WO2007123179A1

WO2007123179A1 - バイオセンサ

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Publication number: WO2007123179A1
Application number: PCT/JP2007/058527
Authority: WO
Inventors: Junko Nakayama; Yoshifumi Takahara; Eriko Yamanishi; Yoshihiro Itoh
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2006-04-19
Filing date: 2007-04-19
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2008-10-19
Also published as: JP2013156278A; CN101427128B; US20090065356A1; JP2013224971A; KR20080111548A; EP2017608A4; JP5342705B2; KR101139104B1; CN101427128A; CA2658036A1; JP5781127B2; CN103257169A; EP2017608A1; JP5325574B2; JPWO2007123179A1

Abstract

本発明のバイオセンサは、液体試料中のグルコースを測定するバイオセンサにおいて、絶縁性基板上に設けられた、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼを含む試薬層中に、分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸もしくは有機酸塩、分子内に少なくとも一つのアミノ基もしくはカルボニル基を有する有機酸あるいは有機酸塩、糖アルコール、あるいは可溶化蛋白質の何れか、またはそれらの組み合わせた添加剤を添加した。　これにより、グルコースに対する基質特異性及び保存安定性を高めることができ、また、グルコース以外の糖類への作用を回避することができる。

Description

明細書

バイオセンサ

技術分野

[0001] 本発明は、試料中の特定成分を分析するバイオセンサに関し、特に、バイオセンサの試薬層を構成する試薬構成に関するものである。

背景技術

[0002] バイオセンサは、微生物、酵素、抗体等の生物材料の分子認識能力を利用し、生物材料を分子識別素子として応用したセンサである。すなわち、固定化された生物材料が、目的の特定成分を認識したときに起こる反応、微生物の呼吸による酸素の消費、酵素反応、発光などを利用したものである。

[0003] バイオセンサの中でも酵素センサの実用化は進んでおり、特に、グルコース用の酵素センサは、糖尿病の病状監視に利用されている。グルコース用の酵素センサの一例として、例えば、特許文献 1で提案されたようなバイオセンサが開示されている。

[0004] このバイオセンサは、絶縁性基板上に、測定電極、対電極および検知電極からなる電極層を形成し、これら電極層上に、試料液中の特定成分と特異的に反応する酵素などを含む試薬層を形成してなるものである。上記試薬層に含まれる酵素として、ピロロキノリンキノンを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、 PQQ— GDHと呼ぶ）を用いている。さらに試薬層には、酵素 PQQ— GDH以外に、フェリシアン化力リウムなどの電子受容体が含まれている。

[0005] このような構成のバイオセンサに血液を添加すると、試薬層では、酵素 PQQ— GD Hが、血液中のグノレコースと反応して、グノレコノラタトンと電子を生成し、該生成した電子によって電子受容体であるフェリシアンィ匕イオンがフヱロシアンィ匕イオンに還元される。そこに一定の電圧をかけ、フエロシアンィ匕イオンを再度フェリシアン化イオンに酸化させる。この時に生じる電流値から血液中のグルコース濃度（血糖値）を求めることができる。

特許文献 1 :特開 2000— 171428号公報

特許文献 2：特開 2001— 343350号公報特許文献 3：特開 2002— 207022号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] し力ながら、上記従来のバイオセンサで使用している酵素 PQQ— GDHは、ダルコースだけでなぐマルトースなど基質以外の糖類にも反応してしまう。そのため、ィコデキストリン、マルトース等を含む輸液を投与中の患者が、このバイオセンサを使用して血糖値を測定すると、実際の血糖値より高い値を示すことになる。このような測定値をもとに、過剰のインスリン投与を行うと、医療事故にもつながる恐れがある。

[0007] 本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであり、グルコースに対する基質特異性に優れ、グルコース以外の糖類への作用を回避することができる高精度の測定が可能なバイオセンサを提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0008] 上記課題を解決するために、本発明の請求項 1にかかるバイオセンサは、試料液中の特定成分と特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中の特定成分の濃度を計測するバイオセンサであって、前記試薬層は、フラビンアデニンジヌタレォチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼと、その分子内に少なくとも 1つのカルボキシノレ基を有する有機酸もしくはその塩とを含む、ことを特徴とする。

[0009] また、本発明の請求項 2にかかるバイオセンサは、請求項 1に記載のバイオセンサにおいて、前記試料液中の特定成分の濃度を、絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極と対極とからなる電極を用いて計測する、ことを特徴とする。

[0010] また、本発明の請求項 3にかかるバイオセンサは、請求項 2に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、前記電極上に形成される、ことを特徴とする。

[0011] また、本発明の請求項 4にかかるバイオセンサは、請求項 2に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう形成される、ことを特徴とする。

[0012] また、本発明の請求項 5にかかるバイオセンサは、請求項 1に記載のバイオセンサにおいて、前記有機酸は、脂肪族カルボン酸、炭酸環カルボン酸、複素環カルボン酸、もしくはそれらの置換体、あるいは誘導体である、ことを特徴とする。

[0013] また、本発明の請求項 6にかかるバイオセンサは、請求項 5に記載のバイオセンサにおいて、前記有機酸は、クェン酸、クェン酸塩もしくはフタル酸、フタル酸塩のいずれカまたはそれらの組み合わせである、ことを特徴とする。

[0014] また、本発明の請求項 7にかかるバイオセンサは、試料液中の特定成分と特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中の特定成分の濃度を計測するバイオセンサであって、前記試薬層は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグノレコースデヒドロゲナーゼと、その分子内に少なくとも 1つのアミノ基、もしくはカルボ二ル基を有する有機酸、あるいはその塩とを含む、ことを特徴とする。

[0015] また、本発明の請求項 8にかかるバイオセンサは、請求項 7に記載のバイオセンサにおいて、前記試料液中の特定成分の濃度を、絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極と対極とからなる電極を用いて計測する、ことを特徴とする。

[0016] また、本発明の請求項 9にかかるバイオセンサは、請求項 8に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、前記電極上に形成される、ことを特徴とする。

[0017] また、本発明の請求項 10にかかるバイオセンサは、請求項 8に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう形成される、ことを特徴とする。

[0018] また、本発明の請求項 11にかかるバイオセンサは、請求項 7に記載のバイオセンサにおいて、前記有機酸は、アミノ酸、もしくはそれらの置換体、あるいは誘導体である、ことを特徴とする。

[0019] また、本発明の請求項 12にかかるバイオセンサは、請求項 11に記載のバイオセンサにおいて、前記有機酸は、タウリンである、ことを特徴とする。

[0020] また、本発明の請求項 13にかかるバイオセンサは、試料液中の特定成分と特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中の特定成分の濃度を計測するバイォセンサであって、前記試薬層は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼと、糖アルコールとを含む、ことを特徴とする。

[0021] また、本発明の請求項 14にかかるバイオセンサは、請求項 13に記載のバイオセンサにおいて、前記試料液中の特定成分の濃度を、絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極と対極とからなる電極を用いて計測する、ことを特徴とする。

[0022] また、本発明の請求項 15にかかるバイオセンサは、請求項 14に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、前記電極上に形成される、ことを特徴とする。

[0023] また、本発明の請求項 16にかかるバイオセンサは、請求項 14に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう形成される、ことを特徴とする。

[0024] また、本発明の請求項 17にかかるバイオセンサは、請求項 13に記載のバイオセンサにおいて、前記糖アルコールは、鎖状の多価アルコール、もしくは環式糖アルコーノレ、あるいはそれらの置換体もしくは誘導体である、ことを特徴とする。

[0025] また、本発明の請求項 18にかかるバイオセンサは、請求項 17に記載のバイオセンサにおいて、前記糖アルコールは、マルチトール、ラタチトールのいずれか、または両方である、ことを特徴とする。

[0026] また、本発明の請求項 19にかかるバイオセンサは、試料液中の特定成分と特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中の特定成分の濃度を計測するバイォセンサであって、前記試薬層は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼと、可溶化蛋白質とを含む、ことを特徴とする。

[0027] また、本発明の請求項 20にかかるバイオセンサは、請求項 19に記載のバイオセンサにおいて、前記試料液中の特定成分の濃度を、絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極と対極とからなる電極を用いて計測する、ことを特徴とする。

[0028] また、本発明の請求項 21にかかるバイオセンサは、請求項 20に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、前記電極上に形成される、ことを特徴とする。

[0029] また、本発明の請求項 22にかかるバイオセンサは、請求項 20に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達対を含み、当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう形成される、ことを特徴とする。

[0030] また、本発明の請求項 23にかかるバイオセンサは、請求項 19に記載のバイオセンサにおいて、前記可溶化蛋白質は、ゥシ血清アルブミン、卵アルブミン、ゼラチン、あるいはコラーゲンである、ことを特徴とする。

[0031] また、本発明の請求項 24にかかるバイオセンサは、試料液中の特定成分と特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中の特定成分の濃度を計測するバイォセンサであって、前記試薬層は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼと、その分子内に少なくとも 1つのカルボキシル基を有機酸もしくはその塩、その分子内に少なくとも 1つのアミノ基もしくはカルボ二ル基を有する有機酸あるいはその塩、糖アルコール、および可溶化蛋白質のうちの少なくとも 2つ以上の添加剤とを含む、ことを特徴とする。

[0032] また、本発明の請求項 25にかかるバイオセンサは、請求項 24に記載のバイオセンサにおいて、前記試料液中の特定成分の濃度を、絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極と対極とからなる電極を用いて計測する、ことを特徴とする。

[0033] また、本発明の請求項 26にかかるバイオセンサは、請求項 25に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、前記電極上に形成される、ことを特徴とする。

[0034] また、本発明の請求項 27にかかるバイオセンサは、請求項 25に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう形成される、ことを特徴とする。発明の効果

[0035] 本発明のバイオセンサによれば、 FAD— GDHを含む試薬層中に、少なくとも力ノレボキシル基を有する有機酸、もしくは有機酸塩を添加するようにしたので、酵素反応等を阻害することなぐブランク電流値を抑えることができ、また、血液中に存在する様々な夾雑物質との不必要な反応をも併せて抑制することができるため、直線性が良好で、かつ、センサ個々のバラツキの少ない、グルコースに対する基質特異性に優れた、高精度の測定が可能なバイオセンサを実現することができる。

[0036] また、本発明のバイオセンサによれば、 FAD— GDHを含む試薬層中に、少なくともァミノ基、もしくはカルボ二ル基を有する有機酸あるいは有機酸塩を添加するようにしたので、試薬層を緻密かつ均質に形成することができ、センサのグルコース濃度に対する応答性を飛躍的に高めることができる、グルコースに対する基質特異性に優れた、高精度の測定が可能なバイオセンサを実現することができる。

[0037] また、本発明のバイオセンサによれば、 FAD— GDHを含む試薬層中に、糖アルコールを添加するようにしたので、酵素反応等を阻害することなぐブランク電流値を抑えることができるため、直線性が良好で、かつ、センサ個々のバラツキの少ない、グノレコースに対する基質特異性及び保存安定に優れた、高精度の測定が可能なバイオセンサを実現することができる。

[0038] また、本発明のバイオセンサによれば、 FAD— GDHを含む試薬層中に、可溶化蛋白質を添加するようにしたので、酵素反応等を阻害することなぐへマトクリットの影響および環境温度の影響を緩和することができる、血液中に存在する様々な夾雑物質との不必要な反応をも併せて抑制することができる、保存安定性及びグルコースに対する基質特異性に優れた高精度の測定が可能なバイオセンサを実現することができる。

図面の簡単な説明

[0039] [図 1]図 1は、本発明のバイオセンサの構成例を示す図である。

[図 2]図 2は、本発明のバイオセンサの他の構成例を示す図である。

[図 3]図 3は、試料液としてマルトースを添加した場合のセンサ応答特性を示す図である。

[図 4]図 4は、試料液としてグノレコースを添カ卩した場合のセンサ応答特性を示す図である。

[図 5]図 5 (a)は、試料液として精製水を用いた場合のブランク値を示す図、図 5 (b) は、試薬として有機酸を用い、試料液として精製水を添加した場合のブランク値を示す図、図 5 (c)は、試料液としてグルコース濃度を添加した場合のセンサ応答特性を示す図である。

[図 6]図 6は、試料液として全血を用いた場合のセンサにおいて、アミノ酸の一例であるタウリンの添加による電流値の応答特性を示す図である。

[図 7]図 7 (a)は、試料液として全血を用い、試薬層に糖アルコールを添加した場合の高温高湿環境下での保存特性を示す図、図 7 (b)は、ノックグラウンド電流の応答特性を示す図、図 7 (C)は、電流の応答特性を示す図である。

[図 8]図 8 (a)は、試料液として全血を用いた場合のセンサ応答特性に対するへマトクリットの影響を示す図、図 8 (b)は、試薬層中に BSAを添加した場合のセンサ応答特性に対するへマトクリットの影響を示す図である。

符号の説明

[0040] 1 基板

2 作用極

3 対極

検知電極

5 試薬層

6 スぺーサ

6a 切り欠き部

7 キヤビティ

8 カバー

9 空気孔

10、 11、 12 リード部

101 基板

102 作用極

103 対極

105 試薬層

106 スぺーサ

106a 切り欠き咅

107 キヤビティ

108 カバー

109 空気孔

110、 111 リード咅

発明を実施するための最良の形態

[0041] 以下に、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。 [0042] (実施の形態 1)

以下に、本発明の実施の形態 1によるバイオセンサについて説明する。

[0043] 図 1は、本実施の形態 1による 3電極方式のバイオセンサの構成例を示す図である

[0044] 図 1に示す 3電極方式のバイオセンサは、その表面に電気伝導層が形成された絶縁性基板 1と、試薬層 5と、切り欠き部 6aを有するスぺーサ 6と、空気孔 9を有する力バー 8とを備えたものである。

[0045] 上記絶縁性基板 1の材料としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリイミドなどがある。

[0046] 上記電気伝導層の材料としては、金、白金、パラジウムなどの貴金属やカーボンなどの単体材料、あるいは、カーボンペーストや貴金属ペーストなどの複合材料があげられる。

[0047] 上記スぺーサ 6およびカバー 8の材料としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリ力ーボネート、ポリイミド、ポリブチレンテレフタレート、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ナイロンなどがあげられる。

[0048] このような構成のバイオセンサの作製方法にっレ、て説明する。

[0049] 絶縁性の基板 1上に、電気伝導層をスパッタリング蒸着法やスクリーン印刷法などによって形成後、レーザなどを用いてスリットを設けることにより、作用極 2、対極 3、および検知電極 4を形成する。検知電極 4とは、検体量の不足を検知するための電極として機能するだけでなぐ参照電極あるいは対極の一部として用いることも可能である。

[0050] そして、電極 2、 3、 4上に、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするダルコ一スデヒドロゲナーゼ（以下、 FAD— GDHと呼ぶ）、電子伝達体、および添加剤を含む試薬層 5を形成する。その後、試薬層 5及び電極 2、 3、 4上に、スぺーサ 6と、カバー 8とを貼り合わせることにより、試料液が供給されるキヤビティ 7を形成する。なお、バイォセンサへの試料液供給は、毛細管現象により実現されるが、キヤビティ 7内の空気をバイオセンサ外部へ逃がすための空気孔 9をカバー 8に設けることで、毛細管現象を促進し、試料液の供給をスムーズに行うことができる。 [0051] 試料液は、キヤビティ 7の入り口から毛細管現象によりキヤビティ 7内に供給され、試薬層 5の位置に到達すると、試料液中の特定成分が、試薬層 5に含まれる試薬と反応する。この反応により生じる電流の変化量を、作用極 2、対極 3、検知電極 4のそれぞれのリード部 10、 11、 12を通じて接続された外部の測定装置により読み取り、試料液中の特定成分を定量する。

[0052] 以下に、試薬層 5中に含まれる試薬構成について説明する。

[0053] まず、酵素について説明する。

[0054] 本実施の形態 1では、試薬層 5中に含む酵素として FAD— GDHを採用している。

以下に、 FAD— GDHを採用した理由について、図 3及び図 4を用いて説明する。

[0055] 図 3に、グルコース濃度 80mg/dLの存在下で、マノレトースを 0〜200mg/dLの濃度範囲で添加した場合のセンサ応答特性を示す。図 3において、縦軸は、 PQQ- GDH及び FAD— GDHのマルトースに対する作用性（マルトース Omg/dL感度からの乖離度（％) )を、横軸は、添加マルトース濃度 (mg/dL)を表してレ、る。

[0056] PQQ— GDHは、従来のバイオセンサで使用している酵素であり、マルトースの添加量に比例してセンサ応答値が上昇している。一方、 FAD— GDHは、本実施の形態 1のバイオセンサで採用している酵素であり、マルトースの添加量を増加させても、センサ応答値は、マルトース無添加の時と変わらず低い値を示しており、マルトースへの作用性が低レ、ことが分かる。

[0057] 図 4に、試料液としてグノレコースを添加した場合のセンサ応答特性を示す。図 4において、縦軸は、センサ応答値（電流値 A) )を、横軸は、グルコース濃度 (mg/d L)を表している。

[0058] PQQ— GDHを酵素として用いた場合、グルコース濃度に比例してセンサ応答値が上昇している。また、 FAD— GDHを酵素として用いた場合、 PQQ— GDHを用いた場合と同様、グルコース濃度に比例してセンサ応答値が上昇している。したがって、両酵素のグルコースに対する作用性はほぼ同じである。

[0059] 以上のことから、本実施の形態 1で採用している酵素 FAD— GDHは、従来のバイォセンサで採用されている酵素 PQQ— GDHとほぼ同じグルコースに対する基質特異性を有しながら、マルトースに対する作用性は低いことがわかる。 [0060] 従って、本実施の形態 1では、酵素として FAD— GDHを採用することで、ダルコ一スに対する基質特異性に優れ、マルトースに対する作用性の低い、つまり、ダルコ一スとの相関がよぐマルトースの影響を受けない、優れたバイオセンサを実現することができる。

[0061] 次に、添加剤について説明する。

[0062] 本実施の形態 1では、試薬層 5中に添加する添加剤として、分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸、もしくは有機酸塩を用いた。

[0063] この分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸、もしくは有機酸塩は、酸化型の電子伝達体と、試薬中に含まれる酵素蛋白に存在する反応性に富んだ一部の官能基とが接触して、電子伝達体が酸化型から還元型に変性する（還元される）ことを抑制する働きがある。

[0064] そのため、試薬層 5中に、分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸、もしくは有機酸塩を添加することで、熱や水分の介在下において、試薬層 5に含まれる FAD— GDHと電子伝達体との還元反応により発生するノイズ電流を抑制し、バイオセンサの性能が悪化するのを防ぎ、保存安定性を高めることができる。さらに、血液中、特には血球に存在する様々な夾雑物質との不必要な反応をも併せて抑制することができるため、センサ個々のバラツキを抑え、良好な直線性を実現、つまり、回帰式の傾きが大きく切片が小さくすることができ、高精度の測定を行うことができる

[0065] なお、分子内に少なくとも一つのカルボキシノレ基を有する有機酸もしくは有機酸塩としては、脂肪族カルボン酸、炭素環カルボン酸、複素環カルボン酸等や、それらの塩が挙げられる。

[0066] 例えば、脂肪族カルボン酸としては、マロン酸、コハク酸、グノレタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸などや、それらの塩があげられる。効果の度合いは、直鎖が長く分子量の大きいものほど大きぐ炭化水素鎖が 3つ以上あるもの力特に好ましい。また、ノォセンサに用レ、る試薬としては、水に対する溶解性が高いことが求められるため、分子構造中に、より多くの親水性官能基を持つものがより好ましい。

[0067] 炭素環カルボン酸としては、安息香酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸などや、それらの塩があげられ、これらを用いることでも前記と同様の効果を得ることができる。

[0068] 複素環カルボン酸としては、 2—フノレ酸、ニコチン酸、イソニコチン酸などや、それらの塩があげられ、これらを用レ、ることでも、前記と同様の効果を得ることができる。

[0069] 上述の脂肪族ならびに炭素環カルボン酸、複素環を有するカルボン酸もしくはカルボン酸塩以外にも、カルボン酸ならびにカルボン酸塩の一部の官能基が別の官能基に置き換えられた、例えばリンゴ酸、ォキサ口酢酸、クェン酸、ケトグルタル酸などやそれらの塩においても前記と同様の効果を得ることができる。

[0070] これらの有機酸もしくは有機酸塩のなかで最も好適なものは、ダルタル酸、アジピン酸、フタル酸、安息香酸である。

[0071] なお、これらの有機酸もしくは有機酸塩の添カ卩量は、酵素溶液濃度 500〜2500U /mlに対し、試薬溶液濃度として 0. 0005〜： !OOmM範囲が適当である。

[0072] このような実施の形態 1のバイオセンサによれば、試薬層 5中に、グノレコースに対する基質特異性の優れた FAD— GDHと、少なくともカルボキシノレ基を有する有機酸もしくは有機酸塩とを含ませるようにしたので、酵素反応等を阻害することなぐブランク電流値を抑えることができ、また、血液中に存在する様々な夾雑物質との不必要な反応をも併せて抑制することができるため、グルコースに対する基質特異性及び保存安定性を高めることができ、高精度の測定を行うことができる。

[0073] (実施の形態 2)

以下に、本発明の実施の形態 2によるバイオセンサについて説明する。

[0074] 本実施の形態 2によるバイオセンサは、図 1で示した試薬層 5が、 FAD-GDH,電子伝達体、および、分子内に少なくとも一つのアミノ基もしくはカルボ二ル基を有する有機酸または有機酸塩を含むことを特徴とする。なお、他の構成要素は、上記実施の形態 1によるバイオセンサと同様であるため説明を省略する。

[0075] 以下、添加剤について説明する。

[0076] 本実施の形態 2では、試薬層 5に添加する添加剤として、分子内に少なくとも一つのァミノ基もしくはカルボ二ル基を有する有機酸、または有機酸塩を用いた。

[0077] 分子内に少なくとも一つのアミノ基、もしくはカルボ二ル基を有する有機酸、または有機酸塩は、試薬層 5の表面状態を極めて平滑、且つ均質に形成することができる。

[0078] 特に、試薬層 5中に電子伝達体として用いられるフェリシアンィ匕カリウムなどの無機塩を含む場合には、試薬溶液の乾燥過程において試薬層が結晶化しやすいが、試薬層 5中に、分子内に少なくとも一つのアミノ基、あるいはカルボ二ル基を有する有機酸、もしくは有機酸塩が含まれることにより、当該無機塩の結晶の成長を阻害することができる。

[0079] そして、結晶の成長を阻害された無機塩は、微少な粒子状態で試薬層 5中に存在するため、酵素分子と密に、均一に接触することが可能となり、酵素分子との電子伝達効率が良好な試薬層状態が実現できる。また、試薬層の溶解性を高めることができるため、センサの感度、ならびに直線性を飛躍的に高めることが可能となる。

[0080] なお、分子内に少なくとも一つのアミノ基、あるいはカルボ二ル基を有する有機酸、もしくは有機酸塩としては、グリシン、ァラニン、ノリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチォニン、ァスパラギン、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルァラニン、トリプトファン、プロリンなどや、それらの塩、あるいはサルコシン、ベタイン、タウリンなどのアミノ酸、もしくはそれらの置換体あるいは誘導体及びその塩が挙げられる。また、これらのアミノ酸もしくは置換体、あるいは誘導体、及びその塩の中でも、グリシン、セリン、プロリン、トレオニン、リシン、タウリンは、特に結晶化阻害の効果が高く好適である。

[0081] なお、これらのアミノ酸、もしくはそれらの置換体あるいは誘導体及びその塩の添カロ量は、酵素溶液濃度 500〜2500U/mlに対し、試薬溶液濃度として 10〜： !OOmM が適当である。

[0082] このような実施の形態 2のバイオセンサによれば、試薬層 5中に、グノレコースに対する基質特異性の優れた FAD— GDHと、少なくともアミノ基もしくはカルボ二ル基を有する有機酸、あるいは有機酸塩とを含ませるようにしたので、試薬層を緻密かつ均質に形成することができるとともに、センサのグノレコース濃度に対する応答性を飛躍的に高めることができ、高精度の測定を行うことができる。

[0083] (実施の形態 3)

以下、本発明の実施の形態 3によるバイオセンサについて説明する。 [0084] 本実施の形態 3によるバイオセンサは、図 1で示した試薬層 5が、 FAD— GDH、電子伝達体、及び糖アルコールを含むことを特徴とする。なお、他の構成要素は、上記実施の形態 1によるバイオセンサと同様であるため説明を省略する。

[0085] 以下、添加剤について説明する。

[0086] 本実施の形態 3では、試薬層 5に添加する添加剤として、糖アルコールを用いた。

[0087] 糖アルコールは、酸化型の電子伝達体と、試薬中に含まれる酵素蛋白に存在する反応性に富んだ一部の官能基が接触して、電子伝達体が酸化型から還元型に変性する（還元される）ことを抑制する働きがある。

[0088] そのため、試薬層 5中に、糖アルコールを添加することで、熱や水分の介在下におレ、て、試薬層 5に含まれる FAD - GDHと電子伝達体との還元反応が生じることにより発生するノイズ電流を抑制することができるため、バイオセンサの性能が悪化することを防ぐことができる。また、血液中、特には血球に存在する様々な夾雑物質との不必要な反応をも併せて抑制することができるため、直線性が良好で、かつ、センサ個々のバラツキを抑制することができる。

[0089] なお、糖アルコールとしては、ソノレビトーノレ、マルチトール、キシリトール、マンニトーノレ、ラタチトール、還元パラチノース、ァラビ二トール、グリセロール、リビトーノレ、ガラクチトール、セドヘプチトール、ペルセィトール、ボレミトーノレ、スチラシトール、ポリガリトール、イジトール、タリトーノレ、ァリトール、イシリトール、還元澱粉糖化物、イシリトールなどの鎖状の多価アルコールや、環式糖アルコールがあげられる。また、これらの糖アルコールの立体異性体、置換体、または誘導体であっても、同様の効果を得ることができる。なお、これらの糖アルコールの中でも、マルチトール、ラタチトールは、比較的材料単価が安ぐ容易に入手もでき、また、ノイズ電流を抑制する効果が飛躍的に高いため、最も好適な材料であると言える。

[0090] なお、これら糖アルコールの添加量は、酵素溶液濃度 500〜2500UZmlに対し、試薬溶液濃度として 0.：!〜 50mMが適当である。

[0091] このような実施の形態 3のバイオセンサによれば、試薬層 5中に、グノレコースに対する基質特異性の優れた FAD— GDHと、糖アルコールとを含ませるようにしたので、酵素反応等を阻害することなぐブランク電流値を抑えることができ、また、血液中に存在する様々な夾雑物質との不必要な反応をも併せて抑制することができるため、グルコースに対する基質特異性及び保存安定性を高めることができ、高精度の測定を行うことができる。

[0092] (実施の形態 4)

以下、本発明の実施の形態 4によるバイオセンサについて説明する。

[0093] 本実施の形態 4によるバイオセンサは、図 1で示した試薬層 5が、 FAD_GDH、電子伝達体、及び可溶化蛋白質を含むことを特徴とする。なお、他の構成要素は、上記実施の形態 1によるバイオセンサと同様であるため説明を省略する。

[0094] 以下、添加剤について説明する。

[0095] 本実施の形態 4では、試薬層 5に添加する添加剤として、可溶化蛋白質を用いた。

[0096] 可溶化蛋白質は、酵素反応等を阻害することなぐ薬剤等の運搬作用、浸透圧の維持、電解質バランスの維持など多彩な働きを有する。

[0097] そのため、試薬層 5中に、可溶化蛋白質を添加することで、酵素反応等を阻害することなく、グルコース電極近傍への供給を制限することができ、へマトクリットの影響、および環境温度の影響を低減することができる。

[0098] なお、可溶化蛋白質としては、ゥシ血清アルブミン（BSA)、卵アルブミン、ゼラチン、コラーゲン等があげられる。

[0099] なお、これら可溶化蛋白質の添加量は、酵素溶液濃度 500〜2500U/mlに対し、 0. 01〜： 1. OOwt%が適当である。

[0100] このような実施の形態 4のバイオセンサによれば、試薬層 5中に、グノレコースに対する基質特異性の優れた FAD— GDHと、可溶化蛋白質とを含ませるようにしたので、酵素反応等を阻害することなぐへマトクリットの影響、および環境温度の影響を緩和することができ、保存安定性、かつグノレコースに対する基質特異性を高め、高精度の測定を行うことができる。

[0101] なお、上記実施の形態 1から 4では、上記試薬層 5中に添加する添加剤として、分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸もしくは有機酸塩、分子内に少なくとも一つのアミノ基もしくはカルボ二ル基を有する有機酸あるいは有機酸塩、糖アルコール、可溶化蛋白質をそれぞれ添加した例を説明したが、さらにはそれらを組み合わせることも可能である。

[0102] また、上記実施の形態 1から 4において、試薬中に含まれる電子伝達体としては、フエリシアン化カリウム、 p—べンゾキノンおよびその誘導体、フエナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フエ口センおよびその誘導体などを用いることができる。

[0103] また、上記実施の形態 1から 4では、試薬層 5が、電極上に設けられるものとして説明をしたが、具体的には、電極上の全面、もしくは一部に、試薬層 5を配置することができ、また、それ以外にも、バイオセンサの性能を悪化させることのない範囲内、すなわち、試薬層中の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が設けられるよう、試薬層 5を配置してもよい。

[0104] また、上記実施の形態 1から 4では、 3電極方式のバイオセンサについて示したが、 2電極方式のバイオセンサを作製しても良レ、。この 2電極方式のバイオセンサの構成例を図 2に示す。

[0105] 図 2に示す 2電極方式のバイオセンサは、絶縁性基板 101と、試薬層 105と、スぺーサ 106と、カバー 108とを有する。各構成要素の材料は、図 1と同様のものが考えられる。

[0106] このようなバイオセンサの作製方法について説明する。

[0107] 絶縁性の基板 101上に、電気伝導層をスパッタリング蒸着法やスクリーン印刷法などにより形成後、レーザなどを用いてスリットを設けることにより作用極 102、および対極 103を形成する。この電極上に、 FAD— GDH、電子伝達体、および添加剤を含む試薬層 105を形成する。そして、試薬層 105及び電極 102、 103上に、切り欠き部 106aを有するスぺーサ 106とカバー 108とを貼り合わせることにより、試料液が供給されるキヤビティ 107が形成される。

[0108] 試料液は、キヤビティ 107の入り口から毛細管現象によりキヤビティ 7内に供給され、試薬層 5の位置に到達すると、試料液中の特定成分が、試薬層 105に含まれる試薬と反応する。この反応により生じる電流の変化量を、作用極 102、対極 103のそれぞれのリード部 110、 111を通じて接続された外部の測定装置により読み取り、試料液中の特定成分を定量する。

[0109] (実施例 1) ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁基板 101上に、スクリーン印刷により作用極 102と、対極 103と、力なる電極層を設ける。その電極層上に、酵素（FAD— GDH : 600〜1500U/ml)、電子伝達体（フェリシアン化カリウム）、アミノ酸（タウリン： 50〜 85mM)、および糖アルコール（マルチトール： l〜3mM)を含んだ試薬層 105を形成する。その上に、ポリエチレンテレフタレートからなるスぺーサ 106と、同じくポリエチレンテレフタレートからなるカバー 108とを設ける。このようにして 2電極方式の血糖値測定センサを作製した。

[0110] 上記作製した血糖値測定センサに、試料液として精製水を用いた場合のセンサ応答値 (ブランク電流値）を計測する。その結果を、図 5 (a)に示す。ここでは比較のため、酵素として PQQ— GDHを用レ、、試薬層中に、酵素溶液濃度 1000〜： 1500U/ mlに対して、 0. 05〜0.15mMのクェン酸塩、タウリン 50〜85mM、マルチトール 1 〜3mMが添加された従来のバイオセンサのセンサ応答特性を示した。

[0111] この図 5 (a)から分かるように、従来の PQQ— GDHを用いたバイオセンサのブランク電流値は、約 0. 03 /i Aであるのに対し、本発明の FAD— GDHを用いたバイオセンサのブランク電流値は、 0. 40 /i Aと高い値を示している。ブランク電流値が高いと、グルコースの正確な定量ができなくなるため，ブランク電流値を抑える必要がある。

[0112] そこで、ノイズ電流を抑制する働きのある有機酸を試薬層に添加した。具体的には、 FAD— GDH酵素溶液濃度 1500U/mlに対し、フタル酸塩の濃度を 0. 05mM、クェン酸塩の濃度を 0· 08mMとなるよう調製して添加したところ、図 5 (b)に示すように、無添加時に比べ、ブランク電流値が小さくなつた。また、フタル酸塩の濃度を 0. 0 15mM、クェン酸塩の濃度を 0. 24mMに調製し添加した場合には、ブランク電流値力り小さくなつた。

[0113] このときのグルコース濃度に対するセンサ応答電流値を、図 5 (c)に示す。図 5 (c) に示すように、 FAD— GDHに、上述したように調製した有機酸を添カ卩しても、 PQQ — GDHとほぼ同程度の、グルコースに対する基質特異性を有していることが分かる

[0114] 以上のように、試薬層中に有機酸を添加することで、ブランク電流値が小さぐダルコースに対する基質特異性が高い、高精度の測定が可能なバイオセンサを作製すること力 Sできる。

[0115] (実施例 2)

次に、試薬層 105にアミノ酸を添加した場合のセンサ応答特性について説明する。

[0116] 本実施例 2のバイオセンサは、上記実施例 1と同様の手順により作製した。そして、該バイオセンサの試薬層 105に、アミノ酸の一例であるタウリンをさらに添カ卩した。

[0117] 図 6に、試薬層 105中にタウリンを OmM、 15mM、 85mM添加した場合の電流の応答特性を示す。

[0118] 図 6を見て判るように、タウリンの添力卩量を多くするほど、センサ応答特性は飛躍的に向上していることがわかる。

[0119] したがって、試薬層 105にタウリンを添加することで、グルコースに対する基質特異性に優れ、高精度の測定が可能なバイオセンサを実現することができる。

[0120] (実施例 3)

次に、試薬層 105に糖アルコールを添加した場合のセンサ応答特性について説明する。

[0121] 本実施例 3のバイオセンサは、上記実施例 1と同様の手順により作製した。そして、該バイオセンサの試薬層 105に、糖アルコールの一例であるマルチトールあるいはラクチトールをさらに添加した。また、試料液として、グルコース濃度 80mg/dlを含む全血を用い 7こ。

[0122] 図 7 (a)は、試薬層 5中にマルチトールあるいはラタチトールをそれぞれ OmM、 5m M、 lOmM添加した場合の高温高湿環境下（温度 40°C、湿度 80%)での保存特性を示す。

[0123] 図 7 (a)を見て判るように、マルチトールまたはラタチトールを添カ卩した場合の方が、高温高湿度環境による電流値上昇を抑制することができ、センサの保存特性は明らかに向上する。

[0124] また、図 7 (b)は、試薬層 105中にマルチトールあるいはラタチトールをそれぞれ 0 mM、 5mM、 lOmM添加した場合の高温高湿環境下（温度 40°C、湿度 80%)でのバックグラウンド電流の応答特性を示す。

[0125] 図 7 (b)を見て判るように、マルチトールまたはラタチトールを添加することで、高温高湿環境下でのバックグラウンド電流値の上昇を抑制することができ、センサの保存特性が向上する。

[0126] 図 7 (c)は、試薬層 105中にマルチトールあるいはラタチトールをそれぞれ OmM, 5 mM， 1 OmM添加した場合の電流の応答特性を示している。

[0127] 図 7 (c)を見て判るように、マルチトールまたはラタチトールを添加しても、センサのグノレコース濃度に対する応答特性を低下させることなく良好な直線性を維持することができる。

[0128] 以上のことから、糖アルコールであるマルチトールまたはラタチトールを添加することで、直線性が良好で、保存安定性に優れた、高精度の測定が可能なバイオセンサを実現すること力 Sできる。

[0129] (実施例 4)

次に、へマトクリットの影響について説明する。

[0130] 図 8 (a)は、試料液として、グルコース濃度 350mg/dLを含有する全血を用いた場合のセンサ応答特性に対するへマトクリットの影響を示すグラフである。図 8において、縦軸は、へマトクリット値 45%感度からの乖離を示し、横軸は、へマトクリット値を示す。

[0131] PQQ— GDHを用いた場合のセンサ応答特性と、 FAD— GDHを用いた場合のセンサ応答特性を比較すると、へマトクリット値が約 25〜75%の範囲では、へマトクリツトの影響によるセンサ応答特性の差異は見られなかった。へマトクリット値が 25%以下の低濃度範囲では、へマトクリットの影響に顕著な差異が見られ、 FAD— GDHを用いた場合の方に特にへマトクリットの影響が大きいことが認められた。

[0132] このように、酵素として FAD— GDHを用いた場合のセンサ応答特性は、 PQQ-G DHを用いた場合に比べ、特に、低へマトクリット濃度範囲において、へマトクリットの影響を受けやすい。そのため、へマトクリットの影響を受けにくい、保存安定性に優れたバイオセンサが望まれる。

[0133] そこで、試料層 105に、可溶化蛋白質である BSAを添加した。図 8 (b)は、試薬層中に BSAを添加した場合のセンサ応答特性に対するへマトクリットの影響を示す図である。 [0134] 0.1wt%の BSAを試薬層 105に添加したところ、低へマトクリット濃度範囲において、 PQQ— GDHと同程度にまでへマトクリットの影響を抑えることができた。

[0135] このように、従来の PQQ— GDHを用いたバイオセンサと同程度にまでへマトクリットの影響を抑え、保存安定性、かつグルコースに対する基質特異性に優れたバイオセンサを作製することができた。

産業上の利用可能性

[0136] 本発明によるバイオセンサは、グルコースに対する基質特異性に優れた高精度の測定が可能なグルコース用酵素センサとして、利用可能である。

Claims

請求の範囲

[1] 試料液中の特定成分と特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中の特定成分の濃度を計測するバイオセンサであって、

前記試薬層は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼと、その分子内に少なくとも 1つのカルボキシノレ基を有する有機酸もしくはその塩とを含む、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[2] 請求項 1に記載のバイオセンサにおいて、

前記試料液中の特定成分の濃度を、絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極と対極とからなる電極を用いて計測する、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[3] 請求項 2に記載のバイオセンサにおいて、

前記試薬層は、電子伝達体を含み、前記電極上に形成される、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[4] 請求項 2に記載のバイオセンサにおいて、

前記試薬層は、電子伝達体を含み、当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう形成される、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[5] 請求項 1に記載のバイオセンサにおいて、

前記有機酸は、脂肪族カルボン酸、炭酸環カルボン酸、複素環カルボン酸、もしくはそれらの置換体、あるいは誘導体である、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[6] 請求項 5に記載のバイオセンサにおいて、

前記有機酸は、クェン酸、クェン酸塩もしくはフタル酸、フタル酸塩のいずれ力 \またはそれらの組み合わせである、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[7] 試料液中の特定成分と特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中の特定成分の濃度を計測するバイオセンサであって、前記試薬層は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼと、その分子内に少なくとも 1つのアミノ基、もしくはカルボ二ル基を有する有機酸、あるいはその塩とを含む、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[8] 請求項 7に記載のバイオセンサにおいて、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[9] 請求項 8に記載のバイオセンサにおいて、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[10] 請求項 8に記載のバイオセンサにおいて、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[11] 請求項 7に記載のバイオセンサにおいて、

前記有機酸は、アミノ酸、もしくはそれらの置換体、あるいは誘導体である、ことを特徴とするバイオセンサ。

[12] 請求項 11に記載のバイオセンサにぉレ、て、

前記有機酸は、タウリンである、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[13] 試料液中の特定成分と特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中の特定成分の濃度を計測するバイオセンサであって、

前記試薬層は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼと、糖アルコールとを含む、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[14] 請求項 13に記載のバイオセンサにおいて、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[15] 請求項 14に記載のバイオセンサにぉレ、て、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[16] 請求項 14に記載のバイオセンサにぉレ、て、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[17] 請求項 13に記載のバイオセンサにおいて、

前記糖アルコールは、鎖状の多価アルコール、もしくは環式糖アルコール、あるいはそれらの置換体もしくは誘導体である、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[18] 請求項 17に記載のバイオセンサにおいて、

前記糖アルコールは、マルチトール、ラタチトールのいずれか、または両方である、ことを特徴とするバイオセンサ。

[19] 試料液中の特定成分と特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中の特定成分の濃度を計測するバイオセンサであって、

前記試薬層は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼと、可溶化蛋白質とを含む、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[20] 請求項 19に記載のバイオセンサにおいて、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[21] 請求項 20に記載のバイオセンサにおいて、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[22] 請求項 20に記載のバイオセンサにおいて、

前記試薬層は、電子伝達対を含み、当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう形成される、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[23] 請求項 19に記載のバイオセンサにおいて、

前記可溶化蛋白質は、ゥシ血清アルブミン、卵アルブミン、ゼラチン、あるいはコラ一ゲンである、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[24] 試料液中の特定成分と特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中の特定成分の濃度を計測するバイオセンサであって、

前記試薬層は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼと、その分子内に少なくとも 1つのカルボキシノレ基を有機酸もしくはその塩、その分子内に少なくとも 1つのアミノ基もしくはカルボ二ル基を有する有機酸あるいはその塩、糖アルコール、および可溶化蛋白質のうちの少なくとも 2つ以上の添加剤とを含む、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[25] 請求項 24に記載のバイオセンサにぉレ、て、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[26] 請求項 25に記載のバイオセンサにおいて、

ことを特徴とするバイオセンサ。

[27] 請求項 25に記載のバイオセンサにおいて、

ことを特徴とするバイオセンサ。