WO2008007600A1

WO2008007600A1 - Procédé de détection du lupus érythémateux systémique

Info

Publication number: WO2008007600A1
Application number: PCT/JP2007/063446
Authority: WO
Inventors: Tetsuji Naka; Satoshi Serata
Original assignee: Japan Health Sciences Foundation
Current assignee: Japan Health Sciences Foundation
Priority date: 2006-07-12
Filing date: 2007-07-05
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2009-01-12
Also published as: JP2008020315A; JP5067921B2

Description

明細書

全身性エリテマトーデスの検査方法

技術分野

[0001] 本発明は、全身性エリテマトーデス (SLE)の新規マーカーとして、初めて抗アルドラーゼ A抗体及び該抗アルドラーゼ A抗体に対するェピトープ部分を確認したことによる、抗アルドラーゼ A抗体の測定方法及び SLEの検査方法に関する。

[0002] 本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願 2006— 192201号優先権を請求する。

背景技術

[0003] 全身性エリテマトーデス (systemic lupus erythematosus;以下「SLE」 t 、う。）は、膠原病の一種である。

膠原病は、結合組織と血管の炎症を主とし、自己抗体の出現を伴う原因不明の自己免疫性'難治性疾患である。膠原病には、慢性関節リウマチ (以下「RA」ともいう。 ) 、 SLE、全身性硬化症 (強皮症 )(SSc)、多発性筋炎 (PM)Z皮膚筋炎 (DM)、リウマチ熱 (RF)、結節性多発動脈炎（PN)に加え、混合性結合組織病 (MCTD)ゃシ一ダレン症候群（SjS)、ベーチェット病などの多くの類縁疾患がある。膠原病が疑われる場合には、まず一般検査が行われ、確定診断のために抗核抗体などの血清学的検査が行われる。

[0004] SLEは、免疫調節における広範囲の異常によって出現すると考えられている全身性の自己免疫疾患である (Wakeland et al, Immunity 15, 97〜408(2001) ;Marrack et al, Nat. Med. 7, 899〜905(2001))。 SLE患者には、核内タンパク質、 DNA、リン脂質などに対する自己抗体が出現する。現在は、 SLEの検査のために抗 Sm抗体及び抗 dsDNA抗体を測定する方法が一般的に行われて、る。抗 Sm抗体にっ、ての検查結果は SLEに非常に特異性が高いものの、感度が 5〜30%であり、抗 Sm抗体だけでは SLEの診断に有用とはいえない。また、抗 dsDNA抗体についての検査結果は疾患の活動性に相関する力 SLEに対する特異性が低い。

[0005] 一方、膠原病の一種である RAのマーカーとして抗アルドラーゼ抗体が使用可能なことが開示されている（特許文献 1)。また、ヒトアルドラーゼ Aの N末から 38番目までのアミノ酸力もなるポリペプチド力 RAにおける抗アルドラーゼ抗体に対する抗原ポリペプチドとして有用であることが開示されている（特許文献 2)。し力しながら、 RAが膠原病の一種として SLEとは共通して、るとしても、これらの疾病の臨床症状は異なり、各々の原因にっヽても全く異なる疾患として捉えられて、る。

[0006] さらに、糖尿病性網膜症の診断マーカーとして抗アルドラーゼ自己抗体に着目した報告がある（非特許文献 1)。また、アルッノ、イマ一の患者からの抗アルドラーゼ抗体の標的抗原となるアルドラーゼの単離にっ、て報告がある (非特許文献 2)。しかしながら、これらの疾患は SLEとは全く相違する。

[0007] SLEについて、従来の疾患マーカーによる検査方法に比べ、より感度及び特異性の高い疾患マーカーの解明ならびに検査方法が、診断及び予後の推定のために望まれている。

特許文献 1：特開平 11― 94836号公報

特許文献 2 :特開 2000— 178299号公報

非特許文献 1 : Bo- Young Ahn et al., Proteomics 2006, 6, 0000- 0000(www.proteomic s- journal.com)

非特許文献 2 : Felix Mor et al., J. Immunology 2005, 3439-3445

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明は、 SLEの検査方法に関し、従来の抗 Sm抗体及び Z又は抗 dsDNA抗体を測定する検査法に比べて、より感度及び特異性の高、検査方法を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者らは上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、抗アルドラーゼ A抗体が SLEの疾患マーカーとなりうることを初めて確認した。更に検討を重ねた結果、 SLEのマーカーである抗アルドラーゼ A抗体に対するェピトープ部分力アルドラーゼ Aの特定の領域に存在することを見出し、本発明を完成した。

[0010] すなわち、本発明は以下よりなる。 1.配列表の配列番号 1に示すアミノ酸配列の N末端から第 94位〜第 183位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号 2)、あるいは配列番号 2に示されるアミノ酸配列のうち 1個若しくは複数個のアミノ酸力置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列の領域力選択され、少なくとも 4個のアミノ酸を含むアミノ酸配列力なることを特徴とする、抗アルドラーゼ A抗体に対する抗原性を有するポリペプチド。

2.前項 1に記載のポリペプチドを少なくとも 1種用いることを特徴とする抗アルドラーゼ A抗体の測定方法。

3.前記測定方法が、前項 1に記載のポリペプチドの少なくとも 1種を抗原ペプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗アルドラーゼ A抗体との反応産物を検出することにより抗アルドラーゼ A抗体の測定を行う、前項 2に記載の抗アルドラーゼ A抗体の測定方法。

4.前項 2又は 3に記載の抗アルドラーゼ A抗体の測定方法を用いた全身性エリテマトーデス (SLE)の検査方法。

5.前項 1に記載のいずれ力 1種又は複数種のポリペプチドに対する抗体を SLEの疾患マーカーとして検出する SLEの検査方法。

6.配列表の配列番号 2、あるいは配列番号 2に示されるアミノ酸配列のうち 1個若しくは複数個のアミノ酸力置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原ペプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗アルドラーゼ A抗体との反応産物を検出することによる SLE検査方法。

7.全長アルドラーゼ Aを抗原ペプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗アルドラーゼ A抗体との反応産物を検出することによる SLE検查方法。

8.前項 4〜7のいずれ力 1項に記載の SLEの検査方法に加え、さらに抗 Sm抗体及び Z又は抗 dsDNA抗体の測定を行う SLEの検査方法。

9.配列表の配列番号 2、又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列のうち 1個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは前項 1に記載のポリペプチドを少なくとも 1種含む SLE検査用試薬。発明の効果

[0011] 本発明の抗アルドラーゼ A抗体の測定による検査を行うと、感度及び特異性の高い SLEの検査を行うことができる。また、アルドラーゼ Aポリペプチドは ELISA法に適用することができるため、多くの検体を処理することができ、より早期に SLEの検査を行うことができる。さらに、従来行われていた抗 Sm抗体及び Z又は抗 dsDNA抗体の検査も並行して組み合わせて行うことにより、より感度及び特異性の高い SLEの検査方法を提供することができる。

図面の簡単な説明

[0012] [図 1]培養細胞（HUVEC)のタンパク質抽出物についての 2D— PAGE法によるタンノク質展開パターンを示す図である。（実施例 1)

[図 2]図 1で展開したタンパク質に対して、 SLE患者血清を反応させたときのゥエスタンブロッテイング結果を示す図である。（実施例 1)

[図 3]図 1で展開したタンパク質に対して、健常人の血清を反応させたときのゥエスタンブロッテイング結果を示す図である。（実施例 1)

[図 4]図 1で展開したタンパク質に対して、抗アルドラーゼ抗体を含む試料を反応させたときのウェスタンブロッテイング結果を示す図である。（実施例 1)

[図 5]アルドラーゼ Aの部分欠失変異体を示す図である。（実施例 3)

[図 6]抗アルドラーゼ A抗体のェピトープを確認するためのウェスタンブロッテイング結果を示す図である。（実施例 3)

[図 7]アルドラーゼ Aを抗原ペプチドとしたときの ELISA結果を示す図である。（実施例 4)

[図 8]アルドラーゼ Aを抗原ペプチドとしたときの ELIS A結果を示す図である。図 7の SLE患者を腎障害の有無でグループ分けした。（実施例 4)

発明を実施するための最良の形態

[0013] 本発明にお、て、配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列は、 NCBI accession

No. NP_000025により特定されるヒトアルドラーゼ Aを構成するアミノ酸配列である。

[0014] 本発明のポリペプチドは、本発明の抗アルドラーゼ A抗体に対して抗原性を有するポリペプチドをいう。本発明の抗アルドラーゼ A抗体は、 SLEの疾患マーカーとなりうる抗体をいう。本発明のポリペプチドは、具体的には、配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列のうち、 N末端力も第 94位〜第 183位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号 2)から選択されるポリペプチドであり、抗アルドラーゼ A抗体に対して抗原性を有するものをいう。抗体に対して抗原性を有するポリペプチドとしては、少なくとも 4個のアミノ酸を含むことが必要とされる。したがって、本発明のポリペプチドは、少なくとも 4個のアミノ酸を含み、上記の領域から選択されるアミノ酸配列を有し、抗アルドラーゼ A抗体に対して抗原性を示すポリペプチドであれば、ポリペプチドに含まれるアミノ酸の数は特に限定されない。

[0015] また、本発明のポリペプチドは、上記に限定されるものではなぐ配列番号 2に示されるアミノ酸配列のうち、 1個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列の領域力選択され、抗アルドラーゼ A抗体に対する抗原性を有するポリペプチドであってもよ、。

[0016] さらに、本発明のポリペプチドは、本発明における抗アルドラーゼ A抗体を検出しうるのであれば、配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列のうち、 N末端力も第 94 位〜第 183位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号 2)あるいは、配列番号 2に示されるアミノ酸配列のうち、 1個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列を含むアルドラーゼ Aであってもよい。具体的には、全長ァルドラーゼ Aであってもよ、。

[0017] 本発明の抗アルドラーゼ抗体の測定方法において使用されるポリペプチドは、上記力選択される少なくとも 1種のポリペプチドである。特異性及び測定感度を向上させるために、複数種のポリペプチドを組み合わせて使用してもよい。例えば、配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよいし、本発明のポリぺプチドに適合する少なくとも 4個のアミノ酸を含むポリペプチドであってもよい。また、これらカゝら選択される複数種のポリペプチドが混在したものであってもよい。

[0018] SLEなどの自己免疫疾患の患者が産生しうる自己抗体は、ポリクローナル抗体であるため、上記本発明の抗アルドラーセ抗体の測定方法に用いられる抗原ペプチドは、それ自体が複数個所にェピトープを有するものであってもよいし、複数種の抗原ペプチドを含むものであってもよ、。 [0019] 本発明の抗アルドラーセ抗体の測定方法又は SLEの検査方法において、検体として、血清、血漿などの体液を使用することができる。

[0020] 本発明の抗アルドラーゼ抗体の測定方法は、該アルドラーゼ抗体と本発明のポリべプチドの抗原抗体反応を検出しうる免疫学的手法による。そのような免疫学的手法としては、ラテックス凝集法、ォクタ口-一法、免疫クロマトグラフィー法や ELISA法などの自体公知の手法を適用することができる。多くの検体を処理しうる ELISA法が、特に好適である。具体的には、本発明のポリペプチドを抗原ペプチドとして固相に固定し、該固相に固定した抗原ペプチドに検体を接触させ、抗原ペプチドと検体中に含有可能性のある抗アルドラーゼ抗体との免疫複合体、又は反応産物を検出することで、抗アルドラーゼ抗体を測定することができる。 ELISA法の実施に伴う非特異反応の抑制方法や、検出の際に使用しうる標識物質、測定機器などは、自体公知のもの、又は今後開発されるものを適用することができる。

[0021] 本発明は、本発明のポリペプチドを少なくとも 1種用いることによる抗アルドラーゼ抗体の測定方法及び該抗アルドラーゼ抗体の測定方法を用いた SLEの検査方法にも及ぶ。さら〖こは、本発明のポリペプチドを少なくとも 1種含む SLE検査用試薬にも及ぶ。また、前記検査用試薬を含み、その他 ELISA法などに使用するマイクロプレート、標識物質など適宜必要な器具及び Z又は試薬を含む SLE検査用キットにっ、ても本発明に含まれる。

実施例

[0022] 以下、本発明の理解を深めるために、本発明のポリペプチドの発明に至る経緯を実施例により説明し、本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな、ことは、うまでもな!/、。

[0023] (実施例 1) SLEの患者血清中の新規自己抗原の同定

SLEにおいては症状の一つとして血管に炎症が起きることから、血管内皮細胞由来である HUVEC (正常ヒト臍帯静脈内皮細胞)力もタンパク質を抽出し、 SLEの患者血清中の自己抗体が反応する新規自己抗原の同定を試みた。

[0024] まず、 HUVECからタンパク質を抽出し、該抽出したタンパク質を 2D— PAGEでゲル上にスポットとして展開した（図 1参照)。展開したタンパク質を、 PVDF膜に転写して、患者血清を抽出したタンパク質と反応させ、ウェスタンプロット法により患者血清中に存在する抗体と展開した各タンパク質との抗原抗体反応パターンを調べた (図 2参照)。健常ヒト血清でのウェスタンプロットパターン (図 3参照）と比較し、患者血清中で特異的に見られる陽性スポットを自己抗原とした。また、抗アルドラーゼ A抗体を含む試料でのウェスタンプロットパターンも調べた (図 4参照)。

[0025] 1) HUVECからのタンパク質の抽出方法

HUVECは CHAMBREX社力購入し、添付の培地を用いて培養した。増殖した H UVECを PBS (―)で洗浄後、細胞剥離器 (cell scraper)ではがし、遠心分離により細胞を回収し 7こ。タンノヽク質抽出用やット (complete mammalian proteome extraction kit (Calbiochem社)）を用いて HUVECから 2D— PAGE用にタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質は、タンパク質定量キット（RC- DC Protein Assay kit (Bio-Rad Labo ratories社)）を用いてゥシ血清アルブミン（BSA)をスタンダードとして定量した。

[0026] 2) 2D— PAGEの手技

抽出したタンパク質 50 μ gを 7Μ尿素 (urea)、 2Mチォ尿素 (thiourea)、 4%CHAP ¾ (3— [(3— cholamidopropyl)— dimethylammonio]— 1 -propane sulfonate)緩 ¾r揿、 2mM TBP(tributyl phosphine)、 0. 0002%ブロモフエノールブルー（BPB)、電解質（0. 2% biolyte 3- 10(Bio- Rad))を含む膨潤溶液で溶かし、等電点電気泳動 (IEF)を行つた o

[0027] IEFの条件は以下の通りである。 IEFには 11cmのストリップ (ReadyStrip™ IPG strip s pH3-10NL)を用いた。タンパク質を含む膨潤溶液で 12時間、 50Vの電圧をかけてストリップゲルを膨潤させ、タンパク質をゲルに取り込ませた。膨潤後、 2時間で 250V 、その後 1時間で 8, 000Vまで上昇させ、 45, OOOVh通電した。 IEF後のストリップゲルを以下の手順で還元アルキルィ匕した。

[0028] 最初に 20mgZml DTTを含む平衡化緩衝液（50mM Tris—HCl、 6M尿素、 2 0%vZvグリセロール、 2%SDS、 pH8. 8)で 20分間振とうし、その後、 25mg/ml ョードアセトアミドを含む平衡ィ匕緩衝液で 13分間遮光して振とうした。続いて、 2次元電気泳動は 10% Bis-Tris Criterion™ XT Precast gel (Bio-Rad Laboratories社)を用いて泳動した。展開したタンパク質の染色には MS (Mass Spectrometry)銀染キット (和光純薬社)により染色した。

[0029] 3)ウェスタンブロッテイング

上記の手法により 2D— PAGEによりゲル上に展開した HUVECタンパク質を PVD F膜に電気転写し、 SLE患者血清を用いて自己抗体が反応する新規自己抗原の探索を行った。血清の非特異的な反応を防ぐために、タンパク質を転写した PVDF膜を 5%スキムミルク ZPBST(PBS + 0. 1% Tween20)により室温で 1時間振とうしブロッキングした。 PVDF膜を PBSTで洗浄後、 PBSTで 150倍希釈した SLE患者血清を用いて PVDF膜を室温で 1時間インキュベートした。 PBSTで 10分間、 3回ずつ洗浄した後、 PBSTで 5,000倍希釈した HRP標識抗ヒト IgG (GE healthcare社)を用いて PVDF膜を室温で 1時間インキュベートした。 PBSTで 10分間、 3回ずつ洗浄し 7こ後、光反ンスアム、 chemiluminescence reaction system (PerkinElmerfc )【こより、自己抗体が反応する自己抗原を検出した。タンパク質は 2D— PAGEで展開しているため、自己抗原はスポットとして検出される。

[0030] 患者血清に特異的なスポットに相当するタンパク質を染色したゲル力切り出し、トリブシンを用いたゲル内消化によりペプチドとして回収し、質量分析にて解析した。質量分析のデータを解析ソフトによりデータベースサーチすることでタンパク質を同定した。解析ソフトの例として、 MASCOT(Matrix science社）が挙げられる。このような手法を免疫プロテオミクス法と、う。

[0031] 4)トリプシンを用いたゲル内消化方法、

ゲノレ内消化は、以下の論文に従って行った (Shevchenko A et al, Anal Chem 1996, 68, 850-8.)。トリプシン消化ペプチドは、 5%トリフルォロ酢酸 (TFA)、 45%蒸留水（ DW)、 50%CH CNにより抽出し、凍結乾燥した。その後、 0. 1%TFA, 2%CH C

3 3

N, 98%DWで溶解し、質量分析のサンプルとした。

[0032] 5)質量分析法

質量分析は、液体クロマトグラフィー (LC)と質量分析計 (MS)を組み合わせた LC /MS解析システムにより行った。 LCは、逆相 HPLCシステムにより、 Magic 2002 ca pillary HPCL (Michrom BioResources社)を用い、カラムは C— 18 RP column (length 1 5 cm, i.d. 200 mm; GL Sciences Inc社)を用いた。

[0033] ペプチドは以下の溶媒 A、溶媒 Bを 30分で 5〜65%にグラジェントをかけることで力ラム力も溶出した (溶媒 A : 0. 1%ギ酸を含む 2 : 98のァセトニトリル Z蒸留水;溶媒 B : 0. 1%ギ酸を含む 95 : 5のァセトニトリル/蒸留水）。ナノスプレーイオン源を介してイオン化したペプチドは LCQイオントラップ型質量分析機 (ThermoElectron社)で解祈した。データは、全 MSスキャンとそれに続いて最も強いピークを MSZMSスキヤンにより得た。 MS/MSスペクトルは MASCOT検索プログラム (Matrix Science社)を用い、ヒトタンノク質スイスプロットデータベース (human protein Swiss— Prot database) に対してデータベースサーチをした。

[0034] 上述の免疫プロテオミクス法により、 HUVECのタンパク質抽出液力 SLEの新規自己抗原として、アルドラーゼ A (Aldlase A)を同定した。また、同手法により SLEの既知の自己抗原である SS— BZLa、 GAPDH(glyceraldehydes- 3- phosphate dehyd rogenase)、 hnRNP A2/B 1 (heterogeneous nuclear rioonucleoprotein A2/B1)、 "7 ネキシン A2(annexin A2)、等の自己抗原も検出できた（図 2参照)。このことより、免疫プロテオミクス手法力自己抗原のスクリーニングとして有用であることが示された。

[0035] (実施例 2)抗アルドラーゼ抗体の SLE疾患マーカーとしての有用性

アルドラーゼ Aに対する抗アルドラーゼ A抗体力 SLEの疾患マーカーとして有用か否かを確認するため、抗アルドラーゼ A抗体の検出方法の確立を試みた。アルドラーゼ Aについて、遺伝子をクローユングし、遺伝子組み換えタンパク質を大腸菌発現系により大量発現、精製した。アルドラーゼ Aの組換タンパク質と患者血清でゥエスタンブロット法により血清の反応性を再度確認した。

[0036] アルドラーゼ Aの遺伝子は、 HEK293 (ヒト胎児腎細胞）の cDNAライブラリーに対し、アルドラーゼ Aに特異的なプライマーを用いて PCRにより増幅した。 PCR産物を大腸菌発現ベクターである PET28の Ndelサイトにクローユングした。 DNAシーケンス解析により遺伝子配列が正しいことを確認した。組み換えタンパク質は、精製を容易にするため、 N末端に 6 X Hisを融合したタンパク質として発現させた。 pET28 Ald-A を BL21(DE3)codon plus RIL (Stratagene社)に形質転換し、組み換えアルドラーゼ A の大量発現を行った。形質転換した大腸菌を 50 gZmlカナマイシンを含む LB培地で培養し、濁度 600nm力 SO. 6に達して力ら 0. 4mMの IPTG ( j8—ガラクトシターゼ活性の誘導物質)を加え、 25°C、 2時間で発現を誘導した。発現を誘導した大腸菌を遠心分離により回収し、 PBS + 1%トリトン X100+ 1%プロテアーゼ阻害剤 (Protease inhibitor cocktail (ナカライテスタ社))で懸濁し、超音波破砕により大腸菌を破砕した。大腸菌破砕液は高速遠心機により上清と沈殿に分離した。組み換えアルドラーゼ Aは上清から精製した。まず、 PBS + lmMイミダゾールで平衡化させた Niセファロ一ス榭脂 (GE healthcare社)と遠心上清を 4°Cで 1時間インキュベートさせた後、カラムに移し、 PBS + 30mMイミダゾールで洗浄し、 PBS + 250mMイミダゾールで溶出した。溶出したタンパク質は PBSで透析し、遠心上清を— 85°Cで保存した。精製したタンパク質は、タンパク質定量キット (Bio-Rad Laboratories社)を用いて、 BSAをスタンダードとして定量した。

[0037] (実施例 3)抗アルドラーゼ A抗体ェピトープの確認

背景技術の欄で説明したように、特許文献 1及び特許文献 2において、 RAでは抗アルドラーゼ A抗体がマーカーとなりうること、また該抗アルドラーゼ A抗体の認識部位はアルドラーゼ Aの N末端アミノ酸側 (第 1位〜第 38位）に存在することが報告されている。そこで、本発明における SLEのマーカーとなりうる抗アルドラーゼ A抗体に対するェピトープとなりうる領域について確認した。

[0038] 正常なアルドラーゼ A (全長アルドラーゼ A)は、配列表の配列番号 1に示す 363個のアミノ酸より構成される。そこで、アルドラーゼ Aについて第 274位〜第 363位のァミノ酸領域、第 184位〜第 363位のアミノ酸領域、第 94位〜第 363位のアミノ酸領域の各 C末端側のアミノ酸領域を欠損させた 3種類の欠損変異体 (deletion mutant),ァルドラーゼ A C-del 1〜3を人工的に作製した（図 5参照）。 SLE患者血清中の抗アルドラーゼ A抗体に対するェピトープ領域を、全長アルドラーゼ A及び 3種類の欠損変異体を抗原としてウェスタンブロッテイングにより確認した。

[0039] 1)アルドラーゼ A C-del 1〜3の 3種類の欠損変異体の作製

アルドラーゼ A C-del 1〜3の 3種類の欠損変異体を作製するために、それぞれの領域に対してプライマーを作製し、 pET28 AW-Aを铸型として PCRを行い、それぞれの欠損変異体を増幅した。これらの産物を pET28の Ndelサイトにクローユングした。 D NAシーケンス解析により遺伝子配列が正、ことを確認した。組み換えタンパク質は、精製を容易にするため、 N末端に 6 X His融合したタンパク質として発現させた。それぞれの発現ベクターを pET28Ald- A C-del 1, pET28Ald- A C- del 2, pET28Ald- A C-del 3と名付けた。 3種類の発現ベクターをそれぞれ BL21(DE3)codon plus RIL ( Stratagene社)に形質転換し、組み換えアルドラーゼ A C-del 1〜3の大量発現を行つた。形質転換した大腸菌を 50 gZmlカナマイシンを含む LB培地で培養し、濁度 6 OOnm力 . 6に達してから 0. 4mM IPTG、 25°C、 2時間発現を誘導した。発現を誘導した大腸菌を遠心分離により回収し、 PBS + 1%トリトン X100+ l%プロテアーゼ阻害剤け力ライテスタ社)で懸濁し、超音波破砕により大腸菌を破砕した。大腸菌破砕液は高速遠心機により上清と沈殿に分離した。組み換えアルドラーゼ A C-del 1〜 3は沈殿（封入体 (Inclusion body))から精製した。封入体を PBS +4%トリトン X100で洗浄後、遠心分離した。次に、封入体を蒸留水で洗浄し、遠心分離した。 PBS + 8M 尿素 + 10mM DTTで封入体からタンパク質を抽出し、 PBSで 10倍に DTTを希釈後、 PBS + lmMイミダゾールで平衡化させた Niセファロース榭脂 (GE healthcare社）と室温で 1時間インキュベートし、榭脂に組み換えタンパク質を吸着させた。タンパク質を吸着させた榭脂をカラムに移し、 PBS + 8M尿素 + 30mMイミダゾールで洗浄し、 PBS + 8M尿素 + 250mMイミダゾールで溶出し— 85°Cで保存した。溶出したタンパク質はタンパク質定量キット (Bio-Rad Laboratories社)を用いて、 BSAをスタンダードとして定量した。

2)ウェスタンブロッテイング

ウェスタンブロッテイングには、全長アルドラーゼ Aとアルドラーゼ A C-del 1〜3を 2 OOngずつ混合し、ゲル（10% Bis-Tris Criterion™ XT Precast gel (Bio-Rad Laborato ries社)）を用いて電気泳動を行った。続いて PVDF膜に電気転写し、 5%スキムミルクで 1時間ブロッキングし、 1レーンずつ短冊状に切断し、 PBSTで 1,000倍希釈した巿販アルドラーゼ A抗体 (Santa Cruz社)、又は PBSTで 150倍希釈した血清を用いて、室温で 1時間インキュベートした。 PBSTで 10分間、 3回ずつ洗浄した後、 PBSTで 5, 000倍希釈した HRP標識抗ャギ抗体 (Santa Cruz社)又は、 HRP標識抗ヒト IgG(GE healthcare社)を用いて PVDF膜を室温で 1時間インキュベートした。 PBSTで 10分間、 3回ずつ洗浄した後、蛍光反応システム (PerkinElmer社)により、反応したタンパク質を検出した。

[0041] 3)ウェスタンブロッテイング結果

SLE患者では全長アルドラーゼ八、アルドラーゼ A C-del 1及び C- del 2でバンドが認められたのに対し、アルドラーゼ A C-del 3ではバンド反応が認められなかった。すなわち、 SLE患者に認められる抗アルドラーゼ抗体のェピトープとなりうる領域は、アルドラーゼ Aを示す配列番号 1に示すアミノ酸配列のうち、第 94位〜第 183位の領域 (配列番号 2)に含まれることが考えられた (図 6参照)。

[0042] 一方、疾患コントロールとして RA患者についても同様の検討を行った。その結果、全長アルドラーゼ A及びアルドラーゼ A C-del 1〜3のすベてにおいてバンドが認められた。すなわち、 RA患者に認められる抗アルドラーゼ抗体のェピトープとなりうる領域は、アルドラーゼ Aを示す配列番号 1に示すアミノ酸配列のうち、第 1位〜第 93位の領域に含まれることが考えられた（図 6参照)。このことより、 SLE患者に認められる抗アルドラーゼ抗体に対するェピトープは、 RA患者に認められる抗アルドラーゼ抗体に対するェピトープとは異なることが確認された。

[0043] (実施例 4) ELISA法による確認

ELISA法により 40名の患者血清を用いてアルドラーゼ Aについての自己抗原陽性率を解析し、疾患マーカーとしての有効性を検証した。その結果、約 30%の患者にお、て抗アルドラーゼ A抗体が検出された（図 7参照)。また SLE患者のうちでもより重症である腎障害のある SLE患者の 64. 7%において、抗アルドラーゼ抗体陽性を示すことが判明した（図 8参照)。一方、健常人 19名の血清を用いて同様の解析を行った結果、抗アルドラーゼ抗体陽性率は 0%であった（図 7、 8参照)。

[0044] さらに、疾患コントロール群として自己免疫疾患である RA患者 49名及び多発性筋炎 (PM)患者 11名について同様の解析を行った。その結果、抗アルドラーゼ抗体陽性率は、それぞれ 8. 2%、 18. 2%であった（図 7、 8参照）。

[0045] 大腸菌発現系で大量発現、精製した全長アルドラーゼ Aを PBSで 10 μ gZmlに希釈し、 96ゥエルプレート (MaxiSorp Nunc社)に 100 1ずつ加え、シールし、 4°Cで一晚インキュベートし抗原をプレートに固相化した。次に、 PBSでゥエルを洗浄後、 1% BSAを含む PBSを 100 1ずつ加え、シールし室温で 2時間振とうし、ブロッキングを行った。検体は SLE患者 40名、 RA患者 49名、 ΡΜ患者 11名及び健常人 19名を用いた。血清を抗原と反応させる際に、大腸菌タンパク質に対する血清中の抗体を吸収させるため、血清を、 BL21(DE3)codon plus RILのタンパク質（0. lmg/ml)を含む PBSTで血清を 500倍希釈し、室温で 1時間振とうした。ブロッキング後のプレートを PBSで洗浄し、希釈した血清を 100 1ずつ加え、シールして室温で 1時間振とうし、インキュベートした。

[0046] 続、て、ゥエルを 200 μ 1の PBSTで 5回洗浄し、 PBSTで 5,000倍希釈した111^標識抗ヒト IgG(GE healthcare社)を 100 μ 1ずつ加え、シールして室温で 1時間振とうし、インキュベートした。ゥエルを 200 μ 1の PBSTで 5回洗浄した。 TMB+ (Dako社）を 10 0 μ 1ずつゥエルに加え、シールして室温で、振とうして発色させ、 100 μ 1の停止液（ KPL社）をカ卩え、 450nmの吸収をマイクロプレートリーダー (Immuno- mini NJ-2300 m icroplate reader (Nalge Nunc International, Tokyo, Japan))で測定した。検体の吸光度 Z (健常人の吸光度の平均値 + 3 X健常人の標準偏差） X 100で計算し、グラフ化した。この式から 100結合単位 (100 binding unit)をカットオフ値とした。

[0047] 上記により、アルドラーゼ Aに関し、 SLE患者と RA患者では、異なる自己抗原を有することが示唆された。したがって、 SLE患者の場合は、 RA患者とは異なるェピトープを認識する抗アルドラーゼ A抗体であることが確認された。

産業上の利用可能性

[0048] 以上説明したように、抗アルドラーゼ A抗体を測定して SLEにつ、て検査を行うと、従来の検査方法に比べて、より感度及び特異性の高、検査方法を行うことができる。また、アルドラーゼ Aは、 ELISA法に適用することができる。さらに、従来行われていた抗 Sm抗体及び Z又は抗 dsDNA抗体の検査を行うことにより、より感度及び特異性の高い SLEの検査方法を提供することができる。その結果、多種類の検体を処理することができ、 SLEの早期診断が可能となる。さらに、 SLEの早期診断を可能とすることにより、 SLEに対する適切な治療方法を早期に提供することができる。

Claims

請求の範囲

[1] 配列表の配列番号 1に示すアミノ酸配列の N末端力も第 94位〜第 183位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号 2)、あるいは配列番号 2に示されるアミノ酸配列のうち 1個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列の領域力選択され、少なくとも 4個のアミノ酸を含むアミノ酸配列力なることを特徴とする、抗アルドラーゼ A抗体に対する抗原性を有するポリペプチド。

[2] 請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドを少なくとも 1種用いることを特徴とする抗ァルドラーゼ A抗体の測定方法。

[3] 前記測定方法が、請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドの少なくとも 1種を抗原べプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗アルドラーゼ A抗体との反応産物を検出することにより抗アルドラーゼ A抗体の測定を行う、請求の範囲第 2項に記載の抗アルドラーゼ A抗体の測定方法。

[4] 請求の範囲第第 2項又は第 3項に記載の抗アルドラーゼ A抗体の測定方法を用いた全身性エリテマトーデス (SLE)の検査方法。

[5] 請求項 1に記載のいずれか 1種又は複数種のポリペプチドに対する抗体を SLEの疾患マーカーとして検出する SLEの検査方法。

[6] 配列表の配列番号 2、あるいは配列番号 2に示されるアミノ酸配列のうち 1個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原ペプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗アルドラーゼ A抗体との反応産物を検出することによる SLE検査方法。

[7] 全長アルドラーゼ Aを抗原ペプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗アルドラーゼ A抗体との反応産物を検出することによる SLE検查方法。

[8] 請求の範囲第 4項〜第 7項のいずれか 1項に記載の SLEの検査方法に加え、さらに抗 Sm抗体及び Z又は抗 dsDNA抗体の測定を行う SLEの検査方法。

[9] 配列表の配列番号 2、又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列のうち 1個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列を含むポリぺプチド、あるいは請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドを少なくとも 1種含む SLE検查用試薬。