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WO2008003773A1 - Procede de detection d'interactions a l'aide du rapporteur de fluorescence pyrenylalanine - Google Patents

Procede de detection d'interactions a l'aide du rapporteur de fluorescence pyrenylalanine Download PDF

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WO2008003773A1
WO2008003773A1 PCT/EP2007/056866 EP2007056866W WO2008003773A1 WO 2008003773 A1 WO2008003773 A1 WO 2008003773A1 EP 2007056866 W EP2007056866 W EP 2007056866W WO 2008003773 A1 WO2008003773 A1 WO 2008003773A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
fluorescence
pya
phosphatase
target
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP2007/056866
Other languages
English (en)
Inventor
Bernard Pierre Roques
Marie-Claude Fournie-Zaluski
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pharmaleads SA
Original Assignee
Pharmaleads SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pharmaleads SA filed Critical Pharmaleads SA
Publication of WO2008003773A1 publication Critical patent/WO2008003773A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching

Definitions

  • the present invention relates to the field of fluorescence detection of interactions between peptide compounds and their targets.
  • the present invention relates to a method of fluorescence detection of an interaction between (i) a peptide compound containing at least one phosphorylated or phosphorylatable amino acid and (ii) a target (for example, an enzyme such as a protein phosphatase or a protein kinase) capable of interacting with this peptide compound.
  • a target for example, an enzyme such as a protein phosphatase or a protein kinase
  • the detection is carried out thanks to the presence, in the peptide sequence of said compound, of the amino acid pyrenylalanine (Pya) used as a fluorescence reporter and this, in the absence of cleavage of said peptide sequence.
  • a typical example of a cascade of signaling involving protein kinases (also here called kinases or PK) and protein phosphatases (also herein referred to as phosphatases or PP) is that which relates to the mitogenic actions of insulin. They are exercised through a complex cascade of events.
  • the first substrate of the insulin receptor after binding thereof has been named logically insulin receptor substrate No. 1 "Insulin Receptor Substrate 1" (IRS-1). This receptor is a 165-180 kDa protein.
  • Activation of the insulin receptor results in phosphorylation of IRS-1 on many tyrosine residues (Tyr). At least 8 tyrosines of IRS-1 thus undergo phosphorylation by the insulin receptor.
  • phosphotyrosines Tyr-O-PO3H 2 or pTyr
  • GRB2 insulin signaling pathways
  • PLC ⁇ proteins involved in insulin signaling pathways
  • PI3 kinase etc.
  • SH2 domains SH2 domains
  • SH2 proteins recognize phosphotyrosines belonging to different sequences in the sequence of IRS-1. It is the sequences around the phosphorylated tyrosines that determine the binding specificities of the different SH2 proteins with IRS-1.
  • the IRS-1 / Grb-2 complex interacts with a homologous protein of the Drosophila "Son of Sevenless” (SoS) gene product.
  • SoS Drosophila "Son of Sevenless”
  • This SoS protein catalyzes the exchange of GDP for GTP at the level of the ras protein (p21 ras), which results in the phosphorylating activation of the latter.
  • the ras protein also has a GTPase activity which remains weak, however, and must be stimulated (up to 10,000 times) by a GTPase Activating Protein (GAP).
  • GAP GTPase Activating Protein
  • Tyrosine phosphatase SHP-2 which is involved in the signal transduction of certain growth factors (IGF-1, EGF, etc.) and cytokines, by activating the MAP kinase cascade after binding to the Grb2-SoS complex, could also play a role in signal regulation.
  • SHIP-2 SH2-domain inositol 5-phosphatase normally catalyzes the conversion of PIP3 to PIP2. In mice, heterozygous invalidation of the SHIP-2 gene increases insulin sensitivity.
  • the dephosphorylation of tyrosine in a peptide can be monitored by measuring the fluorescence increase of this amino acid during the hydrolysis of the O-PO3H2 group (Zhang et al., 1993).
  • this variation is very small, of the order of 130 to 150 units, which represents hardly a doubling of the basic fluorescence of the substrate. It is also easily altered by the presence of other amino acids, in particular Tyr or Trp.
  • a more complicated variant requires fluorescence polarization revelation (Molecular Devices). It is based on the change (reduction) in the rotational-displacement rate of the phosphorylated peptide when it is bound to the iron complex by its phosphate group, and conversely (increase) when the phosphate is removed by the action of a phosphorylated peptide. phosphatase. In addition to the sophistication of equipment that this technique requires, the sensitivity remains low.
  • Fluorescent substrates sensitive to the activity of protein kinases have recently been described (Wang et al., 2006).
  • the authors fixed the fluorophore pyrene at the end of the side chain of L-2,3-diaminopropionic acid (Dap) or ⁇ -2,4-acid. -diaminobutanoic (Dab).
  • Dap or Dab residues thus modified are then introduced into peptide chains comprising 10 amino acids, including tyrosine, to form libraries of potential substrates. Fluorescence of the pyrenyl residue is enhanced upon tyrosine phosphorylation by tyrosine kinases.
  • the Applicant proposes here for the first time to use a single fluorescence reporter, both universal and powerful, of the phosphorylated state or not of tyrosine residues, namely the Pya (L-pyrenylalanine) residue.
  • the Applicant proposes to introduce Pya into short peptide sequences containing one or more phosphorylatable or phosphorylated tyrosines, and to use it as a reporter for the phosphorylation and / or dephosphorylation reactions of this amino acid. by kinases or phosphatases, respectively.
  • the sequences comprising the residues Tyr and Pya can advantageously be immobilized on a support (e.g., ball, column or plate).
  • the inventors have noticed that the phosphorylated or non-phosphorylated states of peptide sequences, originating from known substrates of phosphatases or kinases, or from a restricted library, lead to an intense change (decrease to extinction, or increase) of the fluorescence of the protractor Pya, under the effect of a phenomenon of modulation of this parameter by collision ("collisional quenching").
  • the present invention shows that these fluorescence changes can be advantageously used to measure the activity of a phosphatase or a kinase and, thus, look for inhibitors or activators of these enzymes and quantify the potency of these molecules in a homogeneous test High Speed.
  • the Applicant therefore proposes methods that facilitate the characterization and the determination of tyrosine phosphatases and tyrosine kinases, as well as the characterization and the determination of their specific inhibitors or activators. Also proposed are methods that facilitate the identification of new phosphatases or kinases, as well as the search for substrates for phosphatases or kinases.
  • the Applicant further proposes means of selecting the substrate optimized for a known or unknown phosphatase / kinase, and of using it to measure the inhibitory or activating power of a given substance.
  • the Applicant also proposes a sensitive method making it possible to demonstrate and characterize complexes between peptides or phosphorylated proteins and their receptor protein targets in a homogeneous medium or on cells or tissues.
  • the present invention takes advantage of the singular properties, demonstrated here for the first time, of the Pya fluorescent residue when it is placed in an amino acid sequence, at least one of which corresponds to a tyrosine. or a phosphorylated tyrosine.
  • This amino acid Pya can be produced in large quantities in L form (Soleilhac et al., 1996) and is easily introduced by solid phase synthesis into a peptide sequence, which considerably minimizes the associated steric hindrance problems, in the known techniques, the introduction of various fluorescent groups at the end of amino acid side chains (cysteine, lysine, Dap / Dab).
  • a major interest of the rest Pya is the very intense fluorescence of pyrene which has two emission maxima at 377 nm and 405 nm, that is to say located in regions that are not affected by remission of tyrosines and tryptophans possibly present in the protein to be studied or in the cell medium.
  • the pyrene possesses excellent fluorescence quantum yield (0.32) as well as a long fluorescence lifetime (100 ns) (Berlman ID (eds), 1971).
  • the fluorescence emitted by Pya is sensitive to a very polar environment, the proximity of the latter leading to fluorescence quenching by collision (Yaron et al., 1979).
  • This sensitivity to a polar environment has already been used in the past to measure, for example, endothelin degradation by the endothelin converting enzyme (ECE) (Luciani et al., 2001).
  • ECE endothelin converting enzyme
  • patent FR 2 807 523 that of the substrates of botulinum toxin B (Anne et al., 2001, patent FR 2 809 733) and A (patent application FR 2 869 908). .
  • pNF p-nitrophenylalanine
  • the inventors have found quite unexpectedly that the fluorescence of the Pya residue was strongly affected by the phosphorylation state of a target tyrosine of a kinase or a phosphatase.
  • the action of a phosphatase such as PTP1 B produces the opposite effect, that is to say a very significant decrease in the fluorescence of Pya.
  • the present invention relates to a method for fluorescence detection of an interaction between: a peptide in which at least one phosphorylated or phosphorylatable tyrosine is separated from a Pya marker by at most 4 amino acids; and
  • a target capable of interacting with this peptide said target being a phosphatase or a protein kinase,
  • said method comprising at least, in the absence of cleavage of the peptide sequence: a) bringing the peptide containing the Pya marker into contact with said target; b) determining the level of F1 fluorescence of said labeled peptide in the presence of said target; and c) comparing the level of F1 fluorescence obtained in step b) with the fluorescence level FO of said labeled peptide in the absence of said target, a significant difference between FO and F1 revealing an interaction between the target and the peptide .
  • an "interaction” can be either direct or indirect.
  • a "direct” interaction between at least two partners involves no intermediary or relay. Either the partners are in immediate physical contact with each other (interaction that could be described as structural), or the partners interact "remotely".
  • one or more additional partners serve as relays. This relay (s) is (are) therefore, him (them), in direct interaction with the partners in question. In any case, whatever the type of interaction, it has the effect of having an effect on the biological function of at least one of the partners (functional interaction).
  • a “peptide sequence” is a sequence of "leftovers” or
  • Residues which may be natural amino acids, L-series, or “modified” amino acids such as phosphorylated natural amino acids, modified phenylalanine Phe- (p-CH 2 P ⁇ 3H 2 ) or p-CH 2 - Phe, the marker Pya.
  • sequence (peptide) “chain (peptide)””sequence(peptide)” and “peptide” are equivalent and denote a sequence of amino acids, including the marker Pya, whose length can range from 2 to 30 residues, preferably from 2 to 20 residues, more preferably from 2 to 15 residues, more preferably from 5 to 11 residues.
  • the terms “remainder” and “residue” are synonymous and here denote a unit in the peptide chain, in particular an amino acid, modified or unmodified, phosphorylated or not, and Pya.
  • the peptide sequences implemented in the context of the present invention comprise at least one tyrosine residue, phosphorylated or otherwise.
  • the expression “in the absence of cleavage of the peptide sequence” means that it is excluded any breakage of one or more peptide bonds in the sequence in question.
  • This feature of the invention reflects the ability of the Pya remainder to serve as an autonomous fluorescence marker, allowing it alone to detect an interaction signal.
  • the "cleavage” as described above of the phosphatase catalyzed hydrolysis of a -O-PO3H2 group in -OH group is clearly distinguished here.
  • Pya marker As is clear from the present text, the terms "Pya marker”, “Pya fluorescence marker”, “Pya fluorescence reporter”, “Pya reporter”, “Pya remainder”, “Pya residue” are synonymous with Pya denotes L-pyrenyl-alanine.
  • the peptide is said to be “labeled” when the peptide sequence contains the Pya marker.
  • target is used here to designate an enzyme to modify the structure and / or the function of the peptide as above-defined.
  • This enzyme is in this case a phosphatase or a kinase.
  • the peptide can be, by interaction with this enzyme, structurally modified by dephosphorylation (respectively, by phosphorylation), thus causing a change in its function. This change may result in activation or inhibition, partial or total, or a change of activity.
  • the enzyme is a phosphatase and the peptide comprises at least one phosphorylated Tyr residue.
  • the enzyme is a kinase and the peptide comprises at least one phosphorylatable Tyr residue.
  • the enzyme according to the invention is a phosphatase and in this case the molecule comprises, or is preferably, at least one phosphorylated Tyr residue.
  • Pya can be incorporated into the peptide sequence via a covalent bond, that is to say a peptide-type bond.
  • the Pya marker is then preferably incorporated in the peptide sequence so as to be separated from the Tyr or pTyr residue or residue by at most 4, preferably 3, more preferably 2, amino acids.
  • the determination of the fluorescence levels FO and F1 of the labeled peptide is carried out by conventional methods, which are well known to those skilled in the art. This determination may be purely qualitative (the appearance or disappearance, or the increase or decrease in intensity, of the fluorescence is then detected).
  • the determination may be a quantitative measure of the fluorescence (then fluorescence measurements which make it possible to access the kinetic constants, the dissociation constants, to determine an inhibitory or activating power, etc.).
  • the quantitative determination of the fluorescence according to the method which is the subject of the present invention is advantageously adapted to systematic sorting.
  • High Throughput (HTS) (For a recent review of currently available techniques, see US Application 2005/0026234 in the name of Violin et al.)
  • the difference between the fluorescence levels FO and F1 observed in step c) corresponds to an increase in the fluorescence. This is, for example, the case when the target is a protein tyrosine kinase and the peptide contains a tyrosine.
  • the difference between the fluorescence levels FO and F1 observed in step c) corresponds to a decrease in the fluorescence.
  • the case where the target is a tyrosine phosphatase and the peptide contains a pTyr is exemplified.
  • a second aspect of the present invention is the application of the method described above to the detection, identification and selection of a phosphatase or a protein kinase.
  • One embodiment corresponds, for example, to a screening method for identifying such an enzyme, in which the fluorescence detection method according to the invention is implemented, using, as substrate of the enzyme, the peptide containing the fluorescence marker Pya. In this case, the target is then the enzyme to be identified. The detection, identification and selection of the enzyme will be based on the activity that can be demonstrated in the presence of the substrate.
  • the present invention is concerned with the application of the fluorescence detection method as described above, to the assay of the biological activity of a phosphatase or a protein kinase.
  • a method for assaying the activity of such an enzyme that is to say a kinase (phosphorylation activity) or a phosphatase (activity of dephosphorylation).
  • the fluorescence detection method described above in which the peptide containing Pya is the substrate of the enzyme, is used, and the fluorescence levels, quantitatively determined, are correlated with levels of enzymatic activity.
  • a fourth aspect of the present invention relates to the application of the fluorescence detection method above, to the detection, identification and selection of a peptide capable of acting as a substrate for a phosphatase or a protein kinase.
  • a particular embodiment corresponds to a method for screening a peptide containing the Pya marker and capable of acting as a substrate for such an enzyme, which process comprises at least the implementation of steps a) to c) of the method fluorescence detection method previously described, so that at the end of step c), if FO and F1 are significantly different, the peptide is selected for its ability to act as a substrate of the enzyme.
  • the present invention relates to the application of the fluorescence detection method described above, to the detection, identification and selection of a compound capable of disrupting the interaction between a peptide containing Pya acting as substrate and a phosphatase or protein kinase.
  • rupt may here be synonymous with “promote / increase / activate” or, conversely,
  • this application corresponds to a method for screening a compound capable of disturbing the interaction between a phosphatase or a protein kinase and a peptide containing Pya and acting as a substrate, said method comprising at least the implementation steps a) to c) of the detection method according to the invention then, if FO and F1 are significantly different, the selection of the compound capable of disrupting the interaction between the peptide and the enzyme (which is here the target).
  • the compound is capable of inhibiting the interaction between the peptide and the target (the compound is therefore an inhibitor).
  • F1 is significantly greater than FO, the said compound is capable of promoting the interaction between the peptide and the target (the compound is then an activator).
  • a sixth aspect of the present invention relates to the application of the fluorescence detection method as described above, to the determination of the kinetic characteristics of the interaction between:
  • this application of the fluorescence detection method according to the invention further comprises the quantitative determination of the power of a compound to inhibit or activate said interaction and, optionally, the calculation of the thermodynamic constants of this inhibition or activation.
  • a seventh aspect of the present invention relates to a self-reporter peptide substrate of its phosphorylation state, comprising a Pya marker, of general formula chosen from the following formulas (I) and (II):
  • Z is an acetyl, biotinyl or 6-aminohexanoyl group; - Xi, X'i and X "i represent independently of each other a natural amino acid L-series, phosphorylated or not, or p-CH 2 -Phe;
  • n is less than or equal to 4.
  • X 2 is selected from Tyr, pTyr and p-CH 2 -Phe.
  • a self-reporter peptide substrate of its phosphorylation state has the formula, a formula chosen from:
  • Z is an acetyl, biotinyl or 6-aminohexanoyl group
  • - Xi and X'i represent independently of each other a natural amino acid L series selected from A, E, D, L;
  • X 2 is selected from Tyr, pTyr and p-CH 2 -Phe.
  • one or more libraries (or libraries) of substrates responding to one or other of these formulas (I) to (IV) will be constituted and may in particular be used for screening purposes, substrates (in particular, phosphatase or kinase substrates) and / or enzymes (in particular, phosphatases or kinases) capable of acting on these substrates.
  • the present invention aims at the use of such a self-reporter peptide substrate of its phosphorylation state, in a fluorescence detection method according to the preceding description, or in one of the aforementioned applications.
  • This is the case of fixing on a support (plate, resin, magnetic beads, etc.) via the hexanoyl residue or biotinyl of a phosphorylated substrate corresponding to a phosphorylated sequence of a kinase.
  • the introduction of the amino acid p-CH 2 -Phe instead of pTyr prevents nonspecific or phosphatase hydrolysis, and allows the potential target (s) of the kinase to be isolated.
  • a typical example of this is the phosphorylated growth factor receptor or angiogenic factor sequence that has intracellular tyrosine kinase activity.
  • the phosphorylated, phosphatase-resistant and immobilized peptide makes it possible to isolate a target, for example SoS for the EGF receptor, by the fluorescence variation of the remainder p-CH 2 -Phe, during the interaction with its ( its) specific target (s), that (s) may be one (or) phosphatase (s).
  • phosphatase PTP1 B which is specifically recognized by a peptide sequence such as IYETD pY pY RK NH 2 .
  • a peptide sequence such as IYETD pY pY RK NH 2 .
  • the peptide 9 cited in the examples below which is derived from the library of peptide substrates of formula (III) mentioned above and in which the first tyrosine is replaced by Pya, would be used in this case.
  • FIG. 1 Comparison of the fluorescence emission spectra of peptides 9 (phosphorylated) and 8 (non-phosphorylated).
  • PTP1 B Inhibition of the phosphatase activity of PTP1 B on substrate 9 by a competitive and reversible inhibitor: the PTP inhibitor IV.
  • Buffer used 5mM Hepes pH 6.9, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 2mM DTT.
  • PTP1 B was used at a concentration of 20 ng / mL, substrate 9 at a concentration of 10 ⁇ M.
  • FIG. 4 Phosphorylation kinetics of peptide 12 (20 ⁇ M) by the p60s-src kinase.
  • Buffer used 5mM Tris pH 7.5, 2mM DTT, 5mM MgCl 2, 1mM MnCl 2, 0.01mg / mL BSA, 1mM ATP.
  • the percentage of dephosphorylation was then determined for each phosphatase by comparison between the test and the negative controls (fluorescence of compound 9 alone at 25 ⁇ M and fluorescence of the dephosphorylated peptide 8 alone at 25 ⁇ M). Each experiment was performed at least twice, in duplicate.
  • FIG. 6 Comparison of the dephosphorylation kinetics of the phosphorylated peptide (Ac-1-Pya-ETD-pY-pY-RK-NH 2 ) by different phosphatases.
  • RPTPs Receptor-Protein-Tyrosine phosphatase
  • PTP-LAR and PTP-RO B
  • NRPTPs Non-Receptor-Protein-Tyrosine Phosphatases
  • the rest Pya can be introduced: in known peptide sequences, which can serve as substrates for phosphatases and kinases,
  • Peptide 9 Ac-1-Pya-ETD-pY-pY-RK-NH 2 , in which Pya replaces a tyrosine, was synthesized and found to be an excellent PTP1 B substrate, with simultaneous dephosphorylation of the two remaining pYs. (see examples below).
  • the unphosphorylated analog 8 (Ac-1-Pya-ETDYYRK-NH 2 ) is a kinase substrate and, more particularly, the PTK domain of the insulin receptor.
  • Z is an acetyl, biotinyl or 6-aminohexanoyl group (during the synthesis carried out in the solid phase, the Z group is an acetyl); m and n are each less than or equal to 4;
  • X 2 is selected from Tyr, pTyr and p-CH 2 -Phe.
  • a single alanine is replaced in each peptide by a Pya residue, thus leading to 8 different peptides if each of m and n is 4.
  • each remaining alanine is successively replaced by a mixture of the 18 natural amino acids (except AIa), to which are added the modified amino acids Tyr-OPO 3 H 2 (pTyr) and Phe-CH 2 -PO 3 H 2 (pCH 2 -Phe).
  • FIG. 1 illustrates the difference in fluorescence of the L-pyrenylalanyl residue in a peptide containing a phosphorylated or non-phosphorylated tyrosine 8 at the same concentration (1 micromolar).
  • Figure 2 shows the dephosphorylation kinetics of peptide 9 in the presence of PTP1B phosphatase.
  • FIG. 3 represents the inhibition curve of the activity of PTP1B on substrate 9 by the action of a competitive inhibitor.
  • Figure 4 shows the kinetics of phosphorylation of the substrate 12 by the p60 kinase c "src.
  • FIGS. 5 and 6 respectively show the dephosphorylation selectivity of peptides 16 and 9 by different phosphatases.
  • Table 1 below reports the kinetic parameters of the dephosphorylation of different peptides containing phosphorylated tyrosine (s) (pY) and L-pyrenalanine (Pya) in their sequence.
  • Table 1 below reports the kinetic parameters of the dephosphorylation of different peptides containing phosphorylated tyrosine (s) (pY) and L-pyrenalanine (Pya) in their sequence.
  • the Z 'factors were determined by three independent experiments comparing the fluorescence of the phosphorylated peptide to the same dephosphorylated peptide.
  • the best Km / kcat ratio is sought for maximum fluorescence variation (for example, for PTP1 B).
  • the determination of the inhibitory power of a candidate compound can then be carried out according to the conventional methods (see FIG. 3), in particular by (i) pre-incubation of increasing doses of the compound potentially inhibiting with the enzyme used at a concentration close to its Km and for a time such that it remains below a threshold set at 15% of the maximum activity (defined as the activity leading to a dephosphorylation or total phosphorylation), followed by (ii) bringing the thus preincubated enzyme into contact with the pre-selected substrate peptide. A decrease of the enzymatic activity is then sought in the presence of the substrate and the potential inhibitor, relative to the level of reference activity of the enzyme in the presence of the single substrate.
  • the identification of an activator can be carried out in an analogous manner, but by seeking, conversely, an increase in the enzymatic activity in the presence of the substrate and the potential activator, with respect to the level of activity of the activator. reference of the enzyme in the presence of the single substrate.
  • Yet another advantage of the invention lies in the large and unexpected variation of the fluorescence of the Pya residue in one of the peptide sequences of a library according to the above, when this sequence recognizes a specific tyrosine phosphatase effector.
  • This (or these) effector (s) corresponds (ent) to a protein, a set of proteins, a peptide, a free or complexed nucleic acid that is or is more or less critically involved in cell signaling regulated by the action of phosphatases.
  • this amino acid may advantageously be replaced by a Phe-CH 2 -P ⁇ 3 H 2 residue (Marseigne and Roques, 1988), which is not hydrolysable and therefore lends itself more easily to measurements, in a homogeneous medium or not (cell homogenates, cells, tissues), without risk of cleavage whereas it could be the case with the rest O-PO3H2.
  • the variation of the fluorescence of Pya observed during the binding between the phosphorylated sequence containing the fluorophore and an effector is used to characterize inhibitors (or activators) of this interaction.
  • This reaction which is carried out in a homogeneous medium in a single step, is easily and advantageously due to its sensitivity, to a systematic high throughput sorting of inhibitory or activating molecules (HTS screening).
  • labeled peptides present in a library are screened to isolate the most refined peptide sequence for a potential enzyme by fluorescence variation.
  • the most refined peptide is used to isolate the enzyme.
  • the tyrosine residue (respectively pTyr) is replaced by its nonhydrolyzable analogue pCH 2 -Phe.
  • the peptide sequence can be immobilized, for example, via an N-terminal biotinyl residue that will interact with an avidin, or by direct covalent attachment with N-terminal amino hexanoic acid.
  • the above examples are more particularly concerned with protein phosphatases as biological targets of interest.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection par fluorescence d'une interaction entre (i) un peptide contenant au moins un acide aminé phosphorylé ou phosphorylable et (ii) une cible enzyme telle qu'une protéine phosphatase ou une protéine kinase susceptible d'interagir avec ce peptide, dans lequel, en l'absence de clivage de l ' enchainement peptidique, a) on met en présence ladite cible et le peptide contenant le marqueur de fluorescence pyrénylalanine (Pya); b) on détermine le niveau de fluorescence Fl du peptide marqué en présence de ladite cible; et c) on compare ce niveau de fluorescence Fl avec le niveau de fluorescence FO du peptide marqué en l'absence de ladite cible, une différence significative entre FO et Fl révélant une interaction entre la cible et le peptide, cette interaction pouvant entra*ner une déphosphorylation ou une phosphorylation du peptide lorsque la cible est respectivement une phosphatase ou une protéine kinase.

Description

PROCEDE DE DETECTION D'INTERACTIONS A L'AIDE DU RAPPORTEUR DE FLUORESCENCE PYRENYLALANINE
La présente invention se rapporte au domaine de la détection, par fluorescence, d'interactions entre des composés peptidiques et leurs cibles.
Plus précisément, la présente invention concerne un procédé de détection par fluorescence d'une interaction entre (i) un composé peptidique contenant au moins un acide aminé phosphorylé ou phosphorylable et (ii) une cible (par exemple, une enzyme telle qu'une protéine phosphatase ou une protéine kinase) susceptible d'interagir avec ce composé peptidique. Selon ce procédé, la détection est réalisée grâce à la présence, dans l'enchaînement peptidique dudit composé, de l'acide aminé pyrénylalanine (Pya) utilisé comme rapporteur de fluorescence et ce, en l'absence de clivage dudit enchaînement peptidique.
La connaissance des mécanismes intracellulaires qui permettent le contrôle du cycle cellulaire est essentielle. Les cascades de phosphorylations-déphosphorylations des protéines font partie de ces mécanismes biologiques essentiels. Selon toute vraisemblance, de nombreux nœuds de communication existent entre ces mécanismes intracellulaires et les voies de signalisation des médiateurs intercellulaires.
Au plan des mécanismes, on constate que la diversité des contrôles ne s'appuie pas sur une grande variété de réactions. Pour ce qui concerne les médiateurs à récepteurs membranaires, on observe toujours l'activation d'une ou plusieurs protéines kinases suivie de la phosphorylation de diverses protéines substrats. Ces protéines substrats sont, par exemple, des enzymes, des canaux ioniques, des protéines du cytosquelette, des facteurs de transcription, des protéines de contrôle du cycle cellulaire, etc., dont la phosphorylation entraînera une modification des propriétés biologiques (activation ou désactivation). Les changements de propriétés de ces protéines substrats conduisent, plus ou moins directement, à des modifications métaboliques et/ou génomiques qui, ensemble, constituent la réponse cellulaire spécifique.
Il est également intéressant de constater que de très nombreuses étapes de transduction des signaux cellulaires consistent en la levée d'inhibitions. C'est le cas de l'activation des récepteurs membranaires tyrosines kinases et des récepteurs nucléaires aux facteurs de transcription. Dans ces deux cas, pourtant structurellement très différents l'un de l'autre, on observe que l'absence du domaine de liaison de l'hormone entraîne l'activation constitutive du récepteur. Ceci indique que les domaines de liaison des hormones inhibent les activités des domaines transducteurs en l'absence du ligand. Il est donc important de rechercher les protéines dont l'interaction dépend de manière critique de la phosphorylation-déphosphorylation d'une ou plusieurs tyrosine(s).
Un exemple type d'une cascade de signalisations impliquant des protéines kinases (également ici appelées kinases ou PK) et protéines phosphatases (également ici dénommées phosphatases ou PP) est celui qui concerne les actions mitogéniques de l'insuline. Elles s'exercent par l'intermédiaire d'une cascade complexe d'événements. Le premier substrat du récepteur de l'insuline après la liaison de celle-ci, a été nommé, de manière assez logique, substrat n°1 du récepteur de l'insuline « Insulin Receptor Substrate 1 » (IRS-1). Ce récepteur est une protéine de 165-180 kDa. L'activation du récepteur de l'insuline entraîne la phosphorylation de l'IRS-1 sur de nombreux résidus tyrosines (Tyr). Au moins 8 tyrosines de IRS-1 subissent ainsi une phosphorylation par le récepteur de l'insuline. Ces phosphotyrosines (Tyr-O-PO3H2 ou pTyr) sont les points d'ancrage d'autres protéines intervenant dans les voies de signalisation de l'insuline (GRB2, PLCγ, PI3 kinase, etc.). Toutes ces protéines ont en commun de posséder des domaines SH2 (« src homology 2 ») responsables des interactions spécifiques avec des régions portant ces phosphotyrosines. Ces protéines à SH2 reconnaissent des phosphotyrosines appartenant à des séquences différentes dans l'enchaînement d'IRS-1. Ce sont les séquences situées autour des tyrosines phosphorylées qui déterminent les spécificités de liaison des différentes protéines à SH2 avec IRS-1.
A titre d'exemple, le complexe IRS-1/Grb-2 interagit avec une protéine homologue du produit du gène « Son of Sevenless » (SoS) de la drosophile. Cette protéine SoS catalyse l'échange du GDP pour le GTP au niveau de la protéine ras (p21 ras), ce qui entraîne l'activation phosphorylante de cette dernière. La protéine ras possède également une activité GTPase qui reste cependant faible et doit être stimulée (jusqu'à 10 000 fois) par une GTPase Activating Protein (GAP). L'action de GAP entraîne la désactivation de ras.
La tyrosine phosphatase SHP-2, impliquée dans la transduction du signal de certains facteurs de croissance (IGF-1 , EGF, etc.) et de cytokines, en activant la cascade des MAP kinases après sa liaison au complexe Grb2-SoS, pourrait aussi jouer un rôle dans la régulation du signal.
Dans le cas des protéines à phosphotyrosine, la spécificité de reconnaissance des sites phosphorylés porte sur la phosphotyrosine elle- même et sur les 3 résidus adjacents du côté C-terminal. Néanmoins, on a récemment mis en évidence un domaine appelé TPB (« phosphotyrosine binding »), dont la spécificité de liaison porte sur les résidus du côté N- terminal par rapport à la phosphotyrosine. Ce recouvrement des sites de spécificité laisse envisager une certaine compétition entre les deux types de domaine (et, donc, une balance entre les voies de signalisation concernées). Ces résidus adjacents du côté N-terminal de la phosphotyrosine sont également déterminants pour la liaison des tyrosines phosphatases et, donc, pour la durée de vie de la phosphorylation de la tyrosine considérée.
En effet, les mécanismes de régulation des processus cellulaires impliquent un équilibre permanent entre l'état phosphorylé d'une protéine par une kinase, et son état déphosphorylé par une phosphatase. Ainsi, certaines tyrosines phosphatases membranaires, en déphosphorylant le récepteur de l'insuline, sont capables de l'inactiver. Chez la souris, l'absence de la protéine tyrosine phosphatase 1 B (PTP-1 B) entraîne une augmentation de la sensibilité à l'insuline. Grâce à son domaine SH2, SHIP-2 se lie à certaines phosphotyrosines d'IRS-1 et inhibe ainsi son activité. Autre phosphatase jouant un rôle probable dans la régulation du signal insulinique, la SHIP-2 (inositol 5-phosphatase à domaine SH2) catalyse normalement la conversion de PIP3 en PIP2. Chez la souris, l'invalidation hétérozygote du gène de SHIP-2 augmente l'insulinosensibilité.
Ainsi apparaît-il que de nombreux mécanismes peuvent moduler la cascade de réactions faisant suite à la liaison des messagers extracellulaires (insuline dans les exemples précédents) à leurs récepteurs. En outre, les diverses voies d'activation impliquées présentent entre elles des interactions, rendant ainsi particulièrement difficile la compréhension du rôle précis de chaque molécule. C'est la raison de l'intérêt porté aux phosphatases et kinases ainsi qu'à leur(s) cible(s).
D'un point de vue pratique, il existe à ce jour de nombreuses méthodes pour étudier les kinases et phosphatases. Quelques-unes des méthodes les plus courantes sont décrites ci-après à titre de présentation non-exhaustive de l'arrière-plan technologique de l'invention.
La déphosphorylation de la tyrosine dans un peptide peut être suivie par la mesure de l'accroissement de fluorescence de cet acide aminé au cours de l'hydrolyse du groupe O-PO3H2 (Zhang et al., 1993). Toutefois, cette variation est très faible, de l'ordre de 130 à 150 unités, ce qui représente à peine un doublement de la fluorescence de base du substrat. Elle est en outre facilement altérée par la présence d'autres amino-acides, en particulier Tyr ou Trp.
Plusieurs dosages utilisant la fluorescence ont été rapportés tant pour mesurer l'activité kinase que l'activité phosphatase. Ces dosages sont basés sur le changement de conformation attendu lorsqu'une protéine ou un peptide gagne ou perd le groupe PO3H2 sur un acide aminé phosphorylable. Pour être efficaces, ces méthodes exigent l'introduction d'un groupe fluorescent, tel que 6-acryloyl-2-diméthylaminonaphtalène (acrylodan), BODIPY, IANBD amide, IAEDANS, etc., sur la chaîne latérale d'une cystéine nécessairement adjacente à l'acide aminé phosphorylable ou phosphorylé (revue dans Brennan J. D., 1999 ; Past et al., 1994 ; Higaschi et al., 1997 ; Noble J. et al., 2003). L'avantage de ces essais est de pouvoir être conduits de manière homogène (en solution et de manière continue). Ils possèdent toutefois plusieurs inconvénients. En particulier, l'obligation de vicinité entre la cystéine et le reste phosphorylable peut représenter une gêne à la liaison avec la kinase ou la phosphatase et ce, d'autant plus que ce reste Cys va comporter un fluorophore très encombrant. En outre, la contrainte de vicinité limite la construction (et la diversité) de librairies de substrats. Enfin, la sensibilité reste assez faible, ce qui rend nécessaire des quantités d'enzymes importantes et un temps de mesure long. Ceci est un facteur défavorable pour le tri à haut débit d'inhibiteurs (Noble J., 2003).
Deux méthodes proches des techniques précédentes et s'appuyant sur la fluorescence ont été rapportées. Elles consistent à introduire un fluorophore, tel que la rhodamine, à l'extrémité d'un peptide phosphorylable, puis à placer ce peptide en présence d'un complexe soluble ou non du fer. La phosphorylation de l'acide aminé (Tyr, Ser, Thr) par une kinase conduit à la liaison du groupe O-PO3H2 avec le complexe du fer et à un rapprochement du fluorophore. Ceci entraîne une diminution de la fluorescence qui peut donc être utilisée pour doser l'activité de l'enzyme, son inhibition, etc. Inversement, dans le cas d'une phosphatase, la fluorescence du phosphopeptide, éteinte au début du fait de l'interaction du peptide avec le complexe du fer, va augmenter au fur et à mesure de la déphosphorylation. Là encore, cette technique possède plusieurs inconvénients : i) elle nécessite un apport extérieur de complexe métallique qui peut interagir avec du phosphate inorganique présent dans la préparation utilisée (homogénats) ou avec un groupe de ce type dans un inhibiteur à tester ; ii) elle présuppose que la conformation du peptide est suffisamment flexible pour se modifier et venir à très grande proximité du complexe du fer, ce qui dépend bien évidemment de la séquence du peptide. Cette technique est actuellement commercialisée sous différents noms (QTL biosystems, IQTM technology). Une variante plus compliquée exige une révélation par polarisation de fluorescence (Molecular Devices). Elle se base sur le changement (réduction) dans la vitesse de rotation- déplacement du peptide phosphorylé lorsqu'il est lié au complexe du fer par son groupe phosphate, et inversement (augmentation) lorsque le phosphate est éliminé par l'action d'une phosphatase. Outre la sophistication d'appareillage que cette technique exige, la sensibilité reste faible.
Une autre méthode est décrite dans la demande de brevet internationale WO 2005/012329. Cette méthode s'effectue en deux temps et exige la construction de peptides phosphorylables possédant un site de clivage spécifique pour une enzyme donnée. Le peptide contient en N- terminal un groupe fluorescent et en C-terminal un reste capable d'éteindre la fluorescence émise par le fluorophore (« quencher »). Le « quenching » s'effectue par transfert d'énergie de fluorescence (FRET). La phosphorylation d'un tel peptide n'affecte pas le FRET mais le « quenching » disparaît lorsque l'enzyme ajoutée coupe le peptide et libère le fluorophore contenu dans un des deux métabolites. Il s'agit d'un dosage non homogène (deux étapes) qui présente de nombreuses limitations, parmi lesquelles la mise en oeuvre d'une peptidase dont l'activité est modulée par la présence ou l'absence du reste phosphorylé, ce qui limite le caractère universel de la méthode.
D'autres méthodes d'étude de l'activité des protéines kinases basées sur le transfert d'énergie de fluorescence FRET ont été rapportées. Elles diffèrent par la nature du couple donneur-accepteur (Sato et al., 2002 ; Ting et al., 2001 ; Zhang et al., 2001 ). Cependant, toutes exigent l'introduction d'un couple de fluorophores, ce qui rend plus difficile, notamment, la construction de librairies de peptides substrats.
Des substrats fluorescents sensibles à l'activité des protéines kinases ont été décrits récemment (Wang et al., 2006). Afin de mettre en évidence la phosphorylation de résidus Tyr, les auteurs ont fixé le fluorophore pyrène à l'extrémité de la chaîne latérale de l'acide L-2,3- diaminopropionique (Dap) ou de l'acide ι_-2,4-diaminobutanoîque (Dab). Les résidus Dap ou Dab ainsi modifiés sont ensuite introduits dans des chaînes peptidiques comprenant 10 acides aminés, dont la tyrosine, afin de constituer des librairies de substrats potentiels. La fluorescence du reste pyrényl est augmentée lors de la phosphorylation de la tyrosine par des tyrosines kinases. Cependant, les auteurs ont constaté que ces substrats n'étaient pas universels. En effet, un certain nombre de tyrosines kinases ne les reconnaissent pas. Plusieurs explications peuvent être avancées. D'une part, le reste pyrényl, très encombrant, parce qu'il est introduit à l'extrémité de la chaîne latérale du Dap ou du Dab, est mobile et, donc, d'autant plus susceptible d'entraver l'accès de l'enzyme à sa cible et, par conséquent, de nuire à leur interaction. D'autre part, Wang et al. introduisent le reste pyrène dans les substrats à la fin de la synthèse peptidique en phase solide, après l'étape de déprotection des restes Dab et Dap jusque-là protégés sous forme de 4-méthyltrityl. Ceci limite considérablement les possibilités de diversification des acides aminés utilisables pour construire la librairie de substrats. En l'occurrence, compte tenu des possibilités de réaction de l'acide 1-pyrène acétique avec les chaînes latérales, seuls 4 acides aminés différents (G, A, E et I) sont utilisés dans la formule générale. Les acides aminés G, A et I sont par constitution dépourvus de groupement réactif dans leur chaîne latérale ; le carboxylate en γ de l'acide glutamique E est protégé par un reste t-Bu. En outre, les peptides synthétiques mis en œuvre ne doivent contenir aucun acide aminé portant une chaîne latérale susceptible d'interagir avec l'acide 1-pyrényl-acétique, ce qui est en particulier le cas pour les acides aminés Lys, Arg, His, Ser, Thr,... Dans ces conditions, comme le soulignent les auteurs, la reconnaissance des substrats par un grand nombre de kinases différentes est de facto limitée, du fait de la faible variabilité de séquence des substrats présents dans la librairie. Du reste, le changement de fluorescence (ici, une augmentation) lors de la phosphorylation du résidu Tyr n'est observé que lorsque la chaîne latérale portant le reste pyrène se trouve en position +3 ou -2 par rapport à la tyrosine. Il en résulte donc que cette méthode ne peut permettre l'étude que d'un nombre restreint de tyrosines kinases. II existe ainsi diverses méthodes pour étudier les molécules d'intérêt qui présentent une activité biologique, notamment enzymatique, telles que les kinases et phosphatases. Pourtant, toutes les méthodes disponibles à ce jour imposent des contraintes de faisabilité et de réalisation et/ou présentent des inconvénients techniques, qui en limitent de manière notable l'utilité, la facilité d'usage, la mise en œuvre à grande échelle (ou à haut débit : pour du « high-throughput screening - HTS ») et la généralité d'application. Il existe donc un besoin pour une méthode et des moyens qui seraient à la fois (i) simples de réalisation et d'utilisation ; (ii) efficaces ; (iii) sensibles et (iv) applicables de manière beaucoup plus générale que les méthodes et moyens connus. La présente invention représente précisément la première réponse technique satisfaisante apportée dans le domaine.
La Demanderesse propose ici pour la première fois d'utiliser un rapporteur de fluorescence unique, à la fois universel et puissant, de l'état phosphorylé ou non de résidus tyrosines, à savoir le reste Pya (L-pyrényl- alanine).
Et, dans le cadre de la présente invention, la Demanderesse propose d'introduire Pya dans de courtes séquences peptidiques contenant une ou plusieurs tyrosines phosphorylables ou phosphorylées, et de l'utiliser comme rapporteur des réactions de phosphorylation et/ou déphosphorylation de cet acide aminé par des kinases ou phosphatases, respectivement. Les séquences comprenant le ou les résidus Tyr et Pya peuvent avantageusement être immobilisées sur un support (e.g., bille, colonne ou plaque).
Brièvement, les Inventeurs se sont aperçus que les états phosphorylés ou non de séquences peptidiques, issues de substrats connus de phosphatases ou de kinases, ou bien provenant d'une librairie restreinte, conduisent à un changement intense (diminution jusqu'à l'extinction, ou augmentation) de la fluorescence du rapporteur Pya, sous l'effet d'un phénomène de modulation de ce paramètre par collision (« collisional quenching »). La présente invention montre que ces changements de fluorescence peuvent être avantageusement utilisés pour mesurer l'activité d'une phosphatase ou d'une kinase et, ainsi, rechercher des inhibiteurs ou activateurs de ces enzymes et quantifier la puissance de ces molécules dans un test homogène à haut débit.
La Demanderesse propose donc ici des méthodes qui facilitent la caractérisation et le dosage de tyrosines phosphatases et tyrosines kinases, ainsi que la caractérisation et le dosage de leurs inhibiteurs ou activateurs spécifiques. Sont également proposées des méthodes qui facilitent l'identification de nouvelles phosphatases ou kinases, ainsi que la recherche de substrats des phosphatases ou des kinases.
La Demanderesse propose en outre des moyens de sélectionner le substrat optimisé pour une phosphatase/kinase connue ou inconnue, et de l'utiliser pour mesurer le pouvoir inhibiteur ou activateur d'une substance donnée.
La Demanderesse propose également une méthode sensible permettant de mettre en évidence et de caractériser des complexes entre peptides ou protéines phosphorylés et leurs cibles protéiques réceptrices en milieu homogène ou sur cellules ou tissus.
Comme indiqué ci-dessus, la présente invention tire profit des propriétés singulières, mises en évidence ici pour la première fois, du reste fluorescent Pya, lorsqu'il est placé dans une séquence d'aminoacides dont l'un au moins correspond à une tyrosine ou une tyrosine phosphorylée.
Cet acide aminé Pya peut être produit en grande quantité sous forme L (Soleilhac et al., 1996) et s'introduit facilement par synthèse en phase solide dans une séquence peptidique, ce qui minimise considérablement les problèmes d'encombrement stérique associés, dans les techniques connues, à l'introduction de divers groupes fluorescents à l'extrémité de chaînes latérales d'acides aminés (cystéine, lysine, Dap/Dab).
Un intérêt majeur du reste Pya tient à la fluorescence très intense du pyrène qui possède deux maxima d'émission à 377 nm et 405 nm, c'est-à-dire situés dans des régions qui ne sont pas affectées par rémission des tyrosines et tryptophanes éventuellement présents dans la protéine à étudier ou dans le milieu cellulaire. De plus, le pyrène possède un excellent rendement quantique de fluorescence (0,32) ainsi qu'un long temps de vie de fluorescence (100 ns) (Berlman ID (éd.), 1971 ).
La fluorescence émise par Pya est sensible à un environnement très polaire, la proximité de ce dernier conduisant à une extinction de fluorescence par collision (Yaron et al. 1979). Cette sensibilité à un environnement polaire a d'ailleurs déjà été mise à profit dans le passé pour mesurer, par exemple, la dégradation de l'endothéline par l'enzyme de conversion de l'endothéline (ECE) (Luciani et al., 2001 ; brevet FR 2 807 523), celle des substrats des toxines botuliques B (Anne et al., 2001 ; brevet FR 2 809 733) et A (demande de brevet FR 2 869 908). . Dans ces exemples, un reste très polaire, la p-nitrophénylalanine (pNF), a été introduit dans les substrats pour servir de « quencher ». Le clivage du substrat entre les deux chromophores libère deux métabolites et une intense fluorescence du reste Pya est observée, puisque celui-ci ne subit plus l'influence du groupe « quencher ».
Or, dans le cadre de la présente invention, les Inventeurs ont trouvé de manière tout à fait inattendue que la fluorescence du reste Pya était fortement affectée par l'état de phosphorylation d'une tyrosine cible d'une kinase ou d'une phosphatase. En outre, de manière tout aussi surprenante, ils ont trouvé que la phosphorylation par une kinase de cet acide aminé et, donc, son changement de polarité, produisait non pas une diminution mais une augmentation de la fluorescence de Pya. Réciproquement, l'action d'une phosphatase telle que la PTP1 B produit l'effet inverse, c'est-à-dire une diminution très importante de la fluorescence de Pya.
Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de détection par fluorescence d'une interaction entre : - un peptide dans lequel au moins une tyrosine phosphorylée ou phosphorylable est séparée d'un marqueur Pya par au plus 4 acides aminés ; et
- une cible susceptible d'interagir avec ce peptide, ladite cible étant une phosphatase ou une protéine kinase,
ledit procédé comprenant au moins, en l'absence de clivage de l'enchaînement peptidique : a) la mise en présence du peptide contenant le marqueur Pya, avec ladite cible ; b) la détermination du niveau de fluorescence F1 dudit peptide marqué en présence de ladite cible ; et c) la comparaison du niveau de fluorescence F1 obtenu à l'étape b) avec le niveau de fluorescence FO dudit peptide marqué en l'absence de ladite cible, une différence significative entre FO et F1 révélant une interaction entre la cible et le peptide.
Il est connu qu'une « interaction » peut être soit directe, soit indirecte. Une interaction « directe » entre deux partenaires au moins ne fait intervenir aucun intermédiaire ou relais. Soit les partenaires sont en contact physique immédiat les uns avec les autres (interaction que l'on pourrait qualifier de structurelle), soit les partenaires interagissent « à distance ». A l'opposé, dans une interaction « indirecte » entre au moins deux partenaires, un ou plusieurs partenaires additionnels servent de relais. Ce(s) relais est(sont) donc, lui(eux), en interaction directe avec les partenaires en question. Dans tous les cas, quel que soit le type d'interaction, elle a pour conséquence de produire un effet sur la fonction biologique de l'un des partenaires au moins (interaction fonctionnelle).
Ici, l'interaction entre les résidus Tyr ou pTyr (Tyr phosphorylée) et l'enzyme, respectivement la kinase ou la phosphatase, sont typiquement des interactions directes. Les termes et expressions « activité », « fonction », « activité biologique » et « fonction biologique » sont équivalents et répondent à l'acception usuelle dans le domaine technique de l'invention. Une telle activité peut être notamment de nature enzymatique. Un « enchaînement peptidique » est une séquence de « restes » ou
« résidus », qui peuvent être des acides aminés naturels, de série L, ou des acides aminés « modifiés » tels que des acides aminés naturels phosphorylés, la phénylalanine modifiée Phe-(p-CH2Pθ3H2) ou p-CH2- Phe, le marqueur Pya. Les termes « enchaînement (peptidique) », « chaîne (peptidique) » « séquence (peptidique) » et « peptide » sont équivalents et désignent une suite d'acides aminés, incluant le marqueur Pya, dont la longueur peut aller de 2 à 30 résidus, de préférence de 2 à 20 résidus, de préférence encore de 2 à 15 résidus, de manière encore préférée de 5 à 11 résidus. Comme il ressort de ce qui précède, les termes « reste » et « résidu » sont synonymes et désignent ici une unité dans la chaîne peptidique, en particulier un acide aminé, modifié ou non, phosphorylé ou non, et Pya. De préférence, les séquences peptidiques mises en œuvre dans le cadre de la présente invention comprennent au moins un résidu tyrosine, phosphorylé ou non. L'expression « en l'absence de clivage de l'enchaînement peptidique » signifie que l'on exclut toute rupture d'une ou plusieurs liaisons peptidiques dans la séquence en cause. Cette caractéristique de l'invention reflète la capacité du reste Pya à servir de marqueur autonome de fluorescence, permettant à lui seul de détecter un signal d'interaction. Bien évidemment, on distingue ici clairement le « clivage » tel que décrit ci-dessus de l'hydrolyse, catalysée par une phosphatase, d'un groupe -O-PO3H2 en groupe -OH.
Comme cela ressort sans ambiguïté du présent texte, les termes et expressions « marqueur Pya », « marqueur de fluorescence Pya », « rapporteur de fluorescence Pya », « rapporteur Pya », « reste Pya », « résidu Pya » sont synonymes, avec Pya désignant la L-pyrényl-alanine. Le peptide est dit « marqué » lorsque l'enchaînement peptidique contient le marqueur Pya.
Le terme « cible » est ici utilisé pour désigner une enzymeapte à modifier la structure et/ou la fonction du peptide tel que sus-défini. Cette enzyme est en l'occurrence une phosphatase ou une kinase. Ainsi, dans le cas où l'enzyme est une phosphatase (respectivement, une kinase), le peptide peut être, par interaction avec cette enzyme, modifié structurellement par déphosphorylation (respectivement, par phosphorylation), entraînant ainsi une modification de sa fonction. Cette modification peut se traduire par une activation ou une inhibition, partielle ou totale, ou un changement d'activité.
Selon un mode de réalisation, l'enzyme est une phosphatase et le peptide comprend au moins un résidu Tyr phosphorylé. Alternativement, l'enzyme est une kinase et le peptide comprend au moins un résidu Tyr phosphorylable.
De manière préférée, l'enzyme selon l'invention est une phosphatase et, en ce cas, la molécule comprend, ou est, de préférence au moins un résidu Tyr phosphorylé.
En pratique, préalablement à la mise en œuvre du procédé selon l'invention, Pya peut être incorporé dans l'enchaînement peptidique via une liaison covalente, c'est-à-dire une liaison de nature peptidique. Le marqueur Pya est alors de préférence incorporé dans la séquence peptidique de manière à être séparé du ou d'un résidu Tyr ou pTyr par au maximum 4, de préférence 3, de préférence encore 2, acides aminés. Lors des étapes b) et c), la détermination des niveaux de fluorescence FO et F1 du peptide marqué est réalisée par des méthodes conventionnelles, bien connues de l'homme du métier. Cette détermination peut être purement qualitative (on détecte alors l'apparition ou la disparition, ou bien l'augmentation ou la diminution d'intensité, de la fluorescence). Alternativement ou bien additionnellement, la détermination peut être une mesure quantitative de la fluorescence (on effectue alors des mesures de fluorescence qui permettent d'accéder aux constantes cinétiques, aux constantes de dissociation, de déterminer un pouvoir inhibiteur ou activateur, etc.)- La détermination quantitative de la fluorescence selon le procédé objet de la présente invention est avantageusement adaptée au tri systématique, à haut débit (HTS) (Pour une revue récente des techniques actuellement disponibles, voir la demande US 2005/0026234 au nom de Violin et al.)
Selon un mode de réalisation, la différence entre les niveaux de fluorescence FO et F1 observée à l'étape c) correspond à une augmentation de la fluorescence. Ceci est, par exemple, le cas lorsque la cible est une protéine tyrosine kinase et le peptide contient une tyrosine.
Selon un autre mode de réalisation, la différence entre les niveaux de fluorescence FO et F1 observée à l'étape c) correspond à une diminution de la fluorescence. On citera à titre d'exemple de ce mode de réalisation, le cas où la cible est une tyrosine phosphatase et le peptide contient une pTyr.
Un deuxième aspect de la présente invention vise l'application du procédé décrit ci-dessus à la détection, l'identification et la sélection d'une phosphatase ou une protéine kinase. Un mode de réalisation correspond, par exemple, à un procédé de criblage pour identifier une telle enzyme, dans lequel on met en œuvre le procédé de détection par fluorescence conforme à l'invention, en utilisant, en tant que substrat de l'enzyme, le peptide contenant le marqueur de fluorescence Pya. En ce cas, la cible est alors l'enzyme à identifier. La détection, l'identification et la sélection de l'enzyme se feront d'après l'activité susceptible d'être mise en évidence en présence du substrat.
Selon un troisième aspect, la présente invention s'intéresse à l'application du procédé de détection par fluorescence tel que précédemment décrit, au dosage de l'activité biologique d'une phosphatase ou une protéine kinase. Selon un mode de réalisation, l'on met en œuvre un procédé de dosage de l'activité d'une telle enzyme, c'est-à-dire d'une kinase (activité de phosphorylation) ou d'une phosphatase (activité de déphosphorylation). A cette fin, on utilise le procédé de détection par fluorescence décrit ci-dessus, dans lequel le peptide contenant Pya est le substrat de l'enzyme, et les niveaux de fluorescence, déterminés quantitativement, sont corrélés aux niveaux d'activité enzymatique.
Un quatrième aspect de la présente invention a trait à l'application du procédé de détection par fluorescence ci-dessus, à la détection, l'identification et la sélection d'un peptide capable d'agir comme substrat d'une phosphatase ou une protéine kinase.
Un mode de réalisation particulier correspond à un procédé de criblage d'un peptide contenant le marqueur Pya et susceptible d'agir comme substrat d'une telle enzyme, lequel procédé comprend au moins la mise en oeuvre des étapes a) à c) du procédé de détection par fluorescence précédemment décrit, de telle sorte qu'à l'issue de l'étape c), si FO et F1 sont significativement différents, on sélectionne le peptide pour sa capacité à agir comme substrat de l'enzyme.
Dans un cinquième aspect, la présente invention concerne l'application du procédé de détection par fluorescence décrit ci-dessus, à la détection, l'identification et la sélection d'un composé capable de perturber l'interaction entre un peptide contenant Pya agissant comme substrat et une phosphatase ou une protéine kinase.
Le terme « perturber » peut ici être synonyme de « promouvoir/augmenter/activer » ou, à l'opposé, de
« altérer/réduire/inhiber/supprimer ».
Selon un mode de réalisation, cette application correspond à un procédé de criblage d'un composé susceptible de perturber l'interaction entre une phosphatase ou une protéine kinase et un peptide contenant Pya et agissant comme substrat, ledit procédé comprenant au moins la mise en œuvre des étapes a) à c) du procédé de détection selon l'invention puis, si FO et F1 sont significativement différents, la sélection du composé capable de perturber l'interaction entre le peptide et l'enzyme (qui est ici la cible).
Lors de l'étape de sélection, si FO est significativement supérieur à
F1 , le composé est capable d'inhiber l'interaction entre le peptide et la cible (le composé est donc un inhibiteur). En revanche, si F1 est significativement supérieur à FO, ledit composé est capable de promouvoir l'interaction entre le peptide et la cible (le composé est alors un activateur).
Un sixième aspect de la présente invention concerne l'application du procédé de détection par fluorescence tel que décrit plus haut, à la détermination des caractéristiques cinétiques de l'interaction entre :
- un peptide contenant une ou plusieurs tyrosines phosphorylées ou phosphorylables et un marqueur Pya ; et
- une enzyme présentant une activité kinase ou phosphatase.
Selon un mode réalisation particulier, cette application du procédé de détection par fluorescence conforme à l'invention comprend en outre la détermination quantitative du pouvoir d'un composé à inhiber ou activer ladite interaction et, facultativement, le calcul des constantes thermodynamiques de cette inhibition ou activation.
Un septième aspect de la présente invention concerne un substrat peptidique auto-rapporteur de son état de phosphorylation, comprenant un marqueur Pya, de formule générale choisie parmi les formules (I) et (II) suivantes :
Z-(Xi)ι-X2-(X'i)m-Pya-(X"i)n-NH2 (I)
Z-(X1)I-Py3-(X1 IVX2-(X11 I)n-NH2 (II)
dans lesquelles :
- Z est un groupe acétyl, biotinyl ou 6-aminohexanoyl ; - Xi, X'i et X"i représentent indépendamment les uns des autres un acide aminé naturel de série L, phosphorylé ou non, ou p-CH2-Phe ;
- m est inférieur ou égal à 4 ;
- l+m+n est inférieur ou égal à 9 ; - X2 est choisi parmi Tyr, pTyr et p-CH2-Phe.
Selon un mode de réalisation particulier, un substrat peptidique auto-rapporteur de son état de phosphorylation a pour formule, une formule choisie parmi :
Z-(Xi)3-X2-(X'i)2-Pya-E-NH2 (III)
Z-(Xi)3-Pya-(X'i)2-X2-E-NH2 (IV)
dans lesquelles : - Z est un groupe acétyl, biotinyl ou 6-aminohexanoyl ;
- Xi et X'i représentent indépendamment les uns des autres un acide aminé naturel de série L choisi parmi A, E, D, L ;
- X2 est choisi parmi Tyr, pTyr et p-CH2-Phe.
La présence du marqueur Pya rend ces substrats fluorescents. Avantageusement, une ou plusieurs librairies (ou banques) de substrats répondant à l'une ou l'autre de ces formules (I) à (IV) seront constituées et pourront notamment être utilisées à des fins de criblage, de substrats (en particulier, de substrats de phosphatases ou de kinases) et/ou d'enzymes (en particulier, de phosphatases ou de kinases) susceptibles d'agir sur ces substrats.
Selon un huitième aspect, la présente invention vise l'utilisation d'un tel substrat peptidique auto-rapporteur de son état de phosphorylation, dans un procédé de détection par fluorescence conforme à la description précédente, ou dans l'une des applications susmentionnées. Il en est ainsi de la fixation sur un support (plaque, résine, billes magnétiques, etc.) par l'intermédiaire du reste hexanoyl ou biotinyl d'un substrat phosphorylé correspondant à une séquence phosphorylée d'une kinase. L'introduction de l'aminoacide p-CH2-Phe à la place de pTyr empêche l'hydrolyse non spécifique ou par une phosphatase, et permet d'isoler la(les) cible(s) potentielle(s) de la kinase. On peut à cet égard citer l'exemple typique de la séquence phosphorylée du récepteur aux facteurs de croissance ou aux facteurs angiogéniques qui possède une activité tyrosine kinase intracellulaire. Le peptide phosphorylé, résistant aux phosphatases et immobilisé, permet d'isoler une cible, par exemple SoS pour le récepteur à l'EGF, par la variation de fluorescence du reste p-CH2-Phe, lors de l'interaction avec sa (ses) cible(s) spécifique(s), celle(s)-ci pouvant être une (des) phosphatase(s).
On peut citer également l'exemple de la phosphatase PTP1 B qui est reconnue de manière spécifique par une séquence peptidique telle que I Y E T D pY pY R K NH2. On utiliserait dans ce cas le peptide 9 cité dans les exemples ci-après, qui est issu de la banque de substrats peptidiques de formule (III) mentionnée ci-dessus et dans lequel la première tyrosine est remplacée par Pya.
Les figures suivantes illustrent la présente invention, sans en limiter ni l'objet ni la portée. - Figure 1 : Comparaison des spectres d'émission de fluorescence des peptides 9 (phosphorylé) et 8 (non phosphorylé).
Conditions : Tampon utilisé : Hepes 50 mM pH 6.9, NaCI 150 m M, EDTA 1 mM, DTT 2 mM. Mesure à l'aide d'un spectrophotomètre Perkin-Elmer à λex=343 nm; f ex = 15 ; f em = 2.5. - Figure 2 : Cinétique de la déphosphorylation du peptide 9 (10 μM) par la PTP1 B (10 ng/mL).
Conditions Tampon utilisé : Hepes 5OmM pH 6.9, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 2 mM. La PTP1 B a été utilisée à une concentration de 10 ng/mL. La cinétique a été suivie à l'aide d'un fluorimètre Berthold (λex=340 nm; λem= 405 nm; Lamp energy = 10 000) à 30 0C. Paramètres cinétiques de la réaction : Km = 1.30 ± 0.20 μM, kcat = 46.0 ± 2.0 s-1 , kcat/Km = 3.20 ± 0.10 107 M-1.S-1
- Figure 3 : Inhibition de l'activité phosphatase de la PTP1 B sur le substrat 9 par un inhibiteur compétitif et réversible : le PTP inhibitor IV. Conditions : Tampon utilisé : Hepes 5OmM pH 6.9, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 2 mM. La PTP1 B a été utilisée à une concentration de 20 ng/mL, le substrat 9 à une concentration de 10 μM. Les tests d'activité ont été réalisés après une incubation de 15 min à 30 0C. (Lecture sur plaques 96 puits, à l'aide d'un fluorimètre Berthold à λex=340 nm; λem= 405 nm; Lamp energy = 10 000).
- Figure 4 : Cinétique de phosphorylation du peptide 12 (20 μM) par la kinase p60s-src.
Conditions : Tampon utilisé : Tris 5OmM pH 7.5, DTT 2mM, MgCI2 5mM, MnCI2 1 mM, BSA 0,01 mg/mL, ATP 1mM. La p60c-src (famille des tyrosines kinase) (humaine, SIGMA, ref : S5439, lot n° 014K2706) a été utilisée à une concentration finale de 10 nM, le substrat 12 a été utilisé à une concentration de 20 μM. (Lecture sur plaques 96 puits, à l'aide d'un fluorimètre Berthold à λex=340 nm; λem= 405 nm; Lamp energy = 10 000). Paramètres cinétiques de la réaction : Km = 20.16 μM, kcat = 1.53 s-1 , kcat/Km = 7.59 104 M-1. s-1.
- Figure 5 : Comparaison de la cinétique de déphosphorylation du peptide phosphorylé 9 (Ac-ELE-pY-AD-Pya-E-NH2 ; issu de la banque de substrats de formule (III) citée précédemment) par différentes phosphatases.
La déphosphorylation du composé 9 (25μM) par 25ng/mL de trois différentes RPTP (Receptor-Protein-Tyrosine phosphatase) : PTP-LAR, PTP-CD45 et PTP-RO (B) et six NRPTP (Non-Receptor-Protein-Tyrosine phosphatases) : PTP-PEST, PTP-MEG2, PTP-SHP2, PTP1 B et TC-PTP (D) a été étudiée par fluorimétrie. Pour chaque essai, une incubation du substrat et de la phosphatase a été effectuée à 300C durant deux heures dans un tampon approprié à chaque enzyme. Le pourcentage de déphosphorylation a ensuite été déterminé pour chaque phosphatase par comparaison entre l'essai et les contrôles négatifs (fluorescence du composé 9 seul à 25μM et fluorescence du peptide déphosphorylé 8 seul à 25μM). Chaque expérimentation a été effectuée au minimum deux fois, en duplicat.
- Figure 6 : Comparaison de la cinétique de déphosphorylation du peptide phosphorylé 16 (Ac-l-Pya-ETD-pY-pY-RK-NH2) par différentes phosphatases. La déphosphorylation du composé 16 (25μM) par 100ng/mL de deux différentes RPTP (Receptor-Protein-Tyrosine phosphatase) : PTP-LAR et PTP-RO (B) et trois NRPTP (Non-Receptor-Protein-Tyrosine phosphatases) : PTP-PEST, PTP-MEG2 et PTP1 B (D) a été étudiée par fluorimétrie. Pour chaque essai, une incubation du substrat et de la phosphatase a été effectuée à 300C durant deux heures dans un tampon approprié à chaque enzyme. Le pourcentage de déphosphorylation a ensuite été déterminé pour chaque phosphatase par comparaison entre l'essai et les contrôles négatifs (fluorescence du composé 16 seul à 25μM et fluorescence du peptide déphosphorylé 17 seul à 25μM). Chaque expérimentation a été effectuée au minimum deux fois, en duplicat.
D'autres propriétés, modes de réalisation et avantages de la présente invention pourront ressortir à la lecture des exemples suivants, donnés ici à titre purement illustratif.
EXEMPLES
I- Préparation de séquences peptidiques marquées, utilisables comme substrats potentiels de kinases ou phosphatases :
Le reste Pya peut être introduit : - dans des séquences peptidiques connues, susceptibles de servir de substrats à des phosphatases et des kinases,
- dans des librairies de séquences peptidiques lorsque les substrats des enzymes sont inconnus.
1-1- Introduction du reste Pya dans une séquence peptidique connue, susceptible de servir de substrat à des phosphatases et des kinases :
A titre d'exemple et de manière non limitative, on peut citer :
a) la mise au point d'un substrat de la phosphatase PTP1B.
Le domaine d'activation du récepteur à l'insuline, le fragment 1157-
1168 (1-pY-E-T-D-pY-pY-R-K-G-G-K) est déphosphorylé très rapidement, sur les deux pY adjacentes, par la PTP1 B.
Le peptide 9 Ac-l-Pya-E-T-D-pY-pY-R-K-NH2, dans lequel Pya remplace une tyrosine, a été synthétisé et s'est révélé être un excellent substrat de PTP1 B, avec déphosphorylation simultanée des deux pY restantes (voir exemples ci-dessous).
L'analogue non phosphorylé 8 (Ac-I-Pya-E-T-D-Y-Y-R-K-NH2) est un substrat de kinase et, plus particulièrement, du domaine PTK du récepteur à l'insuline.
b) la mise au point d'un substrat de la kinase p60c-src.
A partir du substrat commercial Ac-I-Y-G-E-F-NH2 (Nair et al., 1995), le peptide 11 et son analogue phosphorylé 10 ont été synthétisés (Ac-I-Y-G-E-Pya-NH2 et Ac-l-pY-G-E-Pya-NH2).
c) la mise au point d'un substrat de la kinase Hck. A partir du substrat décrit dans la littérature (Porter et al., 2000), on a procédé à la synthèse du composé 12 (Ac-E-E-Pya-I-Y-G-E-I-E-A-NH2) et de son analogue phosphorylé 13 (Ac-E-E-Pya-l-pY-G-E-l-E-A-NH2).
1-2- Librairie de séquences peptidiques :
Les librairies de « peptides substrats » revendiquées ici peuvent avantageusement être obtenues par synthèse en phase solide tel que décrit dans la littérature (D. Conis et al., 1998).
L'accès chimique à ces librairies est simplifié, soit par l'utilisation de la méthode « split-mix » qui conduit à des peptides possédant en une seule position un mélange de « n » aminoacides (Furka A. et al., 1991 ), soit en utilisant la méthode « AIa scan inverse » (Vetter S.W. et al., 2000) qui consiste à partir d'un peptide ne contenant que des alanines et à changer successivement chaque AIa par divers aminoacides.
a) Librairies construites par la méthode « split and mix » :
Ces librairies développées par la Demanderesse correspondent aux formules générales :
Ac-S-K-G-Pya-(X)n-Y (ou pY) -G-G-K-NH2 (V)
et Ac-S-K-G-Y (ou pY) -(X)n-Pya-G-G-K-NH2 (Vl)
dans lesquelles n=1 , 2 ou 3 et X est un mélange d'α-aminoacides choisis parmi les aminoacides suivants : G, V, L, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, E, D, H, K, R, pY, pCH2Phe.
b) Librairies construites parla méthode « AIa scan inverse » :
A partir de la séquence suivante, comportant des restes alanines (formule VII ci-dessous). Z-(A)m-X2-(A)n-NH2 (VII)
Où :
- Z est un groupe acétyl, biotinyl ou 6-aminohexanoyl (lors de la synthèse effectuée en phase solide, le groupe Z est un acétyl) ; m et n sont chacun inférieurs ou égaux à 4 ;
- X2 est choisi parmi Tyr, pTyr et p-CH2-Phe.
Une seule alanine est remplacée dans chaque peptide par un résidu Pya, conduisant ainsi à 8 peptides différents si chacun des m et n vaut 4.
Puis, dans chacun de ces peptides, chaque alanine restante est successivement remplacée par un mélange des 18 acides aminés naturels (sauf AIa), auxquels on ajoute les acides aminés modifiés Tyr- OPO3H2 (pTyr) et Phe-CH2-PO3H2 (pCH2-Phe).
Il- Exemples de substrats de phosphatases et de kinases marqués selon l'invention :
Afin d'illustrer les méthodes proposées dans la partie I précédente, les peptides suivants ont été synthétisés selon la procédure susmentionnée. Chaque peptide a été synthétisé sous forme phosphorylée ou non sur la(les) tyrosine(s) contenue(s) dans leur séquence.
1 Ac S K G Pya A K pY G G-K- NH2
2 Ac S K G Pya A K Y G G-K- NH2
3 Ac E L E F pY M D Pya E NH2
4 Ac E L E F Y M D Pya E NH2
Figure imgf000025_0001
7 Ac I Pya E T D pY Y R K NH2
8 AcI Pya ET D YY RKNH2
9 Ac I Pya E T D pY pY R K NH2
10 Ac I pY G E Pya NH2 η 11 AcI Y G E Pya NH2 J
12 AcE E Pya I YG E I EANH2 ""
13 AcE E Pya IpYG E I EANH2 -
14 AcS KG Pya M D pYGGKNH2 15 AcS KG Pya M DYG G KNH2
16 AcE L EpYAD Pya E NH2
17 AcE L EYAD Pya E NH2
La figure 1 illustre la différence de fluorescence du reste L- pyrénylalanyle dans un peptide contenant une tyrosine phosphorylée 9 ou non phosphorylée 8 à la même concentration (1 micromolaire).
La figure 2 représente la cinétique de déphosphorylation du peptide 9 en présence de la phosphatase PTP1B.
La figure 3 représente la courbe d'inhibition de l'activité de la PTP1B sur le substrat 9 par action d'un inhibiteur compétitif.
La figure 4 représente la cinétique de phosphorylation du substrat 12 par la kinase p60c"src.
Les figures 5 et 6 présentent respectivement la sélectivité de déphosphorylation des peptides 16 et 9 par différentes phosphatases. Le tableau 1 ci-dessous rapporte les paramètres cinétiques de la déphosphorylation de différents peptides contenant une (des) tyrosines(s) phosphorylée(s) (pY) et la L-pyrenalanine (Pya) dans leur séquence. Tableau 1
Figure imgf000027_0001
La constante de Michaelis (km), la vitesse (kcat) et les efficacités catalytiques indiquées dans le Tableau 1 ci-dessus, ont été déterminées par au minimum deux expérimentations indépendantes avec des NRPTP (Non-Receptor-Protein-Tyrosine phosphatases) : TC-PTP, SHP-2, PTP- 1 B, PTP-PEST et PTP-MEG2 ainsi que des RPTP (Receptor-Protein- Tyrosine phosphatase) : CD45, PTP-LAR et GLEP. Les facteurs Z' ont été déterminés par trois expérimentations indépendantes comparant la fluorescence du peptide phosphorylé au même peptide déphosphorylé.
III- Dosage de l'activité enzymatique et identification d'inhibiteurs ou d'activateurs :
Lorsque la meilleure séquence peptidique substrat a été déterminée pour une enzyme (protéine phosphatase (PP) ou protéine kinase (PK)), elle peut être avantageusement utilisée comme substrat afin de déterminer les caractéristiques cinétiques de la réaction enzymatique selon les méthodes conventionnelles (voir la légende des figures 2 et 4).
On recherche en particulier le meilleur rapport Km/kcat pour une variation de fluorescence maximale (par exemple, pour PTP1 B).
La détermination du pouvoir inhibiteur d'un composé candidat peut ensuite s'effectuer selon les méthodes classiques (voir figure 3), notamment par (i) pré-incubation de doses croissantes du composé potentiellement inhibiteur avec l'enzyme utilisée à une concentration voisine de son Km et pendant un temps tel que l'on reste en-dessous d'un seuil fixé à 15% de l'activité maximale (définie comme étant l'activité conduisant à une déphosphorylation ou un phosphorylation totale), suivie d'une (ii) mise en contact de l'enzyme ainsi préincubée avec le peptide substrat sélectionné au préalable. On recherche alors une diminution de l'activité enzymatique en présence du substrat et de l'inhibiteur potentiel, par rapport au niveau d'activité de référence de l'enzyme en présence du seul substrat.
L'identification d'un activateur peut s'effectuer de manière analogue, mais en recherchant, à l'inverse, une augmentation de l'activité enzymatique en présence du substrat et de l'activateur potentiel, par rapport au niveau d'activité de référence de l'enzyme en présence du seul substrat.
IV- Recherche, caractérisation et inhibition/activation des complexes formés par des peptides ou protéines phosphorylés et un domaine protéique récepteur :
Plusieurs méthodes ont été décrites pour mettre en évidence des complexes formés entre un peptide ou une protéine phosphorylé(e) et un domaine protéique récepteur. Ces techniques sont le plus souvent basées sur l'utilisation d'un fragment de la protéine contenant la séquence phosphorylée (Liu et al., 1999). Toutefois, en l'absence de rapporteur, la variation de fluorescence du reste Tyr-POβhb lors de l'interaction avec son substrat est très faible (Cussac et al., 1994).
Or, un autre avantage propre à l'invention tient à la variation importante et inattendue de la fluorescence du reste Pya dans une des séquences peptidiques d'une librairie conforme à ce qui précède, lorsque cette séquence reconnaît un effecteur de la tyrosine phosphatase spécifique. Ce (ou ces) effecteur(s) correspond(ent) à une protéine, un ensemble de protéines, un peptide, un acide nucléique libre ou complexé qui est ou sont impliqués de manière plus ou moins critique dans la signalisation cellulaire régulée par l'action des phosphatases.
Lorsque la séquence peptidique contenant le reste Pya doit être phosphorylée sur une tyrosine, on peut avantageusement remplacer cet aminoacide par un reste Phe-CH2-Pθ3H2 (Marseigne et Roques, 1988), qui n'est pas hydrolysable et se prête donc plus facilement à des mesures, en milieu homogène ou non (homogénats cellulaires, cellules, tissus), sans risque de clivage alors que ce pourrait être le cas avec le reste O- PO3H2. La variation de la fluorescence de Pya observée lors de la liaison entre la séquence phosphorylée contenant le fluorophore et un effecteur est utilisée pour caractériser des inhibiteurs (ou activateurs) de cette interaction. Cette réaction qui s'effectue dans un milieu homogène en une seule étape se prête facilement, et avantageusement du fait de sa sensibilité, à un tri systématique à haut débit de molécules inhibitrices ou activatrices (criblage de type HTS).
V- Mise en évidence de phosphatases jusque-là inconnues :
La caractérisation des phosphatases et leur mise en évidence lorsqu'elles sont inconnues devrait en principe pouvoir s'appuyer sur l'existence de séquences préférentielles.
Il est intéressant de noter que, même si la séquence globale est évidemment identique pour un système kinase/phosphatase donné, la séquence particulière permettant une reconnaissance spécifique optimisée de l'une ou l'autre enzyme n'est pas identique, la kinase nécessitant généralement un enchaînement d'acides aminés plus long autour de l'amino-acide Tyr phosphorylable que la phosphatase.
Conformément à la présente invention, dans une première étape, les peptides marqués présents dans une librairie sont criblés afin d'isoler la séquence peptidique la plus affine pour une enzyme potentielle par variation de fluorescence. Dans une seconde étape, le peptide le plus affin est utilisé pour isoler l'enzyme. Pour ce faire, on remplace le reste tyrosine (respectivement pTyr) par son analogue non hydrolysable pCH2-Phe. La séquence peptidique peut être immobilisée, par exemple, par l'intermédiaire d'un reste biotinyle en N-terminal qui va interagir avec une avidine, ou bien par fixation covalente directe grâce à l'acide amino- hexanoïque N-terminal.
Les exemples ci-dessus s'intéressent plus particulièrement aux protéines phosphatases comme cibles biologiques d'intérêt.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection par fluorescence d'une interaction entre :
- un peptide dans lequel au moins une tyrosine phosphorylée ou phosphorylable est séparée d'un marqueur L-pyrénylalanine (Pya) par au plus 4 acides aminés ; et
- une cible susceptible d'interagir avec ce peptide, ladite cible étant une phosphatase ou une protéine kinase,
ledit procédé comprenant au moins, en l'absence de clivage de l'enchaînement peptidique : a) la mise en présence du peptide contenant le marqueur Pya, avec ladite cible ; b) la détermination du niveau de fluorescence F1 dudit peptide marqué en présence de ladite cible ; et c) la comparaison du niveau de fluorescence F1 obtenu à l'étape b) avec le niveau de fluorescence FO dudit peptide marqué en l'absence de ladite cible, une différence significative entre FO et F1 révélant une interaction entre la cible et le peptide.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ladite cible est une phosphatase et ledit peptide comprend au moins un résidu Tyr phosphorylé.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la détermination des niveaux de fluorescence FO et F1 dudit peptide marqué est quantitative.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la différence entre les niveaux de fluorescence FO et F1 correspond à une augmentation de la fluorescence.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la différence entre les niveaux de fluorescence FO et F1 correspond à une diminution de la fluorescence.
6. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 à la détection, l'identification et la sélection d'une phosphatase ou protéine kinase.
7. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 au dosage de l'activité biologique d'une phosphatase ou protéine kinase.
8. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 à la détection, l'identification et la sélection d'un peptide capable d'agir comme substrat d'une phosphatase ou protéine kinase.
9. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 à la détection, l'identification et la sélection d'un composé capable de perturber l'interaction entre un peptide et une phosphatase ou protéine kinase.
10. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 à la détermination des caractéristiques cinétiques de l'interaction entre :
- un peptide contenant une ou plusieurs tyrosines phosphorylées ou phosphorylables et un marqueur L-pyrénylalanine (Pya) ; et
- une enzyme présentant une activité kinase ou phosphatase.
11. Application selon la revendication 10, comprenant en outre la détermination quantitative du pouvoir d'un composé à inhiber ou activer ladite interaction et, facultativement, le calcul des constantes thermodynamiques de cette inhibition ou activation.
12. Substrat peptidique auto-rapporteur de son état de phosphorylation comprenant un marqueur L-pyrénylalanine (Pya) et susceptible d'être utilisé dans un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou dans une application selon l'une quelconque des revendications 6 à 11 , de formule générale choisie parmi les formules (I) et (II) suivantes :
Z-(Xi)ι-X2-(X'i)m-Pya-(X"i)n-NH2 (I)
Z-(X1)I-Py3-(X1IVX2-(X11I)n-NH2 (II)
dans lesquelles :
- Z est un groupe acétyl, biotinyl ou 6-aminohexanoyl ;
- Xi, X'i et X"i représentent indépendamment les uns des autres un acide aminé naturel de série L, phosphorylé ou non, ou p-CH2-Phe ; - m est inférieur ou égal à 4 ; l+m+n est inférieur ou égal à 9 ;
- X2 est choisi parmi Tyr, pTyr et p-CH2-Phe.
13. Substrat peptidique selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il a pour formule, une formule choisie parmi les formules (III) et (IV) suivantes :
Z-(Xi)3-X2-(X'i)2-Pya-E-NH2 Z-(Xi)3-Pya-(X'i)2-X2-E-NH2 (IV)
dans lesquelles : - Z est un groupe acétyl, biotinyl ou 6-aminohexanoyl ;
- Xi et X'i représentent indépendamment les uns des autres un acide aminé naturel de série L choisi parmi A, E, D, L ;
- X2 est choisi parmi Tyr, pTyr et p-CH2-Phe.
14. Utilisation d'un substrat selon la revendication 12 ou 13 dans un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou dans une application selon l'une quelconque des revendications 6 à 11.
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