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WO2008009798A1 - Composition a base de d-glucosamine, de lactoferrine et de chondroitine sulfate pour prevenir et/ou pour traiter les maladies articulaires dégénératives - Google Patents

Composition a base de d-glucosamine, de lactoferrine et de chondroitine sulfate pour prevenir et/ou pour traiter les maladies articulaires dégénératives Download PDF

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WO2008009798A1
WO2008009798A1 PCT/FR2007/001198 FR2007001198W WO2008009798A1 WO 2008009798 A1 WO2008009798 A1 WO 2008009798A1 FR 2007001198 W FR2007001198 W FR 2007001198W WO 2008009798 A1 WO2008009798 A1 WO 2008009798A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glucosamine
lactoferrin
composition according
chondroitin sulfate
order
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2007/001198
Other languages
English (en)
Inventor
Michel-François DEGRE
Jean-Baptiste D'huart
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bio Serae Laboratoires SA
Original Assignee
Bio Serae Laboratoires SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Serae Laboratoires SA filed Critical Bio Serae Laboratoires SA
Publication of WO2008009798A1 publication Critical patent/WO2008009798A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7008—Compounds having an amino group directly attached to a carbon atom of the saccharide radical, e.g. D-galactosamine, ranimustine
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    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
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    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis

Definitions

  • the invention relates to the treatment and prevention of degenerative joint diseases, and relates more particularly to compositions intended to be administered orally, such as a medicament, a food supplement and / or a medicinal product, with a view to preserve the health of the articular cartilages especially with regard to chronic and / or acute inflammations.
  • Articular cartilage is a connective tissue consisting of four main constituents: water (about 70-80% by weight), proteoglycans (about 10-15%), collagen (of the order of 10-15%) and cells (about 1%). Among the cells present, chondrocytes are responsible for the constant and perpetual construction and remodeling of cartilage.
  • Resistant and elastic, articular cartilage has the role of reducing friction between moving joints. Also, by accumulating synovial fluid and rejecting it wisely, it fulfills the function of hydraulic damper with respect to shocks affecting the joints.
  • Degenerative joint diseases such as rheumatoid arthritis, arthritis psoriasis and osteoarthritis (osteoarthritis) are the cause of profound disorders in the structure and integrity of articular cartilage.
  • Degenerative joint disease is most often caused by chronic joint inflammation that results in chronic and irreversible disruption of the joint. In addition to pain, symptoms also result in abnormal joint stiffness (especially on awakening) and / or joint swelling and / or deformity of the joints.
  • US 6,924,273 proposes a method for stimulating or enhancing the production of articular proteoglycans which is based on the oral administration of a composition prepared from hyaluronic acid, and optionally supplemented with a quantity of glucosamine sulfate and / or chondroitin sulfate and / or vitamins (A, C, D and / or E) and / or biotin.
  • Hyaluronic acid and glucosamine are described as precursors for the synthesis of cartilaginous proteoglycans.
  • WO 98/44929 describes a composition comprising hydrolyzed collagen fractions (of molecular weight between 1 and 300 kDa, and preferably between 10 and 80 kDa) in combination with glucosamine.
  • EP 0 704 216 discloses a medicament composition in the form of an orally administrable gel, comprising as an active substance with respect to the synthesis of cartilaginous proteoglycans, an effective amount of an organic salt. or inorganic chondroitin sulfate.
  • the aim of the invention is to propose a novel composition of the medicinal product type, food supplement or foodstuff, intended for the prevention and treatment of degenerative joint diseases and has improved efficacy.
  • the invention aims to provide a composition capable of blocking / slowing the establishment and development of arthritis, especially when it is induced by collagen type IL
  • the object of the invention is to propose a composition having protective properties with respect to chondrocytes, and whose biological activity results in an improvement in the survival of these cells when they are subjected to an inflammatory environment and / or mechanical stress.
  • the invention relates to a composition intended to be administered orally for preventing and / or treating degenerative joint diseases, comprising, as active components, an effective amount of D-glucosamine, lactoferrin and chondroitin sulfate.
  • the invention results first of all from the demonstration made by the inventors that the particular combination of these three active agents makes it possible to significantly reduce the risk of contracting a degenerative joint disease.
  • the inventors have in particular carried out tests to assess the sensitivity with respect to the contraction of arthritis induced by type II collagen of mice subjected to a diet supplemented or not with an active ingredient composition according to the invention.
  • the invention also results from the observation according to which, in degenerative joint diseases, a chronic inflammatory state and / or a mechanical stress does not induce (not) a simple severe deterioration of the components of the cartilaginous matrix of the joints (collagen and proteoglycans).
  • a composition according to the invention makes it possible in particular to advantageously improve the survival and integrity of chondrocytes with respect to inflammatory events characteristic of arthropathies.
  • composition according to the invention which is therefore characterized in that it comprises an effective amount of D-glucosamine, lactoferrin and chondroitin sulfate, may consist of a drug or a food supplement.
  • a composition in accordance with the invention may be produced in galenic forms and various formulations, in particular:
  • a solution for example, a suspension, a syrup, a liquid composition embedded in a hard or soft capsule.
  • An oral administration composition according to the invention may also consist of a food product, that is to say an ordinary, solid and / or liquid food composition, which incorporates an effective amount of a mixture of D- glucosamine, lactoferrin and chondroitin sulfate.
  • a food product that is to say an ordinary, solid and / or liquid food composition, which incorporates an effective amount of a mixture of D- glucosamine, lactoferrin and chondroitin sulfate.
  • a food product that is to say an ordinary, solid and / or liquid food composition, which incorporates an effective amount of a mixture of D- glucosamine, lactoferrin and chondroitin sulfate.
  • additives and / or excipients are, for example, binders, lubricants, sweeteners, diluents, excipients, effervescent agents, coating agents, etc.
  • active compounds to prepare a composition according to as D-glucosamine, it is advantageous to use at least one glucosamine salt chosen from: glucosamine hydrochloride (in particular in the form of D-glucosamine HCl), glucosamine sulphate (especially in the form of D-sulphate), glucosamine 2KC1).
  • glucosamine hydrochloride is used.
  • a D-Glucosamine with a molecular weight of the order of 215 Da, derived from the chitin extracted from the crustacean shell, is used.
  • lactoferrin it is possible to use lactoferrin compositions originating from animal milk, prepared using conventional purification and extraction techniques (such as ultrafiltration, ion exchange column chromatography, chromatography). on steric exclusion columns ). These compositions more or less rich in lactoferrin generally correspond to particular protein fractions, purified from milk of bovine origin.
  • a lactoferrin whose molecular weight is of the order of 80 kDa is used.
  • the lactoferrin powder is prepared from cow's milk. In terms of dry matter weight, it advantageously has a lactoferrin content at least of the order of 40%. Preferably, this content is at least 50%. Typically, it is a composition of pure lactoferrin at least 85%.
  • this chondroitin sulfate has a molecular weight of the order of 30-50 kDa.
  • the chondroitin sulfate is present in the form of a powder which, in terms of weight of dry matter, has an effective content of chondroitin sulfate at least of the order of 90%.
  • chondroitin sulfate also reinforces the proteoglycan matrix of cartilage. articular.
  • a composition according to the invention has a weight proportion lactoferrin / D-glucosamine (effective weight of active compounds) of between 1:40 and 20: 1.
  • this proportion is advantageously of the order of 1: 10 or of the order of 1: 1.
  • D-glucosamine and lactoferrin are present in the form of two mixed powders.
  • the D-glucosamine powder is prepared from the chitin extracted from the crustacean shell. In terms of dry matter weight, it advantageously has an effective content of D-glucosamine of at least about 99%.
  • the weight ratio chondroitin sulfate / D-glucosamine (in terms of effective weight of the active compounds) is between 1: 5 and 100: 1, more particularly between 1: 3 and 20: 1 It is preferably of the order of 1: 2.
  • a composition according to the invention comprises, as active components, an effective amount of a mixture of lactoferrin, D-glucosamine and chondroitin sulfate, with a lactoferrin / D weight ratio.
  • a composition according to the invention comprises, as active components, an effective amount of lactoferrin, D-glucosamine and chondroitin sulfate, with a lactoferrin / D-glucosamine / chondroitin weight ratio. sulfate of the order of 1: 17.5: 5.
  • a composition according to the invention comprises, as active components, an effective amount of lactoferrin, D-glucosamine and chondroitin sulfate, with a lactoferrin / D-glucosamine / chondroitin weight ratio. sulfate of the order of 1: 37.5: 10.
  • a composition according to the invention comprises, as active components, an effective amount of a mixture of lactoferrin, D-glucosamine and chondroitin sulfate with a lactoferrin / D-weight proportion.
  • the effective amounts of D-glucosamine in the daily intake as well as the amounts of total daily intake (dosages) for a given 70 kg of man are presented in Table 1 below.
  • a composition according to the invention comprises an effective amount of D-glucosamine, lactoferrin and chondroitin sulfate determined for a daily dose corresponding to an effective amount of D-glucosamine (dosage) of between 125 mg and 1850 mg, in particular of the order of 550 mg, for an adult of the order of 70 kg.
  • composition according to the invention comprises an effective amount of D-glucosamine, lactoferrin and chondroitin sulfate determined for a total daily intake (dosage) of between 320 mg and 2390 mg, in particular of the order of 1000 mg, for an adult of the order of 70 kg.
  • the invention also relates to a composition for oral administration for preventing and / or treating degenerative joint diseases, and the use of a mixture of glucosamine, lactoferrin and chondroitin sulfate for the preparation of a A medicament for preventing and / or treating degenerative joint diseases, particularly osteoarthritis, characterized in combination by all or some of the features mentioned above or hereafter.
  • FIG. 1 is a rod representation relating to tests showing the sensitivity of chondrocytes subjected to an inflammatory environment, and validating the in vitro study model used to test the potential effects of various active agents on the survival of chondrocytes cultured in an inflammatory environment,
  • FIG. 2 is a representation in the form of curves illustrating the dose-dependent effect of the active agents tested on the survival of chondrocytes subjected to an inflammatory environment
  • FIGS. 3 a and 3b illustrate, in the form of rods, the results of tests demonstrating the synergistic effect of D-glucosamine and lactoferrin on the survival of chondrocytes subjected to an inflammatory environment
  • FIG. 4 is a rod representation summarizing the comparative in vitro measurements of the effects of a reduction of inflammation specific to the use of ibuprofen, with respect to the effects of particular compositions in accordance with the invention, on the survival of chondrocytes subjected to an inflammatory environment,
  • FIG. 5 is a rod representation relating to the result of arthritic index (AI) tests carried out on mice
  • FIG. 6 is a rod representation relating to the result of a quantification test of TNF- ⁇ (Tumor Necrosis factor- ⁇ ) measured in mouse plasma
  • FIG. 7 is a rod representation relating to the result of a quantification test of INF- ⁇ (interferon- ⁇ ) produced by mice.
  • FIG. 8 is a rod representation relating to the photometric result (OD) of an ELISA test for the quantification of total IgG of mice in an acellular extract derived from mouse articulation.
  • cytokines such as TNFa (tumor necrosis factor ⁇ ), IL-I I 1 (interleukin-1) and INF ⁇ ( ⁇ interferon ). These cytokines act concomitantly and are responsible for the development of inflammation, which actively contributes to the destruction of the articular matrix, notably by inducing the death of chondrocytes. a) Reconstitution of culture medium reproducing the effects of inflammation.
  • the inventors have reconstituted, in vitro, a chondrocyte culture affected by an inflammatory reaction.
  • the culture medium comprises DMEM supplemented with 10% of calf serum, penicillin and streptomycin (100 ⁇ g / ml).
  • the inflammatory state is mimicked by adding to the previously exposed standard medium, a quantity of
  • CYTOMIX a cytokine cocktail comprising, among others, TNF ⁇ , IL-1 and INF ⁇ . To do this, per milliliter of standard medium were added 60 ng Cytomix ®.
  • the inflammatory state is mimicked by the presence, in the standard medium, of macrophages having previously been activated by bacterial exotoxins.
  • This complementary approach of the previous one allows to reproduce in vitro, the interconnection between the chondrocytes of the matrix articular and inflammatory pool cells, and thereby reproduce conditions close to those encountered in vivo.
  • the chondrocytes are cultured in these different culture media for 48 hours before appreciating the proportion of dead cells by apoptosis:
  • the degenerative chondrocyte process was evaluated by measuring apoptotic death using an APOPTAG kit.
  • This kit makes it possible to visualize the DNA breaks and to quantify, by a fluorescence microscope reading, the percentage of cells in apoptosis.
  • chondrocyte culture in a medium without inflammatory stress apoptosis of chondrocytes occurs for about 10% of cells after 48 hours. This rate is of the order of 22%, when the chondrocytes are co-cultured with macrophages (not activated).
  • macrophages not activated.
  • the chondrocytes die by apoptosis after 72 hours. About 80% of chondrocytes die in less than 48 hours.
  • these results confirm that an inflammatory reaction has the effect of inducing apoptosis of chondrocytes.
  • Chondrocytes are cultured in a medium
  • D-glucosamine, lactoferrin and chondroitin sulfate were individually studied for their effects on chondrocyte survival, depending on their concentration in the culture medium. The studies were carried out in particular with a
  • D-Glucosamine derived from chitin extracted from the shell of crustaceans. This D-glucosamine, with a molecular weight of the order of 215 Da, is marketed in particular in powder form which, in terms of dry matter weight, has an effective content of D-glucosamine of at least about 99% .
  • lactoferrin its effect has been tested with two types of lactoferrin compositions:
  • a substantially pure lactoferrin (Lf) composition in the form of a powder contains at least 97% (by weight of dry matter) of proteins originating from cow's milk, and of which at least 90% corresponds to a native lactoferrin with a molecular weight of the order of 80 kDa;
  • co-Is co-isolate
  • cow's milk contains at least 90% (by weight of dry matter) proteins from cow's milk, and 45-60% of which corresponds to a native lactoferrin of molecular weight of the order of 80 kDa (the remaining protein part is essentially represented by the other milk proteins such as lactoperoxidase, ⁇ -lactoglobulin and lactalbumin).
  • chondroitin sulfate As regards chondroitin sulfate, the tests were carried out in particular with a chondroitin sulfate of molecular weight of the order of 30-50 kDa, extracted from selacian cartilage.
  • This chondroitin sulfate is commercially available in the form of a powder which, in terms of dry matter weight, has an effective chondroitin sulfate content of at least about 90%.
  • the previously mentioned compositions of D-glucosamine, lactoferrin and chondroitin sulfate are especially marketed by the company BIO SERAE, France.
  • Table 3 presents the results obtained, expressed as a percentage of dead cells by apoptosis, after 48 hours of culture in an inflammatory environment, as a function of the concentration of the factors tested (expressed in micrograms of the factor composition) per milliliter. of culture medium.
  • D-glucosamine has a protective effect of chondrocytes which is a function of its dose. This effect is measurable at the concentration of 0.001 ⁇ g / ml, to reach a maximum effect at around 10 ⁇ g / ml.
  • lactoferrin used in the form of a highly concentrated composition (Lf) also has a protective effect of chondrocytes. In comparison with D-glucosamine, its effect is nevertheless more limited.
  • lactoferrin Tested with a composition of less concentration, in this case the co-isolate (co-Is.), The protective effect of lactoferrin is not significant under the experimental conditions, when this substance is tested separately from other active or potentially active agents.
  • Ibuprofen is a non-inflammatory steroidal properties also analgesic, antipyretic.
  • Ibuprofen is widely prescribed in the treatment of arthropathies, despite its potential adverse effects: gastritis, stomatitis, abdominal pain, ulceration of the digestive tract, jaundice, headache, drowsiness ... It is also accompanied by many contraindications, for example in case of a history of gastric or duodenal ulcer, in case of gastric or renal insufficiency, in case of pregnancy or breastfeeding ...
  • the inventors have compared the effects of a reduction of inflammation caused by ibuprofen with the chondroprotective effects of different compositions according to the invention, on the survival of chondrocytes cultured in an inflammatory environment.
  • chondrocytes were co-cultured with macrophages previously activated by bacterial exotoxins, in different culture media:
  • the proportion of dead cells was assessed after 48 hours of culture.
  • mice Male DBA (H-2 q ) mice, 6-8 weeks old, marketed by IFFA-CREDO (Les Oncins, France).
  • Each mouse was subjected to a specific diet, including lactoferrin and / or D-glucosamine and / or chondroitin sulfate, for 15 days before it was inoculated with effective doses of collagen. type II for the purpose of inducing an arthritic condition.
  • Assays were performed with the ELISA method. For this purpose, 96-well microtiter plates were coated with type II collagen, and left overnight for PBS. The wells were then loaded with 100 ⁇ l of sera, extracted from the joints and diluted in PBS. Different dilutions of the sera were applied.
  • antigenic antibody complexes anti-mouse IgG
  • ELISA kit SIGMA
  • concentration of antibody-antigen complexes was assessed by an optical density measurement at 410 nm.
  • Table 7 shows the OD corresponding to the IgG2a anti-collagen type II assays carried out on arthritic mice, by a type II collagen induction induced after 15 days of an ordinary diet supplemented with an the following substances:
  • chondroitin sulfate / D-glucosamine mixture 50:50 (by dry weight), a first composition (Comp.T) particular according to the invention, comprising a lactoferrin / D-glucosamine / chondroitin sulfate mixture, 1: 37 , 5: 10,
  • Comp.2 a second particular composition according to the invention, comprising a lactoferrin / D-glucosamine / chondroitin sulfate mixture, 1: 17.5: 5.
  • FIG. 8 shows the rods representative of the photometric determination (OD) of type II anti-collagen IgG2a made in mice rendered arthritic by a type II collagen induction after an ordinary food diet lasting 15 days and supplemented with 5 mg daily of any of the following substances:
  • composition according to the invention comprising a mixture of Lactoferrin and D-glucosamine, 1.2: 1 (D Gluco + Cl),
  • composition according to the invention comprising a mixture of lactoferrin, D-glucosamine and chondroitin sulfate 1.2: 1: 1 (LGC),
  • TNF ⁇ tumor necrosis factor ⁇
  • an inflammatory cytokine used here as a marker of the severity of arthritic symptoms caused in mice.
  • TNF ⁇ assay results obtained are also shown in Table 7 for the compositions lactoferrin, D-glucosamine, chondroitin sulfate 1: 37.5: 10 and 1: 17.5: 5 below and in FIG. lactoferrin, D-glucosamine, chondroitin sulfate 1,2: 1: 1 composition.
  • Figure 6 shows the rods representative of the TNF- ⁇ assay. performed on mice rendered arthritic by a type II collagen induction after an ordinary food diet lasting 15 days and supplemented with 5 mg per day of one of the following substances:
  • D-Glucosamine D-Gluco
  • Lactoferrin Cl
  • composition according to the invention comprising a mixture of Lactoferrin and D-glucosamine, 1.2: 2, (D Gluco + Cl),
  • composition according to the invention comprising a mixture of lactoferrin, D-glucosamine and chondroitin sulfate 1.2: 1: 1 (LGC),
  • compositions of the invention demonstrate very significantly a protective effect exerted by the compositions of the invention with respect to the establishment and development of arthropathies. Indeed, on the one hand, the production of TNF- ⁇ by lymphoid spleen cells in response to collagen II is substantially reduced, indicating that a composition according to the invention (Comp 1 and Comp 2 and LGC) exerts a control over the mechanisms of inflammation characteristic of an arthritic condition. On the other hand, there is also a decrease in the level of type II anti-collagen IgG2a, in mice fed with a composition according to the invention, compared to mice following an ordinary diet. d) Evaluation of the arthritic index after type II collagen treatments
  • the inventors have also conducted a series of tests aimed at measuring the frequency of occurrence and the severity of the arthritic symptoms (pronounced edema and swelling of the joints) caused in the mouse by IL-type collagen treatment. The results are given on a subjective scale. graduated from 1 to 3.
  • FIG. 5 clearly describes a synergistic inhibitory effect characteristic of the composition according to the invention lactoferrin / D-glucosamine / chondroitin sulfate 1.2: 1: 1 (LGC) on the inflammation induced by collagen type II in comparison with the following treatments:
  • D Gluco D Gluco
  • Cl lactoferrin
  • mice that developed arthropathy had inflammatory symptoms and moderate clinical criteria .
  • this proportion varies between 84% and 100% with severe symptoms (swelling of the joint, edema).
  • FIG. 7 shows the rods representative of the INF- ⁇ assay carried out in arthritic (right) or non-arthritic (left) mice by means of treatment with type II collagen after an ordinary dietary diet. a duration of 15 days supplemented with 5 mg per day of one of the following substances with 5 mg of composition per day:
  • D-Gluco D-glucosamine
  • composition according to the invention comprising a mixture of Lactoferrin and D-glucosamine 1,2: 1 (D Gluco + Cl), - Particular composition according to the invention comprising a mixture of lactoferrin, D-glucosamine, chondroitin 1.2: 1: 1 sulfate (LGC),
  • Aspirin (Asp) 50 ⁇ M In mice for which inflammation was not induced with type II collagen, it was clearly observed that there was a significant decrease in the level of INF- ⁇ basal comparable to the decrease observed with the controls Ibuprofen, Indomethacin and Aspirin. .
  • a marked decrease in the level of INF- ⁇ was observed in the mice treated with the lactoferrin, D-glucosamine and chondroitin sulfate 1 composition. , 2: 1: 1, this The decrease in the production of INF-gamma is greater than that obtained with the control compositions.

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Abstract

L'invention concerne une composition destinée à être administrée par voie orale pour prévenir et/ou pour traiter les maladies articulaires dégénératives. Ladite composition comprend, en tant que composants actifs, une quantité efficace d'un mélange de D-glucosamine, de lactoferrine et de chondroïtine sulfate.

Description

COMPOSITION A BASE DE D-GLUCOSAMINE, DE LACTOFERRINE ET DE CHONDROITINE SULFATE POUR PREVENIR ET/OU POUR TRAITER LES MALADIES ARTICULAIRES DEGENERATIVES
L'invention a trait au traitement et à la prévention des maladies articulaires dégénératives, et se rapporte plus particulièrement à des compositions destinées à être administrées par voie orale, telles qu'un médicament, un complément alimentaire et/ou un alicament, en vue de préserver la santé des cartilages articulaires notamment à l'égard des inflammations chroniques et/ou aiguës. Le cartilage articulaire est un tissu conjonctif constitué de quatre constituants principaux : l'eau (de l'ordre de 70-80 % en poids), des protéoglycanes (de l'ordre de 10-15 %), le collagène (de l'ordre de 10-15 %) et des cellules (environ 1 %). Parmi les cellules présentes, les chondrocytes sont responsables de la construction et du remaniement constants et perpétuels du cartilage.
Résistant et élastique, le cartilage articulaire a pour rôle de diminuer les frictions entre des articulations en mouvement. Egalement, en accumulant du liquide synovial et en le rejetant à bon escient, il remplit la fonction d'amortisseur hydraulique à l'égard de chocs touchant les articulations. Les maladies articulaires dégénératives telles que par exemple l'arthrite rhumatoïde, l'arthrite psoriasis et l'arthrose (ostéoarthrose), sont la cause de profonds désordres dans là structure et dans l'intégrité du cartilage articulaire. En particulier, on constate chez les personnes arthrosiques un déséquilibre entre la synthèse et la dégradation des protéoglycanes du cartilage articulaire, en partie causé par la dépolymérisation des précurseurs glycosaminoglycanes.
Les maladies articulaires dégénératives sont le plus souvent causées par des inflammations articulaires chroniques qui aboutissent à une déstructuration chronique et irréversible de l'articulation. Outre la douleur, les symptômes se traduisent également par une rigidité anormale des articulations (en particulier au réveil) et/ou une tuméfaction au niveau des articulations et/ou une déformation des articulations.
Egalement, il est connu que des inflammations aiguës (non chroniques) peuvent induire la destruction du cartilage articulaire en évoluant vers une inflammation chronique, mais ce sont là des cas relativement rares.
A l'heure actuelle, on ignore précisément la(les) cause(s) des inflammations chroniques responsables de ces maladies articulaires dégénératives. On ne connaît pas non plus les facteurs qui déterminent la rémission des inflammations aiguës articulaires, ni ceux qui sont responsables de l'établissement d'un état arthrosique.
Aujourd'hui encore, les traitements dispensés dans ce type de maladies consistent quasi-exclusivement en la prescription palliative de préparations médicamenteuses qui associent des anti-inflammatoires stéroïdiens (en particulier, des corticostéroïdes) ou non-stéroïdiens, et des composés analgésiques, pour réduire l'inflammation et la douleur des patients. Conjointement à ces traitements palliatifs qui n'ont pour objectif que de soulager la douleur et/ou de freiner la maladie, se sont développées les techniques chirurgicales de reconstruction et de remplacement (par des prothèses) des articulations atteintes. En marge de ces traitements palliatifs peu efficaces et de ces opérations chirurgicales lourdes, sont récemment apparues des compositions de type médicaments, compléments alimentaires ou alicaments, élaborées pour régénérer et/ou pour renforcer structurellement les cartilages articulaires à l'égard des atteintes arthrosiques. JP 2005 06806 décrit une composition pharmaceutique orale caractérisée par l'association de la lactoferrine avec une ou plusieurs molécule(s) ou extrait(s) pour le traitement de l'arthrite.
US 6,924,273 propose une méthode permettant de stimuler ou d'amplifier la production des protéoglycanes articulaires qui repose sur l'administration par voie orale d'une composition préparée à partir d'acide hyaluronique, et éventuellement complétée par une quantité de glucosamine sulfate et/ou de chondroïtine sulfate et/ou de vitamines (A, C, D et/ou E) et/ou de biotine. L'acide hyaluronique et la glucosamine sont décrits comme des précurseurs de la synthèse des protéoglycanes cartilagineux.
Dans le même objectif, WO 98/44929 décrit une composition comprenant des fractions de collagène hydrolyse (de poids moléculaire compris entre 1 et 300 kDa, et de préférence entre 10 et 80 kDa) en combinaison avec de la glucosamine.
EP 0 704 216 décrit une composition médicamenteuse se présentant sous la forme d'un gel destiné à être administré par voie orale, comprenant en tant que substance active à l'égard de la synthèse des protéoglycanes cartilagineux, une quantité efficace d'un sel organique ou inorganique de chondroïtine sulfate.
L'invention vise à proposer une nouvelle composition de type médicament, complément alimentaire ou alicament, destinée à la prévention et au traitement des maladies articulaires dégénératives et présente une efficacité améliorée.
L'invention a pour objectif de proposer une composition ayant un effet globalement notable sur la prévention et sur l'atténuation de la détérioration du cartilage articulaire qui se développe généralement chez les patients atteints d'une maladie articulaire dégénérative. Notamment, l'invention vise à proposer une composition apte à bloquer/ralentir l'établissement et le développement de l'arthrite, notamment lorsqu'elle est induite par le collagène de type IL
Egalement, l'invention a pour objectif de proposer une composition ayant des propriétés protectrices à l'égard des chondrocytes, et dont l'activité biologique se traduit par une amélioration de la survie de ces cellules lorsqu'elles sont soumises à un environnement inflammatoire et/ou à un stress mécanique.
Pour ce faire, l'invention concerne une composition destinée à être administrée par voie orale pour prévenir et/ou pour traiter des maladies articulaires dégénératives, comprenant, en tant que composants actifs, une quantité efficace de D-glucosamine, de lactoferrine et de chondroïtine sulfate.
L'invention résulte tout d'abord de la démonstration faite par les inventeurs que la combinaison particulière de ces trois actifs permet de réduire de façon significative le risque de contracter une maladie articulaire dégénérative. A cet effet, les inventeurs ont notamment réalisé des tests pour apprécier la sensibilité à l'égard de la contraction d'une arthrite induite par du collagène de type II de souris astreintes à un régime alimentaire complémenté ou non avec une composition d'actifs selon l'invention. L'invention résulte également du constat selon lequel dans les maladies articulaires dégénératives, un état inflammatoire chronique et/ou un stress mécanique n'indui(sen)t pas qu'une simple détérioration sévère des composants de la matrice cartilagineuse des articulations (collagènes et protéoglycanes). Il(s) favorise(nt) l'établissement progressif d'un dérèglement du comportement des chondrocytes, cellules quasi-exclusives des tissus cartilagineux et primordiales dans le processus de réparation et de régénération du cartilage. Ce dérèglement du comportement des chondrocytes a pour conséquence un déséquilibre entre la synthèse et la dégradation des composants de la matrice cartilagineuse. Or, les inventeurs ont réussi à mettre en évidence un effet protecteur synergique exceptionnel et inattendu de la D-glucosamine et de la lactoferrine à l'égard de l'évolution apoptotique des chondrocytes soumis à un environnement inflammatoire, notamment chronique. Qui plus est, les inventeurs ont également constaté que cet effet synergique de la D-glucosamine et de la lactoferrine sur la survie des chondrocytes, se trouve significativement amplifié par la chondroïtine sulfate.
De plus, les inventeurs ont montré, au moyen d'un test d'indice arthritique, que cet effet synergique exceptionnel de la D-glucosamine associée à la lactoferrine et à la chondroïtine sulfate se retrouve sur un modèle murin. De même, les inventeurs ont démontré cet effet synergique exceptionnel de la D-glucosamine associée à la lactoferrine et à la chondroïtine sulfate sur la concentration plasmatique en TNF-α de souris traitées avec du collagène de type IL Ainsi, en marge des traitements classiques qui ont pour cible la réduction des inflammations articulaires et/ou le rétablissement de la matrice cartilagineuse, dans lesquels les patients se voient prescrire des anti- inflammatoires et/ou des composés appréciés pour leur effet précurseur et/ou stimulateur du métabolisme des protéoglycanes et/ou du collagène articulaire, une composition selon l'invention permet notamment d'améliorer avantageusement la survie et l'intégrité des chondrocytes à l'égard des événements inflammatoires caractéristiques des arthropathies.
Une composition à administration par voie orale conforme à l'invention, qui se caractérise donc par le fait qu'elle comprend une quantité efficace de D-glucosamine, de lactoferrine et de chondroïtine sulfate, peut consister en un médicament ou un complément alimentaire. Une composition conforme à l'invention peut être réalisée sous des formes galéniques et des formulations diverses, notamment :
- sous la forme d'un mélange de particules solides et divisées, par exemple une poudre effervescente ou non effervescente, et dont la prise nécessite qu'elle soit mélangée à de l'eau,
- sous la forme d'un comprimé effervescent ou non, à avaler avec un peu d'eau, à sucer ou à croquer,
- sous forme d'une solution, par exemple, une suspension, un sirop, une composition liquide enrobée dans une capsule dure ou molle.
Une composition à administration par voie orale conforme à l'invention, peut également consister en un alicament, c'est-à-dire une composition alimentaire ordinaire, solide et/ou liquide, qui incorpore une quantité efficace d'un mélange de D-glucosamine, de lactoferrine et de chondroïtine sulfate. Quelle que soit la forme dans laquelle se présente la composition de l'invention (médicament, complément alimentaire, alicament), outre ledit mélange de D-glucosamine, de lactoferrine et de chondroïtine sulfate, elle comprend en outre au moins un additif et/ou au moins un excipient acceptable du point de vue pharmaceutique et/ou alimentaire, notamment permettant d'obtenir une forme galènique administrable par voie orale. Ces additifs et/ou excipients sont par exemple des liants, des lubrifiants, des édulcorants, des diluants, des excipients, des agents effervescents, des agents d'enrobage... S'agissant des composés actifs, pour préparer une composition selon l'invention, à titre de D-glucosamine, on peut avantageusement utiliser au moins un sel de glucosamine choisi parmi : le chlorhydrate de glucosamine (notamment sous forme de D-glucosamine HCl), le sulfate de glucosamine (notamment sous forme de sulfate de D-glucosamine 2KC1).
De préférence, on utilise exclusivement le chlorhydrate de glucosamine.
Avantageusement et selon l'invention, on utilise une D-Glucosamine de poids moléculaire de l'ordre de 215 Da, dérivée de la chitine extraite de la carapace de crustacés.
S'agissant de la lactoferrine, on peut utiliser des compositions de lactoferrine provenant du lait animal, préparées en mettant en œuvre des techniques de purification et d'extraction classiques (telles que des ultrafiltrations, des chromatographies sur colonnes échangeuses d'ions, des chromatographies sur colonnes d'exclusion stérique...). Ces compositions plus ou moins riches en lactoferrine correspondent généralement à des fractions protéiques particulières, purifiées à partir de lait d'origine bovine. Avantageusement et selon l'invention, on utilise une lactoferrine dont le poids moléculaire est de l'ordre de 80 kDa. La poudre de lactoferrine est préparée à partir du lait de vache. En terme de poids de matière sèche, elle présente avantageusement une teneur en lactoferrine au moins de l'ordre de 40 %. De préférence, cette teneur est au moins de 50 %. Typiquement, il s'agit d'une composition de lactoferrine pure au moins à 85 %.
A titre de chondroïtine sulfate, on peut avantageusement utiliser une chondroïtine sulfate extraite du cartilage de sélacien. Avantageusement et selon l'invention, cette chondroïtine sulfate a un poids moléculaire de l'ordre de 30-50 kDa.
Avantageusement, dans une composition selon l'invention, la chondroïtine sulfate est présente sous la forme d'une poudre qui, en terme de poids de matière sèche, présente une teneur effective en chondroïtine sulfate au moins de l'ordre de 90 %.
Les inventeurs ont pu constater que, outre le fait d'améliorer l'effet synergique de la D-glucosamine et de la lactoferrine sur la survie des chondrocytes soumis à un environnement inflammatoire chronique, la chondroïtine sulfate permet aussi de renforcer la matrice protéoglycane du cartilage articulaire.
Avantageusement, une composition selon l'invention présente une proportion pondérale lactoferrine/D-glucosamine (en poids effectif de composés actifs) comprise entre 1:40 et 20:1. À titre d'exemple, cette proportion est avantageusement de l'ordre de 1 : 10 ou de l'ordre de 1 : 1.
Avantageusement, dans une composition selon l'invention, la D-glucosamine et la lactoferrine sont présentes sous la forme de deux poudres mélangées. La poudre de D-glucosamine est préparée à partir de la chitine extraite de la carapace de crustacés. En terme de poids de matière sèche, elle présente avantageusement une teneur effective en D-glucosamine au moins de l'ordre de 99 %.
Avantageusement, dans une composition selon l'invention, la proportion pondérale chondroïtine sulfate/D-glucosamine (en termes de poids effectif des composés actifs) est comprise entre 1:5 et 100 :1, plus particulièrement entre 1 :3 et 20: 1. Elle est de préférence de l'ordre de 1 : 2. Selon un mode de mise en œuvre particulièrement préféré, une composition selon l'invention comprend, en tant que composants actifs, une quantité efficace d'un mélange de lactoferrine, de D-glucosamine et de chondroïtine sulfate, avec une proportion pondérale lactoferrine/D- glucosamine/chondroïtine sulfate de l'ordre de 1:10:5.
Selon un autre mode préféré de mise en œuvre, une composition selon l'invention comprend, en tant que composants actifs, une quantité efficace de lactoferrine, de D-glucosamine et de chondroïtine sulfate, avec une proportion pondérale lactoferrine/D-glucosamine/chondroïtine sulfate de l'ordre de 1:17,5:5.
Selon un autre mode préféré de mise en œuvre, une composition selon l'invention comprend, en tant que composants actifs, une quantité efficace de lactoferrine, de D-glucosamine et de chondroïtine sulfate, avec une proportion pondérale lactoferrine/D-glucosamine/chondroïtine sulfate de l'ordre de 1:37,5:10.
Selon un autre mode préféré de mise en œuvre, une composition selon l'invention comprend, en tant que composants actifs, une quantité efficace d'un mélange de lactoferrine, de D-glucosamine et de chondroïtine sulfate avec une proportion pondérale lactoferrine/D-glucosamine/ chondroïtine sulfate de l'ordre de 1,2:1: 1.
Selon ces modes de mise en œuvre de l'invention, avec ces proportions particulières en agents actifs conformes à l'invention, les quantités efficaces de D-glucosamine dans la prise journalière ainsi que les quantités de la prise journalière totale (posologies) pour un homme de 70 Kg sont présentées dans le tableau 1 ci-après.
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Tableau 1
En conséquence, une composition selon l'invention comprend une quantité efficace de D-glucosamine, de lactoferrine et de la chondroïtine sulfate déterminée pour une prise journalière correspondant à une quantité de D-glucosamine effective (posologie) comprise entre 125 mg et 1850 mg, notamment de l'ordre de 550 mg, pour un adulte de l'ordre de 70 kg.
Egalement, une composition selon l'invention comprend une quantité efficace de D-glucosamine, de lactoferrine et de la chondroïtine sulfate déterminée pour une prise journalière totale (posologie) comprise entre 320 mg et 2390 mg, notamment de l'ordre de 1000 mg, pour un adulte de l'ordre de 70 kg.
L'invention concerne aussi une composition destinée à être administrée par voie orale pour prévenir et/ou traiter des maladies articulaires dégénératives, ainsi que l'utilisation d'un mélange de glucosamine, de lactoferrine et de chondroïtine sulfate, pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir et/ou à traiter des maladies articulaires dégénératives -notamment l'arthrose-, caractérisées en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit et qui présente quelques-uns des tests, réalisés par les inventeurs dans le cadre de la présente invention. Les résultats obtenus de ces tests permettent à eux seuls de conclure à l'effet protecteur global qu'exercent des compositions selon l'invention à l'égard du développement des maladies articulaires dégénératives, en général, et à l'égard d'une part d'une évolution apoptotique des chondrocytes soumis à un environnement inflammatoire chronique et d'autre part à l'égard d'un modèle arthritique murin soumis à un traitement inflammatoire chronique, en particulier. Les résultats expérimentaux sont notamment présentés sous la forme de représentations graphiques annexées, parmi lesquelles :
- la figure 1 est une représentation en bâtonnets relative à des tests montrant la sensibilité des chondrocytes soumis à un environnement inflammatoire, et validant le modèle d'étude in vitro utilisé pour tester les effets potentiels de différents agents actifs sur la survie des chondrocytes cultivés dans un environnement inflammatoire,
- la figure 2 est une représentation sous forme de courbes illustrant l'effet dose-dépendant des agents actifs testés, sur la survie des chondrocytes soumis à un environnement inflammatoire,
- les figures 3 a et 3b illustrent, sous forme de bâtonnets, les résultats de tests mettant en évidence l'effet synergique de la D-glucosamine et de la lactoferrine sur la survie des chondrocytes soumis à un environnement inflammatoire,
- la figure 4 est une représentation en bâtonnets résumant les mesures comparatives in vitro des effets d'une réduction de l'inflammation propre à l'utilisation de l'ibuprofène, par rapport aux effets de compositions particulières conformes à l'invention, sur la survie de chondrocytes soumis à un environnement inflammatoire,
- la figure 5 est une représentation en bâtonnets relative au résultat de tests d'indice arthritique (AI) effectués sur des souris,
- la figure 6 est une représentation en bâtonnets relative au résultat d'un test de quantification de TNF-α (Facteur de Nécrose Tumorale-α) mesuré dans le plasma de souris, - la figure 7 est une représentation en bâtonnets relative au résultat d'un test de quantification de l'INF-γ (interféron-γ) produit par des souris.,
- la figure 8 est une représentation en bâtonnets relative au résultat photométrique (DO) d'un test ELISA de quantification des IgG totaux de souris dans un extrait acellulaire provenant d'articulation de souris.
1/ - Expérience d'apoptose des chondrocytes soumis à un environnement inflammatoire.
Au cours d'une réaction inflammatoire articulaire, les cellules du pool inflammatoire et immunitaire produisent un grand nombre de cytokines tels que le TNFα (tumor necrosis factor α), I1IL-I (interleukine-1) et l'INFγ (interféron γ). Ces cytokines agissent de manière concomitante et sont responsables du développement de l'inflammation qui contribue activement à la destruction de la matrice articulaire, notamment en induisant la mort des chondrocytes. a) Reconstitution de milieu de culture reproduisant les effets d'une inflammation.
Les inventeurs ont reconstitué, in vitro, une culture de chondrocytes affectée d'une réaction inflammatoire. Le milieu de culture comprend du DMEM complémenté avec 10 % de sérum de veau, de la pénicilline et de la streptomycine (100 μg/ml).
Selon un premier mode opératoire, l'état inflammatoire est mimé en ajoutant au milieu standard précédemment exposé, une quantité de
CYTOMIX , un cocktail de cytokines comprenant, entre autres, du TNFα, de l'IL-1 et de l'INFγ. Pour ce faire, par millilitre de milieu standard, on ajoute 60 ng de Cytomix®.
Selon un deuxième mode opératoire, l'état inflammatoire est mimé grâce à la présence, dans le milieu standard, de macrophages ayant été préalablement activés par des exotoxines bactériennes. Cette approche complémentaire de la précédente permet de reproduire in vitro, l'interconnexion entre les chondrocytes de la matrice articulaire et les cellules du pool inflammatoire, et de reproduire ainsi des conditions proches de celles rencontrées in vivo.
Les chondrocytes sont cultivés dans ces différents milieux de culture pendant 48 heures avant d'apprécier la proportion de cellules mortes par apoptose :
- un milieu standard (st.),
- un milieu standard contenant des macrophages à l'état inactivé
(st. /Mac"),
- un milieu standard complémenté par le CYTOMIX (st.lCytom.),
- un milieu standard avec des macrophages activés (st./Mac ).
Le processus dégénératif des chondrocytes a été évalué par une mesure de la mort par apoptose, en utilisant un kit APOPTAG . Ce kit permet de visualiser les cassures d'ADN et de quantifier, par une lecture au microscope à fluorescence, le pourcentage de cellules en apoptose.
Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 2 ci- après, et sont également présentés sous la forme de bâtonnets à la figure 1.
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Tableau 2
Dans des conditions standard (culture des chondrocytes dans un milieu sans stress inflammatoire), l'apoptose des chondrocytes se produit pour environ 10 % des cellules, après 48 heures. Ce taux est de l'ordre de 22 %, lorsque les chondrocytes sont mis en co-culture avec des macrophages (non activés). Sous l'effet d'une inflammation simulée par la présence de CYTOMIX® dans le milieu de culture, ou par la présence de macrophages activés, les chondrocytes meurent par apoptose après 72 heures. Environ 80 % des chondrocytes meurent en moins de 48 heures. D'une part, ces résultats permettent de confirmer qu'une réaction inflammatoire a pour effet d'induire l'apoptose des chondrocytes.
D'autre part, ils démontrent que la complémentation d'un milieu de culture par le CYTOMDC permet de reproduire in vitro, les effets in vivo d'une réaction inflammatoire sur les chondrocytes et ce, de façon relativement similaire. Ce milieu de culture pro-inflammatoire peut être avantageusement utilisé comme modèle d'étude pour tester les effets potentiels de différents agents et substances sur la survie des chondrocytes cultivés dans un environnement inflammatoire. b) Etude de l'effet protecteur de la D-glucosamine et/ou de la lactoferrine et/ou de la chondroïtine sulfate
Les chondrocytes sont mis en culture dans un milieu
(R) standard additionné de CYTOMIX , éventuellement en présence des différentes substances à tester : D-glucosamine, lactoferrine et chondroïtine sulfate.
Après une période de culture de 48 heures, la proportion de
(K) cellules mortes par apoptose est évaluée en utilisant un kit APOPTAG .
Dans un premier temps, la D-glucosamine, la lactoferrine et la chondroïtine sulfate ont été étudiées individuellement pour leurs effets sur la survie des chondrocytes, en fonction de leur concentration dans le milieu de culture. Les études ont été menées notamment avec une
D-Glucosamine dérivée de la chitine extraite de la carapace de crustacés. Cette D-glucosamine, de poids moléculaire de l'ordre de 215 Da, est commercialisée notamment sous forme de poudre qui, en terme de poids de matière sèche, présente une teneur effective en D-glucosamine au moins de l'ordre de 99 %. S'agissant de la lactoferrine, son effet a été testé avec deux types de compositions de lactoferrine :
1) une composition de lactoferrine (Lf) pratiquement pure, sous forme de poudre ; cette composition de lactoferrine contient au moins 97 % (en poids de matière sèche) de protéines provenant du lait de vache, et dont au moins 90 % correspond à une lactoferrine native de poids moléculaire de l'ordre de 8O kDa ;
2) un co-isolat (co-Is), également sous forme de poudre, qui renferme au moins 90 % (en poids de matière sèche) des protéines provenant du lait de vache, et dont 45-60 % correspond à une lactoferrine native de poids moléculaire de l'ordre de 80 kDa (la partie protéique restante est essentiellement représentée par les autres protéines du lait telles que la lactoperoxydase, la β-lactoglobuline et la lactalbumine).
S'agissant de la chondroïtine sulfate, les tests ont été notamment réalisés avec une chondroïtine sulfate de poids moléculaire de l'ordre de 30-50 kDa, extraite de cartilages de sélaciens. Cette chondroïtine sulfate est disponible dans le commerce sous la forme d'une poudre qui, en terme de poids de matière sèche, présente une teneur effective en chondroïtine sulfate au moins de l'ordre de 90 %. Les compositions de D-glucosamine, de lactoferrine et de chondroïtine sulfate précédemment évoquées sont notamment commercialisées par la société BIO SERAE, France.
Le tableau 3 ci-après présente les résultats recueillis, exprimés en pourcentage de cellules mortes par apoptose, après 48 heures de culture dans un environnement inflammatoire, en fonction de la concentration des facteurs testés (exprimé en microgrammes de la composition de facteur) par millilitre de milieu de culture.
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Tableau 3
Les résultats correspondants sont également représentés, à la figure 2 sous la forme de courbes effet-dose.
Au vu de cette première série de résultats, on constate que la D-glucosamine (D-gluco.) présente un effet protecteur des chondrocytes qui est fonction de sa dose. Cet effet est mesurable dès la concentration de 0,001 μg/ml, pour atteindre un effet maximal aux alentours de 10 μg/ml. Dans les mêmes conditions, la lactoferrine, utilisée sous la forme d'une composition fortement concentrée (Lf), présente également un effet protecteur des chondrocytes. En comparaison avec la D-glucosamine, son effet est néanmoins plus limité.
Testé avec une composition de concentration moindre, en l'occurrence le co-isolat (co-Is.), l'effet protecteur de la lactoferrine n'est pas significatif dans les conditions d'expérimentation, lorsque cette substance est testée isolément d'autres agents actifs ou potentiellement actifs.
La même constatation est faite avec la chondroïtine sulfate, lorsqu'elle est testée isolément d'autres agents actifs ou potentiellement actifs. Dans un deuxième temps, les effets protecteurs des mélanges binaires suivants ont été testés :
- D-glucosamine + lactoferrine,
- D-glucosamine + chondroïtine sulphate, - D-glucosamine + lactoferrine (sous la forme d'une composition Lf
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ainsi que l'effet protecteur du mélange ternaire :
- D-glucosamine + lactoferrine + chondroïtine sulfate. Les tableaux 4 et 5 ci-après présentent les résultats obtenus.
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Les représentations graphiques en bâtonnets des figures 3a et 3b, élaborées à partir de données numériques sélectionnées du tableau 3, illustrent l'effet synergique entre la D-glucosamine et la lactoferrine.
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Tableau 5
c) Étude comparative des effets d'une réduction de l'inflammation générée par l'ibuprofène et des effets de compositions particulières conformes à l'invention, sur la survie des chondrocytes soumis à un environnement inflammatoire L'ibuprofène est un anti-inflammatoire non stéroïdien aux propriétés également analgésiques, antipyrétiques.
L'ibuprofène est largement prescrit dans le cadre du traitement des arthropathies, malgré ses effets indésirables potentiels : gastrite, stomatite, douleur abdominale, ulcération du tube digestif, jaunisse, céphalée, somnolence... Il est également assorti de nombreuses contre-indications, par exemple en cas d'antécédent d'ulcère gastrique ou duodénal, en cas d'insuffisance gastrique ou rénale, en cas de grossesse ou d'allaitement...
Les inventeurs ont comparé les effets d'une réduction de l'inflammation provoquée par l'ibuprofène avec les effets chondroprotecteurs de différentes compositions conformes à l'invention, sur la survie des chondrocytes cultivés dans un environnement inflammatoire.
A cet effet, les chondrocytes ont été mis en co-culture avec des macrophages préalablement activés par des exotoxines bactériennes, dans différents milieux de culture :
1) un milieu standard contenant de l'ibuprofène à une concentration molaire de 1 μM,
2) des milieux standard comprenant de la D-glucosamine (0,01 μg/ml) et/ou de la lactoferrine (0,001 μg/ml) et/ou de la chondroïtine sulfate (1 μg/ml).
La proportion de cellules mortes a été appréciée après 48 heures de culture.
Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 6 ci- après, et sont également présentés, sous forme graphique, à la figure 4.
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Tableau 6
Les résultats obtenus montrent que la D-glucosamine, la lactoferrine et la chondroïtine sulfate, lorsqu'elles sont testées seules (à la concentration indiquée) ne présentent pas une efficacité loin d'être comparable à celle d'une réduction de l'inflammation générée par l'ibuprofène. Cependant lorsque ces substances sont utilisées en association, conformément à l'invention, les effets sont au moins comparables.
2/ - Expérience d'induction de l'arthrite par le collagène de type II - Identification d'agents actifs aux effets protecteurs. Les inventeurs ont mené un ensemble de tests chez la souris visant à quantifier les effets protecteurs de diverses compositions per os contenant de la lactoferrine et/ou de la D-glucosamine et/ou de la chondroïtine sulfate à l'égard de l'arthrite induite par le collagène (collagène de type II).
A cet effet, les inventeurs ont utilisé des souris mâles DBA (H-2q), de 6-8 semaines, commercialisées par la société IFFA-CREDO (Les Oncins, France).
Chaque souris a été soumise à un régime alimentaire spécifique, comprenant ou non de la lactoferrine et/ou de la D-glucosamine et/ou de la chondroïtine sulfate, pendant 15 jours, avant qu'on ne lui inocule des doses efficaces de collagène de type II aux fins d'induire un état arthritique.
Aux fins de comparaison, les mêmes expériences ont également été réalisées en remplaçant les agents actifs précédents, par des antiinflammatoires connus et classiquement utilisés pour traiter les maladies articulaires dégénératives, notamment l'ibuprofène, l'aspirine et l'indométhacine. L'induction de l'arthrite a été réalisée avec une solution de collagène de type II émulsionnée avec un volume égal de CFA (GlBCO-BRL, Allemagne), injectée à la base de la queue de chaque animal. Un "boost" est effectué 3 semaines après, en utilisant une solution de collagène de type II émulsionnée dans de l'adjuvant incomplet de Freund. Les souris ont été suivies pendant 85 jours après, et sondées pour les symptômes cliniques de l'arthrite. a) Dosage des IgG2a anti-collagène de type II (IgG2a anti- CII), au niveau des articulations et du sérum des souris rendues arthritiques.
Les dosages ont été effectués avec la méthode d'ELISA. Pour ce faire, des plaques à micro-titre de 96 puits ont été recouvertes de collagène de type II, et laissées ainsi pendant toute une nuit avant d'être lavées au PBS. Les puits ont ensuite été chargés avec 100 μl de sérums, extraits des articulations et dilués dans du PBS. Différentes dilutions des sérums ont été appliquées.
Après un nouveau lavage intensif, des anticorps de chèvre anti-IgG de souris, conjugués à la phosphatase alcaline (PharMingen), ont été ajoutés aux puits.
Les puits ont été une nouvelle fois lavés intensivement, avant de procéder à la révélation des complexes anticorps antigène (anti-IgG de souris), au moyen d'un substrat de révélation usuel (kit ELISA, SIGMA). La concentration des complexes anticorps-antigène a été appréciée par une mesure de densité optique à 410 nm.
Le tableau 7 ci-après présente les DO correspondant aux dosages des IgG2a anti-collagène de type II réalisés sur des souris rendues arthritiques, par une induction au collagène de type II provoquée au bout de 15 jours d'un régime alimentaire ordinaire complémenté avec une des substances suivantes :
- l'ibuprofène,
- un mélange chondroïtine sulfate/D-glucosamine, 50:50 (en poids sec), - une première composition (Comp. T) particulière conforme à l'invention, comprenant un mélange lactoferrine/D-glucosamine/chondroïtine sulfate, 1:37,5:10,
- une deuxième composition (Comp. 2) particulière conforme à l'invention, comprenant un mélange lactoferrine/D-glucosamine/chondroïtine sulfate, 1:17,5:5.
La figure 8 montre les bâtonnets représentatifs du dosage photométrique (DO) des IgG2a anti-collagène de type II réalisés sur des souris rendues arthritiques par une induction au collagène de type II après une diète alimentaire ordinaire d'une durée de 15 jours et complémentée avec 5 mg par jour de l'une des substances suivantes:
- solution contrôle (C), - Chondroïtine sulfate (Cs),
- D-glucosamine (D Gluco),
- Lactoferrine (Cl),
- Composition particulière conforme à l'invention comprenant un mélange de Lactoferrine et de D-glucosamine, 1,2:1 (D Gluco+Cl),
- Composition particulière conforme à l'invention comprenant un mélange de lactoferrine, de D-glucosamine et de chondroïtine sulfate 1,2:1:1 (LGC),
- Ibuprofène 50 μM (Ib), - Indométhacine 50 μM (In),
- Aspirine 50 μM (As). b) Dosage de TNFα induit après un traitement au collagène de type II.
Parallèlement au dosage des IgG2a anti-CII, les inventeurs se sont aussi intéressés à celui du TNFα (tumor necrosis factor α), une cytokine inflammatoire utilisée ici comme marqueur de la gravité des symptômes arthritiques provoqués chez les souris.
Les résultats de dosage de TNFα obtenus sont également présentés dans le tableau 7 pour les compositions lactoferrine, D-glucosamine, chondroïtine sulfate 1:37,5:10 et 1:17,5:5 ci-après et sur la figure 6 pour la composition lactoferrine, D-glucosamine, chondroïtine sulfate 1,2:1:1.
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Tableau 7
La figure 6 montre les bâtonnets représentatifs du dosage du TNF-α. réalisé sur des souris rendues arthritiques par une induction au collagène de type II après une diète alimentaire ordinaire d'une durée de 15 jours et complémentée avec 5 mg par jour d'une des substances suivantes:
- solution contrôle (C),
- chondroïtine sulfate (Cs),
- D-glucosamine (D-Gluco), - Lactoferrine (Cl),
- Composition particulière conforme à l'invention comprenant un mélange de Lactoferrine et de D-glucosamine, 1,2:2, (D Gluco+Cl),
- Composition particulière conforme à l'invention comprenant un mélange de lactoferrine, de D-glucosamine et de chondroïtine sulfate 1,2:1:1 (LGC),
- Ibuprofène 50 μM (Ibu),
- Indométhacine 50 μM (Ind),
- Aspirine 50 μM (Asp). Ces quelques résultats démontrent de manière très significative un effet protecteur exercé par les compositions répondant à l'invention à l'égard de l'établissement et du développement des arthropathies. En effet, d'une part, la production de TNF-α par les cellules lymphoïdes de rate en réponse au collagène II est sensiblement réduite indiquant qu'une composition selon l'invention (Comp. 1 et Comp. 2 et LGC) exerce un contrôle sur les mécanismes de l'inflammation caractéristiques d'un état arthritique. D'autre part, on observe également une baisse du niveau des IgG2a anti-collagène de type II, chez les souris nourries avec une composition selon l'invention, par rapport aux souris suivant un régime alimentaire ordinaire. d) Evaluation de l'indice arthritique après traitements au collagène de type II
Les inventeurs ont également mené une série de tests visant à mesurer la fréquence d'apparition et la gravité des symptômes arthritiques (oedèmes prononcés et gonflement des articulations) provoqués chez la souris par traitement au collagène de type IL Les résultats sont donnés sur une échelle subjectivement graduée de 1 à 3.
La figure 5 décrit clairement un effet inhibiteur synergique caractéristique de la composition conforme à l'invention lactoferrine/D- glucosamine/chondroïtine sulfate 1,2:1:1 (LGC) sur l'inflammation induite par le collagène de type II en comparaison avec les traitements suivants:
- solution contrôle (C),
- chondroïtine sulfate (Cs),
- D-glucosamine (D Gluco), - lactoferrine (Cl),
- D-glucosamine+lactoferrine, 1:1,2 (D Gluco + Cl),
- lactoferrine+D-glucosamine+chondroïtine sulfate dans des proportions lactoferrine/D-glucosamine/chondroïtine sulfate, 1,2:1:1 (LGC)
Les inventeurs ont également constaté, au moyen d'analyses statistiques (non présentées ici) qu'un régime alimentaire complémenté avec une composition conforme à l'invention permettait de réduire notablement le risque pour les souris testées de développer une arthropathie. 20 à 55 % des souris soumises à un régime alimentaire complémenté par une composition selon l'invention développent les symptômes d'arthrite suite à une injection de collagène de type II : les souris ayant développé une arthropathie avaient des symptômes inflammatoires et des critères cliniques modérés. Pour les souris ayant un régime alimentaire ordinaire, cette proportion varie entre 84% et 100 % avec des symptômes sévères (gonflement de l'articulation, œdème). e) Dosage de l'INF-γ sur des souris
La figure 7 montre les bâtonnets représentatifs du dosage de l'INF-γ réalisé sur des souris rendues (à droite) ou non (à gauche) arthritiques au moyen d'un traitement avec du collagène de type II après une diète alimentaire ordinaire d'une durée de 15 jours complémentée avec 5 mg par jour d'une des substances suivantes avec 5 mg de composition par jour :
- solution contrôle (C), - Chondroïtine sulfate (Cs),
- D-glucosamine (D-Gluco),
- Lactoferrine (Cl),
- Composition particulière conforme à l'invention comprenant un mélange de Lactoferrine et de D-glucosamine 1,2:1 (D Gluco+Cl), - Composition particulière conforme à l'invention comprenant un mélange de lactoferrine, de D-glucosamine, chondroïtine sulfate 1,2:1:1 (LGC),
- Ibuprofène (Ibu) 50 μM,
- Indométhacine (Ind) 50 μM,
- Aspirine (Asp) 50 μM. On observe clairement, sur les souris pour lesquelles l'inflammation n'a pas été induite avec du collagène de type II une diminution significative du niveau d' l'INF-y basai comparable à la diminution observée avec les contrôles Ibuprofen, Indométhacine et Aspirine. En revanche, on observe, sur les souris pour lesquelles l'inflammation a été induite avec du collagène de type II, une forte diminution du niveau d'INF-γ chez les souris traitées avec la composition lactoferrine, D-glucosamine, chondroïtine sulfate 1,2:1:1, cette diminution de la production d'INF-γ étant plus importante que celles obtenues avec les compositions contrôle.

Claims

REVENDICATIONS
II - Composition destinée à être administrée par voie orale pour prévenir et/ou pour traiter des maladies articulaires dégénératives, comprenant, en tant que composants actifs, une quantité efficace de D- glucosamine, de lactoferrine et de chondroïtine sulfate.
2/ - Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite D-glucosamine consiste en au moins un sel de glucosamine choisi parmi le chlorhydrate de glucosamine et le sulfate de glucosamine.
3/ - Composition selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisée en ce que ladite D-glucosamine est exclusivement le chlorhydrate de glucosamine.
Al - Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite D-glucosamine a un poids moléculaire de l'ordre de 215 Da. 5/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite lactoferrine correspond à une fraction protéique particulière purifiée à partir de lait d'origine bovine.
6/ - Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite lactoferrine a un poids moléculaire de l'ordre de 80 kDa. 11 - Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit chondroïtine sulfate est extrait du cartilage de sélacien.
8/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit chondroïtine sulfate a un poids moléculaire de l'ordre de 30-50 kDa.
91 - Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle présente une proportion pondérale lactoferrine/ D-glucosamine comprise entre 1:40 et 20:1.
10/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle présente une proportion pondérale lactoferrine/ D-glucosamine de l'ordre de 1:10. 11/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle présente une proportion pondérale lactoferrine/ D-glucosamine de l'ordre de 1:1.
12/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle présente une proportion pondérale chondroïtine sulfate/D-glucosamine comprise entre 1:5 et 100:1.
13/ - Composition selon l'une des revendications I h 12, caractérisée en ce qu'elle présente une proportion pondérale chondroïtine sulfate/D-glucosamine de l'ordre de 1:2. 14/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant que composants actifs, une quantité efficace de lactoferrine, de D-glucosamine et de chondroïtine sulfate, avec une proportion pondérale lactoferrine/D-glucosamine/chondroïtine sulfate de l'ordre de 1:10:5. 15/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant que composants actifs, une quantité efficace de lactoferrine, de D-glucosamine et de chondroïtine sulfate, avec une proportion pondérale lactoferrine/D-glucosamine/chondroïtine sulfate de l'ordre de 1,2:1:1. 16/ - Composition selon les revendications 1 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace de lactoferrine, D- glucosamine et de chondroïtine sulfate déterminée pour une prise journalière correspondant à une quantité de D-glucosamine effective comprise entre 125 mg et 1850 mg, notamment de l'ordre de 550 mg, pour un adulte de l'ordre de 70 kg. 17/ - Composition selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace de D-glucosamine, de lactoferrine et de la chondroïtine sulfate déterminée pour une prise journalière totale comprise entre 320 mg et 2390 mg, notamment de l'ordre de 1000 mg, pour un adulte de l'ordre de 70 kg. 18/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un additif et/ou au moins un excipient acceptable du point de vue pharmaceutique et/ou alimentaire.
19/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une préparation choisie parmi : un médicament, un complément alimentaire, un alicament.
20/ - Utilisation d'une composition conforme à l'une des revendications 1 à 19 pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir et/ou à traiter des maladies articulaires dégénératives. 21/ - Utilisation d'une composition conforme à l'une des revendications 1 à 20 pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir et/ou à traiter l'arthrose.
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