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WO2008092704A1 - Verfahren und vorrichtung zur untersuchung der anheftung oder ablösung lebender oder toter zellen oder zellähnlicher partikel oder sonstiger oberflächenbelegung an oberflächen mittels plasmonenresonanz sowie verwendung dieses verfahrens und dieser vorrichtung - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur untersuchung der anheftung oder ablösung lebender oder toter zellen oder zellähnlicher partikel oder sonstiger oberflächenbelegung an oberflächen mittels plasmonenresonanz sowie verwendung dieses verfahrens und dieser vorrichtung Download PDF

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WO2008092704A1
WO2008092704A1 PCT/EP2008/000826 EP2008000826W WO2008092704A1 WO 2008092704 A1 WO2008092704 A1 WO 2008092704A1 EP 2008000826 W EP2008000826 W EP 2008000826W WO 2008092704 A1 WO2008092704 A1 WO 2008092704A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
measuring
light
attachment
incidence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2008/000826
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Andreas Hofmann
Norbert Danz
Silke Hofmann
Michael Keusgen
Ulla Magdolen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to US12/525,418 priority Critical patent/US8232061B2/en
Publication of WO2008092704A1 publication Critical patent/WO2008092704A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection
    • G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for investigating the attachment or detachment of living or dead cells or cell-like particles or other surface occupation of surfaces by means of plasmon resonance and to the use of this method and this device.
  • the phenomenon of surface plasmon resonance is a collective excitation of the electrons on the surface of a free-electron-comprising layer.
  • the resonant frequency of the surface plasmons is very sensitive to the refractive index of the medium adjacent to the sensitive surface. This is used to measure thin layers in terms of refractive index or layer thickness.
  • this effect is used to investigate the attachment kinetics of biomolecules from a sample fluid to a functionalized metal surface.
  • the resonance condition of the surface plasmons is detected time-resolved.
  • the surface plasmons of the thin metal layer are excited by light incident on the metal layer at a certain angle or within an angular range.
  • the resonance condition is then satisfied for a particular combination of wavelength and angle of incidence.
  • the intensity of the light reflected on the metal layer is significantly reduced due to the generation of the surface plasmons.
  • the angle of incidence at constant wavelength
  • the wavelength at constant angle of incidence
  • a gold-coated glass body (prism) and light of constant wavelength is used, which strikes the gold layer with an angle of incidence range suitable for plasmon resonance.
  • WO 02/39095 discloses a plasmon resonance sensor in which light with an incident angle spectrum which is suitable for plasmon resonance is directed onto a measuring region on the reflective inner side of a metal layer or semiconductor layer applied to a light-transmissive body, the outer surface of which bears the surface the biomolecules or cells containing sample liquid is brought into contact, wherein the individual measuring points of the measuring range are irradiated with the entire angular spectrum and the rays reflected from different points of the measuring range combined and collected with the same angles of incidence and continuously during a period of time with determination of the angle of incidence evaluated the reflected lowest light intensity and thereby the occurring angle of incidence shift of the intensity minimum is measured.
  • the invention is characterized in that the evaluation of the reflected light is performed in such a way that two or more intensity minima occurring simultaneously within the time span are time-dependent registered for different angles of incidence, wherein the registered measuring signals reflect the respective level of surface coverage ,
  • the method according to the invention thus offers for the first time the possibility of tracking cell adhesion processes in a continuous process with unlimited time and quantitatively, excluding the subjective impression of the observer, and to draw conclusions about the binding behavior of cells. So far, statements about the cell adhesion can only win by visual methods, for example by using a microscope or a spectrophotometer, but only a direct observation and no automated evaluation of the attachment process is possible. Only with this automated evaluation can also possibly only briefly occurring peculiarities during a long, possibly continuously running for several days investigation process detect and document.
  • the abovementioned previous examination methods can be used in a targeted manner in addition to the method according to the invention in order to be able to correctly interpret the occurrence of the minima.
  • the occurrence of a double minimum or its dissolution after a certain time may indicate the beginning or the termination of a cell adhesion.
  • a double minimum or its dissolution after a certain time may indicate the beginning or the termination of a cell adhesion.
  • the invention promises great benefits in a number of different fields, namely
  • Inflammatory cells cells involved in wound healing, cells involved in embryonic development, cells involved in tissue remodeling, and cells involved in a malignant situation;
  • Bonding non-biological compact particles to cells e.g. when measuring the interaction of abrasion from implants with the body's own cells or the particles of contrast agent with the body's own cells (magnetofection);
  • the method of the invention is the review of the effectiveness of ZeI charge-promoting or degrading substances (pharmacodynamics) or the behavior of biological or non-biological substances in the physiologically or partophysiologically altered organism.
  • the invention also relates to a device having a plasmon resonance sensor with a translucent body, a reflective metal layer or semiconductor layer with a cell sensitization surface, a light source for generating a light through the body to a measuring area of the inside of the Layer the beam path with an angle spectrum falling on all points of the measuring range, with a collection optics for the combination of incident beams with the same angles of incidence and with a detector that captures the reflected emergent beam path and determines the time angle of the incident angle of the light changing as a result of deposits on the sensitive surface; in the case of which an intensity minimum of light which emerges occurs as a result of the resonance, the detector being assigned an evaluation device with software for time-dependent and angle-dependent continuous registration of the intensity minimum.
  • a device is also known from WO 02/39095.
  • the evaluation device and the software in this device are such that they also detect two or more simultaneously occurring intensity minima and register them as a function of time.
  • the measuring range is advantageously subdivided into two or more narrow parallel measuring channels, to which separate detector regions, each having its own signal registration, are assigned.
  • the invention also relates to the use of the method and apparatus for assaying the attachment or detachment of cells or cell-like particles in the field of biology / medicine for measuring cell surface interaction in the field of food technology for measuring the behavior of food substances and germs against body cells in bacteriology to study the virulence of fungi, bacteria, viruses, unicellular organisms or parasites, to measure the attachment behavior of synthetic cells such as liposomes to body cells, to measure the binding of non-biological particles to the body's own cells or to study the attachment of rocks or crystalline Structures of cells to endogenous cells. Additional explanations to these applications can be found in the previous versions.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of a plasmon resonance sensor according to the invention
  • Figure 2 shows the indicated in Figure 1 diagram in an enlarged view
  • FIG. 3 shows the intensity of the emergent light for different angles of incidence for the time ti (FIG. 2).
  • FIG. 4 shows a test result for adhesion of osteoplasts evaluated in accordance with the illustration in FIG. 2.
  • an extended monochromatic light source 1 is provided, which is associated with a glass prism 2, which carries a gold layer 3 on its upper side.
  • a collimating lens 4 is arranged, which directs the beams to a detector 5, to which an evaluation device 6 is connected.
  • the gold layer 3 has at its top a demarcated by interfaces 7 measuring range with which the sample liquid (solution) is in contact with the cells. This is subdivided for clarity into a medium 8 (refractive index ni) and a medium 9 (refractive index n 2 ). This dichotomy corresponds to the idea of two different cell states during an annealing process that result in co-occurring minima of the SPR signal at different positions.
  • FIG. 1 illustrates how the collimation optics 4 combine the beams with the same angles of incidence on the detector 5 in the collection points 14 and 17, respectively.
  • intermediate light beams 12, each with the same angles of incidence and light beams 13 with another, likewise uniform, angle of incidence, are drawn in from the outgoing beam path, which are combined at points 16 and 15, respectively, at detector 5.
  • the evaluation device 6 equipped with appropriate software detects the minima detected by the detector 5, a CCD camera, and records them continuously during the entire test period. As indicated, the evaluation device 6 comprises an optical display (screen) on which the course of the two minima can be represented. This is done in a diagram in which the refractive index n is plotted against the time axis t.
  • Figure 2 shows the refractive index diagram of Figure 1 in an enlarged view.
  • the diagram contains two completely separate curves for ni and n 2 , that is two minima during the entire registration period.
  • the minimum values ni and n 2 may coincide temporarily, which corresponds to the detection of only a single intensity minimum, or appear simultaneously for a limited period of time or after a certain period of time Running time apart and, if necessary merge again after a further period of time.
  • FIG. 3 shows a reproducible snapshot taken at the time U in FIG. 2, in which the light intensity I of the reflected light is shown over the angles of incidence ⁇ of the light (measured in the angles of incidence corresponding to the angles of incidence).
  • two curves result, each with a minimum, which is assigned to a specific angle of incidence.
  • FIG. 4 with a diagram corresponding to FIG. 2 is based on the following experiment: The purified gold layer 3 according to FIG. 1 was in the region of a first measuring channel with fibronectin, an extracellular glycoprotein, in a concentration of 1 mg / m! coated.
  • a second parallel measuring channel on the gold layer 3 was coated with bovine serum albumin at a concentration of 1 mg / ml.
  • osteoplasts living endothelial cells
  • This solution buffer solution
  • a time-shifting refractive index n could be determined for the first measuring channel as a consequence of an intensity minimum of reflected light, which is plotted over time t in FIG.
  • the refractive index signal beginning at time t 0 is shown as measurement curve ni in FIG.
  • the sudden appearance of a second refractive index plotted as measurement curve n 2 in FIG. 4 was detected, which corresponds to the simultaneous occurrence of two intensity minima. This condition was maintained for about 12 minutes until time t 2 , whereupon no signal was suddenly registered for ni and only the time-continuous signal for n 2 resulted.

Landscapes

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Untersuchung der Anheftung oder Ablösung lebender oder - toter Zellen oder zellähnlicher Partikel oder sonstiger Oberflächenbelegung an Ober flächen mittels Plasmonenresonanz. Dabei wird die Auswertung des reflektierten Lichts derart durchgeführt, dass auch zwei oder mehr gleichzeitig innerhalb einer Zeitspanne auftretende Inensitätsminima des reflektierten Lichts für unterschiedliche Einfallswinkel zeitabhängig registriert werden, wobei die registrierten Meßsignale den jeweiligen Stand der Oberflächenbelegung widerspiegeln. Das überraschend festgestellte gleichzeitige Auftreten von zwei Intensitätsminima gibt wertvolle Hinweise auf besondere Vorgänge bei der Oberflächenbelegung, beispielsweise bei der Adhäsion von Zellen. Diese Hinweise sind u.a. für das Gebiet Medizin / Biologie von besonderer Bedeutung.

Description

Anmelder: Andreas HOFMANN, 96346 Wallenfels
Titel: Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung der Anheftung oder
Ablösung lebender oder toter Zellen oder zellähnlicher Partikel oder sonstiger Oberflächenbelegung an Oberflächen mittels Plasmonen- resonanz sowie Verwendung dieses Verfahrens und dieser Vorrichtung.
Beschreibung:
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Untersuchung der Anheftung oder Ablösung lebender oder toter Zellen oder zellähnlicher Partikel oder sonstiger Oberflächenbelegung an Oberflächen mittels Plasmonenresonanz sowie auf die Verwendung dieses Verfahrens und dieser Vorrichtung.
Bei dem Phänomen der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR - surface plasmon resonance) handelt es sich um eine kollektive Anregung der Elektronen an der Oberfläche einer Freielektronen aufweisenden Schicht. Die Resonanzfrequenz der Ober- flächenplasmonen ist sehr empfindlich auf den Brechungsindex des Mediums, das an die sensitive Oberfläche angrenzt. Dieses wird genutzt, um dünne Schichten hinsichtlich des Brechungsindexes oder der Schichtdicke zu vermessen.
Insbesondere in der Biosensorik wird dieser Effekt genutzt, um die Anlagerungskinetik von Biomolekülen aus einer Probenflüssigkeit an eine funktionalisierte Metalloberfläche zu untersuchen. Hierzu wird zeitaufgelöst die Resonanzbedingung der Ober- flächenplasmonen detektiert. Die Oberflächenplasmonen der dünnen Metallschicht werden durch Licht angeregt, das unter einem bestimmten Winkel oder innerhalb eines Winkelbereichs auf die Metallschicht fällt. Die Resonanzbedingung ist dann für eine bestimmte Kombination von Wellenlänge und Einfallswinkel erfüllt. Unter dieser Resonanzbedingung ist die Intensität des an der Metallschicht reflektierten Lichtes auf Grund der Erzeugung der Oberflächenplasmonen deutlich vermindert. Zum Auffinden der Resonanzbedingung kann entweder der Einfallswinkel (bei konstanter Wellenlänge) oder die Wellenlänge (bei konstantem Einfallswinkel) durchgestimmt werden und die Intensität des reflektierten Lichtes detektiert werden. Im Allgemeinen wird mit einem Gold beschichteten Glaskörper (Prisma) und mit Licht von konstanter Wellenlänge gearbeitet, das mit einem für die Plasmonenresonanz in Betracht kommenden Einfallswinkelspektrum auf die Goldschicht trifft.
Aus WO 02/39095 ist ein Plasmonenresonanzsensor bekannt, bei dem Licht mit einem für die Plasmonenresonanz in Betracht kommenden Einfallswinkelspektrum auf einen Meßbereich an der reflektierenden Innenseite einer auf einen lichtdurchlässigen Körper aufgebrachten Metallschicht oder Halbleiterschicht geleitet wird, die außenseitig die Oberfläche trägt, die mit der die Biomoleküle bzw. Zellen enthaltenden Probenflüssigkeit in Kontakt gebracht wird, wobei die einzelnen Meßpunkte des Meßbereichs mit dem gesamten Winkelspektrum angestrahlt werden und die von verschiedenen Punkten des Meßbereichs reflektierten Strahlen mit jeweils gleichen Einfallswinkeln zusammengeführt und aufgefangen sowie während einer Zeitspanne kontinuierlich unter Bestimmung des Lichteinfallswinkels mit der reflektierten geringsten Lichtintensität ausgewertet und dabei die auftretende Einfallswinkelverschiebung des Intensitätsminimums gemessen wird.
Hierbei wird nicht nur der Zustand an einem Punkt der Meßfläche betrachtet und ausgewertet, wie es beispielsweise aus der EP 305 109 B1 mit der Fokussierung eines Strahlenfächers auf einen Punkt der Meßfläche der Fall ist, vielmehr wird eine flächige Lichtquelle in Form eines Lichtwellenleiters mit einem dicken Kerndurchmesser für die divergente Anstrahlung der Meßbereichspunkte jeweils mit dem gesamten Winkelspektrum eingesetzt, wobei gleichzeitig mehrere Parallelmessungen mit dem in schmale benachbarte Meßkanäle unterteilten angestrahlten Meßbereich durchgeführt werden. Die gleichzeitige Erfassung des gesamten Meßflächenbereichs durch die mit einer Kollimationslinse erfolgende Zusammenführung der reflektierten Strahlen mit gleichen Einfallswinkeln dient der Gewinnung von Durchschnittswerten der gewonnenen Signale und soll Meßwertverfälschungen durch örtliche Inhomogenitäten der Metallschicht bzw. der Oberläche vorbeugen. Auch hier wird wie bei allen anderen bekannten Plasmonenresonanzsensoren von einer gleichmäßigen Anlagerung an der Oberfläche ausgegangen und dementsprechend ein einziges Minimum unterstellt, das sich mit zunehmender Anheftung (Schichtdicke) einfallswinkelbezogen verschiebt. Überraschenderweise wurde jedoch nunmehr festgestellt, dass sich beim Anlagern von Zellen an eine entsprechend sensitivierte oder funktionalisierte Oberfläche nicht nur eine Verschiebung des Minimums ergibt sondern dass es bei Messungen mit Zellen während der über mehrere Stunden oder gar Tage erfolgenden Messungen zu einer Aufspaltung des gemessenen Signals in zumindest zwei gleichzeitig auftretende Minima kommen kann, die unterschiedlichen Einfallswinkeln zugeordnet sind.
Auf dieser Feststellung basiert die Erfindung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Auswertung des reflektierten Lichts derart durchgeführt wird, dass auch zwei oder mehr gleichzeitig innerhalb der Zeitspanne auftretende Intensitätsminima für unterschiedliche Einfallswinkel zeitabhängig registriert werden, wobei die registrierten Meßsignale den jeweiligen Stand der Oberflächenbelegung widerspiegeln.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet damit erstmals die Möglichkeit, Zellanhef- tungsvorgänge in einem kontinuierlichen Verfahren zeitlich unbeschränkt sowie quantitativ unter Ausschluß des subjektiven Eindrucks des Beobachters zu verfolgen und Rückschlüsse auf das Bindungsverhalten von Zellen zu ziehen. Bisher lassen sich Aussagen über die Zelladhäsion nur durch visuelle Verfahren beispielsweise durch Verwendung eines Mikroskops oder eines Spektrophotometers gewinnen, wobei jedoch nur eine direkte Beobachtung und keine automatisierte Auswertung des Anlagerungsprozesses möglich ist. Erst mit dieser automatisierten Auswertung lassen sich auch evtl. nur kurzzeitig auftretende Besonderheiten während eines langen, ggf. während mehrererTage kontinuierlich ablaufenden Untersuchungsprozesses sicher aufspüren und dokumentieren. Die vorgenannten bisherigen Untersuchungsverfahren können dabei gezielt ergänzend zum erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, um das Auftreten der Minima richtig deuten zu können.
Nach den Erkenntnissen der Erfinder können beispielsweise das Auftreten eines Doppelminimums oder dessen Auflösung nach einer bestimmten Zeit den Beginn oder die Beendigung einer Zelladhäsion anzeigen. Somit lassen sich auf einfache Weise für verschiedene unbeschichtete und beschichtete synthetische und natürliche Oberflächen und für unterschiedliche lebende oder tote Zellen Aussagen über das jeweilige Adhäsionsverhalten sowie über die zugehörigen zeitlichen Gegebenheiten gewinnen, was in vielfacher Hinsicht Vorteile bietet.
Großen Nutzen verspricht die Erfindung auf einer ganzen Reihe unterschiedlicher Gebiete, nämlich
- auf dem Gebiet der Biologie bzw. Medizin zur Messung der Zelloberflächeninter- aktion, z.B. Entzündungszellen, an der Wundheilung beteiligte Zellen, an der Embryonalentwicklung beteiligte Zellen, am Gewebeumbau beteiligte Zellen und an einer malignen Situation beteiligte Zellen;
- in der Lebensmitteltechnologie z.B. zur Messung des Einflusses von Substanzen, die durch die Nahrung aufgenommen und metabolisiert werden, auf die Körperzellen im lebenden Organismus, z.B. Anbindung von Keimen an Körperzellen;
- in der Bakteriologie zur Untersuchung der Virulenz von Pilzen, Bakterien, Viren, Einzellern (Amöben) sowie Parasiten (Würmern);
- Messung bei synthetischen Zellen wie Liposomen, die für den Transport von Pharmaka und therapeutischer DNA verwendet werden;
- Anbinden nicht biologischer kompakter Partikel an Zellen z.B. bei Messung der Interaktion von Abrieb aus Implantaten mit körpereigenen Zellen oder der Partikel von Kontrastmittel mit körpereigenen Zellen (Magnetofektion);
- Messung der Anbindung von Steinen und kristallinen Strukturen von Zellen, z.B. Nierensteine oder Gallensteine.
Damit dient das erfindungsgemäße Verfahren der Überprüfung der Effektivität von ZeI ladhärenz fördernden oder erniedrigenden Substanzen (Pharmakodynamik) oder auch dem Verhalten von biologischen bzw. nicht biologischen Substanzen im physiologisch oder partophysiologisch veränderten Organismus.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Vorrichtung mit einem Plasmonenreso- nanzsensor mit einem lichtdurchlässigen Körper, einer auf eine Fläche des Körpers aufgebrachten reflektierenden Metallschicht oder Halbleiterschicht mit einer für Zellenanlagerungen sensitivierbaren Oberfläche, einer Lichtquelle zur Erzeugung eines durch den Körper auf einen Meßbereich der Innenseite der Schicht einfallen- den Strahlengangs mit einem auf alle Punkte des Meßbereichs fallenden Winkelspektrum, mit einer Sammeloptik für die Zusammenführung ausfallender Strahlen mit gleichen Einfallswinkeln und mit einem Detektor, der den reflektierten ausfallenden Strahlengang auffängt und zeitabhängig den sich durch Anlagerungen an die sensitive Oberfläche ändernden Einfallswinkel des Lichts feststellt, bei dem resonanzbedingt ein Intensitätsminimum an ausfallendem Licht auftritt, wobei dem Detektor eine Auswerteeinrichtung mit einer Software zur zeit- und winkelabhängigen kontinuierlichen Registrierung des Intensitätsminimums zugeordnet ist. Eine solche Vorrichtung ist ebenfalls aus WO 02/39095 bekannt.
Erfindungsgemäß sind bei dieser Vorrichtung die Auswerteeinrichtung und die Software so beschaffen, dass sie auch zwei oder mehr gleichzeitig auftretende Intensi- tätsminima feststellen und zeitabhängig registrieren.
Auch bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in vorteilhafter Weise der Meßbereich in zwei oder mehr schmale parallele Meßkanäle unterteilt, denen separate Detektorbereiche mit jeweils eigener Signalregistrierung zugeordnet sind.
Schließlich betrifft die Erfindung auch die Verwendung des Verfahrens und der Vorrichtung zur Untersuchung der Anheftung oder Ablösung von Zellen oder zellähnlichen Partikeln auf dem Gebiet der Biologie/Medizin zur Messung der Zeiloberflächeninteraktion, auf dem Gebiet der Lebensmitteltechnologie zur Messung des Verhaltens von Nahrungsmittelsubstanzen und Keimen gegenüber Körperzellen, in der Bakteriologie zur Untersuchung der Virulenz von Pilzen, Bakterien, Viren, Einzellern oder Parasiten, zur Messung des Anbindungsverhaltens von synthetischen Zellen wie Liposomen an Körperzellen, zur Messung der Anbindung nicht biologischer Partikel an körpereigene Zellen oder zur Untersuchung der Anbindung von Steinen oder kristallinen Strukturen von Zellen an körpereigene Zellen. Ergänzende Erläuterungen zu diesen Anwendungsmöglichkeiten finden sich in den vorangehenden Ausführungen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels der Vorrichtung erläutert. Figur 1 zeigt in schematischer Darstellung einen erfindungsgemäßen Plasmonen- resonanzsensor;
Figur 2 zeigt das in Figur 1 angedeutete Diagramm in vergrößerter Darstellung;
Figur 3 zeigt für den Zeitpunkt ti (Figur 2) die Intensität des ausfallenden Lichts für verschiedene Einfallswinkel.
Figur 4 zeigt ein der Darstellung in Figur 2 entsprechend ausgewertetes Versuchs ergebnis für eine Adhäsion von Osteoplasten.
In Figur 1 ist eine ausgedehnte monochromatische Lichtquelle 1 vorgesehen, die einem Glasprisma 2 zugeordnet ist, das an seiner Oberseite eine Goldschicht 3 trägt. Im von der Lichtquelle 1 ausgehenden und durch die Goldschicht 3 reflektierten Strahlengang ist eine Kollimationslinse 4 angeordnet, welche die Strahlen auf einen Detektor 5 leitet, an den eine Auswerteeinrichtung 6 angeschlossen ist.
Die Goldschicht 3 weist an ihrer Oberseite einen durch Grenzflächen 7 abgegrenzten Meßbereich auf, mit dem die Probenflüssigkeit (Lösung) mit den Zellen in Kontakt steht. Diese ist zur Verdeutlichung in ein Medium 8 (Brechungsindex ni ) und ein Medium 9 (Brechungsindex n2) unterteilt. Diese Zweiteilung entspricht der Vorstellung von zwei unterschiedlichen Zellenzuständen während eines Anlagerungsprozesses, die gleichzeitig auftretende Minima des SPR-Signals an verschiedenen Positionen zur Folge haben.
Eingezeichnet sind die von den Rändern der ausgedehnten Lichtquelle 1 ausgehenden Grenzstrahlen, die ein einfallendes Strahlenbündel 10 mit minimalem Einfallswinkel und ein Strahlenbündel 11 mit maximalem Einfallswinkel darstellen und damit die Anstrahlung verschiedener Punkte der Goldschicht 3 mit gleichen Einfallswinkeln zeigen. Dabei veranschaulicht Figur 1 , wie die Kollimationsoptik 4 die Strahlen mit gleichen Einfallswinkeln auf dem Detektor 5 in den Sammelpunkten 14 bzw. 17 zusammenführt. Vom ausfallenden Strahlengang sind zusätzlich zwischenliegende Lichtstrahlen 12 mit jeweils gleichen Einfallswinkeln und Lichtstrahlen 13 mit einem anderen ebenfalls einheitlichen Einfallswinkel eingezeichnet, die am Detektor 5 in den Punkten 16 bzw. 15 zusammenführt werden. Hierbei handelt es sich um die Einfallswinkel, die den unterschiedlichen Medien 8 und 9 bzw. den beiden Brechungsindex ni und n2 zuzuordnen sind, bei dem resonanzbedingt eine intensive Schwächung der Strahlenintensität auftritt. Die Punkte 15 und 16 und damit die zugeordneten Einfallswinkel verschieben sich zeitabhängig während des Anlagerungsvorgangs zwischen den Punkten 14 und 17.
Die mit einer entsprechenden Software ausgestattete Auswerteeinrichtung 6 erfasst die vom Detektor 5, einer CCD-Kamera, festgestellten Minima und registriert diese fortlaufend während des gesamten Versuchszeitraums. Wie angedeutet umfasst die Auswerteeinrichtung 6 eine optische Anzeige (Bildschirm), auf dem sich der Verlauf der beiden Minima darstellen lässt. Das geschieht in einem Diagramm, bei dem der Brechungsindex n über der Zeitachse t aufgetragen ist.
Figur 2 zeigt das Brechungsindex-Diagramm aus Figur 1 in vergrößerter Darstellung. Das Diagramm enthält zwei völlig getrennte Kurven für ni und n2, also zwei Minima während der gesamten registrieren Untersuchungsdauer.
Abweichend davon können jedoch - bei Verwendung einer anderen Probenflüssigkeit mit andersartigen Zellen und bei unterschiedlich präparierten Oberflächen - auch die Minimalwerte ni und n2 zeitweise zusammenfallen, was der Detektion von nur einem einzigen Intensitätsminimum entspricht, oder für einen begrenzten Zeitraum gleichzeitig erscheinen oder nach einer gewissen Zeitspanne auseinander laufen und ggf. nach einer weiteren Zeitspanne wieder miteinander verschmelzen.
In Figur 3 ist eine ebenfalls mit der Auswerteeinrichtung 6 erfasste und darstellbare Momentaufnahme zum Zeitpunkt U in Figur 2 wiedergegeben, bei der über den Einfallwinkeln α des Lichts (gemessen in den Einfallswinkeln entsprechenden Pixeln) die Lichtintensität I des reflektierten Lichts dargestellt ist. Entsprechend den Doppel- minima ni und n2 in Figur 2 ergeben sich zwei Kurven mit jeweils einem Minimum, das jeweils einem ganz bestimmten Einfallswinkel zugeordnet ist. Figur 4 mit einem Figur 2 entsprechenden Diagramm basiert auf folgender Versuchsdurchführung: Die gereinigte Goldschicht 3 gemäß Figur 1 wurde im Bereich eines ersten Meßkanals mit Fibronektin, einem extrazellulären Glykoprotein, in einer Konzentration von 1 mg/m! beschichtet. Als Negativkontrolle wurde ein zweiter paralleler Meßkanal auf der Goldschicht 3 mit Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 1 mg/ml beschichtet. Nach dieser Vorbereitung wurden in beide Meßkanäle Osteo- plasten (lebende Endothelzellen) in einer Konzentration von 225.000 bis 300.000/ml zugegeben. Diese Lösung (Pufferlösung) wurde durch die Meßkanäle umgewälzt , so dass eine ständige Durchmischung stattfand und lose Ablagerungen auf der Oberfläche weggeschwemmt wurden. Daraufhin konnte für den ersten Meßkanal ein sich zeitlich verschiebender Brechungsindex n als Folge eines Intensitätsminimums an reflektierem Licht festgestellt werden, der in Figur 4 über der Zeit t aufgetragen ist.
Das zum Zeitpunkt t0 einsetzende Brechungsindex-Signal ist als Meßkurve ni in Figur 4 dargestellt. Nach etwa 20 Minuten (ti) wurde das plötzliche Auftreten eines als Meßkurve n2 in Figur 4 eingezeichneten zweiten Brechungsindex festgestellt, was dem gleichzeitigen Auftreten von zwei Intensitätsminima entspricht. Dieser Zustand blieb ca. 12 Minuten bis zum Zeitpunkt t2 erhalten, worauf für ni plötzlich kein Signal mehr registriert wurde und sich nur noch das zeitlich fortlaufende Signal für n2 ergab.
Im zweiten Meßkanal für die Negativkontrolle konnten dagegen keine zwei gleichzeitigen Minima wie im in Figur 4 hervorgehobenen Zeitfenster ti bis t2 festgestellt werden. Damit muß das Auftreten des Doppelminimums im Zeitfenster ti bis t2 als adhäsionstypisch gewertet werden und kann dem nur im Meßkanal 1 stattfindenden Adhäsionsvorgang zeitlich zugeordnet werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Untersuchung der Anheftung oder Ablösung lebender oder toter Zellen oder zellähnlicher Partikel oder sonstiger Oberflächenbelegung an Oberflächen mittels Plasmonenresonanz, bei dem Licht mit einem für die Plasmonen- resonanz in Betracht kommenden Einfallswinkelspektrum auf einen Meßbereich an der reflektierenden Innenseite einer auf einen lichtdurchlässigen Körper aufgebrachten Metallschicht oder Halbleiterschicht geleitet wird, die außenseitig die Oberfläche trägt, die mit der die Zellen enthaltenden Probenflüssigkeit in Kontakt gebracht wird, wobei die einzelnen Meßpunkte des Meßbereichs mit dem gesamten Winkelspektrum angestrahlt werden und die gleiche Einfallswinkel aufweisenden von verschiedenen Punkten des Meßbereichs reflektierten Strahlen mit jeweils gleichen Einfallswinkeln zusammengeführt und aufgefangen sowie während einer Zeitspanne kontinuierlich unter Bestimmung des Lichteinfallswinkels mit der reflektierten geringsten Lichtintensität ausgewertet werden und dabei die auftretende Einfallswinkelverschiebung des Intensitätsminimums gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertung des reflektierten Lichts derart durchgeführt wird, dass auch zwei oder mehr gleichzeitig innerhalb der Zeitspanne auftretende Intensitätsminima für unterschiedliche Einfallswinkel zeitabhängig registriert werden, wobei die registrierten Meßsignale den jeweiligen Stand der Oberflächenbelegung widerspiegeln.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass eine flächige Lichtquelle für die Anstrahlung der Meßbereichspunkte jeweils mit dem gesamten Winkelspektrum eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig zwei oder mehr Parallelmessungen mit dem in schmale benachbarte Meßkanäle unterteilten angestrahlten Meßbereich durchgeführt werden.
4. Vorrichtung zur Untersuchung der Anheftung oder Ablösung lebender oder toter Zellen oder zellähnlicher Partikel oder Oberflächenbelegung mit einem Plas- monenresonanzsensor (1 bis 6) mit einem lichtdurchlässigen Körper (2), einer auf eine Fläche des Körpers (2) aufgebrachten reflektierenden Metallschicht (3) oder Halbleiterschicht mit einer für Zellenanlagerungen sensitivierbaren Oberfläche, einer Lichtquelle (1) zur Erzeugung eines durch den Körper (2) auf einen Meßbereich der Innenseite der Schicht (3) einfallenden Strahlengangs (10, 11 ) mit einem auf alle Punkte des Meßbereichs fallenden Winkelspektrum, mit einer Sammeloptik (4) für die Zusammenführung ausfallender Strahlen (12; 13) mit gleichen Einfallswinkeln und mit einem Detektor (5), der den reflektierten ausfallenden Strahlengang (12, 13) auffängt und zeitabhängig den sich durch Anlagerungen an die sensitive Oberfläche ändernden Einfallswinkel des Lichts feststellt, bei dem resonanzbedingt ein Intensitätsminimum an ausfallendem Licht auftritt, wobei dem Detektor (5) eine Auswerteeinrichtung (6) mit einer Software zur zeit- und winkelabhängigen kontinuierlichen Registrierung des Intensitätsminimums zugeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteeinrichtung (6) und die Software so beschaffen sind, dass sie auch zwei oder mehr gleichzeitig auftretende In- tensitätsminima feststellen und zeitabhängig registrieren.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Meßbereich in zwei oder mehr schmale parallele Meßkanäle unterteilt ist, denen separate Detektorbereiche mit jeweils eigener Signalregistrierung zugeordnet sind.
6. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder der Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5 zur Untersuchung der Anheftung oder Ablösung lebender oder toter Zellen oder zellähnlicher Partikel auf dem Gebiet der Biologie/Medizin zur Messung der Zeiloberflächeninteraktion, auf dem Gebiet der Lebensmitteltechnologie zur Messung des Verhaltens von Nahrungsmittelsubstanzen und Keimen gegenüber Körperzellen, in der Bakteriologie zur Untersuchung der Virulenz von Pilzen, Bakterien, Viren, Einzellern oder Parasiten, zur Messung des Anbindungsverhaltens von sythetischen Zellen wie Liposomen an Körperzellen, zur Messung der Anbindung nicht biologischer Partikel an körpereigene Zellen oder zur Untersuchung der Anbindung von Steinen oder kristallinen Strukturen von Zellen an körpereigene Zellen.
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