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WO2008078835A1 - Ｄｎａメチル化測定方法 - Google Patents

Ｄｎａメチル化測定方法 Download PDF

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WO2008078835A1
WO2008078835A1 PCT/JP2007/075361 JP2007075361W WO2008078835A1 WO 2008078835 A1 WO2008078835 A1 WO 2008078835A1 JP 2007075361 W JP2007075361 W JP 2007075361W WO 2008078835 A1 WO2008078835 A1 WO 2008078835A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
stranded
stranded dna
double
oligonucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2007/075361
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English (en)
French (fr)
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WO2008078835A9 (ja
Inventor
Yoshitaka Tomigahara
Hirokazu Tarui
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Chemical Co Ltd filed Critical Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority to AU2007339162A priority Critical patent/AU2007339162A1/en
Priority to US12/521,236 priority patent/US20110045463A1/en
Publication of WO2008078835A1 publication Critical patent/WO2008078835A1/ja
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Publication of WO2008078835A9 publication Critical patent/WO2008078835A9/ja
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the content of methylated DNA in a target DNA region in genomic DNA contained in a biological specimen.
  • methylation in the target DNA region in the genomic DNA is performed.
  • There are methods for measuring the content of DNA see, for example, Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11; 22 (15): 2990-7, and Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Mar 18; 94 (6): 2284-9) .
  • this measurement method it is necessary to first extract DNA containing a target DNA region from a DNA sample derived from genomic DNA, and the extraction operation is complicated.
  • a method for measuring the content of methylated DNA in the target region of the extracted DNA for example, (1) After modifying the DNA with sulfite, etc., DNA synthesis by DNA polymerase is performed. (2) A method of amplifying the target region by subjecting it to a polymerase chain reaction (hereinafter, also referred to as PCR). (2) After digesting the DNA with a methylation sensitive restriction enzyme, PC R A method for amplifying a target region by using the method is known. Both of these methods require time and effort for modification of DNA for detection of methylation and subsequent purification of the product, preparation of a reaction system for PCR, confirmation of DNA amplification, and the like. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a method for easily measuring the content of methylated DNA in the target DNA region in the genomic DNA contained in a biological specimen. That is, the present invention
  • the double-stranded DNA formed in the first step is digested with one or more methylation-sensitive restriction enzymes, and then the resulting free digest (one at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme).
  • the double-stranded DN A formed as an undigested product obtained in the second step (Cp G in the methylated state at the recognition site of the above-mentioned methylation-sensitive restriction enzyme)
  • the generated free single-stranded DNA is generated by base-pairing the generated single-stranded DNA (positive strand) with the single-stranded immobilized oligonucleotide.
  • a step of selecting and forming a double-stranded DNA obtained by base pairing of the selected single-stranded DNA and the single-stranded immobilized oligonucleotide (second (A) pre-step), and the step (Second (A) the double-stranded DNA formed in the previous step), using the selected single-stranded DNA as a cage and the single-stranded immobilized oligonucleotide as a primer,
  • second (B) previous step By extending the selected single-stranded DNA to a double-stranded DNA that has been elongated (second (B) previous step) and
  • Double-strand DNA (stretched double-strand DNA that does not contain a CpG pair in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme)
  • a step of separating the DNA (positive strand) that is in a single state and the DNA (negative strand) that is in a single-stranded state (third pre-step), and as this step
  • step A (a) The generated single-stranded DNA (positive strand) and the single-stranded immobilized oligonucleotide (negative strand) are subjected to base pairing to thereby convert the single-stranded DNA into the single-stranded state.
  • a step A (this step) having a step A2 for extending the single-stranded DNA as a double-stranded DNA,
  • step B (this step) of extending the oligonucleotide once to convert the DNA in the single-stranded state into a double-stranded DNA that has been formed by extension.
  • each step of the third step is repeated once after separating the double-stranded DNA formed by extension obtained in each step into a single-stranded state, and then in the target DNA region.
  • the first step it has a single-stranded DN A (positive strand) containing the target DN A region and a base sequence that is complementary to the target DN A region of the single-stranded DN A.
  • base pairing is carried out in a reaction system containing a divalent cation when base-pairing with a single-stranded immobilized oligonucleotide;
  • a method further comprising the following one step as each step of the third step according to any one of the preceding items 1 to 3;
  • Step C 1 By extending the primer once by using the single-stranded DNA selected in Step C 1 as a saddle and using the single-stranded oligonucleotide (negative strand) as a primer.
  • a step of adding a single-stranded oligonucleotide (negative strand) that has a base sequence that is complementary to and in a free state into the reaction system pre-addition step
  • Double-stranded DNA that is an undigested product obtained through the above-mentioned steps and the above-mentioned pre-addition step described above a double-stranded DNA that does not contain the CpG pair in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme
  • Each method of the third step described in any one of 1 to 3 in the preceding paragraph is characterized by additionally having the following one step (hereinafter referred to as the methylation ratio measuring method of the present invention). There is also.)
  • Step C By extending the primer once by using the single-stranded DNA selected in step C1 as a saddle and using the single-stranded oligonucleotide (negative strand) as a primer, The DNA in the single-stranded state is defined as an extended double-stranded DNA.
  • Step C having Step C 2 (this step);
  • a method further comprising the following one step as each step of the third step according to any one of the preceding items 1 to 3;
  • step C1 Base pairing the generated single-stranded DNA (positive strand) with the single-stranded oligonucleotide (negative strand) added to the reaction system in the previous addition step. And step C1 for selecting the DNA in the single-stranded state,
  • step C1 Using the single-stranded DNA selected in step C1 as a saddle, the single-stranded oligonucleotide (negative strand) as a primer, and extending the primer once A C step (this step) having the C 2 step, wherein the DNA in the single-stranded state is formed as an extended double-stranded DNA;
  • a step of separating the single strand DNA) into a single strand state (additional re-preceding step), and
  • a method further comprising the following one step as each step of the third step according to any one of the preceding items 1 to 3;
  • step C 1 The single-stranded DNA selected in step C 1 is used as a saddle, and the primer is extended once using the single-stranded oligonucleotide (negative strand) as a primer.
  • a C step (this step) having a C 2 step, wherein the DNA in the single-stranded state is formed into an elongated double-stranded DNA by the step C;
  • a method for measuring a methylation ratio which further comprises the following two steps as a step of the method according to any one of 1 to 7 above.
  • the DNA of the target DNA region (the total amount of methylated DNA and non-methylated DNA) is amplified to a detectable amount.
  • a fourth step of quantifying the amount of amplified DNA is performed by performing the third step in the method described in any one of the paragraphs.
  • the genomic DNA-derived DNA sample contained in the biological specimen is a DNA sample that has been previously digested with a restriction enzyme that does not use the target DNA region of the genomic DNA as a recognition cleavage site.
  • the method according to any one of 1 to 11 above;
  • a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample is a DNA sample digested with one or more methylation-sensitive restriction enzymes.
  • methylation-sensitive restriction enzymes are methylation-sensitive restriction enzymes Hpa II or Hhal; .
  • FIG. 1 shows that the sample prepared in Example 1 was subjected to either “A (no treatment)” or “B (simultaneous treatment with Hpall and Hhal)”, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of 1.5% agarose gel electrophoresis of the amplified product obtained by amplifying methylated DNA in the region consisting of by PCR. From the leftmost lane in the figure, DNA fragment X2 “AJ-treated sample, DNA fragment X2“ B ”-treated sample, DNA fragment Y2“ A ”-treated Results are shown for the sample, the sample that has been subjected to the “B” treatment of DNA fragment Y2.
  • FIG. 2 shows that the sample prepared in Example 2 was subjected to either “A (no treatment)” or “B (simultaneous treatment with Hpall and Hhal)” and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of 1.5% agarose gel electrophoresis of the amplified product obtained by amplifying methylated DNA in the region consisting of by PCR.
  • DNA marker “M” DNA fragment Y 2 with sample “A” treated sample 1, DNA fragment Y2 with sample “A” treated sample 2, DN A fragment Y2 “AJ-treated sample 3, DNA fragment Y2“ B ”-treated sample 1, DNA fragment Y2“ B ”-treated ⁇ Sample 2, DNA fragment ⁇ 2“ ⁇ ”Treated sample 3, DNA fragment X 2“ ⁇ ”treated sample 1, DNA fragment ⁇ 2“ ⁇ ”treated sample 2, DN ⁇ Fragment X 2“ A ” Treated sample 3, DNA fragment X2 “B” treated sample 1, DNA flag Sample X 2 “B” treated sample 2, DNA fragment X2 “B” treated sample 3 results.
  • FIG. 3 shows that the DNA fragment X 2 sample prepared in Example 3 was subjected to either “A (no treatment)” or “B (simultaneous treatment of Hpall and 3 ⁇ 4hal)”.
  • FIG. 5 shows the results of 1.5% agarose gel electrophoresis of the amplified product obtained by amplifying the methylated DNA in the region consisting of the base sequence shown in 22 with PCR. The leftmost lane in the figure shows the DNA marker “M”.
  • FIG. 4 shows that the sample of DNA fragment Y2 prepared in Example 3 was treated with either “A (no treatment)” or “B (simultaneous treatment of Hpall and hal)”.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of 1.5% agarose gel electrophoresis of the amplified product obtained by amplifying the methylated DNA in the region consisting of the base sequence shown in FIG. The left lane in the figure shows the DNA marker “M”.
  • FIG. 5 shows that the sample of DNA fragment X 2 prepared in Example 4 was treated with either “A (no treatment)” or “B (simultaneous treatment of Hpall and hal)”.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of 1.5% agarose gel electrophoresis of the amplified product obtained by amplifying the methylated DNA in the region consisting of the base sequence shown in FIG. The leftmost lane in the figure shows the DNA marker “M”.
  • FIG. 6 shows that the sample of DNA fragment Y2 prepared in Example 4 was treated with either “A (no treatment)” or “B (simultaneous treatment of Hpall and hal)”.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of 1.5% agarose gel electrophoresis of the amplified product obtained by amplifying the methylated DNA in the region consisting of the base sequence shown in FIG. The leftmost lens in the figure indicates the DNA marker “M”.
  • Example 7 shows that the sample “(I)” prepared in Example 5 was added to “A (no treatment)”, “B (Hpall treatment)”, “C (Hhal treatment)” or “D (Hpall and 3 is a diagram showing the result of measuring the amount of methylated DNA in a region consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 by real-time PCR after performing any of the processes of “3 ⁇ 4hal simultaneous processing”.
  • the vertical axis in the figure shows the relative value when the amount of DNA in the sample treated with “A” is 1 (average soil standard deviation of 3 times). The theoretical value indicates the calculated value (methylation ratio) expected for Group B, Group C, and Group D.
  • FIG. 8 shows that the sample “(II)” prepared in Example 5 was added to “A (no treatment)”, “B (Hpall treatment)”, “C (fflial treatment)” or “D (Hpall and 3 ⁇ 411 & 1 simultaneous processing) ”is a diagram showing the results of measuring the amount of methylated DNA in the region consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 by real-time PCR. .
  • the vertical axis in the figure shows the relative value when the amount of DNA in the sample treated with “A” is 1 (average soil standard deviation of 3 times). The theoretical value indicates the calculated value (methylation ratio) expected for the B, C, and D groups.
  • FIG. 9 shows that the sample “(III)” prepared in Example 5 was added to “A (no treatment)”, “B (Hpall treatment)”, “C (Hhal treatment)” or “D (Hpall and 3 ⁇ 4hal).
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of measuring the amount of methylated DNA in the region consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 by real-time PCR after performing any of the treatments of “H.
  • the vertical axis in the figure shows the relative value when the amount of DNA in the sample treated with “A” is set to 1 (three standard deviations of standard deviation).
  • the theoretical value indicates the calculated value (methylation ratio) expected for the B, C, and D groups.
  • FIG. 10 shows that in Example 5, the prepared sample “(IV)” was added to “A (no treatment)”, “B (Hpal treatment)”, “C (Hhal treatment)” or “D (Hpal treatment)”. l and 3 ⁇ 4 hal simultaneous processing), and the amount of methylated DNA in the region consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 was measured by real-time PCR.
  • FIG. The vertical axis in the figure shows the relative value when the amount of DNA in the sample treated with “A” is 1 (average soil standard deviation of 3 times). The theoretical value indicates the calculated value (methylation ratio) expected for Group B, Group C, and Group D.
  • Fig. 1 1 shows that in Example 5, the prepared sample "(V)" was replaced with "A (no treatment)", “B (Hpal treatment)", “C (Hlial treatment)” or “D (Hpal)".
  • the vertical axis in the figure shows the relative value when the amount of DNA in the sample treated with “A” is set to 1 (average soil standard deviation of 3 times).
  • the theoretical value indicates the calculated value (methylation ratio) expected for the B, C, and D groups.
  • biological specimen for example, a cell lysate, a tissue lysate (herein, tissue has a broad meaning including blood, lymph nodes, etc.) or in mammals
  • biological samples such as plasma, serum, lymph fluid, body secretions (urine, milk, etc.), and genomic DNA obtained by extraction from these biological samples.
  • biological specimen include samples derived from microorganisms, viruses, etc.
  • genomic DNA in the measurement method of the present invention means genomic DNA such as microorganisms and viruses.
  • the present invention measurement method can be expected to be used in periodic health examinations and simple tests.
  • DNA may be extracted using a commercially available DNA extraction kit or the like.
  • plasma or serum is prepared from blood according to a normal method, and the prepared plasma or serum is used as a specimen, and free DNA contained therein (cancer cells such as gastric cancer cells).
  • cancer cells such as gastric cancer cells.
  • there are four types of bases that make up a gene (genomic DNA). Of these bases, the phenomenon that only cytosine is methylated is known, and such methylation modification of DNA is based on the nucleotide sequence represented by 5'-CG-3 '(C represents cytosine).
  • G represents guanine.
  • the base sequence may be written as “CpG”.
  • CpG the base sequence
  • the site that is methylated in cytosine is at position 5.
  • Cytosine is also methylated. Therefore, the DNA methylation state is inherited by two new DNA groups after DNA replication.
  • the “methylated DNA” in the present invention means DNA produced by such methylation modification.
  • the “CpG pair” in the present invention means a double-stranded oligonucleotide formed by base pairing of a base sequence represented by CpG and a complementary CpG.
  • the “target DNA region” in the present invention (hereinafter sometimes referred to as the target region) is a DNA region to be examined for the presence or absence of methylation of cytosine contained in the region. And at least one recognition site for a methylation sensitive restriction enzyme. For example, Lys yl oxidase, HRAS-like suppresso bA305P22.2.
  • a DNA region containing one or more cytosines in the base sequence indicated by CpG present in the base sequence of the translation region (coding region) can be exemplified.
  • the useful protein gene is a Lysyl oxidase gene
  • the base sequence represented by C p G existing in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) is identical.
  • nucleotide sequence including two or more examples include the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the Lysyl oxidase gene derived from chickpea, its 5, and a promoter region located upstream. And the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (corresponding to the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 16001 to 18661 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AF270645).
  • SEQ ID NO: 1 the ATG codon encoding the amino acid methionine at the amino terminal of the human-derived Lysyl oxidase protein is represented by nucleotide numbers 2031 to 2033.
  • the nucleotide sequence of the above exon 1 is represented by the nucleotide number 1957-2661.
  • Cytosine in G exhibits a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, the base numbers 1539, 1560, 1574, 1600, 1623, 1635, 1644, 1654, 1661 1682, 1686, 1696, 1717, 1767, 1774, 1783, 1785, 1787, 1795 etc. be able to.
  • the useful protein gene is the HRAS-1 ike suppres sor gene
  • the C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the HRAS-ike suppressor gene derived from human and the promoted region located 5 'upstream corresponds to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 172001 to 173953 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC068162). ).
  • the base sequence of exon 1 of the human-derived HRAS-like suppressor gene is represented by base numbers 1743-1953.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, the base numbers 1316, 1341, 1357, 1359, 1362, 1374, 1390, 1399, 140 5, 1409, 1414, 1416, 1422, 1428, 1434, 1449, 1451, 1454, 1463, 1469, 1477, 1 479, 1483, 1488, 1492, 1494, 1496, 1498, 1504, 1510, 1513, 1518, The shishin shown by 1520 etc. can be mentioned.
  • the useful protein gene when it is a bA305P22.2.1 gene, it is represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence containing one or more base sequences include those of genomic DNA containing exon 1 of human-derived bA305P22.2.1 gene and a promoter region located 5 'upstream thereof. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (corresponding to the base sequence represented by base numbers 13001 to 13889 of the base sequence described in Genbank Accession No. AL121673) can be mentioned. . Sequence number In the nucleotide sequence shown in Fig.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, base numbers 329, 335, 337, 351, 363, 373, 405, 424, 427 , 446, 465, 472, 486, and the like. More specifically, for example, when the useful protein gene is a Gamma fil amin gene, C p present in the base sequence of the promoted region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence containing one or more base sequences indicated by G is the base sequence of genomic DNA that contains exon 1 of the Ga ⁇ afil amin gene derived from human and the promoter-region located 5 'upstream.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 (corresponding to the complementary sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 63528 to 64390 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC074373) ).
  • the ATG codon encoding the amino terminal methionine of human-derived Gamma fil amin protein is represented by nucleotide numbers 572 to 574, and the nucleotide sequence of exon 1 is Base numbers 463-863.
  • cytosine having a high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, base numbers 329, 333, 337, 350, 353, 360, 363, 370, 379, 382, 3 84, 409, 414, 419, 426, 432, 434, 445, 449, 459, 472, 474, 486, 490, 503, 5
  • the cytosine indicated by 05 mag can be mentioned.
  • the useful protein gene is a HAND1 gene
  • the base sequence represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) is used.
  • Examples of the base sequence containing one or more include the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human-derived HAND1 gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof. More specifically, And a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 (corresponding to a complementary sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 24 303 to 26500 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC026688).
  • the ATG codon encoding the amino acid at the amino terminal of the HAND1 protein derived from human is represented by nucleotide numbers 1656 to 1658, and the nucleotide sequence of exon 1 is The number 1400-2198 is shown.
  • the cytosine in G shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, base numbers 1153, 1160, 1178, 1187, 1193, 1218, 1232, 1266, 1272 1292, 1305, 1307, 1316, 1356, 1377, 1399, 1401, 1422, 1434 and the like. More specifically, for example, when the useful protein gene is the Homologue of RIKEN 2210016F 16 gene, the C p present in the promoter sequence, untranslated region or translated region (coding region) of the promoter region.
  • the base sequence containing one or more base sequences represented by G includes the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human-derived Homologue of RIKEN 2210016F16 gene and the promoter region located 5 'upstream thereof. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 (the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 157056 to 159000 of the nucleotide sequence described in Genbank Accessions NO.AL354733) It corresponds to the complementary base sequence of the sequence. ).
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived RIKEN 2210016F16 gene derived from human is represented by nucleotide numbers 1392 to 1945.
  • Shigosine in pG shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the salt sequence represented by SEQ ID NO: 6, base numbers 1 172, 1175, 1 180, 1183, 1189, 1204, 1209, 1267 1271, 1278, 1281, 1313, 1319, 1332, 1334, 1338, 1346, 1352, 1358, 1366, 1378, 1392, 1402, 1433, 1436, 1438 and the like.
  • the useful protein gene is the FLJ32130 gene, it is indicated by C p G present in the base sequence of the promo overnight region, untranslated region or translated region (coding region).
  • Examples of the base sequence containing one or more base sequences include genomic DNA base sequences containing exon 1 of human-derived FLJ32130 gene and a promoter region located 5 'upstream thereof.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 (corresponding to the complementary base sequence of the base sequence represented by base numbers 1 to 2379 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC002310) is mentioned. It is done.
  • the ATG codon encoding the methionine at the amino acid end of the human-derived FU 32130 protein is represented by nucleotide numbers 2136 to 2138, and the nucleotide sequence considered to be exon 1 above. Is shown in base numbers 2136-2379.
  • Cytosine in CpG exhibits a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as gastric cancer cells. More specifically, cytosine having a high methylation frequency in gastric cancer cells is represented by, for example, SEQ ID NO: 7.
  • nucleotide numbers 1714, 1716, 1749, 1753, 1762, 1795, 1814, 1894, 191 1 The cytosine shown by 1915, 1925, 1940, 1955, 1968 etc. can be mentioned.
  • the useful protein gene is a PPARG angiopoietin-related protein gene
  • it is indicated by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • a base sequence containing one or more base sequences a genomic DNA base sequence containing human PPARG angiopoietin-related protein gene exon 1 and a promoter region located 5 ′ upstream thereof is used. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 can be mentioned.
  • the ATG codon encoding the methionine at the amine end of the human-derived PPARG angiopoietin-related protein protein is represented by base numbers 717 to 719, and the 5 ′ of exon 1
  • the base sequence of the side part is shown in base numbers 1957 to 2661.
  • the cytosine in the base sequence shown by CpG present in the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, particularly the cytosine in C p G present in the region where CpG is densely present in the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 For example, it shows high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine with high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8, base numbers 35, 43, 51, 54, 75, 85, 107, 127, 129, Examples include cytosine represented by 143, 184, 194, 223, 227, 236, 251, 258, and the like. More specifically, for example, when the useful protein gene is a Thrombomodulin gene, the base represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • nucleotide sequence containing one or more sequences examples include the genomic DNA nucleotide sequence containing exon 1 of the Thrombomodulin gene derived from human and a promoter region located 5 'upstream thereof. Includes a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 (corresponding to a base sequence represented by base numbers 1 to 6096 of the base sequence described in Genbank Accession No. AF495471).
  • SEQ ID NO: 9 corresponding to a base sequence represented by base numbers 1 to 6096 of the base sequence described in Genbank Accession No. AF495471.
  • SEQ ID NO: 9 the amino terminus of human-derived Thrombomodulin protein The ATG codon that encodes the end methionine is shown in nucleotide numbers 2590 to 2592, and the base sequence of exon 1 is shown in nucleotide numbers 2048 to 6096.
  • succin having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 9, the base numbers 1539, 1551, 1571, 1579, 1581, 1585, 1595, Examples include cytosine represented by 1598, 1601, 1621, 163 2, 1638, 1645, 1648, 1665, 1667, 1680, 1698, 1710, 1724, 1726, 1756, and the like. More specifically, for example, when the useful protein gene is p53-responsive gene 2 gene, it exists in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence containing one or more base sequences represented by C p G is a genome containing exon 1 of human-derived p53-responsive gene 2 gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof. More specifically, the nucleotide sequence of DNA can be mentioned. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 (the nucleotide sequence of the nucleotide sequence described in Genbank Accesion No. AC009471 1 13501-1 16000 It corresponds to the complementary sequence of the base sequence. In the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10, the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived p53-responsive gene 2 gene is represented by nucleotide numbers 1558 to 1808.
  • Cytosine in the base sequence represented by C p G present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 is, for example, a high methylation frequency (i.e. hypermethylated state (hypermethylated state) in cancer cells such as spleen cancer cells). thyl at i on)). More specifically, as cytosine having high methylation frequency in spleen cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, base numbers 1282, 1284, 1301, 1308, 1315, 1319, 1349, The cytosine shown by 1351, 1357, 1361, 1365, 1378, 1383 etc. can be mentioned. Specifically, for example, when the useful protein gene is a Fibrin2 gene.
  • the base sequence of genomic DNA containing exon 1 and 5 and its upstream promoter region can be raised. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 (Genbank Accession) No. AC113387, which corresponds to the complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 118801 to 121000 of the base sequence described in No. AC113387).
  • SEQ ID NO: 11 Genbank Accession
  • AC113387 which corresponds to the complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 118801 to 121000 of the base sequence described in No. AC113387.
  • the nucleotide sequence of exon 1 of the human fibrillin gene is represented by nucleotide numbers 1091 to 1345.
  • Cytosine in the base sequence represented by C p G present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state ( hypermethyl at i on)). More specifically, examples of cytosine having a high methylation frequency in spleen cancer cells include, for example, nucleotide numbers 679, 687, 690, 699, 746, 773, 777 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11. 783, 795, 799, 812, 823, 830, 834, 843 and the like.
  • the useful protein gene is a neurofilament 3 gene
  • the C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region)
  • the nucleotide sequence containing one or more of the nucleotide sequences shown include the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the neurofilaments gene derived from human and a promoter region located 5 'upstream thereof. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 (corresponding to the complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 28001 to 30000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AF106564) )).
  • the base sequence of exon 1 of the human-derived Neurofiment 3 gene is represented by base numbers 614 to 1694.
  • cytosine in the base sequence represented by C p G present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 2 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state ( hyp ermethyl ation)). More specifically, as cytosine having a high methylation frequency in spleen cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 12, No.
  • C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence containing one or more base sequences represented by is the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human-derived disintegrin and metalloproteinase dom ain 23 gene, and the promoter region located upstream of it.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 (corresponds to the base sequence represented by base numbers 21001 to 23300 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC009225). can give.
  • the nucleotide sequence of exon 1 of the disintegrin and metalloproteinase domain 23 gene derived from the salt I, Koolema, baboon derived from SEQ ID NO: 13 is shown in nucleotide numbers 1194-1630.
  • cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state in a cancer cell such as a premature cancer cell).
  • examples of cytosine having a high methylation frequency in knee cancer cells include, for example, base numbers 998, 1003, 1007, 1011, 1016, 1018, 1020, 1026 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 13. 1028, 1031, 1035, 1041, 1043, 1045, 1051, 1053, 1056, 1060, 1066, 1068, 1070, 1073, 1093, 1096, 1106, 1112, 1120, 1124, 1126 etc. be able to.
  • the useful protein gene is a G protein-coupled receptor 7 gene
  • C present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence containing at least one base sequence represented by pG is the genomic DNA containing exon 1 of the human G protein-coupled receptor 7 gene and the 5 'upstream promoter region. More specifically, a base sequence represented by SEQ ID NO: 14 (base sequence represented by base numbers 75001 to 78000 of the base sequence described in Genbank Accessions NO. AC009800) Corresponds to a column. ). In the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14, the nucleotide sequence of exon 1 of the G protein-coupled receptor 7 gene derived from human is represented by nucleotide numbers 1 666 to 2652.
  • Cytosine in the base sequence represented by C p G present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state in a cancer cell such as a spleen cancer cell). )
  • cytosine with high methylation frequency in spleen cancer cells includes, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 14, and the base numbers 1480, 1482, 1485, 1496, 1513, 1526, 154 2, 1560 1564, 1568, 1570, 1580, 1590, 1603, 1613, 1620 and the like.
  • the useful protein gene is a G-protein coupled soma tostatin and angiotensin-like peptide receptor gene, its promoter region, promoter region, untranslated region or translated region
  • the base sequence containing one or more base sequences indicated by C p G present in the base sequence of the (coding region) is an exon of the G-protein coupled somatostatin and angiotensin-1 ike peptide receptor gene derived from cocoon
  • the base sequence of genomic DNA containing 1 and a promoter region located 5 ′ upstream thereof can be given. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 (Genbank Accession No. AC008971 In the base sequence of 5700 1 to 60000 of the base sequence described in 1).
  • the base sequence of exon 1 of the human-derived G-protein coupled somatostatin angiotensin-like peptide receptor gene is represented by base numbers 776-2632.
  • Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 has a high methylation frequency (that is, a hypermethylation state ( hypermethylalion))).
  • cytosine having a high methylation frequency in S spleen cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 15, base numbers 470, 472, 490, 497, 504, 506, 509, Examples thereof include cytosine represented by 514, 522, 540, 543, 552, 566, 582, 597, 610, 612 and the like.
  • the useful protein gene is the Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter exposure adrenal in member 2 gene, the base of the mouth motor region, untranslated region or translated region (coding region)
  • the nucleotide sequence including one or more nucleotide sequences represented by CpG present in the sequence is human-derived Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenal in member 2
  • the nucleotide sequence of genomic DNA containing the promoter region can be mentioned. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 (base number 78801 to nucleotide sequence of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC026802) It corresponds to a complementary sequence of the base sequence represented by 81000).
  • nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenal in member 2 gene is shown in nucleotide numbers 14 79 to 1804. Cytosine in the base sequence represented by C p G present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state (hypermethylation state) in cancer cells such as spleen cancer cells). methyl at ion))).
  • cytosine having a high methylation frequency in spleen cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, base numbers 1002, 1010, 1019, 1021, 1051, 1056, 1061, 1063, The cytosine shown by 1080, 1099, 1110, 1139, 1141, 1164, 1169, 1184 etc. can be mentioned.
  • “(amplified to a detectable amount of methylated DNA in the target DNA region) and the amount of amplified DNA” means that the genomic DNA contained in the biological sample is The amount after amplification of methylated DNA in the target region possessed, that is, the amount determined in the third step of the measurement method of the present invention.
  • the biological specimen when the biological specimen is 1 mL of serum, it means the amount of DNA amplified based on the methylated DNA contained in 1 mL of serum.
  • “Methylation ratio” in the present invention (particularly the method for measuring methylation ratio of the present invention) The total amount of the amplified amount of methylated DNA in the target DNA region of the genomic DNA contained in the product-derived specimen and the amount after amplification of the unmethylated DNA, It means the value obtained by dividing the amount of methylated DNA after amplification.
  • the “double-stranded DNA containing one or more unmethylated CpG pairs in the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme” is present in the recognition site of the restriction enzyme in double-stranded DNA.
  • Both of the cytosines in one or more C p G pairs are double-stranded DNA that is unmethylated cytosine, ie, present in the recognition site of the restriction enzyme in double-stranded DNA 1
  • it means a double-stranded DNA that is a cytosine in which both a positive-strand DNA cytosine and a corresponding negative-strand cytosine are not methylated.
  • a double-stranded DNA formed by extension that does not contain a C p G pair in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme means that the restriction enzyme recognition site in double-stranded DNA is A double-stranded DNA in which one of the cytosines in all C p G pairs present is methylated and the other is an unmethylated cytosine, that is, the recognition site of the restriction enzyme in the double-stranded DNA In all C p G pairs present in the DNA, either one of the cytosine of the positive-strand DNA and the corresponding cytosine of the negative-strand DNA is methylated and the other is methylated. Means double-stranded DNA which is not cytosine.
  • the first step of the measurement method of the present invention from a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen, a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region and the target DNA region Base-paired with a single-stranded immobilized oligonucleotide having a complementary base sequence, the single-stranded DNA is converted into the single-stranded DNA and the single-stranded immobilized oligonucleotide. Select as double-stranded DNA by base pairing.
  • the “single-stranded immobilized oligonucleotide” in the first step of the measurement method of the present invention is complementary to all the target DNA regions of the single-stranded DNA (positive strand) including the target DNA region.
  • It has a base sequence or a base sequence that is a part of the target DNA region and is complementary to a region including the 3 ′ end of the target DNA region. It is a single-stranded immobilized oligonucleotide (hereinafter sometimes referred to as the present immobilized oligonucleotide).
  • This immobilized oligonucleotide is used to select single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region from genomic DNA-derived DNA samples contained in biological samples.
  • the immobilized oligonucleotide preferably has a length of 5 to 100 bases, and more specifically preferably has a length of 20 to 200 bases.
  • the 5 ′ terminal side of the present immobilized oligonucleotide can be immobilized with a carrier, while the 3 ′ terminal side thereof is changed from the 5th terminal to the 3 ′ terminal by the second pre-process and the second A process described later. What is necessary is just to be a free state so that the one-time extension reaction which progresses toward is possible.
  • “what can be immobilized on a carrier” means that the present immobilized oligonucleotide is immobilized on a carrier when a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region is selected.
  • the 5 ′ end of the oligonucleotide may be fixed to a carrier according to a normal genetic engineering operation method or a commercially available kit / equipment (binding to a solid phase). Specifically, for example, after 5 'end of this oligonucleotide is piotinated, the resulting piotinated oligonucleotide is coated with streptavidin (for example, a streptavidin-coated PCR tube, streptavidin. And a method of fixing to coated magnetic beads or the like.
  • streptavidin for example, a streptavidin-coated PCR tube, streptavidin.
  • the first step of the measurement method of the present invention is, for example, when the immobilized oligonucleotide is a pyotinylated oligonucleotide,
  • a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample is subjected to a base pair of annealing buffer and piotinylated oligonucleotide (the single-stranded DNA (positive strand) and the immobilized oligonucleotide).
  • the mixture is obtained by adding the present immobilized oligonucleotide and the carrier, so that they are immobilized at this stage).
  • the resulting mixture is then quantified at 95 ° C to make single-stranded double-stranded DNA containing the desired DNA region present in the genomic DNA-derived DNA sample contained in the biological specimen. Heat for minutes.
  • the temperature is rapidly decreased to a temperature about 10 to 20 ° C lower than the Tm value of the biotinylated oligonucleotide. And keep at that temperature for several minutes.
  • the base pairing between the single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region and the piotinylated oligonucleotide is biotinylated. This is carried out prior to the immobilization of the oligonucleotide and the streptavidin-coated support, but this order does not matter.
  • a mixture is obtained, Several minutes at 95 ° C in order to make the double-stranded DNA containing the target DNA region present in the DNA sample derived from genomic DNA contained in the biological specimen into a single strand.
  • it can be rapidly increased to a temperature approximately 10-20 ° C below the Tm value of the piotinylated oligonucleotide. It may be cooled and kept at that temperature for several minutes.
  • the solution when using a PCR tube coated with streptavidin, the solution is first removed by pipetting or decantation, and then the TE buffer is approximately equivalent to the volume of the biological sample. After that, the TE buffer can be removed by pipetting or decanting.
  • the TE buffer when using a magnetic bead coated with streptavidin, after fixing the beads with a magnet, first remove the solution by pipetting or decantation, then approximately the same volume as the volume of the biological specimen. Add TE buffer, and then remove the TE buffer by pipetting or decanting.
  • This procedure is important in order to remove DNA NA that has not been immobilized, or DNA NA floating in a solution digested with the restriction enzymes described below, from the reaction solution. If these operations are insufficient, the DNA floating in the reaction solution will be in a bowl shape, and an unexpected amplification product will be obtained in the amplification reaction.
  • DNA with a completely different nucleotide sequence from the target region eg, rat DNA in the case of human biological samples
  • a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region is complementary to the target DNA region of the single-stranded DNA.
  • base pairing with a single-stranded immobilized oligonucleotide having a base sequence include base pairing in a reaction system containing a divalent cation. More preferably, the divalent cation is a magnesium ion.
  • the “reaction system containing a divalent cation” means an annealing buffer used for base pairing the single-stranded DNA (positive strand) and the single-stranded immobilized oligonucleotide. It means a reaction system that contains a divalent cation.
  • a salt containing gnesium ions may be contained at a concentration of 1 mM to 60 OmM.
  • the double-stranded DNA formed in the first step is digested with one or more types of methylation-sensitive restriction enzymes, and the resulting free digest (the aforementioned methylation) Remove the double-stranded DNA that contains one or more amethyl CpG pairs at the recognition site of the sensitive restriction enzyme.
  • “Methylation-sensitive restriction enzyme” in the second step of the measurement method of the present invention means, for example, that a recognition sequence containing methylated cytosine is not digested, but only a recognition sequence containing unmethylated cytosine is digested. It means a restriction enzyme that can be used. That is, in the case of DNA in which cytosine contained in the recognition sequence that can be originally recognized by the methylation-sensitive restriction enzyme is methylated, the methylation-sensitive restriction enzyme is allowed to act on the DNA. The DNA is not cleaved. In contrast, when cytosine contained in a recognition sequence that can be recognized by a methylation-sensitive restriction enzyme is an unmethylated DNA, the methylation-sensitive restriction enzyme can act on the DNA.
  • the DNA is cleaved.
  • a methylation-sensitive enzyme include Hpall, BstUI, Narl, SacIK fflial, and the like.
  • the methylation-sensitive restriction enzyme is a double-stranded DNA containing a hemimethyl-state CpG pair (that is, cytosine of one strand of the CpG pair is methylated and the other strand is methylated). It does not cleave double-stranded DNA that is not methylated with cytosine and has already been clarified by Gruenbaum et al. (Nucleic Acid Research, 9, 2509-2515).
  • a method for examining the presence or absence of digestion with the methylation-sensitive restriction enzyme specifically, for example, using a primer pair capable of amplifying DNA containing the cytosine to be analyzed as a recognition sequence using the above DNA as a saddle type R can be used to check the presence or absence of DNA amplification (amplified product).
  • DNA amplification amplified product
  • cytosine to be analyzed is methylated, an amplification product is obtained.
  • the cytosine to be analyzed is not methylated, an amplification product cannot be obtained. Compare the amount of amplified DNA in this way By doing so, it is possible to measure the methylated ratio of cytosine to be analyzed.
  • the cytosine contained in the single-stranded immobilized oligonucleotide as the negative strand is not methylated, and the DNA strand on the positive strand side
  • the cytosine contained in the DNA of the genomic DNA contained in the biological specimen is methylated by the ability of the cytosine contained in the DNA or whether it is unmethylated. Decide whether or not. That is, if the genomic DNA contained in a biological sample is methylated, the resulting double-stranded DNA is in a hemimethyl state (a state that is not an ammethyl state.
  • Negative strand an unmethylated state, a positive state If the genomic DNA contained in the biological specimen is not methylated, the resulting double-stranded DNA is in an unmethylated state (negative strand: not methylated). State, positive chain: unmethylated state). Therefore, by utilizing the property that the methylation-sensitive restriction enzyme does not cleave double-stranded DNA in the hemimethyl state, the methylation-sensitive restriction enzyme in the genomic DNA contained in the biological specimen is used. It can be discriminated whether cytosine in one or more C p G pairs existing in the recognition site is methylated. In other words, by digestion with the methylation-sensitive restriction enzyme, one existing in the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme in the genomic DNA contained in the biological sample.
  • the double-stranded DNA is in an ammethyl state and is cleaved by the methylation-sensitive restriction enzyme.
  • the two Strand DNA is in a hemimethyl state and is not cleaved by the methylation sensitive restriction enzyme. Therefore, after performing digestion, as described below, by performing PCR using a pair of primers capable of amplifying the target DNA region, the genome contained in the biological sample is collected.
  • the second step of the measurement method of the present invention may be carried out as follows, for example, when the present immobilized oligonucleotide is a biotinylated oligonucleotide.
  • the double-stranded DNA thus formed in the first step is digested with one or more types of methylation-sensitive restriction enzymes, and then generated free digests (recognition sites of the aforementioned methylation-sensitive restriction enzymes). Remove and wash (DNA purification) double-stranded DNA containing one or more CpG pairs in an ammethyl state.
  • the solution when using a PCR tube coated with streptavidin, the solution is first removed by pipetting or decantation, and then the TE buffer is approximately equivalent to the volume of the biological sample. After adding one, the TE buffer can be removed by pipetting or decanting.
  • the TE buffer when using magnetic beads coated with streptavidin, after fixing the beads with a magnet, first remove the solution by pipetting or decanting, and then add TE buffer that is approximately equal to the volume of the biological sample. After the addition, the TE buffer can be removed by pipetting or decanting.
  • the treatment with a plurality of methylation-sensitive restriction enzymes is performed in the second step of the measurement method of the present invention, specifically, for example, the following may be performed.
  • 3 L lmg / mL BSA aqueous solution with 10 X buffer (330 mM Tris-Acetate H 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Di thothrei tol) selected for the double-stranded DNA selected in the first step 3 L, methylation sensitive enzymes Hpal l and Hhal (10 U // L), etc. 1.5 L each, and then add sterilized ultrapure water to the mixture to a volume of 30 L at 37 ° C.
  • 10 X buffer 330 mM Tris-Acetate H 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Di thothrei tol
  • the remaining solution is removed and washed (DNA purification) by pipetting or decantation. More specifically, for example, when using a PCR tube coated with streptavidin, first remove the solution by pipetting or decanting, and then add a TE buffer approximately equal to the volume of the biological specimen to this. After the addition, the TE buffer can be removed by pipetting or decanting.
  • a TE buffer approximately equal to the volume of the biological specimen to this. After the addition, the TE buffer can be removed by pipetting or decanting.
  • magnetic beads coated with streptavidin after fixing the beads with a magnet, first remove the solution by pipetting or decantation, and then use a TE buffer that is approximately equal to the volume of the biological sample. After adding one, the TE buffer can be removed by pipetting or decanting.
  • the “DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample” is the purpose of the genomic DNA.
  • One preferred embodiment is that it is a DNA sample that has been previously digested with a restriction enzyme that does not use the recognized DNA region as a recognition cleavage site.
  • the short type DNA is easier to select.
  • a restriction enzyme that does not use the target DNA region as a recognition cleavage site is derived from a genomic DNA derived from a biological sample. Digestion may be performed directly on DNA samples.
  • a general restriction enzyme treatment method may be used as a method of digesting with a restriction enzyme that does not use the target DNA region as a recognition cleavage site.
  • the “DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample” is a DNA sample digested with one or more methylation-sensitive restriction enzymes. Can be mentioned.
  • a method of digesting a genomic DNA-derived sample contained in a biological specimen with a methyl susceptibility restriction enzyme the same method as described above may be used when the biological specimen is genomic DNA itself.
  • a large excess of methylation-sensitive restriction enzyme for example, 500-fold amount (10 U) or 25 ng DNA amount Digestion treatment may be performed using the above methylation sensitive restriction enzyme.
  • the double-stranded DNA formed as an undigested product obtained in the second step (recognition site of the above-mentioned methylation sensitive restriction enzyme)
  • the DNA in the free single-stranded state thus generated is obtained by base-pairing the generated single-stranded DNA (positive strand) with the single-stranded immobilized oligonucleotide.
  • a step of forming a double-stranded DNA comprising the selected single-stranded DNA and base-paired single-stranded immobilized oligonucleotide (second (A) pre-step), and
  • the double-stranded DNA extended in the second pre-process (the double-stranded DNA formed without the CpG pair in the methylation sensitive restriction enzyme recognition site in the methylation-sensitive restriction enzyme) in the single-stranded state.
  • a step of separating the DNA (positive strand) into a single-stranded DNA (negative strand) (third pre-step), and as this step
  • Step A1 and the single-stranded DNA selected in Step A1 in the vertical form, and the primer is extended once using the single-stranded immobilized oligonucleotide as a primer.
  • a step A (this step) having a step A2 for extending and forming the DNA in the single-stranded state as a double-stranded DNA,
  • step B (this step) of extending the oligonucleotide once to convert the DNA in the single-stranded state into a double-stranded DNA that has been formed by extension.
  • each step of the third step is subjected to the above-mentioned target DNA region by repeating the once-stretched double-stranded DNA (obtained in each step) after separating it into a single-stranded state. Amplify the methylated DNA in the region to a detectable amount and quantify the amount of amplified DNA.
  • a double-stranded DNA formed as an undigested product obtained in the second step (described above)
  • the double-stranded DNA (extended) that does not contain the CpG pair in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme is once separated into a single-stranded state.
  • a double-stranded DNA formed as an undigested product obtained in the second step (a double-stranded DNA containing no CpG pair in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme).
  • the resulting mixture is then heated at 95 ° C for several minutes.
  • the second (A) pre-process in the second pre-process specifically, for example, it may be carried out in accordance with the first process, and the methylated single-stranded DNA and the present immobilized oligonucleotide are obtained.
  • a double-stranded DNA is formed by base pairing. As a result, the double-stranded DNA can be selected.
  • the present immobilized oligonucleotide is a pyotinylated oligonucleotide
  • it may be carried out as follows.
  • the solution when using a PCR tube coated with streptavidin, the solution is first removed by pipetting or decantation, and then the TE buffer is approximately equivalent to the volume of the biological specimen. Add TE and then remove the TE buffer by pipetting or decanting. Strept When using magnetic beads coated with avidin, after fixing the beads with a magnet, first remove the solution by pipetting or decantation, and then add TE buffer that is approximately equal to the volume of the biological specimen. Then, the TE buffer can be removed by pipetting or decanting.
  • the elongated double-stranded DNA obtained in the second (B) pre-process (without the methylated CpG pair at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme)
  • the elongated double-stranded DNA (NA) is once separated into a single-stranded DNA (positive strand) and a single-stranded DNA (negative strand).
  • the double-stranded DNA obtained in the second (B) previous step (a double-stranded DNA that does not contain a CpG pair in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme).
  • the resulting mixture is then heated at 95 for several minutes.
  • the DNA in the single-stranded state selected in (i) above is used as a saddle type, the single-stranded immobilized oligonucleotide is used as a primer, and the primer is extended once, thereby
  • the DNA in the double-stranded state is elongated as a double-stranded DNA (that is, step A2 in step A). Specifically, it may be carried out in accordance with, for example, the following description or the operation method in the extension reaction in the second (B) previous step of the measurement method of the present invention described above.
  • the generated single-stranded DNA (negative strand) is a saddle-shaped DNA, and the single-stranded DNA in the single-stranded state has a partial base sequence (negative strand), and A partial base sequence (negative strand) located 3 'end further than the 3' end of the base sequence (negative strand) that is complementary to the base sequence (positive strand) of the target DNA region.
  • Bases that are complementary to The oligonucleotide (reverse primer) that has the sequence (positive strand) and cannot be used for the extension reaction using the above-mentioned single-stranded immobilized oligonucleotide as a cage is used as an extension primer, and the oligonucleotide is used once.
  • the DNA in the single-stranded state is converted into an extended double-stranded DNA (that is, step B).
  • step B the DNA in the single-stranded state is converted into an extended double-stranded DNA.
  • it may be carried out according to the following description or the operation method in the extension reaction in the second (B) step of the above-described measurement method of the present invention.
  • each step in the third step is repeated after separating the elongated double-stranded DNA obtained in each step into a single-stranded state (for example, step A and step A).
  • step B methylated DNA in the target DNA region is amplified to a detectable amount, and the amount of amplified DNA is quantified.
  • it is carried out according to the following description and the operation method in the second (B) previous step, the A step and the B step in the third step of the measurement method of the present invention. do it.
  • a single-stranded immobilized oligonucleotide that has not been extended in the third step can be used as a reverse primer.
  • Double-stranded DNA extended in the second (B) previous step without amplification double-stranded DNA containing no C-pG pair in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme
  • the reaction from the first pre-step to the present step can be carried out as one PCR reaction.
  • independent reactions can be performed from the first pre-process to the third pre-process, and only this process can be performed as a PCR reaction.
  • PCR can be used as a method for amplifying a target DNA region (ie, a target region) after digestion with a methylation-sensitive restriction enzyme.
  • the present immobilized oligonucleotide can be used as a primer on one side, so by adding only the other primer and performing PCR, an amplification product is obtained, and the amplification product is also immobilized. Will be. At this time, it is labeled in advance with fluorescence.
  • the presence or absence of an amplification product can be evaluated without performing cumbersome operations such as electrophoresis.
  • the PCR reaction solution include DNA obtained in the second step of the measurement method of the present invention, 0.15 1 of a 50 M primer solution, 2.5 1 of 2 mM dNTP, 10X buffer (lOOmM Tris- HCl H 8.3, 500 mM KC1, 20 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) and AmpliTaq Gold (a kind of heat-resistant DNA polymerase: 5 U / il) mixed with 0.2 1 and sterilized ultrapure An example of the reaction solution is 25 1 with water added.
  • the reaction may be carried out by adding an appropriate amount of betaine, DMSO, etc. at times.
  • the above reaction solution is kept at 95 ° C. for 10 minutes, then at 95 ° C. for 30 seconds and then at 55 to 65 ° C. for 30 seconds and further to 72 ° C.
  • the temperature can be kept for 30 to 40 cycles with 30 seconds as one cycle.
  • the obtained amplification product is detected.
  • the amount of the immobilized fluorescent label can be measured after the same washing and purification operations as before.
  • real-time PCR is a method of monitoring PCR in real time and analyzing the obtained monitoring results by force kinetic analysis.For example, a high-precision quantitative PCR method that can detect even a slight difference of about twice the gene amount.
  • Examples of the real-time PCR method include a method using a probe such as a type-dependent nucleic acid polymerase probe, and a method using an infinite force such as Cyber Green.
  • Commercially available equipment and kits for real-time PCR may be used.
  • detection is not particularly limited, and detection by any known method is possible. . In these methods, operations up to detection can be performed without changing the reaction vessel.
  • a new pyotinylated oligonucleotide is designed on the 3 'end side of a primer or single-stranded immobilized oligonucleotide with the same base sequence as the single-stranded immobilized oligonucleotide.
  • the amplification product obtained is immobilized if there is a support coated with streptavidin.
  • streptavidin For example, when PCR is performed in a streptavidin-coated PCR tube, it is immobilized in the tube. Therefore, as described above, the amplification product can be easily detected by using a labeled primer. If the single-stranded immobilized oligonucleotide is immobilized by a covalent bond or the like, the solution containing the amplification product obtained by PCR is transferred to a container containing a streptavidin-coated support and amplified. It is possible to immobilize the product.
  • the detection may be performed as described above.
  • the complementary primer that amplifies the target region can amplify the target region having one or more recognition sites for methylation-sensitive restriction enzymes, and must not contain the recognition site.
  • the reason for this is as follows. Only the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme at the 3 'end of the DNA strand (new strand) of the double-stranded DNA of the double-stranded DNA obtained by selection and single extension reaction is methylated. If not, only that part will be digested with a methylation sensitive restriction enzyme. After digestion, even after washing as described above, double-stranded DNA that has lost only part of the 3 'end of the nascent strand remains in an immobilized state.
  • the primer on the complementary side contains the recognition site for this 3 'end methylation sensitive restriction enzyme, several bases on the 3' end of the primer This is because it anneals to several bases, and as a result, the target region may be amplified by PCR.
  • the pre-operation stage or post-operation stage of the first pre-process of the third process of the measurement method of the present invention or the pre-operation stage or post-operation stage of the third pre-process of the third process, Reacts with a single-stranded oligonucleotide (negative strand) that is free and has a base sequence that is complementary to part of the 3 'end of single-stranded DNA (positive strand) that contains the DNA region It includes a modified method that additionally has a process of adding to the system (pre-addition process).
  • Step C 1 The DNA in the single-stranded state selected in Step C 1 is used as a saddle type, and the primer is extended once by using the single-stranded oligonucleotide (negative strand) as a primer.
  • Each of the third steps of the measurement method of the present invention further includes the following one step (hereinafter, also referred to as the present methylation ratio measurement method).
  • step C1 The DNA, which is in the single-stranded state selected in step C1, is used as a saddle type, and the primer is extended once by using the single-stranded oligonucleotide (negative strand) as a primer.
  • a single-stranded oligonucleotide (negative) having a base sequence complementary to a part of the 3 ′ end of a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region and being in a free state A chain) is added to the reaction system (additional pre-process), and
  • Each of the third steps of the measurement method of the present invention further includes the following one step.
  • Step C 1 Extending the primer once, using the DNA in the single-stranded state selected in Step C 1 as a saddle and the single-stranded oligonucleotide (negative strand) as a primer.
  • a second step C (this step) having a second step C2 in which the DNA in the single-stranded state is elongated to form double-stranded DNA.
  • a single-stranded oligonucleotide (negative) having a base sequence complementary to a part of the 3 ′ end of a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region and being in a free state A double-stranded DNA that is an undigested product obtained through the first pre-process and the above-mentioned pre-addition process (additional process) in the reaction system.
  • DNA is once separated into a single-stranded state (additional re-preceding step), and each of the third steps of the measurement method of the present invention further includes the following one step. (Hereinafter, sometimes referred to as the methylation ratio measuring method of the present invention).
  • the DNA which is in the single-stranded state selected in step C1, is used as a saddle type, and the primer is extended once by using the single-stranded oligonucleotide (negative strand) as a primer.
  • the single-stranded oligonucleotide (negative strand) added to the reaction system in the pre-addition step is a part of the 3 ′ end of the single-stranded DNA (however, it does not include the target DNA region) If the base sequence is complementary to the single-stranded oligonucleotide having a base sequence that is the same as the single-stranded immobilized oligonucleotide at the 5 'end.
  • the base sequence may be the same as the single-stranded immobilized oligonucleotide, or may be a short base sequence, or a long base sequence.
  • the reverse primer positive strand
  • the single-stranded oligonucleotide negative strand
  • the immobilized oligonucleotide is used as a primer on one side.
  • PCR is performed by adding only the other primer, but other methods (for example, the amount of each amplification product obtained by PCR can be compared for detection of the target product).
  • Analysis method as described above, when amplifying the target region, do not use the immobilized oligonucleotide as one (one side) primer, and perform PCR by adding a pair of primers. May be. After performing such PCR, determine the amount of amplification product obtained.
  • the third step of the measurement method of the present invention has a repetition step.
  • “the generated single-stranded DNA (positive strand)” in the first step A 1 means the first third step.
  • DNA (negative strand) generated in the single-strand state” in Step B means both the first step of the third step and the second and subsequent third steps. This means “generated“ fixed ”single-stranded DNA (NA)”. If the third step has an additional C step, it means “generated (fixed) single-stranded DNA (positive strand)” in the first step of the third step. On the other hand, in the second and subsequent third-step repetitive operations, “generated“ fixed ”single-stranded DNA (positive strand)” and “generated“ free ”single-stranded state D "NA (positive chain)” means both.
  • the “stretched double-stranded DNA” obtained in each step of the third step refers to the “methylation described above” in the first step of the third step.
  • Step B the first step, the third step, and the second and subsequent third steps are repeated.
  • the present invention also includes a methylation ratio measurement method (ie, the methylation ratio measurement method of the present invention), which further comprises the following two steps as steps of the measurement method of the present invention.
  • the measuring method of the present invention After carrying out the first step of the measuring method of the present invention (including the above-mentioned modified method), the measuring method of the present invention (without including the second step of the measuring method of the present invention (including the modified method)) By performing the third step (including the above-mentioned modified method), the amount of DNA (total amount of methylated DNA and unmethylated DNA) in the target DNA region can be detected. And a fourth step of quantifying the amount of amplified DNA, and
  • the methylation ratio measuring method may be used in the following situations.
  • the measurement method of the present invention or the method of the present invention is used for the DNA region.
  • the amount of DNA that has been methylated will increase if the method for measuring the rate of methylation is performed.
  • the amount of methylated DNA shows a value close to 0 in the case of a healthy person, while In some cases, the value is significantly higher than the value in the case of a healthy person, so the “degree of disease” can be determined based on the difference between the values.
  • the “degree of disease” here has the same meaning as that generally used in this field. Specifically, for example, when the biological specimen is a cell, it means the malignancy of the cell.
  • the measurement method of the present invention or the methylation ratio measurement method of the present invention makes it possible to diagnose various diseases by examining methylation abnormality.
  • Restriction enzymes, primers or probes that can be used in various methods for measuring the amount of methylated DNA in the target region and measuring the methylation ratio in the measurement method of the present invention or the methylation ratio measurement method of the present invention. Is useful as a reagent for detection kits.
  • the present invention also provides a detection kit containing these restriction enzymes, primers or probes as reagents, and a detection chip in which these primers or probes are immobilized on a carrier.
  • the scope of rights of the measurement method or the methylation ratio measurement method of the present invention includes use in the form of the detection kit or the detection chip as described above using the substantial principle of the method. Example. EXAMPLES The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • Mammal colon adenocarcinoma cell line Caco-2 (ATCC NO. HT B-37), purchased from ATCC, until confluent in a dedicated medium for the cell lines listed in the ATCC catalog. By culturing, approximately 1 ⁇ 10 7 cells were obtained each. After adding 10 times volume of SEDTA buffer [10 mM Tris-HCl H 8.0, 10 mM EDTA H 8.0, lOOmM NaCl] to the obtained cells, this was homogenized.
  • DNA fragment X 2 a DNA fragment used as a test sample (hereinafter referred to as DNA fragment X 2; represented by SEQ ID NO: 18)
  • SEQ ID NO: 18 A sequence corresponding to base numbers 76477 to 77002 of the GPR 7 sequence shown in Genbank Accession No. AC009800 and the like was amplified.
  • PR3 5'-CGATGAGCTTGCACATGAGCT-3 '(SEQ ID NO: 20)
  • a primer solution consisting of 2.5 ng genomic DNA in the form of a cage and a base sequence represented by SEQ ID NO: 19 prepared in 3 M and a base represented by SEQ ID NO: 20
  • Primer solutions consisting of 2.5 and 1 each, 2.5 mM dNTP, 2.5 xl, and 10 X buffer (lOOmM Tris-HC1 pH 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl2 0.01% Gelatin) 2.
  • thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold, 5U / 1) were mixed with 0.1251, and sterilized ultrapure water was added to make the volume 25 25 1.
  • the reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 30 seconds, then at 59 ° C for 60 seconds, and at 72 at 45 seconds for 45 seconds. PCR was performed under the condition of 50 cycles.
  • DNA amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis.
  • the target DNA fragment (526 bp, DNA fragment X2) was excised and purified using QIAG EN QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). .
  • DNA fragment Y2 A portion of the resulting DNA fragment X2 was treated with methylase S ss I (NEB), and 5 'one CG-3, all of which were methylated (hereinafter referred to as DNA fragment Y2).
  • NEB methylase S ss I
  • DNA fragment Y2 5 'one CG-3, all of which were methylated
  • amplification was confirmed by 1.5% agarose electrophoresis, the DNA fragment (526 bp, DNA fragment Y2) was excised and purified using the QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). .
  • an oligonucleotide B 1 (80 bp) having a base sequence represented by SEQ ID NO: 21 and labeled with a biotin at the 5 ′ end was synthesized.
  • the pre-prepared mixture was added as described above, and this was incubated at 37 ° C for 5 minutes, so that the pyotinylated oligonucleotide was allowed to stand. It was fixed to a support coated with streptavidin (this corresponds to the first step of the measurement method of the present invention).
  • 10 O L of TE buffer was added, and then the TE buffer was removed by pipetting. This operation was performed twice more.
  • the double-stranded DNA thus obtained was subjected to the following two treatments.
  • Group A (untreated group): 1 OX buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc2, 5 mM Dithothreitol) suitable for Hpa II and Hha I. 3 ⁇ L and 10 ⁇ BSA (Bovine serum albumin lmg / ml) 3 ⁇ L, and sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 30 L.
  • 1 OX buffer 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc2, 5 mM Dithothreitol
  • BSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • Group B (digestion treated with Hpa II and HhaI): Optimal for Hpa II and Hha I, 15 U for Hpa II and Hha I, respectively, Mix 3 zL of 10 X buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc2, 5 mM Dithothreitol) and 3 L of 10'XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml), and then add the mixture. Sterile ultrapure water was added to the solution to adjust the volume to 30 ⁇ L.
  • 10 X buffer 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc2, 5 mM Dithothreitol
  • 10'XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • PR4 5'-GCGGAGTTGCCCGCCAGA-3 '(SEQ ID NO: 24)
  • the reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes, and then kept at 95 ° C for 30 seconds, then 59 ° C for 60 seconds, and then 72 ° C for 45 seconds for one cycle for 37 cycles. I did a PCR.
  • DNA fragment X2 As for DNA fragment X2, in the case of Group A (untreated group), amplification was confirmed and the amplification product was obtained. In contrast, in the case of Group B (HpaII, Hhal treatment group), no amplification was confirmed and no amplification product was obtained. On the other hand, the DNA fragment Y2 As a result, amplification was confirmed in both group A (no treatment group) and group B (HpaII, Hhal treatment group), and amplification products were obtained. From the above, it is possible to select single-stranded DNA containing the target DNA region, and methylation can be performed without amplifying unmethylated DNA in the target DNA region. It was confirmed that the amount of the amplified DNA can be quantified by amplifying the amplified DNA to a detectable amount. Example 2 The following test was conducted.
  • a serum solution was obtained by adding 1 mL of rat serum to a ratio of 1.
  • This serum solution (DNA fragment 25 pg / mL aqueous solution, 10 xL)
  • 1 M of 5 M Pyotinylated Oligonucleotide B 1 and annealing buffer 0.5 M Church phosphate buffer, 7% SDS, IfflM EDTA
  • the mixture was obtained by adding 10 L of an aqueous solution.
  • the resulting mixture was then heated at 95 ° C. for 5 minutes. After that, it was quickly cooled to 50 ° C and kept at that temperature for 5 minutes. Next, this is incubated at 37 ° C for 5 minutes, and then returned to room temperature.
  • the pre-prepared mixture was added as described above, and this was further incubated at 37 ° C for 5 minutes, so that the biotinylated oligonucleotide was obtained.
  • 10 OL TE buffer After adding one, the TE buffer was removed by pipetting. This operation was performed twice more.
  • the double-stranded DNA thus obtained was subjected to the following two treatments.
  • Group A (untreated group): 1 OX buffer (330 mM Tris-Acetate H 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc2, 5 mM) suitable for Hpa II and Hha I for the double-stranded DNA prepared above Add 3 L of Dithothreitol) and 3 L of 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml), and add sterilized ultrapure water to the mixture to make the volume 30 XL (preparation of 3 each) .
  • 1 OX buffer 330 mM Tris-Acetate H 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc2, 5 mM
  • XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • Group B (digestion group with Hpa II and Hha I): The above-prepared double-stranded DNA is optimal for H pa II and H ha I with 15 U and H pa II and H ha I, respectively.
  • Add 3 L of 10 X buffer 330m Tris-Acetate pH7.9, 660mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5mM Dithothreitol
  • 3L of 10XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • each of a primer solution consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23 and a primer solution consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 prepared in 3 M was added to the genomic DNA in the shape of a cage.
  • 2.5 1 and 2.5 mM dNTP each 2.5 1 and 10X buffer (lOOmM Tris-HCl H 8.3, 500 KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin)
  • the reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes, then kept at 95 ° C for 30 seconds, then at 63 ° C for 60 seconds, and then at 72 ° C for 45 seconds, with one cycle being 35 cycles.
  • PC R was done.
  • DNA fragment X2 in the case of Group A (untreated group), amplification was confirmed and the amplification product was obtained. In contrast, in the case of Group B (HpaII, Hhal treatment group), no amplification was confirmed and no amplification product was obtained. On the other hand, with respect to DNA fragment Y2, amplification was confirmed in both cases of group A (no treatment group) and group B (HpaII, Hhal treatment group), and an amplification product was obtained.
  • Example 3 The following test was conducted using the obtained in Example 1.
  • a single buffer solution (10 mM Tris, ImM EDTA, H 8.0) was prepared.
  • the resulting mixture was then heated at 95 ° C. for 5 minutes. After that, it was quickly cooled to 50 ° C and kept at that temperature for 5 minutes. This is then incubated at 37 ° C for 5 minutes, then returned to room temperature, and base-paired with a single-stranded DNA (DNA fragment X2 or DNA fragment Y2) containing the target DNA region and the pyotinylated oligonucleotide.
  • DNA fragment X2 or DNA fragment Y2 DNA fragment Y2
  • the pre-prepared mixture was added as described above, and the mixture was incubated at 37 ° C for 5 minutes, whereby the pyotinylated oligonucleotide was added. It was fixed to a support coated with streptavidin (this corresponds to the first step of the measurement method of the present invention).
  • 100 L of wash buffer 0.05% Tween20-containing phosphate buffer: ImM KH2P04, 3 mM Na2HP0 ⁇ 7H20, 15 mM NaCK pH 7.4
  • the washing buffer was removed by pipetting. The operation was performed twice more. Thereafter, the double-stranded DNA thus obtained was subjected to the following two types of treatment.
  • Group A (untreated group): 1 OX buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Dithothreitol) suitable for Hpa II and Hha I. ) And 10XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml) 3 L was added, and sterilized ultrapure water was further added to the mixture to make the volume 3 O ⁇ L.
  • 1 OX buffer 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Dithothreitol
  • 10XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • Group B (digestion group with Hpa II and Hha I): Optimal for the double-stranded DN A prepared above, H pa II and H ha I, 15 U, and H pa II and H ha I, respectively. Add 3 L of 10X buffer (330 mM Tris-Acetate pH7.9 660m K0Ac, lOOmM MgOAc2, 5 mM Dithothreitol) and 3 L of 10XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml), and sterilize the mixture. Ultrapure water was added to make the volume 30 L.
  • 10X buffer 330 mM Tris-Acetate pH7.9 660m K0Ac, lOOmM MgOAc2, 5 mM Dithothreitol
  • 10XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • PR4 5'-GCGGAGTTGCCCGCCAGA-3 '(SEQ ID NO: 24)
  • a primer solution consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23 prepared in 5 OM was added to the genomic DNA as a cage.
  • Primer solution consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 0.3 1 each, 2 mM dNTPs 5 1 each, 10 X buffer (lOOmM Tris-HCl H 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl 0.01% Gela tin) 5 1, thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5U / 1 1 0.2 5 1 and 5 N betaine aqueous solution 10 1 are mixed, and then sterilized ultrapure water is added to the solution. A 50 was used. Incubate the reaction solution at 95 ° C for 10 minutes, then heat at 32 ° C for 30 seconds, then at 59 ° C for 30 seconds, and then at 72 ° C for 45 seconds for one cycle. PCR was performed under conditions. After PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The results were as follows (this corresponds to the third step of the measurement method of the present invention).
  • DNA fragment X2 in the case of group A (untreated group), amplification was confirmed in the lpg / lOL sample and lOpgZlO ⁇ L sample, and the amplification product was obtained.
  • the target DN is obtained by base pairing with a single-stranded immobilized oligonucleotide having a base sequence that is complementary to the DNA region. It is possible to select single-stranded DNA containing A region, and amplify unmethylated DNA in the target DNA region by treatment with a methylation-sensitive restriction enzyme. It was confirmed that only the methylated DNA was amplified to a detectable amount, and the amount of amplified DNA could be quantified.
  • Example 2 The following test was performed using the DNA fragment X2 and the DNA fragment Y2 obtained in Example 1.
  • a pg / 10 L rat serum solution was prepared. Separately, each of these 10 solutions was prepared with 1 L, 10 X annealing buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Dithothreitol).
  • a mixture was obtained by adding 7 L of sterilized ultrapure water.
  • the resulting mixture was then heated at 95 ° C. for 5 minutes. After that, it was quickly cooled to 50 ° C and kept at that temperature for 5 minutes. This is then incubated at 37 ° C for 5 minutes, then returned to room temperature, and base-paired with a single-stranded DNA (DNA fragment X2 or DNA fragment Y2) containing the target DNA region and the pyotinylated oligonucleotide.
  • DNA fragment X2 or DNA fragment Y2 DNA fragment Y2
  • the pre-prepared mixture was added as described above, and this was incubated at 37 for 5 minutes to strep the pyotinylated oligonucleotide. Fixed to a support coated with avidin (this corresponds to the first step of the measurement method of the present invention). Then, after removing the solution from the PCR tube, add 100 L wash buffer (0.05 Tween20-containing phosphate buffer: ImM KH2P04, 3 mM Na2HP0-7H20> 1 54 mM NaC pH 7.4) and then wash The buffer was removed by pipetting. This operation was performed twice more. Thereafter, the double-stranded DNA thus obtained was subjected to the following two treatments.
  • wash buffer 0.05 Tween20-containing phosphate buffer: ImM KH2P04, 3 mM Na2HP0-7H20> 1 54 mM NaC pH 7.4
  • Group A (untreated group): 1 OX buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc2, 5 mM) suitable for Hpa II and Hha I to the double-stranded DNA prepared above 3 L of Dithothreitol) and L of 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml) were added, and sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 3.
  • 1 OX buffer 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc2, 5 mM
  • XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • Group B (digestion treated with Hpa II and HhaI): Optimal for Hpa II and Hha I, 15 U for Hpa II and Hha I, respectively, Add 3 L of 10 X buffer (330 mM Tris-Acetate pH7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Dithothreitol) and 3 L of 10XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml), and sterilize the mixture. Ultrapure water was added to make the volume 30 L.
  • 10 X buffer 330 mM Tris-Acetate pH7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Dithothreitol
  • 10XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • PR4 5'-GCGGAGTTGCCCGCCAGA-3 '(SEQ ID NO: 24)
  • 5 1 and thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5U / l 0 25 1 and 5 1 betaine aqueous solution 10 1 were mixed, and sterilized ultrapure water was added thereto to make the volume 50 a 1.
  • the reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes, then kept at 95 ° C for 30 seconds, then at 59 ° C for 30 seconds, and further at 72 ° C for 45 seconds for 32 cycles.
  • PC R was done.
  • Mammal breast cancer cell line MC F-7 (ATCC NO. HTB-22), purchased from AT CC, is cultured until confluent in the dedicated medium for the cell line described in the AT CC catalog. As a result, about 1 ⁇ 10 7 cells were obtained. After adding 10 times volume of S EDTA buffer [lOmM Tris-HCl pH 8.0, lOmM EDTA H 8.0, lOOmM NaCl] to the obtained cells, it was homogenized. After adding proteinase K (Sigma) to 500 g Zm1 and sodium dodecyl sulfate to 1% (w / v) to the obtained mixture, this was shaken at 55 ° C for about 16 hours.
  • S EDTA buffer [lOmM Tris-HCl pH 8.0, lOmM EDTA H 8.0, lOOmM NaCl]
  • the mixture was subjected to phenol [saturated with 1M Tris-HCK pH 8.0] and black mouth form extraction.
  • the aqueous layer was recovered, and NaCl was added to 0.5 N to this, and then this was precipitated with ethanol and the resulting precipitate was recovered.
  • the extract was processed by ru-clo mouth form.
  • DNA fragment XI shown in SEQ ID NO: 25
  • SEQ ID NO: 17 region corresponding to base numbers 257 to 352 of the LINE1 sequence shown in Genbank Accession No. M80343, etc.
  • the PCR reaction solution consists of 2 ng of genomic DNA to be a cage and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26 prepared in lOO pmo lZ H 1 Primer solution and primer solution consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 0.125 1 each, 2 mM dNTP 2.5 1 and 10 X buffer (lOOmM Tris-HC1 pH 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 2.5 1 and heat resistant DNA
  • Polymerase 5UZ i 1 was mixed with 0.125 1 and sterilized ultrapure water was added to make the volume 25 a 1. Incubate the reaction solution at 95 ° C for 10 minutes, then heat at 95 ° C for 30 seconds, then at 63 ° C for 60 seconds, and at 72 ° C for 45 seconds for one cycle for 50 cycles. PCR was performed under conditions.
  • DNA fragment X 1 was treated with methylase S ss I (NEB), and all 5—CG-3 ′ was methylated (hereinafter referred to as DNA fragment). Gmentment Yl). Again, as before, confirm amplification by 1.5% agarose gel electrophoresis, cut out the desired DNA fragment (473 bp, DNA fragment Y1), and use the QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Purified. A mixture of ragment and unmethylated fragment was prepared. table 1
  • Group A (untreated group): About 25 ng of DNA fragment, 2 OX buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOniM Mg0Ac2, 5 mM Dithothreitol) optimal for Hpa II and Hha I; (iL and 10 L of 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml) were added to 2 L, and sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 20 L.
  • 10 XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • Group B (Hpall treatment group): About 25 ng of DNA fragment, 0.5 U of Hpa II, 10 X buffer solution suitable for Hpa II and Hha I (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, Add 2 L of lOOmM MgOAc2, 5 mM Dithothreitol) and 2 L of 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml), and add sterile ultrapure water to the mixture. The liquid volume was adjusted to 20 L.
  • Group C Hhal treatment group: About 25 ng of DNA fragment, 0.5 U of Hh a I, and 10 X buffer solution suitable for H pall and Hha I (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc2 5 mM Dithothreitol) and 2X of 10XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml) were added, and sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 20 x L.
  • 10XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • Group D (Hpall and ffiial treatment group): Approximately 25 ng of DN A fragment, 0.5 U of Hp al I and Hh a I, and 10 X buffer (330 mM Tris- optimal for Hp a II and Hh a I, respectively) Add 2 L of Acetate ⁇ 9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc2, 5 mM Dithothreitol) and 2 L of 10XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml), and add sterilized ultrapure water to the mixture. 20 L. Each reaction solution was incubated at 37 ° C for 2 hours, and then sterilized ultrapure water was added thereto to dilute it 100 times.
  • XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • a primer solution consisting of 62.5 pg of the DNA fragment of the vertical type and the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 prepared in 3 pm o ⁇ / H 1 and the base represented by SEQ ID NO: 29
  • Two primer solutions consisting of two sequences, 2.5 PL 1 and 2.5 pmo 1 Z / L, and a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30, 2.5 L, each 2 mM DNTP 2.5 1 and 10X PCR buffer (lOOmM Tris-HCl H 8.3, 500 mM KC1, 15 ⁇ MgCl 0.01% Gelatin) 2.5 ⁇ 1 and thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5U / 1 was mixed with 0.125 1 and sterilized ultrapure water was added to make the volume 25 ii 1.
  • Real-time PCR was performed using the Gene Amp 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). To amplify a region (DNA) consisting of the base sequence represented by base numbers 1 to 94 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 17. The reaction solution was incubated at 95 ° C for 10 minutes, and then subjected to real-time PC R with 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 60 seconds as one cycle. Based on the results, the amount of DNA in this region was quantified.
  • the amount of DNA in the region in Group A was taken as 1, and the amount of DNA in the region in other groups was shown.
  • Figure 7 (“I”) is a fragment mixture with a methylation rate of 0%, so the theoretical values for Group B, Group C, and Group D are “0”, and FIG. 8 (“I IJ” is methylation). Since the fragments are 10% fragments, the theoretical values in groups B, C and D are “0.1” and Figure 9 (“III”) is a fragment with a methylation ratio of 25%. The theoretical values for Group B, Group C, and Group D are “0.25” and FIG. 10 (“IV”) is a fragment with a methylation rate of 50%.
  • Oligonucleotide probes designed for real-time PCR designed for real-time PCR

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Abstract

本発明は、生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法等に関する。

Description

明細書
DNAメチル化測定方法 技術分野
本発明は、生物由来検体に含まれるゲノム DN A中の目的とする DN A領域におけ るメチル化された D N Aの含量を測定する方法等に関する。 背景技術
生物由来検体に含まれるゲノム DN A中の目的とする DN A領域における DN A のメチル化状態を評価するための方法としては、例えば、ゲノム DNA中の目的とす る D N A領域におけるメチル化された D N Aの含量を測定する方法がある （例えば、 Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11 ;22 (15) :2990-7, 及び Proc Natl Acad Sci U S A . 1997 Mar 18;94(6) :2284-9参照） 。 当該測定方法では、 まず、 ゲノム DNA由来 の DNA試料から、 目的とする DNA領域を含む DNAを抽出する必要があり、抽出 操作が煩雑である。
また、抽出された D N Aの目的領域におけるメチル化された D N Aの含量を測定す る方法としては、 例えば、 （1)亜硫酸塩等を用いて当該 DNAを修飾した後、 DN Aポリメラーゼによる DNA合成の連鎖反応 （Polymerase Chain Reaction；以下、 PCRと記すこともある。 ) に供することにより目的領域を増幅する方法、 （2) メ チル化感受性制限酵素を用いて当該 DN Aを消化した後、 PC Rに供することにより 、 目的領域を増幅する方法等が知られている。 これらのいずれの方法とも、 メチル化 の検出のための DN Aの修飾及びその後の生成物の精製、 PC Rのための反応系の調 製、 DN Aの増幅の確認等に手間を要する。 発明の開示
本発明は、生物由来検体に含まれるゲノム DN A中の目的とする DN A領域におけ るメチル化された DNA.の含量を簡便に測定する方法等を提供することを目的とす る。 即ち、 本発明は、
1.生物由来検体中に含まれるゲノム DNAが有する目的とする DNA領域における メチル化された D N Aの含量を測定する方法であつて、
(1)生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料から、 目的とする D N A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） と、 当該一本鎖 DN Aの目的とする DN A領域 に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基 対合させることにより、前記の一本鎖 DNAを選択し、選択された一本鎖 DNAと前 記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとが塩基対合してなる二本鎖 DN Aを形成さ せる第一工程、
(2)第一工程で形成させた二本鎖 D N Aを 1種類以上のメチル化感受性制限酵素で 消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位 に 1つ以上のアンメチル状態の C p G対を含む二本鎖 DNA) を除去する第二工程、 及び、
(3)下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である形成され た二本鎖 DN A (前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態の Cp G対を含まない形成された二本鎖 DNA) を一本鎖状態に一旦分離する工程（第一前 工程） と、
生成した遊離の一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 前記の一本鎖固定化オリゴヌク レオチドとを塩基対合させることにより、前記の生成した遊離'の一本鎖状態である D N Aを選択し、選択された一本鎖 D N Aと前記の一本鎖固定化ォリゴヌクレオチドと が塩基対合してなる二本鎖 DNAを形成させる工程 （第二 （A) 前工程） と、 当該工程 （第二 （A) 前工程） で形成された二本鎖 DNAを、 前記の選択された一本 鎖 DN Aを铸型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして 、 当該プライマ一を 1回伸長させることにより、前記の選択された一本鎖 DN Aを伸 長形成された二本鎖 DN Aとする工程 （第二 （B) 前工程） と
を有する工程 （第二前工程） と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖 DN A (前記のメチル化感受性制限酵素の認識部 位にアンメチル状態の CpG対を含まない伸長形成された二本鎖 DNA)を、一本鎖 状態である DNA (正鎖） と一本鎖状態である DNA (負鎖） に一旦分離する工程 （ 第三前工程） とを有し、 且つ、 本工程として
(a)生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 前記の一本鎖固定化オリゴヌク レオチド （負鎖） とを塩基対合させることにより、前記の一本鎖状態である DNAを 選択する第 A 1工程と、第 A 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型とし て、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマ一として、当該プライマーを 1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態である D N Aを二本鎖 D N Aとして伸 長形成させる第 A 2工程とを有する第 A工程 （本工程） と、
(b) 生成した一本鎖状態である DNA (負鎖） を铸型として、 前記の一本鎖状態で ある DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記 の目的とする DNA領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基配列 （負鎖） の 3' 末端よりさらに 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対して相補性 である塩基配列 （正鎖） を有し、 且つ、 前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドを铸 型とする伸長反応に利用できないオリゴヌクレオチド（リバース用プライマー）を伸 長プライマーとして、当該オリゴヌクレオチドを 1回伸長させることにより、前記の 一本鎖状態である DNAを伸長形成された二本鎖 DNAとする第 B工程（本工程） と を有し、
さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖 DN A を一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とする DNA領域 におけるメチル化された D N Aを検出可能な量になるまで増幅し、増幅された D N A の量を定量する第三工程、
を有することを特徴とする方法 （以下、 本発明測定方法と記すこともある。 ） ；
2. 第一工程において、 目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） と、 当該 一本鎖 DN Aの目的とする DN A領域に対して相補性である塩基配列を有する一本 鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させる際に、二価陽イオンを含有する反応 系中で塩基対合させることを特徴とする前項 1記載の方法；
3.二価陽イオンがマグネシウムイオンであることを特徴とする前項 2記載の方法；
4. 前項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の第一前工程の前操作段階において、 前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3'末端の一部に対して 相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
前項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の各本工程として、下記の 1つの工程をさら に追加的に有することを特徴とする方法；
(c) (i) 生成した 本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反応 系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖） とを塩基対合させることにより 、 前記の一本鎖状態である DN Aを選択する第 C 1工程と、
( i i)'第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、前記の一本 鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 当該プライマ一を 1回伸長させ ることにより、前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成された二本鎖 D N Aとする 第 C 2工程とを有する第 C工程 （本工程） ；
5. 前項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の第一前工程の後操作段階において、 前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3'末端の一部に対して 相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、 第二工程及び上記 の追加前工程を経て得られた未消化物である二本鎖 D N A (前記のメチル化感受性制 限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を含まない伸長形成された二本鎖 D NA) を一本鎖状態に一旦分離する工程 （追加再前工程） を有し、 且つ、
前項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の各本工程として、下記の 1つの工程をさら に追加的に有することを特徴とする方法（以下、本発明メチル化割合測定方法と記す こともある。 ）
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反応 系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖） とを塩基対合させることにより 、 前記の一本鎖状態である DNAを選択する第 C 1工程と、
(i i)第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、前記の一本 鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマ一として、 当該プライマーを 1回伸長させ ることにより、前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成された二本鎖 D N Aとする 第 C 2工程とを有する第 C工程 （本工程） ；
6. 前項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の第三前工程の前操作段階において、 前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3'末端の一部に対して 相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖ォリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
前項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の各本工程として、下記の 1つの工程をさら に追加的に有することを特徴とする方法；
(c) ( i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反応 系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖） とを塩基対合させることにより 、 前記の一本鎖状態である DNAを選択する第 C 1工程と、
(i i)第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、前記の一本 鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマ一として、 当該プライマ一を 1回伸長させ ることにより、前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成された二本鎖 D N Aとする 第 C 2工程とを有する第 C工程 （本工程） ；
7. 前項 1〜3のいずれかに記載の第三工程の第三前工程の後操作段階において、 ' 前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3'末端の一部に対して 相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、 第二工程及び上記 の追加前工程を経て得られた未消化物である二本鎖 D N A (前記のメチル化感受性制 限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を含まない伸長形成された二本鎖 D NA) を一本鎖状態に一旦分離する工程 （追加再前工程） を有し、 且つ、
前項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の各本工程として、下記の 1つの工程をさら に追加的に有することを特徴とする方法；
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反応 系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖） とを塩基対合させることにより 、 前記の一本鎖状態である DN Aを選択する第 C 1工程と、
( 1 i)第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、前記の一本 鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマ一として、 当該プライマーを 1回伸長させ ることにより、前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成されたニ本鎖 D N Aとする 第 C 2工程とを有する第 C工程 （本工程） ；
8.前項 1〜7のいずれかに記載の方法の工程として、下記の 2つの工程をさらに追 加的に有することを特徴とするメチル化割合の測定方法。
(4)前項 1〜7のいずれかに記載の方法の第一工程を行った後、前項 1〜8のいず れかに記載の方法の第二工程を行うことなく、前項 1〜 7のいずれかの項記載の方法 における第三工程を行うことにより、前記の目的とする DNA領域の DNA (メチル 化された D N A及びメチルされていない D N Aの総量）を検出可能な量になるまで増 幅し、 増幅された DN Aの量を定量する第四工程、 及び、
(5)前項 1〜7のいずれかに記載の第三工程により定量された DN Aの量と、第四 工程によ 定量された DN Aの量とを比較することにより得られる差異に基づき前 記の目的とする DN A領域におけるメチル化された DN Aの割合を算出する第五ェ 程；
9.生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする前項 1〜8の いずれかに記載の方法；
10.生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする前項 1〜8 のいずれかに記載の方法；
11.生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする前項 1〜 8のいずれかに記載の方法；
12. 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、当該ゲノム DN Aが有する目的とする DNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理 されてなる DNA試料であることを特徴とする前項 1〜11のいずれかに記載の方 法；
13. 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 1種類以上のメ チル化感受性制限酵素で消化処理されてなる DN A試料であることを特徴とする前 項 1〜 12のいずれかに記載の方法；
14. 生物由来検体中に含まれるゲノム DN A由来の DN A試料が、予め精製されて なる DNA試料であることを特徴とする前項 1〜13のいずれかに記載の方法； 15. 1種類以上のメチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノム D N Aが有する目的とする D N A領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であるこ とを特徴とする前項 1〜12のいずれかに記載の方法；
16. 1種類以上のメチル化感受性制限酵素が、 メチル化感受性制限酵素である Hpa II又は Hhalであることを特徴とする前項 1〜14のいずれかに記載の方法； 等を提供するものである。
図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1において、 調製されたサンプルに、 「A (無処理） 」 又は 「B ( Hpall及び Hhal同時処理） 」 のいずれかの処理を施し、 配列番号 22で示された塩基 配列からなる領域におけるメチル化された D N Aを P C Rにて増幅し、得られた増幅 産物を 1. 5 %ァガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。 図中の一番左 のレーンから、 DNAフラグメント X2の 「AJ処理が施されたサンプル、 DNAフ ラグメント X2の 「B」 処理が施されたサンプル、 DNAフラグメント Y2の 「A」 処理が施されたサンプル、 DNAフラグメント Y2の「B」処理が施されたサンプル での結果を示している。
図 2は、 実施例 2において、 調製されたサンプルに、 「A (無処理） 」 又は 「B ( Hpall及び Hhal同時処理） 」 のいずれかの処理を施し、 配列番号 22で示された塩基 配列からなる領域におけるメチル化された D N Aを P C Rにて増幅し、得られた増幅 産物を 1. 5 %ァガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。 図中の一番左 のレーンから、 DNAマ一カー 「M」 、 DNAフラグメント Y 2の 「A」 処理が施さ れたサンプル 1、 DNAフラグメント Y2の 「A」処理が施されたサンプル 2、 DN Aフラグメント Y2の「AJ処理が施されたサンプル 3、 DNAフラグメント Y2の 「B」処理が施されたサンプル 1、 DNAフラグメント Y2の 「B」処理が施さ ήた サンプル 2、 DNAフラグメント Υ2の 「Β」処理が施されたサンプル 3、 DNAフ ラグメント X 2の 「Α」処理が施されたサンプル 1、 DNAフラグメント Χ2の 「Α 」処理が施されたサンプル 2、 DN Αフラグメント X 2の 「A」処理が施されたサン プル 3、 DNAフラグメント X2の 「B」 処理が施されたサンプル 1、 DNAフラグ メント X 2の 「B」 処理が施されたサンプル 2、 DNAフラグメント X2の 「B」 処 理が施されたサンプル 3、 での結果を示している。
図 3は、 実施例 3において、調製された DNAフラグメント X 2のサンプルに、 「 A (無処理） 」 又は 「B (Hpall及ぴ ¾halの同時処理） 」 のいずれかの処理を施し、 配列番号 22で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化された D N Aを P CRにて増幅し、得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示 した図である。 図中の一番左のレーンは、 DNAマーカー 「M」 を示す。 A及び B群 についてはそれぞれ左から、 1 OpgDN Aフラグメント X2/mLTEバッファ一溶液 のサンプル 「1」 、 lpgDN Aフラグメント X2/mLTEバッファー溶液の 「サンプ ル 「2」 、 0. lpgDN Aフラグメント X2/mLTEバッファ一溶液のサンプル 「3 」 、 OpgDNAフラグメント X2/mLTEバッファ一溶液のサンプル 「4」 、 での結 果を示している。
図 4は、 実施例 3において、調製された DNAフラグメント Y 2のサンプルに、 「 A (無処理） 」 又は 「B (Hpall及び halの同時処理） 」 のいずれかの処理を施し、 配列番号 22で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化された D N Aを P CRにて増幅し、得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示 した図である。 図中の一 左のレーンは、 DNAマーカ一 「M」 を示す。 A及び B群 についてはそれぞれ左から、 1 OpgDNAフラグメント Y2/mLTEバッファ一溶液 のサンプル 「1」 、 lpgDNAフラグメント Y2/mLTEバッファー溶液のサンプル 「2」 、 0. lpgDNAフラグメント Y2/mLTEバッファー溶液のサンプル 「3」 、 OpgDNAフラグメント Y2/mLTEバッファ一溶液のサンプル 「4」 、 での結果 を示している。
図 5は、実施例 4において、調製された DNAフラグメント X 2のサンプルに、 「 A (無処理） 」 又は 「B (Hpall及び halの同時処理） 」 のいずれかの処理を施し、 配列番号 22で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化された DNAを P CRにて増幅し、得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示 した図である。 図中の一番左のレーンは、 DNAマーカ一 「M」 を示す。 A及び B群 についてはそれぞれ左から、 1 OpgDNAフラグメント X2/mLラット血清溶液のサ ンプル 「1」 、 lpgDNAフラグメント X2/mLラット血清溶液のサンプル 「2」 、 0. lpgDNAフラグメント X2/mLラット血清溶液のサンプル 「3」 、 OpgDNA フラグメント X2/mLラット血清溶液のサンプル 「4」 、 での結果を示している。 図 6は、実施例 4において、 調製された DNAフラグメント Y2のサンプルに、 「 A (無処理） 」 又は 「B (Hpall及ぴ halの同時処理） 」 のいずれかの処理を施し、 配列番号 22で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化された D N Aを P CRにて増幅し、得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示 した図である。 図中の一番左のレ一ンは、 DNAマ一カー 「M」 を示す。 A及び B群 についてはそれぞれ左から、 1 OpgDNAフラグメント Y2/mLラット血清溶液のサ ンプル 「1」 、 lpgDNAフラグメント Y2/mLラット血清溶液のサンプル 「2」 、 0. lpgDNAフラグメント Y2/mLラット血清溶液のサンプル 「3」 、 OpgDNA フラグメント Y2/mLラット血清溶液のサンプル 「4」 、 での結果を示している。 図 7は、 実施例 5において、 調製されたサンプル 「 （I) 」 に、 「A (無処理） 」 、 「B (Hpall処理） 」 、 「C (Hhal処理） 」 又は 「D (Hpall及ぴ ¾halの同時処理） 」のいずれかの処理を施し、配列番号 17で示された塩基配列からなる領域における メチル化された D N Aの量をリアルタイム P C Rにて測定した結果を示した図であ る。 図中の縦軸は、 「A」処理が施されたサンプルでの DNAの量を 1とした場合 の相対値を示している （3回の平均値土標準偏差） 。 また、 理論値とは、 B群、 C群 、 D群で予想される計算値 （メチル化割合） を示している。
図 8は、 実施例 5において、 調製されたサンプル 「 （I I) 」 に、 「A (無処理） 」 、 「B (Hpall処理） 」 、 「C (fflial処理） 」 又は 「D (Hpall及ぴ¾11&1の同時処理 )」 のいずれかの処理を施し、配列番号 17で示された塩基配列からなる領域におけ るメチル化された D N Aの量をリアルタィム P C Rにて測定した結果を示した図で ある。 図中の縦軸は、 「A」処理が施されたサンプルでの DNAの量を 1とした場 合の相対値を示している （3回の平均値土標準偏差） 。 また、 理論値とは、 B群、 C 群、 D群で予想される計算値 （メチル化割合） を示している。
図 9は、 実施例 5において、 調製されたサンプル 「 （I I I) 」 に、 「A (無処理 ) 」 、 「B (Hpall処理） 」 、 「C (Hhal処理） 」 又は 「D (Hpall及び ¾halの同時処 理）」 のいずれかの処理を施し、配列番号 1 7で示された塩基配列からなる領域にお けるメチル化された D NAの量をリアルタイム P C Rにて測定した結果を示した図 である。
図中の縦軸は、 「A」処理が施されたサンプルでの D NAの量を 1とした場合の相 対値を示している （3回の平均値士標準偏差） 。 また、 理論値とは、 B群、 C群、 D 群で予想される計算値 (メチル化割合) を示している。
図 1 0は、 実施例 5において、 調製されたサンプル 「 （I V) 」 に、 「A (無処理 ) 」 、 「B (Hpal l処理） 」 、 「C (Hhal処理） 」 又は 「D (Hpal l及ぴ ¾halの同時処 理）」 のいずれかの処理を施し、配列番号 1 7で示された塩基配列からなる領域にお けるメチル化された D NAの量をリアルタイム P C Rにて測定した結果を示した図 である。 図中の縦軸は、 「A」処理が施されたサンプルでの D NAの量を 1とした 場合の相対値を示している （3回の平均値土標準偏差） 。 また、 理論値とは、 B群、 C群、 D群で予想される計算値 （メチル化割合） を示している。
図 1 1は、 実施例 5において、 調製されたサンプル 「 （V) 」 に、 「A (無処理） 」 、 「B (Hpal l処理） 」 、 「C (Hlial処理） 」 又は 「D (Hpal l及ぴ ¾halの同時処理 )」 のいずれかの処理を施し、配列番号 1 7で示された塩基配列からなる領域におけ るメチル化された D N Aの量をリアルタイム P C Rにて測定した結果を示した図で ある。
図中の縦軸は、 「A」処理が施されたサンプルでの D NAの量を 1とした'場合の相 対値を示している （3回の平均値土標準偏差） 。 また、 理論値とは、 B群、 C群、 D 群で予想される計算値 （メチル化割合） を示している。 発明を実施するための形態
本発明における 「生物由来検体」 としては、 例えば、 細胞溶解液、 組織溶解液 （こ こでの組織とは、 血液、 リンパ節等を含む広義の意味である。 ） 若しくは、 哺乳動物 においては、 血漿、 血清、 リンパ液等の体液、 体分泌物 （尿や乳汁等） 等の生体試料 及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノム D N Aをあげることができる。また 当該生物由来検体としては、 例えば、 微生物、 ウィルス等由来の試料もあげられ、 こ の場合には、 本発明測定方法における 「ゲノム DNA」 とは、 微生物、 ウィルス等の ゲノム DNAを意味する。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発 明測定方法の利用が期待できる。
ゲノム DNAを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば、市販の DNA抽出用キ ット等を用いて DNAを抽出すればよい。
血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調 製し、調製された血漿又は血清を検体として、 その中に含まれる遊離 DNA (胃癌細 胞等の癌細胞由来の DN Aが含まれる）を分析すると、血球由来の DN Aを避けて胃 癌細胞等の癌細胞由来の DNAを解析することができ、 胃癌細胞等の癌細胞、それを 含む組織等を検出する感度を向上させることができる。 通常、 遺伝子（ゲノム DNA) を構成する塩基は 4種類である。 これらの塩基のう ち、 シトシンのみがメチル化されるという現象が知られており、 このような DNAの メチル化修飾は、 5' -CG- 3 ' で示される塩基配列 (Cはシトシンを表し、 Gは グァニンを表す。 以下、 当該塩基配列を 「CpG」 と記すこともある。 ） 中のシトシ ンに限られている。 シトシンにおいてメチル化される部位は、その 5位である。細胞 分裂に先立つ DNA複製に際して、複製直後は铸型鎖の「CpG」 中のシトシンのみ がメチル化された状態となるが、 メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖の「C pG」 中のシトシンもメチル化される。従って、 DNAのメチル化の状態は、 DNA 複製後も、新しい 2組の DN Aにそのまま引き継がれることになる。本発明における 「メチル化された DNA」 とは、 このようなメチル化修飾により生じた DNAを意味 するものである。
本発明における 「CpG対」 とは、 CpGで示される塩基配列と、 これに相補する Cp Gが塩基対合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。 本発明における 「目的とする DNA領域」 （以下、 目的領域と記すこともある。 ） は、当該領域に含まれるシトシンのメチル化有無を調べようとする DNA領域であつ て、 少なくとも 1種類のメチル化感受性制限酵素の認識部位を有する。 例えば、 Lys yl oxidase, HRAS-like suppresso bA305P22.2. K Gamma f ilamin, HAND Homol ogue of RIKEN 2210016F16, FLJ32130, PPARG angiopoietin-related protein, Thr ombomoduliiu p53- responsive gene 2、 Fibrillin2、 Neurof ilament3> disintegrin and metal loproteinase domain 23、 G protein-coupled receptor 7、 G protein co up led somatostatin and angiotensin - like peptide receptor. Solute carrier fa mily 6 neurotransmitter transporter 直 adrenalin member 2等の有用タンノ ク質 遺伝子のプロモータ一領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域） の塩基配 列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシンを一つ以上含む DN Aの領 域等を挙げることができる。 具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が Lysyl oxidase遺伝子である場合には 、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域） の塩基配列 中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、ヒ卜由来 の Lysyl oxidase遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモータ一領域 とが含まれるゲノム DNAの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番 号 1で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AF270645に記載される塩基配列の 塩基番号 16001〜18661で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号 1 で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Lysyl oxidaseタンパク質のァミノ末端 のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2031〜2033に示されており、 上記 ェクソン 1の塩基配列は、塩基番号 1957〜2661に示されている。配列番号 1で示され る塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号 1で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中の シトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、 高メチ ル化状態 （hypemethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチ ル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 1で示される塩基配列において 、 塩基番号 1539、 1560、 1574、 1600、 1623、 1635、 1644、 1654、 1661、 1682、 1686 、 1696、 1717、 1767、 1774、 1783、 1785、 1787、 1795等で示されるシトシンを挙げる ことができる。 また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が HRAS-1 ike suppres sor遺伝子であ る場合には、 そのプロモータ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列として は、 ヒト由来の HRAS- l ike suppressor遺伝子のェクソン 1と、 その 5 '上流に位置す るプロモー夕一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、より 具体的には、 配列番号 2で示される塩基配列 （Genbank Acces s i on No. AC068162に記 載される塩基配列の塩基番号 172001〜173953で示される塩基配列に相当する。 )があ げられる。 配列番号 2で示される塩基配列においては、 ヒト由来の HRAS-l ike suppr essor遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1743〜1953に示されている。 配列 番号 2で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、と りわけ配列番号 2で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在 する C p G中のシトシンは、例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 (即ち、 高メチル化状態 （hypermethyl at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細 胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 2で示される塩 基配列において、 塩基番号 1316、 1341、 1357、 1359、 1362、 1374、 1390、 1399、 140 5、 1409、 1414、 1416、 1422、 1428、 1434、 1449、 1451、 1454、 1463、 1469、 1477、 1 479、 1483、 1488、 1492、 1494、 1496、 1498、 1504、 1510、 1513、 1518、 1520等で示 されるシ卜シンをあげることができる。 また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、 bA305P22. 2. 1遺伝子である場合 には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基 配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、ヒト 由来の bA305P22. 2. 1遺伝子のェクソン 1と、その 5 '上流に位置するプロモータ一領 域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列 番号 3で示される塩基配列 （Genbank Acces s i on No. AL121673に記載される塩基配列 の塩基番号 13001〜13889で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号 3で示される塩基配列においては、ヒト由来の bA305P22. 2. 1タンパク質のァミノ末端 のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 849〜851に示されており、 上記ェ クソン 1の塩基配列は、塩基番号 663〜889に示されている。配列番号 3で示される塩 基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号 3で 示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシト シンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、 高メチル化 状態 (hypermethyl at ion) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチル化 頻度が高いシトシンとしては、 例えば、配列番号 3で示される塩基配列において、塩 基番号 329、 335、 337、 351、 363、 373、 405、 424、 427、 446、 465、 472、 486等で示 されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Gamma f i l amin遺伝子である場 合には、 そのプロモー夕一領域、 非翻訳領域又は翻訳領摔（コーディング領域） の塩 基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、ヒ ト由来の Ga匪 a f i l amin遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモータ —領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 4で示される塩基配列 （Genbank Access i on No. AC074373に記載される塩基 配列の塩基番号 63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 )があげ られる。 配列番号 4で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Gamma f i l aminタン パク質のアミノ末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 572〜574に示 されており、 上記ェクソン 1の塩基配列は、塩基番号 463〜863に示されている。配列 番号 4で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、と りわけ配列番号 4で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在 する C p G中のシトシンは、例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 (即ち、 高メチル化状態 （hypermethyl at ion) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細 胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 4で示される塩 基配列において、 塩基番号 329、 333、 337、 350、 353、 360、 363、 370、 379、 382, 3 84、 409、 414、 419、 426、 432、 434、 445、 449、 459、 472、 474、 486、 490、 503、 5 05等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 HAND1遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域） の塩基配列中 に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、ヒト由来の HAND1遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモータ一領域とが含まれ るゲノム DNAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、配列番号 5で示さ れる塩基配列 （Genbank Accession No. AC026688に記載される塩基配列の塩基番号 24 303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。） があげられる。配列番号 5で示される塩基配列においては、 ヒト由来の HAND1タンパク質のァミノ末端のメチ ォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 1656〜1658に示されており、 上記ェクソ ン 1の塩基配列は、塩基番号 1400〜2198に示されている。配列番号 5で示される塩基 配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号 5で示 される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシ ンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、 高メチル化状 態 (hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチル化頻 度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 5で示される塩基配列において、塩基 番号 1153、 1160、 1178, 1187、 1193、 1218、 1232、 1266、 1272、 1292、 1305、 1307 、 1316、 1356、 1377、 1399、 1401、 1422、 1434等で示されるシトシンをあげることが できる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Homologue of RIKEN 2210016F 16遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域（コ一デ ィング領域）の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基 配列としては、 ヒト由来の Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のェクソン 1と、 その 5 '上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム DNAの塩基配列をあ げることができ、 より具体的には、 配列番号 6で示される塩基配列 （Genbank Acces sion NO.AL354733に記載される塩基配列の塩基番号 157056~159000で示される塩基 配列の相補的塩基配列に相当する。 )があげられる。配列番号 6で示される塩基配列 においては、 ヒト由来の Homo l ogue o f RIKEN 2210016F16遺伝子のェクソン 1の塩基 配列は、塩基番号 1392〜1945に示されている。配列番号 6で示される塩基配刿中に存 在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号 6で示される塩基 配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシ卜シンは、例えば 、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hyperme thyl at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシ トシンとしては、 例えば、 配列番号 6で示される塩 配列において、 塩基番号 1 172 、 1175、 1 180、 1183、 1189、 1204、 1209、 1267、 1271、 1278、 1281、 1313、 1319、 1 332、 1334、 1338、 1346、 1352、 1358、 1366、 1378、 1392、 1402、 1433、 1436、 1438 等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、 FLJ32130遺伝子である場合には 、 そのプロモ一夕一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列 中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、ヒト由来 の FLJ32130遺伝子のェクソン 1と、その 5 '上流に位置するプロモータ一領域とが含 まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号 7で 示される塩基配列 （Genbank Acces s i on No. AC002310に記載される塩基配列の塩基番 号 1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。 ) があげられる。 配列 番号 7で示される塩基配列においては、ヒト由来の FU 32130タンパク質のアミノ酸末 端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2136〜2138に示されており、 上 記ェクソン 1と考えられる塩基配列は、塩基番号 2136〜2379に示されている。配列番 号 7で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、とり わけ配列番号 7で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在す る C p G中のシトシンは、例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（ 即ち、 高メチル化状態 (hyperme thyl at i on) ) を示す。 さらに具体的にほ、 胃癌細胞 においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 7で示される.塩基 配列において、 塩基番号 1714、 1716、 1749、 1753、 1762、 1795、 1814、 1894、 191 1 1915、 1925、 1940、 1955、 1968等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 PPARG angiopoietin- related protein遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （ コーディング領域）の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含 む塩基配列としては、ヒト由来の PPARG angiopoietin- related protein遺伝子のェク ソン 1と、その 5'上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム DNAの塩 基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号 8で示される塩基配列があげ られる。 配列番号 8で示される塩基配列においては、 ヒト由来の PPARG angiopoieti n- related proteinタンパク質のァミン末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 717〜719に示されており、 上記ェクソン 1の 5 '側部分の塩基配列は、塩基 番号 1957〜2661に示されている。配列番号 8で示される塩基配列中に存在する CpG で示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号 8で示される塩基配列において CpGが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシンは、例えば、 胃癌細胞等 の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 (hypermethylation) ) を示す。さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては 、 例えば、 配列番号 8で示される塩基配列において、 塩基番号 35、 43、 51、 54、 75 、 85、 107、 127、 129、 143、 184、 194、 223、 227、 236、 251、 258等で示されるシト シンをあげることができる。 また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、 Thrombomodulin遺伝子である場 合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩 基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、ヒ ト由来の Thrombomodulin遺伝子のェクソン 1と、その 5 '上流に位置するプロモータ 一領域とが含まれるゲノム DNAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 9で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AF495471に記載される塩基 配列の塩基番号 1〜6096で示される塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 9で示される塩基配列においては、ヒト由来の Thrombomodulinタンパク質のアミノ末 端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2590〜2592に示されており、 上 記ェクソン 1の塩基配列は、塩基番号 2048〜6096に示されている。配列番号 9で示さ れる塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番 号 9で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中 のシ卜シンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、 高メ チル化状態 (hypermethyl at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメ チル化頻度が高いシ卜シンとしては、例えば、配列番号 9で示される塩基配列におい て、 塩基番号 1539、 1551、 1571、 1579、 1581、 1585、 1595、 1598、 1601、 1621、 163 2、 1638、 1645、 1648、 1665、 1667、 1680、 1698、 1710、 1724、 1726、 1756等で示さ れるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 p53- respons ive gene 2遺伝子 である場合には、 そのプロモータ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域（コ一ディング領 域）の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列とし ては、 ヒト由来の p53- respons ive gene 2遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位 置するプロモータ一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 0で示される塩基配列 （Genbank Acces s i on No. AC0094 71に記載される塩基配列の塩基番号 1 13501〜1 16000で示される塩基配列の相補的配 列に相当する。 ） があげられる。配列番号 1 0で示される塩基配列においては、 ヒト 由来の p53-respons ive gene 2遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1558〜18 08に示されている。配列番号 1 0で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される 塩基配列中のシトシンは、例えば、塍臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 (即ち、 高メチル化状態 (hyperme thyl at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 塍臓癌 細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 1 0で示され る塩基配列において、 塩基番号 1282、 1284、 1301、 1308、 1315、 1319、 1349、 1351 、 1357、 1361、 1365、 1378、 1383等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、 F ibr i l l in2遺伝子である場合に は、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配 列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、ヒト由 来の Fibr i l l in2遺伝子のェクソン 1と、その 5，上流に位置するプロモーター領域と が含まれるゲノム D NAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号 1 1で示される塩基配列 （Genbank Access i on No. AC113387に記載される塩基配列の 塩基番号 118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられ る。配列番号 1 1で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Fibri l l in遺伝子のェ クソン 1の塩基配列は、塩基番号 1091〜1345に示されている。配列番号 1 1で示され る塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膝臓癌 細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethyl at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 滕臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシ ンとしては、 例えば、 配列番号 1 1で示される塩基配列において、 塩基番号 679、 68 7、 690、 699、 746、 773、 777、 783、 795、 799、 812、 823、 830、 834、 843等で示され るシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、 Neurof i l ament 3遺伝子である場 合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩 基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、ヒ ト由来の Neurof i l aments遺伝子のェクソン 1と、その 5 '上流に位置するプロモータ 一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 2で示される塩基配列 （Genbank Access i on No. AF106564に記載される塩 基配列の塩基番号 28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があ げられる。 配列番号 1 2で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Neurof i l ament 3遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、塩基番号 614〜1694に示されている。配列番号 1 2で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシンは、例え ば、 塍臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hyp ermethyl at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 塍臓癌細胞においてメチル化頻度が 高いシトシンとしては、例えば、配列番号 1 2で示される塩基配列において、塩基番 号 428、 432、 443、 451、 471、 475、 482、 491、 499、 503、 506、 514、 519、 532、 541 、 544、 546、 563、 566、 572、 580等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 disintegrin and metalloprot einase domain 23遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻 訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一 つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の disintegrin and metalloproteinase dom ain 23遺伝子のェクソン 1と、その 5，上流に位置するプロモーター領域とが含まれ るゲノム DNAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、配列番号 13で示 される塩基配列（Genbank Accession No. AC009225に記載される塩基配列の塩基番号 2 1001〜23300で示される塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 3で示さ れる塩 配歹 I こおレてま、 ヒ卜由来の disintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、塩基番号 1194〜1630に示されている。配列番号 1 3で示される塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシンは、 例え ば、 勝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hyp ermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 膝臓癌細胞においてメチル化頻度が 高いシトシンとしては、例えば、配列番号 13で示される塩基配列において、塩基番 号 998、 1003、 1007、 1011、 1016、 1018、 1020、 1026、 1028、 1031、 1035、 1041、 10 43、 1045、 1051、 1053、 1056、 1060、 1066、 1068、 1070、 1073、 1093、 1096、 1106 、 1112、 1120、 1124、 1126等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 G protein-coupled receptor 7遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コ一デ ィング領域）の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基 配列としては、 ヒト由来の G protein-coupled receptor 7遺伝子のェクソン 1と、そ の 5 '上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム DN Aの塩基配列をあげ ることができ、 より具体的には、 配列番号 14で示される塩基配列 （Genbank Acces sion NO.AC009800に記載される塩基配列の塩基番号 75001〜78000で示される塩基配 列に相当する。 ） があげられる。配列番号 14で示される塩基配列においては、 ヒト 由来の G protein-coupled receptor 7遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1 666〜2652に示されている。 配列番号 14で示される塩基配列中に存在する C p Gで 示される塩基配列中のシトシンは、例えば、塍臓癌細胞等の癌細胞において高いメチ ル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には 、滕臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 14 で示される塩基配列において、 塩基番号 1480、 1482、 1485、 1496、 1513、 1526、 154 2、 1560、 1564、 1568、 1570、 1580、 1590、 1603、 1613、 1620等で示されるシトシン をあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 G-protein coupled soma tost a tin and angiotensin - like peptide receptor遺伝子である場合には、 そのフロモ一 ター領域、 のプロモータ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩 基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、ヒ 卜由来の G- protein coupled somatostatin and angiotensin - 1 ike peptide recepto r遺伝子のェクソン 1と、 その 5' 上流に位置するプロモータ一領域とが含まれるゲ ノム DNAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、配列番号 15で示され る塩基配列 （Genbank Accession No. AC008971に記載される塩基配列の塩基番号 5700 1〜60000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。） があげられる。配列番号 1 5で示される塩基配列においては、 ヒト由来の G- protein coupled somatostatin an d angiotensin- like peptide receptor遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、塩基番号 7 76〜2632に示されている。配列番号 1 5で示される塩基配列中に存在する C p Gで示 される塩基配列中のシトシンは、例えば、勝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル 化頻度 （即ち、 高メチル化状態 (hypermethylalion) ) を示す。 さらに具体的には、 S萃臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 1 5で 示される塩基配列において、 塩基番号 470、 472, 490、 497、 504、 506、 509、 514、 5 22、 540、 543、 552、 566、 582、 597、 610、 612等で示されるシトシンをあげることが できる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Solute carrier family 6 neu rotransmitter transporter 露 adrenal in member 2遺伝子である場合には、. そのフ 口モーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域） の塩基配列中に存在 する CpGで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の Solut e carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenal in member 2遺 to子 のェクソン 1と、その 5'上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム DN Aの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号 16で示される塩基配 列 （Genbank Accession No. AC026802に記載される塩基配列の塩基番号 78801〜81000 で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号 16で示さ れる塩基酉己列においては、 ヒト由来の Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenal in member 2遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 14 79〜1804に示されている。配列番号 16で示される塩基配列中に存在する C p Gで示 される塩基配列中のシトシンは、例えば、滕臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル 化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hyper methyl at ion) ) を示す。 さらに具体的には、 塍臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 16で 示される塩基配列において、 塩基番号 1002、 1010、 1019、 1021、 1051、 1056、 1061 、 1063、 1080、 1099、 1110、 1139、 1141、 1164、 1169、 1184等で示されるシトシンを あげることができる。 本発明における「（目的とする DNA領域におけるメチル化された DNAを検出可 能な量になるまで増幅し、 ） 増幅された DNAの量」 とは、 生物由来検体中に含まれ るゲノム D N Aが有する目的領域におけるメチル化された D N Aの増幅後の量その もの、 即ち、 本発明測定方法の第三工程で求めた量を意味するものである。 例えば、 生物由来検体が 1 m Lの血清であった場合には、血清 1 m L中に含まれる前記のメチ ル化された D N Aに基づいて増幅された D N Aの量を意味する。 本発明 （特に、 本発明メチル化割合測定方法） における 「メチル化割合」 とは、 生 物由来検体中に含まれるゲノム DN Aが有する目的とする DN A領域におけるメチ ル化された DN Aの増幅後の量とメチル化されていない DN Aの増幅後の量との合 計量で、 メチル化された DN Aの増幅後の量を除した数値を意味するものである。 本発明における「前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位に 1つ以上のアンメチ ル状態の CpG対を含む二本鎖 DNA」 とは、二本鎖 DNAにおける前記制限酵素の 認識部位の中に存在している 1つ以上の C p G対におけるシトシンの両者がメチル 化されていないシトシンである二本鎖 DNA、即ち、二本鎖 DNAにおける前記制限 酵素の認識部位の中に存在している 1つ以上の C p G対において、正鎖 DNAのシト シンとこれに対応する負鎖 DNAのシトシンとの両者が共にメチル化されていない シトシンである二本鎖 DNAを意味するものである。また「前記のメチル化感受性制 限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を含まない伸長形成された二本鎖 D NA」 とは、二本鎖 DNAにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している全て の C p G対におけるシトシンの一方がメチル化されており、他方がメチル化されてい ないシトシンである二本鎖 DNA、即ち、二本鎖 DNAにおける前記制限酵素の認識 部位の中に存在している全ての C p G対において、正鎖 DNAのシトシンとこれに対 応する負鎖 DN Aのシトシンとのいずれか一方がメチル化されており、他方がメチル 化されていないシトシンである二本鎖 DN Aを意味するものである。 本発明測定方法の第一工程において、生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来 の DNA試料から、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） と、 目的とす る DNA領域に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオ チドとを塩基対合させることにより、前記の一本鎖 DN Aを、 当該一本鎖 DN Aと一 本鎖固定化オリゴヌクレオチドが塩基対合してなる二本鎖 DNAとして選択する。 本発明測定方法の第一工程における 「一本鎖固定化オリゴヌクレオチド」 は、 目的 とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖）の目的とする DNA領域の全てに対し て相補性である塩基配列、 または、 目的とする DNA領域の一部分であって、 且つ、 目的とする DNA領域の 3 '末端を含む領域に対して相補性である塩基配列を有する 一本鎖固定化ォリゴヌクレオチド（以下、本固定化ォリゴヌクレオチドと記すことも ある。 ） である。
本固定化オリゴヌクレオチドは、生物由来検体中に含まれるゲノム D NA由来の D NA試料から、 目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） を選択するために 用いられる。本固定化オリゴヌクレオチドは、 5〜1 0 0 0塩基長であることが好ま しく、 より具体的には 2 0〜2 0 0塩基長であることが望ましい。
本固定化オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端側は、 担体と固定化され得るものであり、 一方その 3， 末端側は、 後述する第二前工程及び第 A 2工程により 5， 末端から 3 ' 末端に向かって進行する一回伸長反応が可能なようにフリーな状態であればよい。こ こで「担体と固定化され得るもの」 とは、前記の目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NA (正鎖）を選択する際に本固定化オリゴヌクレオチドが担体に固定化されてい ればよく、 （1 ) 当該一本鎖 D NA (正鎖） と本固定化オリゴヌクレオチドとの塩基 対合前の段階で、本固定化ォリゴヌクレオチドと担体との結合により固定化されるも のであってもよく、 また （2 ) 当該一本鎖 D NA (正鎖） と本固定化オリゴヌクレオ チドとの塩基対合後の段階で、本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固 定化されるものであってもよい。
このような構造を得るには、オリゴヌクレオチドの 5 '末端を通常の遺伝子工学的 な操作方法又は市販のキット ·装置等に従い、担体に固定すればよい （固相への結合 ) 。 具体的には例えば、 本オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端をピオチン化した後、 得ら れたピオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトァビジンで被覆した支持体（例えば 、ストレプトアビジンで被覆した P C Rチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁 気ビーズ等） に固定する方法を挙げることができ ¾。
また、 本オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端側に、 アミノ基、 アルデヒド基、 チオール 基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、これを表面がシランカツプリン グ剤等で活性化させたガラス、 シリカ若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に、例 えば、 トリグリセリドを 5個直列に連結したもの等のスぺーサ一、クロスリンカ一等 を介して共有結合させる方法も挙げられる。またさらに、ガラス若しくはシリコン製 の支持体の上で直接、本オリゴヌクレオチドの 5 '末端側から化学合成させる方法も 挙げられる。 本発明測定方法の第一工程は、具体的には例えば、本固定化オリゴヌクレオチドが ピオチン化オリゴヌクレオチドの場合には、
(a) まず、 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料に、 ァニーリ ングバッファ一及びピオチン化オリゴヌクレオチド （当該一本鎖 DNA (正鎖) と本 固定化ォリゴヌクレオチドとの塩基対合後の段階で、本固定化ォリゴヌクレオチドと 担体との結合により固定化されるものであるために、現段階では遊離状態にあるもの ) を添加することにより、 混合物を得る。 次いで、 得られた混合物を、 生物由来検体 中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料に存在する目的とする DNA領域を含 む二本鎖 DNAを一本鎖にするために、 95 °Cで数分間加熱する。その後、 目的とす る D N A領域を含む一本鎖 D N Aとビォチン化ォリゴヌクレオチドとの二本鎖を形 成させるために、ピオチン化オリゴヌクレオチドの Tm値の約 10〜20°C低い温度 まで速やかに冷却し、 その温度で数分間保温する。
(b) その後、 室温に戻す。
(c) ストレプトアビ ンで被覆した支持体に、 上記 （b) で得られた混合物を添加 し、 さらに、 これを 37 °Cで数分間保温することにより、 ピオチン化オリゴヌクレオ チドをストレプトアビジンで被覆した支持伴に固定する。
因みに、 前述の如く、 上記 （a) 〜 （c) では、 前記の目的とする DNA領域を含 む一本鎖 DNA (正鎖） と、 ピオチン化オリゴヌクレオチドとの塩基対合を、 ビォチ ン化オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンで被覆した支持体との固定よりも前 段階で実施しているが、 この順番は、 どちらが先でも構わない。 即ち、 例えば、 スト レプトアビジンで被覆した支持体に固定化されたビォチン化オリゴヌクレオチドに、 生物由来検体中に含まれるゲノム DN A由来の DN A試料を添加することにより混 合物を得て、得られた混合物を生物由来検体中に含まれるゲノム DN A由来の DN A 試料に存在する目的とする DNA領域を含む二本鎖 DNAを一本鎖にするために、 9 5 °Cで数分間加熱し、その後ピオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる ために、ピオチン化オリゴヌクレオチドの Tm値の約 10〜20°C低い温度まで速や かに冷却し、 その温度で数分間保温してもよい。
( d )このようにしてピオチン化ォリゴヌクレオチドをストレプトァビジンで被覆し た支持体に固定した後、 残溶液の除去及び洗浄 （D NA精製） を行う。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆した P C Rチューブを使用する 場合には、 まず溶液をピペッティング又はデカンテーシヨンにより取り除いた後、 こ れに生物由来検体の容量と略等量の T Eバッファーを添加し、その後当該 T Eバッフ ァーをピペッティング又はデカンテ一シヨンにより取り除けばよい。またストレプト アビジンで被覆した磁気ビ一ズを使用する場合には、磁石によりビーズを固定した後 、 まず溶液をピペッティング又はデカンテーシヨンにより取り除いた後、生物由来検 体の容量と略等量の T Eバッファーを添加し、その後当該 T Eバッファ一をピぺッテ ィング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
, 次いで、 このような操作を数回実施することにより、 残溶液の除去及び洗净 (D N A精製） を行う。
当該操作は、 固定化されていない D NA、 又は、後述の制限酵素で消化された溶液 中に浮遊している D NA、 を反応溶液から取り除くため、重要である。 これら操作が 不十分であれば、反応溶液中に浮遊している D NAが铸型となり、増幅反応で予期せ ぬ増幅産物が得られることとなる。支持体と生物由来検体中 D N Aとの非特異的結合 を避けるためには、 目的領域とはまったく異なる塩基配列を有する D NA (例えば、 ヒトの生物由来検体の場合は、 ラット D NA等） を大量に生物由来検体に添加し、 上 記の操作を実施すればよい。
本発明測定方法の第一工程における好ましい態様としては、目的とする D N A領域を 含む一本鎖 D N A (正鎖） と、 当該一本鎖 D N Aの目的とする D N A領域に対して相 補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させる 際に、二価陽イオンを含有する反応系中で塩基対合させることを挙げることができる 。 より好ましくは、二価陽イオンがマグネシウムイオンであることが挙げられる。 こ こで 「二価陽イオンを含有する反応系」 とは、 前記一本鎖 D NA (正鎖） と前記一本 鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させるために用いられるアニーリングバ ッファ一中に二価陽イオンを含有するような反応系を意味し、具体的には例えば、マ グネシゥムイオンを構成要素とする塩（例えば、 MgOAc 2、 MgC 12等） をl mM〜60 OmMの濃度で含まれることがよい。 本発明測定方法の第二工程において、第一工程で形成された二本鎖 DN Aを 1種類 以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記のメ チル化感受性制限酵素の認識部位に 1つ以上のアンメチル状態の C p G対を含む二 本鎖 DNA) を除去する。 '
本発明測定方法の第二工程における 「メチル化感受性制限酵素」 とは、 例えば、 メ チル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを 含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感 受'性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化 されている DN Aの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該 DN Aに作用させ ても、 当該 DNAは切断されない。 これに対して、 メチル化感受性制限酵素が本来認 識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていない D N Aの 場合には、 当該メチル化感受性制限酵素を当該 DNAに作用させれば、当該 DNAは 切断される。 このようなメチル化感受性酵素の具体的な例としては、 例えば、 Hpall 、 BstUI、 Narl、 SacIK fflial等を挙げることができる。 尚、 前記のメチル化感受性制 限酵素は、 へミメチル状態の CpG対を含む二本鎖 DNA (即ち、 前記 CpG対のう ち、一方の鎖のシトシンがメチル化されており、他方の鎖のシトシンがメチル化され ていないような二本鎖 DNA) を切断しないものであり、 すでに Gruenbaumらにより 明らかにされている (Nucleic Acid Research, 9、 2509-2515) 。 当該メチル化感受性制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、具体的には 例えば、前記 DNAを铸型とし、解析対象とするシトシンを認識配列に含む DNAを 増幅可能なプライマー対を用いて PC Rを行い、 DNAの増幅（増幅産物） の有無を 調べる方法をあげることができる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場 合には、増幅産物が得られる。一方、解析対象とするシトシンがメチル化されていな い場合には、増幅産物が得られない。 このようにして、増幅された DN Aの量を比較 することにより、解析対象となるシトシンのメチル化されている割合を測定すること ができる。
因みに、第一工程で選択された二本鎖 D N Aにおいて、 前述の如く、負鎖としての 一本鎖固定化オリゴヌクレオチドに含まれるシトシンはメチルイ匕されていない状態 であり、正鎖側の D N A鎖に含まれるシトシンは生物由来検体中に含まれるゲノム D N Aの D N Aに含まれるシトシンがメチル化されていた力 それともメチル化されて いなかったかにより、当該ニ本鎖 D N Aの状態がァンメチル状態であるか否かが決ま る。即ち、 生物由来検体中に含まれるゲノム D N Aがメチル化されていれば、得られ た二本鎖 D NAはへミメチル状態（アンメチル状態ではない状態。負鎖：メチル化さ れていない状態、 正鎖：メチル化されている状態） であり、 生物由来検体中に含まれ るゲノム D N Aがメチル化されていなければ、得られたニ本鎖 D N Aはアンメチル状 態 （負鎖：メチル化されていない状態、 正鎖：メチル化されていない状態） である。 従って、前記のメチル化感受性制限酵素がへミメチル状態である二本鎖 D N Aを切断 しないという特性を利用することにより、前記の生物由来検体中に含まれるゲノム D NAにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している 1っ以 上の C p G対におけるシトシンがメチル化されていたか否かを区別することができ る。即ち、前記のメチル化感受性制限酵素で消化処理することにより、仮に生物由来 検体生物由来検体中に含まれるゲノム D N Aにおける前記のメチル化感受性制限酵 素の認識部位の中に存在している 1つ以上の C p G対におけるシトシンがメチル化 されていないのであれば、当該二本鎖 D NAはアンメチル状態であり、当該メチル化 感受性制限酵素により切断される。また仮に生物由来検体中に含まれるゲノム D N A における前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全ての C p G対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、当該二本鎖 D NAはへミメ チル状態であり、 当該メチル化感受性制限酵素により切断されない。従って、消化処 理を実施した後、後述のように、前記の目的とする D NA領域を増幅可能な一対のプ ライマ一を用いた P C Rを実施することにより、生物由来検体中に含まれるゲノム D NAにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している 1つ以上の C p G対にお けるシトシンがメチル化されていないのであれば、 P C Rによる増幅産物は得られず 、一方、生物由来検体中に含まれるゲノム DNAにおける前記のメチル化感受性制限 酵素の認識部位の中に存在している全ての CpG対におけるシトシンがメチル化さ れていたのであれば、 P C Rによる増幅産物が得られることになる。 本発明測定方法の第二工程は、具体的には例えば、本固定化ォリゴヌクレオチドが ビォチン化オリゴヌクレオチドの場合には、以下のように実施すればよい。第一工程 で生成した二本鎖 DNAに、 最適な 10X.緩衝液 (330mM Tris- Acetate H 7.9、 660m M K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2, 5mM Dithothreitol) を 3 xL、 lmg/mL BSA水溶液を 3 L、 メ チル化感受性制限酵素 Hpall又は fflial (10U/ /L)等を夫々 1.5^L加え、次いで当該混 合物に滅菌超純水を加えて液量を 30 Lとし、 37°Cで 1時間〜 3時間インキュベーシ ョンすればよい。 このようにして第一工程で形成された二本鎖 D N Aを 1種類以上のメチル化感受 性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記のメチル化感受性制限酵 素の認識部位に 1つ以上のアンメチル状態の C p G対を含む二本鎖 DNA)の除去及 び洗浄 （DNA精製） を行う。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆した P C Rチューブを使用する 場合には、 まず溶液をピペッティング又はデカンテ一シヨンにより取り除いた後、 こ れに生物由来検体の容量と略等量の T Eバッファ一を添加した後、当該 T Eバッファ ーをピベッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレブトァ ビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合は、磁石によりビーズを固定した後、 ま ず溶液をピベッティング又はデカンテ一ションにより取り除いた後、生物由来検体の 容量と略等量の T Eバッファーを添加した後、当該 T Eバッファーをピペッティング 又はデカンテ一シヨンにより取り除けばよい。
次いで、 このような操作を数回実施することにより、 消化物（前記制限酵素の認識 部位に 1つ以上のアンメチル状態の C p G対を含む二本鎖 DNA)除去及び洗浄 (D NA精製） する。 尚、本発明測定方法の第二工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理で の懸念点として、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を完全に消化できな レ （所謂 「D NAの切れ残し」 ） 虞を挙げることができる。 このような虞が問題とな る場合には、メチル化感受性制限酵素の認識部位が多く存在すれば、 「D NAの切れ 残し」 を最小限に抑えることができるので、 目的とする D NA領域としては、 メチル 化感受性制限酵素の認識部位を 1つ以上有しており、その認識部位が多ければ多いほ どよいと考えられる。
従って、本発明測定方法の第二工程において複数のメチル化感受性制限酵素による 処理を実施する場合には、具体的には例えば、 以下のように行えばよい。第一工程で 選択された二本鎖 D N Aに、 最適な 10 X緩衝液 （330mM Tris- Acetate H 7. 9、 660m M K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2、 5mM Di thothrei tol) を 3 L、 lmg/mL BSA水溶液を 3 L、 メ チル化感受性酵素 Hpal l及び Hhal (10U/ / L)等を夫々 1. 5 L加え、 次いで当該混合物 に滅菌超純水を加えて液量を 30 Lとし、 37°Cで 1時間〜 3時間インキュベーション する。その後、 前記と同様な操作に準じて、 ピペッティング又はデカンテ一シヨンに より、 残溶液の除去及び洗浄 （D NA精製） を行う。 より具体的には例えば、 ストレ ブトアビジンで被覆した P C Rチューブを使用する場合には、まず溶液をピベッティ ング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量 の T Eバッファ一を添加した後、当該 T Eバッファ一をピぺッティング又はデカンテ —シヨンにより取り除けばよい。またストレブトァビジンで被覆した磁気ビーズを使 用する場合は、磁石によりビーズを固定した後、 まず溶液をピベッティング又はデカ ンテーシヨンにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量の T Eバッファ一を 添加した後、当該 T Eバッファ一をピぺッティング又はデカンテ一シヨンにより取り 除けばよい。
次いで、 このような操作を数回実施することにより、 残溶液の除去及び洗浄 (D N A精製） を行う。 尚、本発明測定方法又は後述のメチル化割合測定方法において、 「生物由来検体中 に含まれるゲノム D NA由来の D NA試料」が、当該ゲノム D NAが有する目的とす る D N A領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなる D N A試 料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。 ここで、生物由来検 体中に含まれるゲノム D N A (铸型 D NA)を一本鎖固定化オリゴヌクレオチドで選 択する場合には、 短い铸型 D NAの方がより選択され易く、 また、 P C Rで目的領域 を増幅する場合にも、錶型 D NAが短い方がよいと考えられるので、 目的とする D N A領域を認識切断部位としない制限酵素を生物由来検体中に含まれるゲノム D N A 由来の D NA試料に直接使用し消化処理を実施してもよい。尚、 目的とする D NA領 域を認識切断部位としない制限酵素により消化処理する方法としては、一般的な制限 酵素処理法を i¾いればよい。
また、 「生物由来検体中に含まれるゲノム D N A由来の D N A試料」が、 1種類以 上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなる D NA試料であることを好まし い態様の一つとして挙げることができる。
これらの好ましい態様は、生物由来検体そのものを予め上記のような制限酵素で消 化処理しておくことにより、 メチル化量を精度良く求めることができるためである。 当該方法は、 上記のような 「D NAの切れ残し」 を無くすのに有用である。
生物由来検体に含まれるゲノム D N A由来の試料をメチルイヒ感受性制限酵素によ り消化する方法としては、生物由来検体がゲノム D N A自体の場合には前記の方法と 同様な方法でよく、生物由来検体が組織溶解液、細胞溶解液等の場合には前記の方法 と同様な方法に準じて、大過剰のメチル化感受性制限酵素、例えば、 25ngの D NA量 に対して 500倍量（10U)又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素を用いて消化処理を 実施すればよい。 本発明測定方法の第三工程において、下記の各本工程の前工程として、第二工程で 得られた未消化物である形成された二本鎖 D N A (前記のメチル化感受性制限酵素の 認識部位にアンメチル状態の C p G対を含まない二本鎖 D NA)を一本鎖状態に一旦 分離する工程 （第一前工程） と、
生成した一本鎖状態である D NA (正鎖） と、 前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチ ドとを塩基対合させることにより、前記の生成した遊離の一本鎖状態である D N Aを 選択し、選択された一本鎖 D N Aと前記の一本鎖固定化ォリゴヌクレオチドとが塩基 対合してなる二本鎖 DN Aを形成させる工程 （第二 （A) 前工程） と、
当該工程 （第二 （A) 前工程） で形成された二本鎖 DNAを、 前記の選択された一本 鎖 DN Aを铸型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマ一として 、当該プライマーを 1回伸長させることにより、前記の選択された一本鎖 DN Aを伸 長形成された二本鎖 DNAとする工程 （第二 （B) 前工程） と
を有する工程 （第二前工程） と、
第二前工程で伸長形成されたニ本鎖 D N A (前記のメチル化感受性制限酵素の認識部 位にアンメチル状態の CpG対を含まない伸長形成された二本鎖 DNA)を、一本鎖 状態である DNA (正鎖） と一本鎖状態である DNA (負鎖） に一旦分離する工程 （ 第三前工程） とを有し、 且つ、 本工程として
(a) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と前記の一本鎖固定化オリゴヌクレ ォチド （負鎖） とを塩基対合させることにより、 前記の一本鎖状態である DNAを選 択する第 A 1工程と、第 A 1工程で選択された一本鎖状態である DN Aを鎵型として 、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマ一を 1 回伸長させることにより、前記の一本鎖状態である D N Aを二本鎖 D N Aとして伸長 形成させる第 A2工程とを有する第 A工程 （本工程） と、
(b) 生成した一本鎖状態である DNA (負鎖） を铸型として、 前記の一本鎖状態で ある DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記 の目的とする DNA領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基配列 （負鎖） の 3' 末端よりさらに 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対して相補性 である塩基配列 （正鎖） を有し、 且つ、 前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドを铸 型とする伸長反応に利用できないオリゴヌクレオチド （リバース用プライマー） を伸 長プライマーとして、当該オリゴヌクレオチドを 1回伸長させることにより、前記の 一本鎖状態である DNAを伸長形成された二本鎖 DNAとする第 B工程（本工程） と を有し、
さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成されたニ本鎖 D N A (を一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とする DNA領 域におけるメチル化された D N Aを検出可能な量になるまで増幅し、増幅された D N Aの量を定量する。 本発明測定方法の第三工程では、 まず、下記の各本工程の前工程のうち第一前工程 として、第二工程で得られた未消化物である形成された二本鎖 DNA (前記のメチル 化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を含まない伸長形成され た二本鎖 DNA) を一本鎖状態に一旦分離する。具体的には例えば、 第二工程で得ら れた未消化物である形成された二本鎖 DN A (前記のメチル化感受性制限酵素の認識 部位にアンメチル状態の CpG対を含まない二本鎖 DNA)に、アニーリングバッフ ァーを添加することにより、混合物を得る。次いで、 得られた混合物を 95°Cで数分 間加熱する。 その後、 第二'前工程における第二 （A) 前工程では、 具体的に例えば、 第一工程に準じて実施すれば良く、メチル化状態の一本鎖 DN Aと本固定化オリゴヌ クレオチドとが塩基対合してなる二本鎖 DNAを形成される。 これにより、当該二本 鎖 D N Aが選択可能となる。
第二 （B) 前工程においては、 具体的には例えば、 本固定化オリゴヌクレオチドが ピオチン化オリゴヌクレオチドの場合には、 以下のように実施すればよい。
二本鎖 D N Aとして選択されたメチル化状態の一本鎖 D N Aと一本鎖固定化ォリ ゴヌクレオチドに、 滅菌超純水を 17.85 ^L、 最適な 1 OX緩衝液 （lOOmM Tris - HC1 pH 8.3、 500mM KCK 15mM MgCl2) を 3 L、 2mM dNTPを 3 L、 5 ベタインを 6 L 加え、 次いで当該混合物に AmpliTaq (D N Aポリメラーゼの 1種： 511/ 1 を 0.15 L加えて液量を 30 Lとし、 37°Cで 2時間インキュベーションする。 その後、 インキ ュべ一ションされた溶液をピベッティング又はデカンテーションにより取り除いた 後、 これに生物由来検体の容量と略等量の TEバッファーを添加し、当該 TEバッフ ァーをピベッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆した P C Rチューブを使用する 場合には、 まず溶液をピペッティング又はデカンテーシヨンにより取り除いた後、 こ れに生物由来検体の容量と略等量の TEバッファ一を添加し、その後当該 T Eバッフ ァーをピぺッティング又はデカンテ一シヨンにより取り除けばよい。またストレプト アビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、磁石によりビーズを固定した後 、 まず溶液をピペッティング又はデカンテーシヨンにより取り除いた後、生物由来検 体の容量と略等量の T Eバッファーを添加し、その後当該 T Eバッファ一をピぺッテ ィング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
次いで、 このような操作を数回実施することにより、 残溶液の除去及び洗浄（D N A精製） を行う。
第三前工程においては、 第二（B )前工程で得られた伸長形成された二本鎖 D NA (前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を含まな い伸長形成された二本鎖 D NA) を、 一本鎖状態である D NA (正鎖） と一本鎖状態 である D NA (負鎖） に一旦分離する。 具体的には例えば、 第二 （B ) 前工程で得ら れたニ本鎖 D N A (前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を含まなぃニ本鎖D NA)に、アニーリングバッファ一を添加することにより 、 混合物を得る。 次いで、 得られた混合物をを 9 5 で数分間加熱する。
その後、 本工程として、
(i)生成した一本鎖状態である D NA (正鎖） を、 前記の一本鎖固定化オリゴヌクレ ォチド （負鎖） にアニーリングさせるために、 前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチ ド （負鎖） の Tm値の約 1 0〜2 0 °C低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分 間保温する。
(i i)その後、 室温に戻す。 （第 A工程における第 A 1工程）
(i i i)上記（i)で選択された一本鎖状態である D N Aを铸型として、前記の一本鎖固定 化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを 1回伸長させることに より、 前記の一本鎖状態である D NAを二本鎖 D NAとして伸長形成させる （即ち、 第 A工程における第 A 2工程）。具体的には例えば、後述の説明や前述の本発明測定 方法の第二 （B ) 前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。 (iv)生成した一本罈状態である D NA (負鎖） を铸型として、 前記の一本鎖状態であ る D NAが有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記の目的とす る D NA領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基配列 （負鎖） の 3 ' 末端 よりさらに 3 ' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対して相補性である塩基 配列 （正鎖） を有し、 且つ、 前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドを铸型とする伸 長反応に利用できないオリゴヌクレオチド（リバース用プライマー） を伸長プライマ 一として、当該オリゴヌクレオチドを 1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態 ,である D NAを伸長形成された二本鎖 D NAとする （即ち、 第 B工程） 。 具体的には 例えば、 上記（i i i)と同様に、 後述の説明や前述の本発明測定方法の第二 （B ) 前ェ 程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(V)さらに第三工程の各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖 D NAを一本鎖状態に一旦分離した後、 繰り返すこと （例えば、第 A工程及び第 B工程 ) により、前記の目的とする D NA領域におけるメチル化された D NAを検出可能な 量になるまで増幅し、増幅された D NAの量を定量する。具体的には例えば、 上記と 同様に、 後述の説明や前述の本発明測定方法の第三工程における第二 （B ) 前工程、 第 A工程及び第 B工程での操作方法等に準じて実施すればよい。
尚、 リバース用プライマーとして、一本鎖固定化オリゴヌクレオチドを铸型として 伸長反応に利用できない伸長プライマ一を用いることで、第三工程で伸長形成されて いない一本鎖 （固定化） オリゴヌクレオチドを増幅することなく、 第二 （B ) 前工程 で伸長形成されたニ本鎖 D N A (前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメ チル状態の C p G対を含まない二本鎖 D NA) を特異的に増幅できる。 第三工程は、具体的には、第一前工程から開始して本工程に至るまでの反応を、一 つの P C R反応として実施することもできる。また、第一前工程から第三前工程まで 、各々、独立した反応を実施し、本工程のみを P C R反応として実施することもでき る。 メチル化感受性制限酵素による消化処理の後に目的とする D NA領域（即ち、 目的 領域） を増幅する方法としては、 例えば、 P C Rを用いることができる。 目的領域を 増幅する際に、片側のプライマーとして本固定化オリゴヌクレオチドを用いることが できるので、 もう一方のプライマーのみ添加して P C Rを行うことにより、増幅産物 が得られ、 その増幅産物も固定化されることとなる。 この際、予め蛍光等で標識され たプライマーを使用してその標識を指標とすれば、電気泳動等の煩わしい操作を実施 せずに増幅産物の有無を評価できる。 PCR反応液としては、 例えば、本発明測定方 法の第二工程で得た DNAに、 50 Mのプライマーの溶液を 0.15 1と、 2mM dNTPを 2 .5 1と、 10X緩衝液（lOOmM Tris-HCl H 8.3、 500mM KC1、 20mM MgCl2、 0.01% Ge latin)を と、 AmpliTaq Gold (耐熱性 DNAポリメラ一ゼの一種： 5U/ il)を 0 .2 1とを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を 25 1とした反応液をあげること ができる。 · 目的とする DNA領域 （即ち、 目的領域） は、 GCリッチな塩基配列が多いため、 時に、 ベタイン、 DM SO等を適量加えて反応を実施してもよい。反応条件としては 、 例えば、 前記のような反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒間次い で 55〜65°Cにて 30秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 30〜40サイ クル行う条件があげられる。かかる PCRを行った後、得られた増幅産物を検出する 。 例えば、 予め標識されたプライマ一を使用した場合には、 先と同様の洗浄，精製操 作を実施後、 固定化された蛍光標識体の量を測定することができる。 また、標識され ていない通常のプライマーを用いた PC Rを実施した場合は、金コロイド粒子、蛍光 等で標識したプローブ等をァ二一リングさせ、目的領域に結合した当該プローブの量 を測定することにより検出することができる。また、増幅産物の量をより精度よく求 めるには、例えば、 リアルタイム PCR法を用いればよい。 リアルタイム PCR法と は、 PCRをリアルタイムでモニターし、得られたモニター結果を力イネティックス 分析する方法であり、例えば、遺伝子量に関して 2倍程度のほんのわずかな差異をも 検出できる高精度の定量 P C R法として知られる方法である。当該リアルタイム P C R法には、例えば、錶型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプロ一ブを用いる方法 、 サイバーグリーン等のィン夕一力レー夕一を用いる方法等を挙げることができる。 リアルタイム P C R法のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよレ^ 以上の如く、検出については特に限定されることはなく、 これまでに周知のあらゆる 方法による検出が可能である。 これら方法では、反応容器を移し換えることなく検出 までの操作が可能となる。 さらに、一本鎖固定化ォリゴヌクレオチドと同じ塩基配列のピオチン化ォリゴヌク レオチドを片側のプライマー、 又は、 一本鎖固定化オリゴヌクレオチドより、 3 ' 端 側に新しいピオチン化オリゴヌクレオチドを設計しそれを片側のプライマーとし、そ の相補側プライマーを用いて、 目的領域を増幅することもできる。 この場合、得られ た増幅産物は、ストレプトアビジンで被覆した支持体があれば固定化されるので、例 えば、ストレプトアビジンコート P C Rチューブで P C Rを実施した場合には、チュ ーブ内に固定されるため、上記の通り、標識されたプライマ一を用いれば、 増幅産物 の検出が容易である。また、先の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドが共有結合等によ る固定化の場合であれば、 P C Rで得られた増幅産物を含む溶液をストレブトァビジ ン被覆支持体が存在する容器に移し、増幅産物を固定化することが可能である。検出 については、上述の通り実施すればよい。 目的領域を増幅する相補側のプライマーは 、 メチル化感受性制限酵素の認識部位を 1つ以上有する目的領域を増幅でき、 かつ、 その認識部位を含まないプライマーでなければいけない。 この理由は、以下の通りで ある。選択及び 1回伸長反応で得られた二本鎖 D N Aの本固定化ォリゴヌクレオチド 側の D NA鎖（新生鎖） の一番 3 '端側のメチル化感受性制限酵素の認識部位のみが メチル化されていない場合には、その部分だけがメチル化感受性制限酵素で消化され ることになる。 消化後、 前述のように洗浄操作を行っても、 新生鎖で言う 3 '端の一 部だけを失った二本鎖 D N Aが固定化されたままの状態で存在する。相補側のプライ マーが、 この一番 3 '端側のメチル化感受性制限酵素の認識部位を含んでいた場合に は、 当該プライマーの 3 '端側の数塩基が、 新生鎖の 3 '端の数塩基とァニ一リング し、 その結果、 目的領域が P C Rにより増幅する可能性があるからである。 本発明は、 本発明測定方法の第三工程の第一前工程の前操作段階又は後操作段階、 或いは、第三工程の第三前工程の前操作段階又は後操作段階において、前記の目的と する D NA領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） の 3 '末端の一部に対して相補性である 塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖） を反応系内に 添加する工程 （追加前工程） を追加的に有するような変法を含む。
即ち、 (変法 1)
本発明測定方法の第三工程の第一前工程の前操作段階において、
前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3'末端の一部に対して 相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
本発明測定方法の第三 Ϊ程の各本工程として、下記の 1つの工程をさらに追加的に有 することを特徴とする方法。 ノ
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反応 系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖） とを塩基対合させることにより 、 前記の一本鎖状態である DNAを選択する第 C 1工程と、
(i i)第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、前記の一本 鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 当該プライマ一を 1回伸長させ ることにより、前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成された二本鎖 DN Aとする 第 C 2工程とを有する第 C工程 （本工程） 。
(変法 2)
本発明測定方法の第三工程の第一前工程の後操作段階において、
前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3'末端の一部に対して 相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、 第一前工程及び上 記の追加前工程を経て得られた未消化物である二本鎖 DN A (前記のメチル化感受性 制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を含まない伸長形成された二本鎖 DNA) を一本鎖状態に一旦分離する工程 （追加再前工程） を有し、 且つ、 本発明測定方法の第三工程の各本工程として、下記の 1つの工程をさらに追加的に有 することを特徴とする方法 （以下、 本発明メチル化割合測定方法と記すこともある。 )
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反応 系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖） とを塩基対合させることにより 、 前記の一本鎖状態である D NAを選択する第 C 1工程と、
( i i )第 C 1工程で選択された一本鎖状態である D NAを铸型として、前記の一本 鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 当該プライマーを 1回伸長させ ることにより、前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成されたニ本鎖 D N Aとする 第 C 2工程とを有する第 C工程 （本工程） 。
(変法 3 )
本発明測定方法の第三工程の第三前工程の前操作段階において、
前記の目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） の 3 '末端の一部に対して 相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
本発明測定方法の第三工程の各本工程として、下記の 1つの工程をさらに追加的に有 することを特徴とする方法。
( c ) ( i ) 生成した一本鎖状態である D NA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反応 系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖） とを塩基対合させることにより 、 前記の一本鎖状態である D N Aを選択する第 C 1工程と、
( i i )第 C 1工程で選択された一本鎖状態である D NAを錶型として、前記の一本 鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマ一として、 当該プライマ一を 1回伸長させ ることにより、前記の一本鎖状態である D NAを伸長形成された二本鎖 D N Aとする 第 C 2工程とを有する第 C工程 （本工程） 。
(変法 4 )
本発明測定方法の第三工程の第三前工程の後操作段階において、
前記の目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） の 3 '末端の一部に対して 相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、 第一前工程及び上 記の追加前工程を経て得られた未消化物である二本鎖 D N A (前記のメチル化感受性 制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を含まない伸長形成された二本鎖 D NA) を一本鎖状態に一旦分離する工程 （追加再前工程） を有し、 且つ、 本発明測定方法の第三工程の各本工程として、下記の 1つの工程をさらに追加的に有 することを特徴とする方法 （以下、 本発明メチル化割合測定方法と記すこともある。
)
( c ) ( i ) 生成した一本鎖状態である D NA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反応 系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖） とを塩基対合させることにより 、 前記の一本鎖状態である D NAを選択する第 C 1工程と、
( i i )第 C 1工程で選択された一本鎖状態である D NAを铸型として、前記の一本 鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 当該プライマーを 1回伸長させ ることにより、前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成されたニ本鎖 D N Aとする 第 C 2工程とを有する第 C工程 （本工程） 。 当該変法では、外部から 「前記の目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NA (正鎖 )の 3 '末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖 オリゴヌクレオチド （負鎖).」 を反応系内に添加すること等により、 第三工程におけ る前述の目的とする D N A領域の増幅効率を容易に向上させることが可能となる。尚 、 追加前工程で反応系内に添加される一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） は、 一本鎖 D NAの 3 '末端の一部 （但し、 前記の目的とする D NA領域を含まない。 ） に対し て相補性である塩基配列であって、 5 '末端が、 前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチ ドと同じである塩基配列を有する遊離状態である一本鎖ォリゴヌクレオチドであれ ば、 前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列であっても、 又は、短い塩 基配列であっても、 或いは、 長い塩基配列であってもよい。但し、 前記一本鎖固定化 オリゴヌクレオチドよりも長い塩基配列の場合には、前記リバース用プライマー（正 鎖） を伸長プライマ一とし、 当該一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を铸型として、 伸長プライマーを伸長させる反応に利用できない遊離状態である一本鎖オリゴヌク レオチドであることが重要である。 目的領域を増幅する際に、片側のプライマ一として固定化オリゴヌクレオチドを用 いて、 もう一方のプライマーのみ添加して P C Rを行う例を前記したが、 目的産物の 検出のために他の方法（例えば、 P C Rで得られた各々の増幅産物の量を比較するこ とができる分析方法） を実施するのであれば、 上記の如く、 目的領域を増幅する際に 、 固定化オリゴヌクレオチドを一方（片側） のプライマーとして使用せず、 一対のプ ライマーを添加して P C Rを実施してもよい。かかる P C Rを行った後、得られた増 幅産物の量を求める。 本発明測定方法の第三工程は繰り返し工程を有するが、例えば、第 A 1工程におけ る 「生成した一本鎖状態である D NA (正鎖） 」 とは、 第 1回目の第三工程の操作及 び第 2回目以降の第三工程の ϋり返し操作の両操作において「生成した『遊離の』一 本鎖状態である D N Α (正鎖） 」 を意味することになる。
また、 第 B工程における 「生成した一本鎖状態である D NA (負鎖） 」 とは、 第 1 回目の第三工程の操作及び第 2回目以降の第三工程の繰り返し操作の両操作におい て 「生成した 『固定の』 一本鎖状態である D NA (正鎖） 」 を意味する。 伹し、 第三 工程がさらに追加的に C工程を有する場合には、第 1回目の第三工程の操作において 「生成した『固定の』一本鎖状態である D N A (正鎖） 」 を意味し、 一方、 第 2回目 以降の第三工程の繰り返し操作において「生成した『固定の』一本鎖状態である D N A (正鎖） 」 と 「生成した 『遊離の』一本鎖状態である D NA (正鎖） 」 との両者を 意味することになる。 また、 第三工程の各本工程で得られた 「伸長形成された二本鎖 D NA」 とは、 第 A 工程の場合には、第 1回目の第三工程の操作において「前記のメチル化感受性制限酵 素の認識部位に、アンメチル状態の C p G対を含まない伸長形成された二本鎖 D NA 」 を意味し、 一方、 第 2回目以降の第 Ξ工程の繰り返し操作において 「前記のメチル 化感受性制限酵素の認識部位に、アンメチル状態の C p G対を含まない伸長形成され た二本鎖 D NA」 と 「前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位に、 アンメチル状態 の C p G対を含む伸長形成された二本鎖 D NA」 との両者を意味することになる。第 B工程の場合には、第 1回目の第三工程の操作及び第 2回目以降の第三工程の繰り返 し操作の両操作において「前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位では全てがアン メチル状態の C p G対である伸長形成された二本鎖 DNA」 を意味することになる。 尚、 第三工程がさらに追加的に C工程を有する場合にも同様である。 また、第三工程がさらに追加的に C工程を有する場合において、第 C 1工程におけ る 「生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） 」 とは、 第 1回目の第三工程の操作及 び第 2回目以降の第三工程の繰り返し操作の両操作において「生成した『遊離の』一 本鎖状態である DNA (正鎖） 」 を意味することになる。 また本発明は、本発明測定方法の工程として、下記の 2つの工程をさらに追加的に 有することを特徴とするメチル化割合の測定方法（即ち、本発明メチル化割合測定方 法） を含む。
(4) 本発明測定方法 （前記の変法を含む） の第一工程を行った後、 本発明測定方法 (前記の変法を含む） の第二工程を行うことなく、本発明測定方法（前記の変法を含 む） の第三工程を行うことにより、 前記の目的とする DNA領域の DNA (メチル化 された DN A及びメチルされていない DN Aの総量）を検出可能な量になるまで増幅 し、 増幅された DN Aの量を定量する第四工程、 及び、
(5)本発明測定方法（前記の変法を含む） の第三工程により定量された DNAの量 と、第四工程により定量された DN Aの量とを比較することにより得られる差異に基 づき前記の目的とする DN A領域におけるメチル化された DN Aの割合を算出する 第五工程 当該メチル化割合測定方法は、 下記のような場面において利用すればよい。
各種疾患（例えば、癌） において DN Aのメチル化異常が起こることが知られてお り、 この DNAメチル化異常を検出することにより、各種疾患の度合いを測定するこ とが可能と考えられている。
例えば、 疾患生物由来検体中に含まれるゲノム DNAにおいて 100%メチル化され ている DN A領域があり、その DN A領域について、本発明測定方法又は本発明メチ ル化割合測定方法を実施すれば、 メチル化された D NAの量は多くなり、例えば、疾 患生物由来検体中に含まれるゲノム D N Aにおいて 100%メチル化されていない D N A領域があり、その D N A領域について、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測 定方法を実施すれば、 メチル化された D N Aの量はほぼ 0に近い値となるであろう。 また、例えば、健常生物由来検体中に含まれるゲノム D NAにおいてメチル化割合が 低く且つ疾患'生物由来検体中に含まれるゲノム D NAにおいてメチル化割合が高い D NA領域があり、その D NA領域について、本発明測定方法又は本発明メチル化割 合測定方法を実施すれば、健常者の場合には、 メチル化された D NAの量は、 0に近 い値を示し、一方、 疾患患者の場合には、健常者の場合における値よりも有意に高い 値を示すため、 この値の差異に基づき、 「疾患の度合い」 を判定することができる。 ここでの「疾患の度合い」 とは、一般に当該分野において使用される意味と同様であ つて、具体的には、例えば、 生物由来検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を 意味し、 また、例えば、 生物由来検体が組織である場合には当該組織における疾患細 胞の存在量等を意味している。 さらに、 生物由来検体が血漿 ·血清である塲合にはそ の個体が疾患を有する確率を意味している。従って、本発明測定方法又は本発明メチ ル化割合測定方法は、 メチル化異常を調べることにより、各種疾患を診断することを 可能にする。 このような本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法における、目的領域の メチル化された D N A量の測定、メチル化割合の測定を行うための各種方法で使用し 得る制限酵素、 プライマー又はプローブは、 検出用キットの試薬として有用である。 本発明は， これら制限酵素、プライマー又はプロ一ブ等を試薬として含有する検出用 キットゃ、これらプライマー又はプローブ等が担体上に固定化されてなる検出用チッ プも提供しており、 本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法の権利範囲は、 当該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットゃ検出用チップ のような形態での使用も含むものである。 実施例. 以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもので はない。
実施例 1 '
AT C Cより購入された哺乳動物由来の結腸腺癌細胞株 C a c o— 2 (ATCC NO. HT B- 37)を、 ATCCのカタログに記載された細胞株のための専用培地でコンフルェン トになるまで培養することにより、 各々約 1 X 107細胞を得た。 得られた細胞に、 SEDTAバッファ一 [10mM Tris-HCl H 8.0、 10mM EDTA H 8.0、 lOOmM NaCl] を 10倍容量加えた後、 これをホモジナイズした。
得られた混合物に、 proteinase K (Sigma) を 500 g/m 1及びドデシル硫酸 ナトリウムを 1% (w/v) になるように加えた後、 これを 55 °Cで約 16時間振と うした。
振とう終了後、 当該混合物をフエノール [1M Tris-HCK pH 8.0)にて飽和] ·クロ口 ホルム抽出処理した。水層を回収し、 これに NaC lを 0. 5Nとなるよう加えた後 、 これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱 （ゲノム DNA) を回収した。 回収され た沈澱を TEバッファー （10mM Tris、 1禮 EDTA、 pH 8.0) に溶解し、 これに 40 /g/ mlになるように RN a s e A (Sigma)を加えて 37 °Cで 1時間インキュベートした 。インキュベートされた混合物をフエノール ·クロロホルム抽出処理した。水層を回 収し、 これに NaC lを 0. 5 Nとなるよう加えた後、 これをエタノール沈澱するこ とにより沈澱 （ゲノム DNA) を回収した。 回収された沈澱を 70%エタノールでリン スすることにより、 ゲノム DNAを得た。
得られたゲノム D N Aを铸型として、以下のプライマ一及び反応条件を用いて P C Rを行うことにより、供試サンプルとして用いられる DNAフラグメント (以下、 D N Aフラグメント X 2と記す。配列番号 18で示される塩基配列を有する。 Genbank Accession No. AC009800等に示される GP R 7配列の塩基番号 76477〜77002に相当す る配列） を増幅した。
PF3： 5' -GTCCGCGGCGACATTGGG-3' (配列番号 19 )
PR3： 5' -CGATGAGCTTGCACATGAGCT-3 ' (配列番号 20 ) P CRの反応液としては、铸型とするゲノム DNAを 2. 5 ngと、 3 Mに調製 された配列番号 19で示される塩基配列からなるプライマ一の溶液及び配列番号 2 0で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各 2. 5 1と、各々 2mMの dN TPを 2. 5 xlと、 10 X緩衝液（lOOmM Tris- HC1 pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl い 0.01% Gelatin)を 2. 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラ一ゼ （AmpliTaq Gold 、 5U/ 1) を 0. 125 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 2 1とした。 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒間次い で 5 9°Cにて 6 0秒間さらに 7 2でにて 45秒間を 1サイクルとする保温を 5 0サ ィクル行う条件で PC Rを行った。
PCRを行った後、 1. 5 %ァガロースゲル電気 動により DNAの増幅を確認し 、 目的の DNAフラグメント （526bp、 DNAフラグメント X2) を切り出し、 QIAG EN QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社) を用いて精製した。
得られた DNAフラグメント X2の一部をメチル化酵素 S s s I (NEB社） により 処理し、 5 ' 一 CG— 3， 全てをメチル化した DNAフラグメント (以下、 DNAフ ラグメント Y 2と記す。 ) を得た。 これについても、 先と同様に、 1. 5 %ァガロー ス電気泳動により増幅を確認し、 DN Aフラグメント （526bp、 DNAフラグメント Y2) を切り出し、 QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社) を用いて精製 した。
オリゴヌクレオチドとして、配列番号 21に示される塩基配列を有する 5 '末端がビ ォチン標識されたオリゴヌクレオチド B 1 (80bp) を合成した。 くビォチン標識ォリゴヌクレオチド>
B1： 5' -GACAACGCCTCGTTCTCGG-3' (配列番号 21) 各溶液各々 （25pg/mL水溶 液、 IO L) に、 5 Mピオチン化オリゴヌクレオチド B 1を 1 L、 及び、 ァニ一 リングバッファー （0.5Mチャーチリン酸バッファ一、 7% SDS、 lmM EDTA水溶液） を 10 xL添加することにより、 混合物を得た。
次いで得られた混合物を、 9 5 °Cで 5分間加熱した。その後、 5 0 まで速やかに 冷却し、 その温度で 5分間保温した。 次いで、 これを 3 7 °Cで 5分間保温した後、 室 温に戻し、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (DNAフラグメント X2又は DNAフラグメント Y 2) とピオチン化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させた (D
Figure imgf000047_0001
次に、 ストレプトアビジンで被覆した P C Rチューブに、 上記のようにして、前調 製された混合物を添加し、 さらに、 これを 3 7 °Cで 5分間保温することにより、 ピオ チン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した（以上 、 本発明測定方法の第一工程に相当する。 ） 。 次いで、前記の P C Rチューブから溶液を除去した後、 1 0 O Lの TEバッファ —を添加した後、 当該 TEバッファ一をピペッティングにより取り除いた。当該操作 をさらに 2回実施した。
このようにして得られた二本鎖 DNAについて、 以下の 2種の処理を施した。
A群（無処理群） ：上記で調製された二本鎖 DNAに、 Hp a I I及び Hh a Iに最 適な 1 O X緩衝液 （330mM Tris- Acetate pH 7.9, 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithothreitol) を 3 xLと、 10XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 3 x Lとを加えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 30 Lとした。
B群（Hp a I I及び Hh a Iによる消化処理群） ：上記で調製された二本鎖 DN A に、 Hp a I I及び Hh a Iを夫々 15Uと、 Hp a I I及び Hh a Iに最適な 10 X緩衝液 (330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithothr ei tol) を 3 zLと、 10'XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 3 Lとをカロ えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 30 β Lとした。 各々の反応液を 37 °Cで 1時間インキュベーション（消化処理） した後、 上清を取 り除き、 100 t Lの TEバッファ一を添加した後、 当該 TEバッファ一をピぺッテ イングにより取り除いた （以上、 本発明測定方法の第二工程に相当する） 。 次に、得られた未消化物を铸型として、下記のプライマ一及び反応条件を用いて P CRを行った。 目的とする DNA領域がメチル化されていれば DNA (配列番号 22 で示される塩基配列を有する。 Genbank Accession No. AC009800等に示される G P R 7配列の塩基番号 76669〜76835に相当する配列） が増幅される。
PF4： 5' -GACAACGCCTCGTTCTCGG-3' (配列番号 23)
PR4： 5' -GCGGAGTTGCCCGCCAGA-3' (配列番号 24)
PCRの反応液としては、铸型とするゲノム DNAに、 3 Mに調製された配列番 号 23で示される塩基配列からなるプライマーの溶液及び配列番号 24で示される 塩基配列からなるプライマーの溶液各 2. 5 X 1と、 各々 2mMの dNTPを 2. 5 1と、 10 X緩衝液（lOOmM Tris-HCl H 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 2. 5 / 1と、 耐熱性 DNAポリメラーゼ (AmpliTaq Gold) 5U/ Z 1 ' を 0. 125 /i lと、 5Nベタイン水溶液を 5 1とを混合し、 これに滅菌超純水を 加えて液量を 25 a 1とした。 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 30秒間次いで 59 °Cにて 60秒間さらに 72 °Cにて 45秒間を 1サイクル とする保温を 37サイクル行う条件で P CRを行った。
PCRを行った後、 1. 5 %ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その 結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） 。
DNAフラグメント X2に関して、 A群（無処理群） の場合には、 増幅が確認され その増幅産物が得られた。 これに対して B群 （HpaII、 Hhal処理群） の場合には、 増 幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。一方、 DNAフラグメント Y2に関 しては、 A群 （無処理群） の場合と B群 （HpaII、 Hhal処理群） の場合ともに、 増幅 が確認されその増幅産物が得られた。 以上より、前記の目的とする D N A領域を含む一本鎖 D N Aを選択することが可能 であること、且つ、前記の目的とする DNA領域におけるメチル化されていない DN Aを増幅することなく、メチル化された D N Aのみを検出可能な量になるまで増幅し 、 増幅された D N Aの量を定量できることが確認された。 実施例 2 て下記の試験を行った。
1の割合になるようにラット血清 lmLに添加することにより、血清溶液を得た。当 該血清溶液（DNAフラグメント 25pg/mL水溶液、 10 xL) に、 5 Mピオチン化オリ ゴヌクレオチド B 1を 1 /iL、 及び、 アニーリングバッファ一 （0.5Mチャーチリン 酸バッファー、 7% SDS、 IfflM EDTA水溶液） を 10 L添加することにより、 混合物を 得た。 '
次いで得られた混合物を、 9 5 °Cで 5分間加熱した。その後、 50°Cまで速やかに 冷却し、 その温度で 5分間保温した。 次いで、 これを 3 7 °Cで 5分間保温した後、 室 温に戻し、目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN Aとピオチン化オリゴヌクレオチ
、 各々 6本作製） 。
次に、 ストレプトアビジンで被覆した PC Rチューブに、 上記のようにして、 前調 製された混合物を添加し、 さらに、 これを 3 7°Cで 5分間保温することにより、 ピオ チン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した（以上 、 本発明測定方法の第一工程に相当する） 。 次いで、前記の PC Rチューブから溶液を除去した後、 1 0 O Lの TEバッファ 一を添加した後、当該 TEバッファーをピペッティングにより取り除いた。当該操作 をさらに 2回実施した。
このようにして選択され得られた二本鎖 DN Aについて、以下の 2種の処理を施し た。
A群（無処理群） ：上記で調製された二本鎖 DN Aに、 Hp a I I及び Hh a Iに最 適な 1 OX緩衝液 (330mM Tris-Acetate H 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithothreitol) を 3 Lと、 1 0 XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 3 Lとを加えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 30 X Lとした（各々 3本作製） 。
B群（Hp a I I及び Hh a Iによる消化処理群） ：上記で調製された二本鎖 D N A に、 H p a I I及び H h a Iを夫々 15 Uと、 H p a I I及び H h a Iに最適な 10 X緩衝液 (330m Tris-Acetate pH7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2、 5mM Dithothre itol) を 3 Lと、 10XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 3 Lとを加 えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 30 zzLとした（各々 3本作製
各々の反応液を 37 °Cで 1時間インキュベーション（消化処理） した後、 上清を取 り除き、 100 の TEバッファーを添加した後、当該 TEバッファ一をピぺッテ イングにより取り除いた （以上、 本発明測定方法の第二工程に相当する。 ） 。 次に、得られた未消化物から、下記のプライマ一及び反応条件を用いて PCRを行 つた。 目的とする DNA領域がメチル化されていれば DNA (配列番号 22、 Genba nk Accession No. AC009800等に示される GP R 7配列の塩基番号 76669〜76835に相 当する配列） が増幅される。
PF4： 5' -GACAACGCCTCGTTCTCGG-3' (配列番号 23) PR4： 5'-GCGGAGTTGCCCGCCAGA-3' (配列番号 24)
PCRの反応液としては、铸型とするゲノム DNAに、 3 Mに調製した配列番号 23で示される塩基配列からなるプライマーの溶液及び配列番号 24で示される塩 基配列からなるプライマ一の溶液各 2. 5 1と、 各々 2mMの dNTPを 2. 5 1と、 10X緩衝液 (lOOmM Tris-HCl H 8.3, 500 KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Ge latin) を 2. 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラーゼ（AmpliTaq Gold) 5 U/ 1を 0. 125 1と、 5 Nベタイン水溶液を 5 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加 えて液量を 25 1とした。 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95 °C にて 30秒間次いで 63°Cにて 60秒間さらに 72 °Cにて 45秒間を 1サイクルと する保温を 35サイクル行う条件で PC Rを行った。
PCRを行った後、 1. 5 %ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その 結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） 。 DNAフラグメント X2に関して、 A群（無処理群） の場合には、 増幅が確認され その増幅産物が得られた。 これに対して B群 （HpaII、 Hhal処理群） の場合には、 増 幅は確認されずその増幅産物は得られなかった。一方、 DNAフラグメント Y2に関 しては、 A群 （無処理群） の場合及び B群 （HpaII、 Hhal処理群） の両場合ともに、' 増幅が確認されその増幅産物が得られた。 以上より、生物由来検体中に含まれるゲノム DN A由来の DN A試料としての血清 溶液を用いても、前記の実施例 1と同様に、前記の目的とする DN A領域を含む一本 鎖 DN Aを選択することが可能であること、且つ、前記の'目的とする DN A領域にお けるメチル化されていない DN Aを増幅することなく、メチル化された DN Aのみを 検出可能な量になるまで増幅し、増幅された D N Aの量を定量できることが確認され た。 実施例 3 実施例 1で得られた を用い て下記の試験を行った。
Figure imgf000052_0001
、 0. 1、 1及び 10 p g/10 / の丁£バッファ一 （10mM Tris、 ImM EDTA、 H 8.0) 溶液を調製した。 こ れら TEバッファ一溶液 10 L各々別々に、 5 Mピオチン化オリゴヌクレオチド B 1を 1 L、 10 Xアニーリングバッファ一 （330mM Tris—Acetate pH 7.9、 660m M K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2、 5mM Di thothrei tol) を 2 L、 及び、 滅菌超純水を 7 L添 加することにより、 混合物を得た。
次いで得られた混合物を、 95 °Cで 5分間加熱した。その後、 50°Cまで速やかに 冷却し、 その温度で 5分間保温した。 次いで、 これを 37 °Cで 5分間保温した後、 室 温に戻し、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (DNAフラグメント X2又は DNAフラグメント Y2) とピオチン化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させた (D
Figure imgf000052_0002
次に、 ストレプトアビジンで被覆した PC Rチューブに、 上記のようにして、 前調 製された混合物を添加し、 さらに、 これを 37 °Cで 5分間保温することにより、 ピオ チン化オリゴヌクレオチドをストレプトァビジンで被覆した支持体に固定した（以上 、 本発明測定方法の第一工程に相当する。 ） 。 次いで、前記の PC Rチューブから溶液を除去した後、 100 Lの洗浄バッファ 一 （0.05%Tween20含有リン酸バッファ一： ImM KH2P04, 3mM Na2HP0 · 7H20, 15 mM NaCK pH7.4) を添加した後、 当該洗浄バッファ一をピペッティングにより取り除い た。 当該操作をさらに 2回実; した。 その後、 このようにして得られた二本鎖 DNAについて、以下の 2種の処理を施し
A群（無処理群） ：上記で調製された二本鎖 DNAに、 Hp a I I及び Hh a Iに最 適な 1 OX緩衝液 (330mM Tris-Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2、 5mM Dithothreitol) を と、 10XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 3 Lとを加えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 3 O ^Lとした。
B群（Hp a I I及び Hh a Iによる消化処理群） ：上記で調製された二本鎖 DN A に、 H p a I I及び H h a Iを夫々 15 Uと、 H p a I I及び H h a Iに最適な 10 X緩衝液 (330mM Tris-Acetate pH7.9 660m K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithothre itol) を 3 Lと、 10XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 3 Lとを加 えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 30 Lとした。
各々の反応液を 37 °Cで 5時間インキュベーション（消化処理） した後、 上清を取 り除き、 100 Lの上記洗浄バッファーを混合した後、当該洗浄バッファ一をピぺ ッティングにより取り除いた （以上、 本発明測定方法の第二工程に相当する。 ） 。 次に、得られた未消化物から、下記のプライマ一及び反応条件を用いて PC Rを行 つた。 目的とする DNA領域がメチル化されていれば DNA (配列番号 22で示され る塩基配列を有する。 Genbank Accession No. AC009800等に示される G P R 7配列の 塩基番号 76669〜76835に相当する配列） が増幅される。
PF4： 5' -GACAACGCCTCGTTCTCGG-3' (配列番号 23 )
PR4： 5'-GCGGAGTTGCCCGCCAGA-3' (配列番号 24) PCRの反応液としては、铸型とするゲノム DNAに、 5 O Mに調製した配列番 号 23で示される塩基配列からなるプライマ一の溶液及び配列番号 24で示される 塩基配列からなるプライマ一の溶液各 0. 3 1と、各々 2mMの dNTPを 5 1 と、 10 X緩衝液 (lOOmM Tris-HCl H 8.3、 500mM KC1、 15mM MgClい 0.01% Gela tin) を 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 5U/ 1を 0. 2 5 1と、 5 Nベタイン水溶液を 10 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液 量を 50 1としたものを用いた。 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 30秒間次いで 59 °Cにて 30秒間さらに 72 °Cにて 45秒間を 1サイ クルとする保温を 32サイクル行う条件で PC Rを行った。 PCRを行った後、 1. 5 %ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その 結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） 。
DNAフラグメント X 2に関して、 A群（無処理群） の場合には、 l pg/1 0 Lのサンプル及び l O pgZl O ^Lのサンプルで増幅が確認されその増幅産物が 得られた。
これに対して B群 （HpaII、 Hhal処理群） の場合には、 全てのサンプルで、 その増幅 産物は得られなかった。 一方、 DNAフラグメント Y2に関しては、 A群（無処理群 ) 及び B群 （HpaII、 Hhal処理群） の 1 p gZ 10 Lのサンプル及び 10 p gZ 1 0 /zLのサンプルで、 増幅が確認されその増幅産物が得られた。 以上より、 アニーリングバッファ一として二価陽イオン （マグネシウムイオン） を 含有する溶液を用いて、 且つ、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） と 、当該一本鎖 D N Aの目的とする D N A領域に対して相補性である塩基配列を有する 一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させることで、前記の実施例 1及び実 施例 2と同様に、前記の目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN Aを選択することが 可能であること、且つ、 メチル化感受性制限酵素での処理により、前記の目的とする DN A領域におけるメチル化されていない DN Aを増幅することなく、メチル化され た D N Aのみを検出可能な量になるまで増幅し、増幅された D N Aの量を定量できる ことが確認された。 実施例 4
実施例 1で得られた D N Aフラグメント X 2及び D NAフラグメント Y2を用い て下記の試験を行った。 p g/10 Lラット血清溶液を調製した。 これら溶液 10 各々別々に、 5 M ピオチン化オリゴヌクレオチド B 1を 1 L、 1 0 Xアニーリングバッファ一 （330 mM Tris-Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2、 5mM Dithothreitol) を 2 、 及び、 滅菌超純水を 7 L添加するこ,とにより、 混合物を得た。
次いで得られた混合物を、 95 °Cで 5分間加熱した。その後、 50°Cまで速やかに 冷却し、 その温度で 5分間保温した。 次いで、 これを 37 °Cで 5分間保温した後、 室 温に戻し、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (DNAフラグメント X2又は DNAフラグメント Y2) とピオチン化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させた（D
Figure imgf000055_0001
次に、ストレプトアビジンで被覆した PC Rチューブに、上記のようにして、前調 製された混合物を添加し、 さらに、 これを 37 で 5分間保温することにより、 ピオ チン化ォリゴヌクレオチドをストレプトァビジンで被覆した支持 に固定した（以上 、 本発明測定方法の第一工程に相当する。 ） 。 次いで、前記の: P C Rチューブから溶液を除去した後、 100 Lの洗浄バッファ 一 （0.05 Tween20含有リン酸バッファー： ImM KH2P04, 3mM Na2HP0 - 7H20> 1 54mM NaC pH7.4)を添加した後、当該洗浄バッファ一をピペッティングにより取 り除いた。 当該操作をさらに 2回実施した。 その後、 このようにして得られた二本鎖 DNAについて、以下の 2種の処理を施し た。
A群 （無処理群） ：上記で調製された二本鎖 DN Aに、 Hp a I I及び Hh a Iに最 適な 1 OX緩衝液 (330mM Tris- Acetate pH 7.9, 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithothreitol) を 3 Lと、 10 X B S A (Bovine serum albumin lmg/ml) を Lとを加えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 3 とした。
B群（Hp a I I及び Hh a Iによる消化処理群） ：上記で調製された二本鎖 DN A に、 Hp a I I及び Hh a Iを夫々 15Uと、 Hp a I I及び Hh a Iに最適な 10 X緩衝液 （330mM Tris - Acetate pH7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2、 5mM Dithothre itol) を 3 Lと、 10XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 3 Lとを加 えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 30 Lとした。 各々の反応液を 37°Cで 5時間インキュベーション（消化処理） した後、 上清を取 り除き、 100 Lの上記洗浄バッファ一を添加した後、当該洗浄バッファ一をピぺ ッティングにより取り除いた （以上、 本発明測定方法の第二工程に相当する。 ） 。 次に、得られた未消化物から、下記のプライマ一及び反応条件を用いて PC Rを行 つた。 目的とする DNA領域がメチル化されていれば DNA (配列番号 22で示され る塩基配列を有する。 Genbank Accession No. AC009800等に示される G P R 7配列の 塩基番号 76669〜76835に相当する配列） が増幅される。 PF4： 5' -GACAACGCCTCGTTCTCGG-3' (配列番号 23 )
PR4： 5' -GCGGAGTTGCCCGCCAGA-3' (配列番号 24)
PCRの反応液としては、铸型とするゲノム DNAに、 50 Mに調製した配列番 号 23及び配列番号 24で示される塩基配列からなるプライマ一の溶液各 0. 3 1 と、 各々 2mMの dNTPを 5 1と、 10 X緩衝液 （lOOmM Tr is- HC1 pH 8.3、 5 OOmM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin) を 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラ一ゼ （ AmpliTaq Gold) 5U/ lを 0. 25 1と、 5 Nベタイン水溶液を 10 1とを 混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 a 1としたものを用いた。当該反応液 を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒間次いで 59°Cにて 30秒間 さらに 72°Cにて 45秒間を 1サイクルとする保温を 32サイクル行う条件で PC Rを行った。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その 結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） 。 DNAフラグメント X 2に関して、 A群,（無処理群） の場合には、 l pg/10 χ Lのサンプル及び 10 p g/10 2 Lのサンプルで増幅が確認されその増幅産物が 得られた。
これに対して B群 （HpaII、 Hhal処理群） の場合には、 全てのサンプルで、 その増幅 産物は得られなかった。 一方、 DNAフラグメント Y2に関しては、 A群（無処理群 ) 及び B群 （HpaII、 Hhal処理群） の 1 p gZ 10 ^ Lのサンプル及び 10 p g/ 1 0 のサンプルで、 増幅が確認されその増幅産物が得られた。 以上より、生物由来検体中に含まれるゲノム DN A由来の DN A試料としての血清 溶液を用いて、且つ、 アニーリングバッファ一として二価陽イオン（マグネシウムィ オン） を含有する溶液を用いて、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） と、当該一本鎖 DN Aの目的とする DN A領域に対して相補性である塩基配列を有す る一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させることで、前記の実施例 3と同 様に、前記の目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN Aを選択することが可能である こと、 且つ、 メチル化感受性制限酵素での処理により、前記の目的とする DNA領域 におけるメチル化されていない DNAを増幅することなく.、メチル化された DNAの みを検出可能な量になるまで増幅し、増幅された D N Aの量を定量できることが確認 された。 実施例 5
AT C Cより購入された哺乳動物由来の乳癌細胞株 MC F - 7 (ATCC NO. HTB-22) を、 AT C Cのカタログに記載された当該細胞株のための専用培地でコンフルェント になるまで培養することにより、 約 1 X 107個の細胞を得た。得られた細胞に、 S EDTAバッファ一 [lOmM Tris-HCl pH 8.0、 lOmM EDTA H 8.0、 lOOmM NaCl] を 1 0倍容量加えた後、 これをホモジナイズした。 得られた混合物に、 proteinase K (S igma) を 500 g Zm 1及びドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w/v)になるように加 えた後、 これを 55°Cで約 16時間振とうした。振とう終了後、 当該混合物をフエノ ール [1M Tris-HCK pH 8.0 にて飽和] ·クロ口ホルム抽出処理した。 水層を回収し 、 これに NaC lを 0. 5Nとなるよう加えた後、 これをエタノール、沈澱処理して生 じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を TEバッファー （lOmM Tris、 ImM EDTA, pH 8.0) に溶解し、 これに 40 n g/m 1になるように RN a s e A (S i gma) を 加えて 37 °Cで 1時間インキュベートした。インキュベートされた混合物をフエノー ル-クロ口ホルム抽出処理した。 水層を回収し、 これに NaC lを 0. 5 Nとなるよ う加えた後、 これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱（ゲノム DNA) を回収した 。回収された沈澱を 70%エタノールでリンスすることにより、ゲノム DN Aを得た 得られたゲノム DNAを铸型として、以下のプライマ一及び反応条件を用いて PC Rを行うことにより、供試サンプルとして用いられる配列番号 17で示される塩基配 列（Genbank Accession No. M80343等に示される LINE1配列の塩基番号 257〜352に相当 する領域） を含む DNAフラグメント （DNAフラグメント XI、配列番号 25で示 される塩基配列を有する。 Genbank Accession No. M80343等に示される L I NE 1配 列の塩基番号 8〜480に相当する配列） を増幅した。
PF1： 5' -GAGCCAAGATGGCCGAATAGG-3' (配列番号 26)
PR1： 5' -CTGCTTTGTTTACCTAAGCAAGC-3' (配列番号 27) PCRの反応液としては、錶型とするゲノム DNAを 2ngと、 l O O pmo lZ H 1に調製した配列番号 26で示される塩基配列からなるプライマ一の溶液及び配 列番号 27で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各 0. 125 1と、各々 2mMの dNTPを 2. 5 1と、 10 X緩衝液（lOOmM Tris- HC1 pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 2. 5 1と、 耐熱性 DNA
ポリメラ一ゼ 5UZ i 1を 0. 125 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて 液量を 25 a 1としたものを用いた。当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後 、 95 °Cにて 30秒間次いで 63 °Cにて 60秒間さらに 72°Cにて 45秒間を 1サイ クルとする保温を 50サイクル行う条件で P C Rを行った。
P CRを行った後、 1. 5 %ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 目的の DNAフラグメント （473bp、 DNAフラグメント XI) を切り出し、 QIAGEN QIAqu ick Gel Extraction Kit (QIAGEN社） を用いて精製した。
得られた DNAフラグメント X 1の一部をメチル化酵素 S s s I (NEB社） により 処理し、 5— CG—3' 全てをメチル化した DNAフラグメント （以下、 DNAフラ グメント Ylと記す） を得た。 これについても、 先と同様に、 1. 5%ァガロースゲ ル電気泳動により増幅を確認し、 目的の DNAフラグメント （473bp、 DNAフラグ メント Y1) を切り出し、 QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社) を用い て精製した。 ラグメントと非メチル化フラグメントとの混合物を調製した。 表 1
Figure imgf000059_0001
I〜V各々の DNAフラグメントを用いて、 以下の 4種の溶液を調製した
A群 （無処理群） ： DNAフラグメント約 25 ngに、 Hp a I I及び Hh a Iに最 適な 1 O X緩衝液 (330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOniM Mg0Ac2、 5mM Dithothreitol) を 2 ;(iLと、 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 2 Lとを加えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 20 Lとした。
B群 （Hpall処理群） ： DNAフラグメント約 25 n gに、 Hp a I Iを 0. 5Uと、 Hp a I I及び Hh a Iに最適な 10 X緩衝液 （330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660m M K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithothreitol) を 2 Lと、 10 XBSA (Bovine s erum albumin lmg/ml) を 2 Lとを加えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加え て液量を 20 Lとした。
C群 （Hhal処理群） ： DNAフラグメント約 25 n gに、 Hh a Iを 0. 5Uと、 H p a l l及び Hh a Iに最適な 10 X緩衝液 （330mM Tris-Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithothreitol) を と、 10XBSA (Bovine ser um albumin lmg/ml) を 2 Lとを加えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて 液量を 20 xLとした。
D群 （Hpall及び ffiial処理群） ： DN Aフラグメント約 25 n gに、 Hp a l I及び Hh a Iを夫々 0. 5Uと、 Hp a I I及び Hh a Iに最適な 10 X緩衝液（330mM Tris-Acetate ρΗ7· 9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithothreitol) を 2 Lと 、 10XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 2 Lとを加えて、 さらに当該 混合物に滅菌超純水を加えて液量を 20 Lとした。 各々の反応液を 37 °Cで 2時間インキュベーションした後、これに滅菌超純水を加 えて 100倍希釈した。 ' 各希釈溶液 5 /L (DNAフラグメント 62.5pg相当量） を铸型とし、 配列番号 17で示 される塩基配列からなる領域の DNA量を求めるために、下記のプライマ一 PF 2及 び PR 2並びに 5'末端がレポ一タ一蛍光色素である F AM (6—カルボキシ—フル ォレツセイン）及び 3'末端がクェンチヤ一蛍光色素である TAMR A (6—力ルポ キシ—テトラメチルーローダミン）で標識されたプローブ T 1を用いたリアルタイム P CRを行った。
<プライマー >
P F 2 (フォヮ一ド側） ： 5' -CACCTGGAAAATCGGGTCACT-3' (配列番号 28 )
PR 2 (リバース側） ： 5'- CGAGCCAGGTGTGGGATATA-3' (配列番号 29)
<プローブ > T 1 ： 5'-CGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTT-3' (配列番号 30)
PCRの反応液としては、錶型とする DNAフラグメント 62. 5 pgと、 3 pm o \ / H 1に調製した配列番号 28で示される塩基配列からなるプライマーの溶液 及び配列番号 29で示される塩基配列からなるプライマーの溶液 2種を各 2. 5 PL 1 と、 2. 5 pmo 1 Z/ Lに調製した配列番号 30で示される塩基配列からなるプロ —ブを 2. 5 Lと、 各々 2mMの dNTPを 2. 5 1と、 10XPCR緩衝液（ lOOmM Tris-HCl H 8.3、 500mM KC1、 15πιΜ MgClい 0.01% Gelatin)を 2. 5^ 1と 、 耐熱性 DNAポリメラ一ゼ （AmpliTaq Gold) 5U/ 1を 0. 125 1とを混 合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 ii 1としたものを用いた。 リアルタイム PCRは、 Gene Amp 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystemsリ 用レ て 実施した。配列番号 17で示される塩基配列のうち塩基番号 1〜94で示される塩基 配列からなる領域 （DNA) を増幅するために、 当該反応液を、 95°Cにて 10分間 保温した後、 95 °Cにて 15秒間、 60 °Cにて 60秒間を 1サイクルとしてリアルタ ィム PC Rを行った。当該リアルタイム PC Rの結果により、 当該領域の DN A量を 定量した。 各生物由来検体について 3回試験を実施した。
その結果を図？〜 11に示した。 A群での当該領域の DN A量を 1として、他の群 での当該領域の DN A量を示した。 図 7 ( 「I」 ） は、 メチル化割合 0%のフラグメ ント混合物であるため、 B群、 C群及び D群での理論値は 「0」 、 図 8 ( 「I IJ ) は、 メチル化割合 1 0 %のフラグメントであるため、 B群、 C群及び D群での理論値 は 「0. 1」 、 図 9 ( 「I I I」 ） は、 メチル化割合 25 %のフラグメントであるた め、 B群、 C群及び D群での理論値は 「0. 2 5」 、 図 1 0 ( 「I V」 ） は、 メチル 化割合 5 0 %のフラグメントであるため、 B群、 C群及び D群での理論値は「0. 5 」 、 図 1 1 ( 「V」 ） は、 メチル化割合 1 0 0 %のフラグメントであるため、 B群、 C群及び D群での理論値は「1」 を示すことになる。 実験の結果、 図 7〜11に示す 通り、 D群で、 この理論値に最も近い値が得られており、 2種類以上のメチル化感受 性酵素での消化処理が好ましいことが明らかとなった。 産業上の利用可能性
本発明により、生物由来検体中に含まれるゲノム D N Aが有する目的とする D N A 領域におけるメチル化された D N Aの含量を簡便に測定する方法等を提供すること が可能となる。 配列表フリーテキスト
配列番号 1 9
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 2 0
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 2 1 ' 固定化のために設計されたピオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号 2 3
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 2 4
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号 2 6
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 2 7
PCRのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 2 8
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 2 9
PCRのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 3 0 ,
リアルタイム PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ

Claims

請求の範囲
1.生物由来検体中に含まれるゲノム DNAが有する目的とする DNA領域における メチル化された D N Aの含量を測定する方法であって、
(1)生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料から、 目的とする D NA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） と、 当該一本鎖 DNAの目的とする DNA領域 に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基 '対合させることにより、前記の一本鎖 DN Aを選択し、選択された一本鎖 DN Aと前 記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとが塩基対合してなる二本鎖 DNAを形成さ せる第一工程、
( 2 )第一工程で形成させた二本鎖 D N Aを 1種類以上のメチル化感受性制限酵素で 消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位 に 1つ以上のアンメチル状態の C p G対を含む二本鎖 DNA) を除去する第二工程、 及び、
(3)下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である形成され た二本鎖 DNA (前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を含まない形成された二本鎖 DNA) を一本鎖状態に一旦分離する工程（第一前 工程） と、
生成した遊離の一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 前記の一本鎖固定化オリゴヌク レオチドとを塩基対合させることにより、前記の生成した遊離の一本鎖状態である D N Aを選択し、選択された一本鎖 D N Aと前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと が塩基対合してなる二本鎖 DN Aを形成させる工程 （第二 （A) 前工程） と、 当該工程 （第二 （A) 前工程） で形成された二本鎖 DNAを、 前記の選択された一本 鎖 DN Aを铸型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマ一として 、当該プライマーを 1回伸長させることにより、前記の選択された一本鎖 DNAを伸 長形成された二本鎖 DNAとする工程 （第二 （B) 前工程） と
を有する工程 （第二前工程） と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖 DN A (前記のメチル化感受性制限酵素の認識部 位にアンメチル状態の CpG対を含まない伸長形成された二本鎖 DNA)を、一本鎖 状態である DNA (正鎖） と一本鎖状態である DNA (負鎖） に一旦分離する工程 （ 第三前工程） とを有し、 且つ、 本工程として
(a) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 前記の一本鎖固定化オリゴヌク レオチド （負鎖） とを塩基対合させることにより、前記の一本鎖状態である DNAを 選択する第 A 1工程と、第 A 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型とし て、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを 1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態である DNAを二本鎖 D N Aとして伸 長形成させる第 A 2工程とを有する第 A工程 （本工程） と、
(b) 生成した一本鎖状態である DNA (負鎖） を铸型として、 前記の一本鎖状態で ある DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記 の目的とする DN A領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基配列 （負鎖） の 3' 末端よりさらに 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対して相補性 である塩基配列 （正鎖） を有し、 且つ、 前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドを铸 型とする伸長反応に利用できないオリゴヌクレオチド（リバース用プライマ一）を伸 長プライマーとして、 当該オリゴヌクレオチドを 1回伸長させることにより、前記の 一本鎖状態である DNAを伸長形成された二本鎖 DNAとする第 B工程（本工程） と を有し、
さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖 DN A を一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とする DNA領域 におけるメチル化された DN Aを検出可能な量になるまで増幅し、増幅された DN A の量を定量する第三工程、
を有することを特徴とする方法。 2. 第一工程において、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） と、 当該 一本鎖 D N Aの目的とする D N A領域に対して相補性である塩基配列を有する一本 鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させる際に、二価陽イオンを含有する反応 系中で塩基対合させることを特徴とする請求項 1記載の方法。
3 .二価陽イオンがマグネシウムイオンであることを特徴とする請求項 2記載の方法
4. 請求項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の第一前工程の前操作段階において、 前記の目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） の 3 '末端の一部に対して 相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
請求項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の各本工程として、下記の 1つの工程をさ らに追加的に有することを特徴とする方法。
( c ) ( i ) 生成した一本鎖状態である D NA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反応 系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖） とを塩基対合させることにより 、 前記の一本鎖状態である D NAを選択する第 C 1工程と、
( i i )第 C 1工程で選択された一本鎖状態である D NAを铸型として、前記の一本 鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマ一として、 当該プライマーを 1回伸長させ ることにより、前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成されたニ本鎖 D N Aとする 第 C 2工程とを有する第 C工程 （本工程） 。
5 . 請求項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の第一前工程の後操作段階において、 前記の目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） の 3 '末端の一部に対して 相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、 第二工程及び上記 の追加前工程を経て得られた未消化物である二本鎖 D N A (前記のメチル化感受性制 限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を含まない伸長形成された二本鎖 D NA) を一本鎖状態に一旦分離する工程 （追加再前工程） を有し、 且つ、
請求項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の各本工程として、下記の 1つの工程をさ らに追加的に有することを特徴とする方法。
( c ) ( i ) 生成した一本鎖状態である D NA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反応 系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖） とを塩基対合させることにより 、 前記の一本鎖状態である D NAを選択する第 C 1工程と、
( i i )第 C 1工程で選択された一本鎖状態である D NAを铸型として、前記の一本 鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 当該プライマ一を 1回伸長させ ることにより、前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成された二本鎖 D N Aとする 第 C 2工程とを有する第 C工程 （本工程） 。
6 . 請求項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の第三前工程の前操作段階において、 前記の目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） の 3 '末端の一部に対して 相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
請求項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の各本工程として、下記の 1つの工程をさ らに追加的に有することを特徴とする方法。
( c ) ( i ) 生成した一本鎖状態である D NA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反応 系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖） とを塩基対合させることにより 、 前記の一本鎖状態である D NAを選択する第 C 1工程と、
( i i )第 C 1工程で選択された一本鎖状態である D NAを铸型として、前記の一本 鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマ一として、 当該プライマーを 1回伸長させ ることにより、前記の一本鎖状態である D NAを伸長形成された二本鎖 D NAとする 第 C 2工程とを有する第 C工程 （本工程） 。
7 . 請求項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の第三前工程の後操作段階において、 前記の目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） の 3 '末端の一部に対して 相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程（追加前工程） を追加的に有し、 且つ、 第二工程及び上記 の追加前工程を経て得られた未消化物である二本鎖 D N A (前記のメチル化感受性制 限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を含まない伸長形成された二本鎖 D NA) を一本鎖状態に一旦分離する工程 （追加再前工程） を有し、 且つ、 請求項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の各本工程として、下記の 1つの工程をさ らに追加的に有することを特徴とする方法。
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反応 系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖） とを塩基対合させることにより' 、 前記の一本鎖状態である DNAを選択する第 C 1工程と、
( i i)第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、前記の一本 鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 当該プライマーを 1回伸長させ ることにより、前記の一本鎖状態である DN Aを伸長形成された二本鎖 DN Aとする 第 C 2工程とを有する第 C工程 （本工程） 。
8.請求項 1〜 7のいずれかに記載の方法の工程として、下記の 2つの工程をさらに 追加的に有することを特徴とするメチル化割合の測定方法。
(4)請求項 1〜7のいずれかに記載の方法の第一工程を行った後、請求項 1〜8の いずれかに記載の方法の第二工程を行うことなく、請求項 1〜 7のいずれかの項記載 の方法における第三工程を行うことにより、前記の目的とする DNA領域の DNA ( メチル化された DN A及びメチルされていない DNAの総量）を検出可能な量になる まで増幅し、 増幅された DN Aの量を定量する第四工程、 及び、
( 5 )請求項 1〜 7のいずれかに記載の第三工程により定量された D N Aの量と、第 四工程により定量された DN Aの量とを比較することにより得られる差異に基づき 前記の目的とする DN A領域におけるメチル化された DN Aの割合を算出する第五 工程。
9.生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする請求項 1〜8 のいずれかに記載の方法。
10. 生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする請求項 1〜 8のいずれかに記載の方法。
1 1. 生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする請求項 1 〜 8のいずれかに記載の方法。
12. 生物由来検体中に含まれるゲノム DN A由来の DN A試料が、当該ゲノム DN Aが有する目的とする DN A領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理 されてなる DNA試料であることを特徴とする請求項 1〜11のいずれかに記載の 方法。
13. 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 1種類以上のメ チル化感受性制限酵素で消化処理されてなる DN A試料であることを特徴とする請 求項 1〜 12のいずれかに記載の方法。
14. 生物由来検体中に含まれるゲノム DN A由来の DN A試料が、予め精製されて なる DN A試料であることを特徴とする請求項 1〜 13のいずれかに記載の方法。
15. 1種類以上のメチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノム D N Aが有する目的とする DNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であるこ とを特徴とする請求項 1〜 12のいずれかに記載の方法。
16. 1種類以上のメチル化感受性制限酵素が、 メチル化感受性制限酵素である Hpa II又は Hhalであることを特徴とする請求項 1〜 14のいずれかに記載の方法。
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