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WO2008043461A2 - Inhibition der pde2a - Google Patents

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WO2008043461A2
WO2008043461A2 PCT/EP2007/008561 EP2007008561W WO2008043461A2 WO 2008043461 A2 WO2008043461 A2 WO 2008043461A2 EP 2007008561 W EP2007008561 W EP 2007008561W WO 2008043461 A2 WO2008043461 A2 WO 2008043461A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pde2a
cardiomyopathy
prophylaxis
well
treatment
Prior art date
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Ceased
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PCT/EP2007/008561
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English (en)
French (fr)
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WO2008043461A3 (de
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Peter Ellinghaus
Andreas Wilmen
Martin Hendrix
Adrian Tersteegen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Bayer Healthcare AG
Bayer Schering Pharma AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to CA002666355A priority patent/CA2666355A1/en
Priority to US12/444,708 priority patent/US20100035882A1/en
Priority to EP07818641A priority patent/EP2124955A2/de
Publication of WO2008043461A2 publication Critical patent/WO2008043461A2/de
Publication of WO2008043461A3 publication Critical patent/WO2008043461A3/de
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders

Definitions

  • the invention relates to the use of PDE2A inhibitors for the production of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of heart diseases, in particular heart failure and its underlying cardiomyopathies such as dilated cardiomyopathy (DCM), restrictive cardiomyopathy (RCM), arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy ( ARVCM), myocarditis and in particular hypertrophic cardiomyopathy (HCM).
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • RCM restrictive cardiomyopathy
  • ARVCM arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy
  • HCM hypertrophic cardiomyopathy
  • the treatment of erectile dysfunction, hypertension and prevention of arteriosclerosis with PDE2A inhibitors is the subject of the invention.
  • the systolic wall tension - the left ventricular afterload - is increased due to the systolic pressure loading on the ventricular wall.
  • the developing left ventricular hypertrophy leads to a normalization of the wall tension due to increase in thickness of the myocardial walls.
  • the left ventricle is able to require a normal cardiac output at a normal cardiac energy expenditure per unit weight myocardium despite hypertensive systolic blood pressure values.
  • Chronic compression of the left ventricle leads to abnormal activation of fetal growth factors that alter protein biosynthesis and fetal muscle gene products.
  • Angiotensin II, norepinephrine and other growth hormones have a growth-promoting effect on the myocardium. This results in a further stimulation of the development of myocardial hypertrophy, regardless of the systolic pressure load.
  • a hypotrophic myocardial hypertrophy which is similar to a hypertrophic cardiomyopathy, may develop. Due to the fact that the adult myocardial tissue is little or no longer capable of cell division due to the blockade of the cell cycle, a pathological hypertrophic reaction of the myocardium results at the molecular level.
  • Cardiac hypertrophy is not a physiological adaptation mechanism to the chronic long-term burden. It is an independent risk factor for cardiac events such as myocardial infarction, heart failure and sudden cardiac death [I].
  • the DNA sequence encoding human PDE2A is shown in the Sequence Listing in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of human PDE2A is shown in SEQ ID NO: 2 of the Sequence Listing.
  • rat cardiomyocyte cell line H9c2 ATCC number: CRL-1446
  • arginine vasopressin by a hypertrophy stimulus, which may, inter alia, be detected.
  • marker genes for cardiac hypertrophy such as ANP (atrial natriuretic peptide) and MYHCB (myosin heavy chain beta-subunit) [2].
  • Increased expression of the cGMP-hydrolyzing PDE2A can lower the intracellular cGMP level of the cardiomyocytes and thereby suppress the anti-hypertrophic effect of cGMP [3, 4]. It can be deduced from the present observation that the increased expression of PDE2A in hypertrophic H9c2 cells also contributes in vivo to the pathogenesis of cardiac hypertrophy, and inhibition of PDE2A activity by a small molecule drug has a positive effect on cardiac hypertrophy. the cGMP level in the cardiomyocytes is high, and thus the anti-hypertrophic effect of cGMP is retained.
  • BAY 60-7550 is the substance 2- (3,4-dimethoxybenzyl) -7- [1- (1-hydroxyethyl) -4-phenylbutyl] -5-methylimidazo [5, lf] [l, 2,4] triazine-4 (3H) -ones having the structural formula:
  • the PDE2A inhibitor BAY 60-7550 can suppress the increase in the hypertrophy marker gene MYHCB in a dose-dependent manner.
  • the intracellular cGMP content was determined after stimulation of cGMP synthesis by ANP in the presence of the PDE2A inhibitor BAY 60-7550 by EIA.
  • BAY 60-7550 dose-dependently increases intracellular cGMP levels in H9c2 cells.
  • the antihypertrophic effect of the PDE2 inhibitor BAY 60-7550 in vivo was investigated in a mouse hypertrophy model.
  • 2 mg / kg of isoprenaline was administered subcutaneously once a day to mice of strain C57BL6, and as a positive control in addition to isoprenaline 10 mg / kg of enalapril was administered via the drinking water.
  • BAY 60-7550 was co-administered twice daily with isoprenaline injection at a dose of 10 mg / kg ip.
  • the infusion of isoprenaline increases the animals' heart weight in relation to body weight.
  • administration of the PDE2A inhibitor BAY 60-7550 in both dose groups resulted in a significant reduction in the ratio of heart weight to body weight.
  • the present invention therefore relates to the use of PDE2A inhibitors for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of the following diseases: coronary heart disease, in particular stable and unstable angina, acute myocardial infarction, myocardial infarction, sudden cardiac death, heart failure and hypertension and the Consequences of atherosclerosis, as well as vascular diseases, kidney diseases, and erectile dysfunction.
  • coronary heart disease in particular stable and unstable angina, acute myocardial infarction, myocardial infarction, sudden cardiac death, heart failure and hypertension and the Consequences of atherosclerosis, as well as vascular diseases, kidney diseases, and erectile dysfunction.
  • Antagonists within the meaning of the invention are all substances which bring about an inhibition of the biological activity of PDE2A.
  • Particularly preferred antagonists are nucleic acids including “locked nucleic acids”, “peptide nucleic acids” and “Spiegelmers", proteins including antibodies and low molecular weight substances, very particularly preferred antagonists are low molecular weight substances.
  • the invention relates to:
  • a nucleic acid encoding a PDE2A polypeptide is a nucleic acid selected from the group consisting of:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence disclosed by SEQ ID NO: 2 as well as functional fragments thereof;
  • nucleic acid molecules comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1 as well as functional fragments thereof;
  • a PDE2A polypeptide according to the invention is a polypeptide which is encoded by one of the nucleic acids mentioned under a) - d).
  • a polypeptide comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or comprising a fragment thereof having PDE2A activity is a PDE2A polypeptide.
  • nucleic acid may have been introduced endogenously or recombinantly introduced.
  • cardiomyopathy-induced cardiac insufficiency selected from the group of cardiomyopathies consisting of dilated cardiomyopathy (DCM), the restrictive ones Cardiomyopathy (RCM), arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVCM), myocarditis and / or hypertrophic cardiomyopathy (HCM).
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • RCM restrictive ones Cardiomyopathy
  • ARVCM arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy
  • HCM hypertrophic cardiomyopathy
  • a PDE2A inhibitor which has been identified by means of one of the methods according to items 1-7 for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of cardiomyopathy-induced cardiac insufficiency selected from the group of cardiomyopathies consisting of dilated cardiomyopathy ( DCM), restrictive cardiomyopathy (RCM), the arrhythmogenic right ventricular
  • AVCM cardiovascular disease 2019
  • HCM hypertrophic cardiomyopathy
  • PDE2A-specific antibody a PDE2A-specific antisense oligonucleotide or a PDE2A-specific siRNA for the production of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of cardiac insufficiency.
  • a PDE2A-specific antibody, a PDE2A-specific antisense oligonucleotide or a PDE2A-specific siRNA for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of cardiomyopathy-induced heart failure, selected from the group of cardiomyopathies consisting of dilated cardiomyopathy ( DCM), restrictive cardiomyopathy (RCM), arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVCM), myocarditis and / or hypertrophic cardiomyopathy (HCM).
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • RCM restrictive cardiomyopathy
  • ARVCM arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy
  • HCM hypertrophic cardiomyopathy
  • siRNA is a "short interfering RNA.” Those skilled in the art are familiar with methods for providing PDE2A-specific antisense oligonucleotides, antibodies or siRNAs, and suitable antisense oligonucleotides, siRNAs or antibodies ultimately lead to an inhibition of PDE2A
  • Activity This can be done by a mechanism that directly involves the PDE2A protein, or at the level of transcription or translation of PDE2A.
  • PDE2A inhibitor for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of heart failure.
  • the cardiac insufficiency is a cardiomyopathy-induced cardiac insufficiency selected from the group of cardiomyopathies consisting of dilated cardiomyopathy (DCM), the restrictive cardiomyopathy myopathy (RCM), arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVCM), myocarditis and / or hypertrophic cardiomyopathy (HCM).
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • RCM restrictive cardiomyopathy myopathy
  • ARVCM arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy
  • HCM hypertrophic cardiomyopathy
  • PDE2A inhibition may e.g. be measured in the PDE2A inhibition test described below.
  • PDE2A antagonists which inhibit in the PDE2A inhibition test indicated below with an IC 50 of 1 ⁇ M, preferably with an IC 50 of less than 0.1 ⁇ M.
  • the PDE2A inhibitors according to the invention can not pass the blood / brain barrier and act systemically and not centrally.
  • the present invention also provides the use of compounds of the general formula (I)
  • R 1 is phenyl, naphthyl, quinolinyl or isoquinolinyl, which are up to three times identical or different with radicals selected from the group consisting of (C 1 -C 4 ) -alkyl, (C 1 -C 4 ) -alkoxy, halogen, cyano, -NHCOR 8 , -NHSO 2 R 9 , -SO 2 NR 10 R 11 , -SO 2 R 12 , and -NR 13 R 14 may be substituted, means
  • R 8 , R 10 , R ", R 13 and R 14 are independently hydrogen or (C r C 4 ) alkyl
  • R 9 and R 12 are independently (C r C4) alkyl, or
  • R 10 and R 11 together with the adjacent nitrogen atom azetidin-1-yl, pyrrol-1-yl, piperid-1-yl, azepin-1-yl, 4-methyl-piperazin-l-yl or morpholine Form -1-yl radical,
  • R 13 and R 14 together with the adjacent nitrogen atom azetidin-1-yl, pyrrol-1-yl, piperid-1-yl, azepin-1-yl, 4-methyl-piperazin-l-yl or morpholine Form -1-yl radical,
  • R 2 and R 3 independently of one another denote hydrogen or fluorine
  • R 4 (CC.) - Alkyl.
  • R 5 is (C 1 -C 3 ) -alkyl
  • R 6 is hydrogen or methyl
  • R 7 is phenyl, thiophenyl, furanyl, up to three times identically or differently by radicals selected from the group consisting of may be substituted (Ci-C t) alkyl, (Ci-C 4) -alkoxy, halogen and cyano, or ( C 5 -C 8 ) -cycloalkyl,
  • L is carbonyl or hydroxymethanediyl
  • M is (C 2 -C 5 ) -alkanediyl, (C 2 -C 5 ) -alkendiyl or (C 2 -C 5 ) -alkanediyl,
  • C 1 -C 4 -alkyl and (C 1 -C 1) -valent are a straight-chain or branched alkyl radical having 1 to 4 or 1 to 3 carbon atoms, for example: methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, isobutyl, , t-butyl, preferred are methyl and ethyl.
  • Cr-CO-alkanediyl represents a straight-chain or branched alkanediyl radical having 2 to 5 carbon atoms, for example ethylene, propan-1,3-diyl, propan-1,2-diyl, propane-2,2- Diyl, butane-l, 3-diyl, butane-2,4-diyl, pentane-2,4-diyl.
  • a straight-chain (C 2 -C 5 ) -alkane-l, ⁇ -diyl radical is preferred called ethylene, propane-1,3-diyl, butane-1,4-diyl, pentane-l, 5-diyl.
  • propane-1,3-diyl and butane-1,4-diyl particularly preferred are propane-1,3-diyl and butane-1,4-diyl.
  • (C2-dV) -Alkendiyl in the context of the invention represents a straight-chain or branched alkenediyl radical having 2 to 5 carbon atoms. Examples which may be mentioned ethene-l, 2-diyl, ethene-1,1-diyl, propene-1,1-diyl, propene-1,2-diyl, prop-2-en-l, 3-diyl, propene-3 , 3-diyl, propene-2,3-diyl, but-2-en-1, 4-diyl, pent-2-en-1, 4-diyl.
  • Examples which may be mentioned are ethene-1,2-diyl, prop-2-en-1, 3-diyl, but-2-one en-1, 4-diyl, but-3-en-1, 4-diyl, pent-2-en-1, 5-diyl, pent-4-en-1, 5-diyl
  • Particularly preferred are prop-2 -en-l, 3-diyl, but-2-en-l, 4-diyl and but-3-en-l, 4-diyl.
  • (C ⁇ -Cs) alkanediyl represents a straight-chain or branched alkynediyl radical having 2 to 5 carbon atoms, for example ethin-1, 2-diyl, ethyn-1,1-diyl, prop-2-yn 1, 3 - diyl, prop-2-yn-1, 1-diyl, but-2-yn-1, 4-diyl, pent-2-yn-1, 4-diyl, Preferred is a straight-chain (C 2 -C 5 ) - Alkene-l, ⁇ -diyl radical.
  • (C 1 -Q) -alkoxy is a straight-chain or branched alkoxy radical having 1 to 4 carbon atoms. Examples which may be mentioned are: methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, t-butoxy, n-pentoxy and n-hexoxy. Preferred are methoxy and ethoxy.
  • Cs-CgVcycloalkyl in the context of the invention represents cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl or cyclooctyl. Preference may be given to cyclopentyl, cyclohexyl or cycloheptyl.
  • Halogen is in the context of the invention in general for fluorine, chlorine, bromine and iodine. Preference is given to fluorine, chlorine and bromine. Particularly preferred are fluorine and chlorine.
  • Physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention may be acid addition salts of the substances according to the invention with mineral acids, carboxylic acids or sulphonic acids. Particularly preferred are e.g. Salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, toluenesulfonic acid, benzenesulfonic acid, naphthalenedisulfonic acid, acetic acid, propionic acid, lactic acid, tartaric acid, citric acid, fumaric acid, maleic acid or benzoic acid.
  • salts with customary bases can also be mentioned as salts, for example alkali metal salts (for example sodium or potassium salts), alkaline earth salts (for example calcium or magnesium salts) or ammonium salts derived from ammonia or organic amines such as, for example, Example, diethylamine, triethylamine, ethyldiisopropylamine, procaine, dibenzylamine, N-methylmorpholine, dihydroabietylamine, 1-ephenamine or methyl-piperidine.
  • alkali metal salts for example sodium or potassium salts
  • alkaline earth salts for example calcium or magnesium salts
  • ammonium salts derived from ammonia or organic amines such as, for example, Example, diethylamine, triethylamine, ethyldiisopropylamine, procaine, dibenzylamine, N-methylmorpholine, dihydroabietylamine, 1-ephenamine or methyl-pipe
  • the compounds of the invention may exist in stereoisomeric forms that behave either as image and mirror image (enantiomers) or that do not behave as image and mirror image (diastereomers).
  • the invention relates to both the enantiomers or diastereomers or their respective mixtures.
  • the racemic forms can be separated as well as the diastereomers in a known manner in the stereoisomerically uniform components.
  • R 1 is phenyl, whose meta and / or para positions up to three times identically or differently by radicals selected from the group consisting of (C r C4) alkyl is preferably (C r C 4) -alkoxy and -SO 2 NR 10 R 11 are substituted, group, and R 2, R 3, R 4, R 5, R 6, R 7, R 10, R 11, L and M are have the abovementioned meaning for the preparation of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of cardiac insufficiency.
  • the meta and para positions of the phenyl ring are to be understood as meaning those positions which are meta or para to the CR 2 R 3 group. These positions can be illustrated by the following structural formula (Ic):
  • R 7 is phenyl and R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , L and M have the abovementioned meaning for the preparation of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of heart failure.
  • R 10 and R 11 are independently hydrogen or (C r C 4) alkyl
  • R 1 and R 2 are hydrogen
  • R 4 is methyl or ethyl
  • R 5 is methyl
  • R 6 is hydrogen or methyl
  • L is carbonyl or hydroxymethanediyl
  • M is straight-chain (C 2 -C 5 ) -alkane-1, ⁇ ) -diyl, straight-chain (C 2 -C 5 ) -alkene-1, ⁇ -diyl or straight-chain (C 2 -C 5 ) -alkyne-1, ⁇ -diyl means for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of cardiac insufficiency.
  • cardiac insufficiency is cardiomyopathy-induced cardiac insufficiency selected from the group of cardiomyopathies consisting of dilated cardiomyopathy (DCM), restrictive cardiomyopathy (RCM), arrhythmogenic cardiomyopathy right ventricular cardiomyopathy (ARVCM), myocarditis and / or hypertrophic cardiomyopathy (HCM).
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • RCM restrictive cardiomyopathy
  • ARVCM arrhythmogenic cardiomyopathy right ventricular cardiomyopathy
  • HCM hypertrophic cardiomyopathy
  • Fig. 1 Comparison of the relative expression of PDE2A RNA in H9c2 cells after 72 h incubation with 1 micromole of arginine vasopressin. Shown is the expression of PDE2A relative to L32 ribosomal protein (rE) in H9c2 rat cardiomyocytes. The results are tabulated (mean of the relative expression rE from a triplicate, mean of the Ct values for PDE2A and L32).
  • Fig. 2 Relative expression of the hypertrophic marker MYHCB in H9C2 rat cells after stimulation by vasopression ⁇ PDE2A inhibitor BAY 60-7550.
  • vasopressin 0.1 micromol, 1 micromal, 10 micromol. It has been shown that the simultaneous presence of the PDE2A inhibitor BAY 60-7550 dose-dependently suppressed the induction of the hypertrophic marker MYHCB by vasopressin. Following are the Results listed in tabular form. (Mean of the relative expression rE from a duplicate determination).
  • Fig. 3 Change in intracellular cGMP concentration in H9c2 rat cardiomyocytes after stimulation with ANP in the presence of different concentrations of the PDE2A inhibitor BAY 60-7550. Shown is the cGMP content in the cells after 15 min incubation with ANP and the indicated dosages of the PDE2A inhibitor BAY 60-7550. It can be seen that the PDE2A inhibitor BAY 60-7550 increases dose-dependently and synergistically the intracellular cGMP level in the H9c2 cells.
  • Fig. 4 Change in heart weight compared to body weight (HW: BW) by subcutaneous isoprenaline (2 mg / kg / d) and the influence of enalapril as a positive control 810 mg / kg / d in drinking water) or the PDE2A inhibitor BAY 60-7550. Shown is the quotient of heart weight: body weight depending on the treatment. It turns out that the PDE2A inhibitor BAY 60-7550 given in two independent animal groups at 10 mg / kg / d (ip) for 5 days can suppress isoprenaline-induced weight gain almost as well as the positive control enalapril.
  • FIG. 5 shows the cDNA sequence of the human PDE2A (Accession No. NM_002599, SEQ ID NO: 1).
  • Figure 6 shows the amino acid sequence of human PDE2A (Accession No. NP_002590, SEQ ID NO: 2).
  • the relative expression of PDE2A in H9c2 rat cells is determined by quantifying the mRNA using the real-time polymerase chain reaction [7].
  • real-time PCR offers the advantage of more accurate quantification by introducing an additional, fluorescently labeled oligonucleotide.
  • This so-called probe contains the fluorescent dye FAM (6-carboy-fluorescein) at the 5 'end and the fluorescence quencher TAMRA (6-carboxy-tetramethylrhodamine) at the 3' end.
  • the fluorescence dye FAM is cleaved off the probe by the 5'-exonuclease activity of the Taq polymerase, thereby obtaining the previously quenched fluorescence signal.
  • the threshold value [treshold cyle (Ct value)] records the number of cycles at which the fluorescence intensity is approximately 10 standard deviations above the background fluorescence.
  • the total RNA is isolated from a 6-well (approximately 4 ⁇ 10 5 cells) using an RNeasy kit (Qiagen Hilden). 1 ⁇ g of total RNA per tissue is removed for 15 minutes at room temperature to remove contaminations with genomic DNA with 1 unit of DNase I (Invitrogen). Dnase I is inactivated by adding 1 ⁇ l of EDTA (25 mM) followed by heating to 65 ° C. (10 min).
  • the cDNA synthesis is carried out according to the instructions for the "SUPERSCRIPT- ⁇ RT cDNA synthesis kit" (Invitrogen) and the reaction volume is made up to 200 ⁇ l with distilled water.
  • the reaction volume is made up to 200 ⁇ l with distilled water.
  • the final concentration of the primers is 300 nM, that of the probe 150 nM
  • "Forward" and "reverse" primers for the rat PDE2A are: 5'-CCAAATCAGGGACCTCATATTCCO '(SEQ ID NO: 3) and 5'-GGTGTCCCACAAGTTCACCAT-3' (SEQ ID NO: 4), the sequence of the fluorescent Probe 5'-6FAM-AACAACTCGCTGGATTTCCTGGA-TAMRA-S '(SEQ ID NO: 5) "Forward" and "re
  • the PCR is carried out on an ABI Prism SDS 7700 instrument (Applied Biosystems) in accordance with the manufacturer's instructions. 40 cycles are carried out.
  • the Ct value (see above) obtained for each gene in the respective cDNA corresponds to the cycle in which the fluorescence intensity of the released probe is about 10 standard deviations above the background signal. The lower the Ct value, the sooner the duplication begins, ie the more mRNA is contained in the original sample.
  • the expression of a so-called "housekeeping gene” is analyzed in all the samples examined, which should always be expressed equally independently of the treatment of the cells L32 ribosomal protein is used
  • the sequence of the "forward" or "reverse” primer for rat L32 is 5'-GAAAGAGCAGCACAGCTGGC-S '(SEQ ID NO: 9), and 5'-TCATTCTCTTCGCTGCGTAGC-3' (SEQ ID NO: 10), the sequence of the probe 5'-6FAM-TCAGAGTCACCAATCCCAACGCCA-T AMRA-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • the evaluation of the data is carried out as follows: For each RNA, the dCt value is calculated.
  • H9c2 cells The determination of the intracellular cGMP content in H9c2 cells was carried out using the Biotrak (EIA) immunoassay from Amersham (catalog No. RPN 226) in accordance with the manufacturer's protocol. For this purpose 105 H9c2 cells / well are seeded overnight in 12 well plates and after washing with 1 ⁇ PBS (1 ml) for 15 min at room temperature with 800 ⁇ l medium without FCS and the indicated concentrations of the PDE2A inhibitor BAY 60- 7550 and ANP incubated. The supernatants are discarded and the cells are mixed with 500 ml ice-cold 70% ethanol.
  • EIA Biotrak
  • the plates After 2 minutes shaking at room temperature (150 u / min), the plates are frozen at -20 0 C overnight and transferred to the lysed cells after thawing in Eppendorf vessels. After evaporation of the ethanol in a Speed-Vac (3 h at 35 ° C), the samples are reconstituted in 200 ⁇ l assay buffer and worked up as indicated in the kit description. The measurement of Fluorescence is done at 450/570 in a Tecan Spectrafluor photometer. The OD values obtained are converted into fmol / well using the standard calibration curve according to the kit instructions.
  • PDE2A Assays Formats for identifying PDE2A inhibitors are known to those of skill in the art.
  • An example of a possible PDE2A activity test system format is described below.
  • Human PDE2A (GenBank / EMBL Accession Number: NM_002599, Rosman et al., Gene 1997, 191, 89-95) is expressed in Sf9 insect cells using the Bac-to-Bac TM baculovirus expression system. 48 h post-infection, cells are harvested and placed in lysis buffer (20 mL / L culture, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 50 mM NaCl, 1 mM MgC12, 1.5 mM EDTA, 10% glycerol, 20 ⁇ L Protease Inhibitor Cocktail Set in [CalBiochem, La Jolla, CA USA]). The cells are disrupted at 4 ° C for using ultrasound and then centrifuged for 30 min at 4 0 C at 15,000. The supernatant (PDE2A preparation) was collected and stored at -8O 0 C.
  • test substances are dissolved in 100% DMSO and serially diluted to determine their in vitro effect on PDE 2A. Typically, dilution series from 200 ⁇ M to
  • the substrate [5 ', 8-3H] adenosine 3', 5'-cyclic phosphate (1 ⁇ Ci / ⁇ L; Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ), is assayed 1: 2000 with assay buffer (50 mM Tris / HCl pH 7 5, 8.3 mM MgC12, 1.7 mM EDTA) to a concentration of 0.0005 ⁇ Ci / ⁇ L and cGMP (1 ⁇ M final concentration in the assay), which serves to stimulate PDE2. By adding 50 ⁇ L (0.025 ⁇ Ci) of this substrate solution, the enzyme reaction is finally started.
  • assay buffer 50 mM Tris / HCl pH 7 5, 8.3 mM MgC12, 1.7 mM EDTA
  • test mixtures are incubated for 60 min at room temperature and the reaction is stopped by addition of 25 ⁇ L of a suspension of 18 mg / mL Yttrium Scintillation Proximity Beads (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ).
  • the microtiter plates are sealed with a foil and left for 60 min at room temperature.
  • the plates are then measured for 30 seconds per well in a Microbeta scintillation counter (Wallac Inc., Atlanta, GA).
  • IC50 values are determined by plotting the concentration of the substance versus percent inhibition. Inhibition of PDEs 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10 and 11
  • the in vitro activity of test substances on recombinant PDE3B, PDE4B, PDE7B, PDE8A, PDE10A and PDEI IA is determined according to the assay protocol described above for PDE2A, with the exception that the cGMP used for the stimulation of PDE2A is not added to the assay.
  • the protocol is additionally modified as follows: For PDE1, calmodulin 10-7 M and CaC12 3 mM are additionally added to the reaction mixture.
  • substrate [8-3H] cGMP (1 ⁇ Ci / ⁇ L; Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ) is used in the dilution indicated above.
  • 25 ⁇ l of a PDE9A inhibitor dissolved in assay buffer e.g., BAY 73-6691, 5 ⁇ M final concentration
  • assay buffer e.g., BAY 73-6691, 5 ⁇ M final concentration
  • Inhibitors of PDE2A may also attack at the level of transcription or translation of PDE2A. Test systems for finding corresponding inhibitors are well known to the person skilled in the art.
  • mice (strain C57bl / 6) per dose group isoprenaline at a dose of 2 mg / kg / d administered subcutaneously for 5 days while the control group as a vehicle control received a saline solution.
  • a group of the ACE inhibitor enalapril is administered via the drinking water at a dose of 10 mg / kg / d during two additional groups in addition to isoprenaline the PDE2A inhibitor BAY 60-7550 intraperitoneally at a dose of 10 mg / kg / d was administered.
  • HW heart weight / body weight
  • the PDE2A inhibitors may be converted in a known manner into the usual formulations, such as tablets, dragees, pills, granules, aerosols, syrups, emulsions, suspensions and solutions, using inert, nontoxic, pharmaceutically suitable excipients or solvents.
  • the therapeutically active compound should be present in each case in a concentration of 0.5 to 90 wt .-% of the total mixture, i. in amounts sufficient to achieve the stated dosage margin.
  • the formulations are prepared, for example, by stretching the active ingredients with solvents and / or carriers, optionally using emulsifiers and / or dispersants, e.g. in the case of using water as the diluent, organic solvents may optionally be used as auxiliary solvents.
  • the application is carried out in a customary manner, preferably orally, transdermally, intravenously or parenterally, in particular orally or intravenously. But it can also be done by inhalation through the mouth or nose, for example by means of a spray, or topically on the skin.
  • Hassan MA, Ketat AF., Sildenafil citrate increases myocardial cGMP content in rat heart, decreases its hypertrophic response to isoproterenol and decreases myocardial leak of creatine kinase and troponin T, BMC Pharmacol. 2005 Apr 6; 5 (1): 10.
  • AVP arginine vasopressin
  • BW Body weight Ct: Threshold (threshold cycle)
  • HW heart weight
  • MYHCB myosin heavy chain, beta subunit (myosin heavy chain beta subunit)

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von PDE2A-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, akutem Myokardinfarkt, Myokardinfarktprophylaxe, Herzinsuffizienz, sowie Bluthochdruck und den Folgen der Atherosklerose, sowie Gefäßerkrankungen, Erkrankungen der Niere, insbesondere Nierenversagen, entzündlichen Erkrankungen, Erektionsstörungen und Verhinderung des plötzlichen Herztodes.

Description

Inhibition der PDE2A
Die Erfindung betrifft die Verwendung von PDE2A-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzerkrankungen, insbesondere der Herzinsuffizienz und ihr zugrunde liegende Kardiomyopathien wie die dilatative Kardiomyopathie (DCM), die restriktive Kardiomyopathie (RCM), die arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie (ARVCM), die Myokarditis und insbesondere die hypertrophische Kardiomyopathie (HCM). Darüber hinaus ist die Behandlung von Erektionsstörungen, Bluthochdruck und die Verhinderung der Arteriosklerose mit PDE2A Inhibitoren Gegenstand der Erfindung.
Die arterielle Hypertonie schädigt neben Gehirn, Nieren und Gefäßen vor allem auch das Herz. Vor Einführung der antihypertensiven Therapie war die arterielle Hypertonie die Hauptursache von Herzinsuffizienz und Myokardinfarkt. Auch heute noch ist das Risiko, herzinsuffizient zu werden und einen Herzinfarkt zu erleiden, selbst für einen antihypertensiv behandelten Hypertoniker größer als für einen Normotoniker. Die linksventrikuläre Hypertrophie ist der prinzipielle strukturelle Anpassungsmechanismus des Myokards an die chronische Druckbelastung im Verlauf der arteriellen Hypertonie. Das Ausmaß der Myokardhypertrophie nimmt mit der Höhe des Blutdruckes zu.
Im Frühstadium der arteriellen Hypertonie ist die systolische Wandspannung - die linksventrikuläre Nachlast - infolge der systolischen Druckbelastung, die auf der Ventrikelwand lastet, erhöht. Durch die sich entwickelnde Linksherzhypertrophie kommt es wieder zu einer Normalisierung der Wandspannung infolge Dickenzunahme der Myokardwände. In diesem Frühstadium der konzentrischen Linksherzhypertrophie ist der linke Ventrikel in der Lage, ein normales Herzzeitvolumen bei einem normalen kardialen Energieverbrauch pro Gewichtseinheit Myokard trotz hypertensiver systolischer Blutdruckwerte zu fordern. Bereits in diesem Stadium besteht eine Störung der diastolischen Funktion des linken Ventrikels.
Eine chronische Druckbelastung des linken Ventrikels führt zu einer abnormen Aktivierung fetaler Wachstumsfaktoren, die die Proteinbiosynthese und fetale Muskelgenprodukte verändern. Angiotensin II, Noradrenalin und andere Wachstumshormone haben eine wachstumsfördernde Wirkung auf das Myokard. Durch diese kommt es unabhängig von der systolischen Druckbelastung zu einer weiteren Stimulation der Entwicklung der Myokardhypertrophie. Abhängig vom Ausmaß der Wachstumshormone kann unter Umständen eine für die Blutdruckerhöhung überproportionale Myokardhypertrophie entstehen, die einer hypertrophen Kardiomyopathie ähnlich ist. Infolge der Tatsache, daß das adulte Myokardgewebe aufgrund der Blockade des Zellzyklus wenig oder gar nicht mehr zur Zellteilung fähig ist, resultiert auf molekularer Ebene eine pathologische Hypertrophiereaktion des Myokards. Eine Herzhypertrophie ist kein physiologischer Anpassungs- mechanismus an die chronische Dauerbelastung. Sie ist ein eigenständiger Risikofaktor für kardiale Ereignisse wie Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz und plötzlicher Herztod [I].
Therapieverfahren und Wirkstoffe, die die Herzhypertrophie verhindern sind somit zur Behandlung von Symptomen der oben genannten Erkrankungen geeignet.
Die DNA-Sequenz, die für die humane PDE2A kodiert, wird im Sequenzprotokoll in der SEQ ID NO: 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz der humanen PDE2A wird in der SEQ ID NO: 2 des Sequenzprotokolls gezeigt.
Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurde überraschenderweise in einem zellulären Hypertrophie-Modell beobachtet, dass die Expression der PDE2A-mRNA bei Induktion der Hypertrophie erhöht wird. Hierzu wurde der Ratten-Kardiomyozyten-Zellinie H9c2 (ATCC-Nummer: CRL- 1446) durch Arginin-Vasopressin ein Hypertrophie-Stimulus versetzt, der sich u. a. in einer erhöhten Expression von Markergenen für die Herzhypertrophie wie ANP (atriales natriuretisches Peptid) und MYHCB (myosin heavy chain beta-subunit) äußert [2]. Eine erhöhte Expression der cGMP- hydrolysierenden PDE2A kann den intrazellulären cGMP-Spiegel der Kardiomyozyten erniedrigen und dadurch die antihypertrophe Wirkung von cGMP supprimieren [3, 4]. Aus der vorliegenden Beobachtung kann abgeleitet werden, dass die erhöhte Expression der PDE2A in hypertrophen H9c2 -Zellen auch in vivo zur Pathogenese der Herzhypertrophie beiträgt, und eine Inhibition der PDE2A-Aktivität durch ein „small molecule drug" einen positiven Effekt auf die Herzhypertrophie hat, da der cGMP-Spiegel in den Kardiomyozyten hoch und somit die anti-hypertrophe Wirkung von cGMP erhalten bleibt [5]. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurden H9c2-Zellen mit Arginin-Vasopressin stimuliert und mit dem PDE2-Inhbitor BAY 60-7550 [6] inkubiert. Bei BAY 60-7550 handelt es sich um die Substanz 2-(3,4-Dimethoxybenzyl)-7-[l-(l-hydroxyethyl)-4- phenylbutyl]-5-methylimidazo[5,l-f][l,2,4]triazin-4(3H)-one mit der Strukturformel:
Figure imgf000003_0001
Wie in Abbildung 2 gezeigt, kann der PDE2A-Inhibitor BAY 60-7550 den Anstieg des Hypertrophie-Markergens MYHCB dosis-abhängig supprimieren. Zur Verifizierung, dass die Inkubation der H9c2-Zellen mit dem PDE2A-inhbitor BAY 60-7550 auch zur Erhöhung des intrazellulären cGMP-Spiegels führt und hierdurch antihypertroph wirkt, wurde der intrazelluläre cGMP-Gehalt nach Stimulation der cGMP-Synthese durch ANP in Gegenwart des PDE2A-Inhibitors BAY 60- 7550 mittels EIA bestimmt. Wie in Abbildung 3 zu erkennen, erhöht BAY 60-7550 dosis-abhängig den intrazellulären cGMP-Gehalt in H9c2 -Zellen. Zur Verifizierung der in v/fro-Befunde wurde die antihypertrophe Wirkung des PDE2-Inhibitors BAY 60-7550 in vivo in einem Maus- Hypertrophie-Modell untersucht. Hierzu wurde Mäusen vom Stamm C57BL6 einmal täglich 2 mg/kg Isoprenalin subkutan appliziert sowie als Positivkontrolle zusätzlich zum Isoprenalin 10 mg/kg Enalapril über das Trinkwasser verabreicht. BAY 60-7550 wurde parallel zur Isoprenalin- Injektion 2 x täglich mit einer Dosis von 10 mg/kg i. p. appliziert. Wie aus Abbildung 4 zu erkennen, erhöht die Infusion von Isoprenalin das Herzgewicht der Tiere in Relation zum Körpergewicht. Ebenso wie die Positivkontrolle Enalapril führte die Gabe des PDE2A-Inhibitors BAY 60-7550 in beiden Dosisgruppen zu einer deutlichen Verringerung des Verhältnisses von Herzgewicht zu Körpergewicht.
Aus den Daten ergibt sich, das eine PDE2A-Inhibition auch beim Menschen eine Herzhypertrophie verhindern könnte.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung von PDE2A-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder der Prophylaxe der folgenden Krankheiten: koronare Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, akuter Myokardinfarkt, Myokardinfarktprophylaxe, plötzlicher Herztod, Herzinsuffizienz, sowie Bluthochdruck und die Folgen der Atherosklerose, sowie Gefäßerkrankungen, Erkrankungen der Niere, und Erektionsstörungen.
Antagonisten im Sinne der Erfindung sind alle Substanzen, die eine Inhibition der biologischen Aktivität der PDE2A bewirken. Besonders bevorzugte Antagonisten sind Nukleinsäuren inklusive „locked nucleic acids", „peptide nucleic acids" und „Spiegelmere", Proteine inklusive Antikörper und niedermolekulare Substanzen, ganz besonders bevorzugte Antagonisten sind niedermolekulare Substanzen.
Die Erfindung betrifft:
1. Verwendung eines PDE2A Polypeptides oder einer Nucleinsäure, welche ein PDE2A Polypeptid kodiert in einem Testsystem für die Auffindung von Inhibitoren der PDE2A geeignet für die Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz und der ihr zugrunde liegenden Kardiomyopathien. - A -
Bei einer Nukleinsäure, die ein PDE2A-Polypeptid kodiert, handelt es sich um eine Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 2 sowie funktionelle Fragmente derselben umfasst;
b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz sowie funktionelle Fragmente derselben umfassen;
c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäure- molekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und welche die biologische Funktion einer PDE2A aufweisen, wobei man eine stringente Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen in einer wässrigen Lösung, die 0,2 x SSC (Ix Standard saline-citrate = 150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat) enthält, bei 680C durchführt (Sambrook et al., 1989); und
d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden.
Ein PDE2A Polypeptid im Sinne der Erfindung ist ein Polypeptid, welches von einer der unter a) - d) genannten Nukleinsäuren kodiert wird. Insbesondere ist ein Polypeptid umfassend die Sequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1 oder umfassend ein Fragment derselben, welches PDE2A-Aktivität aufweist, ein PDE2A Polypeptid.
2. Verwendung gemäß Punkt 1, wobei es sich um ein zellfreies Testsystem handelt.
3. Verwendung gemäß Punkt 1, wobei es sich um ein Testsystem unter Verwendung ganzer Zellen, die eine Nukleinsäure enthalten, welche eine PDE2A kodiert. Dabei kann die Nukleinsäure endogen vorhanden oder rekombinant eingebracht worden sein.
4. Verwendung gemäß Punkten 1 - 3, wobei eine PDE2A Aktivität gemessen wird.
5. Verwendung gemäß Punkt 4, wobei der cGMP bzw der GMP Spiegel gemessen wird.
6. Verwendung gemäß Punkten 1 - 3, wobei die Expression der PDE2A gemessen wird.
7. Verwendung gemäß Punkten 1 - 6, wobei es sich bei der Herzinsuffizienz um eine durch eine Kardiomyopathie ausgelöste Herzinsuffizienz handelt, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
8. Verwendung eines PDE2A-Inhibitors, welcher mittels einer der Verfahren gemäß Punkten 1 - 7 identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
9. Verwendung eines PDE2A-Inhibitors, welcher mittels einer der Verfahren gemäß Punkten 1 - 7 identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären
Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
10. Verwendung eines PDE2A-spezifischen Antikörpers, eines PDE2A-spezifischen antisense- Oligonukleotides oder einer PDE2A spezifischen siRNA zur Herstellung eines Arznei- mittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
11. Verwendung eines PDE2A-spezifischen Antikörpers, eines PDE2A-spezifischen antisense- Oligonukleotides oder einer PDE2A spezifischen siRNA zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM). Eine siRNA ist eine „short interfering RNA". Dem Fachmann sind Methoden bekannt, PDE2A spezifische antisense- Oligonukleotide, Antikörper oder siRNAs bereit zu stellen. Geeignete antisense-Oligonuk- leotide, siRNAs oder Antikörper führen letztendlich zu einer Inhibition der PDE2A
Aktivität. Dies kann über einen Mechanismus erfolgen, der direkt das PDE2A Protein involviert, oder aber auf Ebene der Transkription oder Translation der PDE2A ansetzt.
12. Verwendung von PDE2A-Inhibitor zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
13. Verwendung gemäß Punkt 12, wobei es sich bei der Herzinsuffizienz um eine durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardio- myopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
14. Verwendung nach Punkten 12 oder 13, wobei der PDE2A-Inhibitor einen IC50- Wert von weniger als 1 μM hat.
15. Verwendung nach Punkten 12 oder 13, wobei der PDE2A-Inhibitor einen IC50-Wert von weniger als 100 nM hat.
Die PDE2A-Inhibition kann z.B. im unten beschriebenen PDE2A-Inhibitionstest gemessen werden.
Dabei werden solche PDE2A-Antagonisten bevorzugt, die im unten angegebenen PDE2A- Inhibitionstest mit einem IC50 von 1 μM, bevorzugt mit einem IC50 von weniger als 0,1 μM inhibieren.
Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen PDE2A-Inhibitoren die Blut/Hirn Schranke nicht passieren und wirken systemisch und nicht zentral.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I),
Figure imgf000007_0001
wonn
R1 Phenyl, Naphthyl, Chinolinyl oder Isochinolinyl, die bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (Ci-C4)-Alkyl, (Ci-C4)- Alkoxy, Halogen, Cyano, -NHCOR8, -NHSO2R9, -SO2NR10R11, -SO2R12, und -NR13R14 substituiert sein können, bedeutet,
worin
R8, R10, R", R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff oder (CrC4)-Alkyl sind, und
R9 und R12 unabhängig voneinander (CrC4)-Alkyl sind, oder
R10 und R11 zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom einen Azetidin-1-yl-, Pyrrol- 1-yl-, Piperid-1-yl-, Azepin-1-yl, 4-Methyl-piperazin-l-yl- oder Morpholin-1-yl- Rest bilden,
oder
R13 und R14 zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom einen Azetidin-1-yl-, Pyrrol- 1-yl-, Piperid-1-yl-, Azepin-1-yl, 4-Methyl-piperazin-l-yl- oder Morpholin-1-yl- Rest bilden,
R2 und R3 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Fluor bedeuten,
R4 (C-C.)-Alkyl bedeutet.
R5 (C,-C3)-Alkyl bedeutet,
R6 Wasserstoff oder Methyl bedeutet,
R7 Phenyl, Thiophenyl, Furanyl, die bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (Ci-Ct)-Alkyl, (Ci-C4)-Alkoxy, Halogen und Cyano substituiert sein können, oder (C5-C8)-Cycloalkyl bedeutet,
L Carbonyl oder Hydroxymethandiyl bedeutet, und
M (C2-C5)-Alkandiyl, (C2-C5)-Alkendiyl oder (C2-C5)-Alkindiyl bedeutet,
und deren physiologisch verträgliche Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
CG-QVAlkyl und (C1-GVAIkVl stehen im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 4 bzw. 1 bis 3 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt: Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, i-, s-, t-Butyl. Bevorzugt sind Methyl und Ethyl.
(Cr-CO-Alkandiyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkandiylrest mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt Ethylen, Propan-1,3- diyl, Propan-l,2-diyl, Propan-2,2-diyl, Butan-l,3-diyl, Butan-2,4-diyl, Pentan-2,4-diyl. Bevorzugt ist ein geradkettiger (C2-C5)-Alkan-l,ω-diyl-Rest. Beispielsweise seien genannt Ethylen, Propan-l,3-diyl, Butan- 1,4-diyl, Pentan-l,5-diyl. Besonders bevorzugt sind Propan- 1,3 -diyl und Butan- 1,4-diyl. (C2-dV)-Alkendiyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkendiylrest mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt Ethen-l,2-diyl, Ethen- 1,1-diyl, Propen- 1,1-diyl, Propen- 1,2-diyl, Prop-2-en-l,3-diyl, Propen-3,3-diyl, Propen-2,3-diyl, But-2-en-l,4-diyl, Pent-2-en-l,4-diyl. Bevorzugt ist ein geradkettiger (C2-C5)-Alken-l,(o-diyl-Rest. Beispielsweise seien genannt Ethen- 1,2-diyl, Prop-2-en-l,3-diyl, But-2-en-l,4-diyl, But-3-en-l,4- diyl, Pent-2-en-l,5-diyl, Pent-4-en-l,5-diyl. Besonders bevorzugt sind Prop-2-en-l,3-diyl, But-2- en-l,4-diyl und But-3-en-l,4-diyl.
(Cϊ-CsVAlkindiyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkindiylrest mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt Ethin-l,2-diyl, Ethin- 1,1 -diyl, Prop-2-in- 1 ,3 -diyl, Prop-2-in- 1 , 1 -diyl, But-2-in- 1 ,4-diyl, Pent-2-in- 1 ,4-diyl. Bevorzugt ist ein geradkettiger (C2-C5)-Alken-l,ω-diyl-Rest. Beispielsweise seien genannt Ethin- 1,2-diyl, Prop- 2-in-l,3-diyl, But-2-in-l,4-diyl, But-3-in-l,4-diyl, Pent-2-in-l,5-diyl, Pent4-in-l,5-diyl. Besonders bevorzugt sind Prop-2-in-l,3-diyl, But-2-in-l ,4-diyl und But-3-in-l,4-diyl.
(C1-Q)-AIkOXy steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt: Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, t-Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy. Bevorzugt sind Methoxy und Ethoxy.
(Cs-CgVCycloalkyl steht im Rahmen der Erfindung für Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl oder Cyclooctyl. Bevorzugt seien genannt: Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cycloheptyl.
Halogen steht im Rahmen der Erfindung im allgemeinen für Fluor, Chlor, Brom und Jod. Bevorzugt sind Fluor, Chlor und Brom. Besonders bevorzugt sind Fluor und Chlor.
Als Salze sind im Rahmen der Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen können Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Stoffe mit Mineralsäuren, Carbonsäuren oder Sulfonsäuren sein. Besonders bevorzugt sind z.B. Salze mit Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzol- sulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure oder Benzoesäure.
Als Salze können aber auch Salze mit üblichen Basen genannt werden, wie beispielsweise Alkali- metallsalze (z.B. Natrium- oder Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- oder Magnesiumsalze) oder Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen wie beispiels- weise Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Prokain, Dibenzylamin, N-Methyl- morpholin, Dihydroabietylamin, 1-Ephenamin oder Methyl-piperidin.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in stereoisomeren Formen, die sich entweder wie Bild und Spiegelbild (Enantiomere), oder die sich nicht wie Bild und Spiegelbild (Diastereomere) verhalten, existieren. Die Erfindung betrifft sowohl die Enantiomeren oder Diastereomeren oder deren jeweilige Mischungen. Die Racemformen lassen sich ebenso wie die Diastereomeren in bekannter Weise in die stereoisomer einheitlichen Bestandteile trennen.
Bevorzugt ist die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I), wobei R1 Phenyl, dessen meta- und/oder para-Positionen bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (CrC4)-Alkyl, (CrC4)-Alkoxy und -SO2NR10R11 substituiert sind, bedeutet, und R2, R3, R4, R5, R6, R7 , R10, R11, L und M die oben angegebene Bedeutung haben zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
Unter den meta- und para-Positionen des Phenylringes sind diejenigen Positionen zu verstehen, die meta bzw. para zur CR2R3 -Gruppe stehen. Diese Positionen können durch die folgende Strukturformel (Ic) veranschaulicht werden:
Figure imgf000010_0001
Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (Ic), in welchen die para- und eine meta-Position des Phenylrestes substituiert sind, und die zweite meta- Position unsubstituiert ist zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
Ebenso bevorzugt ist die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I), wobei R7 Phenyl bedeutet und R1, R2, R3, R4, R5, R6, L und M die oben angegebene Bedeutung haben zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I),
wobei R1 Phenyl, dessen meta- und/oder para-Positionen bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (Ci-C4)-Alkyl, (CrC4)-Alkoxy und -SO2NR10R" substituiert sind, Naphthyl oder Chinolinyl bedeutet,
worin R10 und R11 unabhängig voneinander Wasserstoff oder (CrC4)-Alkyl sind,
R1 und R2 Wasserstoff bedeuten,
R4 Methyl oder Ethyl bedeutet,
R5 Methyl bedeutet,
R6 Wasserstoff oder Methyl bedeutet,
L Carbonyl oder Hydroxymethandiyl bedeutet, und
M geradkettiges (C2-C5)-Alkan-l,α)-diyl, geradkettiges (C2-C5)-Alken-l,ω-diyl oder geradkettiges (C2-C5)-Alkin-l,ω-diyl bedeutet zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
Ebenso bevorzugt ist die Verwendung der Substanz 2-(3,4-Dimethoxybenzyl)-7-[l-(l-hydroxy- ethyl)-4-phenylbutyl]-5-methylimidazo[5,l-f][l,2,4]triazin-4(3H)-one mit der Strukturformel:
Figure imgf000011_0001
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
Bevorzugt ist auch die oben beschriebene Verwendung der oben offenbarten Strukturformeln, wobei es sich bei der Herzinsuffizienz um eine durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechts- ventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM). Die vorgehend beschriebenen Verbindung, ihre Wirkung als PDE2-Inhibitoren sowie Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus WO 02/050078 Al bekannt.
Beschreibung der Figuren:
Fig. 1: Vergleich der relativen Expression der PDE2A-RNA in H9c2 -Zellen nach 72 h Inkubation mit 1 micromol Arginin- Vasopressin. Dargestellt ist die Expression der PDE2A relativ zu L32 ribosomal protein (rE) in H9c2-Rattenkardiomyozyten. Die Ergebnisse sind tabellarisch dargestellt (Mittelwert der relativen Expression rE aus einer Dreifachbestimmung. Mittelwert der Ct-Werte für PDE2A und L32).
Ct r-PDE2A Ct r-L32 rE MW STABW
Control
29,35 17,35 160,90 159,73 12,15
Control
29,47 17,35 147,03
Control
29,48 17,01 171,25
Vasopressin lμM
30,89 16,31 584,07 613,64 228,15
Vasopressin l μM
32,38 16,23 401,71
Vasopressin l μM
31,14 16,55 855,13
Fig. 2: Relative Expression des Hypertrophiemarkers MYHCB in H9C2 -Ratten-Zellen nach Stimulation durch Vasopression ± PDE2A-Inhibitor BAY 60-7550.
Dargestellt ist die Expression von ANP und MYHCB relativ zu L32 ribosomalem Protein in
H9C2-Zellen nach 72 h Inkubation mit Vasopressin (0,1 micromol, 1 micromal, 10 micromol). Es zeigt sich, dass die gleichzeitige Gegenwart des PDE2A-Inhibitors BAY 60-7550 dosis-abhängig die Induktion des Hypertrophiemarkers MYHCB durch Vasopressin supprimiert. Folgend sind die Ergebnisse tabellarisch aufgelistet. (Mittelwert der relativen Expression rE aus einer Doppelbestimmung).
Ct r-MYHCB Ct r-L32 rE MW STABW
Control
34,99 16,07 0,53 Control 34,77 15,69 0,47 0,50 0,03
Vasopressin 1 μM 30,01 16,29 19,43 Vasopressin 1 μM
2,20 30,21 16,12 15,03 17,23
Vasopressin 1 μM + 0,1 μM BAY 60-7550 31,97 17,14 9,00
Vasopressin 1 μM + 0,1 μM BAY
3,44 60-7550 30,46 16,45 15,89 12,44
Vasopressin 1 μM + 1 μM BAY 60- 7550 32,76 17,16 5,28
Vasopressin 1 μM + 1 μM BAY 60- 7550 31,12 3,26
16,68 11,79 8,54
Vasopressin 1 μM + 10 μM BAY 60-7550 32,72 16,91 4,56
Vasopressin 1 μM + 10 μM BAY 60-7550 33,75 0,78
17,34 3,01 3,79
Fig. 3: Änderung der intrazellulären cGMP-konzentration in H9c2-Rattenkardiomyozyten nach Stimulation mit ANP in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen des PDE2A-Inhbitors BAY 60-7550. Dargestellt ist der cGMP-Gehalt in den Zellen nach 15 min Inkubation mit ANP sowie den angegeben Dosierungen des PDE2A-Inhibitors BAY 60-7550. Es zeigt sich, das der PDE2A- inhbitor BAY 60-7550 dosis-abhängig und synergistisch den intrazelluären cGMP-Spiegel in den H9c2-Zellen erhöht.
Fig. 4: Veränderung des Herzgewichtes im Vergleich zum Körpergewicht (HW: BW) durch subkutane Isoprenalingabe (2 mg/kg/d) und der Einfluss von Enalapril als Positivkontrolle 810 mg/kg/d im trinkwasser) bzw. des PDE2A-Hemmers BAY 60-7550. Dargestellt ist der Quotient aus Herzgewicht:Körpergewicht in Abhängigkeit von der Behandlung. Es zeigt sich, das der PDE2A-Hemmer BAY 60-7550 in zwei unabhängigen Tiergruppen bei 10 mg/kg/d (i. p.) für 5 Tage gegeben die Isoprenalin-induzierte Herzgewichtszunahme nahezu so gut supprimieren kann, wie die Positivkontrolle Enalapril.
Fig. 5: Figur 5 zeigt die cDNA-Sequenz der humanen PDE2A (Accession-No. NM_002599, SEQ ID NO: 1).
Fig. 6: Figur 6 zeigt die Aminosäure-Sequenz der humanen PDE2A (Accession-No. NP_002590, SEQ ID NO:2).
Untersuchungen PDE2A-Expression und der MYHCB-Expression in H9c2-Rattenzellen.
Die relative Expression der PDE2A in H9c2-Rattenzellen wird durch die Quantifizierung der mRNA mittels der Echtzeit-Polymerasekettenreaktion ermittelt [7]. Gegenüber der klassischen PCR bietet die Echtzeit-PCR den Vorteil einer genaueren Quantifizierung durch Einführung eines zusätzlichen, fluoreszenzmarkierten Oligonucleotides. Diese sogenannte Sonde enthält am 5 '-Ende den Fluoreszenzfarbstoff FAM (6-Carboy-Fluorescein) und am 3 '-Ende den Fluoreszenzquencher TAMRA (6-Carboxy-tetramethylrhodamin). Während der Polymerasekettenreaktion wird in der TaqMan-PCR durch die 5'-Exonukleaseaktivtät der Taq-Polymerase der Fluoreszenzfarbstoff FAM von der Sonde abgespalten und dadurch das vorher gequenchte Fluoreszenzsignal erhalten. Als sog. Schwellenwert [treshold cyle (Ct- Wert)] wird die Zyklenzahl aufgezeichnet, bei der die Fluoreszenzintensität ca. 10 Standardabweichungen über der Hintergrund-Fluoreszenz liegt.
Aus den H9c2-Rattenkardiomyozyten wird aus einem 6-well (ca. 4 x 105 Zellen) die Gesamt-RNA mittels eines RNeasy Kits (Qiagen Hilden) isoliert. Je 1 μg Gesamt-RNA je Gewebe wird zur Entfernung von Kontaminationen mit genomischer DNA mit 1 Einheit DNase I (Fa. Invitrogen) für 15 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Inaktivierung der Dnase I erfolgt durch Zugabe von 1 μl EDTA (25 mM) und nachfolgendes Erhitzen auf 65°C (10 min).
Anschließend wird im selben Reaktionsansatz die cDNA-Synthese gemäß der Anleitung zum „SUPERSCRIPT-π RT cDNA synthesis kit" (Fa. Invitrogen) durchgeführt und das Reaktionsvolumen mit destilliertem Wasser auf 200 μl aufgefüllt. Für die PCR wird zu je 5 μl der verdünnten cDNA-Lösung 7,5 μl Gemisch von Primer und Sonde sowie 12,5 μl TaqMan-Reaktions- lösung (qPCR-Mastermix, Fa. Eurogentec) gegeben. Die Endkonzentration der Primer ist jeweils 300 nM, die der Sonde 150 nM. Die Sequenz des „forward"- und „reverse"-Primers für die Ratten- PDE2A lautet: 5'-CCAAATCAGGGACCTCATATTCCO' (SEQ ID NO:3) bzw. 5'- GGTGTCCCACAAGTTCACCAT-3' (SEQ ID NO:4), die Sequenz der fluoreszierenden Sonde 5'-6FAM-AACAACTCGCTGGATTTCCTGGA-TAMRA-S' (SEQ ID NO:5). Die Sequenz des „forward"- und „reverse"-Primers für r-MYHCB lautet: : 5'-TGGAGAACGACAAGCAGCAG-S ' (SEQ ID NO:6) bzw. 5'-CCTGGCGTTGAGTGCATTTA-S' (SEQ ID NO:7), die Sequenz der fluoreszierenden Sonde 5'-6FAM- TGGATG AGCGACTC AAAAAG AAGG ACTTTG-T AMRA- 3' (SEQ ID NO:8).
Die PCR erfolgt auf einem ABI-Prism-SDS-7700-Gerät (Fa. Applied Biosystems) gemäß der Anleitung des Herstellers. Dabei werden 40 Zyklen durchgeführt. Der Ct-Wert (s. o.) der für das jeweilige Gen in der betreffenden cDNA erhalten wird, entspricht dem Zyklus, in dem die Fluoreszenzintensität der freigesetzten Sonde ca. 10 Standardabweichungen über dem Hintergrundsignal liegt. Je niedriger der Ct-Wert, umso früher beginnt also die Vervielfältigung, d. h. je mehr mRNA ist in der ursprünglichen Probe enthalten. Zum Ausgleich eventueller Schwankungen bei der cDNA-Synthese wird in allen untersuchten Proben auch die Expression eines sog. „Haushaltsgenes" analysiert, welches unabhängig von der Behandlung der Zellen immer gleich stark exprimiert werden sollte. Für die Normierung der PDE2A-Expression in H9c2-Zellen wird L32 ribosomales Protein verwendet. Die Sequenz des „forward"- bzw. „reverse" Primers für Ratten- L32 ist 5'-GAAAGAGCAGCACAGCTGGC-S' (SEQ ID NO:9), und 5'- TCATTCTCTTCGCTGCGTAGC-3' (SEQ ID NO: 10), die Sequenz der Sonde 5'-6FAM- TCAGAGTCACCAATCCCAACGCCA-T AMRA-3' (SEQ ID NO: 11). Die Auswertung der Daten wird folgendermaßen durchgeführt: Für jede RNA wird der dCt-Wert berechnet. Der dCt-Wert ist die Differenz zwischen dem Ct- Werte für das Kandidatengen (also: MYHCB oder PDE2A) und dem Ct-Wert des Haushaltsgens im jeweiligen Gewebe. Aus diesem Wert wird nach folgender Formel eine relative Expression rE berechnet: rE = 2 (18-dC,)_
Bestimmung des cGMP-Gehaltes in H9c2-Zellen nach Präinkubation mit dem PDE2A- inhibitor BAY 60-7550
Die Bestimmung des intrazellulären cGMP-Gehaltes in H9c2-Zellen erfolgte mit dem Biotrak (EIA) Immunoassay der Fa. Amersham (Katalog-Nr. RPN 226) entsprechend dem Herstellerprotokoll. Hierzu werden 105 H9c2-Zellen/well über Nacht in 12 well-Platten ausgesät und nach dem Waschen mit 1 x PBS (1 ml) für 15 min bei Raumtemperatur mit 800 μl Medium ohne FCS und den angegeben Konzentrationen des PDE2A-Inhibitors BAY 60-7550 sowie ANP inkubiert. Die Überstände warden verworfen und die Zellen mit 500 ml eiskaltem 70%igen Ethanol versetzt. Nach 2 min Schütteln bei Raumtemperatur (150 u/min) werden die Platten bei -200C über Nacht gefroren und die lysierten Zellen nach dem Auftauen in Eppendorfgefäße überführt. Nach dem Verdampfen des Ethanols in einer Speed- Vac (3 h bei 35°C) werden die Proben in 200 μl "assay buffer" rekonstituiert und wie in der Kitbeschreibung angegeben aufgearbeitet. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt bei 450/570 tun in einem Tecan Spectrafluor-Photometer. Die erhaltenen OD- Werte werden anhand der Standard-eichkurve gemäß der kitanleitung in fmol/well umgerechnet.
Test der PDE2A-Inhibition
PDE2A-Asssay Formate zur Identifizierung von PDE2A Inhibitoren sind dem Fachmann bekannt. Ein Beispiel für ein mögliches PDE2A-Aktivitäts Testsystem-Format wird im Folgenden beschrieben.
Humane PDE2A (GenBank/EMBL Accession Number: NM_002599, Rosman et al. Gene 1997 191, 89-95) wird in Sf9 Insektenzellen mit Hilfe des Bac-to-BacTM Baculovirus Expressionssystems exprimiert. 48 h nach der Infektion werden die Zellen geerntet und in Lysispuffer (20 mL/lL Kultur, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 50 mM NaCl, 1 mM MgC12, 1,5 mM EDTA, 10% Glycerin, 20 μL Protease Inhibitor Cocktail Set in [CalBiochem, La Jolla, CA USA]) suspendiert. Die Zellen werden bei 4°C für mit Hilfe von Ultraschall aufgeschlossen und anschließend für 30 Minuten bei 40C bei 15000 x g zentrifugiert. Der Überstand (PDE2A Präparat) wurde gesammelt und bei -8O0C aufbewahrt.
Die Testsubstanzen werden zur Bestimmung ihrer in vitro Wirkung an PDE 2A in 100% DMSO aufgelöst und seriell verdünnt. Typischerweise werden Verdünnungsreihen von 200 μM bis
1.6 μM hergestellt (resultierende Endkonzentrationen im Test: 4 μM bis 0,032 μM). Jeweils 2 μL der verdünnten Substanzlösungen werden in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten (Isoplate; Wallac Inc., Atlanta, GA) vorgelegt. Anschließend werden 50 μL einer Verdünnung des oben beschriebenen PDE2A Präparates hinzugefügt. Die Verdünnung des PDE2A Präparates wird so gewählt, dass während der späteren Inkubation weniger als 70% des Substrates umgesetzt wird (typische Verdünnung: 1 : 200 000; Verdünnungspuffer: 50 mM Tris/HCl pH 7,5; 8,3 mM MgC12;
1.7 mM EDTA, 0,2% BSA). Das Substrat, [5',8-3H] adenosine 3', 5'-cyclic phosphate (1 μCi/μL; Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ), wird 1:2000 mit Assaypuffer (50 mM Tris/HCl pH 7,5; 8,3 mM MgC12; 1,7 mM EDTA) auf eine Konzentration von 0,0005μCi/μL verdünnt und cGMP (1 μM Endkonzentration im Assay), das der Stimulation der PDE2 dient, zugesetzt. Durch Zugabe von 50 μL (0,025 μCi) dieser Substrat-Lösung wird die Enzymreaktion schließlich gestartet. Die Testansätze werden für 60 min bei Raumtemperatur inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von 25 μL einer Suspension mit 18 mg/mL Yttrium Scintillation Proximity Beads (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ.) gestoppt. Die Mikrotiterplatten werden mit einer Folie versiegelt und für 60 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend werden die Platten für 30 s pro Vertiefung in einem Microbeta Szintillationzähler (Wallac Inc., Atlanta, GA) vermessen. IC50-Werte werden anhand der graphischen Auftragung der Substanzkonzentration gegen die prozentuale Inhibition bestimmt. Inhibition der PDEs 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10 und 11
Rekombinante humane PDE3B (GenBank/EMBL Accession Number: NM_000922, Miki et al. Genomics 1996 36, 476-485), PDE4B (GenBank/EMBL Accession Number: NM_002600, Obernolte et al. Gene. 1993 129, 239-247), PDE7B (GenBank/EMBL Accession Number: NM_018945, Hetman et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2000 97, 472-476), PDE8A (GenBank/EMBL Accession Number: AF_056490, Fisher et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998 246, 570-577), PDE9A (GenBank/EMBL Accession Number: NM_002606, Fisher et al. J. Biol. Chem. 1998 273, 15559-15564), PDE10A (GenBank/EMBL Accession Number: NM_06661, Fujishige et al. J. Biol. Chem. 1999 274, 18438-45, PDEI lA (GenBank/EMBL Accession Number: NM_016953, Fawcett et al. Proc. Natl. Acad. Sei 2000 97, 3702-3707) wurden mit Hilfe des pF ASTBAC Baculovirus Expressionssystems (GibcoBRL) in Sf9 Zellen exprimiert. Bovine PDEl wurde von Sigma-Aldrich bezogen (P 9529). PDE5 wurde aus humanen Blutplättchen durch Ultraschallbehandlung, gefolgt von einer Zentrifugation und Säulen-Chromatographie des Überstandes an Mono Q 10/10 (linearer NaCl-Gradient, Elution mit 0,2-0,3 M NaCl in 20 mM Hepes pH7,2, 2 mM MgC12) gereinigt.
Die in vitro Wirkung von Testsubstanzen an rekombinanter PDE3B, PDE4B, PDE7B, PDE8A, PDE10A und PDEI lA wird nach dem oben für PDE2A beschriebenen Testprotokoll bestimmt, wobei dem Assay nicht das für die Stimulation von PDE2A verwendete cGMP zugesetzt wird. Für die Bestimmung einer entsprechenden Wirkung an PDEl, PDE5 und PDE9A wird das Protokoll darüber hinaus wie folgt modifiziert: Bei PDEl werden zusätzlich Calmodulin 10-7 M und CaC12 3 mM zum Reaktionsansatz gegeben. Bei PDE5 und PDE9A findet als Substrat [8-3H] cGMP (1 μCi/μL; Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ) in oben genannter Verdünnung Verwendung. Um die PDE9A-Reaktion zu stoppen werden 25 μl eines in Assay-Puffer gelösten PDE9A-Inhibitors (z.B. BAY 73-6691, 5 μM Endkonzentration) direkt vor Hinzufügen der Yttrium Scintillation Proximity Bead-Suspension zugegeben.
Inhibitoren der PDE2A können auch auf Ebene der Transkription oder Translation der PDE2A angreifen. Testsysteme zur Auffindung entsprechender Inhibitoren sind dem Fachmann wohlbekannt.
Test der PDE2A-Inhibitoren auf anti-hypertrophe Wirkung in vivo:
Zur Testung der antihypertrophen Wirkung des PDE2A-inhbitors BAY 60-7550 wird das sogenannte Maus-Isoprenalin-Modell verwendet [ ]. Hierbei wird 8 Mäusen (Stamm C57bl/6) je Dosisgruppe Isoprenalin mit einer Dosis von 2 mg/kg/d für 5 Tage subkutan appliziert während die Kontrollgruppe als Vehikelkontrolle eine Kochsalzlösung erhielt. Als Positivkontrolle wurde zu- sätzlich zum Isoprenalin einer Gruppe der ACE-Hemmer Enalapril über das Trinkwasser in einer Dosis von 10 mg/kg/d verabreicht während zwei weiteren Gruppen zusätzlich zu Isoprenalin der PDE2A-Inhibitor BAY 60-7550 intraperitoneal mit einer Dosis von 10 mg/kg/d verabreicht wurde. Als Gradmaß für die Herzhypertrophie wird der Quotient aus Herzgewicht/Körpergewicht (HW:BW) nach 5 d bestimmt und die Wirkung der Substanzen in Relation zur Wirkung des Isoprenalins gesetzt.
PDE2A-Inhibitoren Formulierungen
Die PDE2A-Inhibitoren können in bekannter Weise in die üblichen Formulierungen überführt werden, wie Tabletten, Dragees, Pillen, Granulate, Aerosole, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen und Lösungen, unter Verwendung inerter, nicht toxischer, pharmazeutisch geeigneter Trägerstoffe oder Lösungsmittel. Hierbei soll die therapeutisch wirksame Verbindung jeweils in einer Konzentration von 0,5 bis 90 Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein, d.h. in Mengen, die ausreichend sind, um den angegebenen Dosierungsspielraum zu erreichen.
Die Formulierungen werden beispielsweise hergestellt durch Strecken der Wirkstoffe mit Lösungs- mittein und/oder Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln, wobei z.B. im Fall der Benutzung von Wasser als Verdünnungsmittel gegebenenfalls organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel verwendet werden können.
Die Applikation erfolgt in üblicher Weise, vorzugsweise oral, transdermal, intravenös oder parenteral, insbesondere oral oder intravenös. Sie kann aber auch durch Inhalation über Mund oder Nase, beispielsweise mit Hilfe eines Sprays erfolgen, oder topisch über die Haut.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, Mengen von etwas 0,001 bis 10 mg/kg, bei oraler Anwendung vorzugsweise etwa 0,005 bis 3 mg/kg Körpergewicht zur Erzielen wirksamer Ergebnisse zu verabreichen.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit vom Körpergewicht bzw. der Art des Applikationsweges, vom individuellen
Verhalten gegenüber dem Medikament, der Art von dessen Formulierung und dem Zeitpunkt bzw.
Intervall, zu welchen die Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen. Literatur
1. Scherer, CR, Dissertation Univ. Frankfurt, 2002.
2. Brostrom MA, Reilly BA, Wilson FJ, Brostrom CO. Vasopressin-induced hypertrophy in H9c2 heart-derived myocytes. Int J Biochem Cell Biol. 2000 Sep;32(9):993-1006.
3. Calderone A, Thaik CM, Takahashi N, Chang DL, Colucci M., Nitric oxide, atrial natriuretic peptide, and cyclic GMP inhibit the growth-promoting effects of norepinephrine in cardiac myocytes and fibroblasts. J. Clin Invest. 1998 Feb 15;101(4):812-8.
4. Booz GW, Putting the brakes on cardiac hypertrophy: exploiting the NO-cGMP counter- regulatory System. Hypertension. 2005 Mar;45(3):341-6.
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7. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM., Real time quantitative PCR. Genome Res 6 (1996), 986-994.
8. Hassan MA, Ketat AF., Sildenafil citrate increases myocardial cGMP content in rat heart, decreases its hypertrophic response to isoproterenol and decreases myocardial leak of creatine kinase and troponin T, BMC Pharmacol. 2005 Apr 6;5(1): 10.
Abkürzungen
ANP Atriales natriuretisches Peptid
AVP: Arginin- Vasopressin
BW: Körpergewicht (body weight) Ct: Schwellenwert (threshold cycle)
HW: Herzgewicht (heart weight)
MYHCB: Myosin schwere Kette, Beta-Untereinheit (myosin heavy chain beta-subunit)
PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung (phosphate-buffered saline) rE: relative Expression SD: Standardabweichung

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines PDE2 A Polypeptides oder einer Nucleinsäure, welche für ein PDE2A Polypeptid kodiert in einem Testsystem für die Auffindung von Inhibitoren der PDE2A geeignet für die Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz und der ihr zugrunde liegenden Kardiomyopathien, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei es sich um ein zellfreies Testsystem handelt.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei es sich um ein Testsystem unter Verwendung ganzer Zellen, die eine Nukleinsäure enthalten, welche eine PDE2A kodiert.
4. Verwendung gemäß Ansprüchen 1 -3, wobei eine PDE2A Aktivität gemessen wird.
5. Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei der cGMP bzw der GMP Spiegel gemessen wird.
6. Verwendung gemäß Ansprüchen 1 - 3, wobei die Expression der PDE2A gemessen wird.
7. Verwendung gemäß Ansprüchen 1 - 6, wobei es sich bei der Herzinsuffizienz um eine durch eine Kardiomyopathie ausgelöste Herzinsuffizienz handelt, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
8. Verwendung eines PDE2A-Inhibitors, welcher mittels eines der Verfahren gemäß Ansprüchen 1 - 7 identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötz- liehen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
9. Verwendung eines PDE2A-Inhibitors, welcher mittels eines der Verfahren gemäß Ansprüchen 1 - 7 identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, aus- gewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechts- ventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
10. Verwendung eines PDE2A-spezifischen Antikörpers, eines PDE2A-spezifischen antisense- Oligonukleotides oder einer PDE2A spezifischen siRNA zur Herstellung eines Arznei- mittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren
Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
11. Verwendung eines PDE2A-spezifischen Antikörpers, eines PDE2A-spezifischen antisense- Oligonukleotides oder einer PDE2A spezifischen siRNA zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
12. Verwendung von einem PDE2A-Inhibitor zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von
Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
13. Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei es sich bei der Herzinsuffizienz um eine durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie
(ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
14. Verwendung einer Verbindungen der allgemeinen Formel (I),
Figure imgf000023_0001
worin
R1 Phenyl, Naphthyl, Chinolinyl oder Isochinolinyl, die bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (d-C4)-Alkyl, (CrC4)-Alkoxy, Halogen, Cyano -NHCOR8, -NHSO2R9, -SO2NR10R11, -SO2R12, und -NR13R14 substituiert sein können, bedeutet,
worin
R8, R10, R", R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff oder (CrC4)-Alkyl sind, und
R9 und R12 unabhängig voneinander (d-C4)-Alkyl sind,
oder
R10 und R11 zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom einen Azetidin-1-yl-, Pyrrol-1-yl-, Piperid-1-yl-, Azepin-1-yl, 4-Methyl-piperazin-l-yl- oder Morpholin-1-yl-Rest bilden,
oder
R13 und R14 zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom einen Azetidin-1-yl-, Pyrrol-1-yl-, Piperid-1-yl-, Azepin-1-yl, 4-Methyl-piperazin-l-yl- oder Morpholin-1-yl-Rest bilden,
R2 und R3 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Fluor bedeuten,
R4 (C-C.)-Alkyl bedeutet.
R5 (C,-C3)-Alkyl bedeutet,
R6 Wasserstoff oder Methyl bedeutet, R7 Phenyl, Thiophenyl, Furanyl, die bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (CrC4)-Alkyl, (Ci-C4)-Alkoxy, Halogen und Cyano substituiert sein können, oder (C5-C8)-Cycloalkyl bedeutet,
L Carbonyl oder Hvdroxymethandiyl bedeutet, und
M (C2-C5)-Alkandiyl, (C2-C5)-Alkendiyl oder (C2-C5)-Alkindiyl bedeutet,
und deren physiologisch verträgliche Salze
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthoch- drucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
15. Verwendung von Verbindungen wie in Anspruch 14 definiert, wobei R1 Phenyl, dessen meta- und/oder para-Positionen bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (CrC4)-Alkyl, (CrC4)-Alkoxy und -SO2NR10R" substituiert sind, bedeutet und worin R10 und R11 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
16. Verwendung von Verbindungen wir in Anspruch 14 oder 15 definiert, wobei R7 Phenyl bedeutet, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von
Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
17. Verwendung von Verbindungen wie in Anspruch 14 definiert,
wobei
R1 Phenyl, dessen meta- und/oder para-Positionen bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (Ci-C4)-Alkyl, (C,-C4)-Alkoxy und -SO2NR10R1 ' substituiert sind, Naphthyl oder Chinolinyl bedeutet,
worin R10 und R11 unabhängig voneinander Wasserstoff oder (Ci-C4)-Alkyl sind,
R1 und R2 Wasserstoff bedeuten,
R4 Methyl oder Ethyl bedeutet,
R5 Methyl bedeutet,
R6 Wasserstoff oder Methyl bedeutet,
L Carbonyl oder Hvdroxymethandiyl bedeutet, und
M geradkettiges (C2-C5)-Alkan-l,ω-diyl, geradkettiges (C2-C5)-Alken-l,ω-diyl oder geradkettiges (C2-C5)-Alkin- 1 ,ω-diyl bedeutet,
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkran- kungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
18. Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (II),
Figure imgf000025_0001
worin R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, L und M die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben,
und deren Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
19. Verwendung der Substanz 2-(3,4-Dimethoxybenzyl)-7-[l-(l-hydroxyethyl)-4- phenylbutyl]-5-methylimidazo[5,l-f][l,2,4]triazin-4(3H)-one mit der Strukturformel:
Figure imgf000026_0001
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
20. Verwendung gemäß Ansprüchen 14 - 19, wobei es sich bei der Herzinsuffizienz um eine durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
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