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WO2008047947A1 - Method for determining effect of cisplatin administration and kit for determining effect of cisplatin administration - Google Patents

Method for determining effect of cisplatin administration and kit for determining effect of cisplatin administration Download PDF

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WO2008047947A1
WO2008047947A1 PCT/JP2007/070864 JP2007070864W WO2008047947A1 WO 2008047947 A1 WO2008047947 A1 WO 2008047947A1 JP 2007070864 W JP2007070864 W JP 2007070864W WO 2008047947 A1 WO2008047947 A1 WO 2008047947A1
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WO
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gene
cisplatin
effect
expression
genes
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Hideki Tanzawa
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KOSHIN CO Ltd
Chiba University NUC
Original Assignee
KOSHIN CO Ltd
Chiba University NUC
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    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the administration effect of cisplatin used as an anticancer agent and a kit for determining the effect of cisplatin administration.
  • Cisplatin (abbreviated as “CDDP”) is the central agent of anticancer drugs and chemotherapy in all types of cancer.
  • CDDP Cisplatin
  • Non-Patent Literature 1 Bordow SB, Haber M, Madafiglio J, Cheung B, Marshall GM,
  • Non-Patent Document 2 Gottesman MM, Pastan I, Ambudkar SV. Curr Opin Genet Dev.
  • Non-Patent Document 3 Loe D. W., Deeley R. G., Cole S. P. Eur. J. Cancer, 32A: 945-957, 1996.
  • Non-Patent Document 4 Jin S, Scotto KW. Mol Cell Biol. Jul; 18 (7): 4377-4384. 1998
  • Non-Patent Document 5 Perez RP. Eur J Cancer. Sep; 34 (10): 1535-1542. 1998
  • Non Patent Document 6 Hinoshita E, Uchiumi T, Taguchi K, Kinukawa N, Tsuneyoshi
  • the present inventors have aimed to provide a method for determining the effect of cisplatin administration and a kit for determining the effect of cisplatin administration, which can determine the presence or absence of the therapeutic effect of cisplatin administration.
  • the present inventor has identified a gene group exhibiting resistance to or sensitivity to cisplatin by using a cell line exhibiting extremely excellent resistance to cisplatin, and has completed the present invention. .
  • the present invention includes the following.
  • PDE3B phosphodiesterase 3B gene
  • PDGFC piatelet derived growth factor C
  • PKD2 Polycystic kidney disease-2 gene
  • NRG1 neutral receptor l gene
  • step a the amount of mRNA of the gene is measured, and the method for determining the effect of cisplatin administration according to (1).
  • step a the amount of protein that is a product of the gene is measured.
  • the method for determining the effect of cisplatin administration according to (1) is further increased.
  • the method for determining the cisplatin administration effect according to (1) is further increased.
  • kits for determining the efficacy of cisbratin administration comprising a means for measuring the expression of at least one gene.
  • kit for determining cisplatin administration effect according to (5), wherein the means is a polynucleotide that specifically hybridizes to mRNA of the gene or cDNA derived from the mRNA.
  • FIG. 1 is a characteristic diagram showing the results of MTT assay in Sa-3 and Sa-3R strains as representative examples of resistant strains established in the Examples.
  • Fig. 2 shows the expression of ABC transporters (MDR1, MRP1, and MRP2) in Sa-3 and Sa-3R strains as a representative example of resistant strains established in the Examples by RT-PCR. It is a characteristic view which shows the result.
  • FIG. 3 is a Venn diagram showing the number of genes that specifically enhance expression and decrease in expression in resistant strains identified as a result of microarray analysis using the resistant strain and its parent strain established in the Examples.
  • Fig. 4 is a characteristic diagram showing the four networks obtained as a result of a Pausley analysis of 199 genes identified as genes related to cisplatin resistance.
  • FIG. 5 is a characteristic diagram (A) showing the results of RT-PCR performed on the lumican gene as a representative example of the five genes identified in the Examples (A) and a photograph (B) showing the results of Western blotting.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of immunohistological staining of a clinical sample for the lumican gene as a representative example of the five genes identified in the examples.
  • FIG. 7 is a characteristic diagram showing the result of obtaining the IHC score distribution for the PDE3E gene.
  • Fig. 8 is a characteristic diagram showing the results of IHC score distribution for the lumican gene.
  • FIG. 9 is a characteristic diagram showing the result of obtaining the distribution of IHC scores for the PDGFC gene.
  • FIG. 10 is a characteristic diagram showing the results of obtaining the IHC score distribution for the PKD2 gene.
  • Fig. 11 is a characteristic diagram showing the results of obtaining the IHC score distribution for the NRG1 gene.
  • This method for determining the effect of cisplatin administration is obtained as a result of the step a in which the expression of at least one or more genes selected from the following five genes is measured in a biological sample collected from a subject to be diagnosed. Based on the gene expression level And b determining the effect of administering bratin.
  • PDE3B phosphodiesterase 3B gene (SEQ ID NO: 1)
  • PDGFC platelet derived growth factor C gene (distributed IJ number 3)
  • PKD2 Polycystic kidney disease-2 gene
  • NRG1 (neuregulin l) gene (SEQ ID NO: 7)
  • LUM (Lumican) gene (SEQ ID NO: 9)
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the PDE3B gene is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the PDGFC gene is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the PKD2 gene is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the NRG1 gene is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the LUM gene is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the “No.” column shows the number assigned to each gene
  • the “Comraon” column shows the names of common genes.
  • the column “Genbank” is the registration number of the gene in the database provided by Genbank
  • the column “Systematic” indicates the strain name of the gene
  • the column “Map” is the position of the gene on the chromosome. Shows
  • the “Description” column is a description of the gene or a description of the protein that is the product of the gene.
  • the genes listed in Table 1 are composed of genes identified as a result of microarray analysis using cisplatin-resistant and cisplatin-sensitive strains, which will be described in detail later.
  • the cisplatin-resistant strain is a cell line established from an oral squamous cell carcinoma-derived cell line or an oropharyngeal squamous cell carcinoma-derived cell line using cisplatin resistance as an index, and a cell line of a patient that does not respond to cisplatin administration It has a meaning as a model.
  • the cis-bratin sensitive strain means the oral squamous cell carcinoma-derived cell line or the oropharyngeal squamous cell carcinoma-derived cell line itself, which is the parent strain of the cis-bratin resistant strain.
  • the genes listed in Table 1 are composed of genes that are specifically enhanced in expression and genes that are specifically attenuated in cisplatin resistant strains.
  • the genes whose expression was specifically enhanced in the cisplatin resistant strains are Nos. 1 to 164, and the genes whose expression was specifically attenuated in the cisplatin resistant strains are Nos. 165 to 199.
  • 51 gene groups form four networks, and these four networks form a large network.
  • the determination target person is not particularly limited, and may be any of a patient suffering from various cancers, a person suspected of various cancers, and a healthy person.
  • the cisplatin administration effect determination method according to the present invention is not performed directly on the determination target person, but is performed using a biological sample collected from the diagnosis target person.
  • the biological sample is determined Although it will not specifically limit if gene expression analysis in a subject is possible, the protein extract derived from a tissue, a cell, a bodily fluid, urine, and other biological samples can be mentioned.
  • body fluid means blood, lymph fluid, tissue fluid (tissue fluid, intercellular fluid, interstitial fluid), body cavity fluid, serous cavity fluid, pleural effusion, ascites, pericardial fluid, cerebrospinal fluid (spinal fluid), joint fluid ( Synovial fluid), eye aqueous humor (aqueous humor), digestive fluid, knee fluid, intestinal fluid, semen and amniotic fluid.
  • the biological sample may be one or a plurality of protein extracts derived from tissues, cells, body fluids, urine, and other biological samples.
  • the tissue includes a part of the tissue obtained at the time of surgery performed for the treatment of cancer-affected patients, a part of the tissue collected by biopsy etc. from a diagnosis subject suspected of cancer, a patient with cancer This means that it includes a part of the tissue collected by biopsy for the purpose of distinguishing between primary and metastatic.
  • a cell in the cisplatin administration effect determination method according to the present invention a cell isolated from each of the above tissues can be used.
  • the body fluid plasma or serum separated from the blood, urine, lymph fluid, cerebrospinal fluid or ascites can be used.
  • cells or protein extracts isolated from sputum or the like can be used as other organism-derived samples.
  • the amount of mRNA for the gene to be measured is measured or the amount of protein that is the product of the gene to be measured is measured. Just measure.
  • a known method for detecting the expression of a gene can be used.
  • the Northern plotting method can be used to detect the mRNA level of the gene to be measured.
  • a polynucleotide having a DNA sequence that hybridizes under stringent conditions to the gene to be measured can be used as a probe. In order to detect the amount of mRNA of the gene to be measured using the probe, it can be appropriately performed using a known method.
  • a label such as a fluorescent label is appropriately added to the probe, and this is hyper-hydidized with mRNA (or cDNA synthesized from mRNA) isolated from a biological sample collected from the subject. To do. afterwards, By measuring the fluorescence intensity derived from the hyper-prised probe, the mRNA level of the gene to be measured can be detected.
  • the probe can be used by being immobilized on a support such as a glass bead or a glass substrate. That is, it can also be used in the form of a microarray or DNA chip in which probes prepared for a gene to be measured (a plurality of genes) are immobilized on a support.
  • hybridizes under stringent conditions means, for example, 1 XSSC (0.15 MN a Cl, 0.015 M sodium taenoate), 0.1 at 42 ° C. This means that the hybridization is maintained even by washing at 42 ° C with a buffer containing% SDS (Sodium dodecyl sulfate).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • a known protein detection method can be used as a method for measuring the amount of protein that is the product of the gene to be measured. Specifically, various methods using an antibody against the protein to be measured can be applied.
  • the antibody is not particularly limited, and a mouse antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, a Hedge antibody, etc. can be used as appropriate.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferable in that a homogeneous antibody can be stably produced.
  • Polyclonal antibodies and monoclonal antibodies can be prepared by methods well known to those skilled in the art.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody can be basically produced using a known technique as follows. That is, a desired antigen or a cell that expresses the desired antigen is used as a sensitizing antigen, and this is immunized according to a normal immunization method. It can be prepared by fusing and screening for monoclonal antibody-producing cells (hypridoma) by conventional screening methods. Hybridomas can be produced, for example, by the method of Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) etc.
  • the product of the gene described above can be used as an antigen
  • a cell expressing a fragment of the product of the gene described above can be used as an antigen.
  • proteins or fragments of the protein are described in, for example, Molecuar Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition 1st-3rd Sambrook, J. et al., Cold Spring Harber Laboratory Press publication New York 1989. According to the method, those skilled in the art can easily obtain it. Cells expressing these proteins or fragments of the proteins were also described in Molecuar Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1st 1-3 brook Sambrook, j., Cold Spring Harber Laboratory Press, published in New York, 1989. According to the method, it can be easily obtained by those skilled in the art.
  • the resulting monoclonal antibodies can be used for the quantification of proteins to be measured, such as the enzyme enzyme assay (ELISA), enzyme immunodot assay, radioimmunoassay, aggregation based assay, or other well-known methods. It can be used as a test reagent by the existing immunoassay method.
  • the monoclonal antibody is preferably labeled.
  • the labeling compound include enzymes, fluorescent substances, chemiluminescent substances, radioactive substances, and staining substances known in the art.
  • the above-described PDE3B (phosphodiesterase 3B) gene, PDGFC (platelet derived growth factor C) fe, PKD2 (Polycystic kidney disease-2 gene) gene, NRG1 (neuregulin 1) gene and LUM (Lumican) gene are selected.
  • the method for determining the effect of cisbratin administration according to the present invention is not limited to these five genes, and the genes listed in Table 1 Other genes selected from the group may be added as measurement targets.
  • a measurement target gene in addition to the five genes described above, it is more preferable to select another gene selected from the gene group listed in Table 2.
  • the presence or absence of the effect of cisbra and tin administration is determined based on the expression level.
  • the expression level of the gene is evaluated.
  • the expression level may be evaluated by setting a reference value for each gene to be measured and comparing it with this reference value.
  • a relative value with respect to the expression level of the constitutively expressed gene can be set.
  • the expression level of the gene to be measured may be evaluated using an immunohistochemical staining (IHC) score as described above, and a value that can evaluate false positive and false negative may be evaluated as a reference value.
  • IHC immunohistochemical staining
  • the determination method and determination kit for cisplatin administration effect it is possible to determine the presence or the degree of the effect of cisplatin administration for a determination target person with very high accuracy and / or excellent specificity. Can do.
  • the sensitivity means a positive rate in a patient group who succeeds in cisplatin administration.
  • Specificity means the negative rate in the group of patients who are not successful with cisplatin.
  • diagnosis is performed with higher sensitivity and / or higher specificity by increasing the types of genes to be measured (for example, 6 or more genes). be able to.
  • the effect of cisplatin administration can be confirmed by gene expression analysis (mRNA level or protein level) using a biological sample collected from an anticancer agent / cancer patient before starting chemotherapy. Because it can be judged more objectively and specifically, it can prevent the administration of cisbratin, which is an excessive burden on patients who cannot expect the administration effect, and is useful for effective treatment policy for the patient. Knowledge can be provided.
  • a cisbratin resistant strain was established. Specifically, for oral squamous cell carcinoma-derived cell lines (H-1 and Sa-3 strains) provided by the Department of Dentistry and Oral Surgery, Wakayama Medical University School of Medicine, cisplatin (hereinafter sometimes referred to as CDDP) By continuously contacting the CDDP stepwise from a low concentration of 0.1 fg / ml. Thus, a cell line having resistance to cisbratin was established.
  • the cisplatin resistant strain established from the H-1 strain was named H-1R strain
  • the cisplatin resistant strain established from the Sa-3 strain was named Sa-3R strain.
  • CDP treatment was similarly applied to a cell line derived from squamous cell carcinoma of the oropharynx (KB strain) to establish a cisbratin resistant strain.
  • the cisbratin resistant strain established from KB strain was named KBR strain.
  • H-1R strain, Sa-3 strain and KBR strain For these cisplatin resistant strains (H-1R strain, Sa-3 strain and KBR strain), the relative resistance to each parental strain sensitive to cisplatin was examined. Specifically, each resistant strain and each parent strain were treated with CDDP (the concentration of CDDP was 0.05 to: LO g / ml), and then MTT assay was performed. The 50% survival (death) concentration (IC50) was determined for each resistant strain and each parental strain. The relative resistance of H-1 and H-1R strains is about 10 times, the relative resistance of Sa-3 and Sa-3R strains is about 7.5 times, relative to KB and KBR strains Resistance was 8.6 times. These three cell lines did not change their resistance even when they were freeze-thawed or cultured for one month without CDDP.
  • Figure 1 shows the results of MTT assembly for Sa-3 and Sa-3R strains as representative examples.
  • the profile file similar to the profile shown in Fig. ⁇ was shown for other resistant strains and their parent strains.
  • the size of the resistant strain is slightly larger than that of the parent strain, the basic shape, growth rate, and colony forming ability were not significantly changed in the resistant strain and the parent strain. The same properties were maintained.
  • FIG. 2 shows RT-PCR results for Sa-3 and Sa-3R strains as representative examples. From this result, it became clear that each resistant strain established in this example is a cell line genetically resistant to CDP. In the previous reports related to CDDP resistance, the resistance of the resistant strain was about twice, and it was a cell line that possessed only low tolerance that could be regarded as an experimental error range. The resistant strains established in this example had higher drug resistance than the previous cell lines and were considered very useful for analysis.
  • genes that are specifically enhanced in the resistant strain and genes that are specifically attenuated in the resistant strain are identified. Identified. Specifically, for microarray analysis, Affymetrix U133 Plus 2.0 with 54675 probes immobilized was used as the microarray. For microarray analysis, GeneChip Operating Software 1.1 (Affymetrix) and GeneSpring 6.1 (Silicon Genetics) were used as analysis software.
  • the gene group in which the expression of the resistant strain Sa-3R was observed to be 1.5 times higher than that of its parent strain Sa-3, and the parent strain H- We identified a gene group in which expression of 1.5 times or more was observed compared to 1 strain and a gene group in which expression of resistant strain KBR strain was observed to be 1.5 times or more compared to its parental KB strain.
  • a gene group common to these three groups was identified as a gene group (16 4 genes) whose expression was specifically enhanced in cis-bratin resistant strains (see Fig. 3).
  • the gene group in which expression of 5 times or less was observed and the gene group in which the expression of resistant strain KBR was observed 1.5 times or less compared to its parent KB strain were identified.
  • a gene group common to these three groups was identified as a gene group (35 genes) whose expression was specifically attenuated in cisbratin-resistant strains (see Fig. 3).
  • a total of 199 genes could be identified as genes related to cisbratin resistance in cancer cells.
  • GNB1 GNG10
  • GRB2 H2-KA
  • INSR Interaction
  • MAP1B MAP1B, MMP2, MMP9, MMP13, NR3C1 Cellular Movement
  • PAK2 PAK2, PIP5K1B, PLEC1, PRKCA,
  • AKT2, BACH1, BARD1, BRCA1, CEBTPB AKT2, BACH1, BARD1, BRCA1, CEBTPB:
  • HBA1, HBA2, HBB, HAD, HBE1, HBG1 Connective Tissue
  • candidate genes capable of predicting the success rate of anticancer agents by clinical specimens were searched from these 50 genes as a retrospective test.
  • 5 genes PDE3B, PDGFC, PKD2, NRGl and Lumican
  • Anti-human PDE3B goat polyclonal antibody (Santa Cruz) as an antibody against PDE3B, Anti-human PDGFC goat polyclonal antibody (Santa Cruz) as an antibody against PDGFC, Anti-human PKD2 Usagi polyclonal as an antibody against PD2
  • An antibody manufactured by ABGENT
  • an anti-human PKD2 Usagi polyclonal antibody (manufactured by Santa Cruz) as an antibody against NRG1
  • an anti-human Lumican goat polyclonal antibody (manufactured by Santa Cruz) as an antibody against Lumican were prepared. It was confirmed by Western blotting using the prepared antibody that the expression of these genes was enhanced in the resistant strain at the protein level.
  • FIGS. 5 (A) and (B) The results of RT-PCR and Western plotting performed on the lumican gene among the five genes described above are shown as representative examples in FIGS. 5 (A) and (B). As shown in Fig. 5 (A) and (B), it can be seen that the lumican gene is specifically expressed in the resistant strain compared to the parent strain. Similar results were obtained for other genes except the Lumican gene. ,
  • the IHC score was used for the evaluation of staining in the immunohistological staining method.
  • the IHC score is observed with an objective lens of 40 times, and the percentage of positive cells out of the total number of cells in one field and the intensity of staining (for example, 3 levels (weak, medium and strong) are evaluated. 1-3 Is the sum of the numbers multiplied by. This is done with 10 randomly selected visual fields, and the IHC score is calculated as the average value.
  • the IHC score is a method of judging the degree of staining that is generally used at present as an excellent score indicating staining intensity and staining range.
  • Figure 6 shows a representative example of the results of immunohistological staining of clinical samples for the luraican gene. Increased expression of lumi can protein was confirmed in clinical specimens resistant to cisplatin.
  • IHC scores were obtained using 10 NC cases, 22 PR cases, and 16 CR cases for cisplatin administration, and the distribution of IHC scores was obtained for each of the five genes described above.
  • Figure 7 shows the result of the IHC score distribution for the PDE3E gene
  • Figure 8 shows the result of the IHC score distribution for the lumican gene
  • Figure 9 shows the result of the IHC score distribution for the PDGFC gene.
  • the results of obtaining the IHC score distribution for the PKD2 gene are shown in FIG. 10
  • the results of obtaining the IHC score distribution for the NRG1 gene are shown in FIG.
  • Table 5 summarizes the presence or absence of the expression and treatment effect assessment for the above five genes.
  • “10” indicates that the expression at the protein level was positive for each gene, and “one” indicates that the expression at the protein level was negative for each gene.
  • the presence or absence of a response due to administration of cisplatin can be determined with very good accuracy. Therefore, the method for determining the cisplatin administration effect and the kit for determining the cisplatin administration effect according to the present invention can determine whether or not a treatment including cisplatin administration is applied to the subject patient.

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Description

シスブラチン投与効果判定方法及びシスブラチン投与効果判定キット 技術分野
本発明は、 抗癌剤として使用されているシスブラチンの投与効果を判断する方 法及びシスブラチン投与効果判定キットに関する。
明
背景技術
シスプラチン （cisplatin、 "CDDP" と略称書される） は、 全ての種類の癌におい て抗癌剤 ·化学療法の中心的な薬剤である。 シスブラチン投与に起因する副作用 は、 ほぼ 1 0 0 %近くの患者に出現するが、 臨床的効果は必ずしも良好とは言え ない。 シスプラチンの投与効果は、 症例によってばらつきがあり、 一部の患者に 対しては全く奏効しないことが知られている。 このため、 多くの患者が非常に重 篤な副作用に苦しんだにも拘わらず、 治療効果が得られないまま癌が進行して予 後不良となることがしばしばある。
したがって、 シスプラチンによる治療効果が投与前に判定できるとすれば、 患 者にとって非常に大きな福音となる。 また、 シスプラチン投与に耐性を示す患者 群に特異的に発現亢進する遺伝子 （薬剤耐性遺伝子） 及びシスブラチン投与に感 受性を示す患者群に特異的に発現亢進する遺伝子 （薬剤感受性遺伝子） を同定す ることにより、 薬剤耐性を克服した新たな効果的な抗癌剤治療法を開発すること ができる。
しかしながら、 現在までシスブラチン耐性に関連する遺伝子が幾つか発表
(Bordo ら、 1994 (非特許文献 1 ) ； Gottesman ら、 1996 (非特許文献 2 ) ； Loe ら、 1996 (非特許文献 3 ) ； Jinら、 1998 (非特許文献 4 ) ； Perezら、 1998 (非特 許文献 5 ) ； Hinoshita ら、 2000 (非特許文献 6 ) ) されているものの、 実際の臨 床でシスブラチン投与効果を判定できるような遺伝子は無いのが現状である。
非特許文献 1 Bordow SB, Haber M， Madafiglio J, Cheung B， Marshall GM,
Norris MD. Cancer Res. Oct 1 ; 54 (19) : 5036- 5040. 1994 非特許文献 2 Gottesman MM, Pastan I, Ambudkar SV. Curr Opin Genet Dev.
0ct ; 6 (5) : 610-617. 1996
非特許文献 3 Loe D. W.， Deeley R. G.， Cole S. P. Eur. J. Cancer, 32A: 945-957, 1996.
非特許文献 4 Jin S, Scotto KW. Mol Cell Biol. Jul ; 18 (7) : 4377-4384. 1998 非特許文献 5 Perez RP. Eur J Cancer. Sep ; 34 (10) : 1535-1542. 1998 非特許文献 6 Hinoshita E, Uchiumi T, Taguchi K, Kinukawa N, Tsuneyoshi
M， Maehara Y， Sugimachi K, Ku ano M. Clin Cancer Res. Jun ; 6 (6) : 2401 - 2407.
2000 発明の開示
そこで、 本発明者らは、 上述した実情に鑑み、 シスブラチン投与による治療効 果の有無を判定することができるシスブラチン投与効果判定方法及びシスプラチ ン投与効果判定キット提供することを目的としている。
上述した目的を達成するため、 本発明者は、 シスプラチンに対する非常に優れ た耐性を示す細胞株を使用することでシスブラチン耐性或いは感受性を示す遺伝 子群を特定し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下を包含する。
( 1 ) 診断対象者から採取した生体由来試料における、 PDE3B (phosphodiesterase 3B) 遺伝ナ、 PDGFC 、piatelet derived growth factor C) 遺伝子、 PKD2 (Polycystic kidney disease - 2 gene) 遺 ナ、 NRG1 (neuregulin l) 遺伝子及び LUM (Lumican) 遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも 1以上の遺 伝子め発現を測定するステップ aと、 測定の結果として得られた遺伝子の発現量 に基づいてシスブラチンの投与効果を判定するステップ bとを含むシスブラチン 投与効果判定方法。
( 2 ) 前記ステップ aでは、上記遺伝子の mRNA量を測定することを特徴とす る （1 ) 記載のシスブラチン投与効果判定方法。
( 3 ) 前記ステップ aでは、 上記遺伝子の産物であるタンパク質量を測定す ることを特徴とする （1 ) 記載のシスブラチン投与効果判定方法。 ( 4 ) 上記ステップ aでは、 後述する表 1に示す遺伝子群のうち上記 PDE3B 遺伝子、 上記遺伝子、 上記 PKD2遺伝子、 上記 NRG1遺伝子及ぴ上記 LUM遺伝子以 外の少なくとも 1以上の遺伝子の発現量を更に測定することを特徴とする （1 ) 記載のシスプラチン投与効果判定方法。
( 5 ) PDE3B (phosphodiesterase 3B)遺伝子、 PDGFC (platelet derived growth factor C) 遺伝子、 PKD2 (Polycystic kidney disease-2 gene) 遺伝子、 NRG1 (neuregulin 1) 遺伝子及ぴ LUM (Lumican) 遺伝子からなる群から選ばれる少な くとも 1以上の遺伝子の発現を測定するための手段を含む、 シスブラチン投与効 果判定キット。
( 6 ) 上記手段は、上記遺伝子の mRNA又は当該 mRNAに由来する cDNAに対し て特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであることを特徴とする （ 5 ) 記載のシスブラチン投与効果判定キット。
( 7 ) 上記ポリヌクレオチドは、 支持体に固定されたものであることを特徴 とする （6 ) 記載のシスブラチン投与効果判定キット。
( 8 ) 上記手段は、 上記遺伝子の産物であるタンパク質に対して特異的に結 合する抗体であることを特徴とする （5 ) 記載のシスブラチン投与効果判定キッ 卜。
( 9 ) 後述する表 1に示す遺伝子群のうち上記 PDE3B遺伝子、 上記遺伝子、 上記 PKD2遺伝子、 上記 NRG1遺伝子及び上記 LUM遺伝子以外の少なくとも 1以上 の遺伝子の発現を測定するための手段を更に含むことを特徴とする （5 ) 記載の シスブラチン投与効果判定キット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2006-286285号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例で樹立した耐性株の代表例として、 Sa-3株及ぴ Sa-3R株におけ る MTTアツセィの結果を示す特性図である。
図 2は、 実施例で樹立した耐性株の代表例として、 Sa- 3株及び Sa-3R株におけ る ABC トランスポーター （MDR1、 MRP1及び MRP2) について発現を RT- PCRで測定 した結果を示す特性図である。
図 3は、 実施例で樹立した耐性株及ぴその親株を用いたマイクロアレイ解析の 結果として同定された耐性株において特異的に発現増強する遺伝子及び発現減弱 する遺伝子の個数を示すベン図である。
図 4は、 シスプラチン耐性に関連する遺伝子として同定された 1 9 9個の遺伝 子についてパスゥヱイ解析を行った結果として得られた 4つのネットワークを示 す特性図である。
図 5は、 実施例で特定した 5つの遺伝子の代表例として lumican遺伝子につい て行った RT- PCRの結果を示す特性図 （A) 及ぴウェスタンブロッテイングの結果 を示す写真（B)である。
図 6は、 実施例で特定した 5つの遺伝子の代表例として lumican遺伝子につい て臨床検体の免疫組織学的染色法を施行した結果を示す写真である。
図 7は、 PDE3E遺伝子について IHCスコアの分布を求めた結果として示す特性 図である。
図 8は、 lumican遺伝子について IHCスコアの分布を求めた結果として示す特 性図である。
図 9は、 PDGFC遺伝子について IHCスコアの分布を求めた結果として示す特性 図である。
図 1 0は、 PKD2遺伝子について IHCスコアの分布を求めた結果として示す特性 図である。
図 1 1は、 NRG1遺伝子について IHCスコアの分布を求めた結果として示す特性 図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、本発明に係るシスブラチン投与効果判定方法及び/又はシスブラチン投与 効果判定キットを詳細に説明する。
本シスブラチン投与効果判定方法は、 診断対象者から採取した生体由来試料に おける、 以下の 5個の遺伝子から選ばれる少なくとも 1以上の遺伝子の発現を測 定するステップ aと、 測定の結果として得られた遺伝子の発現量に基づいてシス ブラチンの投与効果を判定するステップ bとを含んでいる。
PDE3B (phosphodiesterase 3B) 遺伝子 (配列番号 1 )
PDGFC (platelet derived growth factor C) 遺伝子 （配歹 IJ番号 3 )
PKD2 (Polycystic kidney disease- 2 gene) 遺伝子 （配歹 'J番号 5 )
NRG1 (neuregulin l) 遺伝子 （配列番号 7 )
LUM (Lumican) 遺伝子 （配列番号 9 )
PDE3B 遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号 2に示す。 PDGFC遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号 4に示す。 PKD2 遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号 6に示す。 NRG1遺伝子 がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号 8に示す。 LUM遺伝子がコー ドするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号 1 0に示す。
なお、 これら PDE3B遺伝子、 PDGFC遺伝子、 PKD2遺伝子、 NRG1遺伝子及ぴ L 遺伝子は、 詳細を後述する、 シスブラチン耐性株及ぴシスブラチン感受性株を用 いてマイクロアレイ解析や、 臨床検体を用いた後ろ向き試験を行った結果として 同定された遺伝子である。 また、 本発明に係るシスブラチン投与効果判定方法に おいては、 これらの遺伝子の発現量に加えて表 1に挙げた遺伝子群から得らばれ る少なくとも 1以上の遺伝子の発現量を測定し、 上記 5つの遺伝子の発現量に加 えてこの遺伝子の発現量を判定に使用しても良い。
表 1
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表 1において 「No.」 の欄は各遺伝子に割り振った番号を示し、 「Comraon」 の欄 は一般的な遺伝子の名称を示している。 また、 「Genbank」 の欄は Genbankの提供 するデータベースにおける当該遺伝子の登録番号であり、 「Systematic」の欄は当 該遺伝子の系統名を示し、 「Map」 の欄は当該遺伝子の染色体上の位置を示してい る。 さらに、 「Description」 の欄は遺伝子に関する説明又は当該遺伝子の産物で あるタンパク質に関する説明である。
なお、 表 1に挙げた遺伝子群は、 詳細を後述する、 シスブラチン耐性株及ぴシ スプラチン感受性株を用いてマイクロアレイ解析を行った結果として同定された 遺伝子から構成される。 ここで、 シスブラチン耐性株は、 口腔扁平上皮癌由来細 胞株又は中咽頭扁平上皮癌由来細胞株からシスブラチン耐性を指標として樹立さ れた細胞株であって、 シスプラチン投与により奏効しない患者の細胞株モデルと しての意味を有する。 また、 シスブラチン感受性株とは、 シスブラチン耐性株の 親株である口腔扁平上皮癌由来細胞株又は中咽頭扁平上皮癌由来細胞株それ自身 を意味する。
すなわち、 表 1に挙げた遺伝子群は、 シスプラチン耐性株において、 特異的に 発現増強した遺伝子と特異的に発現減弱した遺伝子とから構成されている。 表 1 において、 シスブラチン耐性株において特異的に発現増強した遺伝子は No. 1〜 164であり、 シスプラチン耐性株において特異的に発現減弱した遺伝子は No. 165 〜199である。
また、 表 1に挙げた遺伝子群について、 上記マイクロアレイ解析の結果を用い て Ingenuity pathway analysi sを行つことで統計的に意義ある不ッ卜ワークを構 築した結果として、 表 2に示す遺伝子群が特定される。
具体的に、 表 1に挙げた遺伝子群のうち 5 1個の遺伝子群が 4つのネットヮー クを形成するとともに、 これら 4つのネットワークが大きな一大ネットワークを 形成している。
表 2
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ここで、 判定対象者としては、 特に限定されず、 各種癌に罹患した患者、 各種 癌を疑われた者及び健常者のいずれであっても良い。 また、 本発明に係るシスプ ラチン投与効果判定方法は、 判定対象者の対して直接何らかの処置を施すもので はなく、 診断対象者から採取した生体由来試料を用いて実施する。
本発明に係るシスブラチン投与効果判定方法において生体由来試料とは、 判定 対象者における遺伝子発現解析が可能であれば特に限定されないが、 例えば、 組 織、 細胞、 体液、 尿及びその他生体試料由来の蛋白質抽出液を挙げることができ る。 ここで体液とは、 血液、 リンパ液、 組織液 （組織間液、 細胞間液、 間質液）、 体腔液、 漿膜腔液、 胸水、 腹水、 心嚢液、 脳脊髄液 （髄液）、 関節液 （滑液）、 眼 房水 （房水）、 消化液、 膝液、 腸液、 精液及び羊水を含む意味である。 また、 生体 由来試料は、 組織、 細胞、 体液、 尿及びその他生体試料由来の蛋白質抽出液のい ずれか一種でも複数種でもよい。
組織としては、 癌罹患患者の治療目的で行われた手術の際に得られた組織の一 部、 癌を疑われた診断対象者から生検等によって採取された組織の一部、 癌罹患 患者で原発性か転移性かを鑑別する目的で生検等によって採取された組織の一部 を含む意味である。
また、 本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法において細胞としては、 上 記各組織から単離した細胞を使用することができる。 また、 体液としては、 上記 血液から分離した血漿又は血清、 尿、 リンパ液、 脳脊髄液或いは腹水を使用する ことができる。 本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法においてその他の生 体由来試料としては、 喀痰などから単離した細胞又は蛋白質抽出液を用いること ができる。
具体的に、 判定対象者から採取した生体由来試料における、 上述した遺伝子の 発現を測定するには、例えば、測定対象の遺伝子に対する mRNA量を測定する又は 測定対象の遺伝子の産物であるタンパク質量を測定すればよい。
測定対象の遺伝子に対する mRNA量を測定する方法としては、公知の遺伝子の発 現の検出方法を用いることができる。例えば、測定対象の遺伝子の mRNA量を検出 するために、 ノーザンプロッティング法を用いることができる。 また、 測定対象 の遺伝子に対して、 ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする D N A配列 を有するポリヌクレオチドをプローブとして用いることができる。 当該プローブ を用いて測定対象の遺伝子の mRNA量を検出するには、公知の方法を用いて適宜実 施することができる。 例えば、 プローブを作製する際に当該プローブに適宜蛍光 標識等の標識を付与しておき、 これを判定対象者から採取した生体由来試料から 単離した mRNA (又は mRNAから合成した cDNA) とハイプリダイズする。 その後、 ハイプリダイズしたプローブに由来する蛍光強度を測定することにより、 測定対 象の遺伝子の mRNA量を検出することができる。 なお、 プローブとしては、 ガラス ビーズやガラス基板等の支持体に固定化して使用することもできる。 すなわち、 測定対象の遺伝子 （複数でもよい） について作製したプローブを支持体上に固定 化したマイクロアレイ又は D N Aチップの形で用いることもできる。
なお、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、 4 2 °C で、 1 X S S C ( 0 . 1 5 M N a C l、 0 . 0 1 5 M タエン酸ナトリウム）、 0 . 1 %の S D S (Sodium dodecyl sulfate) を含む緩衝液による 4 2 °Cでの洗浄処 理によってもハイブリダィズを維持することを意味する。 なお、 ハイブリダィゼ ーションのストリンジエンシーに影響を与える要素としては、 上記温度条件以外 に種々の要素があり、 当業者であれば種々の要素を組み合わせて、 上記例示した ハイプリダイゼーションのストリンジエンシーと同等のストリンジエンシーを実 現することが可能である。
一方、 測定対象の遺伝子の産物であるタンパク質量を測定する方法としては、 公知のタンパク質検出方法を用いることができる。 具体的には、 測定対象のタン パク質に対する抗体を使用した各種の方法を適用することができる。
なお、 測定対象のタンパク質を抗原とし、 当該抗原に結合する限り、 前記抗体 としては特に制限はなく、 マウス抗体、 ラット抗体、'ゥサギ抗体、 ヒッジ抗体等 を適宜用いることができる。 抗体は、 ポリクローナル抗体であってもモノクロ一 ナル抗体であってもよいが、 均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル 抗体が好ましい。 ポリクローナル抗体おょぴモノクローナル抗体は当業者に周知 の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマは、 基本的には公知技術を使用 し、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 所望の抗原や所望の抗原を発現す る細胞を感作抗原として使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常の スクリーニング法により、 モノクローナルな抗体産生細胞 （ハイプリ ドーマ） を スクリーニングすることによって作製できる。 ハイブリ ドーマの作製は、 たとえ ば、 ミルスティンらの方法 （Kohler. G. and Milstein, C. , Methods Enzymol. (1981) 73： 3-46 ) 等に準じて行うことができる。
ここで、 モノクローナル抗体を作製する際には、 上述した遺伝子の産物を抗原 として使用することができ、 また、 上述した遺伝子の産物の断片を発現する細胞 を抗原として使用することができる。 なお、 これらタンパク質若しくは当該タン ノ ク質の断片は、 例えば、 Molecuar Cloning : A Laboratory Manual 第 2版第 1 — 3卷 Sambrook, J.ら著、 Cold Spring Harber Laboratory Press出版 New York 1989年に記載された方法に準じて、当業者であれば容易に取得することができる。 また、 これらタンパク質若しくは当該タンパク質の断片を発現する細胞も、 Molecuar Cloning : A Laboratory Manual 第 2版第 1一 3卷 Sambrook, j . り著、 Cold Spring Harber Laboratory Press出版 New York 1989年に記載された方法 に準じて、 当業者であれば容易に取得することができる。
得られたモノクローナル抗体は、 測定対象のタンパク質の定量用に、 ェンザィ ムーリンクィムノソルベントアツセィ（E L I S A)、酵素ィムノ ドッ トアツセィ、 ラジオィムノアツセィ、 凝集に基づいたアツセィ、 あるいは他のよく知られてい るィムノアッセィ法で検査試薬として用いることができる。 また、 モノクローナ ル抗体は標識化されることが好ましい。 標識化を行う際、 標識化合物としては例 えば当分野で公知の酵素、 蛍光物質、 化学発光物質、 放射性物質、 染色物質など を使用することができる。
ところで、 本発明に係るシスブラチン投与効果判定方法においては、 測定対象 の遺伝子として上述した PDE3B (phosphodiesterase 3B)遺伝子、 PDGFC (platelet derived growth factor C) feナ、 PKD2 (Polycystic kidney disease- 2 gene) 遺伝子、 NRG1 (neuregulin 1)遺伝子及び LUM (Lumican)遺伝子から選択するが、 本発明に係るシスブラチン投与効果判定方法は、 測定対象の遺伝子をこれら 5つ の遺伝子に限定するものではなく、 表 1に挙げる遺伝子群から選ばれる他の遺伝 子を測定対象として追加してもよい。 特に、 測定対象の遺伝子としては、 上述し た 5つの遺伝子に加えて、 表 2に挙げた遺伝子群から選ばれる他の遺伝子を測定 対象とすることがより好ましい。
以上のようにして、 診断対象者から採取した生体由来試料における、 上述した 遺伝子群から選ばれる測定対象の遺伝子の発現量を測定した後、 本発明に係るシ スプラチン投与効果判定方法では、 当該発現量に基づいてシスブラ.,チン投与によ る効果の有無又は効果の程度を判定する。
具体的には、 上述したいずれかの方法により測定対象の遺伝子の発現量を測定 した後、 当該遺伝子の発現量を評価する。 発現量の評価は、 測定対象の遺伝子毎 に基準値を設定し、この基準値との比較によって行っても良い。基準値としては、 構成的に発現する遺伝子の発現量に対する相対値を設定することができる。また、 測定対象の遺伝子の発現量は、今回行ったように免疫組織化学染色 （IHC) スコア にて評価し、 擬陽性と擬陰性を評価できる値を基準値として評価しても良い。 本発明に係るシスブラチン投与効果判定方法及び判定キットによれば、 非常に 優れた確度及び/又は優れた特異度で判定対象者について、シスブラチン投与によ る効果の有無又は効果の程度を判断することができる。 ここで、 感度とは、 シス ブラチン投与に奏功する患者群における陽性率を意味する。 特異度とは、 シスプ ラチン投与に奏功しない患者群における陰性率を意味する。
特に、 本発明に係るシスブラチン投与効果判定方法において、 測定対象の遺伝 子の種類を増やすこと （例えば、 6種類以上の遺伝子） によって、 より優れた感 度及び/又はより優れた特異度で診断することができる。
本発明に係るシスブラチン投与効果判定方法によれば、 抗癌剤 ·化学療法開始 前の癌患者から採取した生体由来試料を用いた遺伝子発現解析（mRNAレベル或い はタンパク質レベル） により、 シスブラチン投与による効果をより客観的、 特異 的に判定することができることから、 投与効果を期待できない患者に対する過度 の負担となるようなシスブラチンの投与を防止することができ、 当該患者にとつ て有効な治療方針にとって有用な知見を提供することができる。
以下、 実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、 本発明に係る技術的範囲は 以下の実施例に限定されるものではない。
<耐性株の樹立 >
先ず、 本実施例ではシスブラチン耐性株を樹立した。 具体的には、 和歌山医科 大学医学部歯科口腔外科講座から提供された口腔扁平上皮癌由来細胞株 （H - 1 株 及び Sa- 3株） に対して、 シスブラチン （以下、 C D D Pと称する場合もある） 濃 度を 0 . 1 f g/mlの低濃度から段階的に C D D Pを持続的に接触させることによ つて、 シスブラチンに対して耐性を有する細胞株を樹立した。 H- 1 株から樹立し たシスブラチン耐性株を H - 1R株と命名し、 Sa- 3株から樹立したシスプラチン耐 性株を Sa-3R株と命名した。
また、 中咽頭扁平上皮癌由来細胞株 （KB株） に対しても同様に C D D P処理を 行い、 シスブラチン耐性株を樹立した。 KB株から樹立したシスブラチン耐性株を KBR株と命名した。
これらシスプラチン耐性株 （H - 1R株、 Sa- 3株及び KBR株） について、 シスプラ チンに対して感受性を示す各親株に対する相対的な耐性度を検討した。 具体的に は、 各耐性株及ぴ各親株をそれぞれ、 C D D Pで処理し （C D D Pの濃度を 0. 05 〜： LO g/mlとした）、 その後、 MTTアツセィを行った。 そして、 各耐性株及ぴ各親 株について 50%生存 （死滅） 濃度 （IC50) を求めた。 H- 1株と H- 1R株の相対的な 耐性度は約 10倍、 Sa - 3株と Sa - 3R株の相対的な耐性度は約 7. 5倍、 KB株と KBR 株の相対的な耐性度は 8. 6倍であった。 これらの 3種類の細胞株は凍結解凍を行 つても、 さらに、 1月間 CDDP無添加培養を行っても耐性は変わらなかった。
図 1に代表例として Sa-3株及ぴ Sa-3R株における MTTアツセィの結果を示す。 なお、 他の耐性株とその親株においても、 図 Γに示したプロファイルと同様なプ 口ファイルを示した。
なお、 耐性株のサイズは親株と比較して若干大きくなつているが、 基本的な形 態、 増殖速度、 およびコロニー形成能については、 耐性株及ぴ親株において大き な変化は認められず、 ほぼ同様の性状を保っていた。
また、 樹立した耐性株が遺伝子学的にも C D D P耐性を示すことを証明するた め、薬剤耐性機構のうち ABC トランスポーター遺伝子の発現状況を RT-PCR法によ つて解析した。 ABC トランスポーター （ATP-binding cassette) は、 細胞膜に存 在し、 薬物の輸送に関わっており、 特に薬剤耐性との関連について多く報告され ている。 CDDP 耐性と関連があるといわれる ABC トランスポーター （MDR1、 MRP1 及び MRP2)について発現を検討した。具体的に、 MDR1、 MRP1及び MRP2の各 RT- PCR に際しては、 以下の表 3に示すプライマーを用いた。 なお、 比較の対象として GAPDHを RT-PCRによって検出した。
表 3 primer
Forward Reverse size
MDE-l 5'-AAGGTTAGTACGAAAGAGGCTGTG-3' 5'-GGGTAGAAACAATAGTGAAAACAA-3* 2 5bp
MKP-1 5'-GGACGTGGACTTGCTTCTGA-3' δ'-G GTGG AGATTG GTTG ATGG G-3' 222bp
MRP-2 5' - GTAGTGGA GAATGATAATGTGAGG-3" 5'-G TAGTGG ATCAATGATAATCTGAGC-S* 204bp
GAPDH 5'-GATCTGTGCCGCCTGTGGTGA-3" 5'-GGATGAGGTTGGGCAGAGCG-3' 306bp
RT-PCRの結果、 本例で樹立した各耐性株においては、 3種類の ABC トランスポ 一ターで強発現が認められた。図 2に代表例として Sa - 3株及び Sa-3R株における RT - PCRの結果を示す。 この結果から、 本例で樹立した各耐性株は遺伝子学的も C D D Pに対する耐性を有する細胞株であることが明かとなった。 なお、 従前の CDDP耐性に関連する報告では、 耐性株の耐性度は 2倍程度であり、 実験誤差範囲 ともいえる程度の低耐性しか保有していない細胞株であった。 本実施例で樹立し た耐性株は、 従前の細胞株と比較して高い薬剤耐性を有し、 解析に非常に有用で あると考えられた。
くマイクロアレイ解析 >
次に、 本実施例では、 耐性株及ぴその親株を用いたマイクロアレイ解析によつ て、 耐性株において特異的に発現増強している遺伝子及び耐性株において特異的 に発現減弱している遺伝子を同定した。 具体的にマイクロアレイ解析では、 マイ クロアレイとして 54675種類のプローブが固定化された Affymetrix U133 Plus 2. 0 を使用した。 また、 マイクロアレイ解析には、 解析ソフトウェアとして GeneChip Operating Software 1. 1 (Affymetrix社製)及び GeneSpring 6. 1 (Silicon Genetics社製）を使用した。
マイクロアレイ解析としては、 先ず、 耐性株 Sa-3R株についてその親株 Sa- 3 株と比較して 1. 5倍以上の発現が観察された遺伝子群、耐性株 H-1R株についてそ の親株 H- 1株と比較して 1. 5倍以上の発現が観察された遺伝子群、及び耐性株 KBR 株についてその親株 KB株比較して 1. 5倍以上の発現が観察された遺伝子群を特定 した。 そして、 これら 3つの群に共通する遺伝子群を、 シスブラチン耐性株にお いて特異的に発現増強している遺伝子群 （1 6 4遺伝子） として同定した （図 3 参照）。 一方、耐性株 Sa-3R株についてその親株 Sa- 3株と比較して 1. 5倍以下の発現が 観察された遺伝子群、耐性株 H- 1R株についてその親株 H-1株と比較して 1. 5倍以 下の発現が観察された遺伝子群、及び耐性株 KBR株についてその親株 KB株比較し て 1. 5倍以下の発現が観察された遺伝子群を特定した。 そして、 これら 3つの群 に共通する遺伝子群を、 シスブラチン耐性株において特異的に発現減弱している 遺伝子群 （3 5遺伝子） として同定した （図 3参照）。
これら合計 1 9 9遺伝子は、 癌細胞においてシスブラチン耐性に関連する遺伝 子として同定できたこととなる。
<パスゥ： ィ解析 >
次に、 本実施例では、 シスブラチン耐性に関連する遺伝子として同定された 1 9 9個の遺伝子についてパスゥヱイ解析を行い、 1 9 9個の遺伝子で如何なるネ ットワークが形成されるかを検討した。 具体的に、 パスウェイ解析には、 ソフ ト ヮエアとして Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity systems千土 ) 使用し た。 その結果、 1 9 9個の遺伝子のうち 5 0個の遺伝子が 4つのネットワークを 形成しており、 これら 4つのネットワークが更に大きな 1つのネットワークを形 成していることが判明した。 これら 4つのネットワークを構成する遺伝子群を表 4にまとめた。
表 4
Network Genes Functons Score
ANXA1, C1QA, C1R, CD47, CNPS5,
COPS8, CUL2, CYFIP2, DCN, EGFR, Cancer
ERBB3, ERBB4, FMR1, FOS, FXR1, Cell-To-Cell Signaling
GNB1,GNG10, GRB2, H2-KA, INSR, and Interaction
26
MAP1B, MMP2， MMP9, MMP13, NR3C1 Cellular Movement
NGR1, PCDHGC3, PDE3B, ΡΡΠ),
RAPGEF1, SNX2, SOCS1, SRC, VPS29,
WASF2
AES, ATF3, ATRX, CBX5, CDK 2A,
CENPJI, DDR1, E2F4， E4F1, GTSE1,
ILIA, IL7R, ITGB5,画 PI, MMP2, Cancer
MMP9,画 P13, NFKB1, PDGFA, Tumor Morphology 22
PDGFC, PLAGL1, PL 2, RBI, RBBP9, Cell Cycle
RELA, RRM2B, SMC2L1, SRI, STAT5A,
TBX3, TFPI2, TK1, TP53, USP7, WIG1A1
ABCC1, BAX, CAPN2, CASP8, CCNL2:
CDC42, CNP,
CTNNB1, DYRK1A, ERBB2, HMGA1,
Cancer
CNAB2, MBP, MMP2, MSN, MYC,
Cell Eeath 11
MYCN, MYLK, NFATC2, NPM1, OSIA:
Hematological Eisease
PAK2, PIP5K1B, PLEC1, PRKCA,
PRKCZ, QKI, RAC1, RBMS1,RDX5
SFRS2, TLE4, TP53, VBL2, V
AKT2, BACH1, BARD1, BRCA1, CEBTPB:
CYP1B1, ESR1, ETV6, FBLN1, FOXC2, Gene Expression
HBA1, HBA2, HBB, HAD, HBE1, HBG1: Connective Tissue
HBG2, HBQ1, HBZ, JUNB, L PEP, MB: Development 11
MYOG, NCOR1, NR2F1, NR2F2, PGR, and Function
P D2, PPARD, PPARG, PPARGC1A, Viral Function
RFC1, RXARA, TNNI1, TP53
またノ スウェイ解析の結果として得られた4つのネットワークを図 4に示す。 表 4及ぴ図 4に示したネットワークを構成する 5 0個の遺伝子は、 耐性株におけ る C D D P耐性という表現型に強く関連する遺伝子であると結論づけた。
く後ろ向き試験 >
次に、 本実施例では、 後ろ向き試験として臨床検体によって抗癌剤の奏功率を 予測しえる候補遺伝子を、 この 5 0個の遺伝子から検索した。 まず、 RT - PCRによ つて mRNAの発現を確認することで、 50遺伝子中で耐性株において発現している 遺伝子のなかから 5個の遺伝子 （PDE3B、 PDGFC, PKD2、 NRGl及び Lumican) を選 出した。
PDE3Bに対する抗体として抗ヒ ト PDE3Bャギポリクローナル抗体 （Santa Cruz 社製）、 PDGFCに対する抗体として抗ヒ ト PDGFCャギポリクローナル抗体 （Santa Cruz 社製）、 P D2 に対する抗体として抗ヒ ト PKD2 ゥサギポリクローナル抗体 (ABGENT社製）、 NRG1に対する抗体として抗ヒ ト PKD2ゥサギポリクローナル抗体 (Santa Cruz社製） 及び Lumicanに対する抗体として抗ヒ ト Lumicanャギポリク ローナル抗体 （Santa Cruz社製） を準備した。 これらの遺伝子がタンパク · レべ ル質レベルで耐性株において発現増強していることを、 準備した抗体を用いたゥ エスタンブロッティングにて確認した。
なお、上述した 5個の遺伝子のうち lumican遺伝子について行った RT- PCRの結 果及びウェスタンプロッティングの結果を代表例として図 5 (A)及び (B)に示す。 図 5 (A)及び（B)に示すように、 lumican遺伝子は、 親株と比較して耐性株におい て特異的に発現していることが判る。 Lumican遺伝子を除く他の遺伝子について も同様な結果が得られた。 ，
また、シスブラチン投与に結果、完全寛解した症例（CR症例： Complete Response 症例）、部分寛解した症例 （PR症例： Partial Response症例） 及び不変の症例 （NC 症例： No Change 症例） 由来の臨床検体を用いて、 免疫組織学的染色法により発 現状態を調べた。 免疫組織学的染色法は、 ホルマリンで固定されたパラフィン包 埋組織を厚さ 4 / mの切片にし、 脱パラフィン処理と脱水処理した後、 0. 3% H202 と 30 分間反応させて内因性ペルォキシダーゼを除去し、 1. 5%ブロッキング血清 (Santa Cruz Biotechnology社製）で非特異的なタンパクとの反応を阻害した。 そ の後、 1 : 100倍希釈抗体 Lin7Cモノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology) を室温 ·湿潤状態で 30分間反応させた。 リン酸緩衝液で 3回洗浄し、 Envision reagent (Dako 社 製 ) と 反 応 さ せ た 後 、 3, 3 -diaminobenzidine tetrahydrochloride (Dako社製）によって発色させ検出した。 最終に、 対比のため にへマトキシリン染色を施した。
免疫組織学的染色法における染色性の評価には IHCスコアを用いた。 IHCスコ ァは、 対物レンズ 40倍で観察し、 1視野の中の全細胞数のうち陽性細胞の百分率 と染色性の強度 （例えば 3段階 （弱、 中及び強） に評価して、 それぞれに 1〜3 の整数を割り当てる） とを掛け合わせた数の総和である。 これを無作為に抽出し た 10視野で行い、 その平均値として IHCスコアを算出する。 IHCスコアは、 染色 強度と染色範囲を示す優れたスコアとして、 現在、 一般的に用いられている染色 度判定方法である。
luraican 遺伝子について臨床検体の免疫組織学的染色法を施行した結果の代表 例を図 6に示した。 シスプラチンに耐性である臨床検体症例において、 lumi can タンパクの発現亢進が確認できた。
また、 シスプラチン投与に対する NC症例を 10症例、 PR症例を 22症例及び CR 症例を 16症例を用いて IHCスコアを求め、 IHCスコアの分布を上述した 5つの遺 伝子毎に求めた。 PDE3E遺伝子について IHCスコアの分布を求めた結果を図 7に 示し、 lumican遺伝子について IHCスコアの分布を求めた結果を図 8に示し、 PDGFC 遺伝子について IHCスコアの分布を求めた結果を図 9に示し、 PKD2遺伝子につい て IHCスコアの分布を求めた結果を図 1 0に示し、 NRG1遺伝子について IHCスコ ァの分布を求めた結果を図 1 1に示した。
図 7〜1 1に示すように、 上記の 5つの遺伝子全てについて、 IHC スコアとシ スプラチン投与の奏功評価とが相関していることが明かとなった。
さらに、 上記の 5個の遺伝子について、 その発現の有無と治療効果判定を表 5 に纏めた。 なお、 表 5において 「十」 は各遺伝子についてタンパク質レベルの発 現が陽性であったことを示し、 「一」は各遺伝子についてタンパク質レベルの発現 が陰性であったことを示している。
表 5 ―
Figure imgf000037_0001
表 5からも判るように、 シスブラチン投与の奏功結果と上述した 5つの遺伝子 の発現とが相関していることが明かとなった。
<結果のまとめ >
以上のように、 先ずくマイクロアレイ解析 >の結果から、 シスブラチン耐性に 関連する遺伝子として信頼性の高い 199個の遺伝子を同定することができたに絞 り込めた。 また、 <パスウェイ解析 >の結果から、 シスプラチン耐性に関連する 遺伝子として更に信頼性の高い 51個の遺伝子を絞り込めた。 さらに、 <後ろ向き 試験 >の結果から、 51個の遺伝子に含まれる 5個の遺伝子については、 その発現 量からシスブラチン投与の効果を判定できることが実証された。 これらの結果か ら、 各種癌に対するシスブラチンの投与効果を患者毎に高精度に判定することが できる有用な手法を開発できたものと評価できる。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 シスプラチンの投与による奏効の有無を非常に優れた確度で 判定することができる。 したがって、 本発明に係るシスプラチン投与効果判定方 法及びシスブラチン投与効果判定キットは、 対象となる患者に対してシスプラチ ン投与を含む治療を適用するか否かの判定を行うことができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . 診断対象者か ら採取した生体由来試料における、 PDE3B (phosphodiesterase 3B) 遣 十、 PDGFC ^platelet derived growth factor C) 遺伝子、 PKD2 (Polycystic kidney disease- 2 gene) 遺伝ナ、 NRG1 (neuregulin 1) 遺伝子及ぴ LUM (Lumican) 遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも 1以上の遺 伝子の発現を測定するステップ aと、
測定の結果として得られた遺伝子の発現量に基づいてシスブラチンの投与効果 を判定するステップ bと、
を含むシスブラチン投与効果判定方法。
2 . 前記ステップ aでは、上記遺伝子の mRNA量を測定することを特徴とする 請求項 1記載のシスブラチン投与効果判定方法。
3 . 前記ステップ aでは、 上記遺伝子の産物であるタンパク質量を測定する ことを特徴とする請求項 1記載のシスプラチン投与効果判定方法。
4 . 上記ステップ aでは、 表 1に示す遺伝子群のうち上記 PDE3B遺伝子、 上 記 PDGFC遺伝子、 上記 PKD2遺伝子、 上記 NRG1遺伝子及び上記 LUM遺伝子以外の 少なくとも 1以上の遺伝子の発現量を更に測定することを特徴とする請求項 1記 載のシスプラチン投与効果判定方法。
表 1
File Name
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5 . PDE3B (phosphodiesterase 3B) 遺伝子、 PDGFC (platelet derived growth factor C) 遺伝子、 PKD2 (Polycystic kidney disease - 2 gene) 遺伝子、 NRGl
(neuregulin l) 遺伝子及ぴ LUM (Lumican) 遺伝子からなる群から選ばれる少な くとも 1以上の遺伝子の発現を測定するための手段を含む、 シスブラチン投与効 果判定キット。
6 . 上記手段は、上記遺伝子の mRNA又は当該 mRNAに由来する cDNAに対して 特異的にハイブリダィズするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項 5 記載のシスブラチン投与効果判定キット。
7 . 上記ポリヌクレオチドは、 支持体に固定されたものであることを特徴と する請求項 6記載のシスプラチン投与効果判定キット。
8 . 上記手段は、 上記遺伝子の産物であるタンパク質に対して特異的に結合 する抗体であることを特徴とする請求項 5記載のシスブラチン投与効果判定キッ 卜。
9 . 表 2に示す遺伝子群のうち上記 PDE3B遺伝子、 上記 PDGFC遺伝子、 上記 PKD2遺伝子、 上記 NRG1遺伝子及ぴ上記 LUM遺伝子以外の少なくとも 1以上の遺 伝子の発現を測定するための手段を更に含むことを特徴とする請求項 5記載のシ スプラチン投与効果判定キット。
表 2
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000057_0001
Figure imgf000058_0001
Figure imgf000059_0001
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