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WO2008064865A2 - Vorrichtung zur durchführung und untersuchung biologischer proben mit temperaturgesteuerten biologischen reaktionen - Google Patents

Vorrichtung zur durchführung und untersuchung biologischer proben mit temperaturgesteuerten biologischen reaktionen Download PDF

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WO2008064865A2
WO2008064865A2 PCT/EP2007/010298 EP2007010298W WO2008064865A2 WO 2008064865 A2 WO2008064865 A2 WO 2008064865A2 EP 2007010298 W EP2007010298 W EP 2007010298W WO 2008064865 A2 WO2008064865 A2 WO 2008064865A2
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WO
WIPO (PCT)
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reaction chamber
biochip
cooling
heating
chamber
Prior art date
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PCT/EP2007/010298
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French (fr)
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WO2008064865A3 (de
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Stefan Heydenhauss
Jens GÖHRING
Friedrich Menges
Jürgen Bauer
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Zenteris GmbH
Original Assignee
Zenteris GmbH
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Publication date
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Priority to DE112007000683T priority patent/DE112007000683B4/de
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    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples

Definitions

  • the invention relates to a device for carrying out and testing biological samples with temperature-controlled biological reactions.
  • a biochip has a generally planar substrate with different capture molecules, which are arranged on predetermined on the surface of the substrate points, the spots.
  • a labeled with a marker substance reacts with certain catcher molecules according to the key-lock principle.
  • the capture molecules are DNA sequences (see, e.g., EP 373 203 B1) or proteins.
  • Such biochips are also called arrays or DNA arrays.
  • the labels are often fluorescent markers.
  • An optical reader captures the fluorescence intensity of the individual spots. This intensity correlates with the number of labeled probe molecules immobilized with the capture molecules.
  • WO 2005/108604 A2 discloses a heatable reaction chamber for processing a biochip.
  • This reaction chamber has an elastic membrane.
  • a silicon biochip is arranged on the membrane.
  • a nickel-chromium thin-film conductor is provided as a heating device.
  • Such nickel-chromium thin-film interconnects have a high electrical resistance and a correspondingly high heating power.
  • an additional trace for temperature measurement is provided.
  • a housing wall is designed as a membrane, so that the biochip 6 can be pressed by means of a plunger 12 against a cover glass 23 lying opposite the membrane 13.
  • a reaction liquid 26 located in the reaction chamber is displaced from the surface of the biochip and does not interfere with the optical detection.
  • a seal 22 is arranged between the membrane 13 and the cover glass 23.
  • the sample liquid 26 is filled by means of a filling cannula 19, which is pushed through the seal 22.
  • ramming 20 excess sample liquid 26 is derived from the reaction chamber 5 by means of a pressure compensating cannula.
  • WO 01/02 094 A1 describes means for applying temperature to biochips, which comprise microstructured resistance heating lines.
  • US Pat. Nos. 5,759,846 and 6,130,056 each describe a reaction chamber for receiving biological tissues.
  • a reaction chamber for receiving biological tissues.
  • a flexible circuit board with electrodes. By compressing the biological tissue and the flexible circuit board, an electrical contact between the biological tissue and the electrodes of the flexible circuit board can be made so that an electrical tap can be made directly on the biological tissue.
  • a reaction chamber in which a biochip can be processed.
  • the reaction chamber has two opposite walls, between which the biochip is arranged.
  • One of the two walls is designed to be transparent, so that it is transparent both for excitation radiation and for signals emitted by the biochip.
  • At least one of the two walls is so mobile that the room between the biochip and the transparent wall is compressible, whereby the sample solution located therebetween can be displaced.
  • US 2004/0047769 A1 and JP 2002-365299 A show a bag made of a plastic material which serves to absorb blood.
  • the blood can be prepared for examination with a DNA array.
  • the DNA array is integrated in the bag.
  • the blood and a sample solution in the pocket are urged towards the DNA array and into a waste area arranged behind it.
  • the DNA array can be read in a conventional manner.
  • the invention has for its object to provide a device for performing and testing biological samples with temperature-controlled biological reactions, which has a hermetically sealed reaction chamber for receiving a biochip and a simple displacement of the sample solution from the area between the biochip and integrated in the reaction chamber Window allowed.
  • the device according to the invention for carrying out and examining biological samples with temperature-controlled biological reactions comprises:
  • reaction chamber for receiving a biochip, wherein the reaction chamber has at least one transparent window, so
  • Excitation light can be radiated from the outside onto the biochip and fluorine essence light from the biochip can be radiated outwards to a measuring device.
  • This device is characterized in that the reaction chamber is communicatively connected to a compensation chamber.
  • the air in the reaction chamber is forced into the expansion chamber and compressed there together with the already existing air.
  • the sample solution located in the reaction chamber is pressurized.
  • the air in the equalization chamber acts on the sample solution as an elastic spring element that allows further displacement of sample solution, wherein the restoring force exerted by the air on the sample solution is small.
  • the force with which the membrane of the reaction chamber must be actuated to displace the sample solution small compared to the conventional reaction chamber with such a membrane.
  • the size of the volume of the expansion chamber determines the working pressure in the reaction chamber. If the volume of the compensation chamber is greater than that of the reaction chamber, a pressure of less than 1 bar is built up when the reaction chamber is completely filled with sample solution. Does that correspond Volume of the expansion chamber to the volume of the reaction chamber, then a pressure of about 1 bar is built up when completely filling the reaction chamber with sample solution. If, on the other hand, the volume of the compensation chamber is smaller than the volume of the reaction chamber, a pressure of more than 1 bar is built up when the reaction chamber is completely filled with sample solution.
  • the working pressure in the reaction chamber can be specifically defined by defining the volume of the expansion chamber.
  • the membrane may be formed as a flexible printed circuit board. Heating / measuring structures can be integrated in this printed circuit board. Such a flexible circuit board thus serves both for heating, measuring and for displacing the sample solution from the area between the biochip and the window.
  • the membrane may also be formed as a transparent plastic film, which serves both as a window for the optical measurements and for displacing the sample solution between the biochip and the film itself.
  • the biochip itself does not have to be moved in the reaction chamber.
  • the device preferably has a filling channel leading to the reaction chamber, in which a check valve is arranged. This makes it possible to fill the reaction chamber by means of a pipette. It is not necessary to use a cannula with which, as is the case with conventional such devices, a seal is pierced.
  • the body limiting the reaction chamber is preferably formed of COC (cycloolefin copolymer). This is an inert plastic material that does not require additional passivation of surfaces to perform temperature-controlled biological reactions (particularly the PCR method) in the reaction chamber.
  • COC cycloolefin copolymer
  • a check valve may be provided in the compensation channel.
  • this check valve is designed to be unlockable from the outside, so that controlled sample solution can be fed back into the reaction chamber.
  • This check valve may be provided both in the embodiments with a flexible printed circuit board and / or transparent plastic film.
  • the check valve in the compensation channel is preferably designed such that it opens only from a predetermined pressure. As a result, a pressure corresponding to the opening pressure of the check valve is quickly built up within the reaction chamber when filling the reaction chamber. If this opening pressure is exceeded, the valve opens and allows medium to flow into the equalization chamber. By providing a check valve with opening pressure, it is possible to agitate the sample solution within the reaction chamber without the sample solution entering the equalization chamber unless the opening pressure is exceeded.
  • a check valve and a controllable valve from the outside can be arranged in the compensation channel. This valve can be selectively opened and closed to control the exchange of medium between the reaction chamber and the compensation chamber.
  • the compensation chamber can also be designed with a variable volume, so that by increasing the volume of the compensation chamber, the sample solution is sucked out of the reaction chamber.
  • a doctor blade in particular a plastic doctor blade, with which the plastic film is painted onto the biochip instead of the roller.
  • the plastic film is pressed flat against the biochip by means of a plate, so that the entire sample liquid between the biochip and the plastic film is safely displaced.
  • the transparent plastic film may be provided on its side facing the biochip with an adhesive or adhesive layer which can be activated when it comes in contact with the sample solution.
  • an adhesive or adhesive layer which can be activated when it comes in contact with the sample solution.
  • This adhesion or adhesive layer is preferably provided on the region of the film which does not come into contact with the area containing the spots of the biochip. The adhesion or adhesive layer is thus arranged circumferentially around the active region of the biochip.
  • FIG. 1 shows a base body of a cartridge according to the invention in a view from below
  • reaction fields spots
  • biochip with optically impermeable and non-fluorescent back
  • Fig. 3 shows an embodiment of a flexible used in the invention
  • FIG. 4 shows a first exemplary embodiment of a biochip with a flex printed circuit board applied to a main body
  • FIG. 5 shows a second exemplary embodiment of a biochip with a flex printed circuit board applied to a main body
  • FIG. 7 shows an embodiment of the arrangement according to the invention, equipped with a transparent panel in a non-transparent base body
  • FIG. 8 shows an embodiment of the cartridge according to the invention, equipped with a nontransparent panel on a transparent main body
  • FIG. 9 shows the section of the illuminated area in the sample space of the inlay without
  • FIG. 10 shows the process principle of filling a sample liquid through cannulas in the reaction chamber according to the prior art
  • Fig. 11 shows the principle of the method of displacement of the supernatant by means of
  • FIG. 12 shows a cartridge with inlay and a flex circuit board stabilization disk
  • FIG. 13 shows a preferred embodiment of a layout of the flex circuit board
  • FIG. 15 shows a control method in a flow chart
  • FIG. 16 shows a cooling device in a schematically simplified illustration
  • FIG. 17 shows a first exemplary embodiment of the cooling device in a schematically simplified sectional illustration
  • FIG. 18 shows a second embodiment of the cooling device in a schematically simplified sectional view
  • FIG. 19 shows an alternative heating / cooling device for heating and cooling the
  • FIG. 20 shows a modification of the heating / cooling device from FIG. 19.
  • a cartridge with a biochip will be described with reference to FIGS. 1-9 and 12.
  • plastic base body 1 contains at the bottom of a recess for a filling channel 7, the one of
  • Filling opening 9 leads to a reaction chamber 5 (Fig. 1, 6), and recesses for the reaction chamber 5, a compensation channel 4 between the reaction chamber 5 and a compensation chamber 2 and a recess for the compensation chamber 2.
  • Filling opening 9 is formed with a conically tapered portion (Fig. 6), which facilitates the insertion of a pipette tip.
  • Fig. 6 conically tapered portion
  • a pipette tip In the filling opening is a
  • Check valve 8 is arranged. In the compensation channel 4 is a viewing window
  • Base body 1 is transparent and thus forms a detection window 14 through which a biochip 6 arranged underneath can be detected.
  • the connecting channels are as short as possible and formed with the smallest possible cross-section so that the dead volume is kept small and the necessary excess of sample liquid is kept small.
  • a flexible printed circuit board 10 On the underside of the main body 1 is a flexible printed circuit board 10, which is referred to below as the flex circuit board 10 (FIG. 3).
  • the Fiex printed circuit board 10 is connected to the underside of the main body 1 such that the recesses 7, 5, 4, 3, 2 are limited towards the bottom and form a continuous communicating, self-contained fluid channel.
  • the flexible printed circuit board 10 contains contact surfaces 10.1, a digital storage medium 10.2 (eg an EEPROM) and an internal heating / measuring structure 10.3 (FIG. 3).
  • a biochip 6 (FIG. 2) which has a number of MN reaction fields 6.1.
  • the biochip 6 on the back is optically impermeable and non-fluorescent, eg coated with black chrome 6.2.
  • the flex circuit board 10 forms a boundary wall of the reaction chamber 5.
  • the biochip 6 is fixed on the flex circuit board 10 and then the flex circuit board 10 is connected to the base body 1.
  • the connection between the flex circuit board 10 and the biochip 6 is made with an adhesive bonding layer 17, e.g. a suitable adhesive tape (suitable for biological reactions) or with a silicone adhesive.
  • a durable, temperature and water resistant compound may e.g. using biocompatible adhesive tape, silicone adhesive, laser welding, ultrasonic welding or other biocompatible adhesives.
  • a second possibility of connecting the flex circuit board 10, biochip 6 and base body 1 consists in the targeted surface bonding of the biochip 6 with the flex circuit board 10 (adhesive only under the biochip) and the subsequent fixation of the base body 1 only outside the reaction chamber. 5 ( Figure 5). With this type of bonding, the heat transfer from the heating / measuring structure 10.3 in the flex circuit board 10 into the reaction chamber 5 is more efficient.
  • the cartridge housing is formed from an upper and a lower half 28.1, 28.2, which define a cuboid cavity, in which the inlay is received positively.
  • the two halves 28.1 and 28.2 of the cartridge housing each have an approximately in the region of the reaction chamber 5 rectangular recess 29.1 or 29.2.
  • a stabilizing disc 24 may be arranged, which rests against the flex circuit board 10 of the inlay 11 and approximately centrally has an opening which is smaller than the recess 29.2 of the lower half 28.2 of the cartridge housing. Whether a stabilizing disc 24 is appropriate depends on how high the pressure within the reaction chamber 5 is and how much the flex circuit board is bent thereby.
  • the sample liquid is injected by means of a syringe or pipette at the filling opening 9 through the check valve 8 via the filling channel 7 into the reaction chamber 5.
  • the sample liquid first fills the reaction chamber 5 and then flows into the equalization channel 4 and possibly into the equalization chamber 2.
  • the filling quantity is preferably dimensioned such that no sample liquid enters the equalization chamber 2.
  • an overpressure is created in the inlay 11 and the air in the compensation chamber 2 is compressed.
  • the filling level can be monitored. Since the volumes of the filling channel 7, the reaction chamber 5 and the compensation channel 4 are known, can be filled with a constant volume of liquid, even without viewing the optical window.
  • the pressure-tight closure with the check valve 8 generates an overpressure in the reaction chamber during filling of the cartridge.
  • the air in the equalization chamber is compressed.
  • the overpressure can be adjusted specifically.
  • the overpressure is in the range of 0 bar to 1 bar.
  • the internal pressure doubles during filling.
  • temperatures up to 100 C can occur.
  • the thermal expansion of the sample liquid leads to a deflection into the compensation channel 4.
  • the sample liquid withdraws again.
  • the pressure differences at T ma ⁇ and T m in (in the cold and hot state) are only minimal, since the air in the expansion chamber 2 is compressed.
  • the volume of the compensation chamber is significantly larger than the volume increase of the sample liquid when heated.
  • the stabilizing disk 24 can minimize expansion of the elastic flex circuit board 10 during the filling process without losing the ability of elastically pressing the biochip 6 to the detection window 14 (FIG. 12).
  • An increase in pressure by 1 bar in the cartridge has the advantage that the boiling point of the sample liquid from 100 ° C to about 125 ° C increases. The formation of air bubbles in the reaction space is thus minimized.
  • Heating device for temperature-controlled biological detection reaction
  • the course of a temperature-controlled biological detection reaction requires the setting of accurate temperatures of the sample liquid in the reaction space. For example, when performing a PCR, temperatures between 30 ° C and 98 ° C are controlled. The temperature distribution of the sample liquid must be homogeneous in the reaction space and temperature changes (heating, cooling) should be fast.
  • the heating / measuring structure acts as a heater when current through the ohmic resistance.
  • the heating / measuring structure can be used simultaneously as a temperature detector by using the resistance characteristic R (T) to determine the temperature.
  • the flex circuit board 10 with the integrated heating conductor causes local temperature fluctuations. Hotspots are located directly above the heating / measuring structures.
  • a temperature homogenization layer 21 (FIG. 7) on the flex circuit board 10 homogenizes the temperature distribution on top of the flex circuit board 10.
  • the temperature homogenization layer 21 is a copper layer which is nickel plated and provided with an additional gold layer.
  • the gold layer has the advantage that it is inert to biological materials and thus biological materials in the reaction chamber can come into direct contact with this layer. This reaction chamber can therefore also be used for experiments other than biochip.
  • This homogenization layer has a good thermal conductivity. Instead of a combined copper-nickel-gold coating, a relatively thick copper layer could also be provided.
  • a heat conductor track integrated into the flex PCB has a low own heat capacity. This higher heating rates of the sample liquid can be realized in the reaction chamber.
  • a preferred embodiment of the layout of the flex circuit board 10 is shown in FIG.
  • the meander-shaped heating / measuring structure 10.3 is formed from a thin strip conductor having a width of 60 ⁇ m and a thickness of 16 ⁇ m. It is about 480 mm long. At room temperature, it has an electrical resistance of about 6 to 8 ohms.
  • the conductor track is formed of copper, preferably copper with a purity of 99.99%. Such pure copper has a temperature coefficient which is almost constant in the relevant temperature range here.
  • the heating / measuring structure 10.3 forms a diamond with an edge length of about 9 mm.
  • the biochip 6 only has an edge length of 3 mm, whereby the rhombus formed by the heating / measuring structure 10.3 and the temperature homogenizing layer 21 covers a larger area than the biochip.
  • the end points of the meandering heating / measuring structure in each case go into a very wide conductor track 30.1 and 30.2, which serve to supply the heating current and even have only a small resistance due to their large width. Furthermore, in each case one further conductor track 31.1 and 31.2 in the region of the connection point of the meandering heating / measuring structure are connected to these two conductor tracks 30.1 and 30.2. These two further interconnects 31.1 and 31.2 serve to pick up the voltage drop across the heating / measuring structure. This will be discussed in more detail below.
  • the flex circuit board 10 has conductor tracks 32 and corresponding contact points 33, 34 for connecting an electrical semiconductor memory.
  • This semiconductor memory is used for storing calibration data for the heater and the data of the biological experiments to be performed with the biochip of the cartridge. These data are thus stored without confusion.
  • FIG. 14 shows an equivalent circuit diagram of a circuit of a measuring and control device for heating and measuring the heating current by means of the meandering heating / measuring structure or heating conductor track.
  • the heating / measuring structure 10.3 is shown in the equivalent circuit diagram as a resistor which is connected in series with a current measuring resistor 35 and a controllable current source 36.
  • the voltage at the current measuring resistor 35 and at the heating / measuring structure 10.3 are each tapped off by means of a separate measuring channel 37, 38.
  • the two Measuring channels 37, 38 are identically formed, each having an impedance converter 39 consisting of two operational amplifiers, an operational amplifier 40 for amplifying the measuring signal, an anti-aliasing filter 41 and an A / D converter 42, with which the analog measuring signal is converted into a digital measured value ,
  • the two measuring channels 37, 38 are thus high-impedance and identical to each other.
  • the operational amplifiers 40 of the two measuring channels 37, 38 are preferably operational amplifiers with laser-trimmed internal resistance whose amplification can be set very precisely.
  • the operational amplifier LT 1991 from Linear Technology is used for this purpose.
  • the two A / D converters 42 of the two measuring channels 37, 38 are preferably realized by a synchronous two-channel A / D converter, which detects both channels simultaneously. This ensures that the readings in both channels are sampled at identical times. This ensures that the voltage tapped off at the current measuring resistor and the voltage tapped at the heating element or at the heating / measuring structure 10.3 are each tapped simultaneously and thus based on the same heating or measuring current, which is determined by the current measuring resistor 35 or the heating current. / Measuring structure 10.3 flows.
  • this current can be used simultaneously for heating and measuring.
  • a constant measuring current is fed in, which is not measured at the sensor.
  • Such a measuring current can not be varied and changed for heating, which is why the heating and measuring are carried out independently.
  • the measurement of the temperature is carried out with a high sampling rate of z. B more than 1,000 Hz, preferably at least about 3,000 Hz. This allows an extremely precise adjustment of the temperature. It has been shown that with just below 3,000 Hz, a heating rate of 85 ° C / sec can be controlled with an accuracy of 0.1 0 C.
  • a heating and measuring current of approx. 50 mA flows and when holding a temperature of approx. 350 mA to 400 mA.
  • the heating / measuring structure 10.3 Due to the design of the heating / measuring structure 10.3 as a long, thin, narrow trace even when using copper as a conductor material achieved sufficiently high resistance, which can be reliably scanned with the above-described 4-point measurement even at low heating current.
  • the 4-point measurement is independent of parasitic resistances.
  • the heating / measuring structure 10.3 serves both as a heating element and as a measuring resistor for measuring the heating voltage, it is not possible to apply arbitrarily high "measuring currents" to this heating / measuring structure 10.3, since these measuring currents also act as heating currents and would lead to a significant increase in temperature, but this is not always desirable, and thus there are boundary conditions which, under certain process conditions, require a very small measuring current so as not to undesirably alter the temperature of the reaction chamber., since two identical measuring channels 37, 38 are used At the same time, if the measuring voltage with a very high impedance picks up and very precise amplifiers are measured, even small voltage drops can be reliably detected at the resistors 35 and 10.3 Since the measuring channels are identical, systematic measuring errors are shortened, since the resistance R of the heating - / measuring structure 10.3 gemes sen, the quotient of the heating current and the heating voltage or the two measuring signals is.
  • the heating / measuring structure 10.3 is formed on the side facing away from the biochip 6 side of the flex circuit board 10. On the opposite side of the flex
  • Printed circuit board is the continuous temperature homogenization layer 21 is provided, which leads to a uniform, rapid heat distribution and a corresponding uniform and rapid heating of the biochip 6 allows.
  • the flex circuit board has only a heat capacity of about 12 mJ / K resulting in a rapid heat transfer of the heat generated in the
  • Reaction chamber located sample liquid and the biochip leads.
  • control device 43 the control method shown schematically in FIG. 15 is executed.
  • step S2 the temperature value is measured, that is, the resistance of the heating / measuring structure 10.3 is calculated from the two measured values and converted into a temperature value according to a table.
  • step S3 the difference between the measured actual temperature and a target temperature is calculated. This value is called the delta value.
  • the SoII temperature changes over time. The function describing this time-varying temperature is called the temperature profile to be applied to the reaction chamber.
  • step S4 a query is made as to whether the delta value is greater than a predetermined minimum. If the answer to this question is "yes”, the process goes to step S5, in which it is asked if this delta value is less than a predetermined maximum, and if the result is "yes” again, the process goes to a block of method steps S6, S7, S8, with which an integral part of a control value (step S6) is calculated, an offset value is added to the delta value (step S7) and based on the thus modified delta value, a proportional value Proportion (step S8) is calculated. A manipulated variable is obtained by adding the integral component and the proportional component. Adding the offset value causes heating at a higher heat output.
  • step S4 If a "No" results as a result in one of the two above queries (step S4) or step (S5), then the method proceeds directly to step S7, omitting the calculation of the integral term an integral component is calculated only within a predetermined range around the target temperature. This area around the target temperature is about +/- 1 ° C to 0 +/- 2 C. the integral component is thus only used when the measured actual Temperature is already relatively close to the desired setpoint temperature, which prevents overshooting of the actual temperature due to the very slow integral component Control phase a very precise and fast approach to the desired target temperature.
  • step S9 it is checked whether the manipulated variable is smaller than a predetermined minimum. If this is the case, the process flow goes to step S10, with which the temperature is lowered with maximum cooling power.
  • step S9 the query indicates that the manipulated variable is not smaller than a predetermined minimum
  • the method proceeds to step S10, in which it is checked whether the manipulated variable is less than zero. If this is the case, the procedure goes to step S12, in which the manipulated variable is set to zero. This means that the reaction chamber is cooled without additional cooling power or that the cooling stamp is removed from the reaction chamber. This avoids overshooting.
  • step S11 determines whether the manipulated variable is less than zero. If the query in step S11 indicates that the manipulated variable is not less than zero, then this means that the temperature must be increased. Accordingly, in step S13, a temperature increase is performed in accordance with the determined manipulated variable. This means that a control signal proportional to the manipulated variable is delivered to the controllable current source 36, which generates a corresponding heating current through the heating / measuring structure 10.3.
  • step S14 it is checked whether the end of the temperature profile has been reached. If this is the case, the process flow is terminated with the step S15. Otherwise, the procedure goes back to the step S2.
  • This control process is repeated at the sampling frequency, which is at least 1,000 Hz, in particular at least about 3,000 Hz.
  • Cooling device for temperature-controlled biological detection reactions
  • FIG. 16 shows the basic principle of the cooling device 50 according to the invention.
  • This cooling device 50 has a cooling body, which is referred to below as a cooling piston 51.
  • the peculiarity of this cooling stamp 51 is that it is movably arranged relative to the cartridge 28 so that it can be brought into contact with a cooling surface with the cartridge 28 such that the reaction chamber 5 of the cartridge 28 can be cooled. It is both possible to arrange the cooling die 51 in a stationary manner and to move the cartridge 28 with a linear drive or to arrange the cartridge in a stationary manner and to move the cooling punch 51 by means of a linear drive.
  • the cooling punch 51 is provided with a cooling unit 52, which comprises a cooling element in the form of a Peltier element, a heat sink and a fan.
  • the cooling punch 51 can be cooled to a predetermined temperature. Furthermore, the cooling device 50 has a linear drive 53, with which the cooling piston can be moved back and forth.
  • the cooling punch 51 has an end face, which is referred to below as the cooling surface 54, and can be brought into contact with the cartridge.
  • the size of the cooling plunger 51 is dimensioned such that the cooling surface 54 in the region of the reaction chamber 5 for cooling on the cartridge or on the flex circuit board 10 can be brought into contact.
  • the heat capacity of the cooling plunger 51 in contrast to the heat capacity of the flex circuit board 10 and the reaction chamber 5 is very large.
  • the heat capacity of the cooling stamper 51 is about 8 to 9 J / K.
  • the total heat capacity of the reaction chamber 5, however, is only about 0.5 J / K.
  • the high heat capacity of the cooling stamp 51 means that its temperature is not changed significantly even when the reaction chamber 5 is cooled by a very high temperature difference. This has the consequence that the cooling piston 51 can be kept at its operating temperature with relatively low cooling capacity. Due to the large heat capacity of the cooling plunger, the necessary rapid cooling process of the reaction chamber 5 is thus decoupled in time from the cooling unit 52, which dissipates the heat from the cooling plunger 51 gradually at relatively low cooling power to the outside.
  • the cooling piston 51 can be kept constant at a relative to the temperatures in the reaction chamber relatively low temperature level of z. B. 20 0 C are maintained, whereby rapid Abkühlvorêt be achieved, in particular when performing PCR reactions in which repeatedly z. B. from a temperature of 98 ° C to a temperature of 40 0 C to 60 0 C must be cooled.
  • the cooling punch 51 is moved away from the reaction chamber 5. If necessary, something can be heated to regulate the final temperature. This is typically the case when the setpoint temperature is above room temperature. If the temperature falls below the setpoint temperature, automatically heated. If, as is necessary in the case of some biological tests, a temperature below room temperature is set in the reaction chamber, the cooling stamp is set to this temperature and pressed permanently against the reaction chamber.
  • cooling die 51 in addition to the applied cooling die 51 can be heated simultaneously. This is particularly useful at lower temperature changes of about 40 0 C to 50 0 C maximum. However, this can also be used to maintain a temperature below room temperature, wherein the cooled to a temperature below the target temperature stamp is permanently in contact with the reaction chamber. A reduced cooling rate can also be achieved by reducing the pressing force with which the cooling stamp is pressed against the reaction chamber.
  • FIG. 1 A first embodiment of the cooling device according to the invention is shown in FIG.
  • This cooling device in turn has a cooling piston 51, a cooling unit 52 and a linear drive 53.
  • linear drive for example, stepper motors or servo geared motors with spindle or worm gear, linear stepper motors, piezolinear motors, motors with pinion and rack, solenoids, rotary magnets, voice coil magnets, motors with cams, etc. are suitable.
  • the cooling punch 51 is cylindrical tube-shaped. It is made of metal, such as copper or aluminum.
  • a pin-shaped or rod-shaped plunger 55 which is made of a plastic or metal, such as copper or aluminum, is movably mounted.
  • the plunger 55 is arranged longitudinally displaceable in the cooling die 51.
  • the plunger is as thin as possible and rounded at its end facing the reaction chamber, so that it presses punctiform as possible against the reaction chamber.
  • the cooling punch 51 is formed of metal, since metal conducts heat well. He may also be formed of another good heat conductive material, such. As special ceramics (alumina ceramics, etc.) or plastics with certain fillers, such as. As graphite, metal powder or tiny metal beads, plastic nanotubes, AI 2 O 3 ceramic powder.
  • the protruding from the cooling device 50 end face 54 of the cooling plunger 51 forms a cooling surface 54. At the remote from the cooling surface peripheral portion of the cooling plunger 51 this is formed with two flat surfaces on which cooling elements 56 are attached in the form of Peltier elements. These cooling elements are components of the cooling unit 52, which still has fan 57 and heat sink 58.
  • the fans 57 are in this case integrated in a housing for receiving a portion of thisdestkovs 51.
  • the cooling punch 51 has at its rear, the cooling surface 54 opposite end face a bush 59 made of a poor thermal conductivity material, such as plastic.
  • This bushing 59 defines a cavity.
  • the plunger 55 extends with its rear end in this cavity and has a plug-shaped end body 60 which is slidably mounted in the sleeve 59. Between this end body 60 and the voltage applied to the cooling piston 51 wall of the bushing 59, a spring 61 is tensioned, which acts on the plunger with a force such that the plunger 55 with its remote from the end body 60 free end face (part of the cooling surface 54) in the cooling die 51 is pulled into it.
  • the bush 59 is fixed in the housing by means of a plastic ring 62. Furthermore, there is in the housing, a linear drive 63 for acting on the end body 60 and the plunger 55 with a force that presses it with its free end a piece of the cooling die 51.
  • the entire unit consisting of the cooling punch 51, the plunger 55, the cooling unit 52, and the linear drive 63 is slidably mounted in the axial direction of the cooling plunger 51 and coupled to the linear drive 53. This coupling takes place by means of a spring 64.
  • the spring has a certain force-displacement characteristic and thus allows a travel control on the linear drive 53 to control the pressing force of the cooling punch 51 to the flex circuit board 10, without the force with an additional force sensor measured or regulated. This type of adjustment of the compressive force meets the requirements, since the tolerances with respect to the set force are uncritical in many areas.
  • the cooling stamp 51 is thermally insulated at all free and accessible locations. For this example, commercially available, fine-pored foam is provided.
  • the cooling surface 54 of the cooling punch 51 is turned flat and polished.
  • the cooling elements 56 are connected in series and connected to control electronics.
  • a temperature sensor for measuring the temperature of the cooling punch is provided on the surface of the cooling punch 51.
  • the temperature control on the cooling stamp 51 is done with a PI controller. The sampling of the temperature takes place, for example, with a sampling rate of 2 Hz.
  • this two-part heatsink heats only by about 2 ° C with a cooling of the reaction chamber by a temperature of about 4O 0 C.
  • the required cooling capacity is relatively low and is about 1 - 2 W. This allows the cooling device can be operated with batteries.
  • FIG. 17 A second embodiment of the cooling device according to the invention is shown in FIG. Like parts of this second embodiment are identified by the same reference numerals as in FIG. 17.
  • the cooling device 50 also comprises a cylindrical tube-shaped cooling punch 51 with a cooling surface 54, a plunger 55 arranged movably therein, two cooling units 52 each having a cooling element 56, a fan 57 and a cooling body 58, a linear drive 63 for actuating the plunger 55 and a spring 61, which pulls the plunger with its free end in the cooling punch 51.
  • the second embodiment of the cooling device 50 differs from the first embodiment in that the cooling piston 51 is arranged stationary and a linear drive 65 is provided for moving the cartridge 28.
  • This linear drive 65 is coupled by means of a spring 66 to a holder (not shown) for receiving the cartridge.
  • the holder is linearly mounted. In the holder, the cartridge can be used with reproducible position.
  • the force-displacement characteristic curve of the spring 66 the force with which the cartridge is pressed against the heat sink 51, 55 can be set by means of a travel control.
  • the linear drives 53, 63 and 65 are designed such that they can be actively retracted to replace the cartridge.
  • cooling unit in the form of cooling fins or the like on the cooling plunger, at which the heat absorbed by the cooling plunger will be released via convection and radiation.
  • the cooling rates are inherently lower with such devices than with active cooling. But such a cooling unit would meet the requirements of many temperature cycles used in practice.
  • cooling units other systems are possible individually or in combination, such. As a water cooling or the generation of very cold air by means of a vortex tube, which is blown to the cooling punch.
  • 19 and 20 each show a combined heating / cooling device for heating and cooling the reaction chamber 5 of the cartridge 28 and another cartridge 71, which in turn has a reaction chamber 5 for receiving a biochip 6, but is not provided with its own heating means.
  • the reaction chamber 5 is limited in a portion of a thin plate 72 of good heat conducting material that may be formed flexible. The plate 72 is exposed with its side facing away from the reaction chamber, so that they can be touched by the heating / cooling device 70.
  • the heating / cooling device 70 has a heating punch 73 with a contact surface 74 facing the plate 72.
  • the heating punch 73 is formed of metal and with a heating means 75, such. B. provided with the heating stamp 73 heating wires provided.
  • the heating means 75 is connected to a control device (not shown), with which the heating punch 73 can be heated to a predetermined temperature.
  • a temperature sensor 76 is arranged, which detects the temperature of the contact surface 74.
  • the temperature sensor is also connected to the control device, so that the control device can regulate the temperature of the heating punch 73.
  • the heating punch 73 is connected via an axis 77 with a linear drive 78, with which the heating punch 73 can be moved to the plate 72 until it touches them with a predetermined pressure or can be pulled away from the plate 72 of the cartridge 71, so that a predetermined Air gap between the heating punch 73 and the plate 72 is made.
  • the cooling stamp 79 On the axis 77 movably supports a cooling ram 79 which surrounds the axis 77.
  • the cooling stamp 79 is formed from metal and arranged displaceably in the longitudinal direction of the axis 77.
  • the cooling ram 79 is connected to a further linear drive 80, with which the position of the cooling ram 79 on the axis 77 is adjustable.
  • the cooling punch 79 can be moved by the linear drive 80 in the direction of the heating punch 73 until the cooling punch 79 touches the heating punch 73 on its side facing away from the contact surface 74 under pressure.
  • the cooling stamp 79 can also be removed from the heating punch 73 such that an air gap is formed therebetween.
  • a cooling unit 81 with a Peltier element, heat sink and fan is arranged on the cooling stamp 79 in order to cool the cooling stamp to a predetermined temperature.
  • the cooling punch 79 has a much larger mass and volume than the heating punch 73. As a result, the cooling stamp 79 has a much larger
  • Cooling stamp 79 touches the heating punch 73, this composite stamp is thermally dominated by the cooling stamp and acts as a reaction chamber cooling the stamp.
  • the volume and mass of the heating punch 73 is small. As a result, the heating stamp 73 with a low energy to predetermined
  • the cooling punch 79 is held at a comparatively low temperature by means of the cooling unit 81.
  • the heating stamp 73 is pressed against the plate 72 of the cartridge 71 during the heating phases.
  • the cooling stamp 79 is arranged at a distance from the heating punch 73.
  • the heating punch 73 is heated by means of its heating means 75, until at the interface between the contact surface 74 and the plate 72, the desired temperature is set.
  • the heating means 75 is switched off and the cooling punch 79 is pressed by the linear drive 80 against the heating punch 73.
  • the Schustkov 73 is in turn in contact with the plate 72 of the cartridge 71. Due to the much larger heat capacity of thedestkovs 79 against the heat capacity of the Schustkovs 73 the Schustkov 73 quickly withdrawn much heat, causing the Schustempel cools and as a coolant for the reaction chamber 5 of Cartridge 71 is used.
  • the temperature at the interface between the heating punch 73 and the plate 72 is monitored by the temperature sensor 76.
  • both the heating stamp 73 and the cooling stamp 79 are retracted by the linear drive 78 or only the cooling stamp 79 is withdrawn and the heating stamp 73 is supplied with heat by the heating means 75 if the temperature of the reaction chamber 5 exceeds must be kept at room temperature. If the temperature of the reaction chamber is to be kept below the room temperature, then it may also be expedient if the heating stamp 73 continues to abut against the reaction chamber 5 and at the same time the cooling stamp 79 contacts the heating stamp 73.
  • the heat flow from - or to the reaction chamber 5 can be controlled such that its temperature is kept constant.
  • FIG. 1 A second embodiment of a heating / cooling device 82 is shown in FIG. This second embodiment differs somewhat from the embodiment shown in FIG. It also serves to contact a cartridge 71 with a plate 72 by means of a heating punch 83 with a contact surface 84.
  • the heating punch 83 is in turn provided with a heating means 85 and a temperature sensor 86 on the contact surface 84.
  • the heating punch 83 is arranged on an axis 87, which is connected to a first linear drive 88, with which the heating punch can be brought into contact with the plate 72 and can be moved away from it.
  • a cooling punch 89 is movably arranged, which in turn is in communication with a linear drive 90, so that the cooling punch 89 can be brought into contact with the heating punch 83.
  • a cooling unit 91 is arranged, with which the cooling punch 89 can be cooled to a predetermined temperature and maintained at this temperature.
  • a tantroisstempel 92 is arranged to be movable in the axial direction on the axis 87.
  • the toaststempel 92 is connected to a further linear drive 93, so that theificatroisstempel 92 can be brought into contact with the heating die 83 or removed from it.
  • the romancestempel 92 is provided with a heating means 94, such as. B. a winding of heating wires to be heated to a predetermined temperature.
  • the volume and the mass of the cooling punch 89 and the beautschuls 92 are greater than that of the Schustempels 83.
  • this combined heating / cooling device 82 functions the same as the heating / cooling device 70 shown in FIG.
  • These two heating / cooling devices can still be provided with a plunger (not shown) which extends through the axes 77 and 87, respectively, and can act on the plate 72, if flexible, to push the biochip against an opposite detection window (not shown). not shown).
  • a cartridge 71 having a rigid plate 72 of a highly thermally conductive material to allow rapid transfer of heat between the reaction chamber and the heating die.
  • the plate 72 opposite detection window is formed elastically, wherein the reading device (not shown) is pressed with a transparent plate against the detection window when reading the biochip so that it rests on the biochip 6.
  • a detection window may be formed of a transparent, elastic plastic material.
  • the flex circuit board is elastically deformed by pressing the plunger 55 when the cartridge with flex circuit board 10 is used so that the glued biochip presses against the detection surface (FIG. 6).
  • a force F 0 must be expended. With an area of about 0.5 cm 2 , you only need about 5 N to build up a pressure of 1 bar.
  • a certain force Fi still has to be expended in order to deform the elastic flex circuit board 10 with the biochip 6 applied by means of the plunger 55 in such a way that the biochip 6 is pressed uniformly against the detection surface.
  • the sum of the forces F 0 + F 1 should not exceed 30 N.
  • the illumination of the biochip in the reaction space is circular. Not only is the rectangular biochip 6 illuminated, but also areas 5.1 of the reaction space next to the biochip in which a sample liquid 26 containing dye was not displaced (FIG. 9). These areas fluoresce intensely. In the optical imaging of the biochip by the optical module on a detector, these areas appear outside of the biochip, but due to the high dye concentration of the sample liquid next to the biochip, a part of the fluorescent light scatters towards the biochip and the reaction fields (spots). The detector detects not only the fluorescence radiation of the spots by the direct illumination but also the indirect fluorescence scattering radiation from the areas next to the biochip. Thus, the image of the spots on the biochip receives a local inhomogeneous, the image analysis disturbing background lighting.
  • This diaphragm 18 can be introduced as an optically absorbing diaphragm (FIG. 8) during injection molding of a transparent main body 1 or as a transparent optical diaphragm 19 or detection window 14 during the injection molding of a nontransparent basic body (FIG. 7).
  • the aperture can also be subsequently applied to the optical observation window (detection surface).
  • the transmission of the diaphragm layer should be less than 10 '2 .
  • the cartridge 28 according to the invention it is possible to continue the temperature-controlled biological detection reaction after image acquisition. If the plunger 55 is moved back, deviates the flex circuit board 10 due to the pressure in the reaction chamber 5 and the compensation chamber 2 back and the sample liquid from the compensation chamber 2 flows back into the reaction chamber 5, also between the biochip 6 and the cover glass. Thus, even after detection, the temperature-controlled biological detection reaction can be continued.
  • the cartridges according to the invention can be used to detect the spots on the biochip at any time during the biological reaction.
  • biochip reader All information about the cartridge, including biochip, must be read out by the biochip reader. To drive accurate temperatures while performing the temperature-controlled biological detection reaction, the heater's specific calibration data for a given flex circuit board is needed on the Flex circuit board. Also, the information on the biochip applied reaction fields (spots), ID numbers, exposure times for image acquisition, etc., must be read by the reader to control the temperature-controlled biological response and to allow a logging and archiving.
  • the necessary information can be applied to the cartridge as a dot code or as a bar code. To read these codes you need a dot code reader (or bar code reader). It is therefore not possible to save current data.
  • More flexible is the use of writable and readable tamper-resistant storage media 10.2 which are advantageously integrated on the flex circuit board.
  • the contacting of an electrically programmable non-volatile memory on the Flex-LP can also take place (FIG. 3). This information can be stored digitally and queried at any time. The storable amount of data is significantly larger than when bar or dot codes applied.
  • the biochip In a contacted electrically programmable non-volatile memory and information during PCR or read the biochip can be stored. In addition, the data can be stored tamper-proof become. After a successful processing, the cartridge can also be marked as "processed" in order to prevent another, unwanted processing.
  • FIGS. 21 and 22 A further exemplary embodiment of the device according to the invention for carrying out and examining biological samples with temperature-controlled biological reactions by means of a biochip is explained with reference to FIGS. 21 and 22. Like parts are designated by the same reference numerals as in the embodiments described above. They also have the same characteristics and properties as in the embodiments described above, unless otherwise stated.
  • This embodiment also has a main body 1 made of plastic, in particular COC, which is arranged on a printed circuit board 10.
  • the printed circuit board 10 may be rigid in this embodiment.
  • a recess for a filling channel 7, which leads from a filling opening 9 to a reaction chamber 5, and recesses for the reaction chamber 5, a compensation channel 4 between the reaction chamber 5 and a compensation chamber 2 and a recess for a compensation chamber 2 are provided.
  • the biochip 6 is fixed in the region of a heating / measuring structure 10.3 of the printed circuit board 10 by means of an adhesive bonding layer 16 on the printed circuit board 10.
  • the biochip 6 is preferably surrounded by a frame 95 within the reaction chamber 5 in a form-fitting manner, whose upper side is aligned with the upper side of the biochip 6 and forms a flat continuous surface with the biochip.
  • the frame is made of plastic, in particular COC 1 is formed.
  • a transparent plastic film 96 is provided, which is glued to the base body 1 with its edge. The film 96 completely covers the recess for forming the reaction chamber 5 of the base body 1.
  • a narrow gap 97 is formed, into which the filling channel 7 and the compensation channel 4 opens.
  • This gap 97 is part of the reaction chamber 5, which also extends between the area of the surface of the biochip 6 and the plastic film 96.
  • a further check valve 98 may be arranged in the compensation channel.
  • This check valve 98 is preferably designed such that it opens only from a defined opening pressure.
  • a defined opening pressure of the check valve 98 allows agitation of the sample solution, without the medium enters the compensation chamber, as long as in the reaction chamber, the pressure is not greater than the opening pressure.
  • the agitation of the sample solution has the advantage that the sample solution is well mixed on the one hand and on the other hand quickly a uniform heat distribution is achieved.
  • check valve 98 may be arranged on the compensation channel and a controllable valve from the outside.
  • This valve may be an electrically actuatable microfluidic valve having a bimetal or magnetic mechanism for opening and closing.
  • Such valves may be integrated into the equalization channel without the need for external mechanical controls which would be required to seal the walls of the equalization channel.
  • a mechanically operable valve which may be located in a e.g. very simple embodiment is designed as an elastic hose, which represents a portion of the compensation channel.
  • a stamp is provided on the hose, which can be actuated by an actuator such that the hose can be compressed by means of the punch, so that the connection in the compensation channel is interrupted or the hose is released from the punch, so that a continuous connection is present.
  • An externally controllable valve has the advantage that the connection to the compensation chamber can be selectively opened and closed.
  • the compensation channel is closed after medium has been forced into the compensation chamber.
  • the medium can no longer retreat into the reaction chamber and the film can therefore no longer stand out from the biochip.
  • the valve can be opened again, whereby medium can get back into the reaction chamber. Temperature-controlled biological reactions can then be carried out again.
  • a roller 99 On the upper side of the main body 1, a roller 99 is provided, which rests with a predetermined pressure on the base body 1 (not shown) by means of an actuating device can be automatically rolled along the surface of the body, wherein the region of the reaction chamber 5 can be run over.
  • the sample solution When filling this device, the sample solution initially accumulates in the reaction chamber 5 in the area between the biochip 6 and the film 96, wherein air is displaced into the expansion chamber 2 and thereby a predetermined Build up pressure.
  • temperature-controlled biological reactions can be carried out in the same way as in the embodiments explained above.
  • the roller After carrying out these reactions, the roller is rolled over the reaction chamber 5, wherein it is moved via the reaction chamber 5 from the side of the filling opening 9 in the direction of the compensation chamber 2.
  • the sample solution located in the reaction chamber 5 is urged in the direction of the compensation chamber 2.
  • the check valve 98 in the compensation channel 4 ensures that no medium passes back into the reaction chamber 5. This ensures that the foil 96 pressed onto the surface of the biochip 6 by the rollers no longer lifts off from the biochip 6.
  • the transparent plastic film 96 is preferably provided with an adhesive or adhesive layer on the side facing the biochip 6, so that the film adheres to the biochip after it has been pressed on.
  • This adhesive layer may be configured to be activated only when in contact with a sample solution for a predetermined period of time to prevent inadvertent sticking prior to use of the cartridge.
  • the adhesion or adhesive layer is preferably arranged in the area surrounding the active area of the biochip, so that no adhesive bond is formed in the area of the spots of the biochip between the biochip 6 and the plastic film 96.
  • mechanical spacers are arranged outside the region between the film 96 and the biochip 6 or the frame 95, in which the film is to be pressed onto the biochip. This avoids unintentional pressing of the film against the biochip and ensures that the film is only selectively pressed against the biochip by means of a hold-down device (roller, doctor blade, plate) when the temperature-controlled biological reactions have been completed.
  • a hold-down device roll, doctor blade, plate
  • the image solution completely displaces the sample solution between the biochip and the detection surface or the window.
  • a hold-down device which only linearly pushes the plastic film against the biochip, such.
  • the displace complete sample solution between the plastic film and the biochip In such an embodiment, a line-shaped recording of the biochip can be created simultaneously while moving the hold-down device on the Kunststoffofffieie.
  • the biochip is detected either in the direction of movement immediately before or immediately after the hold-down device with, for example, a line camera or, if the hold-down device is made transparent, detected by the hold-down device with a line scan camera.
  • the individual line images are assembled into a two-dimensional image.
  • different methods are known in optical image processing (eg stitching). This uptake during on-the-fly movement has the advantage that the sample solution is displaced only locally along a line between the plastic film and the biochip, so that during the scan the complete sample solution can remain in the reaction chamber Compensation space is not necessary here.
  • the check valve 98 is formed unlockable from the outside, so that after performing the optical measurements, the sample solution can get back into the reaction chamber 5 and further biological reactions can be performed.
  • This embodiment with transparent plastic film can of course also be provided with a viewing window in the compensation channel 4 for the detection of the filling level.
  • the volume of the expansion space 2 is formed from the outside variable.
  • This can be realized for example by providing an elastic membrane as a wall of the expansion space 2. This wall can then be moved from the outside and the compensation chamber 2 are raised. This creates a suction effect with which the sample solution can be sucked out of the reaction chamber 5 and the film 96 lays on the surface of the biochip 6.
  • the roller 99 can be omitted.
  • the film 96 may also be expedient to form the film 96 in the immediate working area above the biochip 6 somewhat thicker and stiffer, so that local liquid bubbles are prevented from remaining between the biochip 6 and the film 96.
  • the membrane is formed of an elastic material that can be elastically deformed by a corresponding actuator (plunger, roller, squeegee, plate).
  • a corresponding actuator plunger, roller, squeegee, plate
  • the invention relates to a device for carrying out and testing biological samples with temperature-controlled biological reactions. It comprises: - A reaction chamber 5 for receiving a biochip 6.
  • Reaction chamber has at least one transparent window 14, so that excitation light can be radiated from the outside onto the biochip 6 and fluorine essence light can be emitted from the biochip to the outside to a measuring device.
  • a membrane which forms at least one wall of the reaction chamber and is flexible, so that the window and the biochip are pressed against each other to displace therebetween sample solution.
  • the device according to the invention is characterized in that the reaction chamber is communicatively connected to a compensation chamber.
  • predetermined pressure conditions are created in the reaction chamber, which on the one hand simplify the displacement of the sample solution and on the other hand prevent the formation of bubbles in the sample solution at high temperatures.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung und Untersuchung biologischer Proben mit Temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen. Sie umfasst: Eine Reaktionskammer (5) zur Aufnahme eines Biochips (6). Die Reaktionskammer weist zumindest ein transparentes Fenster (14) auf, damit Anregungslicht von außen auf den Biochip (6) gestrahlt werden kann und Fluoressenzlicht vom Biochip nach außen zu einer Messeinrichtung abgestrahlt werden kann. Eine Membran, die zumindest eine Wandung der Reaktionskammer bildet und elastisch ausgebildet ist, so dass das Fenster und der Biochip aneinander drückbar sind, um dazwischen befindliche Probenlösung zu verdrängen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung zeichnet sich dadurch aus, dass die Reaktionskammer kommunizierend mit einem Ausgleichsraum verbunden ist. Hierdurch werden in der Reaktionskammer vorbestimmte Druckverhältnisse geschaffen, die zum einen das Verdrängen der Probenlösung vereinfachen und zum anderen die Blasenbildung in der Probenlösung bei hohen Temperaturen verhindern.

Description

Vorrichtung zur Durchführung und Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen.
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung und Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen.
Ein Biochip weist ein in der Regel ebenflächiges Substrat mit unterschiedlichen Fängermolekülen auf, die an auf der Oberfläche des Substrates vorbestimmten Punkten, den Spots, angeordnet sind. Eine mit einer Markierung versehene Probensubstanz reagiert mit bestimmten Fängermolekülen nach dem Schlüssel- Schloss-Prinzip. Meistens bestehen die Fängermoleküle aus DNA-Sequenzen (siehe z.B. EP 373 203 B1) oder Proteinen. Derartige Biochips werden auch Arrays bzw. DNA-Arrays genannt. Die Markierungen sind oftmals Fluoreszenz-Marker. Mit einem optischen Lesegerät wird die Fluoreszenz-Intensität der einzelnen Spots erfasst. Diese Intensität korreliert mit der Anzahl der mit den Fängermolekülen immobilisierten markierten Probenmoleküle.
Aus der WO 2005/108604 A2 geht eine beheizbare Reaktionskammer zum Prozessieren eines Biochips hervor. Diese Reaktionskammer weist eine elastische Membran auf. Auf der Membran ist ein Silizium-Biochip angeordnet. Als Heizeinrichtung ist eine Nickel-Chrom-Dünnfilm-Leiterbahn vorgesehen. Derartige Nickel-Chrom-Dünnfilm-Leiterbahnen besitzen einen hohen elektrischen Widerstand und eine dementsprechend hohe Heizleistung. Neben der Leiterbahn für die Widerstandsheizung ist eine zusätzlich Leiterbahn zur Temperaturmessung vorgesehen.
Bei dieser bekannten Reaktionskammer (Fig. 10, 11 ) ist eine Gehäusewandung als Membran ausgebildet, damit der Biochip 6 mittels eines Stößels 12 gegen ein der Membran 13 gegenüberliegendes Deckglas 23 gedrückt werden kann. Hierdurch wird eine in der Reaktionskammer befindliche Reaktionsflüssigkeit 26 von der Oberfläche des Biochips verdrängt und stört nicht bei der optischen Detektion. Zwischen der Membran 13 und dem Deckglas 23 ist eine Dichtung 22 angeordnet. Die Probenflüssigkeit 26 wird mittels einer Einfüllkanüle 19, die durch die Dichtung 22 gestoßen wird, eingefüllt. Beim Stößeln wird mittels einer Druckausgleichskanüle 20 überschüssige Probenflüssigkeit 26 aus der Reaktionskammer 5 abgeleitet. In der WO 01/02 094 A1 werden Mittel zur Temperaturbeaufschlagung von Biochips beschrieben, die mikrostrukturierte Widerstandsheizleitungen umfassen.
In der US 5,759,846 und US 6,130,056 ist jeweils eine Reaktionskammer zur Aufnahme von biologischen Geweben beschrieben. In der Reaktionskammer befindet sich eine flexible Leiterplatte mit Elektroden. Durch Zusammendrücken des biologischen Gewebes und der flexiblen Leiterplatte kann ein elektrischer Kontakt zwischen dem biologischen Gewebe und den Elektroden der flexiblen Leiterplatte hergestellt werden, so dass an dem biologischen Gewebe unmittelbar ein elektrischer Abgriff erfolgen kann.
In der DE 10 2005 09 295 A1 ist eine chemische Reaktionspatrone mit mehreren Kammern beschrieben. Durch Abrollen einer Walze an der Oberfläche der Patrone können Flüssigkeiten von einer Kammer in eine weitere Kammer befördert werden. Weiterhin ist eine Metallstange vorgesehen, mit welcher Druck, Schwingung, Hitze, Kühle oder ähnliches auf die Patrone ausgeübt werden kann, um die chemische Reaktion in der Patrone zu beschleunigen.
Aus K. Shen et al. Sensors and Actuators B 105 (2005), Seiten 251 - 258, „A Microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology" ist es bekannt eine flexible Leiterplatte zum Heizen einer Reaktionskammer zu verwenden, die für ein PCR Verfahren vorgesehen ist. Die Reaktionskammer besteht aus einer Glasplatte, einem Rahmen und einer Kunststoffabdeckung. Auf der Außenseite der Glasplatte ist die flexible Leiterplatte entweder unmittelbar mittels einer Klebeverbindung oder mittels eines dazwischen befindlichen Kupferchips angeordnet. Aufgrund der guten thermischen Eigenschaften der flexiblen Leiterplatte wurden Heizraten von 8°C/s erzielt. Auf der flexiblen Leiterplatte ist eine Leiterbahn ausgebildet, die sowohl zum Heizen als auch zum Messen der Temperatur verwendet wird. Das Heizen erfolgt während eines „Heating State" und das Messen während eines „Sensing State", die zeitlich versetzt ausgeführt werden.
In der WO 2007/051863 A2 ist eine Reaktionskammer beschrieben, in welcher ein Biochip prozessiert werden kann. Die Reaktionskammer weist zwei gegenüberliegende Wandungen auf, zwischen welchen der Biochip angeordnet ist. Eine der beiden Wandungen ist transparent ausgebildet, so dass sie sowohl für Anregungsstrahlung als auch für vom Biochip emittierte Signale transparent ist. Zumindest eine der beiden Wandungen ist derart beweglich, dass der Raum zwischen dem Biochip und der transparenten Wandung zusammendrückbar ist, wodurch die dazwischen befindliche Probenlösung verdrängt werden kann.
Aus der US 2004/0047769 A1 bzw. JP 2002-365299 A geht eine Tasche aus einem Kunststoffmaterial hervor, die zur Aufnahme von Blut dient. Das Blut kann für eine Untersuchung mit einem DNA-Array aufbereitet werden. Das DNA-Array ist in die Tasche integriert. Mittels Walzen wird das Blut und eine Probenlösung in der Tasche in Richtung zum DNA-Array und in einen dahinter angeordneten Abfallbereich gedrängt. Das DNA-Array kann auf herkömmliche Weise ausgelesen werden.
In diesem Beutel sollen, nachdem das Blut einmal eingebracht ist, alle Reaktionen ablaufen und die Reaktionen ausgeführt werden können, ohne dass das Blut und die darin befindlichen Lösungen aus dem Beutel mit der Umwelt in Kontakt gelangen. Hierdurch kann eine Kontamination mit dem eventuell infizierten Blut vermieden werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Durchführung und Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen zu schaffen, die eine hermetisch abgeschlossene Reaktionskammer zur Aufnahme eine Biochips aufweist und ein einfaches Verdrängen der Probenlösung aus dem Bereich zwischen dem Biochip und einem in der Reaktionskammer integrierten Fenster erlaubt.
Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung mit dem Merkmal des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung und Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen umfasst:
- Eine Reaktionskammer zur Aufnahme eines Biochips, wobei die Reaktionskammer zumindest ein transparentes Fenster aufweist, damit
Anregungslicht von außen auf den Biochip gestrahlt werden kann und Fluoressenzlicht vom Biochip nach außen zu einer Messeinrichtung abgestrahlt werden kann.
- Eine Membran, die eine Wandung der Reaktionskammer bildet, so dass das Fenster und der Biochip aneinander drückbar sind, um dazwischen befindliche
Probenlösung zu verdrängen.
Diese Vorrichtung zeichnet sich dadurch aus, dass die Reaktionskammer kommunizierend mit einem Ausgleichsraum verbunden ist. Beim Befüllen der Reaktionskammer mit Probenlösung wird die in der Reaktionskammer befindliche Luft in den Ausgleichsraum gedrängt und dort zusammen mit der bereits vorhandenen Luft komprimiert. Hierdurch wird die in der Reaktionskammer befindliche Probenlösung unter Druck gesetzt.
Hierdurch werden folgende Vorteile erzielt:
1. Da die Probenlösung unter Druck gesetzt ist, steigt der Siedepunkt. Dies hat zur Folge, dass selbst bei einer Erwärmung auf Temperaturen im Bereich von etwa 1000C in der Probenlösung keine Gasblasen entstehen, die die Messungen beeinträchtigen könnten.
2. Die Luft im Ausgleichsraum wirkt auf die Probenlösung wie ein elastisches Federelement, das ein weiteres Verdrängen von Probenlösung erlaubt, wobei die durch die Luft auf die Probenlösung ausgeübte Rückstellkraft klein ist. Somit ist auch die Kraft, mit welcher die Membran der Reaktionskammer betätigt werden muss, um die Probenlösung zu verdrängen, klein im Vergleich zur herkömmlichen Reaktionskammer mit einer solchen Membran.
3. Das Vorsehen einer flexiblen Membran in Kombination mit einem Ausgleichsraum erlaubt ein wiederholtes Verdrängen von Probenlösung aus der Reaktionskammer und Zurückführen der Probenlösung in die Reaktionskammer, wodurch ein intensives Agitieren der Probenlösung erzielt wird. Für einen Hybridisierungsvorgang hat dies den Vorteil, dass die einzelnen Substanzen in der Probenlösung gut durchmischt werden. Für das Amplifizieren ist von Vorteil, dass durch die von außen erzwungene Konvektion in der Probenlösung eine gleichmäßige Temperaturverteilung sichergestellt ist.
4. Weiterhin ist das Verdrängen der Probenlösung aus der Reaktionskammer reversibel, sofern in der Verbindung zwischen der Reaktionskammer und dem Ausgleichraum kein Einweg-Ventil vorgesehen ist. Hierdurch ist es möglich, wiederholt optische Messungen in der Reaktionskammer abwechselnd mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen durchzuführen, wobei bei optischen Messungen ein Großteil der Probenlösungen aus der Reaktionskammer zu verdrängen ist, wohingegen bei Durchführung von temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen sich die Probenlösung fast vollständig innerhalb der Reaktionskammer befinden sollte.
Durch die Größe des Volumens des Ausgleichsraums wird der Arbeitsdruck in der Reaktionskammer festgelegt. Ist das Volumen des Ausgleichsraums größer als das der Reaktionskammer, dann wird beim vollständigen Befüllen der Reaktionskammer mit Probenlösung ein Druck von weniger als 1 bar aufgebaut. Entspricht das Volumen des Ausgleichsraums dem Volumen der Reaktionskammer, dann wird beim vollständigen Befüllen der Reaktionskammer mit Probenlösung ein Druck von etwa 1 bar aufgebaut. Ist das Volumen des Ausgleichsraums hingegen kleiner als das Volumen der Reaktionskammer, dann wird beim vollständigen Befüllen der Reaktionskammer mit Probenlösung ein Druck von mehr als 1 bar aufgebaut. Somit kann gezielt durch die Festlegung des Volumens des Ausgleichsraums der Arbeitsdruck in der Reaktionskammer definiert werden.
Die Membran kann als flexible Leiterplatte ausgebildet sein. In dieser Leiterplatte können Heiz-/Messstrukturen integriert sein. Eine solche flexible Leiterplatte dient somit sowohl zum Heizen, Messen als auch zum Verdrängen der Probenlösung aus dem Bereich zwischen dem Biochip und dem Fenster.
Die Membran kann auch als transparente Kunststofffolie ausgebildet sein, die sowohl als Fenster für die optischen Messungen als auch zum Verdrängen der Probenlösung zwischen dem Biochip und der Folie selbst dient. Bei dieser Ausgestaltung ist vorteilhaft, dass der Biochip selbst nicht in der Reaktionskammer bewegt werden muss.
Die Vorrichtung weist vorzugsweise einen zur Reaktionskammer führenden Befüllkanal auf, in dem ein Rückschlagventil angeordnet ist. Hierdurch ist es möglich, die Reaktionskammer mittels einer Pipette zu füllen. Es ist nicht notwendig, eine Kanüle zu verwenden, mit welcher, wie es bei herkömmlichen derartigen Vorrichtungen der Fall ist, eine Dichtung durchstochen wird.
Der die Reaktionskammer begrenzende Körper ist vorzugsweise aus COC (Cycloolefincopolymer) ausgebildet. Dies ist ein inertes Kunststoffmaterial, das keine zusätzliche Passivierung von Oberflächen erfordert, um in der Reaktionskammer temperaturgesteuerte biologische Reaktionen (insbesondere das PCR-Verfahren) durchzuführen.
Im Ausgleichskanal kann ein Rückschlagventil vorgesehen sein. Vorzugsweise ist dieses Rückschlagventil von außen entriegelbar ausgebildet, so dass gesteuert Probenlösung zurück in die Reaktionskammer geführt werden kann. Dieses Rückschlagventil kann sowohl bei den Ausführungsformen mit flexibler Leiterplatte und/oder mit transparenter Kunststofffolie vorgesehen sein. Das Rückschlagventil im Ausgleichskanal ist vorzugsweise derart ausgebildet, dass es erst ab einem vorbestimmten Druck öffnet. Hierdurch wird beim Befüllen der Reaktionskammer schnell innerhalb der Reaktionskammer ein Druck entsprechend dem Öffnungsdruck des Rückschlagventils aufgebaut. Wird dieser Öffnungsdruck überschritten, so öffnet das Ventil und lässt Medium in den Ausgleichsraum strömen. Durch das Vorsehen eines Rückschlagventils mit Öffnungsdruck ist es möglich, die Probenlösung innerhalb der Reaktionskammer zu agitieren, ohne dass die Probenlösung in den Ausgleichsraum tritt, sofern der Öffnungsdruck nicht überschritten wird.
Als Alternative zu einem Rückschlagventil kann auch ein von außen steuerbares Ventil im Ausgleichskanal angeordnet sein. Dieses Ventil kann gezielt geöffnet und geschlossen werden, um den Austausch von Medium zwischen der Reaktionskammer und dem Ausgleichsraum zu steuern.
Bei der Ausführungsform mit transparenter Kunststofffolie ist es auch möglich, den Biochip im Bereich abzutasten, der von der Niederhalteeinrichtung (Rakel oder Walze) soeben überfahren worden ist, oder durch eine transparent ausgebildete Niederhalteeinrichtung (Rakel oder Platte) hindurch abzutasten.
Bei Verwendung einer transparenten Kunststofffolie als Membran ist es zweckmäßig eine Walze vorzusehen, mit welcher die Kunststofffolie gegen den Biochip gedrückt werden kann. Anstelle dieser Walze oder zusätzlich zur Walze kann der Ausgleichsraum auch mit variablem Volumen ausgebildet sein, so dass durch Vergrößern des Volumens des Ausgleichsraums die Probenlösung aus der Reaktionskammer gesaugt wird. Weiterhin ist es möglich anstelle der Walze eine Rakel, insbesondere eine Kunststoffrakel vorzusehen, mit welcher die Kunststofffolie auf den Biochip gestrichen wird. Bei einer weiteren alternativen Ausführungsform wird die Kunststofffolie mittels einer Platte flächig gegen den Biochip gedrückt, so dass die gesamte Probenflüssigkeit zwischen dem Biochip und der Kunststofffolie sicher verdrängt wird.
Die transparente Kunststofffolie kann an ihrer zum Biochip weisenden Seite mit einer Adhäsions- oder Klebeschicht versehen sein, die aktiviert werden kann, wenn sie mit der Probenlösung in Kontakt kommt. Beim Andrücken der Kunststofffolie an den Biochip haftet diese auf dem Biochip, wodurch ein Eintreten von Probenlösung zwischen dem Biochip und der Kunststofffolie verhindert wird. Diese Adhäsions- oder Klebeschicht ist vorzugsweise an dem Bereich der Folie vorgesehen, der nicht mit den die Spots des Biochips enthaltenden Bereich in Kontakt tritt. Die Adhäsions- oder Klebeschicht ist somit umlaufend um den aktiven Bereich des Biochips angeordnet.
Die Erfindung wird anhand in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispielen erläutert. Die Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 einen Grundkörper einer erfindungsgemäßen Kartusche in einer Ansicht von unten,
Fig. 2 eine Ausführung der Reaktionsfelder (Spots) auf einem Biochip mit optisch undurchlässiger und nicht fluoreszierender Rückseite,
Fig. 3 ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäß verwendeten flexiblen
Leiterplatte mit interner Heiz-/Messstruktur und integriertem EEPROM, Fig. 4 ein erstes Ausführungsbeispiel für einen auf einen Grundkörper aufgebrachten Biochip mit Flex-Leiterplatte, Fig. 5 ein zweites Ausführungsbeispiel für einen auf einen Grundkörper aufgebrachten Biochip mit Flex-Leiterplatte, Fig. 6 ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Anordnung des Inlays mit dem zugehörigen Optikmodul,
Fig. 7 ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Anordnung, ausgestattet mit einer transparenten Blende in einem nicht transparenten Grundkörper,
Fig. 8 ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Kartusche, ausgestattet mit einer nichttransparenten Blende an einem transparenten Grundkörper, Fig. 9 den Ausschnitt der ausgeleuchteten Fläche im Probenraum des Inlays ohne
Blende, Fig. 10 das Verfahrensprinzip des Einfüllens einer Probenflüssigkeit durch Kanülen in den Reaktionsraum nach dem Stand der Technik, Fig. 11 das Verfahrensprinzip der Verdrängung des Flüssigkeitsüberstandes mittels
Stößeln nach dem Stand der Technik,
Fig. 12 eine Kartusche mit Inlay und einer Flex-Leiterplatten-Stabilisierungsscheibe, Fig. 13 ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel eines Layouts der Flex-Leiterplatte,
Fig. 14 eine Meß- und Heizelektronik in einem schematisch vereinfachten Schaltbild, Fig. 15 eine Regelungsverfahren in einem Flußdiagramm, Fig. 16 eine Kühleinrichtung in einer schematisch grob vereinfachten Darstellung, Fig. 17 ein erstes Ausführungsbeispiel der Kühleinrichtung in einer schematisch vereinfachten Schnittdarstellung,
Fig. 18 ein zweites Ausführungsbeispiel der Kühleinrichtung in einer schematisch vereinfachten Schnittdarstellung, Fig. 19 eine alternative Heiz-/Kühleinrichtung zum Beheizen und Kühlen der
Reaktionskammer, und Fig. 20 eine Abwandlung der Heiz-/Kühleinrichtung aus Fig. 19.
Fig. 21 ein weiteres Ausführungsbetspiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer Walze zum Verdrängen der Probenlösung in den Ausgleichsraum in einer Schnittdarstellung, Fig. 22 das in Fig. 21 gezeigte Ausführungsbeispiel, wobei überschüssige
Probenlösung in den Ausgleichsraum verdrängt ist.
Ausführungsbeispiel
Kartusche:
Anhand der Figuren 1-9 und 12 wird eine Kartusche mit einem Biochip beschrieben.
Ein beispielsweise mittels Spritzguss aus Kunststoff hergestellter Grundkörper 1 enthält an der Unterseite eine Aussparung für einen Befüllkanal 7, der von einer
Befüllöffnung 9 zu einer Reaktionskammer 5 führt (Fig. 1 , 6), und Aussparungen für die Reaktionskammer 5, einen Ausgleichskanal 4 zwischen der Reaktionskammer 5 und einem Ausgleichsraum 2 und eine Aussparung für den Ausgleichsraum 2. Die
Befüllöffnung 9 ist mit einem sich konisch verjüngenden Abschnitt ausgebildet (Fig. 6), der das Einführen einer Pipettenspitze erleichtert. In der Befüllöffnung ist ein
Rückschlagventil 8 angeordnet. Im Ausgleichskanal 4 befindet sich ein Sichtfenster
3, durch das erkannt werden kann, ob sich im Ausgleichskanal 4 eine
Probenflüssigkeit befindet. Zumindest im Bereich der Reaktionskammer 5 ist der
Grundkörper 1 transparent ausgebildet und bildet somit ein Detektionsfenster 14 durch das ein darunter angeordneter Biochip 6 detektierbar ist.
Die Verbindungskanäle sind möglichst kurz und mit einem möglichst kleinen Querschnitt ausgebildet, damit das Totvolumen klein und der notwendige Überschuss an Probenflüssigkeit gering gehalten wird.
An der Unterseite des Grundkörpers 1 befindet sich eine flexible Leiterplatte 10, die im Folgenden als Flex-Leiterplatte 10 bezeichnet wird (Fig. 3). Die Fiex-Leiterplatte 10 ist mit der Unterseite des Grundkörpers 1 derart verbunden, dass die Aussparungen 7, 5, 4, 3, 2 nach unten hin begrenzt werden und einen durchgängigen kommunizierenden, in sich abgeschlossenen Fluidkanal bilden.
Die Flex-Leiterplatte 10 enthält Kontaktflächen 10.1 , ein digitales Speichermedium 10.2 (z.B. ein EEPROM) und eine interne Heiz-/Messstruktur 10.3 (Fig. 3). In der Reaktionskammer 5 befindet sich ein Biochip 6 (Fig. 2), der eine Anzahl M N Reaktionsfelder 6.1 aufweist. Zur Vermeidung von optischen Rückreflexen und unerwünschter Fluoreszenzstrahlung von der Flex-Leiterplatte 10 ist der Biochip 6 auf der Rückseite optisch undurchlässig und nicht fluoreszierend, z.B. mit Schwarzchrom beschichtet 6.2. Die Flex-Leiterplatte 10 bildet eine Begrenzungswand der Reaktionskammer 5.
Es wird zuerst der Biochip 6 auf der Flex-Leiterplatte 10 fixiert und anschließend die Flex-Leiterplatte 10 mit dem Grundkörper 1 verbunden. Die Verbindung zwischen der Flex-Leiterplatte 10 und dem Biochip 6 erfolgt mit einer Haftverbindungsschicht 17, wie z.B. einem geeigneten Klebeband (geeignet für biologische Reaktionen) oder mit einem Silikonkleber.
Anschließend wird die Flex-Leiterplatte 10 mit dem aufgebrachten Biochip 6 zum Grundkörper 1 justiert und an ihm fixiert und bildet ein Inlay 11. Eine dauerhafte, temperatur- und wasserbeständige Verbindung kann z.B. mittels biologisch-verträglichen Klebeband, mit Silikonkleber, durch Laserschweißen, durch Ultraschallschweißen oder andere biologisch verträgliche Klebstoffe realisiert werden.
Dabei gibt es die Möglichkeit, die Flex-Leiterplatte 10 großflächig mit dem Klebeband (oder Klebstoff) zu beschichten, den Biochip 6 über der Heiz-/Messstruktur 10.3 der Flex-Leiterplatte aufzukleben, und dann den Grundkörper 1 zum Biochip 6 zu justieren und die Flex-Leiterplatte 10 über der gesamten Fläche des Grundkörpers 1 zu fixieren (Fig. 4).
Eine zweite Möglichkeit der Verbindung von Flex-Leiterplatte 10, Biochip 6 und Grundkörper 1 besteht in der gezielten flächigen Verklebung des Biochips 6 mit der Flex-Leiterplatte 10 (Kleber nur unter dem Biochip) und der anschließenden Fixierung des Grundkörpers 1 nur außerhalb der Reaktionskammer 5 (Fig. 5). Mit dieser Art der Verklebung ist der Wärmeübergang von der Heiz-/Messstruktur 10.3 in der Flex-Leiterplatte 10 in die Reaktionskammer 5 effizienter.
Die so vormontierte Einheit des Inlays 11 , bestehend aus Grundplatte, Biochip, Flex- Leiterplatte und Rückschlagventil wird zur einfacheren Handhabung und Stabilisierung in ein Kartuschengehäuse 28 eingepresst (Fig. 12). Das Kartuschengehäuse ist aus einer oberen und einer unteren Hälfte 28.1 , 28.2 ausgebildet, die einen quaderförmigen Hohlraum begrenzen, in den das Inlay formschlüssig aufgenommen ist. Die beiden Hälften 28.1 und 28.2 des Kartuschengehäuses weisen jeweils im Bereich der Reaktionskammer 5 eine etwa rechteckförmige Aussparung 29.1 bzw. 29.2 auf. In der Aussparung 29.2 der unteren Hälfte 28.2 des Kartuschengehäuses kann eine Stabilisierungsscheibe 24 angeordnet sein, die an der Flex-Leiterplatte 10 des Inlays 11 anliegt und etwa mittig eine Öffnung aufweist, die kleiner als die Aussparung 29.2 der unteren Hälfte 28.2 des Kartuschengehäuses ist. Ob eine Stabilisierungsscheibe 24 zweckmäßig ist, hängt davon ab, wie hoch der Druck innerhalb der Reaktionskammer 5 ist und wie stark die Flex-Leiterplatte hierdurch ausgebogen wird.
Befüllvorgang:
Die Probenflüssigkeit wird mittels einer Spritze oder Pipette an der Befüllöffnung 9 durch das Rückschlagventil 8 über den Befüllkanal 7 in die Reaktionskammer 5 eingespritzt. Die Probenflüssigkeit füllt zunächst die Reaktionskammer 5 aus und strömt dann in den Ausgleichskanal 4 und eventuell in den Ausgleichsraum 2. Die Befüllungsmenge wird vorzugsweise derart bemessen, dass keine Probenflüssigkeit in den Ausgleichsraum 2 gelangt. Beim Befüllvorgang entsteht im Inlay 11 ein Überdruck und die Luft im Ausgleichsraum 2 wird komprimiert. Durch das Sichtfenster 3 im Ausgleichskanal 4 kann der Befüllstand überwacht werden. Da die Volumina des Befüllkanals 7, der Reaktionskammer 5 und des Ausgleichskanals 4 bekannt sind, kann mit einem konstanten Flüssigkeitsvolumen, auch ohne Betrachtung des optischen Fensters, befüllt werden.
Der druckdichte Abschluss mit dem Rückschlagventil 8 erzeugt beim Befüllen der Kartusche einen Überdruck in der Reaktionskammer. Die Luft im Ausgleichsraum wird komprimiert. Mit der Variation der Volumina von Reaktionskammer 5 und Ausgleichsraum 2 kann der Überdruck gezielt eingestellt werden. Der Überdruck liegt im Bereich von 0 bar bis 1 bar. Bei gleichen Volumina der Reaktionskammer und des Ausgleichsraumes verdoppelt sich der Innendruck bei der Befüllung. Während der Durchführung der temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktion können Temperaturen bis 100 C auftreten. Die thermische Ausdehnung der Probenflüssigkeit führt zu einem Ausweichen in den Ausgleichskanal 4. Beim Abkühlvorgang zieht sich die Probenflüssigkeit wieder zurück. Die Druckunterschiede bei Tmaχ und Tmin (im kalten und heißen Zustand) sind nur minimal, da die Luft im Ausgleichsraum 2 komprimiert wird. Das Volumen des Ausgleichsraums ist deutlich größer als die VoIu- menzunahme der Probenflüssigkeit bei Erwärmung.
Die Stabilisierungsscheibe 24 kann eine Ausdehnung der elastischen Flex- Leiterplatte 10 beim Befüllvorgang minimieren, ohne die Fähigkeit des elastischen Andrückens des Biochips 6 an das Detektionsfenster 14 zu verlieren (Fig. 12). Eine Druckerhöhung um 1 bar in der Kartusche hat den Vorteil, dass der Siedepunkt der Probenflüssigkeit von 100°C auf ca. 125°C ansteigt. Die Bildung von Luftblasen im Reaktionsraum wird damit minimiert.
Heizeinrichtung für Temperaturgesteuerte biologischen Nachweisreaktion:
Der Ablauf einer temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktion erfordert die Einstellung genauer Temperaturen der Probenflüssigkeit im Reaktionsraum. Dabei werden bei der Durchführung einer PCR z.B. Temperaturen zwischen 30°C und 98°C angesteuert. Die Temperaturverteilung der Probenflüssigkeit muss im Reaktionsraum homogen sein und Temperaturänderungen (Heizen, Kühlen) sollen schnell erfolgen.
Auf der Flex-Leiterplatte 10 befindet sich eine Heiz-/Messstruktur, die bei Stromführung durch den ohmschen Widerstand als Heizer wirkt. Damit wird die Probenflüssigkeit im Reaktionsraum auf die erforderliche Temperatur T erwärmt. Die Heiz-/Messstruktur kann gleichzeitig als Temperaturdetektor eingesetzt werden, indem die Widerstandskennlinie R(T) zur Bestimmung der Temperatur verwendet wird.
Die Flex-Leiterplatte 10 mit der integrierten Heiz-Leiterbahn verursacht lokale Temperaturschwankungen. Direkt über den Heiz-/Messstrukturen befinden sich Hotspots. Eine Temperaturhomogenisierungsschicht 21 (Fig. 7) auf der Flex- Leiterplatte 10 bewirkt eine Homogenisierung der Temperaturverteilung auf der Oberseite der Flex-Leiterplatte 10. Die Temperaturhomogenisierungsschicht 21 ist eine Kupferschicht, die vernickelt und mit einer zusätzlichen Goldschicht versehen ist. Die Goldschicht hat den Vorteil, dass sie für biologische Materialen inert ist und somit in der Reaktionskammer biologische Materialen unmittelbar mit dieser Schicht in Berührung kommen können. Diese Reaktionskammer kann deshalb auch für andere Experimente als solche mit Biochip verwendet werden. Diese Homogenisierungsschicht besitzt eine gute thermische Leitfähigkeit. Anstelle einer kombinierten Kupfer-Nickel-Gold-Beschichtung könnte auch eine relativ dicke Kupferschicht vorgesehen werden.
Eine in die Flex-Leiterplatte integrierte Heizleiterbahn hat eine niedrige eigene Wärmekapazität. Damit sind höhere Heizraten der Probenflüssigkeit im Reaktionsraum realisierbar. Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel des Layouts der Flex-Leiterplatte 10 ist in Figur 13 gezeigt. Die mäanderförmige Heiz-/Messstruktur 10.3 ist aus einer dünnen Leiterbahn mit einer Breite von 60 μm und einer Stärke von 16 μm ausgebildet. Sie ist etwa 480 mm lang. Bei Raumtemperatur weist sie einen elektrischen Widerstand von etwa 6 bis 8 Ohm auf. Die Leiterbahn ist aus Kupfer, vorzugsweise Kupfer mit einer Reinheit von 99,99% ausgebildet. Derart reines Kupfer weist einen Temperaturkoeffizienten auf, der im hier relevanten Temperaturbereich nahezu konstant ist. In ihrer Gesamtheit bildet die Heiz-/Messstruktur 10.3 eine Raute mit einer Kantenlänge von etwa 9 mm. Es gibt bereits Prototypen von flexiblen Leiterplatten mit einer Kupferschicht, die eine Stärke von 5 μm aufweist und auf welchen Strukturen mit einer Breite von 30 μm ausgebildet sind. Mit derartigen Leiterbahnen würde eine Widerstand von etwa 100 Ohm bis 120 Ohm erzielt werden.
Der Biochip 6 weist lediglich eine Kantenlänge von 3 mm auf, womit die durch die Heiz-/Messstruktur 10.3 und der Temperaturhomogenisierungsschicht 21 gebildete Raute eine größere Fläche als der Biochip abdeckt.
Die Endpunkte der mäanderförmigen Heiz-/Messstruktur gehen jeweils in eine sehr breite Leiterbahn 30.1 und 30.2 über, die zum Zuführen des Heizstromes dienen und selbst aufgrund ihrer großen Breite nur einen geringen Widerstand besitzen. Weiterhin sind an diesen beiden Leiterbahnen 30.1 und 30.2 jeweils eine weitere Leiterbahn 31.1 und 31.2 im Bereich der Anbindungsstelle der mäanderförmigen Heiz-/Messstruktur angebunden. Diese beiden weiteren Leiterbahnen 31.1 und 31.2 dienen zum Abgreifen des Spannungsabfalls an der Heiz-/Messstruktur. Dies wird unten näher erörtert.
Die Flex-Leiterplatte 10 weist Leiterbahnen 32 und entsprechende Kontaktstellen 33, 34 zum Anschließen eines elektrischen Halbleiterspeichers auf. Dieser Halbleiterspeicher dient zum Speichern von Kalibrierdaten für die Heizeinrichtung und der Daten der biologischen Experimente, die mit dem Biochip der Kartusche durchzuführen sind. Diese Daten sind somit verwechslungssicher abgespeichert.
Figur 14 zeigt ein Ersatzschaltbild einer Schaltung einer Mess- und Steuereinrichtung zum Heizen und Messen des Heizstromes mittels der mäanderförmigen Heiz- /Messstruktur bzw. Heiz-Leiterbahn. Die Heiz-/Messstruktur 10.3 ist im Ersatzschaltbild als Widerstand dargestellt, der in einer Reihe mit einem Strommesswiderstand 35 und einer steuerbaren Stromquelle 36 geschaltet ist. Die Spannung am Strommesswiderstand 35 und an der Heiz-/Messstruktur 10.3 werden jeweils mittels eines separaten Messkanals 37, 38 abgegriffen. Die beiden Messkanäle 37, 38 sind identisch ausgebildet mit jeweils einem aus zwei Operationsverstärkern bestehenden Impedanzwandler 39, einem Operationsverstärker 40 zum Verstärken des Messsignals, einem Anti-Aliasingfilter 41 und einem A/D-Wandler 42, mit dem das analoge Messsignal in einen digitalen Messwert umgesetzt wird. Die beiden Messkanäle 37, 38 sind somit hochohmig und identisch zueinander ausgebildet.
Die Operationsverstärker 40 der beiden Messkanäle 37, 38 sind vorzugsweise Operationsverstärker mit lasergetrimmtem Innenwiderstand, deren Verstärkung sehr präzise einstellbar ist. Im vorliegenden Ausfϋhrungsbeispiel wird hierfür der Operationsverstärker LT 1991 der Firma Linear Technology eingesetzt. Die beiden A/D-Wandler 42 der beiden Messkanäle 37, 38 werden vorzugsweise durch einen synchronen Zwei-Kanal A/D-Wandler realisiert, der beide Kanäle gleichzeitig erfasst. Hierdurch wird sichergestellt, dass die Messwerte in beiden Kanälen jeweils zu identischen Zeiten abgetastet werden. Dies gewährleistet, dass die am Strommesswiderstand abgegriffene Spannung und die am Heizelement bzw. an der Heiz-/Messstruktur 10.3 abgegriffene Spannung jeweils gleichzeitig abgegriffen werden und somit auf dem gleichen Heiz- bzw. Messstrom beruhen, der durch den Strommesswiderstand 35 bzw. die Heiz-/Messstruktur 10.3 fließt.
Da der Heiz- bzw. Messstrom gemessen wird, kann dieser Strom gleichzeitig zum Heizen und zum Messen verwendet werden. Bei herkömmlichen Messvorrichtungen wird ein konstanter Messstrom eingespeist, der nicht am Sensor gemessen wird. Ein solcher Messstrom kann nicht variiert werden und zum Heizen verändert werden, weshalb das Heizen und Messen unabhängig voneinander ausgeführt wird.
Da bei einem Heiz- und Messstrom das Heizen und Messen gleichzeitig ausgeführt wird, wird eine präzisere Regelung der Temperatur möglich.
Die Messung der Temperatur erfolgt mit einer hohen Abtastrate von z. B mehr als 1.000 Hz vorzugsweise zumindest etwa 3.000 Hz. Dies erlaubt eine extrem präzise Einstellung der Temperatur. Es hat sich gezeigt, dass mit knapp unter 3.000 Hz eine Heizrate von 85°C/sec mit einer Genauigkeit von 0,10C gesteuert werden kann.
Beim Abkühlen fließt ein Heiz- und Messstrom von ca. 50 mA und beim Halten einer Temperatur von ca. 350 mA bis 400 mA.
Durch die Ausbildung der Heiz-/Messstruktur 10.3 als lange, dünne, schmale Leiterbahn wird selbst bei Verwendung von Kupfer als Leiterbahnmaterial ein ausreichend hoher Widerstand erzielt, der mit der oben erläuterten 4-Punkt-Messung auch bei geringem Heizstrom zuverlässig abgetastet werden kann. Die 4-Punkt- Messung ist unabhängig von parasitären Widerständen. Denn, da die erfindungsgemäße Heiz-/Messstruktur 10.3 sowohl als Heizelement als auch als Messwiderstand zum Messen der Heizspannung dient, ist es nicht möglich, beliebig hohe „Messströme" an diese Heiz-/Messstruktur 10.3 anzulegen, denn diese Messströme wirken auch als Heizströme und würden zu einer signifikanten Temperaturerhöhung führen, die jedoch nicht immer gewünscht ist. Es liegen somit Randbedingungen vor, die unter gewissen Prozessbedingungen einen sehr geringen Messstrom erfordern, um nicht die Temperatur der Reaktionskammer in unerwünschter Weise zu Verändern. Da zwei identische Messkanäle 37, 38 verwendet werden, die zeitgleich die Messspannung mit einer sehr hohen Impedanz abgreifen und sehr präzisen Verstärkern messen, können selbst geringe Spannungsabfälle an den Widerständen 35 und 10.3 zuverlässig detektiert werden. Da die Messkanäle identisch sind, kürzen sich systematische Messfehler heraus, da der Widerstand R der Heiz-/Messstruktur 10.3 gemessen wird, der Quotient aus dem Heizstrom und der Heizspannung bzw. der beiden Messsignale ist.
Die Heiz-/Messstruktur 10.3 ist auf der von dem Biochip 6 abgewandten Seite der Flex-Leiterplatte 10 ausgebildet. Auf der gegenüberliegenden Seite der Flex-
Leiterplatte ist die durchgehende Temperaturhomogenisierungsschicht 21 vorgesehen, die zu einer gleichmäßigen, schnellen Wärmeverteilung führt und eine entsprechende gleichmäßige und schnelle Erwärmung des Biochips 6 erlaubt.
Zudem besitzt die Flex-Leiterplatte lediglich eine Wärmekapazität von etwa 12 mJ/K was zu einer schnellen Wärmeübertragung der erzeugten Wärme auf die in der
Reaktionskammer befindlichen Probenflüssigkeit und den Biochip führt.
Bei herkömmlichen vergleichbaren Heizeinrichtungen wurden meistens Leiterbahnen aus einem Material mit einem höheren spezifischen Widerstand als Kupfer, wie z. B. NiCr verwendet und für das Heizen als auch für das Messen werden zwei separate Leiterbahnen vorgesehen, da es bisher als schwierig erachtet wurde, mit einer Kupferleiterbahn gleichzeitig zu Heizen als auch die Temperatur zu Messen. Bisher wurden auch vor allem Siliziumsubstrate als Heizelemente verwendet, da sie aufgrund ihrer hohen Wärmeleitfähigkeit vorteilhaft zur schnellen Verteilung der Wärme erschienen. Derartige Siliziumsubstrate besitzen jedoch eine Wärmekapazität, die etwas mehr als das 10-fache der Wärmekapazität der erfindungsgemäßen Flex-Leiterplatte beträgt. Hierdurch wird der Heizvorgang sehr träge. Die mit der oben erläuterten Messschaltung erhaltenen Messwerte werden einer digitalen Steuereinrichtung 43 zugeführt, die über eine Leitung 44 die steuerbare Stromquelle 36 ansteuert.
In der Steuereinrichtung 43 wird das schematisch in Figur 15 gezeigte Regelverfahren ausgeführt.
Dieses Verfahren zum Durchführen eines Temperaturprofils beginnt mit dem Schritt S1. Im Schritt S2 wird der Temperaturwert gemessen, das heißt der Widerstand der Heiz-/Messstruktur 10.3 wird aus den beiden Messwerten berechnet und in einen Temperaturwert gemäß einer Tabelle umgesetzt.
Im Schritt S3 wird die Differenz zwischen der gemessenen Ist-Temperatur und einer Soll-Temperatur berechnet. Dieser Wert wird als Delta-Wert bezeichnet. Die SoII- Temperatur verändert sich mit der Zeit. Die Funktion, die diese zeitlich veränderliche Temperatur beschreibt, wird als Temperaturprofil bezeichnet, das an der Reaktionskammer angelegt werden soll.
Im Schritt S4 wird abgefragt, ob der Delta-Wert größer als ein vorbestimmtes Minimum ist. Wenn die Antwort auf diese Frage „Ja" ist, geht der Verfahrenablauf auf den Schritt S5 über, in dem abgefragt wird ob dieser Delta-Wert kleiner als einer vorbestimmtes Maximum ist. Ist das Ergebnis wiederum „Ja", geht der Verfahrensablauf auf einen Block von Verfahrensschritten S6, S7, S8 über, mit welchen ein Integral-Anteil eines Regelungswertes (Schritt S6) berechnet wird, zum Delta-Wert ein Offset-Wert hinzu addiert wird (Schritt S7) und anhand des derart veränderten Delta-Wertes ein Proportional-Anteil (Schritt S8) berechnet wird. Eine Stellgröße ergibt sich durch Addieren des Integral-Anteils und des Proportional- Anteils. Das Addieren des Offset-Werts bewirkt, dass mit höherer Heizleistung geheizt wird.
Ergibt sich bei einer der beiden obigen Abfragen (Schritt S4) bzw. Schritt (S5) ein „Nein" als Ergebnis, so geht der Verfahrensablauf direkt auf den Schritt S7 über, womit die Berechnung des Integral-Anteils ausgelassen wird. Dies heißt, dass nur innerhalb eines vorbestimmten Bereiches um die Soll-Temperatur ein Integral-Anteil berechnet wird. Dieser Bereich um die Solltemperatur beträgt etwa +/- 1°C bis +/- 20C. Der Integral Anteil wird somit nur verwendet, wenn die gemessene Ist- Temperatur schon relativ nahe an der gewünschten Soll-Temperatur ist. Hierdurch wird zum einen ein Überschwingen der Ist-Temperatur aufgrund des sehr trägen Intergral-Anteils verhindert. Andererseits ermöglicht der Integral-Anteil in der letzten Regelungsphase eine sehr präzise und schnelle Annäherung an die gewünschte Soll-Temperatur.
Im Schritt S9 wird geprüft, ob die Stellgröße kleiner als ein vorbestimmtes Minimum ist. Ist dies der Fall, geht der Verfahrensablauf auf den Schritt S10 über, mit dem die Temperatur mit maximaler Kühlleistung gesenkt wird.
Ergibt im Schritt S9 die Abfrage, dass die Stellgröße nicht kleiner als ein vorbestimmtes Minimum ist, dann geht der Verfahrensablauf auf den Schritt S10 über, in dem geprüft wird, ob die Stellgröße kleiner als Null ist. Ist dies der Fall, geht der Verfahrensablauf auf den Schritt S12 über, in dem die Stellgröße auf Null gesetzt wird. Dies bedeutet, dass die Reaktionskammer ohne zusätzliche Kühlleistung abgekühlt wird bzw. dass der Kühlstempel von der Reaktionskammer entfernt wird. Hierdurch wird ein Überschwingen vermieden.
Ergibt die Abfrage im Schritt S11 hingegen, dass die Stellgröße nicht kleiner als Null ist, dann bedeutet dies, dass die Temperatur erhöht werden muss. Demgemäß wird im Schritt S13 eine Temperaturerhöhung entsprechend der ermittelten Stellgröße durchgeführt. Dies heißt, dass ein zur Stellgröße proportionales Stellsignal an die steuerbare Stromquelle 36 abgegeben wird, die einen entsprechenden Heizstrom durch die Heiz-/Messstruktur 10.3 erzeugt.
Im Schritt S14 wird geprüft, ob das Ende des Temperaturprofils erreicht worden ist. Ist dies der Fall, wird der Verfahrensablauf mit dem Schritt S15 beendet. Ansonsten geht der Verfahrensablauf wieder auf den Schritt S2 über. Dieser Regelvorgang wir mit der Abtastfrequenz wiederholt, die zumindest 1.000 Hz, insbesondere zumindest etwa 3.000 Hz beträgt.
Kühleinrichtung für temperaturgesteuerte biologische Nachweisreaktionen:
Figur 16 zeigt das Grundprinzip der erfindungsgemäßen Kühleinrichtung 50. Diese Kühleinrichtung 50 weist einen Kühlkörper auf, der im folgenden als Kühlstempel 51 bezeichnet wird. Die Besonderheit dieses Kühlstempels 51 liegt darin, dass er bezüglich der Kartusche 28 beweglich angeordnet ist, so dass er mit einer Kühlfläche mit der Kartusche 28 derart in Kontakt bringbar ist, dass die Reaktionskammer 5 der Kartusche 28 gekühlt werden kann. Es ist sowohl möglich, den Kühlstempel 51 ortsfest anzuordnen und die Kartusche 28 mit einem Linearantrieb zu bewegen oder die Kartusche ortsfest anzuordnen und den Kühlstempel 51 mittels eines Linearantriebes zu bewegen. Der Kühlstempel 51 ist mit einer Kühleinheit 52 versehen, die ein Kühlelement in Form eines Peltier-Elementes, einen Kühlkörper und einen Lüfter umfasst. Mit dieser Kühleinheit 52 kann der Kühlstempel 51 auf eine vorbestimmte Temperatur gekühlt werden. Weiterhin weist die Kühleinrichtung 50 einen Linearantrieb 53 auf, mit dem der Kühlstempel hin und her bewegt werden kann. Der Kühlstempel 51 weist eine Stirnfläche auf, die im folgenden als Kühlfläche 54 bezeichnet wird, und mit der Kartusche in Kontakt gebracht werden kann. Die Größe des Kühlstempels 51 ist derart bemessen, dass die Kühlfläche 54 im Bereich der Reaktionskammer 5 zum Kühlen an der Kartusche bzw. an der Flex-Leiterplatte 10 in Berührung gebracht werden kann.
Die Wärmekapazität des Kühlstempels 51 ist im Gegensatz zur Wärmekapazität der Flex-Leiterplatte 10 bzw. der Reaktionskammer 5 sehr groß. Bei den unten beschriebenen Ausführungsbeispielen beträgt z.B. die Wärmekapazität des Kühlstempels 51 etwa 8 bis 9 J/K. Die gesamte Wärmekapazität der Reaktionskammer 5 beträgt hingegen lediglich etwa 0,5 J/K. Hierdurch ist zum einen ein hoher Wärmetransfer sicher gestellt. Zum anderen bedeutet die hohe Wärmekapazität des Kühlstempels 51 , dass dessen Temperatur auch beim Abkühlen der Reaktionskammer 5 um einen sehr hohen Temperaturunterschied nicht wesentlich verändert wird. Dies hat zur Folge, dass der Kühlstempel 51 mit relativ geringer Kühlleistung auf seiner Arbeitstemperatur gehalten werden kann. Durch die große Wärmekapazität des Kühlstempels wird somit der notwendige schnelle Abkühlvorgang der Reaktionskammer 5 zeitlich von der Kühleinheit 52 entkoppelt, die vom Kühlstempel 51 allmählich bei relativ geringer Kühlleistung die Wärme nach außen abführt.
Weiterhin kann der Kühlstempel 51 konstant auf einem gegenüber den Temperaturen in der Reaktionskammer relativ geringen Temperaturniveau, von z. B. 200C gehalten werden, wodurch schnelle Abkühlvorgänge erzielt werden, insbesondere beim Durchführen von PCR-Reaktionen, bei welchen wiederholt z. B. von einer Temperatur von 98°C auf eine Temperatur von 400C bis 600C abgekühlt werden muss.
In dem Moment, wo die Temperatur der Reaktionskammer 5 die Zieltemperatur erreicht hat oder kurz vorher wird der Kühlstempel 51 von der Reaktionskammer 5 wegbewegt. Gegebenenfalls kann etwas geheizt werden, um die Endtemperatur einzuregeln. Dies ist typischerweise der Fall, wenn die Solltemperatur über der Raumtemperatur liegt. Falls die Temperatur unter die Solltemperatur fällt, wird automatisch geheizt. Soll, wie es bei manchen biologischen Tests notwendig ist, eine Temperatur unterhalb der Raumtemperatur in der Reaktionskammer eingestellt werden, wird der Kühlstempel auf diese Temperatur eingestellt und dauerhaft gegen die Reaktionskammer gedrückt.
In speziellen Anwendungen, bei welchen man eine geringer Kühlrate wünscht, kann zusätzlich zum anliegenden Kühlstempel 51 gleichzeitig geheizt werden. Dies ist insbesondere bei geringeren Temperaturänderungen von maximal etwa 400C bis 500C zweckmäßig. Dies kann aber auch dazu eingesetzt werden, um eine Temperatur unterhalb der Raumtemperatur zu halten, wobei der auf eine Temperatur unterhalb der Zieltemperatur abgekühlte Stempel permanent mit der Reaktionskammer in Kontakt steht. Eine verringerte Kühlrate kann auch durch Verringern der Andrückkraft, mit der der Kühlstempel gegen die Reaktionskammer gedrückt wird, erzielt werden.
Ein erstes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Kühleinrichtung ist in Figur 17 gezeigt. Diese Kühleinrichtung weist wiederum einen Kühlstempel 51 , eine Kühleinheit 52 und einen Linearantrieb 53 auf.
Als Linearantrieb sind beispielsweise Schrittmotoren oder Servogetriebemotoren mit Spindel- oder Schneckengetriebe, Linearschrittmotoren, Piezolinearmotoren, Motoren mit Ritzel und Zahnstange, Hubmagnete, Drehmagnete, Voice-Coil- Magnete, Motoren mit Kurvenscheiben usw. geeignet.
Der Kühlstempel 51 ist zylinderrohrförmig ausgebildet. Er besteht aus Metall, wie zum Beispiel Kupfer oder Aluminium. Im Inneren des Kühlstempels 51 lagert beweglich ein stift- oder stabförmiger Stößel 55, der aus einem Kunststoff oder Metall, wie zum Beispiel Kupfer oder Aluminium ausgebildet ist. Der Stößel 55 ist längsverschieblich im Kühlstempel 51 angeordnet. Der Stößel ist möglichst dünn ausgebildet und an seinem zur Reaktionskammer weisenden Ende abgerundet, so dass er möglichst punktförmig gegen die Reaktionskammer drückt.
Der Kühlstempel 51 ist aus Metall ausgebildet, da Metall wärme gut leitet. Er kann auch aus einem anderem gut wärme leitenden Material ausgebildet sein, wie z. B. spezielle Keramiken (Aluminiumoxidkeramik, etc.) oder Kunststoffe mit bestimmten Füllstoffen, wie z. B. Grafit, Metallpulver oder winzigen Metallkügelchen, Kunststoffnanoröhrchen, AI2O3-Keramikpulver. Die aus der Kühleinrichtung 50 hervorstehende Stirnfläche 54 des Kühlstempels 51 bildet eine Kühlfläche 54. Am von der Kühlfläche entfernten Umfangsbereich des Kühlstempels 51 ist dieser mit zwei ebenen Flächen ausgebildet, an welchen Kühlelemente 56 in Form von Peltier-Elementen befestigt sind. Diese Kühlelemente sind Bestandteile der Kühleinheit 52, die weiterhin noch Lüfter 57 und Kühlkörper 58 aufweist. Die Lüfter 57 sind hierbei in ein Gehäuse zum Aufnehmen eines Abschnittes dieses Kühlstempels 51 integriert.
Der Kühlstempel 51 weist an seiner rückwärtigen, der Kühlfläche 54 gegenüberliegenden Stirnfläche eine Buchse 59 aus einem schlecht wärmeleitenden Material, wie zum Beispiel Kunststoff auf. Diese Buchse 59 begrenzt einen Hohlraum. Der Stößel 55 erstreckt sich mit seinem rückwärtigen Ende in diesen Hohlraum und weist einen pfropfenförmigen Endkörper 60 auf, der in der Buchse 59 gleitend lagert. Zwischen diesem Endkörper 60 und der am Kühlstempel 51 anliegenden Wandung der Buchse 59 ist eine Feder 61 gespannt, die den Stößel mit einer Kraft derart beaufschlagt, dass der Stößel 55 mit seiner vom Endkörper 60 abgewandten freien Stirnfläche (Bestandteil der Kühlfläche 54) in den Kühlstempel 51 hineingezogen wird.
Die Buchse 59 ist im Gehäuse mittels eines Kunststoffrings 62 fixiert. Weiterhin befindet sich im Gehäuse ein Linearantrieb 63 zum Beaufschlagen des Endkörpers 60 bzw. des Stößels 55 mit einer Kraft, die ihn mit seinem freien Ende ein Stück aus dem Kühlstempel 51 herausdrückt. Die gesamte Einheit bestehend aus dem Kühlstempel 51 , dem Stößel 55, der Kühleinheit 52, und dem Linearantrieb 63 ist in Axialrichtung des Kühlstempels 51 gleitend gelagert und an den Linearantrieb 53 gekoppelt. Diese Kopplung erfolgt mittels einer Feder 64. Die Feder weist eine bestimmte Kraft-Weg-Kennlinie auf und erlaubt somit über eine Wegsteuerung am Linearantrieb 53 die Andruckkraft des Kühlstempels 51 an die Flex-Leiterplatte 10 zu steuern, ohne dass die Kraft mit einem zusätzlichen Kraftsensor gemessen oder geregelt wird. Diese Art der Einstellung der Druckkraft genügt den Anforderungen, da die Toleranzen bezüglich der eingestellten Kraft in weiten Bereichen unkritisch sind.
Der Kühlstempel 51 ist an allen freien und zugänglichen Stellen thermisch isoliert. Hierzu ist beispielsweise handelsüblicher, feinporiger Schaumstoff vorgesehen. Die Kühlfläche 54 des Kühlstempels 51 ist plangedreht und poliert. Die Kühlelemente 56 sind in Reihe geschaltet und mit einer Steuerelektronik verbunden. Weiterhin ist an der Oberfläche des Kühlstempels 51 ein Temperatursensor zum Messen der Temperatur des Kühlstempels vorgesehen. Die Temperaturregelung am Kühlstempel 51 erfolgt mit einem Pl-Regler. Die Abtastung der Temperatur erfolgt beispielsweise mit einer Abtastrate von 2 Hz.
Aufgrund der großen Wärmekapazität des Kühlstempels 51 und des Stößels 55, der gleichermaßen mit dem Kühlstempel 51 kühl gehalten wird, erwärmt sich dieser zweiteilige Kühlkörper lediglich um etwa 2°C bei einer Abkühlung der Reaktionskammer um eine Temperatur von etwa 4O0C. Die erforderliche Kühlleistung ist relativ gering und beträgt etwa 1 - 2 W. Dies erlaubt, dass die Kühleinrichtung mit Batterien betrieben werden kann.
Ein zweites Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Kühleinrichtung ist in Fig. 18 gezeigt. Gleiche Teile dieses zweiten Ausführungsbeispiels sind mit gleichen Bezugszeichen wie in Fig. 17 gekennzeichnet.
Auch die Kühleinrichtung 50 nach dem zweiten Ausführungsbeispiel umfasst einen zylinderrohrförmigen Kühlstempel 51 mit einer Kühlfläche 54 , einen darin beweglich angeordneten Stößel 55, zwei Kühleinheiten 52 mit jeweils einem Kühlelement 56, einem Lüfter 57 und einem Kühlkörper 58, einen Linearantrieb 63 zum Betätigen des Stößels 55 und eine Feder 61 , die den Stößel mit seinem freien Ende in den Kühlstempel 51 zieht.
Das zweite Ausführungsbeispiel der Kühleinrichtung 50 unterscheidet sich vom ersten Ausführungsbeispiel dadurch, dass der Kühlstempel 51 ortsfest angeordnet ist und ein Linearantrieb 65 zum Bewegen der Kartusche 28 vorgesehen ist. Dieser Linearantrieb 65 ist mittels einer Feder 66 an eine Halterung (nicht dargestellt) zur Aufnahme der Kartusche gekoppelt. Die Halterung ist linear gelagert. In die Halterung kann die Kartusche mit reproduzierbarer Position eingesetzt werden. Über die Kraft-Weg-Kennlinie der Feder 66 kann mittels einer Wegsteuerung die Kraft eingestellt werden, mit welcher die Kartusche gegen den Kühlkörper 51 , 55 gedrückt wird.
Die Linearantriebe 53, 63 und 65 sind derart ausgebildet, dass sie aktiv zurückgezogen werden können, um die Kartusche auszutauschen.
Bei dieser Vorrichtung ist vorteilhaft, dass lediglich die im Vergleich zur übrigen Kühleinrichtung kleine Kartusche 28 bewegt wird.
Um bestimmte Temperaturprofile auszuführen, deren kühlste Temperaturen etwa 100C bis 200C über Raumtemperatur liegen, ist es nicht notwendig, aktiv zu kühlen. Hierzu genügt es, am Kühlstempel eine Kühleinheit in Form von Kühlrippen oder dergleichen vorzusehen, an welchen die vom Kühlstempel aufgenommene Wärme über Konvektion und Strahlung abgeben wird. Die Kühlraten sind bei solchen Vorrichtungen prinzipbedingt geringer als bei einer aktiven Kühlung. Aber eine solche Kühleinheit würde der Anforderungen vieler in der Praxis verwendete Temperaturzyklen genügen. Als Kühleinheiten sind auch andere Systeme einzeln oder in Kombination möglich, wie z. B. eine Wasserkühlung oder die Erzeugung sehr kalter Luft mittels eines Wirbelrohres, das an den Kühlstempel geblasen wird.
Kombinierte Heiz-/Kühleinrichtung:
Fig. 19 und 20 zeigen jeweils eine kombinierte Heiz-/Kühleinrichtung zum Beheizen und Kühlen der Reaktionskammer 5 der Kartusche 28 bzw. einer anderen Kartusche 71 , die wiederum eine Reaktionskammer 5 zur Aufnahme eines Biochips 6 aufweist, jedoch nicht mit eigenen Heizmitteln versehen ist. Die Reaktionskammer 5 ist in einem Teilbereich von einer dünnen Platte 72 aus gut wärmeleitendem Material begrenzt, die biegsam ausgebildet sein kann. Die Platte 72 liegt frei mit ihrer von der Reaktionskammer abgewandten Seite, so dass sie von der Heiz-/Kühleinrichtung 70 berührt werden kann.
Die Heiz-/Kühleinrichtung 70 weist einen Heizstempel 73 mit einer zur Platte 72 weisenden Kontaktfläche 74 auf. Der Heizstempel 73 ist aus Metall ausgebildet und mit einem Heizmittel 75, wie z. B. mit um den Heizstempel 73 gewickelten Heizdrähten, versehen. Das Heizmittel 75 ist mit einer Steuereinrichtung (nicht dargestellt) verbunden, mit welcher der Heizstempel 73 auf eine vorbestimmte Temperatur beheizt werden kann. An der Kontaktfläche 74 ist ein Temperatursensor 76 angeordnet, der die Temperatur der Kontaktfläche 74 erfasst. Der Temperatursensor ist auch mit der Steuereinrichtung verbunden, so dass die Steuereinrichtung die Temperatur des Heizstempels 73 regeln kann. Der Heizstempel 73 ist über eine Achse 77 mit einem Linearantrieb 78 verbunden, mit welchem der Heizstempel 73 zur Platte 72 bewegt werden kann, bis er diese mit einem vorbestimmten Druck berührt oder von der Platte 72 der Kartusche 71 weggezogen werden kann, so dass ein vorbestimmter Luftspalt zwischen dem Heizstempel 73 und der Platte 72 besteht.
Auf der Achse 77 lagert beweglich ein Kühlstempel 79, der die Achse 77 umschließt. Der Kühlstempel 79 ist aus Metall ausgebildet und in Längsrichtung der Achse 77 verschieblich angeordnet. Der Kühlstempel 79 ist mit einem weiteren Linearantrieb 80 verbunden, mit welchem die Position des Kühlstempels 79 auf der Achse 77 einstellbar ist. Der Kühlstempel 79 kann durch den Linearantrieb 80 in Richtung zum Heizstempel 73 bewegt werden, bis der Kühlstempel 79 den Heizstempel 73 an seiner von der Kontaktfläche 74 abgewandten Seite unter Druck berührt. Der Kühlstempel 79 kann auch vom Heizstempel 73 derart entfernt werden, dass dazwischen ein Luftspalt ausgebildet ist. Am Kühlstempel 79 ist eine Kühleinheit 81 mit einem Peltier-Element, Kühlkörper und Lüfter angeordnet, um den Kühlstempel auf eine vorbestimmte Temperatur zu kühlen.
Der Kühlstempel 79 weist eine wesentlich größere Masse und Volumen als der Heizstempel 73 auf. Dadurch besitzt der Kühlstempel 79 eine wesentlich größere
Wärmekapazität als der Heizstempel 73. Dies hat zur Folge, dass wenn der
Kühlstempel 79 den Heizstempel 73 berührt, dieser zusammengesetzte Stempel thermisch vom Kühlstempel dominiert wird und als ein die Reaktionskammer kühlender Stempel wirkt. Das Volumen und die Masse des Heizstempels 73 ist gering. Hierdurch kann der Heizstempel 73 mit geringer Energie auf vorbestimmte
Temperaturen aufgeheizt werden.
Der Kühlstempel 79 wird auf einer vergleichsweise geringen Temperatur mittels der Kühleinheit 81 gehalten.
Soll in dieser Heiz-/Kühleinrichtung ein vorbestimmter Temperaturzyklus abgefahren werden, so wird während der Heizphasen der Heizstempel 73 gegen die Platte 72 der Kartusche 71 gedrückt. Hierbei ist der Kühlstempel 79 mit Abstand zum Heizstempel 73 angeordnet. Der Heizstempel 73 wird mittel seines Heizmittels 75 geheizt, bis an der Grenzfläche zwischen der Kontaktfläche 74 und der Platte 72 die gewünschte Temperatur eingestellt ist.
Bei Kühlphasen wird das Heizmittel 75 ausgeschaltet und der Kühlstempel 79 durch den Linearantrieb 80 gegen den Heizstempel 73 gedrückt. Der Heizstempel 73 steht wiederum in Kontakt mit der Platte 72 der Kartusche 71. Aufgrund der wesentlich größeren Wärmekapazität des Kühlstempels 79 gegenüber der Wärmekapazität des Heizstempels 73 wird dem Heizstempel 73 schnell viel Wärme entzogen, wodurch der Heizstempel abkühlt und als Kühlmittel für die Reaktionskammer 5 der Kartusche 71 dient. Auch während der Kühlphase wird die Temperatur an der Grenzfläche zwischen dem Heizstempel 73 und der Platte 72 vom Temperatursensor 76 überwacht. Ist die gewünschte Temperatur erzielt, so werden sowohl Heizstempel 73 als auch Kühlstempel 79 vom Linearantrieb 78 zurückgezogen oder es wird lediglich der Kühlstempel 79 zurückgezogen und dem Heizstempel 73 wird mittels des Heizmittels 75 Wärme zugeführt, falls die Temperatur der Reaktionskammer 5 über der Raumtemperatur gehalten werden muss. Soll die Temperatur der Reaktionskammer unterhalb der Raumtemperatur gehalten werden, dann kann es auch zweckmäßig sein, wenn der Heizstempel 73 weiterhin an der Reaktionskammer 5 anliegt und gleichzeitig der Kühlstempel 79 den Heizstempel 73 berührt. Durch Energiezufuhr vom Heizmittel 75 kann der Wärmestrom von - bzw. zur Reaktionskammer 5 derart gesteuert werden, dass deren Temperatur konstant gehalten wird.
Es ist vorteilhaft, wenn die Berührungsfläche zwischen dem Heizstempel 73 und dem Kühlstempel 79 möglichst großflächig ausgebildet ist, da dann ein hoher Wärmefluss ermöglicht wird.
Eine zweite Ausführungsform einer Heiz-/Kühleinrichtung 82 ist in Fig. 20 gezeigt. Diese zweite Ausführungsform unterscheidet sich etwas von der in Fig. 19 gezeigten Ausführungsform. Sie dient auch zum Berühren einer Kartusche 71 mit einer Platte 72 mittels eines Heizstempels 83 mit einer Kontaktfläche 84. Der Heizstempel 83 ist wiederum mit einem Heizmittel 85 und einem Temperatursensor 86 auf der Kontaktfläche 84 versehen. Der Heizstempel 83 ist auf einer Achse 87 angeordnet, die mit einem ersten Linearantrieb 88 verbunden ist, mit dem der Heizstempel mit der Platte 72 in Berührung gebracht werden kann und von dieser wegbewegt werden kann. An der Achse 87 ist ein Kühlstempel 89 beweglich angeordnet, der wiederum mit einem Linearantrieb 90 in Verbindung ist, so dass der Kühlstempel 89 mit dem Heizstempel 83 in Berührung gebracht werden kann. Am Kühlstempel 89 ist eine Kühleinheit 91 angeordnet, mit welcher der Kühlstempel 89 auf eine vorbestimmte Temperatur gekühlt und auf dieser Temperatur gehalten werden kann. Weiterhin ist auf der Achse 87 ein Zusatzheizstempel 92 in Axialrichtung beweglich angeordnet. Der Zusatzheizstempel 92 ist mit einem weiteren Linearantrieb 93 verbunden, so dass der Zusatzheizstempel 92 mit dem Heizstempel 83 in Berührung gebracht werden kann oder von diesem entfernt werden kann. Der Zusatzheizstempel 92 ist mit einem Heizmittel 94 versehen, wie z. B. einer Wicklung aus Heizdrähten, um auf eine vorbestimmte Temperatur geheizt zu werden.
Das Volumen und die Masse des Kühlstempels 89 bzw. des Zusatzheizstempels 92 sind größer als die des Heizstempels 83. Während einer Heiz- bzw. Kühlphase wird der Zusatzheizstempel 92 bzw. der Kühlstempel 89 mit dem Heizstempel 83 in Berührung gebracht, um so den Heizstempel 83 schnell auf eine vorbestimmte Temperatur zu heizen bzw. auf eine vorbestimmte Temperatur abzukühlen. Im Übrigen funktioniert diese kombinierte Heiz-/Kühleinrichtung 82 genauso wie die in Figur 19 gezeigt Heiz/-Kühleinrichtung 70. Diese beiden Heiz-/Kühleinrichtungen können noch mit einem Stößel (nicht dargestellt) versehen werden, der sich durch die Achsen 77 bzw. 87 erstreckt und die Platte 72, falls sie flexibel ausgebildet ist, beaufschlagen kann, um den Biochip gegen ein gegenüberliegendes Detektionsfenster (nicht dargestellt) zu drücken.
Diese beiden kombinierten Heiz-/Kühleinrichtung werden vorzugsweise mit einer Kartusche 71 verwendet, die eine starre Platte 72 aus einem gut wärmeleitenden Material aufweist, um eine schnelle Wärmeübertragung zwischen der Reaktionskammer und dem Heizstempel zu ermöglichen. Hierbei ist das der Platte 72 gegenüberliegende Detektionsfenster elastisch ausgebildet, wobei beim Lesen des Biochips die Detektionseinrichtung (nicht dargestellt) mit einer durchsichtigen Platte gegen das Detektionsfenster gedrückt wird, so dass dieses auf dem Biochip 6 aufliegt. Hierdurch wird Probenflüssigkeit zwischen dem Biochip 6 und dem Detektionsfenster verdrängt und die einzelnen Spots des Biochips können zuverlässig abgetastet werden. Ein solches Detektionsfenster kann aus einem transparenten, elastischen Kunststoffmaterial ausgebildet sein.
Bildaufnahme:
Nach durchgeführter temperaturgesteuerter biologischer Nachweisreaktion wird bei Verwendung der Kartusche mit Flex-Leiterplatte 10 die Flex-Leiterplatte durch Andrücken des Stößels 55 elastisch verformt, so dass der aufgeklebte Biochip an die Detektionsfläche drückt (Abb. 6). Um den Luftdruck im Ausgleichsraum 2 zu überwinden, muss eine Kraft F0 aufgewendet werden. Bei einer Fläche von ca. 0,5 cm2 benötigt man nur ca. 5 N um einen Druck von 1 bar aufzubauen. Zusätzlich muss noch eine bestimmte Kraft Fi aufgewendet werden, um die elastische Flex- Leiterplatte 10 mit aufgebrachten Biochip 6 mittels des Stößels 55 so zu verformen, dass der Biochip 6 gleichmäßig an die Detektionsfläche gedrückt wird. Die Summe der Kräfte F0 + F1 soll nicht über 30 N liegen.
Beim Stößeln wird die überstehende, Farbstoffmoleküle enthaltende Probenflüssigkeit, der Flüssigkeitsüberstand, zwischen Biochip und Detektionsfläche weggedrückt. Sie strömt durch den Ausgleichskanal 4 in den Ausgleichsraum 2. Eine Beleuchtungseinheit eines Optikmoduls (nicht dargestellt) regt nur noch die auf dem Biochip gebundenen Farbstoffmoleküle zur Fluoreszenz an. Die Beleuchtungs- und Detektionseinheit des Optikmoduls detektiert nach dem Stößeln nur das Fluoreszenzlicht der auf dem Biochip gebundenen Farbstoffmoleküle. Ein geeignetes Optikmodul ist in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP2007/054823 beschrieben, auf die hier Bezug genommen wird.
Ohne spezielle Blendenausführung im Optikmodul erfolgt die Ausleuchtung des Biochips im Reaktionsraum dabei kreisförmig. Es wird nicht nur der rechteckige Biochip 6 beleuchtet, sondern auch Bereiche 5.1 des Reaktionsraumes neben dem Biochip in denen eine farbstoff haltige Probenflüssigkeit 26 nicht verdrängt wurde (Fig. 9). Diese Bereiche fluoreszieren intensiv. Bei der optischen Abbildung des Biochips durch das Optikmodul auf einen Detektor erscheinen diese Bereiche zwar außerhalb des Biochips, aber infolge der hohen Farbstoffkonzentration der Probenflüssigkeit neben dem Biochip streut ein Teil des Fluoreszenzlichtes auch in Richtung Biochip und auf die Reaktionsfelder (Spots). Der Detektor detektiert neben der Fluoreszenzstrahlung der Spots durch die direkte Beleuchtung auch die indirekte Fluoreszenzstreustrahlung aus den Bereichen neben dem Biochip. Damit erhält das Bild der Spots auf dem Biochips eine lokale inhomogene, die Bildauswertung störende Untergrundbeleuchtung.
Mittels einer rechteckigen Blende 18, 19, die auf dem Grundkörper über der Reaktionskammer 5 aufgebracht, oder in diesen integriert ist und geometrische Abmessungen etwas kleiner als der Biochip (Fig. 7, 8) aufweist, wird die optische Fluoreszenzanregung des Farbstoffes im Reaktionsraum neben dem Biochip verhindert.
Diese Blende 18 kann beim Spritzguss eines transparenten Grundkörpers 1 als optisch absorbierende Blende (Fig. 8) oder beim Spritzguss eines nichttransparenten Grundkörpers als transparente optische Blende 19 bzw. Detektionsfenster 14 eingebracht werden (Fig. 7). Die Blende kann auch nachträglich auf das optische Beobachtungsfenster (Detektionsfläche) aufgebracht werden.
Die Transmission der Blendenschicht sollte kleiner als 10'2 sein.
Wiederholtes Durchführen der temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktionen
Im Gegensatz zu bekannten Vorrichtungen (z.B. DE 10 2004 022 263 A1 ), bei der die Probenflüssigkeit vor der Bildaufnahme durch den Stößelvorgang irreversibel aus einem Reaktionsraum verdrängt wird, besteht in der erfindungsgemäßen Kartusche 28 die Möglichkeit, nach erfolgter Bildaufnahme die temperaturgesteuerte biologische Nachweisreaktion weiterzuführen. Wird der Stößel 55 zurückgefahren, weicht die Flex-Leiterplatte 10 infolge des Überdrucks in der Reaktionskammer 5 und dem Ausgleichsraum 2 zurück und die Probenflüssigkeit aus dem Ausgleichsraum 2 fließt zurück in die Reaktionskammer 5, auch zwischen den Biochip 6 und das Deckglas. Damit kann auch nach erfolgter Detektion die temperaturgesteuerte biologische Nachweisreaktion fortgeführt werden.
Prinzipiell kann mit der erfindungsgemäßen Kartusche zu jedem Zeitpunkt der biologischen Reaktion eine Detektion der Spots auf dem Biochip vorgenommen werden.
Auslesen und Einschreiben von Daten:
Alle Informationen über die Kartusche, einschließlich Biochip, müssen vom Biochipreader ausgelesen werden. Zum Ansteuern exakter Temperaturen bei der Durchführung Fahren der temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktion werden die für eine bestimmte Flex-Leiterplatte spezifischen Kalibrierungsdaten des Heizers auf der Flex-Leiterplatte benötigt. Auch die Informationen über die auf den Biochip aufgebrachten Reaktionsfelder (Spots), ID-Nummem, Belichtungszeiten für die Bildaufnahme, usw., müssen vom Reader ausgelesen werden, um die temperaturgesteuerte biologische Reaktion zu steuern und eine Protokollierung und Archivierung zu ermöglichen.
Die notwendigen Informationen können als Dot-Code oder als Bar-Code auf die Kartusche aufgebracht werden. Zum Auslesen dieser Codes benötigt man einen Dot- Code-Reader (oder Bar-Code-Reader). Ein Speichern aktueller Daten ist damit nicht möglich.
Flexibler ist der Einsatz von beschreibbaren und auslesbaren manipulationssicheren Speichermedien 10.2 die vorteilhafterweise auf der Flex-Leiterplate integriert sind.
Neben der Kontaktflächen 10.1 der Heiz-/Messstruktur kann auch die Kontaktierung eines elektrisch programmierbaren nichtflüchtigen Speichers auf der Flex-LP erfolgen (Fig. 3). Damit können Informationen digital abgespeichert und zu jedem Zeitpunkt abgefragt werden. Die speicherbare Datenmenge ist dabei deutlich größer als bei aufgebrachten Bar- oder Dotcodes.
Bei einem kontaktierten elektrisch programmierbaren nichtflüchtigen Speicher können auch Informationen während der PCR oder beim Auslesen des Biochips gespeichert werden. Außerdem können die Daten manipulationssicher gespeichert werden. Nach einer erfolgten Prozessierung kann die Kartusche auch als „prozessiert" markiert werden um eine erneute, ungewollte Prozessierung zu verhindern.
Anhand von Figur 21 und 22 wird ein weiteres Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung und Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen mittels eines Biochips erläutert. Gleiche Teile sind mit gleichen Bezugszeichen wie in den oben beschriebenen Ausführungsbeispielen bezeichnet. Sie weisen auch die gleichen Merkmale und Eigenschaften auf, wie in den oben beschriebenen Ausführungsbeispielen, sofern nichts Gegenteiliges ausgeführt ist.
Auch dieses Ausführungsbeispiel weist einen Grundkörper 1 aus Kunststoff, insbesondere COC auf, der auf einer Leiterplatte 10 angeordnet ist. Die Leiterplatte 10 kann bei diesem Ausführungsbeispiel starr ausgebildet sein. Im Grundkörper 1 ist jedoch eine Aussparung für einen Befüllkanal 7, der von einer Befüllöffnung 9 zu einer Reaktionskammer 5 führt, und Aussparungen für die Reaktionskammer 5, einen Ausgleichskanal 4 zwischen der Reaktionskammer 5 und einem Ausgleichsraum 2 und eine Aussparung für einen Ausgleichsraum 2 vorgesehen.
Der Biochip 6 ist im Bereich einer Heiz-/Messstruktur 10.3 der Leiterplatte 10 mittels einer Haftverbindungsschicht 16 auf der Leiterplatte 10 befestigt. Der Biochip 6 ist innerhalb der Reaktionskammer 5 von einem Rahmen 95 vorzugsweise formschlüssig umgeben, dessen Oberseite mit der Oberseite des Biochips 6 fluchtet und mit dem Biochip eine ebene durchgehende Fläche bildet. Der Rahmen ist aus Kunststoff, insbesondere COC1 ausgebildet. Als Sichtfenster ist eine transparente Kunststofffolie 96 vorgesehen, die am Grundkörper 1 mit ihrem Rand aufgeklebt ist. Die Folie 96 überdeckt vollständig die Aussparung zur Ausbildung der Reaktionskammer 5 des Grundkörpers 1. Zwischen dem Rahmen und dem Grundkörper 1 ist ein schmaler Spalt 97 ausgebildet, in den der Befüllkanal 7 bzw. der Ausgleichskanal 4 mündet. Dieser Spalt 97 ist Bestandteil der Reaktionskammer 5, die sich auch zwischen dem Bereich der Oberfläche des Biochips 6 und der Kunststofffolie 96 erstreckt.
Im Ausgleichskanal kann ein weiteres Rückschlagventil 98 angeordnet sein. Dieses Rückschlagventil 98 ist vorzugsweise derart ausgebildet, dass es erst ab einem definierten Öffnungsdruck öffnet. Hierdurch wird beim Befüllen der Reaktionskammer mit Probenlösung erst Medium in den Ausgleichsraum 2 geleitet, wenn in dieser der Öffnungsdruck vorliegt. Ein definierter Öffnungsdruck des Rückschlagventils 98 erlaubt ein Agitieren der Probenlösung, ohne das Medium in den Ausgleichsraum gelangt, solange in der Reaktionskammer der Druck nicht größer als der Öffnungsdruck ist. Das Agitieren der Probenlösung hat den Vorteil, dass die Probenlösung zum einen gut durchmischt wird und zum anderen schnell eine gleichmäßige Wärmeverteilung erzielt wird.
Anstelle des Rückschlagventils 98 kann am Ausgleichskanal auch ein von außen steuerbares Ventil angeordnet sein. Dieses Ventil kann ein elektrisch ansteuerbares mikrofluidisches Ventil sein, das einen Bimetall- oder Magnetmechanismus zum Öffnen und Schließen aufweist. Solche Ventile können in den Ausgleichskanal integriert sein, ohne dass mechanische Steuerelemente nach außen zu führen sind, die bezügliche der Wandungen des Ausgleichskanals abzudichten wären. Es kann auch ein mechanisch betätigbares Ventil vorgesehen sein, das in einer z.B. sehr einfachen Ausgestaltung als elastischer Schlauch ausgebildet ist, der einen Abschnitt des Ausgleichkanals darstellt. Am Schlauch ist ein Stempel vorgesehen, der von einem Stellglied derart betätigbar ist, dass der Schlauch mittels des Stempels zusammengedrückt werden kann, so dass die Verbindung im Ausgleichskanal unterbrochen ist oder der Schlauch vom Stempel freigegeben wird, so dass eine durchgehende Verbindung vorhanden ist.
Ein von außen steuerbares Ventil hat den Vorteil, dass die Verbindung zum Ausgleichsraum gezielt geöffnet und geschlossen werden kann. Soll sichergestellt werden, dass eine transparente Kunststofffolie auf dem Biochip niedergehalten wird, so wird der Ausgleichskanal geschlossen, nachdem Medium in den Ausgleichsraum gedrängt worden ist. Das Medium kann hierdurch nicht mehr in die Reaktionskammer zurückweichen und die Folie kann sich daher nicht mehr vom Biochip abheben. Nach den optischen Messungen kann das Ventil wieder geöffnet werden, wodurch Medium zurück in die Reaktionskammer gelangen kann. Es können dann temperaturgesteuerte biologische Reaktionen erneut ausgeführt werden.
Auf der Oberseite des Grundkörpers 1 ist eine Walze 99 vorgesehen, die mit einem vorbestimmten Druck auf dem Grundkörper 1 aufliegt wo mittels einer Betätigungseinrichtung (nicht dargestellt) automatisch entlang der Oberfläche des Grundkörpers abgerollt werden kann, wobei der Bereich der Reaktionskammer 5 überfahren werden kann.
Beim Befüllen dieser Vorrichtung sammelt sich die Probenlösung zunächst in der Reaktionskammer 5 im Bereich zwischen dem Biochip 6 und der Folie 96 an, wobei Luft in den Ausgleichsraum 2 verdrängt wird und sich hierdurch ein vorbestimmter Druck aufbaut. Mit der sich in der Reaktionskammer befindlichen Probenlösung können in gleicher Weise wie bei den oben erläuterten Ausführungsbeispielen temperaturgesteuerte biologische Reaktionen ausgeführt werden. Nach dem Durchführen dieser Reaktionen wird die Walze über die Reaktionskammer 5 hinweggerollt, wobei sie über die Reaktionskammer 5 von der Seite der Befüllöffnung 9 in Richtung zum Ausgleichsraum 2 bewegt wird. Hierdurch wird die in der Reaktionskammer 5 befindliche Probenlösung in Richtung zum Ausgleichsraum 2 gedrängt. Durch das Rückschlagventil 98 im Ausgleichskanal 4 wird sichergestellt, dass kein Medium zurück in die Reaktionskammer 5 gelangt. Hierdurch wird sichergestellt, dass die durch das Walzen auf die Oberfläche des Biochips 6 gedrückte Folie 96 sich nicht mehr vom Biochip 6 abhebt.
Da die Folie 96 transparent ist, können die optischen Messungen am Biochip 6 mittels eines geeigneten Optikmoduls durchgeführt werden. Die transparente Kunststofffolie 96 ist vorzugsweise auf der zum Biochip 6 weisenden Seite mit einer Adhäsions- oder Klebeschicht versehen, so dass die Folie nach dem Andrücken auf dem Biochip auf diesem haftet. Diese Adhäsions- oder Klebeschicht kann derart ausgebildet sein, dass sie erst aktiviert wird, wenn sie einen vorbestimmten Zeitraum mit einer Probenlösung in Kontakt ist, um eine unbeabsichtigtes Anhaften vor Benutzung der Kartusche zu vermeiden. Die Adhäsions- oder Klebeschicht ist vorzugsweise in dem Bereich angeordnet, der den aktiven Bereich des Biochips umgibt, so dass keine Klebeverbindung im Bereich der Spots des Biochips zwischen dem Biochip 6 und der Kunststofffolie 96 ausgebildet wird. Vorzugsweise sind mechanische Abstandshalter außerhalb des Bereiches zwischen der Folie 96 und dem Biochip 6 bzw. dem Rahmen 95 angeordnet, in dem die Folie auf den Biochip gedrückt werden soll. Hierdurch wird ein unbeabsichtigtes Drücken der Folie gegen den Biochip vermieden und sichergestellt, dass die Folie erst gezielt mittels einer Niederhalteeinrichtung (Walze, Rakel, Platte) gegen den Biochip gedrückt wird, wenn die temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen abgeschlossen sind.
Der Vorteil dieser Anordnung gegenüber den obigen Ausführungsbeispielen ist, dass der empfindliche Biochip 6 selbst nicht bewegt werden muss. Es wird lediglich die Folie 96 auf die Oberfläche des Biochips 6 angeschmiegt.
Bei den oben erläuterten Ausführungsbeispielen wird bei der Bildaufnahme die Probenlösung vollständig zwischen dem Biochip und der Detektionsfläche bzw. dem Fenster verdrängt. Bei der Ausführungsform mit Kunststofffolie und einer Niederhalteeinrichtung, die lediglich linienförmig die Kunststofffolie gegen den Biochip drückt, wie z. B. eine Walze oder eine Rakel, ist es nicht notwendig, die vollständige Probenlösung zwischen der Kunststofffolie und dem Biochip zu verdrängen. Bei einer solchen Ausführungsform kann gleichzeitig während des Bewegens der Niederhalteeinrichtung auf der Kunstofffolie eine zeilenförmige Aufnahme des Biochips erstellt werden. Hierbei wird der Biochip entweder in Bewegungsrichtung unmittelbar vor oder unmittelbar nach der Niederhalteeinrichtung mit beispielsweise einer Zeilenkamera detektiert oder falls die Niederhalteeinrichtung transparent ausgebildet ist, durch die Niederhalteeinrichtung hindurch mit einer Zeilenkamera detektiert. Die einzelnen Zeilenbilder werden zu einem zweidimensionalen Bild zusammengesetzt. Hierzu sind in der optischen Bildverarbeitung unterschiedliche Verfahren bekannt (z.B. Stitching). Diese Aufnahme während der Bewegung der Niederhalteeinrichtung („on the fly") hat den Vorteil, dass die Probenlösung lediglich lokal entlang einer Linie zwischen der Kunststofffolie und dem Biochip verdrängt wird, so dass während der Abtastung die vollständige Probenlösung in der Reaktionskammer verbleiben kann. Ein Ausgleichsraum ist hier nicht notwendig.
Vorzugsweise ist das Rückschlagventil 98 von außen entriegelbar ausgebildet, so dass nach dem Durchführen der optischen Messungen die Probenlösung wieder zurück in die Reaktionskammer 5 gelangen kann und weitere biologische Reaktionen durchgeführt werden können.
Diese Ausführungsform mit transparenter Kunststofffolie kann selbstverständlich auch mit einem Sichtfenster im Ausgleichskanal 4 zur Detektion des Füllstandes versehen sein.
Bei einer weiteren Abwandlung dieser Anordnung ist das Volumen des Ausgleichraums 2 von außen veränderlich ausgebildet. Dies kann beispielsweise durch Vorsehen einer elastischen Membran als eine Wandung des Ausgleichraums 2 realisiert sein. Diese Wandung kann dann von außen bewegt und der Ausgleichsraum 2 aufgezogen werden. Hierdurch entsteht eine Saugwirkung mit welcher die Probenlösung aus der Reaktionskammer 5 abgesaugt werden kann und sich die Folie 96 auf die Oberfläche des Biochips 6 legt. Bei dieser Ausführungsform kann die Walze 99 entfallen.
Es kann auch zweckmäßig sein, die Folie 96 im unmittelbaren Arbeitsbereich über dem Biochip 6 etwas dicker und steifer auszubilden, so dass verhindert wird, dass lokale Flüssigkeitsblasen zwischen dem Biochip 6 und der Folie 96 verbleiben.
Die Erfindung ist oben anhand von Ausführungsbeispielen erläutert worden, bei welchen zumindest eine Wandung der Reaktionskammer aus einer flexiblen Membran ausgebildet ist. Vorzugsweise ist die Membran aus einem elastischen Material ausgebildet, das durch eine entsprechende Betätigungseinrichtung (Stößel, Walze, Rakel, Platte) elastisch verformt werden kann.
Die Erfindung lässt sich folgendermaßen kurz zusammenfassen:
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung und Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen. Sie umfasst: - Eine Reaktionskammer 5 zur Aufnahme eines Biochips 6. Die
Reaktionskammer weist zumindest ein transparentes Fenster 14 auf, damit Anregungslicht von außen auf den Biochip 6 gestrahlt werden kann und Fluoressenzlicht vom Biochip nach außen zu einer Messeinrichtung abgestrahlt werden kann. - Eine Membran, die zumindest eine Wandung der Reaktionskammer bildet und flexibel ausgebildet ist, so dass das Fenster und der Biochip aneinander drückbar sind, um dazwischen befindliche Probenlösung zu verdrängen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zeichnet sich dadurch aus, dass die Reaktionskammer kommunizierend mit einem Ausgleichsraum verbunden ist.
Hierdurch werden in der Reaktionskammer vorbestimmte Druckverhältnisse geschaffen, die zum einen das Verdrängen der Probenlösung vereinfachen und zum anderen die Blasenbildung in der Probenlösung bei hohen Temperaturen verhindern.
Bezugszeichenliste
1 Grundkörper
1.1 transparenter Grundkörper
1.2 nichttransparenter Grundkörper
2 Ausgleichsraum
3 Sichtfenster
4 Ausgleichskanal
5 Reaktionskammer
5.1 ausgeleuchtete Fläche
6 Biochip
6.1 Reaktionsfelder (Spots)
6.2 Rückbeschichtung
7 Befüllkanal
8 Rückschlagventil
9 Befüllöffnung
10 Flex-LP
10.1 Kontaktflächen Flex-LP
10.2 Speichermedium
10.3 Heiz-/Messstruktur Flex-LP
11 Inlay
12 Stößel
13 Membran
14 Detektionsfenster
15
16 Haftverbindungsschicht
17 Trägerschicht
18 Blende (nichtransparent)
19 Einfüllkanüle
20 Druckausgleichskanüle
21 Temperaturhomogenisierungsschicht
22 Dichtung
23 Deckglas
24 Stabilisierungsscheibe
25 Kartuschengrundkörper
26 Probenflüssigkeit
27 Optikmodul
28 Kartusche
28.1 obere Hälfte des Kartuschengehäuses 28.2 untere Hälfte des Kartuschengehäuses
29 .l CN1 Aussparung in 28.1
29 Aussparung in 28.2
30 .1 Leiterbahn (Heizstrom)
30 .2 Leiterbahn (Heizstrom)
31 .1 Leiterbahn (Messstrom)
31 .2 Leiterbahn (Messstrom)
32 Leiterbahn
33 Kontaktstelle
34 Kontaktstelle
35 Strommesswiderstand
36 Stromquelle
37 Messkanal
38 Messkanal
39 Impedanzwandler
40 Operationsverstärker
41 Anti-Aliasing-Filter
42 A/D-Wandler
43 Steuereinrichtung
44 Leitung
50 Kühleinrichtung
51 Kühlstempel
52 Kühleinheit
53 Linearantrieb
54 Kühlfläche
55 Stößel
56 Kühlelement
57 Lüfter
58 Kühlkörper
59 Buchse
60 Endkörper
61 Feder
62 Kunststoff ring
63 Linearantrieb
64 Feder
65 Linearantrieb
66 Feder
70 Heiz-/Kühleinrichtung
71 Kartusche 72 Platte
73 Heizstempel
74 Kontaktfläche
75 Heizmittel
76 Temperatursensor
77 Achse
78 Linearantrieb
79 Kühlstempel
80 Linearantrieb
81 Kühleinheit
82 Heiz-/Kühleinrichtung
83 Heizstempel
84 Kontaktfläche
85 Heizmittel
86 Temperatursensor
87 Achse
88 Linearantrieb
89 Kühlstempel
90 Linearantrieb
91 Kühleinheit
92 Zusatzheizstempel
93 Linearantrieb
94 Heizmittel
95 Rahmen
96 Folie
97 Spalt
98 Rückschlagventil
99 Walze

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur Durchführung und Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen, umfassend eine Reaktionskammer (5) zur Aufnahme eines Biochips (6), wobei die Reaktionskammer (5) zumindest ein transparentes Fenster (14) aufweist, damit Anregungslicht von außen auf den Biochip (6) gestrahlt werden kann und Fluoreszenzlicht vom Biochip (6) nach außen zu einer Messeinrichtung abgestrahlt werden kann, und zumindest eine Wandung der Reaktionskammer (5) als flexibleolastischo Membran (10) derart ausgebildet ist, dass das Fenster (14) und der Biochip (6) aneinander drückbar sind, so dass eine dazwischen befindliche Probenlösung verdrängt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskammer (5) kommunizierend mit einem Ausgleichsraum (2) verbunden ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Ausgleichsraum (2) lediglich eine einzige Öffnung aufweist, die kommunizierend mit der Reaktionskammer (5) verbunden ist und im Übrigen vollständig gegenüber der Umgebung abgedichtet ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskammer (5) und der Ausgleichsraum (2) über einen Ausgleichskanal (4) verbunden sind, der vorzugsweise langgestreckt mit kleinem Querschnitt ausgebildet ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Ausgleichskanal (4) ein Sichtfenster (3) angeordnet ist, wobei im Bereich des Sichtfensters der Ausgleichskanal (4) vorzugsweise etwas aufgeweitet ist.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen des Ausgleichsraums (2) etwa dem Volumen der Reaktionskammer (5) entspricht.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen des Ausgleichsraums (2) größer als das Volumen der Reaktionskammer (5) ist.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen des Ausgleichraums (2) kleiner als das Volumen der Reaktionskammer (5) ist.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die elastische Membran eine flexible Leiterplatte (10) ist.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die elastische Membran eine transparente Folie ist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die transparente Folie im Bereich des Biochips zu einem plattenförmigen, im wesentlichen steifen Sichtfenster ausgebildet ist.
11. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die transparente Folie (96) mit an ihrer zum Biochip weisenden Seite mit einer Adhäsions- oder Klebeschicht versehen ist.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass im Ausgleichskanal (4) ein Rückschlagventil (98) angeordnet ist, das einen Medienfluss nur in Richtung zum Ausgleichsraum erlaubt.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Rückschlagventil (98) von außen derart entriegelbar ist, dass Probenlösung aus dem Ausgleichsraum (2) zurück in die Reaktionskammer (5) fließen kann.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass im Ausgleichskanal (4) ein von außen steuerbares Ventil angeordnet ist, mit welchem der Mediumfluß zwischen der Reaktionskammer (5) und dem Ausgleichsraum (2) gezielt absperrbar ist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass ein Betätigungselement, wie z.B. ein Stößel (12), eine Walze (99), ein Rakel oder eine Platte vorgesehen ist, mit welchem die Membran mit einer vorbestimmten Kraft beaufschlagt werden kann.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Betätigungselement transparent ausgebildet ist, so dass eine optische Abtastung durch das Betätigungselement hindurch ausführbar ist.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen des Ausgleichsraums (2) derart von außen veränderlich ist, dass der Ausgleichsraum (2) durch Aufweiten seines Volumens zum Ansaugen der Probenlösung aus der Reaktionskammer (5) verwendet werden kann.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein zur Reaktionskammer (5) führender Befüllkanal (7) vorgesehen ist, in dem ein Rückschlagventil (8) angeordnet ist.
19. Verfahren zur Durchführung und Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionenτ in einer Reaktionskammer (5) zur Aufnahme eines Biochips (6), wobei eine Wandung der Reaktionskammer (5) aus einer transparenten Folie ausgebildet ist, durch die Anregungslicht von außen auf den Biochip (6) gestrahlt werden kann und Fluoressenzlicht vom Biochip (6) nach außen zu einer Messeinrichtung abgestrahlt werden kann, und einer linienförmigen Niederhalteeinrichtung vorgesehen ist, die entlang der Folie verfahrbar ist, um die Folie gegen den Biochip zu drücken, dadurch gekennzeichnet, dass während die Niederhalteeinrichtung die Kunstofffolie linienförmig gegen den Biochip drückt der Biochip zeilenförmig entweder in Bewegungsrichtung unmittelbar vor oder nach der Niederhalteeinrichtung oder durch die Niederhalteeinrichtung hindurch abgetastet wird, und nach mehreren zeilenförmigen Abtastungen die hierbei erzeugten zeilenförmigen Bilder zu einem zweidimensionalen Bild zusammengesetzt werden.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Niederhalteeinrichtung transparent ausgebildet ist.
21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Niederhalteeinrichtung eine Walze oder eine Rakel ist.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21 dadurch gekennzeichnet, dass eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18 verwendet wird.
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