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WO2008004542A1 - Method of separating vesicle, process for producing medicinal preparation, and method of evaluation - Google Patents

Method of separating vesicle, process for producing medicinal preparation, and method of evaluation Download PDF

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WO2008004542A1
WO2008004542A1 PCT/JP2007/063287 JP2007063287W WO2008004542A1 WO 2008004542 A1 WO2008004542 A1 WO 2008004542A1 JP 2007063287 W JP2007063287 W JP 2007063287W WO 2008004542 A1 WO2008004542 A1 WO 2008004542A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hydrophilic polymer
closed
membrane
ribosome
vesicle
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2007/063287
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English (en)
French (fr)
Inventor
Keisuke Yoshino
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Terumo Corp
Original Assignee
Terumo Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Terumo Corp filed Critical Terumo Corp
Priority to EP07768061.9A priority Critical patent/EP2039350A4/en
Priority to US12/307,232 priority patent/US20090232883A1/en
Publication of WO2008004542A1 publication Critical patent/WO2008004542A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
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    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
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    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction, e.g. ion-exchange, ion-pair, ion-suppression or ion-exclusion
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
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    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
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    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
    • Y10T428/2984—Microcapsule with fluid core [includes liposome]

Definitions

  • the present invention relates to a method for separating a membrane-modified closed vesicle, a method for producing a purified preparation using the separation method, a closed vesicle having a controlled desired hydrophilic polymer modification rate, and a method for producing the same
  • the present invention relates to a method for evaluating agents.
  • DDS drug delivery systems
  • closed vesicles such as ribosomes, emulsions, lipid microspheres, and nanoparticles as drug carriers (carriers)
  • carriers drug carriers
  • the retention in blood is a property that a drug is present in blood, and if the retention in blood is improved, a smaller amount of drug can be administered.
  • Increasing the retention of closed vesicles in blood is thought to allow passive accumulation in tissues with increased vascular permeability, such as tumor tissue and inflammatory sites, and as a result, reach the target site with high selectivity. It is considered possible.
  • the modification amount of the hydrophilic polymer and the membrane surface distribution state depend on the function of the preparation, that is, the blood retention and physical chemistry of the preparation. It is an important factor related to physical stability. In particular, even if it is a hydrophilic polymer with low toxicity, it is desirable to reduce the amount when considering in vivo administration, and excessive membrane modification tends to cause membrane instability. Before the expected retention in blood, it is not preferable from the viewpoint of manufacturing cost due to defective products. From these viewpoints, it is desired that the modification with the hydrophilic polymer in the preparation is carried out with the minimum necessary amount.
  • the amount of hydrophilic polymer introduced can be determined by quantifying the amount of force that has not been removed in the removal treatment after the modification treatment and taking the difference from the amount charged. It is common.
  • a method for directly analyzing water-soluble polymer substances incorporated into the micelles actually introduced has also been proposed. After solubilizing the membrane (micelle) itself with an aqueous solvent containing a surfactant, gel filtration is performed. A method for analysis by chromatography has been proposed (see Patent Document 4).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 5-505173
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 7-20857
  • Patent Document 3 Japanese Patent No. 2667051
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 10-142214
  • Non-Patent Document 1 DD Lasic, “LIPOSOMES from Physics to Applications J. Elsevier, 19
  • Non-Patent Document 2 Martin C. Woodle, edited by Gerrit Storm "Long Circulating Liposomes: Old Drugs, New Therapeutics]. Springer, 1997
  • Non-Patent Document 3 D.D ⁇ asic, D.Papahadjopoulos, ⁇ Medical Applications of LIPOSOME SJ, Elsevier, 1998 ''
  • Non-Patent Document 4 Yasuyuki Sadzuka, ⁇ Effects of mixed polyethleneglycol modification o n fixed aqueous layer thickness and antitumor activity of Doxoruoicin containing lipo somej 238, 2002, 171-180
  • Non-Patent Document 5 Gregory Gregoriadis “Liposome Technology 2nd Edition VolumelJ, 1992
  • Non-Patent Document 6 Hiroshi Terada, “Ribosomes in Life Science”, Springer Hue Arark Tokyo, 1992
  • Non-Patent Document 7 Colin Tilcock, Pieter Cullis, Tomas Dempsey, B.B.A 979 (1989), 208 -214
  • the membrane modification to the outer surface of the closed vesicle is desired to be modified with the minimum amount of hydrophilic polymer, especially the homogeneous membrane modification with the minimum amount required only on the outer surface of the closed vesicle membrane.
  • the minimum amount of hydrophilic polymer especially the homogeneous membrane modification with the minimum amount required only on the outer surface of the closed vesicle membrane.
  • the average value analyzed as the hydrophilic polymer content with small variations in the entire formulation can be regarded as the content of each individual closed vesicle particle, the effect of the hydrophilic polymer is most efficient. Can be expected.
  • the present inventor has obtained a difference in the hydrophilic polymer modification state on the outer surface of the closed vesicle in order to obtain a closed vesicle having a controlled desired hydrophilic polymer modification rate.
  • a concentration gradient that changes the ionic strength of the eluent over time to ion-exchange chromatography.
  • the closed vesicle may be a preparation encapsulating a drug. With this separation method, it was conceived that closed vesicles (or preparations) with high uniformity at a desired hydrophilic polymer modification rate can be obtained by applying them to the production process.
  • the separation method described above is applied directly, or as an analysis method for closed vesicles (formulations), and the analysis data is applied to the manufacturing process.
  • the production conditions By adjusting the production conditions by feedback, it is possible to produce closed vesicles (formulations) having a desired hydrophilic polymer modification ratio with a narrow distribution and high uniformity.
  • the hydrophilic polymer of the preparation is obtained. It is possible to know the exact correlation between the modification rate and the effect.
  • the closed vesicle is separated according to the membrane modification rate of the hydrophilic polymer by the separation method according to any one of claims 1 to 6,
  • a closed vesicle in which the outer surface of the membrane is modified with a hydrophilic polymer including those having a modification rate of the hydrophilic polymer with respect to the membrane lipid of the closed vesicle of less than 0.5 mol%.
  • the closed vesicles are previously adjusted to have a desired membrane modification rate.
  • a method for producing a closed vesicle wherein the production conditions of the production process are adjusted to obtain a closed vesicle in which the membrane modification rate of the hydrophilic polymer is controlled to a desired membrane modification rate.
  • closed vesicles having different membrane surface states by modification with a hydrophilic polymer Can also be separated. It is possible to provide a method for producing closed vesicles having a controlled desired hydrophilic polymer modification rate, in which the separation method is used in a purification process of closed vesicles. According to this production method, closed vesicles having a highly uniform membrane modification rate among the individual closed vesicles can be obtained. In particular, to provide closed vesicles that are purified only to those having an effective membrane modification rate, in which membrane modification with a hydrophilic polymer is less than the effective rate of biodynamic kinetic modification. Can do.
  • FIG. 1 (A) to (C) are diagrams showing measurement conditions in the method of the present invention.
  • FIG. 2 is a high-performance liquid chromatogram showing an analysis example (separated state) of a PEG-modified ribosome preparation according to Condition 1 in the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a high-performance liquid chromatogram showing an analysis example (separated state) of a PEG-modified ribosome preparation under condition 2 in the method of the present invention.
  • FIG. 4 is a high-performance liquid chromatogram showing an analysis example (separated state) of a PEG-modified ribosome preparation under condition 3 in the method of the present invention.
  • FIG. 5 is a high-performance liquid chromatogram showing an example of separation of a mixture by the method of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between blood collection time and “% of Dose” in the blood retention test after injection of various ribosome preparations with different PEG modification rates.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between the PEG modification rate of a ribosome preparation and the corresponding AUC.
  • modification or membrane modification refers to a state in which a hydrophilic polymer is held chemically, physically or electrically fixed on the outer surface of a membrane forming closed vesicles.
  • the closed vesicle in the present invention is particularly a particulate membrane structure (carrier) capable of encapsulating a drug.
  • W is the water phase and o is the oil phase.
  • closed vesicles include ribosomes, microcapsules, lipid microspheres, and nanoparticles. These can take the form of spheres or similar.
  • the particle diameter of closed vesicles (the diameter of the particle outer diameter) varies depending on the type, but is usually from 0.01 to 500 ⁇ m.
  • a ribosome it is usually from 0.02 to 1 ⁇ m, preferably from 0.05 to 0.25 / z m.
  • microcapsenore it is usually 1 to 500 / ⁇ ⁇ , preferably 1 to 150 / ⁇ ⁇ .
  • lipid microspheres it is usually 1 to 500 ⁇ m, preferably 1 to 300 ⁇ m.
  • the particle size of the nanoparticles is usually from 0.01 to m, and preferably from 0.01 to 0.
  • the particle diameter is determined as an average diameter value of all particles measured by a dynamic light scattering method.
  • the closed vesicle in the present invention is preferably a ribosome among the above-mentioned ones having a potential function capable of encapsulating a drug in a high concentration therein.
  • a drug containing a drug inside the closed vesicle is called a preparation.
  • Closed vesicles are usually formed by using amphipathic lipids containing a hydrophobic group and a hydrophilic group as a membrane material.
  • amphipathic lipids containing a hydrophobic group and a hydrophilic group as a membrane material.
  • ribosome as an example.
  • Ribosomes are generally closed vesicles formed by a lipid bilayer membrane with phospholipid as the main membrane material. More specifically, the ribosome has a closed space structure in which a phospholipid containing a hydrophobic group and a hydrophilic group forms a membrane in an aqueous solvent based on both polarities, and the membrane forms. Ribosomes are usually handled in a suspension state in which an inner aqueous phase and an outer aqueous phase in a closed space exist across this membrane.
  • ribosome is used to include this ribosome suspension.
  • encapsulating or encapsulating a drug in a ribosome means including the drug in the inner aqueous phase or in the inner aqueous phase, and the ribosome preparation encapsulates (encapsulates) this drug. Refers to ribosome.
  • This encapsulation (encapsulation) means that the drug is retained by adhesion to the membrane. Including those that are retained or retained in the membrane, in which case the drug is not necessarily present in the inner aqueous phase.
  • Phospholipids are generally amphiphilic substances having a hydrophobic group composed of a long-chain alkyl group and a hydrophilic group composed of a phosphate group in the molecule.
  • HSPC hydrogenated soybean phosphatidyl choline
  • hydrogenated phospholipids such as hydrogenated soybean phosphatidylcholine, sphingomyelin and the like are preferably used.
  • Ribosomes can contain a single species or multiple species of the above phospholipids as the main membrane material
  • the ribosome is exposed to a temperature higher than the living body temperature (typically about 60 ° C) so that the encapsulated drug is not easily leaked during storage or in a living body such as blood. It is preferable to use a phospholipid having a phase transition point higher than the in-vivo temperature (35 to 37 ° C.) as the main membrane material. It is preferable that the phase transition point of the main membrane material of ribosome is 50 ° C or higher! /, One of the embodiments.
  • the ribosome can contain other membrane components together with the phospholipid.
  • other membrane constituents include lipids other than phospholipids and derivatives thereof (hereinafter, these may be referred to as “other lipids”).
  • Lipids other than phospholipids refer to lipids that have a hydrophobic group composed of a long-chain alkyl group or the like in the molecule and do not contain a phosphate group in the molecule.
  • the lipid is not particularly limited. Examples thereof include glyceglycoglycolipids, glycosphingolipids, sterols such as cholesterol, and derivatives such as hydrogenated products thereof.
  • Sterols are not particularly limited as long as they have a cyclopentanohydrophenanthrene ring.
  • the phospholipid is usually 20-: LOOmol%, preferably 40-: LOOmol%.
  • the other lipids are usually 0 to 80 mol%, preferably 0 to 60 mol% in the total lipid.
  • a ribosome formed into a film with a mixed lipid of the above phospholipid and other lipids is a preferred embodiment.
  • the lipid bilayer structure of the ribosome can be either a Unilamellar Vesicle or a Multilamellar Vesicle (ML V).
  • the lamella vesicle is also a 3 ⁇ 4 LTV (Small Unilamellar Vesicle) is also an LUV (Large Unilamellar Vesicle). From the viewpoint of liposomal stability, LUV with a particle size of 0.05 to 0.25 m is preferred.
  • the hydrophilic polymer for modifying the lipid membrane as described above is not particularly limited, and examples thereof include known hydrophilic polymers.
  • Specific examples of the hydrophilic polymer include polyethylene glycols, polyglycerins, polypropylene glycols, ficoll, polybutyl alcohol, styrene-maleic anhydride alternating copolymer, dibule ether, maleic anhydride, alternating copolymer.
  • Polymer polybulylpyrrolidone, polybulumethyl ether, polybulumethyloxazoline, polyethyloxazoline, polyhydroxypropyloxazoline, polyhydroxypropylmethacrylamide, polymethacrylamide, polydimethylacrylamide, polyhydroxypropylmethatalyl
  • rate polyhydroxyethyl acrylate, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, polyaspartamide, and synthetic polyamino acid.
  • water-soluble polysaccharides such as glucuronic acid, sialic acid, dextran, pullulan, amylose, amylopectin, chitosan, mannan, cyclodextrin, pectin, carrageenan and derivatives thereof such as glycolipids can be mentioned.
  • hydrophilic polymers are -CH 2 CH 2 O-, -CH 2 CH 2 CH 2-, -CH.
  • the hydrophilic polymer may be a homopolymer composed of one kind of repeating units or a copolymer containing two or more kinds of units.
  • the copolymer may be in any form such as a random copolymer, a block copolymer, or a terpolymer.
  • homopolymers are preferred, especially polyethylene glycol (PEG) and polyglycerin (PG), which have been confirmed to improve the retention of blood in ribosome preparations. ), Polypropylene glycol (PPG) is preferred!
  • hydrophilic polymers are not particularly limited as long as they have a molecular weight capable of forming a molecular chain capable of expressing the effect of improving retention in blood of a ribosome preparation, but the molecular weight of PEG is usually 500 to 10%. , 000 daltons, and preferably ⁇ is 1,000 to 7,000 daltons, more preferably ⁇ is 2,000 to 5,000 daltons.
  • the molecular weight of PG is usually 100 to 10,000 daltons, preferably 200 to 7,000 daltons, more preferably 400 to 5,000 daltons.
  • the molecular weight of PPG is usually 100 to 10,000 daltons, preferably ⁇ 200 to 7,000 daltons, more preferably ⁇ 1,000 to 5,000 daltons.
  • the hydrophilic polymer is usually used for membrane modification as a lipid derivative.
  • the molecular end of the hydrophilic polymer is usually a hydroxyl group, but the end of the hydrophilic polymer that is not bound to the lipid in the lipid derivative also has a storage stability surface that is alkoxy (eg, methoxylated, It may be ethoxylated or propoxylated).
  • alkoxy eg, methoxylated, It may be ethoxylated or propoxylated.
  • the lipid that forms the lipid derivative of the hydrophilic polymer is not particularly limited as long as it is a compound having an affinity hydrophobic portion in the ribosome membrane.
  • other lipids such as phospholipids and sterols that are the same as or similar to the membrane component, long-chain aliphatic alcohols, polyoxypropylene alkyls, glycerin fatty acid esters and the like can be mentioned.
  • phospholipid is one of the preferred embodiments.
  • the phospholipid is not particularly limited as long as it can bind to the hydrophilic polymer, and examples thereof include phosphatidylethanolamine, phosphatidylglycerol, and phosphatidylserine. Of these, phosphatidylethanolamine is one of the preferred embodiments.
  • the acyl chain contained in phospholipids is usually C-C.
  • the saturated fatty acid has a chain length of c 20 -c.
  • the chain As the chain,
  • Examples include dipalmitoyl, distearoyl, palmitoyl stearoyl and the like.
  • the combination of the hydrophilic polymer and the lipid in the lipid derivative of the hydrophilic polymer is not particularly limited.
  • the hydrophilic polymer is PEG
  • phospholipids or cholesterol derivatives are usually preferred as examples.
  • Such lipid derivatives of hydrophilic polymers can be produced by known methods, and are also available as commercial products. Some can be done.
  • PEG-DSPE PEG distearoylphosphatidylethanolamine derivative
  • the ribosome (closed vesicle) in the present invention may be membrane-modified with one or more of the above-mentioned hydrophilic polymer lipid derivatives.
  • the rate of ribosome modification by hydrophilic polymer is usually 0.1 to: LO mol%, preferably 0.1 to 5 mol%, more preferably, as a ratio of the amount of hydrophilic polymer to the lipid membrane (total lipid). 0.2 to 3 mol%.
  • the total lipid includes lipids in lipid derivatives of hydrophilic polymers.
  • the membrane modification state of the hydrophilic polymer mainly includes an embodiment in which the hydrophilic polymer is randomly distributed inside and outside the membrane and an embodiment in which the hydrophilic polymer is selectively distributed outside the membrane surface.
  • the latter is desirable.
  • the production method of the latter embodiment will be described later, the ribosome in which the hydrophilic polymer is selectively distributed outside the membrane surface is compared with the ribosome in which the hydrophilic polymer is randomly distributed inside and outside the membrane.
  • the hydrophilic polymer can produce its effect at half the hydrophilic polymer weight, and the hydrophilic polymer is advantageous because it has little effect on the efficiency of existence and the stability of the lipid membrane due to its presence.
  • the ribosome preparation is stable because it is not easily affected by the pH of the product.
  • the outside of the former membrane is selected for the ribosome preparation in the present invention.
  • a form modified with a hydrophilic polymer is preferable.
  • any other component can be optionally included as long as it can retain the membrane structure of the above membrane constituent components and can be contained in the ribosome.
  • Specific examples include surface modifiers other than hydrophilic polymer derivatives, for example, charged substances such as compounds having basic functional groups; compounds having acidic functional groups.
  • the charged substance is usually in the form of a lipid derivative.
  • examples of lipids are the same as lipid derivatives of hydrophilic polymers.
  • the basic functional group is, for example, an amino group, an amidino group, a guanidino group, etc.
  • Examples of compounds having these functions or lipid derivatives thereof (cationic lipids) are disclosed in, for example, JP-A-61-161246. Described in DOTMA, JP-T 5-508626 DOTAP, Transfectam described in JP-A-2-292246, TMAG disclosed in JP-A-4-108391, 3, described in pamphlet of WO97 / 42166 5-Dipentadecyloxybenzamidine hydrochloride, DOS PA, DOTAP, TfxTM-50, DDAB, DC-CHOL, DMRIE and the like.
  • Examples of the compound having an acidic functional group include acidic phospholipids such as phosphatidic acid, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, and cardiolipin; saturated or insoluble such as oleic acid and stearic acid. Saturated fatty acids; Gandariosides having sialic acid such as Gandarioside GM1, Gandarioside GM3; Acidic amino acid surfactants such as N-acyl-glutamine.
  • acidic phospholipids such as phosphatidic acid, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, and cardiolipin
  • saturated or insoluble such as oleic acid and stearic acid. Saturated fatty acids
  • Gandariosides having sialic acid such as Gandarioside GM1, Gandarioside GM3
  • Acidic amino acid surfactants such as N-acy
  • the drug contained in the ribosome (closed vesicle) as described above is not particularly limited as long as it is a drug for treatment and Z or diagnosis.
  • examples of drugs include
  • AGEs Advanced glycation endproducts
  • radical scavengers tannins, hemoglobin solutions, peptides, glycosaminodaricans and their derivatives, oligosaccharides and polysaccharides and their derivatives, etc .
  • X-ray contrast agents ultrasound diagnostic agents
  • Examples include radioisotope-labeled nuclear medicine diagnostic agents and diagnostic agents for nuclear magnetic resonance diagnosis.
  • the ribosome preparation according to the present invention can contain a pharmaceutically acceptable stabilizer and Z or acid inhibitor depending on the administration route.
  • the stabilizer is not particularly limited, and examples thereof include saccharides such as glycerol, mannitol, sorbitol, ratatose or sucrose.
  • the anti-oxidation agent is not particularly limited, and examples thereof include ascorbic acid, uric acid, a, ⁇ , ⁇ , and ⁇ tocopherol homologs (eg, vitamin ⁇ ).
  • the suspension medium of the ribosome preparation which is usually in the form of a suspension, that is, the outer aqueous phase of the ribosome is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable depending on the administration route.
  • these media may contain a surfactant acceptable as a pharmaceutical additive or a buffer having a physiological pH acceptable in vivo.
  • Ribosomes (closed vesicles) and ribosome preparations that have been membrane-modified with a hydrophilic polymer as described above can be produced by employing known methods. Ribosomes (closed vesicles) in which hydrophilic polymers are selectively distributed on the outer surface of the membrane are modified by adding lipid derivatives of hydrophilic polymers after forming liposomes. Can be obtained by a two-stage process.
  • the ribosome formation method itself includes, for example, the ethanol injection method, the thin film method, the reverse phase evaporation method, the freeze-thaw method, the ultrasonic method, the high-pressure discharge method ("Liposome in Life Science” edited by Terada, Yoshimura et al .; Springer Fairlake Tokyo ( 1992): the description of the present specification is cited with reference to the description here), and various techniques such as the etastulation method are known.
  • the ribosome can be produced by using an appropriate method from among these.
  • the hydrophilic polymer can be selectively distributed outside the membrane of the ribosome by adding a hydrophilic polymer capable of modifying the ribosome, such as a lipid derivative, to the ribosome formed as described above. Can do.
  • the drug can be sealed by appropriately adopting a known introduction method after an appropriate process according to the type of drug, that is, after the ribosome formation process or after the membrane modification process in the ribosome formation process.
  • the powerful drug not encapsulated in the ribosome is usually removed by a known removal method.
  • the separation method of the present invention is a method of separating closed vesicles membrane-modified with a hydrophilic polymer.
  • the outer surface of the membrane is selectively selected by the hydrophilic polymer.
  • Closed vesicles represented by ribosomes with a modified structure can be directly isolated.
  • Hydrophilic polymers present inside closed cells cannot be evaluated by this separation method and do not perform the desired function.
  • the separation method of the present invention is suitable for separation between closed vesicles modified with the same hydrophilic polymer species.
  • closed vesicles having different membrane modification rates are separated by ion exchange chromatography (also referred to as IEC) to which a concentration gradient that changes the ionic strength of the eluent with time is applied.
  • IEC is a well-known method of separating counter ions using an ion-exchange resin in which molecules that dissociate on the surface of ion-exchange resin particles and generate a charged surface are chemically bound. Categorized into cation exchange and anion exchange.
  • anion exchange a resin containing a cation residue such as a quaternary ammonium or a jetylaminoethyl group is usually used.
  • cation exchange a key such as a sulfopropyl group is usually used.
  • a resin into which an on-residue has been introduced is used.
  • IEC based on anion exchange is preferred, and an IEC based on weak anion exchange such as a jetylaminoethyl group is more preferred.
  • Ion exchange resin does not work with either porous or non-porous particles. Columns filled with these ion exchange resins are commercially available and can be used for the separation of the present invention. Examples of weak anion exchange resin columns include commercially available products such as DEAE-5PW (manufactured by Tosohichi Co., Ltd.) and YMC-Pack IES-AX (manufactured by Sakai YMC Co., Ltd.). [0045] IEC can be measured by providing these appropriate columns in a high performance liquid chromatograph (HPLC). This measurement data can be used for drug evaluation as described later.
  • HPLC high performance liquid chromatograph
  • an eluent containing no organic solvent is preferable.
  • the optimum pH range differs depending on the type of ion-exchange resin, and it affects the charge state, so it is desirable to adjust the pH of the eluent (also referred to as the mobile phase) appropriately.
  • pH of the eluent is typically closed vesicles in gesture et preferred range of PH2 ⁇ ll, especially P H4 ⁇ from the viewpoint of the stability of the ribosome: LO is preferred.
  • the pH of the eluent is 6 to 10 or more preferably 6 to 9.
  • the eluent may be buffered with, for example, a phosphate buffer, Tris-HCl buffer, or acetate buffer.
  • concentration of the buffer is usually 10 to 50 mM.
  • Concentration gradients mainly include a method of changing the solvent composition of the eluent and a method of changing the ionic strength over time, but considering that closed vesicles may be denatured by the solvent, In the invention, a method of changing the ion intensity with time is preferable.
  • NaCl sodium chloride
  • ammonium sulfate or the like is usually used, and among these, NaCl is used because of easy adjustment of the ionic strength.
  • the ionic strength it is desirable to select a range that does not affect the structure of the closed vesicles. Specifically, in the case of ribosomes, it is preferable to select an ionic strength that does not cause membrane permeation.
  • the maximum concentration is preferably 2 molZL or less with NaCl.
  • Concentration gradient methods include, but are not limited to, a linear type in which the ionic strength changes at a constant rate, a curve type (concave-convex gradient elution), and a stepwise type that changes stepwise.
  • Control power is linear type.
  • a known method can be used as the method of linearly ionic strength concentration gradient. This linear concentration gradient is shown schematically in Fig. 1.
  • the speed of the concentration gradient is important, and the separation performance is improved by reducing the gradient at the same flow rate.
  • the PEG modification rate increases with decreasing concentration gradient even if the final ionic strength is the same. It was confirmed that the resolution based on this was improved.
  • each separation peak was clearly separated if the PEG modification rate was about 0.5 mol%, about 0.25 mol%, and an unmodified ribosome preparation. It was confirmed that a chromatogram can be obtained.
  • each PEG modification rate ribosome preparation can be separately separated and recovered as an IEC fraction, whereby a ribosome preparation having a desired PEG modification rate can be purified and separated from a mixture with a wide distribution.
  • the width of the distribution can be adjusted by setting the fractionation time around the outflow time corresponding to the ribosome preparation having the desired PEG modification rate.
  • Separation conditions by IEC are not particularly limited except that the column selection and mobile phase solvent type and concentration gradient are used as described above, and can be performed by appropriately selecting general IEC conditions. it can.
  • the flow rate of the mobile phase is usually 0.05 to 0.1 mLZ for a column with a column diameter of 2. Omm, but it is necessary to set the flow rate in consideration of the maximum pressure of the gel packed in the column.
  • the effect of modifying closed vesicles (formulations) with hydrophilic polymers is evaluated more strictly than the conventional method for analyzing the PEG modification rate of ribosome preparations (closed vesicles). can do.
  • the surface modification rate of closed vesicles (formulations) measured by conventional analytical methods is the average value of the entire measurement sample, so for example, even if the surface modification rate is 0.25 mol%, Omol% And 0.5 mol% of the mixture.
  • the blood retention effect of the surface modification rate cannot be strictly evaluated, and
  • the separation method of the present invention can be separated at each surface modification rate, at least the distribution (variation width) of the surface modification of the produced closed vesicles. You can know what you have.
  • a highly purified preparation having a desired surface modification rate can be obtained by selecting the fraction width, the surface modification effect can be strictly evaluated. For example, a correlation between the separated and purified ribosome preparation and the test (AUC) result of the preparation can be observed.
  • the effect of surface modification can be evaluated by associating the corresponding AUC with each drug peak of IEC.
  • the separation method of the present invention is applied to a manufacturing process of closed vesicles (or preparations) modified with a hydrophilic polymer to obtain closed vesicles (formulations) highly purified to a desired modification rate.
  • the above separation method is applied, and the closed vesicles (formulations) are modified with the above-mentioned hydrophilic polymer molecules.
  • the isolated vesicles (or preparations) having a desired hydrophilic polymer modification rate can be recovered from the isolated closed vesicles (formulations).
  • the modification rate of the hydrophilic polymer that is less pharmacokinetically effective specifically, the modification rate of the hydrophilic polymer to the membrane lipid of the closed vesicle is less than 0.5 mol%.
  • closed vesicles whose outer surface is modified with a hydrophilic polymer can be obtained.
  • An embodiment in which the membrane-modified closed vesicle is a ribosome (or preparation) membrane-modified with polyethylene glycol is a preferred embodiment of the present invention.
  • the above separation method is applied as an analysis method for closed vesicles (or preparations) that have been membrane-modified with a hydrophilic polymer, and the obtained analysis data is used as a manufacturing process for the closed vesicles (or preparations).
  • closed vesicles (or preparations) that are highly adjusted to the desired hydrophilic polymer modification rate are obtained.
  • Hydrogenated soybean soy phosphatidylcholine (HSPC) (MW 790, Lipoid SPC3) 7.021 g and Cholesterol (MW 386.65, Solvay) 2.927 g
  • HSPC Hydrogenated soybean soy phosphatidylcholine
  • PEG modification rate (mol%) calculated as (PEG — DSPEZ total lipid) X 100 is 0 (mol%)
  • Ribosome formulation 1 0.25 (same formulation 2), 0.5 (same formulation 3), 0.75 (same formulation 4), 1 (same formulation 5) or 2 (same formulation 6) mol% Add in theoretical amount (no addition, 0.55, 1.09, 1.64, 2.18 or 4.37 mL) corresponding to the given concentration, 60. The mixture was stirred at C for 30 minutes and then cooled on ice.
  • the PEG-modified ribosome obtained above was subjected to gel filtration using a column (Sepharose 4FF) substituted with 10 mM Tris (pH 9.0) 10% sucrose to replace the outer aqueous phase.
  • the HSPC concentration (mgZmL) was quantitatively analyzed using a phospholipid quantification kit (Linlipid C Test ⁇ Cho (choline quantification) manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). In addition, the total lipid amount (mM) was calculated. The total lipid amount here means the total amount of HSPC, Choi and DSPE.
  • Doxorubicin hydrochloride Dox: molecular weight 579.99
  • 10 mM Tris pH 9.0
  • Dox / Total Lipid (mol / mol) 0.16 against the above total lipid amount Dox was introduced by heating at 60 ° C. for 60 minutes with stirring in addition to each of the PEG-modified ribosomes that were included in a predetermined amount and substituted for the outer aqueous phase.
  • the ribosome after drug introduction was ice-cooled and then gel-filtered with a gel column (Sepharose 4FF) substituted with 10 mM histidine (pH 6.5) 10% sucrose to remove the drug without ribosome encapsulation.
  • a gel column Sepharose 4FF substituted with 10 mM histidine (pH 6.5) 10% sucrose to remove the drug without ribosome encapsulation.
  • ribosome preparations PEG-modified doxorubicin-encapsulated ribosomes 1 to 6.
  • Table 1 also shows.
  • the actual value of the PEG modification rate obtained here is the average value of the entire measurement sample.
  • the doxorubicin hydrochloride (Dox) concentration (mgZmL) was quantitatively analyzed by a calibration method based on the absorbance at 480 nm. Saline containing Dox at each predetermined concentration (mgZmL) was used as a calibration curve sample. Absorbance was measured by dispersing 40 L of sample in 2 mL of fluorescence analysis methanol.
  • mM equivalent value and molar ratio to total lipid were determined from the Dox concentration (mgZmL). These values are shown in Table 1.
  • PEG modification rate (mol%) (PEG -DSPE / Total Lipid) X 100
  • the ribosome preparation 16 prepared in Preparation Example 1 was measured by applying the NaCl concentration gradient method of the mobile phase. The measurement conditions are shown below.
  • Ribosome preparations 1 to 6 having different PEG modification rates prepared in Preparation Example 1 were measured under the respective NaCl concentration conditions. In each measurement chart, the same NaCl concentration conditions were overlapped on the paper.
  • Figure 2 (Condition 1), Figure 3 (Condition 2) and Figure 4 (Condition 3) are charts that combine the data for each condition.
  • ribosome preparations were found to have different efflux times depending on the PEG modification rate by application of the NaCl concentration gradient method. That is, it was proved that PEG-modified ribosome preparations can be separated by the difference in PEG modification rate. Furthermore, it has been clarified that the resolving power is increased by making the NaCl concentration gradient gentle. In particular, in ribosome preparations surface-modified with PEG, the modification rate can be as high as 0.5 mol%.
  • This 0.5 mol% is a kinetically effective modification rate of the liposome as shown in the test examples described later, and therefore the method of the present invention is extremely useful in the production of PEG-modified liposome preparations. means.
  • PEG-modified ribosome preparations 1 to 6 produced in Preparation Example 1 were taken in equivalent amounts and mixed.
  • liquid chromatography was measured in the same manner as in Example 1 by applying the NaCl concentration gradient condition 3 described above. The results are shown in FIG.
  • the ribosome formulation mixture could be separated for each difference in PEG modification rate.
  • Each peak position coincided with the position shown in FIG. From these, this departure Clear method power It was confirmed that liposomal preparations with different modification rates could be separated from a mixture of ribosome preparations with different SPEG modification rates.
  • Ribosome preparations 1 to 6 (total lipid amount 10 ⁇ mol / 2 mL / kg) prepared in Preparation Example 1 were administered from the tail vein of mice, and blood concentration transitions were examined (3 mice in each group).
  • a 25G winged intravenous needle (Terumo) with heline (1000 units ZmL, Aventis Pharma) was added from the tail vein, and an lmL syringe for tuberculin (Te About 0.5 mL of blood was collected.
  • the blood was raised on an ice bath, and after blood collection, the blood was separated by centrifugation (BECKMAN GS-15R, lOOOOrpm, 4 ° C, 10 minutes).
  • the residual rate (%) with respect to the dose at the time of each blood collection after injection was calculated by estimating the residual rate at the time of administration (0) as 100%. It is shown in Figure 6 as “% of dose” versus elapsed time.
  • ribosomes not introduced with PEG were 2Z3 or less of other ribosomes with a lower blood concentration compared to other ribosomes at the initial administration (after 6 hours).
  • the higher the PE G modification rate (mol%) the higher the retention in the blood.
  • the concentration exceeds 0.5 mol% the change in blood concentration does not change much, and the 24% "% of Dose" is about 30%.
  • the 48% “% of Dose" was about 17%. From these, it can be said that the effect of PEG modification is sufficient if the PEG modification rate is about 0.5 mol%! /.
  • FIG. 7 shows the AUC based on the absorption rate for which the blood concentration force after the injection time is also determined for the PEG modification rate (actual value) of each ribosome preparation.
  • AUC X (absorption rate) ZV (distributed volume) XK (disappearance rate)
  • the denominator factors V and K are determined by the drug, and AUC is assumed to be proportional to the absorption rate.
  • the method of the present invention can theoretically confirm the retention in blood of a ribosome preparation that can analyze the surface of the ribosome preparation with respect to the PEG modification rate.

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Description

明 細 書
閉鎖小胞の分離方法、製剤の製造方法および評価方法
技術分野
[0001] 本発明は、膜修飾された閉鎖小胞の分離方法、該分離方法を用いる精製された製 剤の製造方法、制御された所望の親水性高分子修飾率を有する閉鎖小胞および製 剤の評価方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、薬物を安全にかつ効率よく目的病巣部位に送達 '分布させるドラッグデリバリ 一システム（DDS)が盛んに研究されている。その方法のひとつとして、リボソーム、 ェマルジヨン、リピッドマイクロスフェア、ナノパーティクルなどの閉鎖小胞を薬物運搬 体 (担体）に利用することが検討されている。閉鎖小胞を用いる DDSの実用化に際し ては克服すべき様々な課題がある。中でも、薬物を標的部位に送達させるためには 、閉鎖小胞の生体側の異物認識機構力 の回避および体内動態の制御、たとえば 血液中のォプソニン蛋白質や血しょう蛋白質などとの相互作用（吸着）による凝集を 防止し、肝臓、脾臓等の細網内皮系組織 (RES)での捕捉を回避することが重要であ る。すなわち、閉鎖小胞の血中安定性 (血中滞留性)が重要である。
[0003] 血中滞留性とは、薬物が血液中に存在する性質であり、血中滞留性を向上させれ ば、より少ない量での薬物投与が可能である。閉鎖小胞の血中滞留性を高めれば、 腫瘍組織や炎症部位などの血管透過性が亢進した組織への受動的な集積が可能と 考えられ、その結果、標的部位に高い選択性で到達させることが可能と考えられる。
[0004] この課題を解決する方法として、閉鎖小胞を形成する膜を親水性高分子により修飾 する技術が知られている。親水性高分子で表面修飾された閉鎖小胞は、血漿中のォ プソニンタンパク質などが表面に吸着するのを防止してその血中安定性を高め、 RE Sでの捕捉を回避することが可能となる。特にリン脂質力もなる膜で形成されるリポソ ームでは、親水性高分子による膜修飾により血中滞留性が向上することが確かめら れており、このような形態のリボソーム製剤の実用化が進められている（特許文献 1〜 3および非特許文献 1〜3参照)。親水性高分子として、低毒性で、医薬品の安定ィ匕 および体内動態の改善に広く応用されているポリエチレングリコール (以下、「PEG」 とも表記)で膜修飾したリボソームは、各種薬物につ ヽて製剤化が実現して ヽる。
[0005] 上記のような親水性高分子による閉鎖小胞膜修飾技術において、親水性高分子の 修飾量およびその膜表面分布状態は、製剤の機能、すなわち製剤の血中滞留性お よび物理化学的安定性に係る重要な因子となる。特に、低毒性の確認されている親 水性高分子であっても生体内への投与を考慮すれば少ないことが望ましぐまた過 度の膜修飾は膜の不安定ィ匕を起こしやすいため、期待される血中滞留性以前に、製 剤の不良品化による製造コストの観点からも好ましくない。これら観点から、製剤にお ける親水性高分子による修飾は必要最小量での実施が望まれる。
[0006] 従来、このような親水性高分子による修飾は、通常、仕込み量に基づ!/、て論議され ている。閉鎖小胞の膜修飾処理において、親水性高分子の導入量は、その仕込み 量から、修飾処理後の除去処理で除去されな力つた量を定量して差分をとることによ り求めるのが一般的である。
実際に導入されたミセルに組み込まれた水溶性高分子物質を直接分析する方法も 提案されており、界面活性剤を含有する水性溶媒などで膜 (ミセル）自体を可溶化し た後、ゲルろ過クロマトグラフィーで分析する方法が提案されている（特許文献 4参照
) o
[0007] また、ナノサイズ粒子の表面状態の理ィ匕学的分析としては、従来、粒子径、 Zeta電 位の測定などがある。さらに、界面電気化学的手法により測定した、リボソーム膜表 面に形成された固定水層厚さ（Fixed Aquaous Layer Thickness： FALT)、 Aquaous Two-Phase System (水性二相分離）によりリボソーム膜表面における PEG分子の状 態を推測し、これにより PEG修飾と血中滞留性増大との相関性についても言及する ことが報告されて 、る (非特許文献 5〜7参照)。
[0008] 特許文献 1 :特表平 5— 505173号公報
特許文献 2：特公平 7— 20857号公報
特許文献 3：特許第 2667051号公報
特許文献 4：特開平 10— 142214号公報
非特許文献 1 : D.D. Lasic著「LIPOSOMES from Physics to Applications J .Elsevier, 19 非特許文献 2 : Martin C.Woodle, Gerrit Storm編「Long Circulating Liposomes: Old D rugs, New Therapeutics] .Springer, 1997
非特許文献 3 : D.D丄 asic, D.Papahadjopoulos編「Medical Applications of LIPOSOME SJ , Elsevier, 1998
非特許文献 4 : Yasuyuki Sadzuka編「Effects of mixed polyethleneglycol modification o n fixed aqueous layer thickness and antitumor activity of Doxoruoicin containing lipo somej 238, 2002, 171-180
非特許文献 5： Gregory Gregoriadis編「Liposome Technology 2nd Edition VolumelJ , 1992
非特許文献 6：寺田弘編「ライフサイエンスにおけるリボソーム」 ,シュプリンガー ·フエ アラーク東京， 1992
非特許文献 7 : Colin Tilcock, Pieter Cullis, Tomas Dempsey, B.B.A 979 (1989) , 208 -214
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
上記のように閉鎖小胞の外表面への膜修飾は、必要最小量の親水性高分子での 修飾が望まれ、特に閉鎖小胞膜外表面のみへの必要最小量での均質な膜修飾が 望まれる。すなわち、製剤全体でのバラツキが小さぐ親水性高分子含有量として分 析される平均値がほぼ閉鎖小胞粒子個々の含有量とみなせるものであれば、親水性 高分子による効果をもっとも効率的に発現できると期待できる。特に平均値に対する ノ ツキが大きい場合には、全体平均でみれば所望の含有率であっても、親水性高 分子を期待される量で含まない閉鎖小胞粒子が存在したり、あるいは反対に医薬的 観点からみて不適切な過剰量で含む閉鎖小胞粒子が存在する可能性が高 、。この ため、閉鎖小胞製剤粒子個々についての親水性高分子による修飾状態を分析し得 る方法が望まれ、またこれにより実際に有効な親水性高分子の修飾率を把握すること が望まれる。し力しながら、上記従来の方法により測定される親水性高分子の修飾量 は、いずれも測定サンプル全体での平均値として得られ、これら方法では、測定サン プル中の個々の閉鎖小胞に基づく修飾量は得られな 、。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者は、上記に鑑みて、制御された所望の親水性高分子修飾率を有する閉 鎖小胞を得るために、閉鎖小胞の外表面における親水性高分子修飾状態の違いを 分析する方法を確立すべく検討を行ったところ、イオン交換クロマトグラフィーに溶離 液のイオン強度を経時的に変化させる濃度勾配を適用することによって、親水性高 分子の修飾率に応じて閉鎖小胞を分離できるという知見を得た。この閉鎖小胞は薬 物を封入した製剤であってもよい。この分離方法であれば、これを製造プロセスに適 用することにより所望の親水性高分子修飾率での均一性の高い閉鎖小胞 (もしくは 製剤)を得ることが可能であることに想到した。たとえば、準備した閉鎖小胞 (製剤)の 精製手段として、上記分離方法を直接実施することにより、あるいは閉鎖小胞 (製剤） の分析方法として上記分離方法を適用し、その分析データを製造工程にフィードバ ックして製造条件を調整することにより、分布が狭ぐ所望の親水性高分子修飾率を 高 、均一性で有する閉鎖小胞 (製剤)を製造することができる。
[0011] さらに、上記分離方法により得られるクロマトグラムと、各親水性高分子修飾率の製 剤に対応する別途に求めた血中持続性効果などとの対比により、製剤の親水性高分 子修飾率と効果との正確な相関関係を知ることができる。
親水性高分子で修飾された閉鎖小胞につ!、て、親水性高分子の修飾状態を直接 分析する方法は知られていない。特に、閉鎖小胞をそのまま、即ち非破壊的に各親 水性高分子による膜外表面の状態の違いによって分離することや分布を知ることは 報告されていない。したがって上記課題を解決するものとして以下のような本発明を 提供する。
[0012] (1)溶離液のイオン強度を経時的に変化させる濃度勾配を適用するイオン交換クロ マトグラフィーを用いて膜修飾率の異なる閉鎖小胞を分離する、親水性高分子で膜 修飾された閉鎖小胞の分離方法。
(2)親水性高分子がポリエチレングリコールであり、閉鎖小胞がリボソームである上記 (1)の分離方法。
(3)イオン強度が NaClのイオン強度である上記（1)または（2)の分離方法。 (4)イオン交換クロマトグラフィーが弱陰イオン交換クロマトグラフィーである上記（1) 〜（3)の 、ずれかの分離方法。
(5)溶離液が緩衝剤を含む pH6〜10の水性溶媒である上記 (4)の分離方法。
(6)閉鎖小胞が、該閉鎖小胞内に薬物を含む製剤である上記（1)〜（5)のいずれか の分離方法。
[0013] (7)親水性高分子で膜修飾された閉鎖小胞を準備し、
該閉鎖小胞を請求項 1〜6のいずかの分離方法により、前記閉鎖小胞を前記親水 性高分子の膜修飾率に応じて分離し、
所望の親水性高分子修飾率を有する閉鎖小胞を回収することより精製された閉鎖 小胞を得る、閉鎖小胞の製造方法。
(8)前記膜修飾された閉鎖小胞がポリエチレングリコールで膜修飾されたリボソーム である上記（7)に記載の製造方法。
(9)閉鎖小胞の膜脂質に対する親水性高分子の修飾率が 0. 5mol%未満のものを 含まな 、、親水性高分子で膜の外表面が修飾された閉鎖小胞。
(10)前記親水性高分子がポリエチレングリコールであり、前記閉鎖小胞がリボソーム である上記（9)に記載の閉鎖小胞。
(11)前記閉鎖小胞が内部に薬物を含む製剤である上記（9)または（10)に記載の 閉鎖小胞。
[0014] (12)上記（1)〜（6)のいずれかに記載の分離方法を用いる、親水性高分子で膜修 飾されかつ内部に薬物を含む閉鎖小胞の製剤を親水性高分子修飾率に基づき評 価する方法。
(13)親水性高分子で膜修飾された閉鎖小胞を製造する工程、
製造された閉鎖小胞を請求項 1〜6のいず力の分離方法で分析する工程を含み、 得られた分析データに基づいて、前記閉鎖小胞が所望の膜修飾率となるように前 記製造工程の製造条件を調整し、親水性高分子の膜修飾率が所望の膜修飾率に 制御された閉鎖小胞を得る、閉鎖小胞の製造方法。
発明の効果
[0015] 本発明によれば、親水性高分子の修飾による膜表面状態の異なる閉鎖小胞 (製剤 も含む意)を分離することができる。該分離方法を閉鎖小胞の精製工程に利用する、 制御された所望の親水性高分子修飾率を有する閉鎖小胞の製造方法を提供できる 。この製造方法によれば、閉鎖小胞個々同士で均一性の高い膜修飾率を有する閉 鎖小胞を得ることができる。特に、親水性高分子による膜修飾が体内動力学的に有 効な修飾率に満たな 、ものが排除され、有効な膜修飾率を有するもののみに精製さ れた閉鎖小胞を提供することができる。
また本発明では、精密な (分布の狭い)表面修飾率を知ることができるため、表面修 飾率と製剤効果との関係を正確に評価することができる。
図面の簡単な説明
[0016] [図 1] (A)〜 (C)は、本発明の方法における測定条件を示す図である。
[図 2]本発明の方法における条件 1による PEG修飾リボソーム製剤の分析例 (分離状 態）を示す高速液体クロマトグラムである。
[図 3]本発明の方法における条件 2による PEG修飾リボソーム製剤の分析例 (分離状 態）を示す高速液体クロマトグラムである。
[図 4]本発明の方法における条件 3による PEG修飾リボソーム製剤の分析例 (分離状 態）を示す高速液体クロマトグラムである。
[図 5]本発明の方法による混合物の分離例を示す高速液体クロマトグラムである。
[図 6]PEG修飾率の異なる各種リボソーム製剤注射後の血中滞留性試験における採 血時間ど'％ of Dose"との関係を示す図である。
[図 7]リボソーム製剤の PEG修飾率と、対応する AUCとの関係を示す図である。
[図 8]高速液体クロマトグラムの各 PEG修飾率のリボソーム製剤の保持時間と、各 PE
G修飾率のリボソーム製剤に対応する AUCとの関係を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0017] 以下、まず本発明に係る分離方法で分離される親水性高分子で膜修飾された閉鎖 小胞およびその中に薬物を含む製剤、ならびにその製造方法を具体的に説明する。 本発明において、修飾または膜修飾とは、親水性高分子が閉鎖小胞を形成する膜 の外表面に化学的、物理的または電気的に固定的に保持されている状態をいう。本 発明における閉鎖小胞は、薬物を内封しうる粒子状膜構造体 (担体)であれば特に 制限されず、一般的に wZoZw型担体である閉鎖小胞に対し、 wZo型担体とし て分類されるミセル、マイクロスフェアなどを広く含む意味で解することができる。なお wは水相、 oは油相である。
[0018] 閉鎖小胞としては、具体的にたとえばリボソーム、マイクロカプセル、リピッドマイクロ スフエア、ナノパーティクルなどを挙げることができる。これらは、球状またはそれに近 い形態をとることができる。
閉鎖小胞の粒子径 (粒子外径の直径）は、その種類によっても異なるが、通常 0. 0 1〜500 μ mである。たとえばリボソームの場合には、通常、 0. 02〜1 μ mであり、好 ましく ίま 0. 05〜0. 25 /z mである。マイクロカプセノレの場合に ίま、通常、 1〜500 /ζ πι であり、好ましくは 1〜150 /ζ πιである。リピッドマイクロスフェアの場合には、通常、 1 〜500 μ mであり、好ましくは 1〜300 μ mである。ナノパーティクルの粒子径は、通 常、 0. 01〜： mであり、好ましくは 0. 01〜0. である。
上記粒子径は、動的光散乱法により測定される全粒子の直径平均値として求めら れる。
[0019] 本発明における閉鎖小胞は、内部に薬剤を高濃度封入することのできる潜在的機 能を有するものが好ましぐ上記のうちでもリボソームが好ましい。本発明では、この 閉鎖小胞の内部に薬物を含むものを製剤という。
閉鎖小胞は、通常、疎水性基と親水性基とを含有する両媒性の脂質を膜材として 形成される。以下には、主としてリボソームを例にとって具体的に説明する。
リボソームは、一般的に、リン脂質を主膜材とする脂質二重膜で形成される閉鎖小 胞である。さらに詳しくは、リボソームは、疎水性基と親水性基とを含有するリン脂質 が両方の極性に基づいて水性溶媒中で膜を生じ、当該膜が形成する閉鎖空間構造 を有する。リボソームは、通常、この膜を隔てて、閉鎖空間内の内水相と外水相とが 存在する懸濁液の状態で扱われる。
[0020] なお、本明細書にぉ 、て、リボソームの語は、このリボソーム懸濁液を含む意味で 使用される。また、リボソームに薬物を封入または内封するとは、この内水相として、ま たは内水相中に薬物を含ませることをいい、リボソーム製剤とは、この薬物が封入（内 封)されたリボソームをいう。この封入（内封)とは、薬物が膜に付着などにより保持さ れたものあるいは膜中に保持されたものも含むことを意味し、この場合には薬物が必 ずしも内水相に存在するとは限らな ヽ。
[0021] リン脂質は、一般的に、分子内に長鎖アルキル基より構成される疎水性基とリン酸 基より構成される親水性基とを持つ両親媒性物質である。リン脂質としては、たとえば 、フォスファチジルコリン（=レシチン）、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジ ン酸、フォスファチジルエタノールァミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイ ノシトールなどのグリセ口リン脂質;スフインゴミエリンなどのスフインゴリン脂質;カルジ オリピンなどの天然または合成のジフォスファチジル系リン脂質およびこれらの誘導 体;これらの部分または完全水素添加物（たとえば、水素添カ卩大豆フォスファチジル コリン (HSPC) )などを挙げることができる。
これらのうちでも、水素添カ卩大豆フォスファチジルコリンなどの水素添カ卩されたリン 脂質、スフインゴミエリンなどが好ましく使用される。
リボソームは、主膜材として上記リン脂質の単一種または複数種を含むことができる
[0022] また、リボソームは、封入された薬物が保存時または血液などの生体中で容易に漏 出しないように、また製造時に生体温度より高い温度 (典型的に 60°C程度）に晒され る場合があることを考慮して、主膜材として相転移点が生体内温度（35〜37°C)より 高いリン脂質を用いることが好適である。リボソームの主膜材の相転移点が 50°C以上 であるのは好まし!/、態様の 1つである。
[0023] リボソームは、上記リン脂質とともに他の膜構成成分を含むことができる。他の膜構 成成分としては、たとえば、リン脂質以外の脂質およびその誘導体 (以下、これらを「 他の脂質類」と称することもある。）が挙げられる。リン脂質以外の脂質は、分子内に 長鎖アルキル基などより構成される疎水性基を有し、リン酸基を分子内に含まない脂 質をいう。当該脂質は特に限定されない。たとえば、グリセ口糖脂質、スフインゴ糖脂 質、コレステロールのようなステロール類、およびこれらの水素添加物などの誘導体 を挙げることができる。ステロール類は、シクロペンタノヒドロフエナントレン環を有する ものであれば特に限定されない。たとえば、コレステロールが挙げられる。これら他の 脂質類を単一種または複数種含むことができる。 [0024] リボソーム膜を構成する総脂質中、前記リン脂質は、通常、 20〜： LOOmol%であり、 好ましくは 40〜： LOOmol%である。他の脂質類は、総脂質中、通常、 0〜80mol%で あり、好ましくは 0〜60mol%である。
なかでも、上記のリン脂質と他の脂質類との混合脂質で膜形成されるリボソームは 好ましい態様例である。
[0025] またリボソームの脂質二重膜構造は、ュニラメラ小胞 (Unilamellar Vesicle)でも、多 重ラメラ小胞（Multilamellar Vesicle, ML V)のいずれでもよぐまたュ-ラメラ小胞は ¾ LTV (Small Unilamellar Vesicle)でも、 LUV (Large Unilamellar Vesicleノで よ ヽ。リ ポソームの安定性の面から、粒子径 0. 05〜0. 25 mの LUVが好ましい。
[0026] 上記のような脂質膜を修飾する親水性高分子は、特に制限されず、公知の親水性 高分子を挙げることができる。親水性高分子としては、具体的に、ポリエチレングリコ ール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類、フイコール、ポリビュルアルコ ール、スチレン 無水マレイン酸交互共重合体、ジビュルエーテル 無水マレイン 酸交互共重合体、ポリビュルピロリドン、ポリビュルメチルエーテル、ポリビュルメチル ォキサゾリン、ポリェチルォキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルォキサゾリン、ポリヒドロ キシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリ ヒドロキシプロピルメタアタリレート、ポリヒドロキシェチルアタリレート、ヒドロキシメチル セルロース、ヒドロキシェチルセルロース、ポリアスバルトアミド、合成ポリアミノ酸など が挙げられる。さらに、グルクロン酸、シアル酸、デキストラン、プルラン、アミロース、 アミロぺクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ぺクチン、カラギーナンなどの 水溶性多糖類およびその誘導体、たとえば糖脂質が挙げられる。
[0027] 上記のうちでも、親水性高分子は、 -CH CH O—、 -CH CH CH O—、—CH
2 2 2 2 2 2
CH (OH) CH O 、 一 CH CH (CH OH) O 力もなる群から選ばれる少なくとも 1
2 2 2
つの単位を含むものが好ましい。親水性高分子は、これら単位の 1種類の繰り返しか らなるホモポリマー、 2種類以上の単位を含むコポリマーでもよい。コポリマーは、ラン ダムコポリマー、ブロックコポリマー、ターポリマーなど、いずれの形態でもよい。
これらの中でも、ホモポリマーが好ましぐ特には、リボソーム製剤の血中滞留性を 向上させる効果が確認されているポリエチレングリコール（PEG)、ポリグリセリン (PG )、ポリプロピレングリコール（PPG)が好まし!/ヽ。
[0028] これら親水性高分子は、リボソーム製剤の血中滞留性向上効果を発現しうる分子鎖 となる分子量を有していれば特に限定されないが、 PEGの分子量は、通常、 500〜1 0, 000ダル卜ンであり、好まし <は 1, 000〜7, 000ダル卜ン、より好まし <は 2, 000〜 5, 000ダル卜ンである。 PGの分子量は、通常 100〜10, 000ダル卜ンであり、好まし くは 200〜7, 000ダルトン、より好ましくは 400〜5, 000ダルトンである。 PPGの分 子量は、通常 100〜10, 000ダル卜ンであり、好まし <は 200〜7, 000ダル卜ン、より 好まし <は 1, 000〜5, 000ダル卜ンである。
[0029] 上記親水性高分子は、通常脂質誘導体として膜修飾に使用される。なお、親水性 高分子の分子末端は通常水酸基であるが、脂質誘導体における脂質に結合してい ない親水性高分子の末端側は、保存安定性の面力もアルコキシィ匕 (たとえば、メトキ シ化、エトキシ化、プロポキシ化）されていてもよい。本発明の分離方法では、親水性 高分子の分子末端がアルコキシ基あっても分離することができる。
親水性高分子の脂質誘導体を形成する脂質は、リボソームの膜に親和性の疎水性 部分を有する化合物であれば特に制限されない。通常、該膜成分と同じもしくは類似 のリン脂質、ステロールなどの他の脂質類、長鎖脂肪族アルコール、ポリオキシプロ ピレンアルキル、グリセリン脂肪酸エステルなどが挙げられる。中でも、リン脂質が好ま しい態様の一つである。
[0030] リン脂質としては、上記の親水性高分子と結合可能であれば特に制限されないが、 たとえばフォスファチジルエタノールァミン、フォスファチジルグリセロール、フォスファ チジルセリンなどが挙げられる。これらのうちでもフォスファチジルエタノールァミンが 好ましい態様の一つである。リン脂質に含まれるァシル鎖は、通常、 C -C 、好ま
14 20 しくは c -c の鎖長をもつ飽和脂肪酸であることが望ましい。ァシル鎖としては、た
16 18
とえばジパルミトイル、ジステアロイル、パルミトイルステアロイルなどが挙げられる。
[0031] 親水性高分子の脂質誘導体における親水性高分子と脂質との組み合わせは、特 に限定されない。たとえば親水性高分子が PEGである場合には、通常、リン脂質また はコレステロール誘導体が好まし ヽ態様例として挙げられる。このような親水性高分 子の脂質誘導体は公知の方法によって製造することができ、また市販品として入手 できるものもある。たとえば PEGのジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン誘 導体 (PEG- DSPE)は、入手容易な汎用化合物である。
本発明におけるリボソーム（閉鎖小胞）は、上記親水性高分子の脂質誘導体の 1種 または 2種以上で膜修飾されて 、てもよ 、。
[0032] 親水性高分子によるリボソーム修飾率は、脂質膜 (総脂質）に対する親水性高分子 量の割合として、通常 0. 1〜： LOmol%、好ましくは 0. l〜5mol%、より好ましくは 0. 2〜3mol%である。なお、この総脂質には、親水性高分子の脂質誘導体中の脂質も 含まれる。
[0033] 上記親水性高分子の膜修飾状態は、主として、膜の内外にランダムに分布してい る態様と、膜表面の外側に選択的に分布している態様とがあるが、本発明では、後者 が望ましい。後者の態様の製造方法は後述するが、膜表面の外側に選択的に親水 性高分子が分布しているリボソームは、親水性高分子が膜の内外にランダムに分布 して 、るリボソームに対して、半分の親水性高分子量でその効果を発現することがで き、存在効率およびその存在による脂質膜の安定性に与える影響が少ないため有利 であるだけでなぐ親水性高分子が内水相の pHに影響を受けにくくリボソーム製剤 が安定であるため好まし 、。このような親水性高分子の膜修飾における修飾効率お よび製剤の安定性の点とともに、本発明の分離方法による分離効果を考慮して、本 発明におけるリボソーム製剤は、前者の膜の外側が選択的に親水性高分子で修飾さ れた形態が好ましい。
[0034] 本発明では、上記膜構成成分による膜構造を保持しうるものであってリボソームが 含むことができるものであれば、さらに他の成分を任意に含むことができる。具体的に は、親水性高分子誘導体以外の表面修飾剤たとえば、塩基性官能基を有する化合 物;酸性官能基を有する化合物などの荷電物質が挙げられる。荷電物質は、通常、 脂質誘導体の形態である。脂質は親水性高分子の脂質誘導体と同様のものが挙げ られる。
[0035] 塩基性官能基は、たとえばアミノ基、アミジノ基、グアジニノ基などであり、これら官 能を有する化合物もしくはその脂質誘導体 (カチオンィ匕脂質)としては、たとえば特開 昭 61— 161246号公報に記載された DOTMA、特表平 5— 508626号公報に記載 された DOTAP、特開平 2— 292246号公報に記載されたトランスフエクタム（Transfe ctam)、特開平 4— 108391号公報に開示された TMAG、国際公開第 97/42166 号パンフレットに記載された 3, 5—ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩、 DOS PA、 DOTAP、 TfxTM— 50、 DDAB、 DC— CHOL、 DMRIEなどが挙げられる。
[0036] 酸性官能基を有する化合物としては、たとえば、フォスファチジン酸、フォスファチジ ルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルグリセロール、カルジオリピ ンなどの酸性リン脂質;ォレイン酸、ステアリン酸などの飽和あるいは不飽和脂肪酸； ガンダリオシド GM1、ガンダリオシド GM3などのシアル酸を有するガンダリオシド類； N -ァシル——グルタミンなどの酸性アミノ酸系界面活性剤などが挙げられる。
し
[0037] 本発明において、上記のようなリボソーム（閉鎖小胞）中に含まれる薬物は、治療お よび Zまたは診断のための薬物であれば特に制限されない。薬物としては、たとえば
、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体、抗癌剤、抗生物質、酵素剤、抗 酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、抗炎症剤、ステロイド剤、血管拡張剤、 アンジォテンシン変換酵素阻害剤、アンジォテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の 増殖'遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメディエーターの遊離 阻害剤、血管内皮細胞の増殖促進または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサ ンギゥム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗 ウィルス剤、メイラード反応抑制剤、アミロイド一シス阻害剤、一酸化窒素合成阻害剤
、 AGEs (Advanced glycation endproducts)阻害剤、ラジカルスカベンジャー、タンノ ク質、ヘモグロビン溶液、ペプチド、グリコサミノダリカンおよびその誘導体、オリゴ糖 および多糖およびそれらの誘導体など; X線造影剤、超音波診断剤、放射性同位元 素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬などが挙げられる。
[0038] また、本発明に係るリボソーム製剤は、投与経路次第で医薬的に許容される安定 ィ匕剤および Zまたは酸ィ匕防止剤を含むことができる。安定化剤としては、特に限定さ れないが、たとえば、グリセロール、マン-トール、ソルビトール、ラタトースまたはシュ クロースのような糖類が挙げられる。酸ィ匕防止剤としては、特に限定されないが、たと えば、ァスコルビン酸、尿酸、 a、 β、 γまたは δトコフエロール同族体（たとえば、ビ タミン Ε)が挙げられる。 [0039] また、通常、懸濁液の形態であるリボソーム製剤の懸濁媒体すなわちリボソームの 外水相は、投与経路次第で医薬的に許容されるものであれば特に制限されず、たと えば、水、生理食塩水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビュルアル コール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビ二ルポリマー、カルボキシメチルセルロー スナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、力 ノレボキシメチノレスターチナトリウム、ぺクチン、メチノレセノレロース、ェチノレセノレロース、 キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリ コール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン (HSA)、 PBSまたは生体内分解性ポリマーなどの水溶液、無血清培地などが挙げ られる。
これらのうちでも、水、生理食塩水が好ましい。また、これら媒体は、医薬添加物とし て許容される界面活性剤または生体内で許容し得る生理的 pHの緩衝剤を含んでい てもよい。
[0040] 上記のような親水性高分子により膜修飾された形態のリボソーム（閉鎖小胞)および リボソーム製剤は、公知の方法を採用して製造することができる。膜表面の外側に選 択的に親水性高分子が分布している態様のリボソーム（閉鎖小胞）は、ー且リポソ一 ムを形成した後に、親水性高分子の脂質誘導体を添加して修飾する 2段工程により 得ることができる。リボソーム形成方法自体は、たとえばエタノール注入法、薄膜法、 逆相蒸発法、凍結融解法、超音波法、高圧吐出法（「ライフサイエンスにおけるリポソ ーム」寺田、吉村ら編；シュプリンガー ·フエアラーク東京 (1992)参照：ここでの記載を 引用して本明細書の記載されているものとする）、エタストリュージョン法などの各種の 技術が知られており、上記した膜構成成分である脂質を用い、これらのうちから適宜 の方法を採用して、リボソームを製造することができる。
[0041] さらに公知のサイジング技術、たとえば G.Gregoriadis編「Liposome Technology Lip osome Preparation and Related rechniques」2nd edition, Vol.1— III、 CRC Press (ここ での記載を引用して本明細書に記載されて 、るものとする）を適用して、リボソームを 所望のサイズにすることもできる。
またリボソームのュ-ラメラ化方法も公知（たとえば上記文献（「ライフサイエンスに おけるリボソーム」など）であり、適宜採択することができる。
[0042] 次に、上記で形成されたリボソームに、脂質誘導体など、リボソームを修飾可能な親 水性高分子を添加することにより、親水性高分子をリボソームの膜の外側に選択的に 分布させることができる。
薬物は、薬物の種類に応じて適宜の工程、すなわち、リボソーム形成工程において 、リボソーム形成工程後、または膜修飾工程後に、公知の導入方法を適宜採択して 封人することができる。
薬物導入後、リボソーム内に封入されな力つた薬物は、公知の除去方法により通常 除去される。
[0043] 本発明の分離方法は、親水性高分子で膜修飾された閉鎖小胞の分離方法であり、 特に本発明では、上記のように、親水性高分子により膜表面の外側が選択的に修飾 された構造のリボソームに代表される閉鎖小胞を直接分離することができる。閉鎖小 胞内部に存在する親水性高分子は、本分離方法では評価することができず、また望 まれる機能を果たさない。また本発明の分離方法は、同一の親水性高分子種で修飾 された閉鎖小胞間の分離に好適である。本発明では、具体的に、溶離液のイオン強 度を経時的に変化させる濃度勾配を適用するイオン交換クロマトグラフィー (IECとも 表記する）により膜修飾率の異なる閉鎖小胞を分離する。
[0044] IECは、イオン交換榭脂粒子の表面で解離し、荷電表面を生じる分子を化学的に 結合したイオン交換榭脂を用いて対イオンを分離する公知の方法であり、表面荷電 状態により陽イオン交換と陰イオン交換に大別される。陰イオン交換には、通常、第 4 級アンモ-ゥム、ジェチルアミノエチル基などのカチオン残基を導入した榭脂が用い られ、陽イオン交換には、通常、スルホプロピル基などのァ-オン残基を導入した榭 脂が用いられる。本発明では、陰イオン交換による IECが好ましぐなかでもジェチル アミノエチル基などによる弱陰イオン交換による IECがより好ま 、。イオン交換榭脂 は、多孔性粒子、非多孔性粒子のどちらでも力まわない。これらイオン交換榭脂を充 填したカラムは市販されており、本発明の分離に用いることができる。弱陰イオン交換 榭脂カラムとしては、 DEAE— 5PW (東ソ一（株）製）、 YMC— Pack IES—AX ( (株 )ヮイエムシィ製)などの市販品がある。 [0045] 高速液体クロマトグラフ（HPLC)に、これら適宜のカラムを備えつけることより、 IEC を測定することもできる。この測定データを後述するように薬物の評価に利用すること ちでさる。
[0046] 本発明では、扱われる閉鎖小胞は溶媒により変性する可能性があることを考慮して 、有機溶媒を全く含まない溶離液が好適である。また、 IECでは、イオン交換樹脂の 種類によって最適な pH範囲が異なり、荷電状態にも影響を与えるため、溶離液 (移 動相とも表記する）の pHを適切に調整することが望まれる。イオン交換樹脂の性質上 から、溶離液の pHは、一般的に pH2〜l lの範囲が好ましぐさらに閉鎖小胞、特に リボソームの安定性の観点からは PH4〜： LOが好ましい。陰イオン交換榭脂を用いる I ECの場合には、溶離液の pHは、 6〜10カ 子ましく、 6〜9がより好ましい。
溶離液は、たとえばリン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、酢酸緩衝剤で緩衝化されて いてもよい。緩衝剤の濃度は、通常 10〜50mMが適当である。
[0047] 本発明では、 IECにおいて、溶離液に濃度勾配をつける。濃度勾配には、主として 、溶離液の溶媒組成を変化させる方法、イオン強度を経時的に変化させる方法があ るが、閉鎖小胞は溶媒により変性する可能性があることを考慮して、本発明ではィォ ン強度を経時的に変化させる方法が好適である。
本発明において、イオン強度を調整するためには、通常、 NaClや硫酸アンモ-ゥ ムなどが用いられ、これらのうちでもイオン強度の調整しやすさから NaClが用いられ る。イオン強度を選択する際には、閉鎖小胞の構造に影響を及ぼさない範囲を選択 することが望ましい。具体的には、リボソームの場合、膜透過を引き起こさないイオン 強度の選択が好ましぐ具体的に最高濃度でも NaClで 2molZL以下が望ましい。
[0048] 濃度勾配方法は、イオン強度が一定割合で変化するリニア型、カーブ型（凹型 -凸 型勾配溶出）および段階的に変化させるステップワイズ型などの変化方法があり、特 に限定されないが、コントロールのしゃすさ力 リニア型が好適である。イオン強度を リニア型に濃度勾配させる方法そのものは公知の方法を利用することができる。このリ ニァ型濃度勾配を模式的に図 1に示す。
[0049] 本発明における分離方法において、濃度勾配の速度は重要であり、同一流速下に おいては勾配を小さくすれば分離能が向上する。このことは後述の実施例に示す。 たとえば NaClに基づく濃度勾配 (0→0. 5M)を適用した IECによる PEG修飾リポ ソーム製剤の分離例では、最終イオン強度が同一であっても、濃度勾配を遅くするほ ど、 PEG修飾率に基づく分離能が向上することが確かめられた。特に 35分かけて濃 度勾配をもたせた場合には、 PEG修飾率が約 0. 5mol%、約 0. 25mol%および無修 飾のリボソーム製剤であれば、各分離ピークが明確に分離されたクロマトグラムを得る ことができることが確認された。すなわち、各 PEG修飾率のリボソーム製剤は、各別 々に IEC分画として分離回収できることができ、これにより幅広い分布の混合物から、 所望 PEG修飾率を有するリボソーム製剤を精製分離することができる。所望 PEG修 飾率を有するリボソーム製剤に対応する流出時間近辺での分画時間の設定により、 分布の広さを調整することもできる。
[0050] なお、したがって濃度勾配を上記例よりも一層遅くすれば、 PEG修飾率が lmol% 以上のものでも分離可能であるが、現実的な実施効率を考慮すれば、分離所要時 間は短いことが望ましい。また後述の実施例および以下にも説明するとおり、リポソ一 ム製剤における PEG修飾効果の評価にける PEG修飾率の効果に対する知見から、 約 0. 5mol%までの PEG修飾率のリボソーム製剤を精製することができれば PEG修 飾の主目的は達成できる。このような観点からは、通常、長くても 180分程度で分離 を行うことができる。
IECによる分離条件は、上記したようなカラムの選択および移動相の溶媒種ならび に濃度勾配を用いる点以外は、特に制限されず、一般的な IECの条件力 適宜に選 択して行うことができる。移動相の流速は、カラム径 φ 2. Ommのカラムで、通常 0. 0 5〜0. lmLZ分であるが、カラムにパックされるゲルの最大圧力を考慮して設定する 必要がある。
[0051] 本発明では、上記分離方法により、従来のリボソーム製剤（閉鎖小胞)の PEG修飾 率の分析方法に対し、より厳密に親水性高分子による閉鎖小胞 (製剤)の修飾効果 を評価することができる。特に従来の分析方法で測定される閉鎖小胞 (製剤)の表面 修飾率は、測定サンプル全体の平均値であるため、たとえば表面修飾率が 0. 25mol %であっても、端的には Omol%と 0. 5mol%のものの混合物であるものと区別できな かった。この場合、表面修飾率の血中滞留性効果は厳密な評価ができず、またそれ を検証することも困難であつたが、本発明の分離方法であれば、各表面修飾率ごと に分離できるため、少なくとも製造された閉鎖小胞の表面修飾がどのような分布（ばら つき幅）をもっかを知ることができる。また、分画幅の選択により所望の表面修飾率の 高度に精製された製剤を得ることができるため、表面修飾効果を厳密に評価すること ができる。たとえば分離精製されたリボソーム製剤と、該製剤の試験 (AUC)結果との 相関をみることができる。さらに、 IECの各製剤ピーク上に、該当する AUCを対応さ せることにより表面修飾による効果を評価することもできる。
[0052] また、本発明の分離方法を、親水性高分子で修飾した閉鎖小胞 (もしくは製剤)の 製造プロセスに適用して所望修飾率に高度に精製された閉鎖小胞 (製剤)を得ること もできる。たとえば、親水性高分子で膜修飾され、かつ内部に薬物を含む閉鎖小胞（ 製剤)の精製工程として、上記分離方法を適用し、閉鎖小胞 (製剤)を前記親水性高 分子の膜修飾率に応じて分離し、分離された閉鎖小胞 (製剤)のうちから所望の親水 性高分子修飾率を有する閉鎖小胞 (もしくは製剤）を回収することができる。このよう な製造方法により、体内動態的に有効性の小さい親水性高分子の修飾率のもの、具 体的には閉鎖小胞の膜脂質に対する親水性高分子の修飾率が 0. 5mol%未満のも のを含まな ヽ、親水性高分子で膜の外表面が修飾された閉鎖小胞を得ることができ る。本発明において、特に修飾率が Omol%のものを排除することも容易である。 したがって、本発明では、このような所望修飾率に高度に精製された閉鎖小胞 (製 剤)を提供できる。この膜修飾された閉鎖小胞がポリエチレングリコールで膜修飾され たリボソーム (もしくは製剤）である態様は、本発明の好ま 、態様である。
[0053] また親水性高分子で膜修飾された閉鎖小胞 (もしくは製剤)の分析方法として上記 分離方法を適用し、得られた分析データを、上記閉鎖小胞 (もしくは製剤)の製造ェ 程にフィードバックすることにより、製造工程の製造条件を調整して、所望の修飾率と なるように制御する方法により、所望の親水性高分子修飾率に高度に調整された閉 鎖小胞 (もしくは製剤)を得ることもできる。
実施例
[0054] 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例、 試験例に限定されるものではな 、。 (調製例 1)
(1)リボソームの作製
水素添カ卩大豆フォスファチジルコリン（HSPC) (分子量 790、リポイド（Lipoid)社製 SPC3) 7. 021gおよびコレステロール（Choi) (分子量 386. 65、ソルべィ（Solvay) 社） 2. 927gに、無水エタノール（和光純薬社製） 10mLをカ卩えて 68°Cに加温し、完 全溶解後、 250mM硫酸アンモニゥム（和光純薬製）水溶液を 90mLをカ卩え、 68°Cの 恒温槽にて 15分間膨潤したのち、ボルテックス撹拌し、リボソーム粗分散液を調製し た。次いで、エタストルーダ（The ExtruderT.100, Lipex biomembranes Inc.製）に取 り付けたフィルター（孔径 0. 2 m X 5回、 0. 1 m X 10回、 Whatman社製）に順次 通し、リボソーム分散液 (以下、リボソームとも記す)を得た。
[0055] (2) PEG修飾
ポリエチレングリコール（分子量 5000) フォスファチジルエタノールァミン（PEG
500 DSPE) (分子量 6075、日本油脂社）を蒸留水で希釈して、 36. 74mgZmLの P
0
EG —DSPE水溶液を調製した。
5000
8mLずつ取り分けた上記リボソームを含む各容器に、この PEG — DSPE水溶液
5000
を、（PEG — DSPEZ総脂質） X 100として算出される PEG修飾率 (mol%)が 0 (
5000
後述のリボソーム製剤 1)、0. 25 (同製剤 2)、 0. 5 (同製剤3)、0. 75 (同製剤 4)、 1 ( 同製剤 5)または 2 (同製剤 6) mol%の所定濃度に対応する理論量 (無添加、 0. 55、 1. 09、 1. 64、 2. 18または 4. 37mL)で加え、 60。Cで 30分撹拌した後、氷冷した。
[0056] (3)外水相置換
10mM Tris (pH9. 0) 10%スクロースに置換したカラム（セファロース（Sepharose ) 4FF)を用いて、上記で得られた PEG修飾リボソームをゲルろ過し、外水相を置換 した。
[0057] (4)薬物導入
ゲルろ過後のサンプルにつ 、て、リン脂質定量キット (和光純薬工業株式会社製リ ン脂質 Cテストヮコー（コリン定量)）を用いて HSPC濃度 (mgZmL)を定量分析し、 この HSPC濃度をもとに、総脂質量 (mM)を算出した。ここでの総脂質量は、 HSPC 、 Choiおよび DSPEの合計量を意味する。 塩酸ドキソルビシン（Dox:分子量 579. 99)を、 10mM Tris (pH9. 0) 10%スクロ ース 10mL中に、上記総脂質量に対し、 Dox/Total Lipid (mol/mol) =0. 16となる 所定量でそれぞれ含ませ、上記外水相置換された各 PEG修飾リボソームに加え、撹 拌しながら 60°Cで 60分加熱することにより、 Doxの導入を行った。
(5)後処理
薬物導入後のリボソームを氷冷した後、 10mMヒスチジン (pH6. 5) 10%スクロー スで置換したゲルカラム（Sepharose4FF)でゲルろ過し、リボソーム未封入の薬物を 除去した。
次いで、滅菌フィルター（MINISART PLUS 0. 2 m)を通すことにより滅菌処理し、 PEG修飾ドキソルビシン内封リボソーム（以下、リボソーム製剤） 1〜6を得た。
[0058] (6)分析
く PEG修飾率 >
上記で得られた各リボソーム製剤について、高速液体クロマトグラフ（カラム:フエ- ル基をィ匕学結合した多孔性シリカゲル，移動相： BufferZMeOHZEtOH混液）によ り、検出器として示差屈折計を用いて、脂質 (HSPC、 Choiおよび PEG — DSPE
5000
)の濃度 (mgZmL)を定量分析した。得られた分析値カゝら算出した総脂質濃度 (Tot al Lipid/mM)、 PEG修飾率（mol%)を、 PEG — DSPE仕込み量の理論 mol%
5000
とともに表 1に示す。ここで求められる PEG修飾率の実測値は、測定サンプル全体の 平均値である。
[0059] <薬物濃度 >
塩酸ドキソルビシン (Dox)濃度 (mgZmL)は、 480nmにおける吸光度に基づい て検量法により定量分析した。 Doxを各所定濃度 mgZmL)で含む生理食塩水を検 量線サンプルとして用いた。吸光度は、サンプル 40 Lを 2mLの蛍光分析用メタノ ールに分散させて測定した。
各リボソーム製剤について、 Dox濃度 (mgZmL)から、 mM換算値、総脂質に対 するモル比（DoxZTotal Lipid)を求めた。これら各値を表 1に示す。
[0060] <粒子径>
リボソーム製剤 20mLを生理食塩水で 3mLに希釈し、 Zetasizer3000HS (Malvern Instruments.製)で平均粒子径 (nm)を測定した。結果を表 1に示す。
[0061] [表 1]
Figure imgf000021_0001
PEG修飾率（mol%) = (PEG -DSPE/Total Lipid) X 100
[0062] (実施例 1)
陰イオン交換カラムを備えた高速液体クロマトグラフ (HPLC)を用いて、調製例 1で 作成されたリボソーム製剤 1 6について、移動相の NaCl濃度勾配法を適用して測 定した。測定条件を以下に示す。
移動相： 20mM Tris(pH9.0)中の NaCl濃度を、以下の 3とおりの条件 1 3で 0 M 0.5Mの間で変化させた。すなわち、 20mM Tris中の NaCl濃度を流出開始 0.5分から下記の時間まで直線的に濃度勾配 (0→0.5M)させた後、 0.5MNaCl 濃度を 5分間持続した。その後、 NaCl濃度を含まない 20mM Tris(pH9.0)を 20 分間流出させた。これら条件を、図 1(A:条件 1, B:条件 2, C:条件 3)に示す。 条件 1:0.5 15分（0→0.5M)+5分間（0.5M)+20分間（0M)
条件 2:0.5 25分（0→0.5M)+5分間（0.5M)+20分間（0M)
条件 3:0.5 35分（0→0.5M)+5分間（0.5M)+20分間（0M)
[0063] 流速： lmLZ分
カラム： DEAE— 5PW (カラム：径 φ2. Omm,長さ 75cm) (東ソ （株）製 陰イオン 交換 HPLC用多孔性親水ポリマーゲルカラム）をあら力じめ 20mM Tris(pH9.0) で置換して使用した。
カラム温度：設定せず (環境温度 28 32°C) 注入量： 10 L (上記条件 3にて、 5 Lおよび 20 Lについても測定し、ピーク位置 は 10 Lと同じであることを確認（図示せず)。 )
測定吸収波長： 254nm (条件 1)または 280nm (条件 2および 3)
[0064] 調製例 1で作成された PEG修飾率の異なるリボソーム製剤 1〜6について、それぞ れ上記各 NaCl濃度条件下で測定した。個々の測定チャートを、同一の NaCl濃度条 件同士を紙面上で重ね合わせた。各条件ごとのデータを合成したチャートを、図 2 ( 条件 1)、図 3 (条件 2)および図 4 (条件 3)に示す。
[0065] これら図に示されるとおり、リボソーム製剤は、 NaCl濃度勾配法の適用により、 PE G修飾率に応じて流出時間が異なることがわ力つた。すなわち、 PEG修飾リボソーム 製剤を、 PEG修飾率の違いにより分離することが可能であることがわ力つた。さらに、 NaCl濃度勾配を緩やかにすることによって分離能が高まることが明らかになった。 特に、 PEG で表面修飾されたリボソーム製剤では、修飾率 0. 5mol%までを高
5000
精度に分離することができる。この 0. 5mol%は、後述する試験例に示されるとおりリ ポソームの動力学的に有効な修飾率であることから、本発明の方法が PEG修飾リポ ソーム製剤の製造において極めて有用であることを意味する。
したがって、 0. 5mol%以下の修飾率のものの分離が容易な上記方法により、たと えば 0. 5mol%に満たないものを回収せず、 0. 5mol%以上の修飾率のものを回収 することによって、リボソームの動力学的に有効な修飾率のもののみに高度に精製す ることができる。また、添加した PEG —DSPEの理論修飾率と最大修飾率はほぼ
5000
等しいと考えられるので、たとえば lmol%となるように添カ卩した場合は、 0. 5mol% 未満を含まないように、 0. 5mol%以上の修飾率のものを回収すれば、 0. 75±0. 2 5mol%の修飾率のリボソーム製剤が得られる。
[0066] (実施例 2)
調製例 1で製造した PEG修飾リボソーム製剤 1〜6を当量ずつ取り、混合した。この 混合サンプルについて、上記 NaCl濃度勾配条件 3を適用して、実施例 1と同様に液 体クロマトグラフィーを測定した。結果を図 5に示す。
図 5に示されるとおり、リボソーム製剤混合物は、 PEG修飾率の違いごとに分離する ことができた。また、各ピーク位置は図 4で示された位置と一致した。これらから、本発 明の方法力 SPEG修飾率の異なるリボソーム製剤の混合物から修飾率の相違するリポ ソーム製剤を分離することができることが確かめられた。
[0067] (試験例 1)
調製例 1で作製されたリボソーム製剤 1〜6 (総脂質量として 10 μ mol/2mL/kg) を、マウスの尾静脈より投与し、血中濃度推移を調べた (各群 3匹)。
投与後 1, 3, 6, 24, 48時間目に尾静脈よりへノ リン（1000単位 ZmL,アベンテ イスファーマ）を添加した 25G翼付静注針 (テルモ）と、ッベルクリン用 lmL注射筒（テ ルモ）とを用いて約 0. 5mLの採血を行った。血液は氷浴上に起き、採血終了後、遠 心処理（BECKMAN GS-15R, lOOOOrpm, 4°C, 10分）し、血漿を分離した。血漿中 ドキソルビシン濃度は、励起波長（Ex) = 500nm,蛍光波長（Em) = 580nmにて蛍 光強度を測定した。
[0068] 注射後の各採血時の投与量に対する残存率（％)を、投与時点（0)の残存率を 10 0%と概算して求めた。経過時間に対する"％ of dose"として図 6に示す。
図 6に示すとおり、 PEG未導入のリボソームは、投与初期の時点で他のリボソーム に比べ血中濃度が低ぐ他のリボソームの 2Z3以下であった（6h経過時)。また、 PE G修飾率 (mol%)が高くなるほど血中滞留性が高くなる力 0. 5mol%を超えると血 中濃度の推移はあまり変わらなくなり、 24hの"％ of Dose"は約 30%、 48hの"％ of Dose"は約 17%であった。これらから、 PEG修飾の効果は、 PEG修飾率がほぼ 0. 5 mol%であれば充分であると!/、える。
[0069] また、 PEG修飾率を AUC (Area under the curve,吸収曲線下面積）の観点から評 価した。各リボソーム製剤の PEG修飾率 (実測値）に対する注射時間後の血中濃度 力も求められる吸収率に基づく AUCを図 7に示す。
なお、 AUC=X(吸収率) ZV (分布容積） XK (消失速度）
d el
分母の因子 Vおよび Kは薬物により定まっており、 AUCは吸収率に比例するとみ
d el
なされる。
図 6に示す結果と同様、 PEG修飾率 0. 5mol%までは、 PEG修飾率が高くなるほ ど AUCは増大するが、 PEG修飾率 0. 5mol%を超えると AUCの増大はあまりみら れず、ほぼ 0. 5mol%で飽和することがわかった。 図 4にお!/、て、各 PEG修飾率のピーク位置（時間軸）に、上記で求めた AUC (図 7 参照）の各 PEG修飾率に対応する値 (平均値)を適用し、 AUCと高速液体クロマトグ ラムにおける保持時間との関係をみた。図 8に示す。
図 8に示されるとおり、 AUCと高速液体クロマトグラムにおける保持時間との間には 、負の相関があることがわ力つた。
これら結果から、本発明の方法は、リボソーム製剤の表面を PEG修飾率について 解析できるだけでなぐリボソーム製剤の血中滞留性を理ィ匕学的に確認できることが 明らかになった。

Claims

請求の範囲
[I] 溶離液のイオン強度を経時的に変化させる濃度勾配を適用するイオン交換クロマト グラフィーを用いて膜修飾率の異なる閉鎖小胞を分離する、親水性高分子で膜修飾 された閉鎖小胞の分離方法。
[2] 前記親水性高分子がポリエチレングリコールであり、前記閉鎖小胞がリボソームで ある請求項 1に記載の分離方法。
[3] 前記イオン強度が NaClのイオン強度である請求項 1または 2に記載の分離方法。
[4] 前記イオン交換クロマトグラフィーが弱陰イオン交換クロマトグラフィーである請求項
1〜3のいずれかに記載の分離方法。
[5] 前記溶離液が緩衝剤を含む pH6〜10の水性溶媒である請求項 4に記載の分離方 法。
[6] 前記閉鎖小胞が、該閉鎖小胞内に薬物を含む製剤である請求項 1〜5のいずれカゝ に記載の分離方法。
[7] 親水性高分子で膜修飾された閉鎖小胞を準備し、
該閉鎖小胞を請求項 1〜6のいずかの分離方法により、前記閉鎖小胞を前記親水 性高分子の膜修飾率に応じて分離し、
所望の親水性高分子修飾率を有する閉鎖小胞を回収することより精製された閉鎖 小胞を得る、閉鎖小胞の製造方法。
[8] 前記膜修飾された閉鎖小胞がポリエチレングリコールで膜修飾されたリボソームで ある請求項 7に記載の製造方法。
[9] 閉鎖小胞の膜脂質に対する親水性高分子の修飾率が 0. 5mol%未満のものを含 まな 、、親水性高分子で膜の外表面が修飾された閉鎖小胞。
[10] 前記親水性高分子がポリエチレングリコールであり、前記閉鎖小胞がリボソームで ある請求項 9に記載の閉鎖小胞。
[II] 前記閉鎖小胞が内部に薬物を含む製剤である請求項 9または 10に記載の閉鎖小 胞。
[12] 請求項 1〜6のいずれかに記載の分離方法を用いる、親水性高分子で膜修飾され かつ内部に薬物を含む閉鎖小胞の製剤を親水性高分子修飾率に基づき評価する
L8Z£90/L00Zd /lDd 93 ひ£簡800 OAV
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