WO2007108393A1

WO2007108393A1 - 雄性生殖系列幹細胞のインビトロ増殖方法

Info

Publication number: WO2007108393A1
Application number: PCT/JP2007/055213
Authority: WO
Inventors: Mito Shinohara; Takashi Shinohara
Original assignee: Kyoto University NUC
Current assignee: Kyoto University NUC
Priority date: 2006-03-16
Filing date: 2007-03-15
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2008-09-16
Also published as: JPWO2007108393A1

Abstract

　本発明は、ＦＧＦを含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することを含む、雄性生殖系列幹細胞の増殖方法を提供する。本発明の方法を用いれば、動物種の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能となる。また、本発明の方法を用いれば、精巣細胞が由来する動物の齢の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能となり、特に出生前動物の精巣細胞から高効率で雄性生殖系列幹細胞を樹立することが可能となる。

Description

明細書

雄性生殖系列幹細胞のインビトロ増殖方法

技術分野

[0001] 本発明は、 FGFを用いる雄性生殖系列幹細胞の増殖方法、該方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞、該細胞を含む不妊治療剤、雄性生殖系列幹細胞増殖促進剤、雄性生殖系列幹細胞の製造方法、精子の製造方法、外来遺伝子が導入された雄性生殖系列幹細胞の製造方法等に関する。更に、本発明は FGFを用いる多能性幹細胞の製造方法等に関する。

背景技術

[0002] 哺乳類精巣の雄性生殖系列幹細胞 (male germline stem cell),例えば精原幹細胞（ spermatogonial stem cell)は、成体で無限に増殖し続け、減数分裂を経て精子形成に至る源となる細胞である。雄性生殖系列幹細胞は、次世代へ遺伝子を引き継ぐために分配される成体における唯一の幹細胞であるため、生体実験、医学的研究、バィォテクノロジ一等に有用である。

[0003] Brinsterらは、 1994年に in vivoで精原幹細胞を移植することに成功した（Proc. Natl . Acad. Sci. U.S.A., vol.91, No.24, p.11298-11302, 1994 :非特許文献 1)。この方法では精巣を形成する精細管内に幹細胞を移植するとコロニーをつくり、ドナー細胞由来の精子形成を起こし、仔をつくることができるというものである。これによつて、 ES細胞以外にも生殖系列細胞を操作する新しい可能性が切り開かれ、雄性生殖系列幹細胞を用いた発生工学と!/、う新、分野が確立された。

[0004] 一方、精原幹細胞の生体内における自己増殖や分化は、グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF)等のサイト力インによって制御されて、ることが明らかにされた (Cellula r and Molecular Life Sciences, vol.58, No.8, p.1061- 1066, 2001 :非特許文献 2、 Scie nce, vol.287, No.5457, p.1489- 1493, 2000 :非特許文献 3参照）。

[0005] 本願発明者らは、精原幹細胞等の雄性生殖系列幹細胞のインビトロ長期培養方法を開発した（国際公開第 2004Z092357号パンフレット：特許文献 1、 Biology of Rep reduction, vol.69, No.2, p.612-616, 2003：非特許文献 4)。新生児の精巣細胞をグリァ細胞由来神経栄養因子 (GDNF)、白血病抑制因子 (LIF)等の存在下で培養すると、生殖細胞が固有の形状のコロニーを形成し、幹細胞が 5ヶ月以上にわたり増殖した。不妊マウスの精細管に移植すると、培養した細胞は精子形成コロニーをつくり、正常な精子及び子孫を産出した。これにより、雄性生殖系列幹細胞を実用可能な程度にまで増殖させ、操作し、バイオテクノロジー等へ応用することが可能となった。

[0006] 本願発明者らは、この方法を更に改良し、培養の安定が多数種類のサイト力イン等の因子に依存していない、より安定で効率的な雄性生殖系列幹細胞の増殖方法（国際公開第 2006Z028278号パンフレット：特許文献 5)、血清やフィーダ一細胞を用いない雄性生殖系列幹細胞の増殖方法（Biol. Reprod., vol.72, p.985-991, 2005 :非特許文献 5、特開 2006— 115767号明細書:特許文献 6)を開発した。

[0007] し力しながら、これらの雄性生殖系列幹細胞の増殖方法は、主にマウスの細胞を用いて開発されたものであるため、同一の方法で他の動物種由来の雄性生殖系列幹細胞を培養した場合に、その増殖スピードが緩やかになる場合があった。また、特に単離されたば力りの精巣細胞力雄性生殖系列幹細胞の培養を榭立する段階において、精巣細胞が由来する動物の齢により、雄性生殖系列幹細胞の誘導効率が変動し、特に出生前の動物の精巣細胞を用いた場合に該誘導効率が低下する場合がめつに。

[0008] Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.102, p.17430-17435, 2005 (非特許文献 6)には、上述の特許文献 1及び非特許文献 5に開示された培養条件と類似の条件を用いたラット精原幹細胞の増殖方法が記載されている。また、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.102, p.14302-14307, 2005 (非特許文献 7)には、 GDNF,可溶性 GDNF受容体 a— 1 (GFR a - 1)及び bFGFの組み合わせカ^ット精原幹細胞の増殖を支持したことが開示されている。しかしながら、これらの方法を用いても、なお十分満足な雄性生殖系列幹細胞の増殖効率を達成することはできない。

[0009] そこで、動物種の差異や、精巣細胞が由来する動物の齢の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能な方法を開発することが望まれる。

[0010] また、本願発明者らは、上述の雄性生殖系列幹細胞のインビトロ長期培養方法と類似の条件下で精巣細胞を培養すると、 GS細胞のコロニーに加えて、 ES細胞コ口- 一と識別がつ力ない形態を呈する多能性幹細胞のコロニーが派生することを見い出した（国際公開第 2005Z100548号パンフレット：特許文献 4、 Cell, vol.119, p.1001 -1012, 2004:非特許文献 8)。この方法は、出生後の個体から多能性幹細胞を製造し得る画期的な方法であるが、その製造効率が精巣細胞が由来する動物の齢により左右され、特に出生前の精巣細胞 (例えば始原生殖細胞等)から多能性幹細胞を誘導する場合にその製造効率が低下することが見られる場合があった。

[0011] 出生前の精巣細胞力多能性幹細胞を誘導する方法としては、始原生殖細胞を S CF、 LIF及び FGF2を含む培地中で培養することにより EG細胞を製造する方法が報告されている（Cell, vol.70, p.841-847, 1992 :非特許文献 9、 Nature, vol.359, 550 -551, 1992 :非特許文献 18)。しかし、この方法も、始原生殖細胞を採取する胚の発生時期により EG細胞の誘導効率が大きく変動し、例えばマウスの場合では 14.5dpc 以降の発生段階の始原生殖細胞からは EG細胞を誘導することが出来ないことが知られている（Development, vol.120, 3197-3204, 1994:非特許文献 10)。

[0012] そこで、精巣細胞が由来する動物の齢の差異に左右されず、安定して効率よく多能性幹細胞を製造する方法を開発することが望まれる。

[0013] 一方、線維芽細胞増殖因子 (FGF)は、多様な生物学的活性を有するポリペプチド成長因子として知られている（TRENDS in Genetics, Vol.20, No.ll, p.563- 569, 2004 ：非特許文献 11)。ヒト及びマウスにおいては、 FGF1〜FGF23が確認されている。ヒト FGF19はマウス FGF15のオルソログであるので、ヒト及びマウスの FGFファミリーは 22のメンバーで構成される（Genome Biol, vol.2, 3005.1-3005.12, 2001 :非特許文献 12)。系統発生学的解析により、 FGF遺伝子ファミリ一は 7つのサブファミリー (F GF1サブファミリー、 FGF4サブファミリー、 FGF7サブファミリー、 FGF8サブファミリ一、 FGF9サブファミリー、 FGF11サブファミリー及び FGF19サブファミリー）に分類される。ヒト FGFは約 150〜300アミノ酸力もなり、約 30〜60%アミノ酸同一性を有する保存された約 120アミノ酸残基コアを含む。

[0014] FGFは多様な生物学的活性を有し、様々な細胞の培養に有用であることが報告されている。例えば、特許文献 1及び非特許文献 5には、 FGF2を用いた精原幹細胞の増殖方法が記載されている。 Cell, vol.104, p.875-889, 2001 (非特許文献 13)には、 FGF9 欠損マウスにおいて雄力雌への性転換が起こり、 FGF9が精巣の発生に関与していることが報告されている。国際公開第 96Z41523号パンフレット (特許文献 2)には、 FGF9が FGFR3の高親和性リガンドであり、骨及び軟骨の修復に関与していることが開示されている。国際公開第 96Z41620号パンフレット（特許文献 3)には、 FGF R3が間葉性骨格前駆細胞のマーカーであること、 FGFR3のリガンドである FGF9を用いて間葉性骨格前駆細胞を分離できることが開示されている。

[0015] また、 Molecular Reproduction and Development, vol.68, p.5- 16, 2004 (非特許文献 14)には、 FGF4が始原生殖細胞 (PGC)の増殖を促進することが記載されている。 Experimental Cell Research, vol.294, p.77-85, 2004 (非特許文献 15)には、 FGF4 が雄性生殖細胞をアポトーシス力も保護することが記載されている。 Development, vo 1.132, p.5399-5409, 2005 (非特許文献 16)には、 FGF7が生殖細胞の数に影響を与えることが示されている。 Oncogene, vol.21, p.899- 908, 2002 (非特許文献 17)には、 FGF4を精巣におヽて過剰発現すると、精子形成が増進されることが記載されてヽる

[0016] し力しながら、これらの細胞が精子幹細胞としての活性を有しているかは不明であるため、 FGF2以外の FGFの雄性生殖系列幹細胞増殖に対する作用や、多能性幹細胞誘導に対する効果は知られて、な、。

特許文献 1：国際公開第 2004Z092357号パンフレット

特許文献 2 :国際公開第 96Z41523号パンフレット

特許文献 3：国際公開第 96Z41620号パンフレット

特許文献 4 :国際公開第 2005Z100548号パンフレット

特許文献 5：国際公開第 2006Z028278号パンフレット

特許文献 6：特開 2006 - 115767号明細書

非特許文献 l : Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.91, No.24, p.11298-11302, 1994 非特許文献 2 : Cellular and Molecular Life Sciences, vol.58, No.8, p.1061- 1066, 200 1 非特許文献 3 : Science, vol.287, No.5457, p.1489- 1493, 2000

非特許文献 4 : Biology of Reproduction, vol.69, No.2, p.612- 616, 2003

非特許文献 5 : Biol. Reprod., vol.72, p.985- 991, 2005

非特許文献 6 : Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.102, p.17430-17435, 2005 非特許文献 7 : Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.102, p.14302-14307, 2005 非特許文献 8 : Cell, vol.119, p.1001- 1012, 2004

非特許文献 9 : Cell, vol.70, p.841-847, 1992

非特許文献 10 development, vol.120, 3197-3204, 1994

非特許文献 11 : TRENDS in Genetics, Vol.20, No.l l, p.563- 569, 2004

非特許文献 12 : Genome Biol, vol.2, 3005.1-3005.12, 2001

非特許文献 13 : Cell, vol.104, p.875- 889, 2001

特許文献 14 : Molecular Reproduction and Development, vol.68, p.5-16, 2004 非特許文献 15 : Experimental Cell Research, vol.294, p.77-85, 2004

非特許文献 16 : Development, vol.132, p.5399- 5409, 2005

非特許文献 17 : Oncogene, vol.21, p.899- 908, 2002

非特許文献 18 : Nature, vol.359, 550-551, 1992

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0017] 本発明の第 1の目的は、動物種の差異や、雄性生殖系列幹細胞が由来する動物の齢の差異による影響を最小限に抑えつつ、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を製造し、増殖させることが可能な方法を提供することである。

本発明の第 2の目的は、雄性生殖系列幹細胞が由来する動物の齢の差異による影響を最小限に抑えつつ、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞から多能性幹細胞を誘導することが可能な方法を提供することである。

課題を解決するための手段

[0018] 上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、 FGF9の存在下でラットの雄性生殖系列幹細胞を培養すると、従来法と比較して著しく高い細胞数の増加が確認された。この培養細胞を、不妊ヌードマウスの精細管内へ移植すると、精子形成コロニー形成が確認され、この培養細胞が雄性生殖系列幹細胞を含むことが証明された。同様の活性が他の FGFにお、ても確認されたことから、広く FGFが雄性生殖系列幹細胞の増殖促進効果を有することを見出した。

また、 FGF9の存在下でマウス始原生殖細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞が高い効率で誘導されることを見出した。

更に、 FGF9の存在下でマウス始原生殖細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞のみならず多能性幹細胞も誘導され、従来 EG細胞を誘導させることが出来な力つた 14.5dpc以降の段階のマウス始原生殖細胞力もでも多能性幹細胞を誘導することが可能であることを見出した。

以上の知見に基づき、本発明が完成された。

即ち、本発明は以下に関する。

[I] FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することを含む、雄性生殖系列幹細胞の増殖方法。

[2]FGFが FGF4サブファミリー、 FGF7サブファミリー、 FGF8サブファミリー、 FGF 9サブファミリー又は FGF19サブファミリーのメンバーである、 [1]記載の方法。

[3]FGFが FGF9サブファミリーのメンバーである、 [2]記載の方法。

[4]FGFが FGF4、 FGF5、 FGF6、 FGF8、 FGF9、 FGF10、 FGF16、 FGF17、 FGF18、 FGF19及び FGF20からなる群から選択されるいずれかである、 [1]記載の方法。

[5]FGFが FGF9である、 [4]記載の方法。

[6]培地が更に GDNFレセプターリガンドを含む、 [1]記載の方法。

[7]GDNFレセプターリガンドが GDNFである、 [6]記載の方法。

[8]培地が更に FGF2を含む、 [1]記載の方法。

[9]培地が更に EGFを含む、 [1]記載の方法。

[10] [1]〜[9]のいずれかに記載の方法により増幅された雄性生殖系列幹細胞。

[I I] FGF (FGF2を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞増殖促進剤。

[12]FGFが FGF4サブファミリー、 FGF7サブファミリー、 FGF8サブファミリー、 FG F9サブファミリー又は FGF19サブファミリーのメンバーである、 [11]記載の剤。 [ 13] FGFが FGF9サブファミリーのメンバーである、 [ 12]記載の剤。

[14]FGFが FGF4、 FGF5、 FGF6、 FGF8、 FGF9、 FGF10、 FGF16、 FGF17、 FGF18、 FGF19及び FGF20からなる群から選択されるいずれかである、 [11]記載の剤。

[15]FGFが FGF9である、 [14]記載の剤。

[16]更に GDNFレセプターリガンドを含む、 [11]記載の剤。

[17] GDNFレセプターリガンドが GDNFである、 [16]記載の剤。

[18]更に FGF2を含む、 [11]記載の剤。

[19]更に EGFを含む、 [11]記載の剤。

[20]FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することを含む、雄性生殖系列幹細胞の製造方法。

[21]以下の工程を含む、不妊治療剤の製造方法：

a) FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程;及び

b) a)で増殖された雄性生殖系列幹細胞を医薬として許容される担体と混合し、不妊治療剤を製造する工程。

[22]以下の工程を含む、移植された雄性生殖系列幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物の製造方法：

b) a)で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程。

[23]以下の工程を含む、精子の製造方法：

a) FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；

b) a)で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程;及び c)該非ヒト動物から精子を単離する工程。 [24]以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する胚の製造方法： a) FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；

b) a)で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程； c)該非ヒト動物から精子を得る工程；及び

d)該精子を卵に受精させ、胚を得る工程。

[25]以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法： a) FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；

b) a)で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程； c)該非ヒト動物から精子を得る工程；

d)該精子を卵に受精させ、胚を得る工程;及び

e)該胚を宿主雌動物の子宮又は卵管に移入し、非ヒト子孫を得る工程。

[26]以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法： a) FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；

b) a)で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程;及び c)該非ヒト動物を雌と交配し、非ヒト子孫を得る工程。

[27]以下の工程を含む、外来遺伝子が導入された雄性生殖系列幹細胞の製造方法：

b) a)で増殖された雄性生殖系列幹細胞に外来遺伝子を導入し、外来遺伝子が導入された雄性生殖系列幹細胞を得る工程。

[28]FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養し、雄性生殖系列幹細胞を得ることを含む、雄性生殖系列幹細胞の製造方法。

[29]FGFが FGF9サブファミリーのメンバーである、 [28]記載の方法。

[30]FGFが FGF9である、 [28]記載の方法。

[31]培地が更に GDNFレセプターリガンドを含む、 [28]記載の方法。

[32]GDNFレセプターリガンドが GDNFである、 [31]記載の方法。

[33]培地が更に FGF2を含む、 [28]記載の方法。

[34]培地が更に EGFを含む、 [28]記載の方法。

[35]前駆体が始原生殖細胞である、 [28]記載の方法。

[36] [28]〜 [35]のいずれかに記載の方法により製造された雄性生殖系列幹細胞

[37]FGF (FGF2を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞の分ィ匕誘導剤。

[38]FGFが FGF9サブファミリーのメンバーである、 [37]記載の剤。

[39]FGFが FGF9である、 [37]記載の剤。

[40]培地が更に GDNFレセプターリガンドを含む、 [37]記載の剤。

[41] GDNFレセプターリガンドが GDNFである、 [40]記載の剤。

[42]培地が更に FGF2を含む、 [37]記載の剤。

[43]培地が更に EGFを含む、 [37]記載の剤。

[44] FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養し、多能性幹細胞を得ることを含む、多能性幹細胞の製造方法。

[45]FGFが FGF9サブファミリーのメンバーである、 [44]記載の方法。

[46]FGFが FGF9である、 [44]記載の方法。

[47]培地が更に GDNFレセプターリガンドを含む、 [44]記載の方法。

[48] GDNFレセプターリガンドが GDNFである、 [47]記載の方法。

[49]培地が更に FGF2を含む、 [44]記載の方法。

[50]培地が更に EGFを含む、 [44]記載の方法。

[51]前駆体が始原生殖細胞である、 [44]記載の方法。

[52] [44]〜 [51]のレ、ずれかに記載の方法により製造された多能性幹細胞。

[53] FGF (FGF2を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する多能性幹細胞の製造用組成物。

[54]FGFが FGF9である、 [53]記載の組成物。

[55]更に GDNFレセプターリガンドを含む、 [53]記載の組成物。

[56]GDNFレセプターリガンドが GDNFである、 [55]記載の組成物。

[57]培地が更に FGF2を含む、 [53]記載の組成物。

[58]培地が更に EGFを含む、 [53]記載の組成物。

[59]前駆体が始原生殖細胞である、 [53]記載の組成物。

[60]雄性生殖系列幹細胞増殖促進剤を製造するための、 FGF (FGF2を除く）の使用。

[61]雄性生殖系列幹細胞の分ィ匕誘導剤を製造するための、 FGF (FGF2を除く）の使用。

発明の効果

本発明の方法を用いれば、動物種の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能となる。また、本発明の方法を用いれば、始原生殖系列幹細胞が由来する動物の齢の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能となり、特に出生前動物の精巣細胞から高効率で雄性生殖系列幹細胞を榭立することが可能となる。本発明の方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞は、遺伝子改変動物 (遺伝子導入動物、遺伝子欠損動物等）の作製、雄性不妊の治療、雄性不妊の治療剤の開発、生殖細胞レベルにおける遺伝子治療のための研究および薬剤の開発などに用いることが出来るので、本発明はバイオテクノロジー及び医学の分野において有用である。

更に、本発明の方法を用いれば、始原生殖系列幹細胞が由来する動物の齢の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞から多能性幹細胞を誘導することが可能となる。本発明の方法により得られた多能性幹細胞を用いれば、自家移植のための組織適合性を有する多様な組織を構築することが可能であり、再生医療、遺伝子治療等の医学分野において有用である。また、当該多能性幹細胞はトランスジヱニック動物やノックアウト動物等の遺伝子改変動物の作製に用いることが出来るので、バイオテクノロジー分野において有用である。図面の簡単な説明

[図 1]ラット精原幹細胞の増殖に対する FGF9の効果を示したグラフである。

[図 2]ラット精原幹細胞の増殖に対する FGF9の効果を示したグラフである。独立した 3回の試験の結果を示す。黒印は FGF9非添加群を、白印は FGF9添加群を示す。

[図 3]ラット GS細胞の増殖に対する種々の組み合わせのサイト力インの効果を示すグラフである。全ての培養には FGF9が添カ卩されている。 E :EGF、 F:FGF2、 G : GDN F₀

[図 4]ラット精巣細胞からの GS細胞コロニーの榭立に対する FGF9の効果を顕微鏡で観察した結果を示す写真である。

[図 5]GFP標識されたラット GS細胞が移植されたレシピエントマウス精巣を UV光下で観察した結果を示す図である。ドナー細胞由来の広大な GFP陽性精子形成コ口- 一が認められる。

[図 6]顕微受精に用いた精子形成細胞を可視光及び UV下で観察した結果を示す写真である。写真中央にドナー細胞由来の GFP陽性円形精細胞 (round spermatid)が認められる。

[図 7]FGF9を含む培地中で増殖されたラット GS細胞由来の子孫を可視光及び UV 下で観察した結果を示す写真である。 GS細胞が GFPラット由来であるため、その子孫 (右のラット）は UV下で蛍光を示す。

[図 8]EGFP遺伝子のトランスフエクシヨンから 3日後のラット GS細胞を可視光及び UV 下で観察した結果を示す写真である。バー： 200 m

[図 9]G418選択により樹立された、安定な EGFP遺伝子導入 GS細胞を、 UV下で観察した結果を示す写真である。トランスフエクシヨンから 99日後の細胞の様子を示す

[図 10]マウス始原生殖細胞を FGF9を含む培地で培養することにより得られた雄性生殖系列幹細胞を示す写真である。

[図 11]12. 5dpcのマウス始原生殖細胞を FGF9を含む培地で培養することにより誘導された多能性幹細胞のコロニーを示す写真である。

発明を実施するための最良の形態 [0022] 1.雄件牛適系列幹細胞の方法 (方法 I)

本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法は、 FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することを特徴とする。 FGFを用いることによって、雄性生殖系列幹細胞の増殖効率が飛躍的に上昇する。

[0023] 本発明の方法 Iによれば、雄性生殖系列幹細胞を雄性生殖系列幹細胞としての能力を保持したまま、高い効率で増殖させることが可能となる。本明細書において、雄性生殖系列幹細胞としての能力を保持したままの雄性生殖系列幹細胞の増殖を「増幅」という。

[0024] 本発明の方法 Iは、 FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、既存の雄性生殖系列幹細胞力新たな雄性生殖系列幹細胞を製造する方法でもある。

[0025] 本明細書において、雄性生殖系列幹細胞とは、自己複製し、精子又はその前駆細胞 (例えば精原細胞、精細胞、精祖細胞、精母細胞、精娘細胞等)へ分化し得る能力（雄性生殖系列幹細胞としての能力）を有する生殖系列細胞を、う。雄性生殖系列幹細胞としては、例えば、精原幹細胞、 GS細胞等が挙げられる。

[0026] GS細胞とは、インビトロで GDNFレセプター作動性化合物（GDNF等）に依存的に増殖された精原幹細胞、例えば、 Biol. Reprod., vol.69, p612-616, 2003に記載された方法により増殖された精原幹細胞をいう。

[0027] 細胞が雄性生殖系列幹細胞であるか否かは、例えば、 Brinster, RL et al.， Proc Na tl Acad Sci USA, vol.91, No.24, p.11298-11302, 1994等に記載された方法に従って

、不妊の雄性動物の精細管内に対象の細胞を移入し、該細胞が精細管内で精子形成コロニーを形成する能力を有する力否かを試験することにより判別することができる

。該試験の結果、精子形成コロニーを形成する能力を有する細胞は雄性生殖系列幹細胞であると判別される。

[0028] また、細胞が雄性生殖系列幹細胞である力否かは、例えば、フローサイトメーター等を用いて、細胞表面マーカー等の発現を解析することによつても判別し得る。有用な細胞表面マーカーとしては、 j8 1—インテグリン、 α 6—インテグリン、 EE2、EpCA M、 SSEA— 1、 c—kit、 CD9、フォルスマン抗原等が挙げられる（例えば、 WO2004 /092357等を参照）。

[0029] 本発明の方法 Iにおいて用いられる雄性生殖系列幹細胞は、脊椎動物由来の細胞であれば特に限定されない。該脊椎動物としては、例えば、哺乳動物、鳥、魚、両生動物および爬虫類動物が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげつ歯類やゥサギ等の実験動物、ブタ、ゥシ、ャギ、ゥマ、ヒッジ、ミンク等の家畜、ィヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、ァカゲザル、マーモセット、ォランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。鳥類としては、二ヮトリ、ゥズラ、ァヒル、ガチョウ、シチメンチヨウ、オーストリッチ、エミュ、ダチョウ、ホロホロ鳥、ハト等を挙げることができる。脊椎動物は、好ましくは哺乳動物である。

[0030] 当該哺乳動物は、本発明の方法 Iにより雄性生殖系列幹細胞を増殖し得る限り、出生前であっても、出生後であってもよい。

[0031] 出生後の雄性生殖系列幹細胞を用いる場合、該細胞が由来する動物の齢は、本発明の方法 Iにより雄性生殖系列幹細胞を増殖し得る限り特に限定されず、新生仔、幼仔、成体、老体のいずれであってもよいが、若齢の動物ほど精巣に含まれる幹細胞 (精原幹細胞等)の頻度が高いこと等から、製造効率の観点力はより若齢の動物を用いることが好ましい。

[0032] 本発明の方法 Iにおいて用いられる雄性生殖系列幹細胞は、単離 ·精製されたものであってもよぐあるいは、雄性生殖系列幹細胞を含む精巣細胞として本発明に用いられてもよい。精巣細胞は、上記脊椎動物の精巣より自体公知の方法で調製することができる。例えば精巣を摘出し、摘出された精巣をコラゲナーゼ、トリプシン、 DNase などの分解酵素で消化することにより、精巣細胞を分散させる（例えば、 WO2004/09 2357等を参照)。分散された精巣細胞は培養液により洗浄され、回収される。

[0033] 雄性生殖系列幹細胞の単離，精製は、例えば雄性生殖系列幹細胞に特異的に発現する細胞表面抗原を認識する抗体を用いて、セルソーターや、抗体磁性マイクロビーズ等を用いる方法などにより行うことができる。例えば、精原幹細胞は、《6—ィンテグリン、 c kit、 CD9等の細胞表面抗原を指標に濃縮することができる (例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 8346-8351, 2001等を参照)。あるいはへキスト等の d yeを用いて精原幹細胞を濃縮することも可能である（例えば、 Development, 131, 479 -487, 2004等を参照）。また、接着性の低い培養プレート（例えば、 ultoralow attachm ent plate (Nunc)等）上で、精巣細胞を 7〜10日間培養後、プレート上に接着したコロニー形成細胞を採取することによつても精原幹細胞を濃縮することが出来る。

[0034] 雄性生殖系列幹細胞は、本発明の方法 Iに用いられる前にインビトロで培養されていてもよい。この前培養の条件は、特に限定されないが、例えば、 WO2004/092357 や Biol. Reprod., vol.72, p.985-991, 2005に記載されているように、上述の酵素処理で得られた精巣細胞を GDNF、 LIF、 EGF及び FGF2等の存在下で培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖させることができる。

[0035] FGFは、公知のサイト力インであり、ヒト及びマウスにおいては、 FGF1〜FGF23が確認されている。ヒト FGF19はマウス FGF15のオルソログであるので、ヒト及びマウスの FGFファミリ一は 22のメンバーで構成される（TRENDS in Genetics, Vol.20, No.ll, p.563-569, 2004、 Genome Biol, vol.2, 3005.1—3005.12, 2001)。本明細書において、 FGFの呼称はヒト FGFのノメンクラチヤに従うものとする。

[0036] FGFとしては、例えば、表 1に示されるような、ヒト及びマウスの FGFを挙げることが出来る。表 1は、ヒト及びマウスの野生型 FGFのアミノ酸配列の Genbankァクセッション番号を示す。

[0037] [表 1]

ァクセッション

FGF ヒ卜マウス

ヌクレオチドアミノ酸ヌクレ才チドアミノ酸

X65778

U67610 AAC52907

FGFl E03692 CAA46661

30641 AAA37618

E04557

M30644 AAA37621

AF065903 AAC17503

FGF2 AAA52448

AF065904 AAC17504

m

AF065905 AAC17505

FGF3 X14445 CAA32615 Y00848 CAA68767

NM_002007

FGF4 NP.001998 M30642 AAA37619

E03343

FGF5 M37825 AAB06463 30643 AAA96698

FGF6 X63454 CAA45054 M92416 AAA62261

FGF7 M60828 AAA63210 Z22703 CAA80403

U36223 AAB17893

FGF8 Z48746 CAA88637

U56978 AAB03787

U33535 AAC52529

FGF9 D14838 BM03572

D38258 BAA07410

FGF10 AB002097 BAA22331 D89080 BAA22836

FGF" U66199 AAB18915 U66203 AAB18919

FGF12 U66197 AAB18913 U66201 AAB18917

U66202 AAB18918

FGF13 U66198 AAB18914

AF020737 AAB71606

FGF14 U66200 AAB18916 U66204 AAB18920

FGFl 5* - - AF007268 AAB63197

FGF16 AB009391 BAA24956 AB049219 BAB16405

FGF17 AB009249 BAA25429 AB009250 BAA25430

AB007422 BAA31986 AB004639 BAA31980

FGF18

AF075292 AAC62240 AF075291 AAC62239

AB018122 BAA75500

FGF19* - - AF110400 AAD45973

AB030648 BAB03530

FGF20 AB049218 BAB16 06

AB044277 BAB03633

FGF21 AB021975 BAA99415 AB025718 BAA99416

FGF22 AB021925 BAB13479 AB036765 BAB16407

AB037973 BAB13477 AB037889 BAB13478

FGF23

AF263537 AAG09917 AF263536 AAG09916

*ヒト FGF19はマウス FGF15のオルソログである。

FGFは、系統発生学的解析に基づき 7つのサブファミリー（FGF1サブファミリー、 F GF4サブファミリー、 FGF7サブファミリー、 FGF8サブファミリー、 FGF9サブファミリ一、 FGF11サブファミリー及び FGF19サブファミリー）に分類される。 FGF1サブファミリ一は、 FGFl (aFGF)及び FGF2 (bFGF)力らなる。 FGF4サブファミリ一は、 FG F4、 FGF5及び FGF6力らなる。 FGF7サブファミリ一は、 FGF3、 FGF7 (KGF)、 F GF10及び FGF22からなる。 FGF8サブファミリ一は、 FGF8、 FGF17及び FGF18 からなる。 FGF9サブファミリ一は、 FGF9、 FGF16及び FGF20からなる。 FGF11サブファミリ一は、 FGF11、 FGF12、 FGF13及び FGF14からなる。 FGF19サブファミリ一は、 FGF19、 FGF21及び FGF23力らなる。

[0039] 本発明の方法 Iに用いられる FGFは、好ましくは、 FGF4サブファミリー、 FGF7サブファミリー、 FGF8サブファミリー、 FGF9サブファミリー又は FGF19サブファミリーのメンバーであり、より好ましくは、 FGF9サブファミリーのメンバーである。

[0040] 本発明の方法 Iに用いられる FGFは、好ましくは、 FGF4、 FGF5、 FGF6、 FGF8、 FGF9、 FGF10、 FGF16、 FGF17、 FGF18、 0 19及び。 20からなる群から選択されるいずれかであり、より好ましくは、 FGF9である。

[0041] 培地中に含まれる FGFの濃度は、雄性生殖系列幹細胞の増殖を促進し、該細胞の増殖を達成しうる濃度であれば特に限定されないが、通常 0. 05ngZml〜： LOOm gZml、例えば 0. 5ngZml〜： LOO /z gZml、好ましくは 0. 5ng/ml~10 μ g m より好ましくは 0. 511₈/1111〜1 ₈/1111、更に好ましくは0. 5〜200ng/ml、より!/、つそう好ましくは 0. 5〜50ngZml、最も好ましくは 2〜20ngZmlである。

[0042] 本発明の方法 Iにおいて用いられる培地は、更に GDNFレセプターリガンドを含むことが好ましい。 GDNFレセプターリガンドとは、 GDNFレセプター又は該レセプターの補助レセプターに結合して、該レセプターを介して細胞や生体を活性化し得る化合物を意味する。例えば、本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において用いられたときに、 GDNFレセプターを介して雄性生殖系列幹細胞の増殖を促進し、該細胞の増殖を達成し得る物質を!ヽぅ。

[0043] GDNFレセプターリガンドとしては、例えば、グリア細胞由来神経栄養因子（GDN F)、ノルトリン（Neurturin)、ぺルセフィン（Persephin)、アルテミン (Artemin)等が挙げられる。 GDNFレセプターリガンドは、好ましくは GDNFである。

[0044] GDNFとしては、例えば、ヒト及びラッ HWO93Z06116号パンフレット）、マウス（例えば Gene 203, 2, 149-157, 1997参照)等の GDNFが例示される。

[0045] GDNFレセプターとは、 GDNFの結合物質であって、 GDNFのシグナルを細胞内や生体内へ伝達可能な化合物を意味する。 GDNFレセプターとしては、 GDNFのシグナル媒介性レセプターである cR_etレセプターチ口シンキナーゼを挙げることができる。

[0046] GDNFの補助レセプターとは、 GDNFレセプターリガンドのシグナルを直接は細胞内や生体内へ伝達しな、が、 GDNFレセプターリガンドのシグナルを伝達するレセプターを活性化する化合物を意味する。このような化合物は、特に、そのメンバーが GDNFファミリーレセプター α類（GFR a s)と称されるレセプターである。これらはまた、 GDNF、ぺルセフィン、アルテミンおよびノルトリンのシグナル伝達レセプター複合体 (signaling receptor complex)と関係する。該ファミリーのレセプターとしては 4メンバー（GFR a l〜4) (Jing, S" et al" Cell, 85, 9-10 (1996); Jing, S. Q" et al" J. Biol . Chem., 272, 33111—33117 (1997); Trean or, J. J., et al., Nature, 382, 80—83 (1996 ); Subanto, P., et al" Human Molecular Genetics, 6, 1267-1273 (1997》が既知である。これらは独立してシグナルを伝達することができる力すべてがリガンド結合および cRet活性ィ匕に不可欠である。

[0047] また、 GDNFレセプターリガンドとしては、 GDNFレセプター又は該レセプターのネ甫助レセプターを特異的に認識する抗体やその結合性フラグメント等も含まれる。

[0048] 本発明の方法 Iにおいて、 GDNFレセプターリガンドが培地中に含まれる場合、その濃度は、雄性生殖系列幹細胞の増殖を促進し、該細胞の増殖を達成しうる濃度であれば特に限定されないが、通常 0. 05ngZml〜100mgZml、例えば 0. 5ng/m 1〜： LOO gZml、好ましくは 0. 5ng/ml〜10 g/ml、より好ましくは 0. 5ng/ml 〜1 ₈/1111、更に好ましくは0. 5〜200ng/ml、より!/、つそう好ましくは 0. 5〜50n g/m 最も好ましくは 2〜20ngZmlである。

[0049] 本発明の方法 Iにおいて用いられる培地は、更に FGF2を含むことが好ましい。 FG F2は、雄性生殖系列幹細胞の増殖の補助、特に増殖の誘導又は増強に有用であり、 FGF2を培地に添加することで、より安定且つ効率的に雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが出来る。

[0050] FGF2としては、例えば、ヒト FGF2 (例えば Endocrine Rev., 8, 95, 1987参照)、ゥシ FGF2 (例えば Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6963, 1984参照)、マウス FGF2 (例えば Dev. Biol, 138, 454-463, 1990参照）、ラット FGF2 (例えば Biochem. Biophys. Res . Commun., 157, 256-263, 1988参照）等が例示される。

[0051] 本発明の方法 Iにおいて、 FGF2が培地中に含まれる場合、その濃度は、雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助し、該細胞の増殖を達成し得る濃度であれば特に限定されなヽカ S、通常濃度 0. 05ng/ml〜： LOOmg/ml、 f列えば、 0. 5ng/ml〜： LOO /z g Zml、好ましくは 0. 5ngZml〜： L0 μ g/mUより好ましくは 0. 5ngZml〜l μ g/m 1、更【こ好ましく ίま 0. 5〜200ng/ml、よりヽつそう好ましく ίま 0. 5〜50ng/ml、最も好ましくは 2〜20ngZmlである。

[0052] 本発明の方法 Iにおいて用いられる培地は、更に上皮細胞成長因子 (EGF)を含んでいてもよい。 EGFは、雄性生殖系列幹細胞の増殖の補助、特に増殖の誘導又は増強に有用であり、 EGFを培地に添加することで、より安定且つ効率的に雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが出来る。

[0053] EGFとしては、例えば、マウス（例えば Nature, 257, 325-327, 1975参照）、ヒト（例えば Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 415, 1991参照）等の EGFが例示される。

[0054] 本発明の方法 Iにおいて、 EGFが培地中に含まれる場合、その濃度は、雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助し、該細胞の増殖を達成しうる濃度であれば特に限定されないが、通常濃度 0. 05ng/ml~100mg/ml,例えば 0. 5ngZml〜： LOO /z gZm 1、好ましくは 0. 5ngZml〜10 μ g/ml,より好ましくは 0. 5ngZml〜l μ g/ml,更【こ好ましく ίま 0. 5〜200ng/ml、より!/ヽつそう好ましく ίま 0. 5〜50ng/ml、最も好ましくは 2〜30ngZmlである。

[0055] 本発明の方法 Iにおいて用いられる培地は、更に白血病阻害因子 (LIF)を含んでいてもよい。 LIFとしては、例えば、ヒト（特開平 1-502985)、マウス（特開平 1-502985) 、ヒッジ（特開平 4-502554)、ブタ（特開平 4-502554)、ゥシ（特開平 8-154681)等の LI Fが例示される。本発明の方法において、 LIFが培地中に含まれる場合、その濃度は、通常 10〜： L0⁶units/ml、例えば 10〜： L0⁵units/ml、好ましくは 10²〜10⁴ units /ml、より好ましくは 3 X 10²〜5 X 10³units/mlである。

[0056] 本発明の方法 Iにおいて培地に含まれ得るサイト力イン（FGF、 GDNFレセプターリガンド、 FGF2、 EGF、 LIF等）は、動物由来のもの、好ましくは上述の哺乳動物由来のものであれば特に限定されな！、。 [0057] また、当該サイト力インは、本発明の方法 Iにおいて用いられた際に、対応する野生型のサイト力インと同程度の雄性生殖系列幹細胞の増殖促進活性を有する限り、精製された天然、合成又は組換えタンパク質、変異体タンパク質 (挿入、置換および欠失変異体を含む）、フラグメント、および化学修飾されたそれらの誘導体を含む。

[0058] 「同程度の雄性生殖系列幹細胞の増殖促進活性」とは、雄性生殖系列幹細胞の増殖促進活性が約 0. 1〜： LO倍の範囲内、好ましくは約 0. 5〜2倍の範囲内であることをいう。雄性生殖系列幹細胞の増殖促進活性は、雄性生殖系列幹細胞の増殖倍率を、注目するサイト力インを含む培地中で一定期間雄性生殖系列幹細胞を培養した場合と、該サイト力インを含まないコントロール培地中で同一期間雄性生殖系列幹細胞を培養した場合とで比較することにより決定することが出来る。

[0059] また、本発明の方法 Iにおいて培地に含まれ得るサイト力インは、対応する野生型のサイト力インと同程度の雄性生殖系列幹細胞の増殖促進活性を有する限り、各サイト力インの野生型のアミノ酸配列と実質的に相同なタンパク質も含む。

[0060] 「実質的に相同」とは、野生型のアミノ酸配列に対する相同性の程度力好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、更に好ましくは 95%以上、最も好ましくは 98%以上であることを意味する。

[0061] 「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて 2つのアミノ酸配列をァラインさせた場合の、最適なアラインメント (好ましくは、該ァルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合 (％)を意味する。「類似アミノ酸」とは物理ィ匕学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸 (Phe、 Trp、 Tyr)、脂肪族アミノ酸 (Ala、 Leu、 Ile、 Val)、極性アミノ酸 (Gln、 Asn)、塩基性アミノ酸 (Lys、 Arg、 His)、酸性アミノ酸（Glu、 Asp)、水酸基を有するアミノ酸（Ser、 Thr)、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、 Ala、 Ser、 Thr、 Met)などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はポリペプチドの表現型に変化をもたらさない (即ち、保存的アミノ酸置換である)ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、 Bowieら , Science, 247 : 1306-1310 (1990)を参照）。

[0062] アミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、 Karlinら， Pr oc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム [該ァルゴリズムは NBLASTおよび XBLASTプログラム（version 2.0)に組み込まれている（Altschulら , Nucleic Acids Res., 25 : 3389-3402 (1997)) ]、 Needlemanら, J. Mol. Biol., 48 : 444 -453 (1970)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは GCGソフトウェアパッケージ中の GAPプログラムに組み込まれている]、 Myersおよび Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988) ジの一部である ALIGNプログラム（version 2.0)に組み込まれている]、 Pearsonら， Pro c. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム [該ァルゴリズムは GCGソフトウェアパッケージ中の FASTAプログラムに組み込まれて!/、る]等が挙げられる力それらに限定されない。アミノ酸配列の相同性は、上記プログラムにより、そのデフォルトパラメータを用いて適宜算出され得る。例えばアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST- 2 (National Center for Biotechnology Info rmation Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件（マトリックス = BLO SUM62；ギャップオープン = 11；ギャップエクステンション = 1； x—ドロップオフ = 50；期待値 = 10；フィルタリング = ON)にて計算することができる。

[0063] 本発明の方法 Iにおいて用いられる培地の基礎培地は、自体公知のものを用いることができ、特に限定されないが、例えば DMEM、 EMEM、 RPMI— 1640、 a M EM、 F— 12、 F— 10、 M— 199、 HAM、 ATCC— CRCM30、 DM— 160、 DM— 201、 BMEゝ SFM—101、 Fischerゝ McCoy ' s 5 A、 Leibovitz， s L— 15 、 RI TC80— 7、 HF— Cl、 MCDB107、 NCTC135、 Waymouth' s MB752/1, St emPro - 34 SFM等が挙げられる。また、 ES細胞培養用等に改変された培地を用いてもよぐ上記基礎培地の混合物を用いてもよい。

[0064] 本発明の方法 Iにおいて用いられる培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、特に限定されないが、例えば成長因子 (例えばインスリン等）、鉄源 (例えばトランスフェリン等）、ポリアミン類 (例えばプトレシン等）、ミネラル (例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類 (例えばグルコース等）、有機酸 (例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質 (例えばアルブミン等）、アミノ酸 (例えば L グルタミン等）、還元剤 (例えば 2—メルカプトエタノール等）、ビタミン類 (例えばァスコルビン酸、 d ビォチン等）、ステロイド (例えばエストラジオール、プロゲステロン等）、抗生物質 (例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えば HEPES等）、栄養添加物（例えば StemPro- Nutrient Supplement等）等が挙げられる。当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好まし、。

[0065] また、本発明の方法 Iにおいて用いられる培地は、血清を含んでいてもよい。血清としては、動物由来の血清であれば特に限定されないが、好ましくは上記哺乳動物由来の血清 (例えばゥシ胎児血清、ヒト血清等)である。また血清の代替添加物（例えば Knockout Serum Replacement (KSR) (Invitrogen社製）等）を用いてもよい。血清の濃度は特に限定されないが、通常、 0. 1〜30 (νΖν) %の範囲である。採取されたばかりの精巣細胞から、雄性生殖系列幹細胞の培養を榭立する場合に、雄性生殖系列幹細胞以外の体細胞の増殖を抑制するため、血清の濃度を低く（例えば、 0. 1〜5 ( vZv) %)設定してもよい。

[0066] 本発明の方法 Iにおいて用いられる培地は、 B27 (J. Neurosci. Res., vol. 35, p.567 -576, 1993、 Brain Res., vol. 494, p. 65-74, 1989)を含んでいてもよい。特に、雄性生殖系列幹細胞を無血清培地中で培養する場合、 B27は雄性生殖系列幹細胞の増殖を増強し得る（Biol. Reprod., vol.72, p.985- 991, 2005)。 B27としては、 B- 27 Su pplement ^ p^¾ J、 B— 27 Supplement Minus AU ^ p^¾ J、 B— 27 Supplement Minus Vitamin A (商品名）（以上、 Invitrogen社製）等の市販品を用いてもよい。 B27の培地への添加量は、本発明の方法において、雄性生殖系列幹細胞の増殖を増強させうる範囲で、特に限定されないが、例えば B-27 Supplement (Invitrogen社製）であれば、 1-100 μ l/m 好ましくは 5〜40 μ lZml程度、培地に添加される。

[0067] 本発明の方法 Iにおいては、雄性生殖系列幹細胞をフィーダ一細胞の存在下で培養してもよい。フィーダ一細胞とは、雄性生殖系列幹細胞と共に培養された際に、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持した状態での雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助する環境を提供する、非雄性生殖系列幹細胞をいう。フィーダ一細胞としては、特に限定されないが、自体公知のものを用いることができ、例えば、線維芽細胞（哺乳動物の胎児線維芽細胞、マウス線維芽細胞株 STO等）が挙げられる。フィーダ一細胞は自体公知の方法、例えば放射線 (ガンマ線等）照射や抗癌剤（マイトマイシン c等)処理等で不活化されて、ることが好まし、。フィーダ一細胞を用いる場合には、通常例えば 6穴プレートの 1穴あたり、 10⁵〜10⁶個程度の細胞数が用いられる。雄性生殖系列幹細胞をフィーダ一細胞の存在下で培養することにより、雄性生殖系列幹細胞がフィーダ一細胞に接着し、より効率的に増殖コロニーを形成することができる。

[0068] あるいは、フィーダ一細胞を用いる代わりに、雄性生殖系列幹細胞をラミニンなどの細胞外マトリクスを介して不溶性担体に接着した状態で培養してもよ、 (Biol. Reprod. , vol.72, p.985-991, 2005)。この場合、雄性生殖系列幹細胞は、不溶性担体の表面に被覆された細胞外マトリクスに付着することにより、間接的に不溶性担体に接着する。

[0069] 不溶性担体としては、本発明の方法 Iにおいて用いられた際に、雄性生殖系列幹細胞の増殖を達成し得る範囲において特に限定されず、通常、細胞毒性がなぐ滅菌可能で、タンパク質に親和性を有する部材を用いることができる。一般的にプラスチック系、ガラス系の部材が好ましい。しかし、不溶性担体は、金属やセラミックでもよく、一定の素材に限定されるものではない。不溶性担体は、通常、シャーレ、プレート、フラスコ、ボトル、ビーズ、中空糸などの培養器材 (培養に用いるための器具または材料）に成形して培養に提供される。

[0070] 細胞外マトリクスとは、細胞の外側の空間を構成する生体高分子を!、う。細胞外マトリクスとしては、コラーゲン、エラスチン等の繊維性タンパク質、ヒアルロン酸、コンドロィチン硫酸等のダルコサミノダリカンやプロテオグリカン、フイブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等の細胞接着性タンパク質等が挙げられ、雄性生殖系列幹細胞の不溶性担体への接着を媒介し、雄性生殖系列幹細胞の増殖を達成し得る範囲において特に限定されないが、好ましくは細胞接着性タンパク質であり、より好ましくはラミニンである。

[0071] 細胞外マトリクスを不溶性担体に被覆する方法としては、一般的に、非共有結合（水素結合、イオン結合、疎水結合等）、共有結合等を使用した方法を用いることができる。例えば、細胞外マトリクスを含む適当な緩衝液 (例えばリン酸緩衝液等）中に不溶性担体を静置することにより、細胞外マトリクスを非共有結合により不溶性担体に結合させることが出来る。

[0072] 本発明の方法 Iにおける細胞培養条件は、細胞培養技術において通常用いられている培養条件を用いることができる。例えば、培養温度は通常約 30〜40°Cの範囲であり、好ましくは約 37°Cが例示される。 CO濃度は通常約 1〜10%の範囲であり、好

2

ましくは約 5%が例示される。湿度は通常約 70〜100%の範囲であり、好ましくは約 9 5〜 100%が例示される。

[0073] 本発明の方法 Iにお、て、雄性生殖系列幹細胞の継代間隔、希釈率は、培養条件により適宜設定されるが、通常、 2〜10日間隔で、 1Z2〜： LZ10倍希釈で細胞が継代される。

[0074] 本発明の方法 Iにより増殖された雄性生殖系列幹細胞は、半永久的に凍結保存することが可能であって、必要に応じて融解 '起眠して使用することができる。当該雄性生殖系列幹細胞は凍結保存 ·融解後も、自己複製し、精子又はその前駆細胞へ分化し得る能力（雄性生殖系列幹細胞としての能力）を維持する。凍結保存にぉ、ては、ジメチルスルホキシドとゥシ胎児血清アルブミンを含有するセルバンカー（DIA-IA TRON社製)等の自体公知の細胞凍結保存用組成物中に細胞を懸濁し、 - 80〜― 200°C、好ましくは— 196°C (液体窒素中）の条件で細胞を保存する。

[0075] 本発明の方法 Iにより増殖された雄性生殖系列幹細胞を凍結保存後起眠させる際には、常法に従って溶媒中で融解し、懸濁して細胞浮遊液とする。融解の方法も特に限定されないが、例えば、 37°Cの恒温槽中で、 10%胎児ゥシ血清を含有する DM EM (DMEMZFCS)を用いて行うことができる。具体的には、恒温槽に凍結チューブを浮かべ、凍結させた細胞へ DMEMZFCSを滴下して融解する。細胞を遠心して洗浄した後、培地に再度懸濁する。

[0076] 一度起眠した雄性生殖系列幹細胞を、培養後、再度凍結しても、雄性生殖系列幹細胞としての能力は維持される。

[0077] 本発明の方法 Iにより増殖された雄性生殖系列幹細胞は、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持しているので、該細胞を不妊動物の精細管の中に移植することにより、該移植された細胞に由来する精子形成を起こした動物を製造することが出来る。雄性生殖系列幹細胞の移植方法としては、例えば、精細管内への直接注入、輸出管からの注入、精巣網からの注入等が挙げられ、注入対象である動物の種類や、操作の容易性等を考慮して適宜選択できる。例えばマウス、ラット等のげつ歯類においては、輸出管からの注入が好ましく用いられ、ゥシ等の家畜においては精巣網力もの注入が好ましく用いられる。移植された雄性生殖系列幹細胞は、精細管内において増殖し、精子形成コロニーを形成する。

[0078] レシピエント動物の動物種は、上述と同様である。

[0079] 不妊動物としては、ブスルファン等の抗癌剤投与によって不妊ィ匕された雄性動物や、遺伝的に精子形成能力を欠損している雄性動物 (例えば Wマウスなど)等が挙げられる（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.91, No.24, p.11298-11302, 1994、 Cellul ar and Molecular Life Sciences, vol.58, No.8, p.1061- 1066, 2001等を参照）。

[0080] 移植された雄性生殖系列幹細胞を高!、効率で生着させる観点から、該不妊動物の動物種は、移植される雄性生殖系列幹細胞の動物種と同一であることが好ましい。また、該不妊動物の系統も、移植される雄性生殖系列幹細胞の系統と同一であることが更に好ましい。

[0081] 動物種及び Z又は系統が不妊動物と移植される雄性生殖系列幹細胞との間で異なっている場合は、移植された細胞が拒絶される可能性を減弱する目的で、不妊動物は免疫不全動物であることが好ましい。該免疫不全動物としては、遺伝的に免疫機能を欠損して、る動物（例えばヌードマウス等)や、 T細胞等の免疫担当細胞の細胞表面抗原 (例えば CD4等）に対する抗体を投与すること等により免疫寛容を誘導した動物等が挙げられる。

[0082] また、上述の方法によって得られた、移植された雄性生殖系列幹細胞に由来する精子を形成する動物力精子を採取 (単離)することにより、本発明の方法によって増殖された雄性生殖系列幹細胞由来の精子を製造することが出来る。

[0083] 更に、上述の方法により得られた精子を卵に受精させ、胚を得ることにより、本発明の増殖方法によって増殖された雄性生殖系列幹細胞由来の胚を製造することが出来る。卵とは精子が受精可能な雌性配偶子をいう。卵としては、例えば、卵細胞、卵母細胞等が挙げられる。精子と卵の受精は、顕微受精、 IVF等の周知の方法により行うことができる。

[0084] また、上述の方法により得られた胚を、宿主雌動物の子宮又は卵管に移入し、子孫を得ることにより、本発明の方法 Iによって増殖された雄性生殖系列幹細胞由来の子孫を製造することが出来る。

[0085] 宿主雌動物は、好ましくは偽妊娠動物である。偽妊娠動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮などにより去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。

[0086] 胚が移入された宿主雌動物は、妊娠し、本発明の方法 Iによって増殖された雄性生殖系列幹細胞由来の子孫を出産する。

[0087] また、上述の方法により得られた、移植された雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした動物と雌とを自然交配し、子孫を得ることによつても、本発明の方法 Iによって増殖された雄性生殖系列幹細胞に由来する子孫を製造することが出来る。該自然交配に用いられる雌は、通常、野生型雌動物である。

[0088] 本発明の方法 Iを用いれば、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持した状態で長期間にわたって、安定に、雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能であるので、自体公知の方法で、本発明の方法 Iにより増殖された雄性生殖系列幹細胞の遺伝子を改変し、例えば、特定の外来遺伝子が導入された雄性生殖系列幹細胞や、特定の遺伝子を欠損した雄性生殖系列幹細胞等の遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞を製造することができる。

[0089] 雄性生殖系列幹細胞への遺伝子導入の方法としては、例えば、特定の遺伝子が機能的に発現できるように構築されたベクターを雄性生殖系列幹細胞に導入する。ベクターとしては、プラスミドベクター、ウィルスベクター等を用いることができる。また、ウィルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウィルス、ヘルぺスウィルス、アデノ随伴ウィルス、パルボウイルス、セムリキ森林ウィルス、ワクシニアゥィルス等が挙げられる。

[0090] ベクターを雄性生殖系列幹細胞に導入する方法としては、例えば、リン酸カルシゥム法、 DEAEデキストラン法、エレクト口ポレーシヨン法、又はリポフエクシヨン法等の一般的な遺伝子導入法が挙げられる。ウィルスをベクターに用いる場合には、上述の一般的な遺伝子導入法によりウィルスのゲノムを細胞に導入してもよヽし、ウィルス粒子を、細胞へ感染させることによつても、該ウィルスのゲノムを細胞に導入することができる。

[0091] また、本発明の方法 Iを用いれば、外来遺伝子が安定に導入された安定な遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞を選択することが出来る。例えば、ベクターと同時にマーカー遺伝子を細胞へ導入し、マーカー遺伝子の性質に応じた方法で細胞を培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、ベクターが導入された細胞を培養すれば良ヽ。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤の組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジン S耐性付与遺伝子とブラストサイジン Sとの組み合わせなどをあげることができる。

[0092] また、同様の方法を用いて、特定の遺伝子を欠損した雄性生殖系列幹細胞を得ることも可能である。特定の遺伝子を欠損した雄性生殖系列幹細胞を得る方法としては、例えばターゲッティングベクターを用いた相同的糸且換え（ジーンターゲッティング法）が挙げられる。即ち、特定の遺伝子の染色体 DNAを単離し、そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいは lacZ ( j8—ガラクトシダーゼ遺伝子）、 cat (クロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能を破壊する力、あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DNA配列（例えば、 polyA付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャー RNAを合成できなくすること等によって、結果的に遺伝子を破壊するように構築した DNA配列を有する DNA鎖 (ターゲッティングベクター）を、相同組換え法により雄性生殖系列幹細胞の染色体に導入する。マーカー遺伝子として薬剤耐性を付与する遺伝子を用いる場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、ベクターが導入された細胞を培養すれば良ヽ。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤の組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ノ、イダロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジン S耐性付与遺伝子とブラストサイジン sとの組み合わせなどを挙げることができる。得られた細胞を用いた薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加した培地を用いて培養することにより、ターゲッティングベクターが安定に導入された細胞を選択することが出来る。また、ターゲッティングベクター中の相同的組換え領域の外側にチミジンキナーゼ (TK)遺伝子などの細胞に対して毒性に作用し得るマーカー遺伝子を配置し、該マーカー遺伝子が細胞に対して毒性を発揮し得る条件 (例えば TK遺伝子を用いる場合には、ガンシクロビル添加培地中で細胞が培養される）にて細胞を培養することにより、ランダムにターゲッティングベクターが導入された細胞を選択的に排除し、適切な相同的組換えを起こした細胞を高、効率で選択することが出来る（ポジティブネガティブセレクション)。得られた細胞にっ、て当該特定の遺伝子の DNA上あるヽはその近傍の DNA配列をプローブとしたサザンハイブリダィゼーシヨン解析あるいはターゲッティングベクター上の DNA配列とターゲッティングベクター作製に使用した特定の遺伝子の DNA以外の近傍領域の DNA配列をプライマーとした PCR法により解析し、特定の遺伝子を欠損した雄性生殖系列幹細胞を選択することにより得ることができる。或いは、組織特異的又は発達段階特異的な様式で特定の遺伝子を欠失させる Cre— ΙοχΡ系等を用いてもよい（Marth, J. D. (1996) Clin. Invest. 97 : 19 99 - 2002 ; Wagner, K. U.ら（1997) Nucleic Acids Res. 25 :4323—4330)。また、ジーントラップ法を用いても、遺伝子を欠損した雄性生殖系列幹細胞を得ることが可能である。ジーントラップ法とは、レポーター遺伝子を含むトラップベクターを細胞に導入したとき、染色体上の内在性遺伝子座内にランダムに組み込まれることを利用して未知の遺伝子を探索したり、内在性遺伝子を破壊したりする方法をいう。トラップベクターは、通常、レポーター遺伝子 (l_acZ遺伝子等）、プラスミド配列（プラスミドレスキュー法による内在性遺伝子の回収に必要な配列であって、複製開始点などを含む)及び選択マーカー遺伝子 (neo遺伝子等）を含む。レポーター遺伝子は、通常、プロモーターを有しておらず、スプライスァクセプターのみを有するので、内在性遺伝子の下流に組み込まれたときにのみレポーター遺伝子は発現する。トラップベクタ一の組み込みは、ほとんどの場合、内在性遺伝子の破壊を生ずる。したがって、トラップベクターを雄性生殖系列幹細胞へ導入することによって、内在性遺伝子が破壊された雄性生殖系列幹細胞を得ることが出来る。

[0094] このようにして得られた、遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞を用いて、上述と同様の方法によって、遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物、遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する精子 (遺伝子改変精子)、遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する胚 (遺伝子改変胚)、遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫 (遺伝子改変非ヒト子孫あるいは遺伝子改変非ヒト動物)等を製造することが出来る。

[0095] また、本発明の方法 I、及び該方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞は、雄の不妊治療に有用である。

[0096] 例えば、不妊患者の精巣からバイオプシーで雄性生殖系列幹細胞を採取し、該細胞を本発明の方法 Iによって試験管中で培養する。そして、当該不妊患者の精細管中に増殖された雄性生殖系列幹細胞を注入 (マイクロインジヱクシヨン)して、患者の精巣の精細管の中に培養細胞由来の精子形成を起させるという手法によって、不妊治療を実施することができる。この手法は、例えば、化学療法や放射線治療による不妊に対して、特に効果的である。

このように、本発明の方法 Iにより増殖された雄性生殖系列幹細胞は雄性動物の不妊治療に利用可能であるため、上記雄性生殖系列幹細胞を含む特に男性を対象とした不妊治療剤も本発明の範囲内である。

[0097] 本発明の不妊治療剤は、常套手段に従って、有効量の上記雄性生殖系列幹細胞を医薬として許容される担体と混合することにより製造することが出来る。本発明の不妊治療剤は、通常は、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 (例えば、 D—ソルビトール、 D—マン-トール、塩化ナトリゥムなど)などの注射用の水性液を挙げることが出来る。本発明の免疫調節剤は、例えば、緩衝剤 (例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤 (例えば、塩ィ匕ベンザルコ-ゥム、塩酸プロ力インなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸ィ匕防止剤などと配合してもよい。

[0098] このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒト等の上述の哺乳動物に対して投与することができる。

[0099] また、本発明の方法 I、該方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞は、生殖細胞レベルにおける遺伝子治療に有用である。

[0100] 例えば、特定の遺伝子に変異を有する患者から、バイオプシーで雄性生殖系列幹細胞を採取し、本発明の方法によって試験管中で培養させる。そして、上述の遺伝子改変方法等により、該変異遺伝子を正常に機能する遺伝子と置換した雄性生殖系列幹細胞を作製し、その変異が子孫に伝わらないようにするという治療方法である。このような治療方法においても、雄性生殖系列幹細胞の維持および増殖が必要となるが、この場合に、本発明の方法を有効に利用することができる。

[0101] また、本発明は、 FGF (FGF2を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞増殖促進剤に関する。本発明の剤を含む培地を用いて、上記本発明の方法 Iにより雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞の増殖効率が飛躍的に上昇する。また、本発明の剤を、従来行われている雄性生殖系列幹細胞の培養培地に添カロすることにより、雄性生殖系列幹細胞の増殖効率が飛躍的に上昇する。

[0102] 本発明の剤に用いられる FGFは、好ましくは、 FGF4サブファミリー、 FGF7サブフアミリー、 FGF8サブファミリー、 FGF9サブファミリー又は FGF19サブファミリーのメンバーであり、より好ましくは、 FGF9サブファミリーのメンバーである。

[0103] 本発明の剤に用いられる FGFは、好ましくは、 FGF4、 FGF5、 FGF6、 FGF8、 F GF9、 FGF10、 FGF16、 FGF17、 FGF18、 FGF19及び FGF20からなる群から選択されるいずれかであり、より好ましくは、 FGF9である。

[0104] 本発明の剤は、更に GDNFレセプターリガンドを含んでいてもよい。 GDNFレセプターリガンドは、好ましくは、 GDNFである。

[0105] 本発明の剤は、更に FGF2を含んでいてもよい。

[0106] 本発明の剤は、更に EGFを含んでいてもよい。

[0107] 本発明の剤は、更に LIFを含んでいてもよい。

[0108] 本発明の剤は、更に生理学的に許容される担体 (例えば、生理的な等張液 (生理食塩水、上述の基礎培地、ブドウ糖やその他の補助薬 (例えば、 D—ソルビトール、 D—マン-トール、塩ィ匕ナトリウムなど)を含む等張液等)、賦形剤、防腐剤、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤 (例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、保存剤、酸化防止剤、上述の添加物など）を含むことができる。

[0109] 本発明の剤に含まれる上記各構成成分の混合割合は、本発明の剤が本発明の方法 Iに用いられる培地に添加されるなどして用いられた場合に、各構成成分の培地中の濃度が、上述の好適な範囲に入るように構成されていることが好ましい。

[0110] 本発明の剤は、等張な水溶液、あるいは粉末等の状態で、上記本発明の方法 Iに用いる培地に添加されるなどして用いられる。あるいは本発明の剤は、上記本発明の方法 Iに用いられる培地であってもよい。

[0111] 2.雄件列榦細qの観告去 (方法 Π)

本発明の雄性生殖系列幹細胞の製造方法は、 FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養し、雄性生殖系列幹細胞を得ることを特徴とする。 FGFを用いることによって、雄性生殖系列幹細胞としての活性が誘導され、雄性生殖系列幹細胞の前駆体力雄性生殖系列幹細胞への分ィヒが強力に誘導され、雄性生殖系列幹細胞の製造効率が飛躍的に上昇する。特に、本発明の方法 Πを用いることにより、従来法では困難であった、始原生殖細胞力雄性生殖系列幹細胞をインビトロで誘導することが出来る。

[0112] 雄性生殖系列幹細胞の前駆体とは、雄性生殖系列幹細胞に分ィ匕し得る能力を有する、未分化な細胞をいう。雄性生殖系列幹細胞の前駆体としては、ェピブラスト、始原生殖細胞（primordial germ cell)、雄性生殖細胞（gonocyte)等が挙げられる。前駆体は、好ましくは、始原生殖細胞である。

[0113] 本発明の方法 IIにおいて用いられる雄性生殖系列幹細胞の前駆体は、脊椎動物由来の動物であれば特に限定されない。脊椎動物としては、上記方法 Iと同様のものを挙げることが出来る。脊椎動物は、好ましくは哺乳動物である。

[0114] 当該哺乳動物は、本発明の方法 IIにより雄性生殖系列幹細胞を製造し得る限り、出生前であっても、出生後であってもよい。

[0115] 出生前の雄性生殖系列幹細胞の前駆体を用いる場合、該細胞が由来する胎仔（胚)の発生段階は、本発明の方法 IIにより雄性生殖系列幹細胞を製造し得る限り特に限定されないが、例えば胚中において始原生殖細胞が出現した以降、好ましくは雄性生殖堤 (genital ridge)の形成以降の胚に由来する雄性生殖系列幹細胞が用いられる。例えば、マウスにおいては、通常 8. 5dpc以降、好ましくは 11. 5dpc以降の雄性生殖系列幹細胞の前駆体が用いられる。

[0116] 出生後の雄性生殖系列幹細胞の前駆体を用いる場合、該細胞が由来する動物の齢は、本発明の方法 IIにより雄性生殖系列幹細胞を製造し得る限り特に限定されず、新生仔、幼仔、成体、老体のいずれであってもよいが、例えば、精巣内において go nocyteが精原幹細胞へと分ィ匕する前の段階の個体が用いられる。例えば、マウスにおいては、出生後 5日までには gonocyteが精原幹細胞へ分ィヒするので、出生後 5日より若、雄性生殖系列幹細胞の前駆体が用いられる。

[0117] 本発明の方法 IIにおいて用いられる雄性生殖系列幹細胞の前駆体は、単離 '精製されたものであってもよぐあるいは、雄性生殖系列幹細胞の前駆体を含む精巣細胞として本発明に用いられてもよい。精巣細胞は、上記脊椎動物の精巣より自体公知の方法で調製することができる。例えば精巣を摘出し、摘出された精巣をコラゲナーゼ、トリプシン、 DNaseなどの分解酵素で消化することにより、精巣細胞を分散させる (例えば、 WO2004/092357等を参照)。分散された精巣細胞は培養液により洗浄され、回収される。

[0118] 雄性生殖系列幹細胞の前駆体として、ェピブラストや始原生殖細胞を用いる場合には、調製に先立って、胚の性別を判定して、雄性胚由来のェピブラスト細胞又は始原生殖細胞を分離することが好ましい。胚の性別は、例えば PCR法に基づくジエノタィビング等により、 Y染色体の存在を確認することにより決定できる。胚がマウスの場合であれば、例えば Ubel PCR法（Dev. Biol, vol. 229, p. 468-479, 2001)等を用、ることが出来る。

[0119] 始原生殖細胞は、胚の各発生段階にお!、て始原生殖細胞を豊富に含む組織 (尿膜底部、胚後端部、後腸、腸間膜、尿生殖堤、生殖堤等)をトリプシンなどの分解酵素で消化することにより採取することが出来る。例えばマウスにおいては、 8. 5dpc胚では胚の後部三分の一、 10. 5dpc胚では腸間膜及び尿生殖堤、 11. 5〜16. 5dp c胚においては生殖堤に始原生殖細胞が豊富に含まれる。 [0120] 本発明の方法 IIに用いられる FGFは、好ましくは、 FGF9サブファミリーのメンバーであり、より好ましくは FGF9である。

[0121] 培地中に含まれる FGFの濃度は、本発明の方法 IIにより雄性生殖系列幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常 0. 05ngZml〜100mgZml、例えば 0. 5ng/ml~100 μ g/ml、好ましくは 0. 5ng/ml〜： LO μ g/ml、より好ましくは 0. 511₈/1111〜1 ₈/1111、更に好ましくは0. 5〜200ng/ml、より!/、つそう好ましくは 0. 5〜50ngZml、最も好ましくは 2〜20ngZmlである。

[0122] 本発明の方法 IIにおいて用いられる培地は、更に GDNFレセプターリガンドを含むことが好ましい。 GDNFレセプターリガンドは、好ましくは GDNFである。

[0123] 本発明の方法 IIにおいて、 GDNFレセプターリガンドが培地中に含まれる場合、その濃度は、本発明の方法 Πにより雄性生殖系列幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常 0. 05ngZml〜100mgZml、例えば 0. 5ngZml〜100 μ g/mU好ましくは 0. 5ng/ml〜： LO μ g/ml,より好ましくは 0. 5ngZml〜l μ g /ml、更に好ましくは 0. 5〜200ng/ml、より!/、つそう好ましくは 0. 5〜50ng/ml、最も好ましくは 2〜20ngZmlである。

[0124] 本発明の方法 IIにおいて用いられる培地は、更に FGF2を含むことが好ましい。

[0125] 本発明の方法 IIにおいて、 FGF2が培地中に含まれる場合、その濃度は、本発明の方法 IIにより雄性生殖系列幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常濃度 0. 05ng/ml〜： L00mg/ml、 f列えば、 0. 5ng/ml~100 μ g/ml,好ましくは 0. 5ngZml〜10 μ g/ml,より好ましくは 0. 5ngZml〜l μ g/ml,更に好ましくは 0. 5〜200ng/ml、よりヽつそう好ましくは 0. 5〜50ng/ml、最も好ましくは 2 〜20ngZmlである。

[0126] 本発明の方法 IIにおいて用いられる培地は、更に上皮細胞成長因子 (EGF)を含んでいてもよい。

[0127] 本発明の方法 II〖こおいて、 EGFが培地中に含まれる場合、その濃度は、本発明の方法 IIにより雄性生殖系列幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常濃度 0. 05ngZml〜： LOOmgZml、例えば 0. 5ngZml〜： LOO /z gZml、好ましくは 0. 5ngZml〜10 μ g/ml,より好ましくは 0. 5ngZml〜l μ g/ml,更に好ましくは 0. 5〜200ng/ml、よりヽつそう好ましくは 0. 5〜50ng/ml、最も好ましくは 2 〜30ngZmlである。

[0128] 本発明の方法 IIにおいて用いられる培地は、更に LIFを含んでいてもよい。本発明の方法 IIにおいて、 LIFが培地中に含まれる場合、その濃度は、通常 10〜10⁶units

/ml、例えば 10〜： L0⁵units/ml、好ましくは 10²〜10⁴ units/ml、より好ましくは 3

X 10²〜5 X 10³units/mlである。

[0129] 本発明の方法 IIにおいて培地に含まれ得るサイト力イン（FGF、 GDNFレセプターリガンド、 FGF2、 EGF等）は、動物由来のもの、好ましくは上述の哺乳動物由来のものであれば特に限定されな！、。

[0130] また、当該サイト力インは、本発明の方法 IIにおいて用いられた際に、当該多能性幹細胞の獲得を達成し得る限り、精製された天然、合成又は組換えタンパク質、変異体タンパク質 (挿入、置換および欠失変異体を含む）、フラグメント、および化学修飾されたそれらの誘導体を含む。

[0131] また、本発明の方法 IIにおいて培地に含まれ得るサイト力インは、本発明の方法 II において用いられた際に、当該多能性幹細胞の獲得を達成し得る限り、各サイトカインの野生型のアミノ酸配列と実質的に相同なタンパク質も含む。

[0132] 「実質的に相同」とは、野生型のアミノ酸配列に対する相同性の程度が、好ましくは

80%以上、より好ましくは 90%以上、更に好ましくは 95%以上、最も好ましくは 98%以上であることを意味する。

[0133] 本発明の方法 IIにおいて用いられる培地の基礎培地は、上述の方法 Iと同様のものを用いることができる。

[0134] 本発明の方法 IIにおいて用いられる培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、上述の方法 Iと同様のものを用いることができる。添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ま、。

[0135] また、本発明の方法 IIにおいて用いられる培地は、血清を含んでいてもよい。血清としては、上述の方法 Iと同様のものを用いることができる。血清の濃度範囲は、上述の方法 Iと同様である。

[0136] 本発明の方法 IIにおいては、雄性生殖系列幹細胞の前駆体をフィーダ一細胞の存在下で培養してもよい。フィーダ一細胞としては、上述の方法 Iと同様のものを用いることができる。フィーダ一細胞を用いる場合には、通常例えば 6穴プレートの 1穴あたり、 10⁵〜10⁶個程度の細胞数が用いられる。

[0137] あるいは、上述の方法 Iと同様に、フィーダ一細胞を用いる代わりに、雄性生殖系列幹細胞の前駆体をラミニンなどの細胞外マトリクスを介して不溶性担体に接着した状態で培養してもよい。

[0138] 本発明の方法 IIにおける細胞培養条件は、上述の方法 Iと同様である。

[0139] 本発明の方法 II〖こおいて、細胞の継代間隔、希釈率は、培養条件により適宜設定される力通常、 2〜10日間隔で、 1Z2〜： LZ10倍希釈で細胞が継代される。

[0140] 本発明の方法 IIを用いて雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養すると、培養された細胞は培養開始後約 3〜6週間までには、 2種類の形態のコロニーを形成する。一方のコロニーは、細胞間架橋 (intercellular bridge)と桑実胚 (morula)様構造により特徴付けられる形態を有しており、これは雄性生殖系列幹細胞のコロニーである。他方のコ口-一は、より硬く詰め込まれ (packed)、 ES細胞のコロニーの形態と極めて類似した形態を有しており、これは多能性幹細胞 (後述)のコロニーである。従って、雄性生殖系列幹細胞のコロニーと、多能性幹細胞のコロニーとは、明確に視覚的に識別することができる。

[0141] 上述の形態を指標に、例えば、顕微鏡下で雄性生殖系列幹細胞のコロニーをパスツールピペット、マイクロマニピュレータ一等を用いて選択的にピックアップする力限界希釈等により、雄性生殖系列幹細胞を単離 ·精製し得る。

[0142] 本発明の方法 IIにより得られた細胞が雄性生殖系列幹細胞である力否かは、上記方法 Iの項で記載した方法 (例えば、精細管内へ移入し、精子形成コロニーの有無を確認する方法等）により判別することが出来る。

[0143] 本発明の方法 IIにより得られた雄性生殖系列幹細胞は、上述の本発明の方法 I等を用いることにより、引き続き長期間にわたり、増殖させることが出来る。

[0144] 本発明の方法 IIにより得られた雄性生殖系列幹細胞は、半永久的に凍結保存することが可能であって、必要に応じて融解 '起眠して使用することができる。当該雄性生殖系列幹細胞は凍結保存'融解後も、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持する。凍結保存においては、ジメチルスルホキシドとゥシ胎児血清アルブミンを含有するセルバンカー（DIA-IATRON社製)等の自体公知の細胞凍結保存用組成物中に細胞を懸濁し、— 80〜― 200°C、好ましくは— 196°C (液体窒素中）の条件で細胞を保存する。

[0145] 本発明の方法 IIにより得られた雄性生殖系列幹細胞を凍結保存後起眠させる際には、上述の方法 Iと同様に、常法に従って溶媒中で融解し、懸濁して細胞浮遊液とする。

[0146] 一度起眠した雄性生殖系列幹細胞を、培養後、再度凍結しても、雄性生殖系列幹細胞としての能力は維持される。

[0147] 本発明の方法 IIにより得られた雄性生殖系列幹細胞を用いることにより、上記方法 I により増殖された雄性生殖系列幹細胞と同様に、例えば以下の用途等に用いることが出来る：

•雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成をおこした動物の製造；

•雄性生殖系列幹細胞に由来する精子、胚、子孫等の製造；

•遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞の製造；

•遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成をおこした動物の製造；，遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する精子、胚、子孫等の製造； •雄の不妊治療；

•生殖細胞レベルにおける遺伝子治療。

[0148] また、本発明は、 FGF (FGF2を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞の分化誘導剤

(本発明の剤 Π)に関する。本発明の剤 IIを含む培地を用いて、上記の方法 IIにより雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養することにより、該前駆体力雄性生殖系列幹細胞への分化を誘導し、或いは該分化誘導を促進し、雄性生殖系列幹細胞を製造することが出来る。

[0149] 本発明の剤 IIに用いられる FGFは、好ましくは、 FGF9サブファミリーのメンバーであり、より好ましくは FGF9である。

[0150] 本発明の剤 IIは、更に GDNFレセプターリガンドを含んでいてもよい。 GDNFレセプターリガンドは、好ましくは、 GDNFである。 [0151] 本発明の剤 IIは、更に FGF2を含んでいてもよい。

[0152] 本発明の剤 IIは、更に EGFを含んでいてもよい。

[0153] 本発明の剤 IIは、更に生理学的に許容される担体 (例えば、生理的な等張液 (生理食塩水、上述の基礎培地、ブドウ糖やその他の補助薬 (例えば、 D—ソルビトール、 D—マン-トール、塩ィ匕ナトリウムなど)を含む等張液等)、賦形剤、防腐剤、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤 (例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、保存剤、酸化防止剤、上述の添加物などを含むことができる。

[0154] 本発明の剤 IIに含まれる上記各構成成分の混合割合は、本発明の剤 IIが本発明の方法 II〖こ用いられる培地に添加されるなどして用いられた場合に、各構成成分の培地中の濃度力上述の好適な範囲に入るように構成されていることが好ましい。

[0155] 本発明の剤 IIは、等張な水溶液、あるいは粉末等の状態で、上記本発明の方法 II に用いる培地に添加されるなどして用いられる。あるいは本発明の剤 IIは、上記本発明の方法 IIに用いられる培地であってもよい。

[0156] 尚、本項において用いられる単語の定義は、特に断りのない限り、適宜上記方法 I の項の記載に従うものとする。

[0157] 3. 糸田の ¾告 ( 法 ΤΠ)

本発明の多能性幹細胞の製造方法は、 FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養し、多能性幹細胞を得ることを特徴とする。 FGFを用いることによって、多能性幹細胞の製造効率が飛躍的に上昇する。

[0158] 多能性幹細胞とは、インビト口において培養可能で、長期間にわたって増殖することができ、自己複製能を持ち、生体を構成する全ての細胞やその前駆細胞に分化しうる能力を有する細胞をいう。

[0159] 本発明の方法 IIIにおいては、上述の方法 IIと同様の雄性生殖系列幹細胞の前駆体を用いることが出来る。

[0160] 本発明の方法 IIIにおいて、始原生殖細胞が用いられる場合、その細胞が由来する胚の発生段階は特に限定されないが、例えば胚中において始原生殖細胞が出現した以降、好ましくは雄性生殖堤 (genital ridge)の形成以降の胚に由来する始原生殖細胞が用いられる。例えば、マウスにおいては、通常 8. 5dpc以降、好ましくは 11. 5 dpc以降の始原生殖細胞が用いられる。従来法においては、 14. 5dpc以降のマウスの始原生殖細胞力 EG細胞を誘導することが出来ないが、本発明の方法 IIIによれば、 14. 5dpc以降の始原生殖細胞力もでも多能性幹細胞を誘導することが可能である。

[0161] 本発明の方法 IIIに用いられる FGFは、好ましくは、 FGF9サブファミリーのメンバーであり、より好ましくは FGF9である。

[0162] 培地中に含まれる FGFの濃度は、本発明の方法 ΠΙにより多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常 0. 05ngZml〜100mgZml、例えば 0. 5ngZml〜100 gZml、好ましくは 0. 5ngZml〜10 gZml、より好ましくは 0 . 511₈/1111〜1 ₈/1111、更【こ好ましく ίま 0. 5〜200ng/ml、より!/、つそう好ましく ίま

0. 5〜50ngZml、最も好ましくは 2〜20ngZmlである。

[0163] 本発明の方法 IIIにおいて用いられる培地は、更に GDNFレセプターリガンドを含むことが好ましい。 GDNFレセプターリガンドは、好ましくは GDNFである。

[0164] 本発明の方法 ΠΙにおいて、 GDNFレセプターリガンドが培地中に含まれる場合、その濃度は、本発明の方法 ΠΙにより多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常 0. 05ngZml〜100mgZml、例えば 0. 5η₈/πι1~100 ^ g Zml、好ましくは 0. 5ngZml〜： LO μ g/mUより好ましくは 0. 5ngZml〜l μ g/m

1、更【こ好ましく ίま 0. 5〜200ng/ml、よりヽつそう好ましく ίま 0. 5〜50ng/ml、最も好ましくは 2〜20ngZmlである。

[0165] 本発明の方法 IIIにおいて用いられる培地は、更に FGF2を含むことが好ましい。

[0166] 本発明の方法 IIIにおいて、 FGF2が培地中に含まれる場合、その濃度は、本発明の方法 IIIにより多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常濃度 0. 05ngZml〜： LOOmgZml、例えば 0. 5ngZml〜： LOO /z gZml、好ましくは 0. 5ngZml〜10 μ g/ml,より好ましくは 0. 5ngZml〜l μ g/ml,更に好ましくは 0. 5〜200ngZml、よりいつそう好ましくは 0. 5〜50ngZml、最も好ましくは 2〜20 ng, mlである。

[0167] 本発明の方法 ΠΙにおいて用いられる培地は、更に上皮細胞成長因子 (EGF)を含んでいてもよい。

[0168] 本発明の方法 IIIにおいて、 EGFが培地中に含まれる場合、その濃度は、本発明の方法 IIIにより多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常濃度 0. 05ngZml〜： LOOmgZml、例えば 0. 5ngZml〜： LOO /z gZml、好ましくは 0. 5ngZml〜10 μ g/ml,より好ましくは 0. 5ngZml〜l μ g/ml,更に好ましくは 0. 5〜200ngZml、よりいつそう好ましくは 0. 5〜50ngZml、最も好ましくは 2〜30 ng, mlである。

[0169] 本発明の方法 IIIにおいて用いられる培地は、従来法において、始原生殖細胞から

EG細胞を誘導する際に必須であった SCFや LIFを実質的に含まなくてもよいが、これらの因子を含んで、ても悪影響はな、。

[0170] 本発明の方法 IIIにおいて培地に含まれ得るサイト力イン（FGF、 GDNFレセプターリガンド、 FGF2、 EGF等）は、動物由来のもの、好ましくは上述の哺乳動物由来のものであれば特に限定されな！、。

[0171] また、当該サイト力インは、本発明の方法 IIIにおいて用いられた際に、当該多能性幹細胞の獲得を達成し得る限り、精製された天然、合成又は組換えタンパク質、変異体タンパク質 (挿入、置換および欠失変異体を含む）、フラグメント、および化学修飾されたそれらの誘導体を含む。

[0172] また、本発明の方法 IIIにおいて培地に含まれ得るサイト力インは、本発明の方法 III において用いられた際に、当該多能性幹細胞の獲得を達成し得る限り、各サイトカインの野生型のアミノ酸配列と実質的に相同なタンパク質も含む。

[0173] 「実質的に相同」とは、野生型のアミノ酸配列に対する相同性の程度が、好ましくは

[0174] 本発明の方法 IIIにおいて用いられる培地の基礎培地は、上述の方法 Iと同様のものを用いることができる。

[0175] 本発明の方法 IIIにおいて用いられる培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、上述の方法 Iと同様のものを用いることができる。添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ま、。 [0176] また、本発明の方法 ΠΙにおいて用いられる培地は、血清を含んでいてもよい。血清としては、上述の方法 Iと同様のものを用いることができる。血清の濃度範囲は、上述の方法 Iと同様である。

[0177] 本発明の方法 ΠΙにおいては、雄性生殖系列幹細胞の前駆体をフィーダ一細胞の存在下で培養してもよい。フィーダ一細胞としては、上述の方法 Iと同様のものを用いることができる。フィーダ一細胞を用いる場合には、通常例えば 6穴プレートの 1穴あたり、 10⁵〜10⁶個程度の細胞数が用いられる。

[0178] あるいは、上述の方法 Iと同様に、フィーダ一細胞を用いる代わりに、雄性生殖系列幹細胞の前駆体をラミニンなどの細胞外マトリクスを介して不溶性担体に接着した状態で培養してもよい。

[0179] 本発明の方法 IIIにおける細胞培養条件は、上述の方法 Iと同様である。

[0180] 本発明の方法 IIIにおいて、細胞の継代間隔、希釈率は、培養条件により適宜設定される力通常、 2〜10日間隔で、 1Z2〜： LZ10倍希釈で細胞が継代される。

[0181] 上記方法 IIの項に述べたように、本発明の方法 ΠΙを用いて雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養すると、培養された細胞は培養開始後約 3〜6週間までには、 2種類の形態のコロニーを形成する。一方のコロニーは、細胞間架橋 (intercellular bridge)と桑実胚 (morula)様構造により特徴付けられる形態を有しており、これは雄性生殖系列幹細胞のコロニーである。他方のコロニーは、より硬く詰め込まれ (packed)、 ES細胞のコ口-一の形態と極めて類似した形態を有しており、これは多能性幹細胞のコロニーである。従って、雄性生殖系列幹細胞のコロニーと、多能性幹細胞のコロニーとは、明確に視覚的に識別することができる。

[0182] 上述の形態を指標に、例えば、顕微鏡下で多能性幹細胞のコロニーをパスツールピペット、マイクロマニピュレータ一等を用いて選択的にピックアップする力、限界希釈等により、多能性幹細胞を単離 '精製し得る。

[0183] 本発明の方法 IIIにより得られた細胞が多能性を保持している力否かは、以下に例示する自体公知の方法により確認することができる。

[0184] 本発明の方法 IIIにより得られた細胞を、免疫不全動物や免疫寛容を誘導した動物の皮下又は精細管内等へ注入し、テラトーマの形成の有無を解析することによって、当該細胞の多能性を確認できる。本発明の方法 ΠΙにより得られた多能性幹細胞はテラトーマを形成することができ、当該テラトーマ内には 3つの胚葉系に分ィ匕した多様な細胞 (例えば神経、表皮、筋肉、気管支上皮、軟骨、骨、扁平上皮、神経上皮等)が確認される。一方、雄性生殖系列幹細胞は精細管内へ注入されると、精子形成コロニーを形成し、テラトーマを形成しない。従って、本発明の方法 ΠΙにより得られる多能性幹細胞は雄性生殖系列幹細胞と明確に識別される。

[0185] また、フローサイトメーター等を用いて、得られた細胞の細胞表面マーカー等の発現を解析することによつても、本発明の方法 ΠΙにより得られた細胞が多能性を保持して!、る力否かを確認することが出来る。

[0186] 本発明の方法 IIIにより得られた細胞を宿主胚に導入し、キメラ動物の誕生の有無を解析することによつても、当該細胞が多能性を保持している力否かを確認することができる。

[0187] また、インビトロにお、て ES又は EG細胞を各種の機能細胞へ分ィ匕させる自体公知の方法を適用し、本発明の方法 ΠΙにより得られた細胞のインビト口における分ィ匕能力を解析することによつても、当該細胞の多能性を確認できる。

[0188] また、本発明の方法 IIIにより得られた細胞の細胞内のアルカリフォスファターゼの活性を自体公知の方法により測定することによつても、当該細胞が多能性を保持している力否かを確認することができる。本発明の方法 IIIにより得られる多能性幹細胞は、通常 ES細胞と同様にアルカリフォスファターゼが陽性である。

[0189] 細胞の多能性の確認方法の詳細については、例えば国際公開第 2005Z10054 8号パンフレット等を参照のこと。

[0190] 本発明の方法 IIIにより得られた多能性幹細胞は、長期間（例えば、通常 2ヶ月以上 )にわたり、多能性を維持しながら増殖させることが出来る。

[0191] 本発明の方法 IIIにより得られた多能性幹細胞の維持、増殖、培養においては、上述の方法 IIIにお、て用いられた培地を用いてもよ!、が、多能性幹細胞の長期培養により適した培地 (維持培地)を用いてもょヽ。

[0192] 維持培地は、上述のサイト力イン (FGF、 GDNF、 FGF2、 EGF等）を含まなくてもよいが、好ましくは LIFを含む。この場合、 LIFの濃度は、通常 10〜： L0⁶units/ml、例えば 10〜： L0⁵units/ml、好ましくは 10²〜10⁴units/ml、より好ましくは 3 X 10²〜

5 X 10³units/mlである。

[0193] 維持培地は血清を含んでいてもよい。維持培地中の血清濃度は、通常 2〜30 (vZ v) %、好ましくは 10〜20 (v/v) %である。

[0194] 維持培地の基礎培地は、上記方法 IIIに用いられる培地と同様のものを用いることが出来るが、好ましくは、 ES細胞の培養に好適に用いられる基礎培地 (例えば DME

M等）である。

[0195] 維持培地は、上記方法 IIIに用いられる培地と同様の添加物を含むことが出来る。

[0196] 本発明の方法 IIIにより得られた多能性幹細胞は、半永久的に凍結保存することが可能であって、必要に応じて融解 '起眠して使用することができる。当該多能性幹細胞は凍結保存 ·融解後も、多能性を維持する。凍結保存においては、ジメチルスルホキシドとゥシ胎児血清アルブミンを含有するセルバンカー（DIA-IATRON社製)等の自体公知の細胞凍結保存用組成物中に細胞を懸濁し、 80〜― 200°C、好ましくは 196°C (液体窒素中）の条件で細胞を保存する。

[0197] 本発明の方法 IIIにより得られた多能性幹細胞を凍結保存後起眠させる際には、上述の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法と同様に、常法に従って溶媒中で融解し、懸濁して細胞浮遊液とする。

[0198] 一度起眠した多能性幹細胞を、培養後、再度凍結しても、多能性は維持される。

[0199] 本発明の方法 IIIにより得られた多能性幹細胞は、長期間にわたって、多能性を維持した状態で増殖することができるので、自体公知の方法で、当該多能性幹細胞の遺伝子を改変し、例えば、特定の外来遺伝子が導入された多能性幹細胞や、特定の遺伝子を欠損した多能性幹細胞等の遺伝子改変多能性幹細胞を製造することができる。

[0200] 本発明の方法 IIIにより得られた多能性幹細胞への遺伝子導入の方法としては、上記方法 Iの項で述べた雄性生殖系列幹細胞への遺伝子導入の方法と同様のものを挙げることが出来る。

[0201] また、上記方法 Iの項で述べたものと同様の方法により、外来遺伝子が安定に導入された安定な遺伝子改変多能性幹細胞を選択したり、特定の遺伝子を欠損した多能性幹細胞を得ることも可能である。

[0202] 本発明の方法 IIIにより得られた多能性幹細胞は、生体を構成する全ての体細胞へ分化する能力を有しており、 ES細胞や EG細胞に適用される全ての試験技術、方法を当該多様性幹細胞に適用することができ、当該多能性幹細胞を用いて多様な機能細胞、組織、動物 (ヒトを除く）等を製造することができる。また遺伝子を改変した多能性幹細胞を用いれば、遺伝子が改変された多様な機能細胞、組織、動物 (ヒトを除く）等を製造することができる。

[0203] 例えば、本発明の方法 IIIにより得られた多能性幹細胞を中胚葉系細胞分ィ匕条件にて培養することにより、中胚葉系細胞を製造することができる。中胚葉系細胞分ィ匕条件としては、 ES又は EG細胞を中胚葉系細胞へ分ィ匕させ得る、自体公知の条件が挙げられ、特に限定されないが、例えばタイプ IVコラーゲンコートしたプレート中における培養（例えば Blood, vol.93, pl253-1263, 1999等参照）、メチルセルロース培地中での培養 (Development, vol 125, pl747-1757, 1998)、中胚葉系細胞分化誘導用フィーダ一細胞（例えば OP9細胞などのストローマ細胞）との共培養（Proc. Natl. Aca d. Sci. USA, vol.100, p4018-4023, 2003; Exp. HematoL, vol.22, p979— 984; Science, vol.272, 722-724, 1996; Blood, vol.93, pl253— 1263, 1999; Development, vol 125, P1747-1757, 1998等参照）などが挙げられる。

[0204] 本発明の方法 IIIにより得られる多能性幹細胞を、自体公知の外胚葉系細胞分ィ匕条件にて培養することにより、外胚葉系細胞を製造することが出来る。外胚葉系細胞分化条件としては、 ES又は EG細胞を外胚葉細胞へ分化させ得る自体公知の条件が挙げられ、特に限定されないが、例えば、神経細胞分化誘導培地 (例えば N2B27 培地）を用いたゼラチンコートプレート上での培養等が挙げられる（例えば Nature Bio technology, vol.21, 183-186, 2003等参照）。

[0205] また、本発明の方法 IIIにより得られる多能性幹細胞は、自体公知の内胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、内胚葉系細胞を製造することが出来る。内胚葉系細胞分化条件としては、 ES又は EG細胞を内胚葉系細胞へ分化させ得る自体公知の条件が挙げられ、特に限定されないが、例えば、インスリン産生細胞への分化条件 (Proc Natl Acad Sci USA, 97, 11307- 11312)等が挙げられる。 [0206] その他、本発明の方法 mにより得られた多能性幹細胞を、例えば、 ES細胞を脈管細胞（血管内皮細胞等）へ分化させる方法（Development, vol.125, 1747-1757, 1998 )、 ES細胞を神経細胞へ分化させる方法 (Neuron, vol.28, 31-40, 2000)、 ES細胞を色素細胞へ分化させる方法 (Development, vol.125, 2915-2923, 1998)、 ES細胞をィンスリン産生細胞へ分化させる方法（Proc Natl Acad Sci USA, 97, 11307-11312, 20 00)、 ES細胞を外胚葉系細胞へ分化させる方法 (WO01Z088100号パンフレット）、 ES細胞の細胞塊 (ェンブリオイドボディ）を形成させることにより内胚葉細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、血液細胞、内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細胞、神経細胞、上皮細胞、メラノサイト、ケラチノサイトを製造する方法 (Reprod.Fertil.Dev., 10,31, 1998)等を用いて、多様な機能細胞へと分化誘導することにより、多様な機能細胞を製造することができる。或いは、 Proc Natl Acad Sci U SA, vol.100, pi 1457- 11462, 2003や、 Nature, vol.427, pl48- 154, 2004に記載された方法により、本発明の方法 ΠΙにより得られた多能性幹細胞より精子等の生殖細胞を製造し、これを交配に用いることにより該多能性幹細胞の子孫動物を得ることも可能であり得る。

[0207] また、本発明の方法 ΠΙにより得られた多能性幹細胞をヌードマウス等の免疫不全動物や、免疫寛容を誘導した動物に移入することによりテラトーマを形成させ、当該テラトーマ中力も多様な機能細胞を単離することもできる。

[0208] 更に、本発明の方法 IIIにより得られた多能性幹細胞の遺伝子を改変し、得られた遺伝子改変多能性幹細胞に上述の分化方法を適用することにより、遺伝子改変機能細胞を得ることが可能である。

[0209] 本発明の方法 ΠΙにより得られた多能性幹細胞を用いた動物の製造は、例えばキメラ胚を用いる方法等の自体公知の方法に準じて行うことができる。

[0210] 例えば、まず本発明の方法 IIIにより得られた多能性幹細胞を宿主胚に導入し、キメラ胚を得る。「宿主」の動物種は、導入される多能性幹細胞の動物種と同一であることが好ましい。「胚」としては、特に限定されないが、例えば胚盤胞、 8細胞期胚等が挙げられる。

[0211] 「胚」はホルモン剤（例えば、 FSH様作用を有する PMSGおよび LH作用を有する hCGを使用）等により過排卵処理を施した雌動物を、雄動物と交配させること等により得ることができる。多能性幹細胞を宿主胚に導入する方法としては、マイクロインジュクシヨン法や凝集法等が知られて、るが、、ずれの方法を用いることも可能である。

[0212] 次に、当該キメラ胚を宿主動物の子宫又は卵管に移入し、キメラ動物を得る。宿主動物は好ましくは偽妊娠動物である。偽妊娠動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮などにより去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。キメラ胚が移入された宿主動物は、妊娠し、キメラ動物を出産する。

[0213] 更に、当該キメラ動物を正常動物又は当該キメラ動物同士と交配し、次世代 (F1) 個体の中から当該多能性幹細胞由来遺伝子を保有する個体を選択することにより、当該多能性幹細胞由来遺伝子を保有する動物（当該多能性幹細胞に由来する動物 )を得ることができる。多能性幹細胞由来遺伝子を保有する動物の選択は、様々な形質を指標として用いることができるが、例えば体色や被毛色が指標として用いられる。また、体の一部力 DNAを抽出し、サザンブロット解析や PCRアツセィを行うことにより、選択を行うこともまた可能である。

[0214] また、本発明の方法 IIIにより得られた多能性幹細胞を 4倍体胚に導入し、 4倍体キメラ胚を得て、当該 4倍体キメラ胚を宿主動物の子宮又は卵管に移入することによつて、該多能性幹細胞に由来する動物を直接得ることも出来る（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.90, p8424-8428, 1993)。 4倍体胚は自体公知の方法により胚盤胞を電気融合させることにより得ることが出来るが、 2細胞胚盤胞をマン-トール溶液中で電気パルスを適用することによって電気融合させてもよい。

[0215] 上述の方法を用いることにより、例えば特定の外来遺伝子が導入された多能性幹細胞から、当該導入された外来遺伝子を保有する動物（トランスジニック動物）を得ることができる。また、特定の遺伝子を欠損した多能性幹細胞から、遺伝子欠損へテ口接合体動物を得ることができる。更に得られた遺伝子欠損へテロ接合体動物を繁殖させることで、遺伝子欠損ホモ接合体動物を得ることができる。

[0216] また、本発明は、 FGF (FGF2を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する多能性幹細胞の製造用組成物 (剤）に関する。本発明の組成物を含む培地を用いて、上記の方法 ΠΙにより雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞の前駆体 (例えば始原生殖細胞等）に由来する多能性幹細胞を得ることが出来る

[0217] 本発明の組成物に用いられる FGFは、好ましくは、 FGF9サブファミリーのメンバーであり、より好ましくは FGF9である。

[0218] 本発明の組成物は、更に GDNFレセプターリガンドを含んでいてもよい。 GDNFレセプターリガンドは、好ましくは、 GDNFである。

[0219] 本発明の組成物は、更に FGF2を含んでいてもよい。

[0220] 本発明の組成物は、更に EGFを含んでいてもよい。

[0221] 本発明の組成物は、更に生理学的に許容される担体 (例えば、生理的な等張液（生理食塩水、上述の基礎培地、ブドウ糖やその他の補助薬 (例えば、 D—ソルビトール、 D—マン-トール、塩ィ匕ナトリウムなど)を含む等張液等)、賦形剤、防腐剤、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤 (例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、保存剤、酸化防止剤、上述の添加物など)を含むことができる。

[0222] 本発明の組成物に含まれる上記各構成成分の混合割合は、本発明の組成物が本発明の方法 IIIに用いられる培地に添加されるなどして用いられた場合に、各構成成分の培地中の濃度が、上述の好適な範囲に入るように構成されて、ることが好まヽ

[0223] 本発明の組成物は、等張な水溶液、あるいは粉末等の状態で、上記本発明の方法

IIIに用いる培地に添加されるなどして用いられる。あるいは本発明の組成物は、上記本発明の方法 IIIに用いられる培地であってもよ、。

[0224] 尚、本項において用いられる単語の定義は、特に断りのない限り、適宜上記方法 I 又は IIの項の記載に従うものとする。

[0225] 以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。

実施例 1

[0226] (ラット精原幹細胞の増殖及びその機能解析）

実験材料及び方法 (1)細胞培養

精巣細胞が、 SDラット、 BNラット、 Lewisラット、 Donryuラット、 F344ラット、 BN ( 雌）と SD (雄）との F1ラット、あるいは SDバックグラウンドへ戻し交配した GFPトランスジェ-ックラット（以下 GFP ratと呼ぶことがある）（大阪大学、岡部勝博士より提供） ( 生後 7〜21日齢)から採集された。この GFP ratは EGFP遺伝子を実質的に全ての細胞型にお、て発現して、るので、 EGFPの蛍光を指標に当該ラット由来の細胞を追跡することが可能である。

[0227] 精巣細胞は、 Biology of Reproduction, vol.69, No.2, p.612-616, 2003に記載された方法に準じ、コラゲナーゼ (タイプ IV、シグマ社製)およびトリプシン (インビトロゲン社製)を用いた 2段階酵素分解によって採集された。

[0228] 精巣細胞の懸濁液を 20〜30 μ mのナイロンメッシュに通して未消化細胞塊を除去し、 600 X gで 5分間遠心して精巣細胞を回収し、更に、該精巣細胞から抗 CD9抗体を用いて磁気ビーズ法により、 CD9陽性細胞として精原幹細胞を濃縮した。濃縮操作は (Proc Natl Acad Sci USA, 1999年、 96卷、 5504-5509頁)の記載に準じて実施した。

[0229] 回収された精原幹細胞は培地中に分散され、ラミニンコートされた培養用ディッシュ上で培養された。ラミニンコートプレートは、培養ディッシュを 20 g/mlの濃度でラミニン（BD Biosciences)を含む PBSにより 37°Cでー晚処理した後、該溶液を除去し、 PBSで 2回洗浄することにより調製した。

[0230] 基礎培養培地は、 StemPro サプリメント（Invitrogen)、 25 gZml インシュリン、 1 00 μ g/ml トランスフェリン、 60 プトレシン、 30ηΜ セレン酸ナトリウム、 30 ^ g/ml ピルビン酸、 1 lZml DL 乳酸（Sigma)、 2mM L グルタミン、 5 X 1 0"⁵M 2—メルカプトエタノール、 MEMビタミン溶液（Invitrogen)、 MEM非必須アミノ酸溶液（Invitrogen)、 10"⁴M ァスコルビン酸、 10 /z gZml d—ピオチン、 30ng /ml β エストラジオール、 60ngZml プロゲステロン（Sigma)及び 1 μ g/ml へパリンが補充された StemPro-34 SFM (Invitrogen)であった。所望により、適宜所望の濃度のサイト力インが培地に添加された。基礎培養培地 lmlあたり 0. 625mlの FC Sが添加された。なお、本実施例において使用されたサイト力インは下表の通りである。

[0231] [表 2]

[0232] 細胞は 5%の二酸ィ匕炭素を含む空気中で、 37°Cにて維持され、適宜新たなラミニンコートディッシュ上へ継代された。

[0233] (2)培養されたラット精原幹細胞の移植及び解析

約 5 X 10⁴個の GFP ratの精原幹細胞懸濁液が KSN系統ヌードマウス (10週齢; Jap an SLCより購入した)精巣の精細管内へ輸出管を通して注入された。内因性の精子形成を抑制するために、ヌードマウスは、生後 4週間の時期にブスルファン (44mgZ kg)で処理され、続いて、死亡率を抑えるために対応する骨髄細胞が注射された。各レシピエントの精巣では、注入物が細管の 75〜80%を占めた。

コロニーをカウントするために、レシピエントマウス精巣は、ドナー細胞移植後 2ヶ月で回収され UV光下にて蛍光を観察することにより解析された（Okabe M, Ikawa M, K ominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. ' Green mice' as a source of ubiquitous gree n cells. FEBS Lett 1997; 407: 313-319)。宿主精巣細胞は内在性の蛍光を有さないので、ドナー生殖細胞は特異的に見分けられた。生殖細胞のクラスタ一は、細管の全周囲を占め、少なくとも 0. 1mmの長さを有する場合に、コロニーと定義された (Na gano M, Avarbock M R, Bnnster RL. Pattern and kinetics of mouse donor spermato gonial stem cell colonization in recipient testes. Biol Reprod 1999; 60: 1429-1436) 。全ての動物実験のプロトコルは、京都大学の動物保護および使用制度委員会によつて承認されたものである。

[0234] (3)顕微受精

レシピエント精巣の精細管が慎重に解剖され、生殖細胞が機械的に回収された。顕微受精が既述のように行われた（Kimura Y, Yanagimachi R. Intracytoplasmic sper m injection in the mouse. Biol Reprod 1995; 52: 709-720)。 24時間培養後に 4細胞期に達した胚が day-1偽妊娠 Wistar系統雌ラットの卵管に移入された。 21日目に取り出された生育胎仔は、 Wistar系統里親ラットの授乳によって育てられた。

[0235] 結果

Π )ラット原細qの J ^盲にぼす FGFの効

2週齢の GFPラット（SD系統）の精巣細胞を ultralow attachment plate (Nunc)上、 1 5ng/ml GDNF、 20ng/ml EGF及び lOngZml FGF2を含む培地中で 1週間〜 10日間培養し、プレート上に接着しているコロニー形成細胞を採取することにより精原幹細胞を濃縮した。得られた精原幹細胞を、ラミニンコートディッシュ上、上記培地中で培養することによりラット GS細胞を榭立した。 1. 8 X 10⁵個 Zwellのラット G S細胞をラミニンコートした 6穴プレートへ播種し、種々の FGFが更に添カ卩された上記培地中で更に 7〜13日間培養した。培養後、ゥエル内の GS細胞数を計測し、培養開始時からの増殖倍率を算出した。複数回の試験結果を表 3〜10に示す。

[0236] [表 3] Exp.1(培 ¾ ^間: 11日)

[0237] [表 4]

[0238] [表 5]

[0239] [表 6]

[0240] [表 7] Exp. 5(培養期間 : 9曰)

[0241] [表 8]

[0242] [表 9]

[0243] [表

表 3〜10に示すように、 FGFを培地へ添加することにより、ラット GS細胞の増殖効率が有意に増加した。この効果は、試験したいずれの種類の FGF (FGF4、 FGF5、 FGF6、 FGF8、 FGF9、 FGF10、 FGF16、 FGF17、 FGF18、 FGF19及び FGF2 0)についても確認された。特に FGF9は比較的低濃度においても強力に GS細胞の増殖を促進した。

[0245] (2)ラット精原榦細胞の增應こ及ぼす FGF9の効

2週齢の SD系統ラットの精巣細胞を ultralow attachment plate (Nunc)上、 15ng/ ml GDNF、 20ng/ml EGF及び lOngZml FGF2を含む培地中で 1週間〜 10 日間培養し、プレート上に接着しているコロニー形成細胞を採取することにより精原幹細胞を濃縮した。得られた精原幹細胞を、ラミニンコートディッシュ上、上記培地中で培養することによりラット GS細胞を榭立した。培養開始 61日後から lOngZmlの F GF9を培地に更に添加し、引き続き GS細胞を培養した。細胞数を経時的に計測し、培養開始時力もの増殖倍率を算出した。結果を図 1に示す。

[0246] 図 1に示すように、 FGF9を添加しな、場合、ラット GS細胞の増殖は比較的緩慢であつたが、 FGF9の添カ卩により GS細胞の増殖率が大幅に上昇した。 FGF9添加から 50日後の GS細胞の細胞数は、コントロール (FGF9非添加）と比較して約 572倍の増加を示した。同様の効果が、 BN、 Lewis, Donryu、 F344等の系統のラット由来の GS細胞においても認められた。

[0247] (3)ラット糸田のこぼす FGF9のカ (Π)

2週齢の SD系統ラットの精巣細胞を ultralow attachment plate (Nunc)上、 15ng/ ml GDNF、 20ng/ml EGF及び lOngZml FGF2を含む培地中で 1週間〜 10 日間培養し、プレート上に接着しているコロニー形成細胞を採取することにより精原幹細胞を濃縮した。得られた精原幹細胞を、ラミニンコートディッシュ上、上記培地中で培養することによりラット GS細胞を榭立した。培養開始 29日後から lOngZmlの F GF9を培地に更に添加し、引き続き GS細胞を培養した。細胞数を経時的に計測し、培養開始時からの増殖倍率を算出した。独立した 3回の試験の結果を図 2に示す。

[0248] 図 2に示すように、 FGF9を添加しな、場合、ラット GS細胞の増殖は比較的緩慢であった力 FGF9の添カ卩により GS細胞の増殖率が大幅に上昇した。

[0249] (4)ラット精原榦細胞の増殖に及ぼす FGF9の効 (III)

2週齢の SD系統ラットの精巣細胞を ultralow attachment plate (Nunc)上、 15ng/ ml GDNF、 20ng/ml EGF及び lOngZml FGF2を含む培地中で 1週間〜 10 日間培養し、プレート上に接着しているコロニー形成細胞を採取することにより精原幹細胞を濃縮した。得られた精原幹細胞を、ラミニンコートディッシュ上、上記培地中で培養することによりラット GS細胞を榭立した。 1. 8 X 10⁵個 Zwellのラット GS細胞をラミニンコートした 6穴プレートへ播種し、以下の組み合わせのサイト力インが添加された培地中で更に 6〜10日間培養した。培養後、ゥエル内の GS細胞数を計測し、培養開始時力もの増殖倍率を算出した。結果を表 11に示す。

[0250] [表 11]

A B C D E

+ + + + + GDNF (15 ng/ml) 培請日） - + - + 十 EGF (20 ng/ml)

+ + + FGF2 (10 ng ml)

- - - - + FGF9 (10 ng ml)

Exp.l 6 1.53 1.39 2.15 2.44 3.08

Exp.2 9 0.29 0.39 2.04 1.63 2.42

Exp.3 10 0.48 0.49 2.35 2.07 4.08

[0251] 表 11に示すように、 FGF9を培地へ添加することにより、ラット GS細胞の増殖効率が有意に増カロした。

[0252] (5)ラット精原細胞の谐に及ぼす FGF9の効 (TV)

上記 (4)と同様に SD系統ラットの精巣細胞力も GS細胞培養を榭立した。 1. 8 X 10⁵個/ wellのラット GS細胞をラミニンコートした 6穴プレートへ播種し、以下の組み合わせのサイト力インが添加された培地中で更に 7日間培養した。培養後、ゥエル内の GS細胞数を計測し、培養開始時からの増殖倍率を算出した。結果を表 1 2及び図 3に示す。

[0253] [表 12]

E+F E+F+G Q F+G E+G F

- + + + + 一 GDNF (15 ng/ml)

+ + 一一 + 一 EGF (20 ng ml)

+ + 一 + 一 + FGF2 (10 ng ml)

+ + + + + + FGF9 (10 ng ml)

Exp.1 2.54 4.25 1.82 3.54 2.24 2.78

Exp.2 1.94 5.20 1.58 4.01 1.79 2.63

Exp.3 2.49 4.15 1.14 3.55 2.03 Z00

Mean士 SD 232±0.19 4.53±0.33 1.51 ±0.20 3.70±0.16 2.02±0.13 2.47±0,24

[0254] 表 12及び図 3に示すように、いずれの培養条件においても、ラット GS細胞の有意な増殖が確認された。

[0255] 以上（2)〜（5)の結果から、 FGF9は雄性生殖系列幹細胞の増殖を強力に促進することが示された。

[0256] (6)ラット GS細朐培着の榭立時における FGF9の効果

2週齢の BN (雌）と SD (雄）との F1ラット精巣細胞から ultralow attachment plate (N unc)により濃縮された精原幹細胞を、ラミニンコートした 6穴プレート上、 15ngZml GDNF、 20ng/ml EGF及び 10ng/ml FGF2を含む培地、又は該培地に更に 10ng/ml FGF9を含む培地中で培養することにより GS細胞培養を榭立した。培養開始 26日後の GS細胞の様子を図 4に示す。 FGF9 ( + )培地を用いると、 FG F9 (—）培地を用いた場合と比較して GS細胞の増殖が早ぐ GS細胞コロニーがより大きく発達した。この結果から、 FGF9は、単離されたば力りの精巣細胞からの GS細胞培養の榭立を促進することが示された。

[0257] (7)ラット GS細朐の細朐活件の認

2週齢の SDバックグラウンドへ戻し交配した GFPトランスジエニックラット（GFP rat) の精巣細胞から ultralow attachment plate (Nunc)により濃縮された精原幹細胞を、ラミ-ンコートディッシュ上、 15ngZml GDNF、 20ng/ml EGF及び 10ng/ml F GF2を含む培地中で培養することによりラット GS細胞を榭立した。培養開始 122日後に lOngZml FGF9を培地に添加し、更に培養を続けた。培養後の細胞が雄性生殖系列幹細胞としての活性を維持し、インビトロで幹細胞が増殖して、るか否かを確認するために、異なる 2つの時点で不妊マウスの精細管の中に培養細胞を移植し、形成されるコロニー数を測定した。

具体的には、 100日の培養期間経過後、 GS細胞を採集し、ブスルファン処理されたヌードマウスの精細管へ移植した。 FGF9添カ卩時（day 122)力更に 50日後（day 1 72)に、 GS細胞を移植のために再び回収し、この期間中の幹細胞数の増加の測定を行った。移植実験におけるコロニーは、移植から 7〜8週間後に UV照射下で測定された。

結果を表 13に示す。

[0258] [表 13] コロニ一数 ^ί»数数

SAGS纖数コロニ一数継

FGF9 n /lO⁵^ GS細の增加の増加日数 /»巣巣代

胞 (倍） (倍）

― 100 4 1.8 x 10^s 51.0 土 12.5 28.3 土 6.9 1 1 7

― 172 4 0.4 x 10⁵ 28.3 土 12.8 70.8 土 32.0 27.7 69.3 14 十※ 172 4 0.4 x 10⁵ 28.3 土 12.6 70.8 土 31.5 1661.2 4155.9 14 day 122に FGF9を添加

[0259] FGF9非添カ卩時において、培養開始後 100〜172日の間に、 GS細胞は、全細胞数として 27. 7倍、幹細胞数として 69. 3倍に増殖した。一方、培養開始後 122日後に FGF9を添加すると、 GS細胞は、全細胞数として 1661. 2倍、幹細胞数として 415 5. 9倍にも増殖した。即ち、 FGF9の添カ卩により、全細胞数のみならず幹細胞数の増加率も上昇した。

従って、 FGF9は、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持したままでの雄性生殖系列幹細胞の増殖 (即ち増幅)を強力に促進することが示された。

[0260] (8) J^盲された雄件列榦細qからののィ乍

本発明の方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞が正常な精子形成に寄与し得るかどうかを確認するために、培養細胞をブスルファン処置した KSN系統ヌードマウスの精細管内に移植し、培養細胞由来の精子を用いた顕微受精により、培養細胞由来の子孫動物の作成を試みた。

GFPラット由来の GS細胞を、ラミニンコートディッシュ上、 15ngZml GDNF、 20 ng/ml EGF、 lOngZml FGF2及び lOng/ml FGF9を含む培地中で 116日間培養した。培養細胞をブスルファン処理したヌードマウスの精細管内に移植すると、外見上正常な精子形成細胞で満たされた多数の GFP陽性精細管を生じ、培養細胞由来の広大な精子形成コロニーが形成されることが示された（図 5)。ヌードマウス（レシピエント）は内在性の蛍光を有していないので、移植実験でのホストマウスにおける GFP陽性の精子形成は、培養されたドナー幹細胞由来のもののみである。

子孫動物を榭立するために、生きた GFP陽性精子又は GFP陽性精細胞（図 6)が、ヌードマウスの精巣力集められ、卵母細胞へ注入された。

結果を表 14に示す。

[0261] [表 14] 6時間後 24時間後

ドナ生存 2ΡΝ+ΡΒ 生存分割レシピ

着床数産子数 GFPC+) 生存数一数数 (%) (.%) (%) (%) ェン卜

#100

16 2

(U

4 87 63(72) 16(25) 48(55) 5(10) 33 6(18) 3(9) 1 3

#100

17 4

(R)

[0262] 構築された 87個の胚のうち、培養 24時間後において 48個が生存し、このうち 5個は分割していた。 33個の胚が偽妊娠した雌の輸卵管へ移入された。全部で 6個の胚が着床し、 3匹の子が生まれた（生後母ラットに食べられたものは含まず)。このうち 1 匹が GFP陽性であり、培養された GS細胞由来であることが確認された（図 7)。

[0263] これらの結果から、本発明の方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞力分ィ匕した生殖系列は正常な精子を形成することができ、正常な子孫を残すことができることが確認された。

[0264] (9)ラット GS細朐への遣伝子人

上記（6)と同様に榭立され、 FGF9を含有する培地中で増殖された SD系統ラットの GS細胞が以下の実験に用いられた。

ネオマイシン耐性遺伝子と CAGプロモーターに機能的に連結された EGFP構造遺伝子 (pCAG—EGFP)を保持する pCXNを基礎とするプラスミドベクターが遺伝子導入に使用された。遺伝子導入に際しては、製造会社の指示書に従い、 Cell Line N ucleofector Kit T(Amaxa社)により、 GS細胞がトランスフエタトされた。分離された GS 細胞 5 X 10⁶個を solution T (Nucleofector Kit T, Amaxa社） 100 μ 1に懸濁し、 5 ^ g のプラスミド DNAを添カ卩した後、エレクト口ポレーシヨンを行った。細胞は、 4mlの 15η g/ml GDNF、 20ng/ml EGF、 lOng/ml FGF2、及び lOng/ml FGF9を含む培地中に懸濁され、ラミニンコートディッシュ（30cm²)上に播種された。 G418選択 (40 μ g/ml、ジエネチシン;インビトロゲン社製）がトランスフエクシヨン力も 6日後に開始された。 G418による 14日の選択後、培地力も G418が除かれた。トランスフエクシヨンから 34日後に細胞のクローユングが行われた。 GS細胞の成長は密度により影響されるので、個々のコロニーは、 5000個のトランスフエタトされていない GS細胞と混合され、 96穴ラミニンコート培養プレートに移された。改変された細胞は、 G418 選択を繰り返しながら、 10〜14日おきに継代された。

[0265] トランスフエクシヨンから 3日後に、導入された EGFPの発現が UV光照射下、確認された（図 8)。また、 G418選択を行うことにより、トランスフエクシヨンから 99日後までに、 EGFP遺伝子が導入された、安定でクローナルな、遺伝子導入ラット GS細胞が榭立された（図 9)。

[0266] これらの結果から、本発明の方法を用いることにより、雄性生殖系列幹細胞に外来遺伝子を導入できること、及び外来遺伝子が安定に導入された雄性生殖系列幹細胞を選択できることが確認された。

実施例 2

[0267] (マウス始原生殖細胞のからの GS細胞培養の榭立）

始原生殖細胞は、午前 8時から午後 8時の 12 : 12 昼:夜サイクルを伴う管理された環境中で維持された妊娠 ICR系統マウス力採集された (SLC、静岡、日本)。性交プラグが認められたときに、その日が 0. 5dpcとされた。胚の性別は Ubel PCR法 (D ev. Biol., vol. 229, p. 468-479, 2001)に基づくジエノタイピングを用いて決定され、雄性の胚のみが本試験に用いられた。 12. 5- 15. 5dpc胚の生殖堤の解剖により生殖細胞に富んだ組織を得て、該組織を ImM EDTAdnvitrogen, Carlsbad, CA) を含む 0. 25%トリプシンを用いた 10分間の酵素分解に付すことにより、始原生殖細胞が回収された。

[0268] 回収された細胞は培地中に分散され、ラミニンコートされた培養用ディッシュ上で培養された。ラミニンコートプレートは、培養ディッシュを 20 g/mlの濃度でラミニン (B D Biosciences)を含む PBSにより 37°Cでー晚処理した後、該溶液を除去し、 PBSで 2回洗浄することにより調製した。

[0269] 基礎培養培地としては実施例 1と同一のものを用いた。 15ngZml GDNF、 20ng /ml EGF及び lOngZml FGF2が培地に添カ卩され、所望により更に lOngZml FGF9が培地に添加された。基礎培養培地 lmlあたり 0. 625mlの FCSが添加された。なお、実施例 2において使用されたサイト力インは実施例 1と同様である。細胞は 5%の二酸化炭素を含む空気中で、 37°Cにて維持され、適宜新たなラミニンコートデイツシュ上へ継代された。

[0270] 培養開始から 1ヶ月後の細胞の様子を図 10に示す。 FGF9の存在下で始原生殖細胞を培養することによりその数が増大し、増殖した細胞のコロニーが形成されたが、FGF9の非存在下では始原生殖細胞の増殖はほとんど認められな力つた。

[0271] 増殖した細胞を、精子幹細胞移植法により、 Wマウスの精巣へ移植すると、精子形成コロニーが形成されたことから、この細胞は雄性生殖系列幹細胞としての能力を有していることが示された。

[0272] 従って、 FGF9を含む培地中で始原生殖細胞を培養することによって、雄性生殖系列幹細胞を得ることができることが示された。

実施例 3

[0273] (マウス始原生殖細胞からの多能性幹細胞の誘導）

実施例 2と同様の方法で、 12. 5dpc及び 14. 5dpcの胚の生殖堤の解剖により生殖細胞に富んだ組織を得て、該組織を ImM EDTAdnvitrogen, Carlsbad, CA)を含む 0. 25%トリプシンを用いた 10分間の酵素分解に付すことにより、 ICR系統マウスの始原生殖細胞が採集された。

[0274] 回収された細胞は培地中に分散され、ラミニンコートされた培養用ディッシュ上で培養され、その後マウス胎仔線維芽細胞 (MEF)上で培養された。ラミニンコートプレートは、培養ディッシュを 20 g/mlの濃度でラミニン（BD Biosciences)を含む PBSにより 37°Cで一晩処理した後、該溶液を除去し、 PBSで 2回洗浄することにより調製した。

[0275] 基礎培養培地としては実施例 1と同一のものを用いた。 15ngZml GDNF、 20ng /ml EGF及び lOngZml FGF2が培地に添カ卩され、所望により更に lOngZml FGF9が培地に添加された。基礎培養培地 lmlあたり 0. 625mlの FCSが添加された。なお、実施例 3において使用されたサイト力インは実施例 1と同様である。細胞は 5%の二酸化炭素を含む空気中で、 37°Cにて維持され、適宜新たなラミニンコートデイツシュ上へ継代された。

[0276] 始原生殖細胞を、 FGF9、 GDNF、 FGF2及び EGFを含有する培地中で培養した際に、形成されるコロニーの大部分は、細胞間架橋 (intercellular bridge)と桑実胚 (mo rula)様構造により特徴付けられる、 GS細胞の典型的な外観を有していた。しかしながら、少数（< 5%)のコロニーは ES細胞への著しい類似を呈していた（図 11)。これらのコロニーはより硬く詰め込まれ (_packed)、通常培養開始後 120日以内に出現した。 ES細胞様コロニーは、 12. 5dpc及び 14. 5dpcのいずれの段階の始原生殖細胞からも発生した。 FGF9の非存在下では始原生殖細胞の増殖はほとんど認められなかった。

[0277] ES細胞様コロニーが分離され、更に同様の培養条件で増殖された。テラトーマ形成の解析のために、約 2 X 10⁶個の ES様細胞が KSNヌードマウス（日本 SLC)の皮下に注入され、移植から 3週間後に解析された。形成された組織は 10%中性緩衝ホルマリンで固定され、ノラフィン切片の処理がなされた。切片はへマトキシリンおよびェォジンで染色され、顕微鏡下観察された。

[0278] その結果、移植後 3乃至 4週間で、移植された ES様細胞は典型的なテラトーマを生じた。当該癌（テラトーマ）には、 3つの胚葉（embryonic germ layer)の派生物、例えば筋肉、神経、血管、気管支上皮等が含まれていた。

[0279] 従って、 FGF9を含む培地中で始原生殖細胞を培養することによって誘導された E S様細胞は多能性を有することが示された。

産業上の利用可能性

[0280] 本発明の方法を用いれば、動物種の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能となる。また、本発明の方法を用いれば、精巣細胞が由来する動物の齢の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能となり、特に出生前動物の精巣細胞から高効率で雄性生殖系列幹細胞を榭立することが可能となる。本発明の方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞は、遺伝子改変動物 (遺伝子導入動物、遺伝子欠損動物等)の作製、雄性不妊の治療、雄性不妊の治療剤の開発、生殖細胞レベルにおける遺伝子治療のための研究および薬剤の開発などに用いることが出来るので、本発明はバイォテクノロジー及び医学の分野にぉ、て有用である。

更に、本発明の方法を用いれば、始原生殖系列幹細胞が由来する動物の齢の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞から多能性幹細胞を誘導することが可能となる。本発明の方法により得られた多能性幹細胞を用いれば、自家移植のための組織適合性を有する多様な組織を構築することが可能であり、再生医療、遺伝子治療等の医学分野において有用である。また、当該多能性幹細胞はトランスジヱニック動物やノックアウト動物等の遺伝子改変動物の作成に用いることが出来るので、バイオテクノロジー分野において有用である。本出願は日本で出願された特願 2006— 073471 (出願日： 2006年 3月 16日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲

[2] FGFが FGF4サブファミリー、 FGF7サブファミリー、 FGF8サブファミリー、 FGF9 サブファミリー又は FGF19サブファミリーのメンバーである、請求項 1記載の方法。

[3] FGF力 FGF9サブファミリーのメンバーである、請求項 2記載の方法。

[4] FGFが FGF4、 FGF5、 FGF6、 FGF8、 FGF9、 FGF10、 FGF16、 FGF17、 FG

F18、 FGF19及び FGF20からなる群力も選択されるいずれかである、請求項 1記載の方法。

[5] FGF力 SFGF9である、請求項 4記載の方法。

[6] 培地が更に GDNFレセプターリガンドを含む、請求項 1記載の方法。

[7] GDNFレセプターリガンドが GDNFである、請求項 6記載の方法。

[8] 培地が更に FGF2を含む、請求項 1記載の方法。

[9] 培地が更に EGFを含む、請求項 1記載の方法。

[10] 請求項 1〜9のいずれかに記載の方法により増幅された雄性生殖系列幹細胞。

[II] FGF (FGF2を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞増殖促進剤。

[12] FGFが FGF4サブファミリー、 FGF7サブファミリー、 FGF8サブファミリー、 FGF9 サブファミリー又は FGF19サブファミリーのメンバーである、請求項 11記載の剤。

[13] FGFが FGF9サブファミリーのメンバーである、請求項 12記載の剤。

[14] FGFが FGF4、 FGF5、 FGF6、 FGF8、 FGF9、 FGF10、 FGF16、 FGF17、 FG F18、 FGF19及び FGF20からなる群から選択されるいずれかである、請求項 11記載の剤。

[15] FGFが FGF9である、請求項 14記載の剤。

[16] 更に GDNFレセプターリガンドを含む、請求項 11記載の剤。

[17] GDNFレセプターリガンドが GDNFである、請求項 16記載の剤。

[18] 更に FGF2を含む、請求項 11記載の剤。

[19] 更に EGFを含む、請求項 11記載の剤。

[20] FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することを含む、雄性生殖系列幹細胞の製造方法。

[21] 以下の工程を含む、不妊治療剤の製造方法：

[22] 以下の工程を含む、移植された雄性生殖系列幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物の製造方法：

[23] 以下の工程を含む、精子の製造方法：

b) a)で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程;及び c)該非ヒト動物から精子を単離する工程。

[24] 以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する胚の製造方法：

d)該精子を卵に受精させ、胚を得る工程。

[25] 以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法： a) FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程； b) a)で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程； c)該非ヒト動物から精子を得る工程；

d)該精子を卵に受精させ、胚を得る工程;及び

[26] 以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法： a) FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；

[27] 以下の工程を含む、外来遺伝子が導入された雄性生殖系列幹細胞の製造方法： a) FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程;及び

[28] FGF (FGF2を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養し、雄性生殖系列幹細胞を得ることを含む、雄性生殖系列幹細胞の製造方法。

[29] FGFが FGF9サブファミリーのメンバーである、請求項 28記載の方法。

[30] FGFが FGF9である、請求項 28記載の方法。

[31] 培地が更に GDNFレセプターリガンドを含む、請求項 28記載の方法。

[32] GDNFレセプターリガンドが GDNFである、請求項 31記載の方法。

[33] 培地が更に FGF2を含む、請求項 28記載の方法。

[34] 培地が更に EGFを含む、請求項 28記載の方法。

[35] 前駆体が始原生殖細胞である、請求項 28記載の方法。

[36] 請求項 28〜35の、ずれかに記載の方法により製造された雄性生殖系列幹細胞。

[37] FGF (FGF2を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞の分ィ匕誘導剤。

[38] FGFが FGF9サブファミリーのメンバーである、請求項 37記載の剤。

[39] FGFが FGF9である、請求項 37記載の剤。

[40] 培地が更に GDNFレセプターリガンドを含む、請求項 37記載の剤。

[41] GDNFレセプターリガンドが GDNFである、請求項 40記載の剤。

[42] 培地が更に FGF2を含む、請求項 37記載の剤。

[43] 培地が更に EGFを含む、請求項 37記載の剤。

[45] FGFが FGF9サブファミリーのメンバーである、請求項 44記載の方法。

[46] FGFが FGF9である、請求項 44記載の方法。

[47] 培地が更に GDNFレセプターリガンドを含む、請求項 44記載の方法。

[48] GDNFレセプターリガンドが GDNFである、請求項 47記載の方法。

[49] 培地が更に FGF2を含む、請求項 44記載の方法。

[50] 培地が更に EGFを含む、請求項 44記載の方法。

[51] 前駆体が始原生殖細胞である、請求項 44記載の方法。

[52] 請求項 44〜51のいずれかに記載の方法により製造された多能性幹細胞。

[54] FGFが FGF9である、請求項 53記載の組成物。

[55] 更に GDNFレセプターリガンドを含む、請求項 53記載の組成物。

[56] GDNFレセプターリガンドが GDNFである、請求項 55記載の組成物。

[57] 培地が更に FGF2を含む、請求項 53記載の組成物。

[58] 培地が更に EGFを含む、請求項 53記載の組成物。

[59] 前駆体が始原生殖細胞である、請求項 53記載の組成物。

[60] 雄性生殖系列幹細胞増殖促進剤を製造するための、 FGF (FGF2を除く）の使用。

[61] 雄性生殖系列幹細胞の分化誘導剤を製造するための、 FGF (FGF2を除く）の使用。