WO2007139089A1

WO2007139089A1 - 改良された化学物質の検出方法

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Publication number: WO2007139089A1
Application number: PCT/JP2007/060866
Authority: WO
Inventors: Chiaki Katou
Original assignee: Daikin Industries Ltd
Current assignee: Daikin Industries Ltd
Priority date: 2006-05-29
Filing date: 2007-05-29
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2008-11-29
Also published as: KR20090010123A; CN101460608A; US20100041089A1; JP2007312750A

Abstract

　本発明は、蛍光法のような高価な測定装置を用いることなく、環境試料中の化学物質の存在または存在量を検定できる簡便かつ安価なアッセイ法を提供する。より詳しくは、本発明は、化学物質に応答してプロモーター活性が変化するモニタリング用プロモーター遺伝子の下流に酸化還元酵素をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結することによって形質転換した組換え細胞を用いることを特徴とする。

Description

明細書

改良された化学物質の検出方法

技術分野

[0001] 本発明は酸素電極を用いる化学物質の生物学的検出方法に関する。本発明はまた該検出方法に用いる形質転換細胞および装置にも関する。

背景技術

[0002] 環境庁により昭和 49年から平成 10年度までの 24年間にわたり毎年行われている化学物質環境追跡調査結果によれば、今まで調査した 775種類の化学物質のうち、約 40%の物質が環境中に放出されている。一方、わが国において現在、工業的に生産されている化学物質は約 5万種類とされ、その生産量、種類は年々増加している。また、塩素による水処理、焼却処理等により非意図的に生成されたィ匕学物質が環境を汚染することが知られている。これらの事実から、環境中に蓄積されている化学物質は多数あると予測されるが、これら全てを個々に調査することはきわめて困難である。

[0003] 従来のバイオアツセィ法 (生物材料を用いてその応答性力有害性を評価する手法）は主として魚類ゃミジンコ、貝等の個体、細胞の生育阻害や特定の生体反応を指標としており、環境中の化学物質による毒性の評価はできるが、その毒性の性質やどのような化学物質に起因するかを判断することはできな、。亜硝酸生成細菌または硝酸生成細菌の活性により評価する方法 (特開平 06-123705号公報、特開 2000-2 06087号公報）、鉄バクテリアの活性により評価する方法 (特開平 11-37969号公報）が提案されており、水質安全モニタ（富士電機)のような製品が販売されている。また、国外では、発光微生物の発光強度により評価する製品（MICROTOX、 azur社、ァメリ力； LUMIS、 drlange社、ドイツ）が市販されている。し力し、これらはいずれも従来型のノィオアッセィ法の延長であり、毒性ィ匕学物質に関する詳細な情報は得られない。

[0004] わが国の化学物質のリスク管理は、新たな汚染が見出されるたびに化学物質の見直しが行われ、さらに規制と自主規制を組み合わせる体制の整備がすすめられて!/、る。しかし、トリノ、ロメタンやダイォキシンに代表されるような有害化学物質の非意図的生成および環境放出など、複雑化、多様化する現状に即座に対応する体制は整つていない。また、「ィ匕学物質の審査及び製造等の規制に関する法律」における毒性評価法である動物実験はコストや時間が力かり国際的に受け入れ難くなつている。このように、管理体制についての問題は常に議論されるが、それを解決する具体的な手段が無、こと力課題の解決には至って、な、。

よって、化学物質につ、て人体や生態系に与える影響を評価する要請がある。

[0005] 化学物質が人体や生態系に与える影響を評価する方法として、レポーター ·ジーン •アツセィ法が知られている。レポータ一 ·ジーン ·アツセィ法とは、転写活性を中心とした遺伝子の機能を調べるための、目印となる特定の遺伝子活性を測定する手法であり、プロモーターアツセィ法などが包含される。プロモーターアツセィ法は、ある遺伝子のプロモーターの塩基配列にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結し、遺伝子の発現を間接的に計測する方法である (非特許文献 1)。

[0006] 通常のバイオアツセィ法では、化学物質の存在は、微生物の化学物質に対する細胞応答、例えば細胞の生死、増殖能、呼吸量、特定の遺伝子の発現の変化を指標として評価される。プロモーターアツセィ法では細胞応答としてプロモーター活性の変ィ匕、すなわちプロモーターに連結されたマーカータンパク質を指標として評価されるマーカータンパク質の例としては GFP (Green Fluorescence Protein) (Heim, R.， C ubitt, A. B. and Tsien, R. Y. (1995) Nature 373, 663-664 ; Heim, R" Prasher DC. a nd Tsien, R. Y. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 12501— 12504 ;Warg, S. and Hazer igg, T. ( 1994) Nature 639, 400-403 ;Youvan, D.C. and Michel-Beyerle, M.E. (1996) Nature Biotechnology 14 1219- 1220 ; Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W.

W. and Prasher, D.C. (1994) Science 263, 802-805)、 j8 -ガラクトシダーゼ（Canestr o C, Albalat R, Escriva H, Gonzalez— Duarte R. Endogenous beta— galactosidase acti vity in ampnioxus: a useful histochemical marker for the digestive system. Dev Genes

Evol 2001 Mar 211(3): 154- 6)、ルシフラーゼ（Arch Toxicol 2002 Jun;76(5-6):257 —61、 Estrogenic activity of UV filters determined by an in vitro reporter gene assay and an in vivo transgenic zebrafish assay.Schreurs R, Lanser P, Semen W, Van Der Burg B.)、及びァセチルトランスフェラーゼ（J Recept Signal Transduct Res 2001 Feb; 21(1):71- 84, A simplified method for large scale quantification of ranscriptional activ ity and its use in studies of steroids and steroid receptors. Zhang S, Lu J, lyama K, Lo SC, Danielsen M.)を挙げることができる。

プロモーター活性の変化は、例えば、 GFPなどの蛍光タンパク質の場合、蛍光測定によりモニターされ、ルシフェラーゼの場合、酵素一基質反応による発光によりモ二ターされる。

[0007] WO03Z018792には、蛍光法を用いて環境中に存在する化学物質を簡単に同定する方法が開示されている。この同定方法によれば、毒性物質によって特異的に活性化される酵母遺伝子プロモーターを含む塩基配列に、 GFPのごとき蛍光性のマ一力一タンパク質をコードする塩基配列を作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクターによって酵母を形質転換し、この形質転換酵母を試料に接触後、蛍光タンパク質の発現量を蛍光測定によって検出し、発現量の増大が認められれば、毒性物質が存在すると判定することができる。

[0008] 特許文献 l :WO03Z〇18792

特許文献 2：特開 2001— 252066号公報

特許文献 3：特開 2001— 258592号公報

非特許文献 l : Barelle CJ, Manson CL, MacCallum DM, Odds FC, Gow Na, Brown AJ.: GFP as a quantitative reporter of gene regulation in Candida albicans. Yeast 20 04 Mar; 21(4):333- 40

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] し力しながら、蛍光法を用いる測定では、高価な蛍光測定装置を導入する必要があり、化学物質検出システムのコストが増大してしまう。また、測定する場所も研究所等の特定の場所に限られ、あまり簡便であるとはいえな力つた。

したがって、蛍光法を用いずに、より簡便に環境中の化学物質の存在または存在量を検出できるシステムが求められている。

課題を解決するための手段 [0010] 本発明者らは、マーカータンパク質の一例であるルシフェラーゼが基質であるルシフェリンと酵素一基質反応を起こす際に、酸素を消費することに着目し、発光強度ではなぐ酵素一基質反応における酸素消費量を測定することによって、マーカータンノク質の発現量を検出できることを見出した。

例えば、ホタルルシフェラーゼと D—ホタルルシフェリンによる酵素一基質反応は下式で示される。

[0011] [化 1]

Oxyluciferine

[0012] このように、酵素反応において酸素を電子受容体として消費して、基質を酸化する酵素 (本発明において、「酸ィ匕還元酵素」という。）として、ルシフェラーゼ以外には、例えば、チトクロム Cォキシダーゼ、リン酸ピリドキサアミンォキシダーゼ、ダルタチォンォキシダーゼ、グルコースォキシダーゼ、プロリンォキシダーゼ、アミノ酸ォキシダーゼ、ァスコルビン酸ォキシダーゼ、ァシルー CoAォキシダーゼ、ガラクトースォキシダーゼ、キサンチンォキシダーゼ、コレステロールォキシダーゼ、シユウ酸ォキシダーゼ、ザルコシンォキシダーゼ等のォキシダーゼおよび、キヌレニン 3—モノォキシゲナーゼ、スクアレンォキシゲナーゼ、モノォキシゲナーゼ、トリプトファン 2, 3 ジォキシゲナーゼ等のォキシゲナーゼが挙げられる。

例えば、ダルコースォキシダーゼとダルコースによる酵素基質反応は下式で示される。

[0013] [化 2] グルコースォキシダーゼ

グルコース十 O ₂十 H ₂ O グルコン酸十 H ₂ O ₂

[0014] そこで、本発明者らは、特定の化学物質が、酵母遺伝子のプロモーターを活性化し、そのような化学物質応答性プロモーターを含む塩基配列、並びにこれら遺伝子に相同性の他種由来の遺伝子のプロモーターを含む塩基配列よりなる群力選択される塩基配列の下流に、マーカータンパク質として酸ィ匕還元酵素をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された組換え細胞または、マーカータンパク質として酸ィ匕還元酵素をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結されているポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された組換え細胞を作製し、化学物質を含む試料に、この組換え細胞および酸ィ匕還元酵素の基質を添加し、試料中の溶存酸素の消費量を測定することによって、発現された酸化還元酵素の量を定量すれば、試料中の化学物質の存在または存在量を検定できることに想到した。

[0015] 従来から、酸素電極を用いて溶存酸素量を検出する方法はよく知られて!/ヽる。

例えば、特開 2001— 252066号公報には、細菌数測定対象食品を溶液中に分散させてサンプル溶液を調製し、サンプル溶液の溶存酸素を検出することによって、サンプル溶液中の細菌数を測定する方法が開示されている。

また、特開 2001— 258592号公報には、酸素電極を用いて溶液の溶存酸素量を検出することによって、短時間で正確に測定対象微生物の薬剤感受性を測定する方法が開示されている。この方法によれば、測定対象微生物および薬剤を含む第 1の溶液および薬剤を含まな、第 2の溶液にっ、て、酸素電極からの測定電流値を各々時系列的に保持し、それぞれ時系列的に保持されている測定電流値力移動平均値を算出し、それぞれ算出された移動平均値の対力最小二乗近似で時間微分値を算出するので、非常に簡便かつ正確に測定対象微生物と薬剤との反応を検出することがでさる。

[0016] 本発明の化学物質の検出方法は、（a)酵母遺伝子のプロモーターのうち化学物質に応答するプロモーターを含む塩基配列、並びにこれら遺伝子に相同性の他種由来の遺伝子のプロモーターを含む塩基配列よりなる群力選択される塩基配列の下流に、マーカータンパク質として酸ィ匕還元酵素をコードするポリヌクレオチドまたは酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素をコードするポリヌクレォチドが作動可能に連結されているポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された組換え酵母を用いること、および (b)少なくとも、被検試料と、組換え酵母と、マーカータンパク質である酸化還元酵素に対する基質と、を含む溶液について、酸素電極からの測定電流値を時系列的に保持し、保持した測定電流値の変化から溶存酸素の消費量を算出することによって、環境中の化学物質の存在または存在量を検出することを特徴とする。

[0017] すなわち、本発明の方法は、本発明による形質転換細胞から産生されるルシフェラーゼ、ォキシダーゼまたはォキシゲナーゼ等の酸化還元酵素とそれらの酵素に対する基質との間の酵素一基質反応において消費される酸素量を測定することによって、産生された酸ィ匕還元酵素の存在または存在量を検出できることに基づく。

産生された酸化還元酵素の存在量の増大は、化学物質応答性の遺伝子プロモーターが化学物質の存在により活性化されたことに起因するため、酸素消費量の増大力化学物質の存在または存在量を示すこととなる。

[0018] 本発明においては、化学物質の存在または存在量の検出に形質転換細胞を用いるため、測定において形質転換細胞の呼吸など基礎代謝による酸素消費量も考慮する必要がある。

本発明において、基礎代謝による酸素消費量よりも、酵素-基質反応による酸素消費量が圧倒的に多い場合、予め、基礎代謝による酸素消費量を算出し、これを測定値カも差し引くことによって、酵素一基質反応による酸素消費量を検出することができる。

また、本発明において、基礎代謝による酸素消費の影響を排除するため、形質転換細胞を破砕し、酵素—基質反応のみを観察することができる。

さらに、破砕による細胞の内容物からの影響を回避するために、マーカータンパク質として、細胞膜を透過する酸化還元酵素を選択し、形質転換細胞を破砕することなぐ溶液中から形質転換細胞を回収することによって、酵素一基質反応による酸素消費量を検出することができる。図面の簡単な説明

[0019] [図 1]この発明の化学物質測定装置の一実施態様を示すブロック図である。

[図 2]この発明の化学物質測定装置の酸素電極の原理を示す概略図である。

[図 3]この発明の化学物質測定方法の一実施態様を示すフローチャートである。

[図 4]この発明による溶存酸素測定における電流値の時間変化を示すグラフである。符号の説明

[0020] 1'''第1セル、 1&'.'第1酸素センサ、

2· · '第 2セル、 2a · · '第 2酸素センサ、

3···第 1保持部、 4···第 2保持部、

5·· ·第 1移動平均値算出保持部、 6·· ·第 2移動平均値算出保持部、

7· · ·第 1時間微分値算出部、 8·· ·第 2時間微分値算出部、

9···化学物質測定部、

21···作用電極、

22···参照電極、

23…対電極、

24···測定機器、

25…溶液。

発明を実施するための最良の形態

[0021] 本発明の形質転換に用いる宿主細胞としてはヒト細胞が好ましいのは当然であるが、マウスその他哺乳類の細胞でも良い。また、環境中の毒性評価という面から、これまでノィオアッセィ法に用いられている魚類、線虫等の細胞でも可能である。また、培養が容易であることから微生物の細胞を用いることも好ま、。

本法は酵母細胞の遺伝子を基にして!/、ること、また酵母の生育は塩濃度その他の環境試料にお!、て変動する条件に左右されな!、ことから、好ま、細胞は酵母細胞である。

細胞を形質転換する方法はよく知られている（例えば、 Kaiser C, Michaelis S, Mite hell A: Lithium acetate yeast transformation, Methods in Yeast Genetics, Aし old Sp ring Harbor Laboratory Course Manual 1994 edition (Cold Spring Harbor Laborator y Press) pp.133- 134, 1994を参照）。

また、ベクターを用いなくとも当該酵母遺伝子のコード領域をマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列で置換することによつても目的は達せられる。上記ポリヌクレオチド構築物を細胞に直接導入することも可能であり、その方法も周知である。

[0022] そこで、本発明にお、て、先ず、以下の群から選択される酵母遺伝子のプロモータ一を含む塩基配列、並びにこれら遺伝子に相同性の他種由来の遺伝子のプロモーターを含む塩基配列よりなる群力選択される塩基配列の下流に、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結した塩基配列を導入することによつて、組換え酵母を作製する。

[0023] YBR072W, YCR102C, YCR107W, YDL218W, YDL243C, YDR453C, YDR533C、

YFL014W、 YFL056C、 YFL057C、 YGR110W、 YJR155W, YKL071W, YKR076W, YL

L060C、 YLR460C、 YMR090W、 YNL331C、 YNL332W、 YNL335W、 YOL150C、 YOL

165C、 YPL171C、 YPR167C、 YBL048W、 YBL064C、 YBL107C, YBR008C、 YBR173

C、 YBR256C、 YBR296C、 YDL021W、 YFL022C, YFL024C, YFL061W、 YGL121C、

YGL158W、 YGR043C、 YHR029C、 YHR112C、 YHR139C、 YHR179W, YHR209W、 Y

IR030C、 YJR010W、 YJR048W, YKL001C、 YKL107W, YKR075C, YKR097W, YLLO

56C、 YLR297W, YLR303W、 YML087C, YMR096W、 YNL274C, YOL151W、 YOR22

6C、 YOR338W、 YOR391C、 YPL280W、 YDR406W、 YJL153C, YLR346C、 YOR049C

、 YOR153W、 YPL088W、 YAL034C、 YDL124W, YDL174C, YDR476C, YGL156W、

YGR035C、 YGR157W, YGR213C、 YGR281W、 YGR284C, YHL047C, YHR043C、 Y

HR044C、 YHR054C、 YJR073C、 YKL165C、 YLR008Cゝ YMR315W、 YNL211C、 YOL

031C、 YOL101C、 YOR303W、 YAL005Cゝ YAR031W、 YBL005W- A、 YBL022C, YBL

041W、 YBL049W、 YBL075C、 YBL078C, YBR062C、 YBR169C、 YBR294W, YCL02

0W、 YCL035C、 YCL043C、 YCL050C、 YCL057W, YCR012W、 YCR013C、 YCR060

W、 YDL007W, YDL027C, YDL097C、 YDL110C、 YDL126C、 YDL169C、 YDR070C

、 YDR155C、 YDR158W、 YDR204W, YDR210W、 YDR214W, YDR258C、 YDR313C、

YDR368Wゝ YDR435C、 YER012W、 YER037W、 YER091C、 YER103W、 YFL044C, YF

R003C、 YFR010W、 YFR020W、 YFR024C, YFR044C、 YFR053C、 YGL006W、 YGLO yv wno入 ζεοΊθ人、 εΐ(πο人 ΪΪΟΊΟ人、Λ\¾ΟΗ^ [入 ^OSO 人入

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84C、 YFL059W、 YFR042W, YFR046C、 YFR049W、 YGL026C、 YGL058W、 YGL185 C、 YGL227W, YGL252C, YGL254W, YGR089W、 YGR112W、 YGR134W、 YGR276 C、 YHL019C、 YHR012W、 YHR017W、 YHR028C、 YHR106W、 YHR109W、 YHR156 Cゝ YIL036Wゝ YIL046Wゝ YIL143C、 YIL152Wゝ YIL159Wゝ YIL164C、 YJL071W、 YJLO 94C、 YJL154C, YJR056C, YJR072C, YJR110W, YJR139C, YKL025C, YKL034W, YKL064W, YKL171W, YKL196C、 YKR012C, YKR068C、 YKR069W、 YLL001W、 Y LL057C、 YLL061W、 YLR064W、 YLR070C, YLR099C、 YLR144C, YLR157C, YLR1 60C、 YLR164W、 YLR364W、 YLR421C, YML032C, YML042W, YML112W, YML11 8W、 YMR114C, YMR115W、 YMR258C, YNL181W、 YNL191W、 YNL212W, YNL21 3C、 YNL250W、 YNL265C、 YNL312W、 YNR032W、 YOL038W、 YOL049W、 YOL064 C、 YOR088W、 YOR155C、 YOR257W, YOR265W、 YOR377W, YOR386W、 YPL031 C、 YPL113C、 YPL124W, YPL151C、 YPL249C, YPL260W、 YPL274W, YPR048W、 YPR061C、 YPR093C、 YPR125W、 YPR158W、 YPR168W、 YPR169W、 YPR174C, YP R180W、 YPR193C、 YPR200C、 YAL014C、 YAL017W, YAL049C、 YBL019W、 YBLO 58W、 YBR001C、 YBR013C、 YBR018C、 YBR037C、 YBR045C、 YBR051W、 YBR063 C、 YBR128C、 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YIR031C、 YIR032C、 YJL032W, YJL049W, YJL128C, YJL165C, YJR044C, YJR052W, YJR090C, YJR091C, YJR103W, YJR104C, YJR153 W、 YKL059C、 YKL079W, YKL090W、 YKL094W, YKL192C, YKL209C, YKR052C 、 YKR102W, YKR106W、 YLL054C、 YLR025W、 YLR097C、 YLR200W、 YLR226W, YLR248W, YLR266C、 YLR392C、 YLR427W, YML013W、 YML029W, YML041C, Y ML051W、 YML078W, YML079W, YML088W、 YML099C、 YMR056C、 YMR068W、 YMR091C、 YMR110C、 YMR160W、 YMR186W、 YMR255W, YNL005C、 YNL026W、 YNL039W、 YNL063W、 YNL064C、 YNL077W, YNL083W、 YNL147W, YNL176C、 Y NL194C、 YNL253Wゝ YNL257C, YNL261W、 YNL264C, YNL276C, YNR006Wゝ YNR 034W、 YNR047W, YNR051C、 YNR071C、 YOL065C、 YOL067C, YOR005C、 YORO 08C、 YOR022C, YOR023C、 YOR058C、 YOR069W、 YOR087W, YOR138C、 YOR22 9W、 YOR256C、 YOR267C, YPL005W、 YPL020C、 YPL022W, YPL105C、 YPL147W 、 YPL150W、 YPL152W、 YPL164C、 YPL168W、 YPL180W、 YPL188W、 YPL194W、 Y PR025C、 YPR047W, YPR049C、 YPR066W、 YPR081C、 YPR134W、 YPR140W、 YPR1 48C、 YPR155C、 YPR172W, YPR185W、 YAL018C、 YAR064W、 YBR012C、 YBR076 W、 YBR287W, YDR043C、 YDR250C、 YDR373W、 YFR014C、 YGL191W、 YGR180C 、 YHR136C、 YJL026Wゝ YJL037W、 YLR038C、 YNL058C、 YOR031W、 YGR087C、 YI L166C、 YHR008C、 YIL129C、 YGL256W、 YJR030C, YMR077C, YBR264C, YPL177 C、 YKR040C, YGL056C、 YDR128W、 YGR139W、 YBL101W- A、 YOR253W、 YOL02 6C、 YDR278C, YHR095W、 YCL042W, YNL200C、 YPL221W, YLR415C、 YMR058 W、 YPR037C、 YER072W, YML028W, YOR325W、 YAL039C、 YMR112C, YJR107W 、 YGL088W、 YJR058C, YNL142W, YDR090C、 YMR071C, YBL093C、 YGR293C、 Y ML055W、 YDL017W、 YDL210W、 YGL055W、 YCL025C、 YDR080W、 YDL181W、 Y NR030W、 YJL017W, YIL127C, YDR281C、 YDR366C、 YFR026C、 YJL212C, YPL21 5W、 YEL019C、 YBR132C、 YHL018W、 YNL196C、 YPL038W、 YAR047C, YPL262W 、 YHL006C、 YPL225W, YBR124W, YOR148C、 YKR053C、 YBL044W, YER029C、 Y LR360W、 YCL056C、 YCR007C, YGR239C、 YNL256W、 YPR146C、 YLR377C, YKL 097C、 YBR066C、 YLR338W、 YDL229W, YBR253W、 YJR027W, YKL198C、 YBL030 C、 YBR031W、 YBR118W、 YBR162C、 YBR221C, YCR024C- A、 YCR106W、 YDL046 W、 YDR012W、 YDR133C、 YDR134C、 YDR276C, YDR342C, YDR343C、 YEL027W 、 YEL034W、 YGR038W、 YGR243W, YGR279C, YHR094C、 YHR105W、 YHR175W 、 YHR181W、 YIL056W、 YIL162W、 YJL059W, YJL097W, YJL158C, YJR105W, YKL 051Wゝ YKL056C、 YKL097W- A、 YKL100C、 YKL141Wゝ YKR066C、 YLR134W、 YLR 258W、 YLR339C、 YML058W、 YMR083W、 YMR203W, YNL209W、 YNL307C, YOL 030W、 YOR178C, YPL028W、 YPR028W、 YPR113W、 YPR149W、 YPR150W、 YPR18 3W、 YAL016W、 YBL099W、 YBL100C、 YBR011C、 YBR096W、 YBR100W、 YBR127 C、 YBR283C、 YBR286W、 YCL008C、 YCL058C、 YCR030C、 YCR034W、 YCR069W 、 YDL015C、 YDL023C、 YDL061C、 YDL086W、 YDR038C、 YDR039C、 YDR050C、 Y DR151C、 YDR178W、 YDR233C、 YDR284C, YDR298C、 YDR345C、 YDR359C、 YDR 382W、 YDR385W、 YDR400W、 YDR407C, YDR538W、 YEL024W, YEL033W、 YELO 63C、 YER057C, YER081W、 YER120W、 YFL011W、 YGL012W、 YGL206C、 YGR022 C、 YGR026W、 YGR082W、 YGR107W, YGR172C, YGR191W、 YGR204W, YGR260 W、 YHL005C、 YHL046C、 YHR025W、 YHR026W、 YHR123W、 YHR126C、 YHR143 W、 YIL011Wゝ YIL015W、 YIL018Wゝ YIL157C、 YIR041W、 YJL016W, YJL121C, YJL 133W、 YJL138C, YJL191W, YJR018W, YJR047C, YJR077C, YJR119C, YJR121W, YJR123W、 YJR143C, YJR145C, YKL060C、 YKL147C, YKL148C, YKL157W, YKL 164C、 YKL169C、 YKR033C、 YLL041C、 YLL064C、 YLR041W、 YLR044C, YLR056 W、 YLR058C、 YLR081W、 YLR089C、 YLR110C、 YLR177W, YLR264W, YLR284C, YLR304C、 YLR340W、 YLR354C、 YLR372W, YLR388W、 YML022W, YMR007W, Y MR011W、 YMR015C, YMR092C, YMR101C、 YMR156C、 YMR205C, YMR215W, Y MR261C、 YMR323W, YNL069C、 YNL135C、 YNL195C、 YNR076W, YOL039W、 YO L073C、 YOL086C、 YOL120C、 YOL156W、 YOL161C、 YOR002W、 YOR009W、 YO R010C、 YOR085W、 YOR108W、 YOR128C、 YOR129C、 YOR142W, YOR161C、 YO R176W、 YOR230W、 YOR298W、 YPL004C、 YPL036W、 YPL048W、 YPL057C、 YPLO 59W、 YPし 061W、 YPし 135W、 YPし 179W、 YPし 218W、 YPし 220W、 YPし 246C、 YPし 272 C、 YPR063C、 YPR080W、 YPR181C、 YBR290W、 YCR010C、 YCR091W、 YDL107W 、 YDL129W、 YDR066C、 YDR529C、 YFL026W、 YGL018C、 YGL059W、 YNL144C, YOR003W、 YAL037W、 YAR023C、 YBR003W、 YBR020W、 YBR044C, YBR091C、 Y BR185C、 YBR282W, YCR015C、 YCR038C、 YCR043C、 YDL119C、 YDL146W、 YDL 220C、 YDR057W、 YDR123C、 YDR125C、 YDR222W, YDR225W, YDR277C, YDR2 86C、 YDR347W, YDR408C、 YDR438W、 YDR479C, YDR483W、 YEL039C、 YEL057 C、 YEL073C, YER066W、 YER076C、 YER084W、 YER121W、 YER189W、 YFL017C、 YFL046W、 YFR006W、 YFR008W、 YGL115W、 YGL208W、 YGL214W, YGL218W、 YGR021W、 YGR023W、 YGR024C, YGR064W、 YGR076C、 YGR096W、 YGR108W、 YGR174C, YGR182C、 YGR236C、 YGR288W、 YHL042W, YHR195W、 YHR210C、 Y IL006W、 YIL012W、 YIL028W、 YIL050W、 YIL057C、 YIL089W、 YIL102C、 YIL113W 、 YIL122W, YJL100W, YJL169W, YJL199C, YJR039W, YJR050W, YJR101W, YKL 003C、 YKL016C、 YKL061W、 YKL093W、 YKL121W, YKL160W、 YKL170W, YKL1 94C、 YKR034W, YKR067Wゝ YLR006C、 YLR016C、 YLR030W、 YLR036C、 YLR112 W、 YLR125W、 YLR128W、 YLR204W, YLR211C、 YLR233C、 YLR257W, YLR288C、 YLR326W、 YLR334C、 YLR395C、 YLR408C、 YLR414C, YLR444C, YML050W、 YM L107C、 YML120C, YMR031C、 YMR053C、 YMR073C, YMR162C, YMR204C, YMR 206W、 YMR284W, YNL010W、 YNL025C、 YNL127W, YNL139C、 YNL217W, Y0L1 16W、 YOL118C、 YOR053W、 YOR100C、 YOR103C、 YOR122C, YOR150W、 YOR1 87W、 YOR251C、 YOR312C、 YOR327C, YOR348C、 YOR352W、 YOR388C、 YOR39 4W、 YPL001W、 YPL033C、 YPL066W、 YPL148C、 YPL230W、 YPL275W, YPL276W 、 YPR005C、 YPR014C、 YPR192W、 YPR194C、 YBR005W、 YER025W、 YFL027C, Y GL080W、 YGL205W、 YHL028W、 YHR185C、 YIL076W, YJL166W, YLR046C、 YMR 035W、 YMR238W, YMR252C, YNL192W、 YNL202W, YOL108C、 YOR385W、 YPR1 65W、 YAR033W、 YBL038W、 YBR009C、 YBR010W、 YBR151W、 YCL067C、 YCR09 6C、 YDL137W、 YDL192W、 YDR073W, YDR086C、 YDR224C, YDR377W, YDR378 C、 YER015W、 YGL187C, YHR162W、 YJL167W, YJL216C, YKR009C、 YLR165C、 YMR197Cゝ YNL157W、 YOL002Cゝ YOL109W、 YOR180C、 YPL010Wゝ YPL233W、 Y BR036C、 YDR297W, YGR149W、 YGR224W, YNL043C、 YPL067C, YPL170W, YC R046C、 YDR387C、 YFL050C、 YGL051W、 YHR132C、 YIL112W、 YJL141C, YKR09 8C、 YLR052W、 YLR206W、 YML129C, YNL203C、 YNR014W、 YOL043C、 YOL096 C、 YPR184W、 YAL028W、 YAL055W、 YAR062W、 YBL095W、 YBL102W、 YBR122C 、 YBR157C、 YBR161W、 YBR251W、 YBR298C、 YCR039C、 YCR083W、 YDL018C、 YDL067C, YDL078C、 YDL091C、 YDL215C、 YDL216C、 YDR022C, YDR067C, YD R079W、 YDR181C、 YDR186C、 YDR196C、 YDR262W, YDR306C、 YDR319C、 YER1 88W、 YGL004C、 YGL035C、 YGR036C、 YGR062C、 YGR120C、 YGR131W、 YGR141 W、 YGR167W, YGR287C, YHL024W, YHR080C、 YHR097C、 YIL077C, YJL046W, YJL070C, YJL096W, YJL113W, YJL146W, YJL180C, YJR019C, YJR049C, YKR05 8W、 YLL005C、 YLR078C、 YLR151C、 YLR271W, YLR295C、 YLR351C、 YLR375W 、 YMR023C, YMR025W, YMR135C、 YMR210W, YMR267W, YMR278W, YMR293C 、 YNL073W, YNR037C, YNR040W、 YNR072W, YOR028C、 YOR316C、 YOR328W、 YOR363C、 YPL039W、 YPL040C、 YPL099C、 YPL107W, YPL134C、 YPL138C、 YPL 140C。

[0024] これら酵母遺伝子の塩基配列、アミノ酸配列は公共のデータベース (例えば、ドイツの MIPs : Munich Informationし enter for Protein Sequence ^未国の； 5GD : Saccharo myces Genome Database)に開示されており、インターネットを介して知ることができる。また、プロモーター配列についても公共のデータベース（SCPD : The Promoter Dat abase of ¾accharomyces cerevisiae)に開れてい。

[0025] 上記酵母遺伝子のプロモーターばかりでなぐ上記酵母遺伝子に相同性を有する他種由来の遺伝子のプロモーターも使用できる。ここに「酵母遺伝子に相同性を有する遺伝子」とは、酵母遺伝子の塩基配列に 50%以上、好ましくは 80%以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子であって、該酵母遺伝子がコードするタンパク質と同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子を言う。

[0026] 上記遺伝子のプロモーターの塩基配列の下流に、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結してポリヌクレオチド構築物を得る。プロモーターにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結する方法は当業者によく知られている（例えば R.W.オールド、 S.B.プリムローズ遺伝子操作の原理原書第 5 版，培風館， ppl38-165, pp.234-263, 2000を参照）。

[0027] マーカータンパク質の例としては、ホタルルシフェラーゼ、ゥミシィタケルシフェラーゼ、クリックビートルルシフェラーゼ等のルシフェラーゼ；チトクロム Cォキシダーゼ、リン酸ピリドキサアミンォキシダーゼ、グルタチオンォキシダーゼ、グルコースォキシダーゼ、プロリンォキシダーゼ、アミノ酸ォキシダーゼ、ァスコルビン酸ォキシダーゼ、ァシルー CoAォキシダーゼ、ガラクトースォキシダーゼ、キサンチンォキシダーゼ、コレステロールォキシダーゼ、シユウ酸ォキシダーゼ、ザルコシンォキシダーゼ等のォキシダーゼ；キヌレニン 3—モノォキシゲナーゼ、スクアレンォキシゲナーゼ、モノォキシゲナーゼ、トリプトファン 2,3—ジォキシゲナーゼ等のォキシゲナーゼを挙げることができる。

[0028] ルシフェラーゼをコードする塩基配列の例として、 pGL3- Basic Vector (Promega)のルシフェラーゼの配列を配列番号 1に示す。

[0029] ゲノム配列のよく知られた酵母の遺伝子のうち、ォキシダーゼ関連遺伝子として、 Q 0045、 Q0250、 Q0275, YBL064c、 YBR035c、 YBR244w、 YDL067c、 YDR044w、 YDRO 79w、 YDR231c、 YDR453c、 YDR506c、 YEL045c、 YER014w、 YER021w、 YER058w、 Y ER141w、 YER145cゝ YER153cゝ YER154w、 YFL041w、 YGL187cゝ YGL191wゝ YGL205 w、 YGR029w、 YGR060w、 YGR062c、 YGR112w、 YGR234w、 YHR051w、 YHR116w、 Y ILlllwゝ YIR037wゝ YJL003wゝ YJR034w、 YKL026cゝ YKR066cゝ YLL009cゝ YLL018c- a 、 YLR038c、 YLR142w、 YLR205c、 YLR395c、 YML086c、 YML129c、 YMR020wゝ YMR 058w、 YMR256c、 YNL052w、 YOR350c、 YPL132w、 YPR037cが挙げられる。

また、ゲノム配列のよく知られた酵母の遺伝子のうち、ォキシゲナーゼ関連遺伝子として、 YBL098w、 YDR402c、 YGL055w、 YGR175c、 YGR255c、 YHR007c、 YHR176w、 YJR025c、 YJR069c、 YJR078w、 YJR149w、 YLL057c、 YLR205c、 YMR015cが挙げられる。

これらの酵母遺伝子の塩基配列は、公共のデータベース（例えば、ドイツの MIPS : Municn Informationし enter for Protein Sequence^米国の SGD : ¾accharomyces Gen ome Database)に開示されており、インターネットを介して知ることができる。また、プロモーター配列についても公共のデータベース（SCPD : The Promoter Database of Sac charomyces cerevisiae)に開されてい。

本発明にお、て、上記ォキシダーゼ関連遺伝子またはォキシゲナーゼ関連遺伝子に相同性を有する他種由来の遺伝子を用いることもできる。

[0030] 本発明の方法により検出できる毒性物質は特に限定がないが例えば、 Na As、 Cd

2

CI 、 HgCl 、 PbCl 、 4 -トロキノリン一 N—オキサイド、 2,4,5 トリクロ口フエノール

2 2 2

、 y一へキサクロロシクロへキサン、エチレンビスジチォカルバミドサンマンガン、 2,4, 5, 6—テトラクロロー 1,3 ベンゼンジカルボ-トリル、テトラメチルチウラムジスルフイド、エチレンビス（ジチォカルバメート）亜鉛、 8—メチルー N バニリル 6—ノネンアミド、ジンジャオール、ァクロレイン、ジメチルスルホォキシド、ラウンドアップ（登録商標、除草剤）（N— (ホスホメチル)グリシナートアンモ-ゥム 41. 0%、界面活性剤 59. 0 %)、ドデシルペンゾスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、 2,4 ジクロロフエノキシ酢酸、シアン化カリウム、ベンゾ（a)ピレン、ホルムアルデヒド、ビスフエノール A 、 2,5 ジクロロフエノール、塩化メチル水銀、 p ノ-ルフエノール、ペンタクロロフエノール、塩化ニッケル（Π)、重クロム酸カリウム、トリフエ-ルスズクロライド、フエノール、 S— 4—クロ口ベンジル一 Ν,Ν ジェチルカルバマート、へキサクロ口フェン、トリクロサン、硫酸銅等を含む。

[0031] 2種以上の組換え微生物、即ち異なる酵母遺伝子のプロモーターにマーカータンノク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクタ一で形質転換した 2種以上の組換え微生物を用いて、それぞれにつ、て上記方法を行なうと毒性物質を更に特定することができる。例えば、酵母遺伝子プロモータ一として YLL057Cのものを用いると 2,4—ジクロロフエノキシ酢酸、亜ヒ酸若しくはその塩、カドミウム塩、青酸若しくはその塩が検出可能であり、酵母遺伝子として YLR3 03Wを用いると 2,4—ジクロロフエノキシ酢酸、亜ヒ酸若しくはその塩、カドミウム塩、青酸若しくはその塩、ベンゾ (a)ピレン、ホルムアルデヒド、エチレンビスジチォカルノミド酸マンガン、水銀塩が検出可能である。従って、例えば、酵母遺伝子として YLR303 Wを用いた場合にはマーカータンパク質の発現が誘導されるが、酵母遺伝子として YLL057Cを用いた場合にはマーカータンパク質の発現が誘導されな、なら毒性物質はべンゾ (a)ピレン、水銀塩、エチレンビスジチォ力ルバミド酸マンガン又はホルムアルデヒドと特定される。また、ずれの酵母遺伝子を用いた場合にもマーカータンパク質の発現が誘導されるなら毒性物質は 2,4—ジクロロフエノキシ酢酸、亜ヒ酸若しくはその塩、カドミウム塩、又は青酸若しくはその塩と特定される。

[0032] 図 1は、この発明の化学物質測定装置の一実施態様を示すブロック図である。

この測定装置は、化学物質の存在または存在量を調べようとする被検試料、形質転換細胞およびその形質転換細胞に導入されたポリヌクレオチドにコードされる酸ィ匕還元酵素に対する基質を添加してなる第 1溶液を収容する第 1セル 1と、被検試料を添加せず、形質転換細胞を添加してなる第 2溶液を収容する第 2セル 2と、第 1セル 1 に装着されて第 1溶液の溶存酸素量を検出し、測定電流値を出力する第 1酸素センサ laと、第 2セル 2に装着されて第 2溶液の溶存酸素量を検出し、測定電流値を出力する第 2酸素センサ 2aと、第 1酸素センサ laから出力される測定電流値を時系列的に保持する第 1保持部 3と、第 2酸素センサ 2aから出力される測定電流値を時系列的に保持する第 2保持部 4と、第 1保持部 3に時系列的に保持されている測定電流値から移動平均値を算出し、時系列的に保持する第 1移動平均値算出保持部 5と、第 2保持部 4に時系列的に保持されている測定電流値力移動平均値を算出し、時系列的に保持する第 2移動平均値算出保持部 6と、第 1移動平均値算出保持部 5に時系列的に保持されている移動平均値力第 1の時間微分値を算出する第 1時間微分値算出部 7と、第 2移動平均値算出保持部 6に時系列的に保持されている移動平均値から第 2の時間微分値を算出する第 2時間微分値算出部 8と、第 1の時間微分値と第 2の時間微分値とに基づいて化学物質の存在または存在量を測定する化学物質測定部 9とを有している。

[0033] 図 2は、本発明の化学物質測定装置の原理を示す概略図である。図 2に示すように、作用極 (作用電極) 21と参照極 (参照電極 22)と対極 (対電極) 23から構成され、測定機器 24に接続された酸素電極を備えたセル 1中に溶液 25を収容する。

溶液中で作用極 21において、 O +4H+→2H Oの反応が生じて 4e—の電子の授

2 2

受が行われ、これに対応する電流が流れる。この反応は溶存酸素濃度に依存するため、流れる電流量を溶存酸素濃度に依存する。したがって、第 1溶液および第 2溶液の電流値をそれぞれ測定し、第 1溶液の電流値が第 2溶液の電流値よりも小さい、すなわち、溶存酸素量が少ないとき、酵素一基質反応が促進されていると判断することができる。酵素一基質反応の促進は、化学物質に応答して化学物質応答性プロモーターが活性ィ匕して、上昇した濃度の酵素が発現されたことを意味する。

力べして、溶存酸素量の測定により、被検体中の化学物質の存在または存在量を検出することができる。

[0034] 本発明は、被検試料と、酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素をコードするポリヌクレオチドまたは酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸ィ匕する酵素をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結されているポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されていることを特徴とする組換え細胞と、前記酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素に対する基質と、を含む溶液中の溶存酸素量を、酸素電極を用いて検出し、酸素電極からの出力信号を、第 1の所定時間の間、第 2の時間間隔で収集し、出力信号の変化から、溶存酸素量の変化を算出することによって、被検試料中の化学物質の存在または存在量を検出することを特徴とする化学物質測定方法も提供する。

ここで、第 1の所定時間とは、測定開始から、所定の電流値を下回るまで、もしくはプラトーに達するまで、もしくは所定の時間が経過するまでの時間をいう。

[0035] 次いで、図 3のフローチャートに基づき、本発明による化学物質測定の工程を説明する。ステップ SP1において、第 1セル 1に収容された溶液に被検試料および形質転換細胞を添加するとともに、第 2セル 2に収容された溶液に被検試料を添加せず、形質転換細胞を添加し、ステップ SP2において、第 1酸素センサ la、第 2酸素センサ 2a による溶存酸素量の検出を開始し、ステップ SP3において、第 1酸素センサ la、第 2 酸素センサ 2aから出力される測定電流値をそれぞれ時系列的に保持し、ステップ S P4において、それぞれ時系列的に保持されている測定電流値力移動平均値を算出し、ステップ SP5において、それぞれ算出された移動平均値に対から最小二乗近似で時間微分値を算出し、ステップ SP6において、それぞれ算出された時間微分値に基づ!/、て化学物質の存在を検出し、そのまま一連の処理を終了する。 [0036] 第 1溶液および第 2溶液の溶存酸素量を同時に測定し、移動平均値から化学物質の存在または存在量を検出する 1つの具体例について説明した力第 1溶液および第 2溶液の溶存酸素量を逐次測定することもできる。また、上記移動平均値を用いる測定方法は測定精度が高、ため好ま、が、セルに収容された溶液の溶存酸素が消費し尽くされるまでの時間を測定することもできる。

[0037] 以下に本発明を実施例により更に説明するが本発明はこれら実施例に限定されるものではな!/、ことは勿論である。

実施例

[0038] ¾細

毒性物質の検出のためいかなる酵母遺伝子が有用であるかを調べるため以下の実験を行った。

YPD培地（酵母エキス 1%、ポリペプトン 2%、ブドウ糖 2%)に酵母（Saccharomyces cerevisiae S288C( a SUC2mal mel gap2 CUP1))を 25°Cで培養した。対数増殖期に以下の細胞に対して毒性を有する化学物質の 1つを添加して更に 2時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。化学物質の濃度は酵母の生育を阻害するが死滅には至らないような濃度を選択した。

[0039] 化学物質濃度

1 ) N a 2 A s 0 3 mM

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3 ) H g C 1 ₂ 0 7 mM

4) P b C 1 2 2 mM

5 ) 4一二トロキノリン N—オキサイド 0 2 μ Μ

6 ) 2, 4， 5—トリクロ口フエノール 1 6 ΐχ Μ

7) γ—へキサクロロシクロへキサン 1 3 mM

8 ) エチレンビスジチ才力ノレミド酸マンガン 2 P ρ m

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1 0 ) テトラメチルチウラムジスルフィド 7 5 μ Μ

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1 2 ) 8—メチノレー N リノレー 6 ノネン 0 8 2 mM

1 3 ) ジンジャ才一ノレ 1 3 6 mM

1 4 ) ァクロレイン 0 2 0 mM

1 5 ) ジメチノレスホォキシド 1 4 1 M

1 6 ) ラウンドアップ（登録商標、除草剤） D 1 5 0 0倍希釈

1 7 ) ドデシノレべンゾスノレホン酸ナトリウム 0 0 2 %

1 8 ) ラウリル硫酸ナトリウム 0 0 1 %

1 ) N （ホスホメチル）グリシナートアンモ -ゥム 4 1 , 0% 界面活性剤 5 9. 0 %

[0040] 培養終了後遠心して集菌した。これに酢酸ナトリウム緩衝液（50mM酢酸ナトリウム、 10mM EDTA、 1%SDS)を加え、 65°Cで 5分間振とうし、室温に戻した後上澄みを得るという操作を 2回繰り返した。これにフエノール Zクロ口ホルム 1： 1溶液を 1Z 2容量加えて遠心し上澄みを得、これに上澄みと等容量のクロ口ホルムを加え遠心し、上澄みを得た。この上澄みに等容量の 0.3M酢酸ナトリウムを含むイソプロパノールをカ卩ぇ室温にて 30分放置後遠心を行な、全 RNAの沈殿物を得た。この沈殿物に 70%エタノールを加え遠心し再度沈殿させ、乾燥後水に溶解させた。この全 RNAから次の方法により mRNAを単離した。 mRNAは末端にポリ A鎖が付加されているため、ラテックス粒子の表面上に固定されたポリ T構造を持ったポリヌクレオチドにより mRNAをトラップした後に、スピンカラムで洗浄、溶出を行なった（Oligotex-dT30〈S uper〉mRNA Purification Kit, Takara)。この mRNAを蛍光標識したヌクレオチドを用い逆転写酵素（Super Script II Reverse Transcriptase;カタログ番号 18064- 014, Gibe oBRL)を用、て逆転写し、逆転写の際に Cy 3 - dUTPまたは Cy 5 - dUTPを取りこませて標識 cDNAを得た。 [0041] この標識 cDNAを TEバッファー（10mM Tris -HCl/lmM EDTA, pH8.0)に溶解し、酵母のすべての遺伝子を有する DNAチップ（DNAチップ研究所製）に滴下し、 65 °Cで 12時間以上ハイブリダィズさせた。この DNAチップの蛍光強度をスキャナーで読み取り、化学物質を添加しない場合の蛍光強度に対する比、即ち化学物質存在下における発現 mRNA量 Z化学物質不存在下における発現 mRNA量としてリスト 1 〜9に示した。なおこれらの表中、最右欄の「強度」はコントロール細胞における各遺伝子の mRNA発現量を全遺伝子の発現量の平均値で割った値である。コントロールの mRNA発現量が小さぐ化学物質を添加した場合の mRNA発現量が大き、遺伝子が毒性物質の検出に特に有用である。

[0042] [表 1-1]

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酵母遺伝子 ¾2. ミトコンドリアタンパク質遺伝子

化学物質存在下の発現 mRNAZ不存在下の発現 mRNA

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化学物質存在下の発現 _mRNAZ不存在下の発現 mi¾MA

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酵母遺伝子表 9 その他のカテゴリーに属する遺伝子

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¾28226237203545248269324084101 [0123] 機能未知の酵母遺伝子 2400のうち約 700が重金属、農薬、界面活性剤等の毒性を有する化学物質ヽずれかにより mRNAの発現が誘導され (表 1)、ミトコンドリア局在タンパク質遺伝子 167(表 2)、遺伝子修復系タンパク質遺伝子 52 (表 3)、ェネルギ一系タンパク質遺伝子 161 (表 4)、トランスポート促進タンパク質遺伝子 142 (表 5) 、ストレスタンパク質遺伝子 90 (表 6)、代謝系タンパク質遺伝子 142 (表 7)、脱毒性タンパク質遺伝子 60 (表 8)、その他のカテゴリーに属する遺伝子 507 (表 9)の mRNA の発現が毒性を有する化学物質の！/ヽずれかにより誘導されることが示される。ここで、化学物質存在下における発現 mRNA量 Z化学物質不存在下における発現 mRN A量が 2倍以上のものを有意とした。

[0124] このように毒性物質が存在すると特定の酵母遺伝子の発現が誘導されるのは、毒性物質が該遺伝子のプロモーターを活性化することによると考えられる。そこで本発明者は、酵母遺伝子のプロモーターを含むポリヌクレオチドにマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクターを調製し、該ベクターで酵母細胞を形質転換した。

以下の実施例にはそのようなベクターの調製、該ベクターを用いる酵母細胞の形質転換、形質転換した細胞による毒性物質の検出を示す。

[0125] プロモーターアツセィ法は mRNAの細胞内の変動をマーカー遺伝子の発現レべルに置き換えて、遺伝子発現量を非破壊で測定する方法である。化学物質を検出するために選択した遺伝子は化学物質不存在下においても発現しており、従ってマーカータンパク質も化学物質不存在下においても存在する。本発明の方法は被検試料を付加した時の酵母遺伝子の挙動をマーカータンパク質の発現量の変化によって計測し、毒性ィ匕学物質の存在およびその種類を推定するものである。このため、化学物質不存在下においてはマーカータンパク質の産生が少ない方が望ましぐまたィ匕学物質存在下にお、てマーカータンパク質の産生が多!、方が望ま、。

このため、プロモーターアツセィ法における酵母遺伝子の選択にあたっては、強度（コントロール細胞における遺伝子の発現量 Z全遺伝子の発現量の平均値）好ましくは 1. 5以下、より好ましくは 1以下、さらに好ましくは 0. 5以下であり、発現倍率（化学物質存在下の発現 mRNAZ化学物質不存在下の発現 mRNA)が好ましくは 3 以上、より好ましくは 10以上、さらに好ましくは 20以上であるものを選択する。

[0126] 実施例 2

酵母遺伝子 YKL071wのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを PCRにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェアである Oligo4.0- S, Sequencherlマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は、

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であり、ロウワープライマーの塩基配列は、

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とした。 PCRはテンプレートとして酵母の染色体（Saccharomyces cerevisiae S288C, C at.40802, Reserch Genetics, Inc.)を用い試薬は市販のキット（KOD DNA Polymeras e ;コード KOD— 101、 Toyobo)を使用する。

使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製される YEp型シャトルベクターである pYES2 (pYES2, Cat no:V825— 20, Invirtogen Corporation, USA) (R.W.オールド、 S. B.プリムローズ遺伝子操作の原理原書第 5版，培風館， pp.234-263, 2000) )を用いる。また、マーカータンパク質であるリン酸ピリドキサミンォキシダーゼをコードするポリヌクレオチド（配列番号 4)は、酵母の染色体 DNAをテンプレートとして遺伝子 YBR03 5cの部分を PCRで増幅したものを用いる。

[0127] まず、 pYES2の multiple cloning siteの中にォキシダーゼを挿入したベクターを作成した。その後、 PYES2の GAL1プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子である YKL071wのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（配列番号 4)で置換して、目的とするプラスミドベクターを得る。ォキシダーゼおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行う。

[0128] 次にこのプラスミドベクターで酵母 Saccharomyces cerevisiae W303を开質転換する。形質転換の手順を以下に示す。

1)酵母細胞 Saccharomyces cerevisiae W303を 200mLの SD培地で OD660が 0. 5になるまで振とう培養する。

2)集菌して 5mLの TE-bufferにけん濁する。 3) 2.5Mのリチウムァセティト 250 μ Lを添加する。

4) 300 μ Lずつ分注し 10 μ 1の上記プラスミドベクターを添カ卩し、 30°C30分培養する

5) 700 μ Lの 5O%PEG4000を付カ卩し、 30°C60分振とう培養する。

6)ヒートショック (42°C、 5分)後、急冷する。

7) 1Mソルビトールで 2回洗浄する。

8)最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。

[0129] 开質転換の確認は選択培地（SD培地（Yeast nitrogen base without amino acids ( Difco 0919-15) +グルコース +アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン )により行う。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認する。

[0130] 施例 3

実施例 2にて作成した組換え酵母を、 SD培地 (アデニン、ヒスチジン、トリブトファン、ロイシン）において、 25°Cにて振とう培養することにより定常状態になるように増殖させる。

定常状態の酵母を SD培地で 500倍希釈して、 25°Cにて 15時間振とう培養を行い、対数増殖期として、 600nmの吸光度が 0. 2から 0. 5にあることを確認した後、異なる濃度の化学物質 TPNを負荷した。最終濃度が 0. 0053ppm、 0. 053ppm、 0. 53p pmの溶液をそれぞれ溶液 A、 B、。とする。

また、対照溶液として、 TPNを含まない溶液を標準溶液 Sとする。

[0131] 図 2のブロック図で示される化学物質測定装置の第 1セルに測定用溶液 A、 Bまたは Cを収容し、第 2セルに対照溶液を収容して、溶存酸素量の測定を開始する。測定用溶液 A、 Bまたは Cおよび標準溶液 Sにリン酸ピリドキサミンを添加して、測定を開始する。

[0132] 測定用溶液 A、 Bまたは Cの測定電流値の時間変化と標準溶液 Sの測定電流値の時間変化とを比較することによって、各測定溶液中に存在する化学物質 (TPN)の刺激により産生されたリン酸ピリドキサミンォキシダーゼの量を知ることができ、これによつて、化学物質の存在または存在量を検出することができる。測定用溶液 A、 B、 Cおよび標準溶液 Sの溶存酸素測定における電流値の時間変化を図 4に示す。

図 4は、標準溶液 Sについては、ォキシダーゼの発現がないため、電流値に変化がなぐ測定用溶液 A、 B、 Cについては、化学物質 (TPN)の濃度が高くなるにしたがつて、初期の電流値の低下速度が大きぐプラトーに到達した時の定常値も低くなることを示している。

Claims

請求の範囲

[1] 化学物質の存在下におヽて上昇したプロモーター活性を発現する遺伝子のプロモ一ターを含む塩基配列の下流に、酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸ィヒする酵素をコードするポリヌクレオチドまたは酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結されて!、るポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて、ることを特徴とする組換え細胞。

[2] 酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素が、ォキシダーゼおよびォキシゲナーゼよりなる群力選択される酵素であることを特徴とする請求項 1 に記載の組換え細胞。

[3] 酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素をコードするポリヌクレオチドが、酵母のゲノム配列のうち、ォキシダーゼ関連遺伝子の塩基配列またはォキシゲナーゼ関連遺伝子の塩基配列を含むことを特徴とする請求項 1に記載の組換え細胞。

[4] ォキシダーゼ関連遺伝子が、酵母遺伝子の Q0045、 Q0250、 Q0275、 YBL064c、 YB

R035c、 YBR244w、 YDL067c、 YDR044w、 YDR079w、 YDR231c、 YDR453c、 YDR506c 、 YEL045c、 YER014w、 YER021w、 YER058w、 YER141w、 YER145c、 YER153c、 YER1 54w、 YFL041w、 YGL187c、 YGL191w、 YGL205w、 YGR029w、 YGR060w、 YGR062c、 YGR112w、 YGR234w、 YHR051w、 YHR116w、 YILlllw、 YIR037w、 YJL003w、 YJR034 wゝ YKL026c、 YKR066c、 YLL009c、 YLL018c- a、 YLR038c、 YLR142w、 YLR205c、 YL R395c、 YML086c、 YML129c、 YMR020w、 YMR058w、 YMR256c、 YNL052w、 YOR350 c、 YPL132w、 YPR037c、およびこれらの遺伝子に相同性を有する他種由来の遺伝子の塩基配列よりなる群から選択される遺伝子の塩基配列であることを特徴とする請求項 3に記載の組換え細胞。

[5] ォキシゲナーゼ関連遺伝子力酵母遺伝子の YBL098w、 YDR402c、 YGL055w、 Y

GR175cゝ YGR255cゝ YHR007cゝ YHR176w、 YJR025cゝ YJR069cゝ YJR078wゝ YJR149w 、 YLL057c、 YLR205c、 YMR015c、およびこれらの遺伝子に相同性を有する他種由来の遺伝子の塩基配列よりなる群から選択される遺伝子の塩基配列であることを特徴とする請求項 3に記載の組換え細胞。

[6] 組換え酵母であることを特徴とする請求項 1〜5 、ずれか 1に記載の組換え細胞。

[7] 被検試料と、酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素をコードするポリヌクレオチドまたは酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結されているポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて!/ヽることを特徴とする組換え細胞と、前記酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素に対する基質と、を含む溶液中の溶存酸素量を、酸素電極を用いて検出し、酸素電極からの出力信号を、第 1 の所定時間の間、第 2の時間間隔で収集し、出力信号の変化から、溶存酸素量の変化を算出することによって、被検試料中の化学物質の存在または存在量を検出することを特徴とする化学物質測定方法。

[8] 1種類の溶液を収容すベぐ内面所定位置に酸素電極面を有する測定用セルと、複数個の測定用セルをセット可能な測定装置本体とを有し、測定装置本体は、各測定用セルの酸素電極からの出力信号に基づいて、前記溶液中に存在する化学物質の存在または存在量を示す信号を出力する信号出力手段を含んでいることを特徴とする化学物質測定装置。