les résidus d'acides aminés 1-17 de l'APP. Plus spécifiquement, de tels anticorps ou kits sont disponibles dans le commerce, comme le kit ELISA APP, vendu par Sigma ou Biosource, ou certains anticorps spécifiques de la sAPPα (au niveau de la coupure de l'APP) ou reconnaissant la sAPPα et l'APP :
- anticorps monoclonal 6E10 (spécifique de la sAPPα)
- anticorps monoclonal 2B3 (inclu dans le kit IBL de détection de la sAPPα), spécifique de la sAPPα
- anticorps monoclonal BAN50, produit par immunisation contre le peptide Abeta 1-16 (PMID: 10480887)
- anticorps monoclonal 22Cl 1 (anti-APP reconnnaissant la sAPPα)
- Polyclonal polyCl 1 (Upstate /Millipore, Cat # AB5368, produit par Chemicon)
- sAPP (poly) de OYC (Cat# APP-KPI- Antiserum)
- sAPPα (poly) de Signet Covance (Cat# SIG-39139)
- anticorps 3329 de lapin anti-sAPP, qui reconnaît spécifiquement la forme recombinante de la sAPPα (PMID: 9465092). Applications thérapeutiques
La mise en évidence inattendue que les traitements neuroprotecteurs définis ci-dessus permettent d'induire ou de stimuler la production de sAPPalpha dans les plaquettes permet d'envisager de nouvelles utilisations thérapeutiques de ce type de composés.
Ainsi, un objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé choisi parmi les pyrazolopyridines et les agents modulateurs des récepteurs GABA (A) pour la préparation d'un médicament pour stimuler ou induire la production de sAPPalpha par les plaquettes chez un mammifère.
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé choisi parmi les pyrazolopyridines et les agents modulateurs des récepteurs GABA (A) pour la préparation d'un médicament pour diminuer le risque de formation de thrombus chez un mammifère.
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé choisi parmi les pyrazolopyridines et les agents modulateurs des récepteurs GABA (A) pour la préparation d'un médicament pour réduire les complications vasculaires chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un composé choisi parmi les pyrazolopyridines et les agents modulateurs des récepteurs GABA (A) pour la préparation d'un médicament pour inhiber l'agrégation plaquettaire chez un mammifère, en particulier chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.
La présente invention sera décrite plus en détails à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des Figures Figure 1 : Dosage de la sAPPalpha dans du sérum non-traité
Figure 2 : Effet d'un traitement thermique sur la détection de sAPPalpha en ELISA
Figure 3 : Détection de sAPPalpha dans du sérum humain
Figure 4 : Détection de sAPPalpha recombinant dans du sérum
Figure 5: L'étazolate stimule in vitro la production de sAPPalpha
Figure 6: L'étazolate stimule la production de sAPPalpha dans les neurones
Figure 7 : L'étazolate stimule in vivo la production de sAPPalpha
Figure 8 : Effet de l'étazolate sur la toxicité du peptide amyloide et effet d'inhibiteurs du récepteur GABAA sur la neuroprotection induite par l'étazolate. Statistiques : Test de Wilcoxon : ###, pθ.001; **, p<0.01; ***, p<0.001
Figure 9: Effet d'inhibiteurs des alpha secretase sur la neuroprotection induite par l'étazolate. Statistiques : Test de Wilcoxon : * p<0.05; ***, p<0.001
Figure 10: Effet d'un anticorps neutralisant anti-sAPPα sur la neuroprotection induite par l'étazolate. Statistiques : Test de Wilcoxon : ##, p<0.01; ***, p<0.001
Exemples
Exemple 1 : Procédé de dosage de la sAPP alpha
Le fragment soluble de l'APP (sAPPα) circulant dans le sang est issu des cellules plaquettaires et de l'activité α-secretase associée. Celui-ci a été montré diminuant avec l'âge et au cours du processus physiopathologique de la maladie d'Alzheimer (MA). Le sAPPα circulant dans le sang peut donc être considéré comme un bio marqueur pour monitorer les changements dans le processing de l'APP qui apparaissent avec l'âge et au cours du processus physiopathologique de la maladie d'Alzheimer et qui pourront être corrigés suite la prise de traitements médicamenteux.
Il existe donc un véritable intérêt à quantifier de façon précise les niveaux de sAPPα dans le sang et plus particulièrement dans le sérum, après la coagulation sanguine et l'activation des plaquettes, afin d'évaluer l'efficacité de traitements ayant pour but de modifier le processing de l'APP pour un traitement de la maladie d'Alzheimer.
La méthode décrite ci-dessous a été développée afin de démasquer et de rendre accessible l'épitope spécifique du fragment soluble sAPPα pour une détection de type anticorps-antigène de haute affinité selon la technique double sandwich de type ELISA.
En effet, sans un protocole adapté aux traitements des échantillons de sérum, le sAPPα ne peut être détecté de manière quantifiable et spécifique en ELISA. Comme le montre la figure 1 , le sérum seul sans traitement préalable montre une détection de sAPPα très nettement quantifiable (3.5 ng/mL), mais qui ne semble pas s'additionner au sAPPα recombinant rajouté (+10 ng/mL), alors que la même quantité de sAPPα rajouté montre une détection (8.7 ng/mL) aux alentours de la quantité attendue (lOng/mL). La détection ELISA dans le sérum pur sans aucun traitement particulier ne semble pas être spécifique au sAPPα soluble et circulant.
Pour avoir accès au sAPPα soluble dans le sérum et être capable de le quantifier de manière fiable, spécifique et reproductible, nous avons développé une méthode de préparation et de traitement des échantillons permettant à l'aide d'un traitement thermique de rendre accessible le sAPPα présent dans le sérum aux anticorps spécifiques de l'ELISA.
Les échantillons sériques sont initialement dilués dans du tampon Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (Sigma # D8537), 5% BSA, 0.05% Tween-20. Les échantillons dilués sont ensuite traités par la chaleur à 66°C pendant 10 minutes, puis refroidis à 4°C. Les échantillons sont ensuite analysés par la technique ELISA à l'aide d'un kit spécifique du sAPPα. Comme le montre la figure 2, la détection du sAPPα en ELISA à partir de sérum augmente de manière significative en fonction de la température de chauffage et de la durée du traitement thermique (gamme de température 60- 700C ; X = 66°C).
Cette méthode de préparation des échantillons de sérum et le traitement thermique ont été évalués sur 7 sérums humains différents, dans 3 expériences distinctes. Comme la montre la figure 3, la détection de sAPPα en ELISA à partir de sérums humains semble reproductible avec cette méthode (X = 66°C).
Afin dévaluer au mieux cette méthode de dosage du sAPPα dans le sérum, nous avons évalué la linéarité de la détection du sAPPα dans un sérum humain en utilisant trois quantités croissantes de sAPPα recombinant (5 ; 7,5 et 10 ng/mL). La figure 4, représente la moyenne de 3 expériences distinctes, réalisées à partir du même sérum sur 3 jours différents.
Comme le montre la figure 4, il existe une très bonne relation de proportionnalité entre les quantités de sAPPα rajouté/spikés et les quantités de sAPPα détectées en ELISA dans la matrice biologique (sérum) après la préparation et le traitement thermique. Ces résultats montrent que le sAPPα rajouté au sérum traité ne rentre pas en compétition avec le sAPPα libéré du sérum. Ces résultats présentent une bonne reproductibilité sur 3 expériences réalisées à 3 jours différents.
A partir de ces résultats, le recouvrement du sAPPα recombinant dans le sérum traité a pu être calculé en comparaison à des échantillons correspondant à la matrice biologique sans sAPPα endogène et auquel a été rajouté avec les mêmes quantités de sAPPα.
Comme le montre le tableau ci-dessous, le recouvrement (exprimé en % de la valeur attendue) du sAPPα recombinant dans le sérum à 3 quantités croissantes se situe dans des limites acceptables 100% ± 25%.
Figure imgf000024_0001
La FDA définit les critères de performances des dosages ELISA appliqués aux procédés diagnostiques dans le dcument US Food And Drug Administration Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation, May 2001. Les documents suivants précisent les critères d'acceptance et de validation des immunoessais
- Findlay et al. Validation of immunoassays for bioanalysis: a pharmaceutical industry perspective. Journal of Pharmaceutical and Biomédical Analysis 21 (2000) 1249-1273
- Viswanathan et al. Workshop/Conference Report — Quantitative Bioanalytical Methods Validation and Implementation: Best Practices for Chromatographic and Ligand Binding Assays. The AAPS Journal 2007; 9 (1) Article 4 (http://www .aapsj .org)
Les données ci-dessous montrent que la performance de la méthode de dosage de l'invention, mise en oeuvre à l'aide du kit sAPPα vendu par IBL, est conforme aux critères recommandés par la FDA.
Concentration (ng/ml) sAPPα 5 7.5 10
Recouvrement % Recouvrement 115.9 105.2 105.7
CV% 5.5 6.5 6.2
Précision CV% 4.6 6.4 5.5 inter-série
Précision CV% 5.3 5.3 1.9 intra-série
Linéarité r2 0.99923
CV% 1.8 4.0 4.1 Justesse % 98.1 96.6 96.0
LOQ (ng/ml) 1.0 Effet matrice % Recouvrement 95.8
CV% 13.1 Justesse % 90.0
Spécificité % 95.1 CV% 6.2
LOQ : limite de quantification ; CV% coefficient de variation
Exemple 2 : L'étazolate stimule la production de sAPPalpha
Des cellules HEK293 transfectées de manière stable sur-exprimant l'APP humaine ont été maintenues dans du milieu Eagle Modifié contenant du sel Earle et supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 2mM L-glutamine (Sigma, Lyon, France), IX Acides Aminés Non Essentiels et des antibiotiques. Les cellules ont été traitées 48 heures après étalement sur plaques de 10cm avec des concentrations variables des molécules indiquées, ou avec du DMSO comme véhicule, pendant 24 heures. La sAPPalpha a été mesurée par ELISA et Western blot au moyen d'anticorps disponibles dans le commerce.
Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 5 et montrent que l'étazolate induit une sécrétion de sAPPalpha.
Exemple 3 : L'étazolate stimule la production de sAPPalpha par des neurones corticaux La production de sAPPalpha a été mesurée sur des neurones corticaux isolés à partir d'embryons de rat Wistar âgés de 17 jours. Les cellules sont obtenues à partir des structures corticales qui sont disséquées dans une solution contenant 0.25% de trypsine. Les cellules dissociées sont ensemencées à la densité de 500,000 par cm2 dans du milieu Neurobasal contenant des additifs (IX B27, 2mM L-glutamine, 0.6% glucose, des antibiotiques et des antimycotiques ainsi que du sérum de cheval à 2%) dans des boites de culture coatées avec 6 μg/ml de polyornithine Les cellules sont maintenues à 37°C et 5% CO2. 24 heures après ensemencement, les cellules sont traitées avec 5 μM AraC (5 Cytosine arabinofuranoside) comme antimitotique. Après 4 jours in vitro, la moitié du milieu est changée avec du milieu sans sérum de cheval et la culture est maintenue pour maturation dans ce milieu pendant 7 à 10 jours.
La sAPPalpha a été mesurée par Western blot au moyen d'anticorps disponibles dans le commerce après un changement de milieu et une accumulation dans du milieu frais pendant 24 heures. Les quantifications ont été réalisées à partir d'analyses de densitométrie des images autoradiographiques scannées. Comme le montre la figure 6, l'etazolate (0,2 et 2 μM pendant 24h) stimule le relargage de sAPPalpha à partir des neurones corticaux. Les résultats présentés sont la moyenne ±SEM de trois expériences indépendantes réalisées en duplicat et sont exprimés sous la forme du pourcentage du contrôle (cultures non traitées).
Exemple 4 : L'etazolate stimule la production de sAPPalpha in vivo
La production de sAPPalpha a été étudiée in vivo chez le cochon d'Inde, un modèle physiologique de processing de l'APP dans le cerveau. L'etazolate ou du véhicule (solution saline physiologique) a été administré à des cochons d'Inde mâles albinos Hartley, pesant 250-270 g au début de l'expérience une fois par jour pendant 15 jours consécutifs, per os à la dose de lOmg/kg. 1 h après la dernière administration les cochons d'Inde ont été sacrifiés et les cerveaux immédiatement extraits, congelés dans de l'azote et stockés à -80 0C. Les cortex ont été homogénéisés à 4°C dans une solution de Tris base 2OmM pH 7,5 contenant 0,2% Triton X-100, 50μg/mL gentamycine et un cocktail d'inhibiteurs de protéases . Le sAPPalpha soluble a été mesuré par un test ELISA et les résultats normalisés par rapport à la quantité de protéines présentes dans les extraits.
La figure 7 présente l'augmentation de la quantité de sAPPalpha mesurée dans les cerveaux des animaux traités avec l'etazolate, comparé aux animaux contrôles traités avec le véhicule. L'augmentation d'un facteur trois induite par l'etazolate est statistiquement très significative (*** : p<lE-4 selon le test de Wilcoxon).
Les résultats obtenus montrent que l'etazolate induit une sécrétion de sAPPalpha.
Exemple 5 : L'effet neuroprotecteur de l'étazolate requiert la production de sAPPalpha in vivo
Le peptide Aβ25-35 contient le fragment neuro toxique du peptide amyloïde et est un outil classiquement utilisé pour étudier les effets neuroprotecteurs de composés. Au début de chaque expérience, les cultures neuronales âgées de 7-10 jours sont changées avec du milieu de culture frais et traitées avec le composé inhibiteur étazolate, six heures avant l'addition du peptide amyloïde Aβ25-35 à la concentration de 33.5 μM. De façon classique et reproductible, cette concentration génère 30 à 40% de toxicité dans les cultures neuronales.
Plusieurs expériences sont entreprises pour caractériser l'effet neuroprotecteur de l'etazolate. Afin de vérifier si la neuroprotection met en jeu le récepteur GABAA, les antagonistes du récepteur GABAA Picrotoxine (PTX), Gabazine/SR95531, Bicuculine (BIC) sont préincubés une heure avant l'etazolate à la concentration de 50μM, 20μM et lOμM, respectivement.
Récemment, plusieurs études ont démontré que la sAPPα présente des propriétés neurotrophiques et neuroprotectives, notamment contre le peptide amyloïde in vitro et in vivo, suggérant que l'etazolate pourrait médier ses effets neuroprotecteurs via la voie alpha secretase. Pour déterminer si l'inhibition du sAPPalpha, ou sa production, prévient l'effet neuroprotecteur de l'etazolate contre le peptide amyloide, un anticorps neutralisant anti sAPPα (anticorps 3E9) et des inhibiteurs des alpha secretases sont respectivement utilisés. Pour la neutralisation du sAPPα, l'anticorps 3E9 (5μg/ml) est ajouté aux cellules corticales en même temps que l'etazolate. Deux inhibiteurs des alpha secretases, le composé Furin Inhibitor I (Hwang EM, Kim SK, Sohn JH, Lee JY, Kim Y, Kim YS, Mook-Jung I. Furin is an endogenous regulator of alpha-secretase associated APP processing. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Oct 20;349(2):654- 9.) et le TAPI (Slack BE, Ma LK, Seah CC. Constitutive shedding of the amyloid precursor protein ectodomain is up-regulated by tumour necrosis factor-alpha converting enzyme. Biochem J. 2001 Aug l;357(Pt 3):787-94) sont utilisés en prétraitement une heure avant l'addition de l'étazolate.
Tous les traitements sont effectués au minimum en double et dans au moins deux cultures différentes. Après une incubation de 48 heures la toxicité est mesurée par un test MTT. Les résultats, normalisés à la moyenne du non- traité, sont statistiquement analysés par le test de Wilcoxon. La valeur significative est déterminée à p inférieur ou égal à 0.05.
MTT:
La toxicité est mesurée en utilisant le test MTT. Après l'incubation avec les composés, du MTT est ajouté à une concentration finale de 0,5 mg/ml par puits. Les plaques sont ensuite incubées pendant 30 minutes à 37 0C dans le noir. Le milieu est aspiré et les cristaux sont remis en suspension dans 500 μl de DMSO (diméthylsulfoxyde). L'absorbance à 550 nm est lue et le pourcentage de viabilité est calculé.
Résultats :
Les résultats obtenus sont présentés sur les figures 8-10. Ces résultats illustrent l'effet protecteur du composé de l'invention sur la mort neuronale induite par le peptide amyloïde Aβ 25-35.
Lors du co-traitement des neurones par l'étazolate, un effet protecteur dose-dépendent est observé (Figure 8) avec en particulier 90% de viabilité cellulaire obtenue pour la dose de 0,2 μM. Cet effet est bloqué par l'utilisation des trois agents inhibiteurs du récepteur GABAA et l'analyse statistique indique que cet effet est largement significatif (p<le-4 avec le test Wilcoxon après comparaison 0,2 μM EHT 0202 versus 0,2 μM EHT 0202 plus antagonistes). Les résultats correspondent aux moyennes+/-sem de sept expériences indépendantes.
Les figures 9 et 10 présentent des résultats obtenus à l'aide de l'étazolate sur les neurones corticaux en présence d'inhibiteurs de la production de sAPPα ou de son activité. Les résultats présentés montrent que l'étazolate permet d'atteindre sur ces cellules un effet protecteur qui est inhibé par le traitement avec deux inhibiteurs des alpha secretases, le composé Furin Inhibitor I et le TAPI (Figure 9). Ces données indiquent que l'activité alpha secretase responsable de la production de sAPPα est nécessaire à la neuroprotection induite par l'étazolate.
La figure Figure 10 montre que la neuroprotection induite par l'étazolate requiert la production de sAPPα, car l'effet neuroprotecteur de l'étazolate est perdu lorsqu' un anticorps neutralisant anti-sAPPα est rajouté au milieu de culture.
La présente invention documente l'effet neuroprotecteur de l'étazolate sur la toxicité induite par le peptide amyloïde comme agissant via le récepteur GABAA. Cet effet neuroprotecteur est associé à l'activation de la voie alpha sécrétase et à la production du sAPPα.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de dosage immuno logique de la sAPPalpha dans un échantillon, comprenant une étape de traitement thermique de l'échantillon et une étape de dosage immuno logique.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon est un échantillon de sang ou dérivé de sang, ou d'autres fluides biologiques.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape de traitement thermique comprend un traitement de l'échantillon à une température comprise entre 600C et 700C environ, pendant une période de temps suffisante pour démasquer des épitopes de la sAPPalpha, typiquement pendant une période comprise entre 30 secondes et 10 minutes, environ.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape de dosage immunologique est réalisée au moyen d'un anticorps spécifique.
5. Utilisation d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 4, pour le dosage de la sAPPalpha dans un échantillon (dérivé) de sang humain.
6. Utilisation selon la revendication 5, pour le dosage de la sAPPalpha dans un échantillon (dérivé) de sang provenant d'un sujet humain atteint de la maladie d'Alzheimer.
7. Utilisation d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 4, pour évaluer l'efficacité d'un traitement chez un sujet humain atteint de la maladie d'Alzheimer.
8. Méthode pour évaluer ou suivre l'efficacité d'un traitement neuroprotecteur chez un mammifère, comprenant une étape de mesure in vitro ou ex vivo de la production de sAPPalpha dans un échantillon biologique du mammifère ayant reçu ledit traitement, ledit échantillon contenant des plaquettes, la production de sAPPalpha étant une indication de l'efficacité du traitement.
9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que le traitement neuroprotecteur est un composé choisi parmi les pyrazolopyridines et les agents modulateurs des récepteurs GABA (A).
10. Méthode selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce que le mammifère est atteint d'une maladie neurodégénérative.
11. Méthode selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de sang ou dérivé de sang.
12. Méthode selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisée en ce que la production de sAPPalpha est mesurée par un test immunologique, de préférence de type ELISA.
13. Méthode selon l'une des revendications 8 à 12, caractérisée en ce que la production de sAPPalpha mesurée est comparée à un niveau de référence ou à une valeur mesurée avant le traitement, ou à un stade antérieur de traitement, chez ledit mammifère.
14. Utilisation d'un composé choisi parmi les pyrazolopyridines et les agents modulateurs des récepteurs GABA (A) pour la préparation d'un médicament pour stimuler ou induire la production de sAPPalpha par les plaquettes chez un mammifère.
15. Utilisation d'un composé choisi parmi les pyrazolopyridines et les agents modulateurs des récepteurs GABA (A) pour la préparation d'un médicament pour diminuer le risque de formation de thrombus chez un mammifère.
16. Utilisation d'un composé choisi parmi les pyrazolopyridines et les agents modulateurs des récepteurs GABA (A) pour la préparation d'un médicament pour réduire les complications vasculaires chez les patients atteints de maladies neurodégénératives .
17. Utilisation d'un composé choisi parmi les pyrazolopyridines et les agents modulateurs des récepteurs GABA (A) pour la préparation d'un médicament pour inhiber l'agrégation plaquettaire chez un mammifère, en particulier chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.
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