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WO2007105744A1 - プルキンエ細胞指向性ウイルスベクター - Google Patents

プルキンエ細胞指向性ウイルスベクター Download PDF

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WO2007105744A1
WO2007105744A1 PCT/JP2007/055017 JP2007055017W WO2007105744A1 WO 2007105744 A1 WO2007105744 A1 WO 2007105744A1 JP 2007055017 W JP2007055017 W JP 2007055017W WO 2007105744 A1 WO2007105744 A1 WO 2007105744A1
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WO
WIPO (PCT)
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vector
virus
cells
promoter
cell
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2007/055017
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hirokazu Hirai
Takashi Torashima
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kanazawa University NUC
Original Assignee
Kanazawa University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kanazawa University NUC filed Critical Kanazawa University NUC
Priority to US12/224,827 priority Critical patent/US8912315B2/en
Priority to JP2008505175A priority patent/JP4975733B6/ja
Publication of WO2007105744A1 publication Critical patent/WO2007105744A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses

Definitions

  • the present invention relates to a Purkinje cell-directed viral vector using a modified L7 promoter.
  • the cerebellum plays an important role in coordinated movements such as walking involving multiple muscles. If the cerebellum is damaged, coordination cannot be adjusted well, and smooth movement cannot be achieved. Movement commands from the cerebral cortex are transmitted through the brain stem to the spinal cord and muscles, but at the same time from the brain stem (bridge) to the cerebellar cortex through mossy fibers. Signals transmitted through the mossy fibers are input to granule cells, which are neurons in the cerebellar cortex. Granule cells transmit signals to Purkinje cells via parallel fibers that are axons.
  • Purkinje cell forms more than 100,000 synapses with parallel fibers, integrates input information from it, and outputs information to the cerebellar nucleus deep in the cerebellum.
  • Purkin ⁇ cells are the only output neurons from the cerebellar cortex and play a very important role in the cerebellum, but are fragile and are damaged by cerebellar hemorrhage, trauma, cerebellar tumors and genetic neurodegenerative diseases. Easy to receive.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 In order to efficiently introduce genes into Purkinje cells, it is necessary to use viral vectors with high affinity for nerves such as lentiviruses and adeno-associated viruses.
  • lentiviruses lentiviruses
  • adenoviruses, herpesviruses, adeno-associated viruses, and feline immunodeficiency virus-derived lentiviruses have been used for gene transfer into Purkinje cells.
  • VSV-G Vesicular somatitis virus glycoprotein
  • phospholipid phosphatidylserine
  • lentiviruses infect Stellate cells, basket cells, Golgi cells, and Bergmann glia in addition to Purkinje cells.
  • adeno-associated virus vectors and lentiviral vectors have the ability to introduce and express foreign genes in neural cells, but the gene size that can be expressed is limited due to packaging problems.
  • the gene size that can be expressed in the adeno-associated virus vector and the lentiwinores vector is 4 kb and 8 kb, respectively, together with the promoter region.
  • lentiviral vector plasmids have various improvements to increase safety, so depending on the vector plasmid used, expression is limited to around 5 kb. There are many.
  • the L7 promoter has activity specific to Purkinje cells and has been used to create transgenic mice that express foreign genes only in Purkinje cells.
  • the L7 promoter is as large as about 3 kb in length, and the size of the foreign gene that can be expressed is severely limited when used in adeno-associated virus vectors or lentiviral vectors.
  • its promoter activity is significantly lower than that of non-specific promoters such as CMV and MSCV promoters.
  • Efficient and specific gene transfer into cerebellar Purkinje cells could only be done by creating transgenic mice. However, if a gene can be specifically and efficiently introduced into Purkinje cells using a viral vector, Various studies that could not be performed will be possible, which will contribute greatly to the progress of research on the cerebellum. It is also expected to be applied to gene therapy for spinocerebellar degeneration, in which Purkinje cells are impaired.
  • Patent Document 1 Agudo M., Trejo JL, Lim F., Avila. J., Torres- Aleman I., Diaz-Nido J. & Wandosell F. (2002) Highly efficient and specific gene transfer to Purkinje cells in vivo using a herpes simplex virus I amplicon. Hum. Gene Ther., 13, 665-674.
  • Non-Patent Document 2 Ali sky JM, Hughes SM, Sauter SL, Jolly D., Dubensky TW Jr., Staber PD, Chiorini JA & Davidson BL (2000) Transduction of murine cerebellar neurons with recombinant FIV and AAV5 vectors. Neuroreport, 11, 2669-2673.
  • Patent Literature 3 Kaemmerer WF, Reddy RG, Warlick CA, Hartung SD, Mclvor RS & Low WC (2000) In vivo transduction of cerebellar Purkinje cells using adeno-associated virus vectors. Mol. Ther., 2, 446-457. 4] Xia H., Mao Q., Eliason SL, Harper SQ, Martins IH, Orr HT, Paulson HL, Yang L., Kotin RM & Davidson BL (2004) R Ai suppresses polyglutamine- induced neurodegeneration in a model of spinocerebellar ataxia. Nat. Med., 10, 816-820.
  • An object of the present invention is to provide a viral vector having high affinity for cerebellar Purkinje cells and selectively expressing Purkinje cells for gene expression.
  • the inventors have previously reported that human immunity has not been reported on gene transfer into the cerebellum. Experiments on gene transfer into the cerebellum using a lentiviral vector derived from a defective virus, and the Purkinje cell selectivity of the virus is drastically reduced when the culture medium pH during the production of the virus is slightly shifted to the acidic side. In addition, it was found that the selectivity of the virus to Purkinje cells differs depending on the serum lot added to the culture medium, and therefore some components in the serum are involved in maintaining Purkinje cell selectivity. Furthermore, based on the above findings, the inventors made the following hypothesis and tried to prove it.
  • Serum contains a substance that inhibits the activity of proteases, so that degradation of glycoproteins in the virus chain is suppressed, and selectivity for Purkinje cells is maintained.
  • the conventional L7 promoter has a length of 3 kb, so various lengths shorter than this were prepared and incorporated into viral plasmids.
  • viral vectors were obtained and inoculated into living mouse cerebellum for examination.
  • viral vectors incorporating the modified L7 promoter having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 show gene expression only in Purkinje cells, and the expression level is much higher than that of the conventional L7 promoter. I understood.
  • this book is written in the virus-derived vector plasmid with SEQ ID NO: 3 or 4 To a cerebellar Purkinje cell-directed vector obtained by linking a modified L7 promoter having the base sequence shown in FIG.
  • virus-derived vector plasmids examples include adenovirus, adeno-associated virus, retrovirus, herpes virus, Sendai virus, and lentivirus-derived vector plasmids. It is desirable that the envelope protein is VSV-G.
  • the viral protein produced by the vector is substantially in a state where it has not undergone degradation modification.
  • a vector in which the glycoprotein present on the viral envelope is not substantially subjected to degradation modification can be obtained by producing a virus in a host cell in a culture solution containing a protease inhibitor.
  • a protease inhibitor those having cathebsin K inhibitory activity (cathebsin K inhibitor or force tepsin inhibitor) are preferable.
  • the pH of the culture medium during virus production be maintained at 7.2 to 8.0.
  • the culture solution does not contain serum.
  • the present invention also relates to a cerebellar Purkinje cell-directed vector obtained by linking a foreign gene to a lentiviral vector plasmid in such a manner that the foreign gene can function, and the viral protein produced by the vector, particularly on the viral envelope.
  • a vector characterized in that the glycoprotein present in is in a state in which it is not substantially subjected to degradation modification.
  • the glycoprotein present on the virus envelope is not substantially degraded and modified! /
  • the vector in the state can be obtained by the above-described method.
  • Examples of the foreign gene introduced into the viral vector include a gene for treating Purkinje cell disorder disease and the disease gene. By introducing such a gene, the vector of the present invention can be used for gene therapy for Purkinje cell disorder diseases and for the production of model animals.
  • the therapeutic gene include, for example, GTPase CRAG, ubiquitin chain assembly factor E4B (UFD2a), ATPase VCP / p97, HDJ-2, molecular chaperone containing HSDJ and BiP, cell death inhibitory molecule containing YAPdeltaC, small containing ER degradation enhancing alpha- mannosidase-like protein (EDEM) ER sensor molecules including endoplasmic reticulum proteolysis-promoting molecules, CREB / ATF family members OASIS, IRE1, PERK and ATF6 (Endoplasmic: reticulum stress transducer) ⁇ Sphingomyelina-1, AT-mutated (atm), Reelin, Bel-2 And siRNA of genes encoding neprilysin, BDNF, and NGF, or genes encoding ataxin-1, ataxin-2, ataxin-3, ala voltage-dependent force channel, and PKCy.
  • GTPase CRAG
  • disease gene examples include, for example, ataxin-1, ataxin-2, ataxin-3, huntingtin, or 'a la feili surviving calcium channel having abnormally expanded CAG repeat
  • a gene or a gene encoding ⁇ having a mutation can be mentioned. .
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating a cerebellar Purkinje cell-damaging disease comprising the cerebellar Purkinje cell-directed vector.
  • cerebellar Purkinje cell disorder examples include, for example, spinocerebellar degeneration and Huntington's disease including Boliglutamine disease, Niemann-Pick disease, telangiectasia ataxia, autism, Alzheimer's disease, fetal alcohol syndrome (FAS) , Alcohol poisoning, caro's cerebellar ataxia.
  • spinocerebellar degeneration and Huntington's disease including Boliglutamine disease, Niemann-Pick disease, telangiectasia ataxia, autism, Alzheimer's disease, fetal alcohol syndrome (FAS) , Alcohol poisoning, caro's cerebellar ataxia.
  • the present invention also provides a non-human mammal introduced with the vector of the present invention.
  • a gene that impairs Purkinje cells (ataxin_l, ataxin-2, ataxin-3, huntingtin, or a la voltage-dependent canoleum channel gene with an abnormally elongated CAG repeat, or PKC y with a mutation)
  • a non-human mammal introduced with a gene and expressing the gene specifically in Purkinje cells can be used as a model animal for the cerebellar Purkinje cell disorder described above.
  • the present invention also includes ligating a foreign gene to a lentiviral plasmid vector in such a manner that the foreign gene functions and introducing the gene into a host cell, and culturing the cell in a culture solution containing a protease inhibitor to produce a virus.
  • a method for producing a Purkinje cell-directed viral vector is provided.
  • a modified L7 plasmid having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 in a virus-derived vector plasmid A method for producing a Purkinje cell-directed viral vector, characterized in that a motor is linked in a manner capable of functioning to a foreign gene, and the cells are cultured in a culture medium containing a protease inhibitor to produce a virus. provide.
  • the present invention relates to a culture solution for producing a Purkinje cell-directed virus vector comprising a substance having cathebsin K inhibitory activity, such a culture liquid (substance and cell culture medium having cathebsin K inhibitory activity, Alternatively, a Purkinje cell-directed virus vector preparation kit comprising a cell culture medium containing a substance having cathebsin K inhibitory activity as a constituent element is also provided.
  • the modified L7 promoter used in the present invention is about one-third the size of the conventional L7 promonitor, the size of the foreign gene that can be incorporated into the vector is greatly increased. Moreover, when the same copy number is integrated into the chromosome, it has much higher promoter activity than the conventional L7 promoter, and strongly induces the expression of foreign genes located downstream.
  • gene expression can be performed selectively and efficiently with the most important Purkinje cells in the cerebellum.
  • Purkinje cell-selective gene transfer is possible, and side effects associated with gene transfer and expression in other neurons and Darya cells are expected.
  • the vector can be prepared without using sushi serum, there is no problem of infection such as bovine spongiform encephalopathy, and it does not depend on the serum Lot, and is stably Purkinje cell. A directional vector can be obtained.
  • FIG. 1 shows the structure of pCL20c MSCV-GFP.
  • Fig. 2 shows (A) the experimental procedure of Example 1, (B) the expression of GFP in HEK293FT cells immediately before harvesting the virus 40 hours after transfection, and (C) 64 hours after the transformation. In HEK2 9 3FT cells just before virus recovery
  • Figure 3 shows (left) virus recovered 40 hours after transfection, (middle) Inoculated with virus recovered 64 hours after transfer, (right) Virus recovered after adjusting the pH to 7.0 by adding dilute hydrochloric acid to the culture medium containing virus 40 hours after transfection.
  • 1 is a graph showing the percentage (%) of each cell in all GFP-expressing cells in the cerebellar cortex after 1 week.
  • Figure 4 shows the expression of GFP in the cerebellar cortex molecular layer one week after inoculation with the virus recovered after adding diluted hydrochloric acid to the culture medium containing the virus for 40 hours after transfection and adjusting the pH to 7.0. It is a confocal laser microscope image.
  • B (A) Magnified image.
  • C An antibody against GFAP, a glial cell marker, was used. Double-stained image. The expression of GFP overlaps with the distribution of GFAP (red).
  • FIG. 6 is a graph showing the percentage (%) of Purkinje cells in all cells expressing GFP in an observation field using a 20 ⁇ counterpart lens.
  • FIG. 7 is a graph showing the percentage (%) of GFP-expressing Purkinje cells in all Purkinje cells in an observation field using a 20 ⁇ objective lens.
  • Figure 8 is a schematic diagram showing the structure of the proviral portion of a virus expressing spinal cerebellar degeneration type 3 gene ataxin-3 [Q69] fused with GFP (A). Two months after inoculation of this virus into the cerebellum The results of the rotarod test (B) and GFP-fused ataxin-3 [Q69] aggregate (C) in Purkinje cells of this mouse are shown.
  • Figure 9 shows the schematic diagram (A) of the construct used to create a mouse expressing the spinocerebellar degeneration type 3 gene ataxin-3 [Q69] under the control of Purkinje cell-specific L7 promoter. , b, c line)
  • Spinal cerebellar degeneration type 3 model mice results of rotarod test from 3 to 14 weeks after birth (B), brain sagittal section of wild-type mouse at 80 days after birth (C)
  • FIG. 2 shows cerebral sagittal section (D) of a c-cerebellar degeneration type 3 model mouse b line of the same week.
  • Figure 10 is a schematic diagram showing the structure of the provirus part of a viral vector that expresses CRAG with a Flag tag or VCP (C522T) (VCP / p97 with the 522nd cysteine replaced by threonine).
  • VCP C522T
  • the cerebellum of a b line model mouse is inoculated with GFP, CRAG, or VCP (C522T) -expressing virus 8 weeks after inoculation. Constant speed (5 rev / min) Indicates.
  • Figure 11 shows cerebellum prepared by perfusion fixation 8 weeks after inoculation with nothing (A, B), CRAG (C, D), or VCP (C522T) (E, F) expressing virus.
  • Sections were stained with immunohistochemistry using anti-HA tag antibody (A, C, E), and superimposed with images of double immunohistochemical staining with anti-calbindin antibody (B, D, E), the number of inclusions (G) in the cerebellar cortex of each section, and the molecular layer thickness (H) in each section.
  • FIG. 12 shows a schematic diagram showing the structure of the L7 promoter L (7-1) and its various modified types (L7-2 to L7-7).
  • Fig. 13 shows a schematic diagram of the plasmid pCL20c L7-4-GFP, in which the L7-4 promoter is inserted into a lentiwinole vector vector (pCL20c) and the green fluorescent protein GFP is placed downstream of it.
  • pCL20c lentiwinole vector vector
  • Figure 14 shows the expression rate of GFP in Purkinje cells when using various promoters.
  • A Ratio of Purkinje cells in total GFP-expressing cells: Number of GFP-expressing Purkinje cells / Number of GFP-expressing cells
  • b Ratio of GFP-expressing Purkinje cells in all Purkinje cells: GFP-expressing Purkinje cells / total Purkinje cells number
  • Figure 15 shows (a) a comparison of fluorescence intensity when GFP was expressed in cultured cerebellar Purkinje cells using lentiviral vectors incorporating various promoters, and (b) a lenti that expresses GFP under the control of the CMV promoter.
  • the GFP fluorescence intensity is shown when HEK293T cells are infected with various M0I virus vectors.
  • Figure 16 shows the use of lentiviral vectors incorporating various promoters. The fluorescence immunostaining photographs when the GFP gene is expressed in cultured cerebellar Purkinje cells are shown.
  • Figure 17 shows the results of gene transfer into the cerebellum.
  • A-d is a GFP fluorescence photograph when GFP is expressed using a lentiviral vector under the control of a conventional L7 promoter (L7-1).
  • C is anti-GFP antibodies.
  • E-h shows a GFP fluorescence photograph of cerebellar Purkinje cells when L7-4 promoter is used.
  • the “Purkinje cell-directed vector” according to the present invention (hereinafter referred to as “the vector of Honjo Akira”) has high affinity for cerebellar Purkinje cells and can perform gene transfer specifically for Purkinje cells. It is a vector having a higher selectivity for Purkinje cells than other neurons and glial cells, such as parmanglia, astrocytes, and sputum cells present in the cerebellum.
  • the vector of the present invention is formed by linking a modified L7 promoter and a foreign gene to a virus-derived plasmid vector in such a manner that it can function.
  • a suitable promoter and a foreign gene are linked in a manner capable of functioning to a lentil virus plasmid vector.
  • virus-derived plasmid vectors include adenovirus, adeno-associated virus, retrovirus, henorepeswinores, Sendai virus, and lentivirus-derived plasmid vectors, which are particularly highly selective for Purkinje cells.
  • Adeno-associated virus and lentivirus-derived plasmid vectors are preferred, and lentivirus vectors are most preferred.
  • Lentivirus is one of the RNA viruses that have reverse transcriptase. Thus, non-dividing cells can be efficiently infected without cytokine stimulation, and the virus genome can be integrated into the host chromosome. For this reason, vectors derived from lentivirus are widely used as vectors for gene transfer into mammals. Lentiviruses include human immunodeficiency virus (HIV), feline immunodeficiency virus (FIV), simian immunodeficiency virus (SIV), equine infectious anemia virus (EIAV), Hedge arthritis encephalitis virus (CAEV), maedi virus As vectors, vectors derived from human immunodeficiency virus, feline immunodeficiency virus, and monkey immunodeficiency virus are generally used.
  • RNAs consists of two plus-strand RNAs, a core protein (gag protein) that surrounds it, a matrix that surrounds the core, and a lipid bilayer that surrounds it.
  • the core contains reverse transcriptase, RNase H, integrase, and protease, and the lipid bilayer is spiked with envelope protein, a protein.
  • VSV-G Vesicular somatitis virus glycoprotein
  • Lentiwinores plasmid vectors are usually composed of 2 to 4 component packaging (packaging plasmid, REV plasmid), envelope, and vector.
  • packaging plasmids supply proteins necessary for virus particle formation other than the envelope, but destroy the tat-rev region necessary for replication or delete either tat or rev so that they cannot replicate in the host. The other is then transferred to another plasmid.
  • the envelope plasmid supplies the proteins necessary for envelope formation. As described above, since the HIV envelope can infect only CD4 positive cells, the protein is replaced with VSV-G. Yes.
  • the vector plasmid contains the LTR, packaging signal, and primer binding sites required for reverse transcription.
  • the enhancer / promoter portion of the LTR is deleted and a foreign promoter such as a CMV promoter is incorporated instead to enhance safety I 1 life.
  • a modified L7 promoter is used as the foreign promoter for the appropriate and efficient expression of the foreign gene in Purkinje cells. This modified L7 promoter will be described in detail in the next section.
  • a promoter in particular a modified L7 promoter, and a foreign gene are linked to a retrowinores plasmid vector in such a manner that it can function.
  • the “functional form” means that the foreign gene is introduced into an infected host and appropriately expressed there.
  • the “foreign gene” is a gene that is not originally possessed by a retrovirus.
  • a reporter gene for research such as a GFP gene
  • Disease genes are used. These “therapeutic genes” and “disease genes” will be described in detail later.
  • the virus produced by the vector of the present invention is preferably in a state in which the protein is not substantially denatured.
  • the glycoprotein VSV-G present on the virus envelope is not substantially degraded and modified.
  • viral proteins play an important role in infection and propagation in the host.
  • the inventors added protease to the culture medium for virus production. This proved that the Purkinje cell selectivity was greatly improved. Therefore, “substantially” no degradation modification is not a strict requirement that the viral protein is not 100% degradation-modified from the production of the virus to the time of use. In the range in which (directivity) is achieved, this means that fine unavoidable degradation modifications that do not affect are allowed.
  • the modified L7 promoter used in the present invention is about 1/3 in length based on the conventional cerebellar Purkinje cell-specific L7 promoter (SEQ ID NO: 1) having a length of 3 kb. It was identified as a promoter region having stronger activity while maintaining cell specificity.
  • the modified L7 promoter of the present invention has the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (L7-3) or SEQ ID NO: 4 (L7-4).
  • the present invention is not limited to these sequences, and has a sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
  • DNA that can hybridize with DNA under stringent conditions also has the modified type. As long as it has a base length equivalent to 7 promoter (about 900 bp to 1500 bp) and equivalent Purkinje cell-specific promoter activity, it is included in the modified L7 promoter of the present invention.
  • any sequence from 1006 bp to 1500 bp on the L7 promoter sequence (SEQ ID NO: 1) as long as it contains at least the 17-4 promoter sequence shown in SEQ ID NO: 4, especially the L7-4 promoter sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • any contiguous 1006-11319 bp fragment on the L7-3 promoter sequence (SEQ ID NO: 3) containing can be used as the modified L7 promoter of the present invention.
  • the “stringent condition” means 6xSSC (composition of lxSSC: 0.15M NaCl, 0, 015M sodium taenoate, ⁇ 7.0), 0.5% SDS, 5 ⁇ Denhardt and 100 / ig / ml denatured fragmented salmon sperm DNA and 50% formamide in a solution containing nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 overnight at 55 ° C and low ionic strength, for example, 2xSS
  • stringent conditions such as 0.lxSSC and / or higher temperatures, 37 ° C or higher, for stringiens, 42 ° C or higher, for more stringent, 50 ° C or higher, for more stringent It can be achieved depending on conditions for washing under conditions such as 60 ° C or higher.
  • the vector of the present invention is, for example, linked to a viral vector plasmid in such a manner that a therapeutic gene can function, and transcribed into an appropriate host cell, and then cultured in a culture medium containing a protease inhibitor. And produced by producing a virus.
  • HEK293FT cells As the “host cell”, HEK293FT cells, HEK293T cells and the like are usually used. Calcium ions are used for vector plasmid transfection. [Cohen, SN et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110-2114 (1972)] and the electroporation method, etc. This is achieved by introducing all the plasmids (packaging, envelope, vector) that constitute the vector system into the host cell.
  • the culture media for culturing viruses include MEM, -MEM, D-MEM, BME,
  • Known culture solutions such as RPMI-1640, D-MEM / F-12, Ham's F-10, Ham's F-12, etc. can be appropriately selected and used according to the cells to be cultured.
  • the protease inhibitor added to the culture solution is not particularly limited.
  • K inhibitory activity can be suitably used.
  • Such substances include commercially available cathepsin K inhibitors such as Cathepsin K inhibitor I, Cathepsin.
  • cathepsin inhibitors For example, Cathepsin inhibitor I,
  • Cathepsin inhibitor II and Cathepsin inhibitor III (both manufactured by Merck Cal Biochem) can be used.
  • the culture medium preferably maintains pH 7.2 to pH 8.0 during virus production. If the pH is lower than this, the Purkinje cell directionality (selectivity) of the vector is lowered, and if the pH is higher than this, the cell proliferation is worsened. Since the pH of the culture medium shifts to acidic as the cells grow, it is also possible to add a reagent that has the effect of preventing pH reduction, such as HEPES, in addition to the protease inhibitor in the culture medium.
  • a reagent that has the effect of preventing pH reduction, such as HEPES, in addition to the protease inhibitor in the culture medium.
  • host cells are cultured under conditions of 3 to I 0% CO 2 , 30 to 40 ° C, especially 5% C 0 2 and 37 ° C. is not.
  • the culture period after the transfer is not particularly limited, but is at least 24 hours, at least 216 hours, preferably 36 to 72 hours, more preferably about 40 to 48 hours.
  • the vector of the present invention Since the vector of the present invention has extremely high affinity and selectivity for Purkinje cells, it is useful for gene therapy as a delivery vector to Purkinje cells. That is, the vector of the present invention is useful as a pharmaceutical composition for treating “Purkinje cell disorder” caused by a disorder in Purkinje cells.
  • the pharmaceutical composition is prepared by dissolving and suspending the vector of the present invention in a suitable buffer together with a pharmacologically acceptable carrier, and the subarachnoid space on the cerebellar cortex and / or cerebellar surface. Injected into. ⁇
  • Purkinje cell disorder examples include polyglutamine diseases including spinocerebellar degeneration and Huntington's disease, Niemann-Pick disease, telangiectasia ataxia, autism, Alzheimer's disease, fetal alcohol symptom group ( FAS), alcoholism, and ability to raise age-related cerebellar ataxia.
  • polyglutamine diseases including spinocerebellar degeneration and Huntington's disease, Niemann-Pick disease, telangiectasia ataxia, autism, Alzheimer's disease, fetal alcohol symptom group ( FAS), alcoholism, and ability to raise age-related cerebellar ataxia.
  • the “therapeutic gene” linked to the vector of the present invention when expressed in Purkinje cells, is a gene useful for the treatment of the above-mentioned Purkinje cell disorder disease, and is adapted to the disease to be treated. You can select as follows.
  • GTPase CRAG (Qin et al. J. cell Biol. 2006 Feb 13; 172 (4): 497-504.), Ubiquitin chain assembly factor E4B (UFD2a) (Matsumoto et al. al. EMB0 J. 2004 Feb 11; 23 (3): 659-69.), ATPase VCP / p97 (Hirabayashi et al. Cell Death Differ. 2001 Oct; 8 (10): 977-84.), molecular shear HDJ “-2 HSDJ (Cummings et al. Nat Genet. 1998 Jun; l9 (2): 148-54.) And molecular chaperone BiP (Kozutsumi et al. Nature.
  • siRNA against Huntingtin may be used to suppress the expression of these genes.
  • a gene encoding sphingomyelinase can be used as a therapeutic gene.
  • the gene coding for AT-mutated (atm), and for the treatment of autism the gene encoding Reelin or Bel-2 Can be used.
  • a gene encoding neprilysin can be used as a therapeutic gene.
  • genes encoding Bcl-2, DNF, and NGF can be used as therapeutic genes. .
  • the pharmacological evaluation of such gene therapy differs depending on the type of disease to be treated, but in the case of spinocerebellar degeneration, the vector is administered to the cerebellar cortex and / or the subarachnoid space on the surface of the cerebellum, followed by cytology. Can be achieved by preventing the cerebellar neurons including Purkinje cells, astrocytes and sputum cells from falling off, and clinically (behavioral in animals) by improving cerebellar ataxia. .
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered by injection into the subarachnoid space on the surface of the cerebellum.
  • the injected vector can deliver a therapeutic gene over a wide range with high affinity to the entire Purkinje cell, without being limited only to Purkinje cells around the injection site.
  • the injection of the vector of the present invention into the subarachnoid space on the cerebellum surface is lower than the injection of the lower olive nucleus located deep in the brain reported for herpes virus and adeno-associated virus into the cerebellar nucleus. It is easy to use and can suppress damage to the brain parenchyma, making it excellent for clinical application.
  • a means capable of injecting at a constant rate for example, in the case of mice, a Hamilton syringe and a micromanipulator capable of attaching it. It is desirable to use a microinjection pump for injection.
  • the infusion rate and dose are not particularly limited as long as the brain pressure can be stably maintained. In addition, it can be appropriately set according to the age, weight, disease state, etc. of the individual.
  • nl / min to 800 nl / min preferably 50 nl / min to 400 nl / min, more preferably lOOnl / min to 200 nl / min, and a total of 2 to 81 is desirable.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an amount suitable for exerting a therapeutic effect, and can be appropriately set according to the age, weight, disease state, etc. of the individual.
  • the number of administrations of the therapeutic agent of the present invention may be sufficient as long as it exerts a therapeutic effect.
  • Adeno-associated virus, herpes virus, Sendai When long-term gene expression is used, a single administration may be used, but in order to increase the copy number of the incorporated gene and introduce it into a wider range of cells, while looking at the therapeutic effect, The cerebellar surface location may be changed and administered about 3 times.
  • the expression of a specific gene can be specifically suppressed or overexpressed in Purkinje cells of the target animal.
  • Non-human mammals that can be used include, but are not limited to, mouse, rat, rabbit, horse, hidge, inu, cat, monkey.
  • the use of the vector of the present invention is very effective because it is extremely difficult to produce a transgenic mouse in animals other than mice and rats.
  • the above-mentioned cerebellar disease gene (ataxin-1, ataxin-2, ataxin-3, a la voltage-dependent calcium channel having an abnormally expanded CAG repeat, a gene encoding Huntingtin, Non-human mammals such as Klebe S. et al. Ew mutations in protein kinase Cgamraa associated with spinocerebellar ataxia type 14. Ann Neurol. 2005 Nov; 58 (5): 720-9)
  • the gene involved in the gene can be used as a model animal for cerebellar Purkinje cell disorder or for cerebellar function research. It is useful as a model animal. 6.
  • the present invention also includes a culture liquid for purkinje cell-directed virus vector preparation and a culture medium comprising a substance having cathebsin K inhibitory activity.
  • a Purkinje cell-directed virus vector preparation kit is also provided, which comprises (a substance having a cathepsin K inhibitory activity and a cell culture medium or a cell culture medium containing a substance having a cathebsin K inhibitory activity) as a constituent element. .
  • the culture solution of the present invention is a known culture solution such as ⁇ , ⁇ - ⁇ , D- ⁇ , ⁇ , RPMI-1640, D-MEM / F-12, Ham's F-10, Ham's F-12, etc. It is prepared by adding a substance having cathepsin K inhibitory activity to Examples of substances having cathebsin K inhibitory activity include cathebsin K inhibitors: for example, Cathepsin K inhibitor I, Cathepsin K inhibitor II, Cathepsin K inhibitor III (all manufactured by Merck Calbiochem, etc.), and cathepsin inhibitors: Cathepsin inhibitor I N Cathepsin inhibitor II and Cathepsin inhibitor III (both manufactured by Merck Calbiochem, Inc.) can be used as appropriate, but are not limited thereto.
  • the culture medium may appropriately contain a reagent having an effect of preventing pH reduction such as HEPES so that pH 7.2 to pH 8.0 is maintained during virus production.
  • a reagent having an effect of preventing pH reduction such as HEPES so that pH 7.2 to pH 8.0 is maintained during virus production.
  • the kit of the present invention includes the above-described essential components (a substance having a cathepsin K inhibitory activity and a cell culture medium, or a cell culture medium containing a substance having a cathepsin K inhibitory activity), as well as a virus plasmid transfectivity. It may contain calcium chloride solution for Yeon, Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), phosphate buffer, filter for filter sterilization (such as 0.22 filter). Calcium chloride is prepared, for example, by adding 100 ml of purified water to .36.76 g CaCl 2 2H 20 and sterilizing by filtration. Also, Hank 's balanced salt solution (2xHBSS), for example, NaCl 8. 2g (final 0. 28M ), HEPES 5. 95g (final 0. 05M), Na 2 HP0 4 0. 108g (final 1. 5mM) Prepared by mixing 400 ml of H 2 0, adjusting to pH 7.05 with 5 N NaOH and adding purified water to 500 ml.
  • HBSS
  • Example 1 Effect of incubation time after transfection on Purkinje cell selectivity of virus
  • HEK293FT cells were used for virus production.
  • D-MEM Dulbecco, s modified Eagle's medium
  • HEK293FT cells in logarithmic growth phase are dispersed in phosphate buffered saline (without Mg 2+ and Ca 2+ ) [PBS (—)], then 5 X per 10 cm dish (Falcon). 10 5 cells were seeded. The lOctn dish after seeding, addition of 10 wt% ⁇ shea calf serum containing. Yes D-MEMlOml, after which the cells were cultured in 5 vol% C0 2, 37 ° C.
  • the culture medium in the dish was renewed and replaced with 10 ml of culture medium (D-MEM containing 10% by weight urchin fetal serum). Then the cells, 5 volumes. /. C0 2, and incubated 0.5 hours at 37 ° C.
  • D-MEM culture medium containing 10% by weight urchin fetal serum
  • pCAGkGPIR A packaging plasmid containing gag (encoding viral structural protein) and pol (encoding reverse transcriptase).
  • pCAG4RTR2 A plasmid containing tat (transcriptional regulatory gene). Because rev is deleted, the virus particle cannot replicate in the host.
  • VSV-G stands for Vesicular somatitis virus glycoprotein.
  • the original envelope of lentivirus can only infect CD4 positive cells.
  • pCL20c MSCV-GFP A plasmid in which the MSCV promoter is placed in two LTRs and the GFP gene is linked to the main vector of lentivirus pCL20c. ( Figure 1).
  • the virus produced has infectivity, but lacks self-propagation ability after infection. This increases safety.
  • the plasmid solution was evenly dropped onto the dish and gently mixed with the medium in the dish. Then the cells are 5 volumes. /. The cells were cultured at C0 2 and 35 ° C. The operation was performed in the safety cabinet for biohazard countermeasures.
  • the medium in the dish was replaced with 10 ml of fresh medium (10 wt./. D-MEM containing urchin fetal serum). Further cells, 5 vol ° /.
  • the culture solution was collected containing viruses in C0 2, 37 ° 40 hours later Trang Sufuekushiyon cultured in C (40h virus). Then, a new culture solution was added and the cells were further cultured for 24 hours, and the culture solution containing the virus was collected 64 hours after transfection (64h virus) (see Fig. 2).
  • the medium collected in (1) above was transferred to a 50 ml centrifuge tube and centrifuged at 1000 rpm (120 ⁇ g) for 4 minutes to obtain a supernatant.
  • the obtained supernatant was passed through a filter (Millipore, 0.22 ⁇ diameter).
  • the obtained filtrate was subjected to ultracentrifugation (25,000 rpm, 2 hours, 4 ° C.) using a Beckman rotor SW28.1 to precipitate virus particles, and the supernatant was removed.
  • the resulting virus particle precipitate was suspended in PBS ( ⁇ ) to a final volume of 200 1 to obtain a virus solution for infection.
  • the virus solution that was not used immediately was dispensed 201 by 1 and stored at -80 ° C.
  • HELA cells were dispersed in PBS ( ⁇ ), and then seeded on a 12-well dish (manufactured by Izuki Glass Co., Ltd.) at 5 ⁇ 10 4 cells per well. 10 weights in 12 wood dishes after sowing. /. Add D-MEM containing urchin fetal serum to 1 ml / well, and then add 5 volumes of cells. /. The cells were cultured at C0 2 and 37 ° C for 24 hours. The virus solution was added to the medium in the well so as to be 10 3 to 10 5 times. At the same time, Hexadimethrine Bromide (SIGMA, trade name: Polyprene) was applied to each tool to 6 ⁇ g / ml. Thereafter, the cells were cultured for at 88 with 5 volumes% C0 2, 37 ° C.
  • SIGMA Hexadimethrine Bromide
  • the cells expressing green fluorescent protein (GFP) in the well were measured using a cell counter (manufactured by Azwan, trade name: tally counter) under a fluorescence microscope (manufactured by Olympus ⁇ trade name: CKX41). The titer was calculated. While the addition of 10 x diluted virus solution, if GFP expressing cells in the Y-number of cells were found, the virus titer, YX lO TU / ral! ( TU: transductionunit) is calculated as. ⁇
  • HeLa cells are cultured in a 10cm dish and infected 24 hours after seeding. Three days after infection, 5.0 ⁇ 10 6 cells were obtained. In parallel, the same number of LAV-8E5 cells (ATCC, Manassas, VA, USA) were obtained. LAV-8E5 cells have one copy of HIV type 1 provirus per cell, and this is the standard. Genomic DNA was extracted from these cells and finally dissolved in 1001 TE buffer. Of these, ⁇ ⁇ was used, and the 290 base pair region contained in the HIV prowinores RRE (rev responsive element) was amplified using the following primers:
  • the copy number of provirus integrated into the genome was determined by serial dilution of genomic DNA. That is, by determining the dilution ratio just before the band disappears and comparing it with the standard using LAV-8E5 cells, how many proviruses are integrated per 5.0 X 10 6 HeLa cells ( Genomic copy number Z virus solution (ml) was calculated.
  • mice supplied with SLC, 4 to 10 weeks old
  • pentobarbital trade name: Nembutanore
  • intraperitoneal administration 40 mg / kg body weight
  • the mouse was fixed using a small animal fixation device (trade name: SG-4, manufactured by Narishige) Fixed.
  • the body temperature of the mouse was maintained at 37 ° C. with a body temperature controller [manufactured by FST, product name: body temperature control system (for mouse) FST-HPSM].
  • FST body temperature control system
  • a microdrill (Urawa Kogyo Co., Ltd., trade name: Power Controller UC100 + HB1 (drill)) is applied to the skull of the midline on the caudal side 5-7mtn from Bregma. Was used to make a hole with an inner diameter of 2 to 3 mm. Also, injection # 1 "was used to puncture the dura mater and spider membrane under the bone.
  • the resulting lentiviral vector is filled into the trade name: Rexfill Microsyringe (WPI, 101 volumes), and the Ultra Micropump 2 (WPI), with the flexfil microsyringe attached to the micromanipulator. Set. .
  • the skin of the incised mouse was sutured with an ophthalmic microneedle with a suture (manufactured by Natsume Seisakusho Co., Ltd., trade name: weak ophthalmic needle for ophthalmology C67-0). Thereafter, the mouse was removed from the fixing device and observed with a cage (in the safety cabinet) placed on a heating pad (trade name: rubber mat heater SG-15, manufactured by Showa Seiki Kogyo Co., Ltd.).
  • mice After the mice were awakened from anesthesia, the mouse cages were raised in an infected animal rack (manufactured by Toki Scientific Instruments Co., Ltd., trade name: Bioclean Gabu Cellulite T-BCC- ⁇ 4) with a sputum filter. .
  • mice Seven days after inoculation, the mice were perfused and fixed with 4% formaldehyde phosphate buffer, and the brains were removed. After taking a picture of the whole brain and a fluorescent photograph of GFP using a fluorescence stereomicroscope, a cerebellar sagittal slice with a thickness of 50 111 or 100 m was microslicer (Product name: DTK-1000) ).
  • the prepared brain slices were treated with primary antibody [Mouse monoclonal ant i-parvalbumin (marker of astrocytes and sputum cells): SIGMA, or Mouse monoclonal anti-GFAP (marker of glial cells): Made from a mouse mouse monoclonal anti- neuron-specif ic nuclear protein (Neu ⁇ , granule cell marker): Chemicon or mouse Monoclonal ant i-mGluR2 (Golgi cell marker) Incubated with Prof.
  • Primary antibody Mae monoclonal ant ant i-parvalbumin (marker of astrocytes and sputum cells): SIGMA, or Mouse monoclonal anti-GFAP (marker of glial cells): Made from a mouse mouse monoclonal anti- neuron-specif ic nuclear protein (Neu ⁇ , granule cell marker): Chemicon or mouse Monoclonal ant i-mGluR2 (Golgi cell marker) In
  • Example 2 Based on the results of pH Effect Example 1 of the culture solution when a virus production against Purukine cell selectivity, of the culture solution The relationship between pH and Purkinje cell selectivity And examined.
  • Example 1 the culture solution containing the virus for 40 hours after transfection was diluted with hydrochloric acid to adjust the pH to 7.0, and then the virus was purified and similarly inoculated into the mouse cerebellum. Was observed. Furthermore, the same experiment was performed using HEK293T cells, which grew slower than HEK293FT cells, and therefore also slowed the acidification accompanying the growth of the culture medium.
  • Serum free HEK293T cells were transfectea in the culture medium containing the serum S7. The serum was removed 24 h after the transfection.
  • a virus vector produced in a medium containing only D-MEM without serum or protease inhibitors had a selectivity for Purkinje cells of 48% (about half of the cells expressing GFP were Purkinje). cell).
  • Some viruses produced in serum-added media had greatly increased selectivity (GIBC0, mexican sera, etc.) and some remained almost unchanged (HyClone sera).
  • the selectivity for Purkinje cells was greatly increased in any of the drugs used except TIMP-1.
  • the addition of a force tepsin K inhibitor was remarkable.
  • the gene expression efficiency in Purkinje cells was 37% in a virus vector produced in a medium containing only D-MEM without serum or protease inhibitors (37% of all Purkinje cells in the observation field). Was expressing the GFP gene). Unlike the selectivity results, the gene expression efficiency in Purkinje cells did not increase significantly even when the Lot of the serum used was changed. Similarly, the addition of protease inhibitors did not show a significant increase in 3 out of 5 types. However, when Cathebsin K was added, the gene expression efficiency of Purkinje cells was 86%, showing a marked increase.
  • the culture solution (pH 7.2) for 40 hours and the culture solution for 64 hours (pH 7.0) after transfection are obtained by the procedure of Example 1.
  • Cathepsin K activity in these two cultures is measured using Cathepsin K Detection Kit (Menorek Calbiochem).
  • VSV-G protein of these four viruses Produce and recover 40 and 64 hour viruses. Treat the culture for 40 hours after transfection with cathebsin K, or reduce the pH to 7.0 using dilute hydrochloric acid, and then recover the virus. The state of cleavage of the VSV-G protein of these four viruses is directly amino-terminal sequenced to confirm where it is cleaved.
  • Purkinje cell selectivity is reduced by treating the virus with cathepsin K.
  • Example 1 According to the procedure of Example 1, a culture solution containing virus particles is obtained 40 hours after the transfection. Treat this culture with cathepsin K for 2 hours. Thereafter, ultracentrifugation is performed to collect the virus and inoculate the mouse cerebellum. After 1 week, confirm that the Purkinje cell selectivity of the virus has decreased.
  • cathebucin K mRNA has already been extracted from HEK293T cells and the gene has been obtained using RT-PCR. (The fact that the cathebsin K gene was obtained from HEK293T cells by RT-PCR indicates that HEK293T cells express cathebsin K).
  • the cathebsin K gene was subcloned into the pcDNA3.1 vector and used to transfect HEK293T cells, and the culture broth was collected after 3 days.
  • the culture broth should contain cathepsin K in a plus amount.
  • the causative gene of spinocerebellar degeneration type 3 (MJD disease) is ataxin-3, and CAG repeats within this gene are abnormally elongated in patients. Therefore, a model mouse for MJD disease was created by expressing ataxin-3 with abnormally expanded CAG repeats in Purkinje cells using a lentiviral vector.
  • a vector plasmid was prepared so that ataxin-3 with abnormally expanded CAG repeats was expressed under the control of the MSCV promoter (Fig. 8A).
  • a virus was obtained for 40 hours.
  • HEK293T cells were used as virus-producing host cells.
  • the obtained virus was inoculated into mouse cerebellum, and after 2 months, the degree of cerebellar ataxia was analyzed with a rotarod (Muromachi Kikai Co., Ltd., MK-660C).
  • the rod (accelerated) was gradually accelerated from the stopped state, adjusted to a speed of 40 revolutions / minute after 180 seconds, and the time the mouse was on the rod was measured. The experiment was repeated 8 times.
  • mice inoculated with the virus dropped from the rod in a significantly shorter time than the control mice not inoculated with the virus, indicating that ataxia appeared (Fig. 8 B).
  • the mice were fixed by perfusion, and a cerebellar slice was prepared and observed. Agglutination of ataxin-3 was observed in Purkinje cells (Fig. 8 C arrow).
  • cerebellar disease-causing genes are expressed in Purkinje cells using viruses. By doing so, it was shown that it is possible to create a cerebellar disease model mouse.
  • Example 7 Examination of therapeutic effect of therapeutic gene expression virus using spinal cerebellar degeneration model mice
  • Fig. 9A a DNA construct arranged to express spinal cerebellar degeneration type 3 gene ataxin-3 [Q69] with abnormally elongated CAG repeats.
  • the mice were inoculated into fertilized eggs of mice, and three lines of transgenic mice (spinal cerebellar degeneration model mice) that highly express ataxin-3 [Q69] specifically in cerebellar Purkinje cells were obtained.
  • the cerebellum of these mice was inoculated with CRAG, which is a therapeutic gene candidate, or with a viral vector (Fig. 1 OA) expressing VCP (C522T), which was obtained by converting VCP / p97 cysteine at position 522 to threonine. Was observed to recover (Fig. 10 BE).
  • aline and bline had extremely strong ataxia immediately after birth (Fig. 9B), and cerebellar atrophy was also remarkable (Fig. 9 C, D).
  • the degree of ataxia in the 'c line was intermediate between the wild type and a, and the b line and wild type (Fig. 9B).
  • the cerebellum of a 30-day-old c line model mouse was inoculated with CRAG-expressing virus, and a rotarod test (the rod accelerated from the stationary state to 40 rpm Z in 180 seconds) was performed every other week.
  • a rotarod test the rod accelerated from the stationary state to 40 rpm Z in 180 seconds
  • mice inoculated with the virus gradually improved (Fig. 9D).
  • Purkinje cell-selective CRAG expression using virus significantly recovered motor impairment in spinocerebellar degeneration type 3 model mice.
  • b line mice (21 days after birth) with stronger ataxia were inoculated with a lentiviral vector expressing CRAG or GFP, a significant recovery of rotarod performance was observed after 4 weeks (Fig. 10).
  • I was able to get on the accelerating rotarod for a longer time (the mice that had not been inoculated and mice that had been inoculated with the GFP-expressing lentiviral vector could only take less than 20 seconds.
  • b line mice Two months after virus vector inoculation, b line mice were fixed by perfusion and cerebellar sections were prepared. Cerebellar sections were stained with double immunohistochemistry using anti-HA tag antibodies (Fig. 11 A, C, E) and anti-calbindin antibodies (Fig. 11. B, D, E). In sections where nothing was expressed, the Purkinje cell layer was greatly disturbed, and inclusion bodies containing ataxin-3 were observed inside the cells (Fig. 11. A and B). In contrast, most of the inclusion bodies disappeared in CRAG and VCP (C522T) -expressing sections, and the Purkinje cell layer was in a state close to the wild type with 1-2 layers (Fig. 11 C_F). The number of inclusions in the cerebellar cortex (Fig. 11 A, C, E).
  • Example 8 the thickness of the cerebellar cortex molecular layer (Fig. 1 1 H) were measured, and the number of inclusions in the CRAG and VCP (C522T) -expressing sections There was a significant decrease and a significant increase in molecular layer thickness.
  • L7-1 Based on the conventional L7 promoter (L7-1), various reduced L7 promoters (L7-2, L7-3, L7-4, L7-5, L7-6, L7 -7), and using a lentiviral vector to express GFP under the control of this reduced promoter, Purkinje cell selectivity is the same as that of the CMV promoter, MSCV promoter, or the conventional L7 promoter (L7-1). Compared.
  • the sequences of L7-1 to L7-7 are shown in SEQ ID NOs: 1 to 7, respectively.
  • HEK293FT cells were used for virus production.
  • D-MEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • HEK293FT cells in logarithmic growth phase are dispersed in phosphate buffered saline (without Mg 2+ and Ca 2+ ) [PBS (—)], then 5 X per 10 cm dish (Falcon). It seed
  • pCAGkGPIR A packaging plasmid containing gag (encoding viral structural protein) and pol (encoding reverse transcriptase).
  • PCAG4RTR2 A plasmid containing tat (transcriptional regulatory gene). Because rev is deleted, the virus particle cannot replicate in the host.
  • VSVG stands for Vesicular somatitis virus glycoprotein.
  • the original envelope of lentivirus can only infect CD4 positive cells.
  • VSV envelope that targets the phosphorous membrane component (phosphatidylserine), which is a component of the cell membrane, it becomes possible to infect various cells including nerves.
  • phosphorous membrane component phosphatidylserine
  • pCL20c L7-X-GFP A plasmid in which the promoter of the main vector pCL20c of lentiwinores is replaced with the L7 promoter (L7-1) or its reduced form (L7-2-7) and GFP is ligated into two LTRs.
  • L7-1 the L7 promoter
  • L7-2-7 the reduced form
  • GFP GFP is ligated into two LTRs.
  • the resulting plasmid solution 2. adding 5M CaCl 2 50 ⁇ 1 and stirred, 2XHBSS [pairs formed:. 50mM HEPES, OmM NaCl, 1. 5raM Na 2 HP0 4, pH7 05)] 500 ⁇ added a ⁇ It was caulked and stirred quickly.
  • the media collected in (1) were each transferred to a 50 ml centrifuge tube and centrifuged at 1000 rpm (120 ⁇ g ) for 4 minutes to obtain a supernatant.
  • the obtained supernatant was passed through a filter (Millipore, 0.22 ⁇ m).
  • the obtained filtrate was subjected to ultracentrifugation (25,000 rpm, 2 hours, 4 ° C.) using a Beckman rotor SW28.1 to precipitate virus particles, and the supernatant was removed.
  • the resulting virus particle precipitate was suspended in PBS (-) to a final volume of 200 il to obtain a virus solution for infection.
  • 20 ⁇ l of virus solution that was not used immediately was dispensed and stored at ⁇ 80 ° C.
  • HeLa cells The copy number of provirus integrated in the genome of cultured cells (HeLa cells) (Izopet et al. J Med Virol. 1998 Jan; 54 (1): 54-9.). HeLa cells are cultured in a 10cm dish and infected 24 hours after seeding. infection
  • LAV-8E5 cells Three days later, 5.0 ⁇ 10 6 cells were obtained. In parallel, the same number of LAV-8E5 cells (ATCC, Manassas, VA, USA) were obtained. LAV-8E5 cells have 1 copy of HIV-type virus in 1 'cells, and this was the standard. Genomic DNA was extracted from these cells and finally lysed in 100 (1 TE buffer. 1 of which was used as a 290-base spare region in HIV provirus RRE (rev responsive element). Was augmented with the following primers:
  • the number of upies incorporated into the genome was determined by serial dilution of genomic DNA. That is, by determining the dilution ratio just before the band disappears and comparing it with the standard using LAV-8E5 cells, how many proviruses are incorporated per 5.0 X 10 6 HeLa cells. (Genome copy number / virus solution 1 ml) was determined. (4) Gene transfer experiment to cultured cerebellar Purkinje cells
  • a cerebellar cell suspension with a density of 1.0 ⁇ 10 7 cells / ml was prepared with DMEM / F12 containing 10% FBS.
  • Use 20ml of suspension per tool on a 13mm diameter plastic force bar slip (Sumilon MS-80060, manufactured by Sumitomo Betalite Co., Ltd.) coated in advance with poly-L- ornithine (200,000 cells) It was stretched thinly to have a diameter of about 6 mm. Then allowed to stand for 2 hours in a humidified culture Yoki kept at 5% C0 2, 37 ° C .
  • Culture medium composition DMEM-nutrient mixture of Ham's F-12 (Sigma) ⁇ bovine insulin (lOmg / ml), bovine serum albumin (lOOmg / ml), gentamicin (5mg / ml), glutamine (200mg / ml), human apotransf erin (lOOmg / ml), rostegerone (40nM), putrescine (lOOnM), sodium selenite (30nM), triiodothyronine (0.5 ng / ml) 0 then 2-4xl0 5 genome copy Infected with 1 ml of the virus solution. The next day (24 hours later), FBS was added to a final concentration of 1%.
  • mice SLC supply, 4 to 10 weeks old
  • bentobarbital trade name: Nembutal
  • intraperitoneal administration 40 mg / kg body weight
  • the mouse was fixed using a small animal fixing device [trade name: SG-4, manufactured by Narishige Co., Ltd.].
  • the body temperature of the mouse was maintained at 37 ° C. with a body temperature controller [manufactured by FST, product name: body temperature control system (for mouse) FST-HPSM].
  • FST body temperature control system
  • a microdrill made by Urawa Industries Co., Ltd., product name: noisy Koichi Controller UC100 + HB1 ( Drill)
  • a hole was made in the dura mater and spider underneath the bone using an injection needle.
  • the resulting lentiviral vector is filled into a product name: Rexfil Microsyringe (WPI, 10 ⁇ 1 volume), and the Ultra Micro Pump 2 (WPI) is attached to the micromanipulator. ).
  • the skin of the incised mouse was sutured with an ophthalmic microneedle with a suture (manufactured by Natsume Seisakusho Co., Ltd., trade name. Ophthalmic weak needle C67-0). Thereafter, the mouse was removed from the fixing device and observed with a cage (in the safety cabinet) placed on a heating pad (made by Showa Seiki Kogyo Co., Ltd., trade name: rubber mat heater SG-15). After the mouse awakens from anesthesia, the mouse cage is raised in a rack for infected animals with a filter (made by Toki Scientific Instruments Co., Ltd., trade name: Bioclean Gap Cell unit T-BCC-4). It was.
  • mice Seven days after the inoculation, the mice were perfused and fixed with 4% formaldehyde-phosphate buffer, and the brains were removed. After taking a picture of the whole brain and a fluorescent photograph of GFP using a fluorescence stereomicroscope, a microslicer (made by Dosaka EM Co., Ltd., trade name) is used to obtain a cerebellar sagittal slice with a thickness of 50 ⁇ m or 100 / m. -1000).
  • a microslicer made by Dosaka EM Co., Ltd., trade name
  • the prepared brain slices were treated with the primary antibody [Mouse monoclonal anti-parvalbumin (astrocyte, sputum cell marker): SIGMA, or Mouse monoclonal anti-GFAP (glial cell marker): Kekon ⁇ , Ale Mouse monoclonal anti-neuron-specific nuclear protein (NeuN, granule cell marker): Chemicon, or mouse monoclonal anti-mGluR2 (Golgi cell marker): Acquired by Professor Ryuichi Shigemoto, Physiological Laboratory After incubation, the mixture was incubated with a secondary antibody (Alexa fluor 568-conjugated anti-mouse IgG: manufactured by Invitrogen) for 2 hours at room temperature to obtain a specimen for microscope.
  • a secondary antibody Alexa fluor 568-conjugated anti-mouse IgG: manufactured by Invitrogen
  • Figure 14 shows the introduction rate (expression ratio) when cultured cerebellar neurons were expressed using lentil virus vectors under the control of various promoters.
  • A Ratio of Purkinje cells in all GFP-expressing cells: GFP-expressing Purkinje cell number Shows the number of ZGFP-expressing cells. When the CMV promoter and MSCV promoter were used, most of the GFP-expressing cells were other than Purkinje cells, whereas in L7-1 to L7-4, gene expression occurred only in Purkinje cells. In L7-5 and L7-6, GFP-expressing cells did not exist. L7-7 decreased its specificity for Purkinje cells, and about half of the GFP-expressing cells were non-Purkinje cells.
  • (B) shows the ratio of GFP-expressing Purkinje cells in all Purkinje cells: the number of GFP-expressing Purkinje cells Z the total number of Purkinje cells.
  • the CMV promoter shows GFP expression only in about one-fifth of all Purkinje cells, and in L7-1, about one-third of Purkinje cells.
  • L7-4 is almost 100%, that is, GFP is expressed in all Purkinje cells. Shown is the average of results using at least 4 independent cerebellar neuronal cell cultures.
  • the viral vectors used are used as substantially the same potency of (2- 4xl0 5 Genomuko copy / ml).
  • Figure 15 shows the fluorescence intensity (a) when GFP was expressed in cultured cerebellar Purkinje cells under the control of various promoters using a lentiviral vector. Forty Purkinje cells were randomly selected and fluorescence images were captured with a cooled CCD camera, and the fluorescence intensity was measured using IPLab imaging software (Scanalytics).
  • (B) is a graph showing the GFP fluorescence intensity when lentiviral vectors expressing GFP under the control of CMV promoter were infected with various M0I in HEK293T cells. Forty (40) HEK293T cells were randomly selected and their fluorescence intensity was measured using IPLab imaging software. From MOI 10 to 1000, the fluorescence intensity was almost proportional to the logarithm of M0I.
  • Figure 16 shows the cerebellar Purkinje cells cultured with MSCV promoter, conventional L7 promoter (L7-1) or its reduced promoter (L7-2, L7-4, L7-5, L7) using a lentiviral vector. -7) Shows the results of expressing GFP under control.
  • the left panel shows a fluorescent immunostaining photograph using Purkinje cell-specific anti-calbindin antibody. However, only when MSCV promoter is used (upper left) Staining was performed using granule cell-specific anti-NeuN antibody in addition to the nindin antibody (purkinje cells and granule cells appear red).
  • the middle panel shows fluorescent photographs of GFP expressed by each virus vector.
  • the right panel is an overlay of the left and center panels (Overlay).
  • MSCV promoter When MSCV promoter is used, GFP expression is also observed in Purkinje cells and granule cells, as well as glial cells (arrows) and cells with intermediate cell bodies of granule cells and Purkinje cells (arrowheads). It was. In contrast, L7-1, L7-2, and L7-4 showed GFP expression only in Purkinje cells. In particular, GFP was expressed in all Purkinje cells present in L7-4, and GFP was also strongly expressed, confirming that the promoter activity was significantly higher than that of conventional L7-1.
  • Figure 15 shows the results of gene expression experiments in the mouse cerebellum using lentiviral vectors incorporating various promoters.
  • A-d is a fluorescence photograph of GFP when GFP is expressed under the control of a conventional L7 promoter (L? -1) using a lentiviral vector (titer: 3 ⁇ 7 ⁇ 10 5
  • Genome copies Zml (c) and (d) are photographs of immunostaining with anti-GFP antibody (this increases fluorescence) (eh) shows L7 instead of the conventional L7-1 promoter.
  • a vector having high selectivity for cerebellar Purkinje cells can be prepared without using serum.
  • the vector of the present invention is fundamental in the field of neuroscience, such as elucidation of the mechanism of motor learning and cooperative movement controlled by the cerebellum at the molecular level and gene therapy for Purkinje cell disorder such as spinocerebellar degeneration. Sequence table free text that can be used widely from research to clinical application

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Abstract

　本発明は、ウイルス由来プラスミドベクターに改変型L7プロモーターと治療用遺伝子を機能しうる態様で連結してなるプルキンエ細胞指向性ウイルスベクターに関する。

Description

明 細 '書 プルキンェ細胞指向性ウィルスべクター 技術分 野
本発明は、改変型 L7プロモーターを利用したプルキンェ細胞指向性ウィルス ベクターに関する。
背 景技術
小脳は複数の筋肉が関与する歩行などの協調運動に重要な役割を果たしてい る。 小脳に損傷があると、 協調運動の調節がうまく行かず、 なめらかな動きが できなくなる。 大脳皮質からの運動の指令は脳幹を通って、 脊髄、 筋肉に伝達 されるが、 同時に脳幹 (橋）から苔状線維を介して小脳皮質にも伝達される。 苔 状線維を介して伝達された信号は、 小脳皮質の神経細胞である顆粒細胞に入力 される。 そして、 顆粒細胞はその軸索である平行線維を介してプルキンェ細胞 に信号を伝える。
一つのプルキンェ細胞は平行線維との間に 1 0万個以上のシナプスを形成し、 そこからの入力情報を統合し、 小脳の深部にある小脳核へ情報を出力する。 プ ルキンヱ細胞は小脳皮質からの唯一の出力神経細胞であり、 小脳において非常 に重要な役割を果たしているが、 脆弱であり、.小脳出血、 外傷、 小脳腫瘍や遺 伝性神経変性疾患により障害を受けやすレ、。
近年のゲノム科学の発展によりヒトゃマウスの全ゲノム配列が決定され、 生 命科学研究は同定された遺伝子の役割解明へと向かっている。 神経細胞に野生 型や変異遺伝子を導入し、 その影響を調べる手法は、 神経科学分野の研究面に おいて非常に効果的であるが、 遺伝子治療としての臨床応用面からも、 神経細 胞への遺伝子導入は注目を集めている。
しかしながら、神経細胞は非分裂細胞であり遺伝子導入が難しい。なかでも、 プルキンェ細胞への遺伝子導入は極めて困難であり、 2 0 0 0年以前まで効率 的な遺伝子導入の成功例も報告されていなかつた。 最近ウィルスベクターの開 発が進み、 プルキンェ細胞への効率的な遺伝子導入が可能になってきたが、 そ れでもわずか 4編の論文が報告されているにすぎない （非特許文献 1〜4 )。 プルキンェ細胞に効率的に遺伝子導入するには、 レンチウィルスやアデノ随 伴ウイルスなどの神経に対して高親和性を持つウィルスベクターを使う必要が ある。 ちなみに、 これまでの報告では、 プルキンェ細胞への遺伝子導入には、 アデノウイルス、 ヘルぺスウィルス、 アデノ随伴ウィルス、 ネコ免疫不全ウイ ルス由来レンチウィルスが用いられている。
ところで、 野生型のレンチウィルスは CD4受容体を持つリンパ球にしか感染 しない。 そのため、 現在使われているレンチウィルスベクターは神経細胞にも 感染す よつに、てのエンベロープ力 Λ Vesicular somatitis virus glycoprotein (VSV-G)に置換されている。この VSV- Gは細胞膜の構成成分であるリン脂質（フ ォスファチジルセリン） に結合能を持っため、 神経以外のグリア細胞、 血管内 皮細胞などにも非特異的に感染する。 また小脳においては、 レンチウィルスは プルキンェ細胞以外にも、 星状細胞（Stellate , cell)、 籠細胞（Basket cell) , ゴルジ細胞（Golgi cell)、 バーグマングリァ（Bergmann glia)にも感染する。 上述のとおり、 アデノ随伴ウィルスベクターやレンチウィルスベクターは神 経細胞に外来遺伝子を導入し発現させる能力を持つが、 パッケージング能力の 問題から発現可能な遺伝子サイズに制限がある。 発現可能遺伝子サイズはアデ ノ随伴ウィルスベクターとレンチウイノレスベクターにおいて、 プロモーター領 域と合わせてそれぞれ 4kbと 8kbといわれている。 しかしこれは理論的な値で あり、 レンチウィルスベクタープラスミ ドでは安全性を増すためさまざまな改 良がなされていることから、 使用するベクタープラスミ ドによって異なるが、 発現は 5kb前後が限界であることが多い。
一方、 L7プロモーターはプルキンェ細胞特異的に活性を持ち、 プルキンェ細 胞だけに外来遺伝子を発現するトランスジエニックマウスの作出に利用されて いる。 しかしながら、 L7プロモーターは全長約 3kbと大きく、 アデノ随伴ウイ ルスベクターやレンチウィルスベクターに組み込んで用いる場合、 発現可能な 外来遺伝子のサイズは大きな制限を受ける。また、そのプロモーター活性は CMV や MSCVプロモーター等の非特異的プロモーターに比べて著しく低い。
小脳プルキンェ細胞への効率的かつ特異的な遺伝子導入は、 トランスジェニ ックマウスを作出するしか方法がなかった。しかしウィルスベクタ一を用いて、 プルキンェ細胞に特異的に高効率で遺伝子導入することができれば、 これまで できなかったさまざまな研究が可能となり、 小脳を対象とする研究の進展に大 きく寄与すると考えられる。 また、 プルキンェ細胞が障害される脊髄小脳変性 症などの遺伝子治療への応用も期待される。
また、 最近、 ウィルスベクターを遺伝子治療としてヒ トに用いる場合、 牛海 綿状脳症をはじめとする感染が近年、 大きな問題となっている。 これは、 現在 のプロトコールではウィルス産生時の培地にゥシの血清を加えることが必要で あるためである。 このようなことから、 特に血清を用いることなく、 プルキン ェ細胞に高効率で遺伝子導入できるウィルスベクターを産生できれば、 その臨 床応用はより広がることが期待される。 特許文献 1 ] Agudo M. , Trejo J. L. , Lim F.， Avila. J. , Torres- Aleman I. , Diaz-Nido J. & Wandosell F. (2002) Highly efficient and specific gene transfer to Purkinje cells in vivo using a herpes simplex virus I amplicon. Hum. Gene Ther.， 13， 665-674.
[非特許文献 2 ] Ali sky J. M. , Hughes S. M.， Sauter S. L. , Jolly D.， Dubensky T. W. Jr.， Staber P. D.， Chiorini J. A. & Davidson B. L. (2000) Transduction of murine cerebellar neurons with recombinant FIV and AAV5 vectors. Neuroreport, 11， 2669-2673.
特許文献 3 ] Kaemmerer W. F.， Reddy R. G.， Warlick C. A.， Hartung S. D. , Mclvor R. S. & Low W. C. (2000) In vivo transduction of cerebellar Purkinje cells using adeno- associated virus vectors. Mol. Ther. , 2, 446-457. 特許文献 4 ] Xia H. , Mao Q.， Eliason S. L.， Harper S. Q. , Martins I. H. , Orr H. T. , Paulson H. L. , Yang L. , Kotin R. M. & Davidson B. L. (2004) R Ai suppresses polyglutamine- induced neurodegeneration in a model of spinocerebellar ataxia. Nat. Med.， 10, 816-820. 発 明 の 開 示
本発明は、 小脳プルキンェ細胞に高い親和性を持ち、 プルキンェ細胞選択的 に感染して遺伝子発現するウィルスベクターを提供することにある。
発明者らは、 これまで小脳への遺伝子導入について報告がなかったヒト免疫 不全ウィルス由来レンチウィルスベクターを用いて小脳への遺伝子導入実験を 行い、 ウィルスのプルキンェ細胞選択性は、 ウィルス産生時の培養液 p Hがわ ずかに酸性側にシフトするだけで急激に低下すること、 培養液に添加する血清 の L o tによりウィルスのプルキンェ細胞への選択性が異なり、 それゆえ血清 中の何らかの成分がプルキンェ細胞選択性維持に関与していることを発見した。 さらに、 上記の知見に基づき、 発明者らは以下のような仮説を立て、 その実 証を試みた。
(1)培養液の p Hに依存して変化することから、 p H感受性酵素、おそらく宿主 細胞から放出されたプロテアーゼがウィルスの蛋白質 （特に、 ウィルスェンべ ロープ上に存在する糖蛋白質） を分解することで、 ウィルスのプルキンェ細胞 への選択性が低下する。
(2)血清にはプロテアーゼの活性を阻害する物質が含まれており、そのためにゥ ィルスェンべ口ープの糖蛋白質の分解が抑えられ、 プルキンェ細胞への選択性 が保たれる。
実際、 センダイウィルスゃィンフルェンザウィルスではプロテアーゼにより エンベロープの糖蛋白質が分解され、 細胞への感染性が変化することが知られ ている。 そして、 発明者らの実験結果は上記の仮説を支持するものであった。 ウィルス産生時の培養液にプロテアーゼ阻害剤を加えることで、 プルキンェ細 胞に親和性の高いベクターを得ることができた。 しかしながら、 プルキンェ細 胞以外の細胞にも全体の 1〜2割程度は感染し、遺 ί云子発現を誘導する。そこで、 完全にプルキンェ細胞だけで遺伝子発現が誘導されるように、 ウィルスべクタ 一に組み込まれているプロモーターを非選択的な CMVあるいは MSCVプロモータ 一から L7プロモーターへの変更を検討した。 その際、 従来の L7プロモーター は 3kbの長さがあるため、 これより短い種々の長さのものを調整し、 ウィルス プラスミドに組み込んだ。 これらのウィルスプラスミドを用いて、 ウィルスべ クタ一を得、 生体マウス小脳に接種して検討した。 その結果、 配列番号 3又は 4で示される塩基配列を有する改変型 L7 プロモーターを組み込んだウィルス ベクターでは、 プルキンェ細胞だけに遺伝子発現が見られ、 かつその発現程度 も従来の L7プロモーターよりはるかに高いことがわかった。
すなわち、 本宪明は、 ウィルス由来ベクタープラスミ ドに配列番号 3又は 4 で示される塩基配列を有する改変型 L7プロモーターを、外来遺伝子に機能しう る態様で連結して成る小脳プルキンェ細胞指向性ベクターに関する。
用いられるウィルス由来ベクタープラスミ ドとしては、 アデノウイルス、 ァ デノ随伴ウィルス、 レトロウイルス、 ヘルぺスウィルス、 センダイウィルス、 及びレンチウィルス由来のベクタープラスミ ドが挙げられ、 プロテアーゼ阻害 ■ 剤の効果に関してはエンベロープの糠蛋白質が VSV- Gであることが望ましい。
前記ベクターによって産生されるウィルスの蛋白質、 特にウィルスェンベロ ープ上に存在する糠蛋白質は、 実質的に分解修飾を受けていない状態にあるこ とが望ましい。
前記ウィルスェンベロープ上に存在する糖蛋白質が実質的に分解修飾を受け ていない状態にあるベクターは、 プロテアーゼ阻害剤を含む培養液中で宿主細 胞にウィルスを産生させることにより得ることができる。 前記プロテアーゼ阻 害剤としては、 カテブシン K阻害活性を有するもの （カテブシン K阻害剤や力 テプシン阻害剤） が好ましい。
ウィルス産生時の培養液の p Hは、 7 . 2〜8 . 0に維持されることが望ま しい。
また、 感染防止等の安全性の点から、 前記培養液は血清を含まないことが望 ましい。
本発明はまた、 レンチウィルスベクタープラスミ ドに外来遺伝子を機能しう る態様で連結して成る小脳プルキンェ細胞指向性ベクターであって、 前記べク ターによって産生されるウィルスの蛋白質、 特にウィルスエンベロープ上に存 在する糖蛋白質が、 実質的に分解修飾を受けていない状態にあることを特徴と するベクターも提供する。 ウィルスエンベロープ上に存在する糖蛋白質が実質 的に分解修飾を受けていな!/、状態にあるベクターは、 上記した方法によつて得 ることができる。
ウィルスベクターに導入される外来遺伝子としては、 プルキンェ細胞障害性 疾患の治療用遺伝子や当該疾患遺伝子が挙げられる。 このような遺伝子を導入 することで、 本発明のべクターはプルキンェ細胞障害性疾患の遺伝子治療ゃモ デル動物の作製に用いることができる。
前記治療用遺伝子の具体例としては、たとえば、 GTPase CRAG, ubi qui tin chain assembly factor E4B (UFD2a)、 ATPase VCP/p97、 HDJ-2、 HSDJ及び BiPを含む 分子シャぺ口ン、 YAPdeltaC を含む細胞死抑制分子、 ER degradation enhancing alpha- mannosidase- like protein (EDEM)を含む小胞体蛋白質分解促進分子、 CREB/ATF family member OASIS, IRE1、 PERK及び ATF6を含む ERセンサー分子 (Endoplasmic ： reticulum stress transducer) ^ スフインゴミエリナ— 1 、 AT- mutated (atm)、 Reelin、 Bel- 2、 ネプリライシン、 BDNF、 ならびに NGFをコ ードする遺伝子、 あるいは ataxin - 1、 ataxin- 2、 ataxin- 3、 a la電位依存型力 ルシゥムチャネル、 PKC yをコードする遺伝子の siRNAを挙げることができる。 また、 前記疾患遺伝子の具体例としては、 たとえば、 異常伸長した CAGリピ ートを持つ ataxin - 1、 ataxin - 2、 ataxin - 3、 huntingtin、 ¾しくは 'a la feili 存型カルシウムチャネルをコードする遺伝子、 又は変異を持つ Ρ γをコード する遺伝子を挙げることができる。 .
本発明は、 上記した小脳プルキンェ細胞指向性ベクターを含む、 小脳プルキ ンェ細胞障害性疾患の治療用医薬組成物も提供する。
前記小脳プルキンェ細胞障害性疾患としては、 たとえば、 脊髄小脳変性症や ハンチントン病を含むボリグルタミン病、 ニーマンピック病、 毛細血管拡張性 運動失調症、 自閉症、 アルツハイマー病、胎児アルコール症候群 (FAS)、 アルコ ール中毒、 カロ'齢性小脳失調を挙げることができる。
本発明はまた、 本発明のベクターを導入された非ヒト哺乳動物を提供する。 特に、 プルキンェ細胞を障害する遺伝子 （異常伸長した CAG リピートを持つ ataxin_l、 ataxin - 2、 ataxin - 3、 huntingtin, もしくは a la電位依存型カノレシ ゥムチャネルをコードする遺伝子、 又は変異を持つ PKC yをコードする遺伝子 を導入され、当該遺伝子をプルキンェ細胞特異的に発現する非ヒト哺乳動物は、 前記した小脳プルキンェ細胞障害性疾患のモデル動物として用いることができ る。
本発明はまた、 レンチウィルスプラスミ ドベクターに外来遺伝子を機能しう る態様で連結して宿主細胞に導入し、 前記細胞をプロテアーゼ阻害剤を含む培 養液中で培養してウィルスを産生させることを特徴とする、 プルキンェ細胞指 向性ウィルスベクターの作製方法を提供する。 あるいは、 ウィルス由来べクタ 一プラスミドに配列番号 3又は 4で示される塩基配列を有する改変型 L7 プ口 モーターを、 外来遺伝子に機能しうる態様で連結し、 前記細胞をプロテアーゼ 阻害剤を含む培養液中で培養してウィルスを産生させることを特徴とする、 プ ルキンェ細胞指向性ウィルスベクターの作製方法を提供する。
さらに本発明は、 カテブシン K阻害活性を有する物質を含んで成る、 プルキ ンェ細胞指向性ウィルスベクタ一作製用培養液や、 そのような培養液 （カテブ シン K阻害活性を有する物質と細胞培養液、 またはカテブシン K阻害活性を有 する物質を含む細胞培養液） を構成要素として含む、 プルキンェ細胞指向性ゥ ィルスべクタ一作製用キットも提供する。
本発明で用いられる改変型 L7プロモーターは、 従来の L7プロモニターのお よそ 3分の 1のサイズであるため、 ベクターに組込みうる外来遺伝子のサイズ は大幅に拡大する。 しかも、 同じコピー数が染色体に組み込まれた場合、 従来 の L7プロモーターよりもはるかに高!/、プロモータ一活性を持ち、強力に下流に 配置された外来遺伝子の発現を誘導する。
よって、 本発明によれば、 小脳で最も重要なプルキンェ細胞に選択的に、 か つ高効率で遺伝子発現が可能となる。 これにより、 基礎研究においては、 小脳 が司る運動学習、 協調運動のメカェズムを分子レベルで解明するための研究が 大きく進展することが期待される。 また、 遺伝子治療をはじめとする臨床応用 においては、 プルキンェ細胞選択的な遺伝子導入が可能となり、 他の神経細胞 やダリァ細胞への遺伝子導入おょぴ発現に伴う副作用の軽減が期待される。 さ らに、 本発明では、 ゥシ血清を使用することなくベクタ一を調製しうるため、 牛海綿状脳症などの感染の問題もなく、 血清の Lotに依存することなく、 安定 してプルキンェ細胞指向性べクターを得ることができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 pCL20c MSCV-GFPの構造を示す。
図.2は、 （A) 実施例 1の実験手順、 （B) トランスフヱクション後 40時間でゥ ィルスを回収する直前の. HEK293FT細胞における GFPの発現、 及び （C) トラン スフヱクシヨン後 64時間でウィルスを回収する直前の HEK293FT細胞における
GFPの発現を示す蛍光顕微鏡画像である。
図 3は、 （左） トランスフエクシヨン後 40時間で回収したウィルス、 （中） ト ランスフエクシヨン後 64時間で回収したウィルス、 （右） トランスフエクショ ン後 40時間のウィルスを含む培養液に希塩酸を加えて pHを 7. 0に調節した後 に回収したウィルス、 を接種して 1週間後の小脳皮質の全 GFP発現細胞におけ る各細胞の割合 （％) を示したグラフである。 図中、 （A)プルキンェ細胞 (Purkineje cells)、 （B)バーグマングリア（Bergman glias)、 （C)星状細胞/籠 細胞（Stellate & Basket cells)、 （D)判別不能（Unknown cells) を示す。
図 4は、トランスフエクシヨン後 40時間のウィルスを含む培養液に希塩酸を 加え、 pHを 7. 0に調節した後に回収したウィルスを接種後一週間の、小脳皮質 分子層における GFP の発現を示す共焦点レーザー顕微鏡画像である。 図中 (A) パーグマングリア （矢印） に選択的な GFPの発現を認める。 プルキンェ細胞は GFP の発現がなく、 黒く抜けて見える （矢頭)。 （B) (A) 拡大像。 （C)グリア細 胞マーカーである GFAPに対する抗体を用いた. 2重染色像。 GFPの発現は GFAP の分布 (赤) と重なる。 (A)のスケーノレバー 100 μ m、 (B)のスケールバー 50 μ m 図 5は、 Lot の異なる 8種のゥシ血清を用いて産生、 回収したウィルスを小 脳に接種し、一週間後の脳の蛍光実体顕微鏡写真、及ぴその矢状断における GFP の発現の様子を示す共焦点レーザ一顕微鏡画像である。
図 6は、 20倍の对物レンズを用いた観察視野における、 GFPを発現している 全細胞中のプルキンェ細胞の割合 (％)を示すグラフである。
図 7は、 20倍の対物レンズを用いた観察視野における、全プルキンェ細胞中 の GFP発現プルキンェ細胞の割合 (％)を示すグラフである。
図 8は、 GFPと融合した脊髄小脳変性症 3型遺伝子 ataxin-3 [Q69]を発現する ウィルスのプロウイルス部分の構造を示した模式図（A)、このウィルスを小脳に 接種後、 2ヶ月して施行したロータロッドテストの結果（B)、 このマウスのプル キンェ細胞内の GFP融合 ataxin- 3 [Q69]凝集塊 (C)、 を示す。
図 9は、 プルキンェ細胞特異的 L7プロモータ一制御下で、脊髄小脳変性症 3 型遺伝子 ataxin- 3 [Q69]を発現するマウス作出に用いたコンストラクトの模式 図（A)、 作出した 3ライン（a, b, c line)の脊髄小脳変性症 3型モデルマウスに おける、 生後 3週から 14週にかけてのロータロッドテストの成績 (B)、 生後 80 日の野生型マゥスの脳矢状断 (C)、同週齢の脊髄小脳変性症 3型モデルマウス b line の脳矢状断 (D)、 を示す。 図 1 0は、 Flagタグを付加した CRAG、 あるいは VCP (C522T) (VCP/p97の 522 番目のシスティンをスレオニンに置換したもの） を発現するウィルスベクター のプロウィルス部分の構造を示した模式図（A)、このウィルスべクターの脊髄小 脳変性症 3型モデルマウスの小脳への接種を示す模式図（B)、 c lineのモデル マウスの小脳に CRAG発現ウィルスを接種した後 8週間までのロータロッドの成 績（C)、 b lineのモデルマウスの小脳に GFP、 CRAG, あるいは VCP (C522T)発現 ウィルスを接種後 4週間と 8週間で行ったロータロッドの成績 (D) (C, Dとも 口ッドは止まつた状態からスタートし、 180秒後に 40回転 Z分の速度となる）、 b lineのモデルマウスの小脳に GFP、 CRAG, あるいは VCP (C522T)発現ウィルス を接種後 8週間で行った定速 （5回転/分） ロータロッ ドの成績 ）、 を示す。 図 1 1は、何も接種していない（A，B)、 CRAG (C，D)、あるいは VCP (C522T) (E, F) 発現ウィルスを接種後、 8週間で灌流固定して作製した小脳切片を、 抗 HAタグ 抗体を用レ、て免疫組織染色したもの（A, C, E)、それらを抗カルビンディン抗体に よる二重免疫組織染色の像と重ね合わせたもの（B， D, E)、それぞれの切片の小脳 皮質における封入体の数 (G)、 それぞれの切片における分子層の厚さ（H)、 を示 す。
図 1 2は、 L7プロモーター L (7-1) 及びその各種改変型 （L7- 2〜L7- 7) の構 造を示す模式図を示す。
図 1 3は、 L7-4プロモーターをレンチウイノレスべクタ一プラスミ ド (pCL20c) に挿入し、 その下流に緑色蛍光タンパク質 GFP を配置したプラスミ ド pCL20c L7-4-GFPの模式図を示す。
図 1 4は、 種々のプロモーターを用いたときのプルキンェ細胞への GFPの発 現割合を示す。 （a)全 GFP発現細胞中のプルキンェ細胞の割合： GFP発現プルキ ンェ細胞数/ GFP発現細胞数 （b)全プルキンェ細胞中の GFP発現プルキンェ細 胞の割合： GFP発現プルキンェ細胞数/全プルキンェ細胞数
図 1 5は、 （a) 種々のプロモーターを組み込んだレンチウィルスベクターを 用いて培養小脳プルキンェ細胞に GFP を発現させたときの蛍光強度の比較、 (b) CMVプロモーター制御下で GFPを発現するレンチウィルスベクターをさまざ まな M0Iで HEK293T細胞に感染させたときの GFP蛍光強度を示す。
図 1 6は、 種々のプロモーターを組み込んだレンチウィルスベクターを用い て、 培養小脳プルキンェ細胞に GFP遺伝子を発現させたときの蛍光免疫染色写 真を示す。
図 1 7は、 生体小脳への遺伝子導入の結果を示す。 （a- d)は、 レンチウィルス ベクターを用いて、従来の L7プロモーター（L7 - 1)制御下で GFPを発現させたと きの GFPの蛍光写真、 （c) , (d)は抗 GFP抗体を用いて免疫染色した写真 （これ により蛍光は増強する）、（e- h)は L7-4プロモーターを用いた場合の小脳プルキ ンェ細胞の GFP蛍光写真を示す。
なお、 上記図面のグラフ中、 * pく 0. 05、 ** pく 0. 01、 ***pく 0. 001 (ANOVA with least significance test; 本明細書は、 本願の優先権の基礎である特願 2 0 0 6— 0 6 2 1 9 2号及び 特願 2 0 0 6— 1 9 8 3 9 8号の明細書に記寧された内容を包含する。 発明を実施するための最良の形態
1 . プルキンェ細胞指向性ベクター
本発明にかかる 「プルキンェ細胞指向性ベクター」 （以下、 「本癸明のベクタ 一」 という） とは、 小脳プルキンェ細胞に高い親和性を有し、 プルキンェ細胞 特異的に遺伝子導入を行うことができるベクターであって、 小脳に存在するパ 一ダマングリア、 星状細胞、 籠細胞等の他の神経細胞やグリア細胞よりも、 プ ルキンェ細胞に対して高い選択性を有するベクターである。
本発明のベクターは、ウィルス由来プラスミ ドベクターに改変型 L7プロモー ターと外来遺伝子を機能しうる態様で連結して成る。 あるいは、 レンチウィル スプラスミ ドベクターに適当なプロモーターと外来遺伝子を機能しうる態様で 連結して成る。
ここで、 ウィルス由来プラスミ ドベクターとは、 アデノウィルス、 アデノ随 伴ウィルス、 レトロウィルス、 へノレぺスウイノレス、 センダイウィルス、 及ぴレ ンチウィルス由来のプラスミ ドベクターを含み、 特にプルキンェ細胞に対する 選択性が高いアデノ随伴ウィルスとレンチウィルス由来のプラスミ ドベクター が好ましく、 レンチウィルスベクターが最も好ましい。
「レンチウィルス」 とは、 逆転写酵素を有する R NAウィルスの 1つであつ て、 非分裂細胞にもサイトカイン刺激なしに高効率で感染し、 宿主染色体にゥ ィルスゲノムを組み込むことができる。 そのため、 レンチウィルス由来のべク ターは、 哺乳動物への遺伝子導入用ベクターとして汎用されている。 レンチウ ィルスとしては、 ヒト免疫不全ウィルス （HIV)、ネコ免疫不全ウィルス （FIV)、 サル免疫不全ウィルス （SIV)、 ゥマ伝染性貧血ウィルス （EIAV)、 ヒッジ関節炎 脳炎ウィルス (CAEV)、マエディウィルス等が知られているが、ベクターとして は、 一般にヒト免疫不全ウィルス、 ネコ免疫不全ウィルス、 サル免疫不全ウイ ルスに由来するものが使用されている。
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2本のプラス鎖 R N Aとこれを囲むコア 蛋白質 （gag蛋白質)、 コアを囲むマトリックス、 さらにその外側を囲む脂質二 重膜で構成される。 コアの中には、 逆転写酵素、 R N a s e H、 インテグラー ゼ、 プロテアーゼが含まれ、 脂質二重膜には糠萆白質であるエンベロープ蛋白 質がスパイクしている。
ウィルスの感染、 宿主中での増殖には、 上記した蛋白質が複雑に関与する。 特に、 ウィルスエンベロープ上の糖蛋白質はウィルスの感染性に非常に重要で あり、 ィンフルェンザウィルスでは、 この糖蛋白質が酵素により切断されるこ とで感染性が変化することが知られている。 H I Vは CD4陽性細胞にしか感染 できないが、 H I V由来レンチウィルスベクターではさまざまな種類の細胞へ の感染を可能にするため、 Vesicular somatitis virus glycoprotein (VSV-G) VSV-G に置換されている。' したがって、 H I V由来レンチウィルスベクターの プルキンェ細胞選択性についても、 この VSV - Gが深く関与していることが予測 される。
レンチウイノレスプラスミドベクターは、通常 2〜4つのコンポーネントレ ッ ケージング （パッケージングプラスミド、 REVプラスミド）、 エンベロープ、 ベ クタ一]から構成される。 このうちパッケージングプラスミドは、エンベロープ 以外のウイルス粒子形成に必要な蛋白質を供給するが、 宿主内で複製できない よう、 複製に必要な tat- rev領域を破壊したり、 tatあるいは revの一方を削 除して他方を別なプラスミドに移している。 エンベローププラスミドはェンべ ロープ形成に必要な蛋白質を供給するが、 上述のごとく H I Vのエンベロープ では CD4陽性細胞にしか感染できないため、 その蛋白質を VSV - Gに置換されて いる。 ベクタープラスミドは、 L T R、 パッケージングシグナル、 逆転写に必 要なプライマー結合部位を含む。 汎用されているベクタープラスミドでは、 安 全 I1生を高めるために、 L T Rのェンハンサー /プロモーター部分を削除し、代わ りに CMVプロモーター等の外来のプロモーターを組み込んでいる。
特に好ましい態様として、 本発明ではプルキンェ細胞での外来遺伝子の適切 かつ効率的な発現のために、前記外来プロモーターとして、改変型 L7プロモー ター使用する。 この改変型 L7プロモーターについては次項で詳述する。
本発明のベクターでは、レトロウイノレスプラスミ ドベクターにプロモーター、 特に改変型 L7プロモーターと外来遺伝子が機能しうる態様で連結されている。 ここで 「機能しうる態様」 とは、 前記外来遺伝子が感染宿主に導入され、 そこ で適切に発現されることを意味する。
前記「外来遺伝子」は、レトロウィルスが本来有していない遺伝子であって、 研究のためのレポーター遺伝子 （GFP遺伝子など） のほか、 遺伝子治療のため の治療用遺伝子や疾患モデルマウス作出のための疾患遺伝子が用いられる。 こ れら 「治療用遺伝子」 及ぴ 「疾患遺伝子」 については、 後で詳述する。
本発明のベクターによって産生されるウィルスは、 その蛋白質が実質的に分 解修飾されていない状態にあることが望ましい。 特に、 ウィルスエンベロープ 上に存在する糖蛋白質 VSV- Gが実質的に分解修飾されていない状態にあること が望ましい。 これは、 上述したように、 ウィルスの蛋白質は感染や宿主での増 殖において重要なはたらきをしているからであり、 実際、 発明者らはウィルス 産生のための培養液にプロテアーゼを添加しておくことで、 そのプルキンェ細 胞選択性が大きく向上することを実証した。 したがって、 「実質的に」分解修飾 されていない状態とは、 ウィルスの産生から使用時まで、 ウィルス蛋白質が 1 0 0 %分解修飾されないことを厳密に要求したものではなく、 その目的 （プル キンェ細胞指向性） が達成される範囲において、 影響を与えない程度の微細な 不可避的に生じる分解修飾を許容する意味である。
2 . 改変型 L7プロモーター
本発明で用いられる改変型 L7プロモーターは、従来の 3kbの長さを持つ小脳 プルキンェ細胞特異的 L7プロモーター（配列番号 1 ) を基に、約 3分の 1の長 さ（lkb)で細胞特異性を保持したまま、より強い活性を持つプロモータ一領域と して同定されたものである。
具体的には、本発明の改変型 L7プロモーターは、配列番号 3 (L7-3) 又は配 列番号 4 (L7-4) に示される塩基配列を有する。 しかしながら、 これらの配列 に限定されず、 配列番号 3又は 4で示される塩基配列と相補的な配列を有する • DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる DNAもまた、 それが 前記改変型し 7プロモーターと同等の塩基長 （900bp〜1500bp程度） を有し、 か つ同等のプルキンェ細胞特異的プロモーター活性を有する限り、 本発明の改変 型 L7プロモーターに包含される。 少なくとも配列番号 4に示される 17 - 4プロ モーター配列を含む限り、 L7 プロモーター配列 （配列番号 1 ) 上の連続した 1006bp〜1500bpの任意の断片、 とくに配列番号 4に示される L7 - 4プロモータ 一配列を含む L7- 3プロモーター配列（配列番号 3 )上の連続した 1006〜1319bp の任意の断片は、本発明の改変型 L7プロモーターとして利用可能なことは理解 できるであろう。
なお、本明細書において、前記「ストリンジェントな条件」 とは、 6xSSC (lxSSC の組成： 0. 15M NaCl, 0， 015M タエン酸ナトリウム、 ρΗ7· 0)と 0. 5% SDS と 5χ デンハルトと 100 /i g/ml変性断片化サケ精子 DNAと 50%ホルムァミドを含む溶 液中、配列番号 1に示される塩基配列からなる核酸とともに 55°Cで一晩保温し、 低イオン強度、 例えば、 2xSS よりス トリンジェントには、 0. lxSSC等の条件 及び/又はより高温、 37°C以上、 ストリンジエン には、 42°C以上、 よりスト リンジェントには、 50°C以上、 より一層ストリンジェントには、 60°C以上等の 条件下での洗浄を行なう条件により達成されうる。
3 . プルキンェ細胞指向性ベクターの調製
本発明のベクタ一は、 たとえば、 ウィルスベクタープラスミドに治療用遺伝 子を機能しうる態様で連結させ、 適当な宿主細胞にトランスフヱクシヨンし、 ' これをプロテアーゼ阻害剤を含む培養液中で培養して、 ウィルスを産生させる ことにより作製される。
前記 「宿主細胞」 としては、 通常 HEK293FT細胞、 HEK293T細胞等が用いられ る。 ベクタープラスミドのトランスフエクシヨンは、 カルシウムイオンを用い る方法 [Cohen, S. N. et al. ： Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 69： 2110-2114 (1972) ]や、エレクトロポレーシヨン法等、公知の方法を用いて、前項に記載し たベクターシステムを構成するすべてのプラスミ ド （パッケージング、 ェンべ ロープ、 ベクター） を宿主細胞に導入することにより達成される。
ウィルスを培養するための培養液はとしては、 MEM、 -MEM, D-MEM、 BME、
RPMI- 1640、 D- MEM/F- 12、 Ham' s F- 10、 Ham' s F- 12 等、 公知の培養液を培養 する細胞に合わせて適宜選択して用いることができる。
前記培養液に加えるプロテアーゼ阻害剤は特に限定されないが、 カテブシン
K阻害活性を有するものを好適に用いることができる。 そのような物質として は、市販のカテブシン K阻害剤：たとえば、 Cathepsin K inhibitor I、 Cathepsin
K inhibitor II、 Cathepsin K inhibitor III (いずれ.も、 メスレク 力/レビオケ ム社製等） のほか、 カテブシン阻害剤：たとえば、 Cathepsin inhibitor I、
Cathepsin inhibitor II、 Cathepsin inhibitor III (いずれも、 メルク カル ビオケム社製等） を使用することができる。
前記培養液は、 ウィルス産生時において p H 7 . 2〜p H 8 . 0が維持され ていることが好ましい。 これ以下の p Hではベクターのプルキンェ細胞指向性 (選択性） が低下し、 これ以上の p Hでは細胞の増殖が悪くなるからである。 細胞の増殖につれて、 培養液の p Hは酸性にシフトするため、 培養液中にはプ 口テアーゼ阻害剤のほか、 HEPES 等の p H低下を防ぐ効果のある試薬を適宜加 えてもよレヽ。
宿主細胞の培養は、一般には 3〜 I 0 % C O 2、 3 0〜 4 0 °C、特に 5 % C 0 2、 3 7 °C、 の条件下で行われるが、 これに限定されるものではない。 トラ ンスフエクシヨン後の培養期間は、 特に限定されないが、 少なくとも 24時間、 長い場合は 216時間、 好ましくは 36から 72時間、 より好ましくは 40から 48 時間程度である。
なお、 ィンビ ト ロシェン社製のレンチウィルスベクター（商品 名： pLenti6/V5-DEST)を用いる場合は、そのまま使用するとあまり高い力価は得 られないが、 該ベクターから SV40プロモーターと Blasticidine耐性遺伝子を 除去することで、 高力価 （107TU/ml) を得ることができる （特願 2005-2；31514 参照）。 4 . プルキンェ細胞指向性ベクターによる遺伝子治療
本発明のベクターは、 プルキンェ細胞に対する親和性、 選択性が極めて高い ため、 プルキンェ細胞への送達ベクターとして、 遺伝子治療に有用である。 す なわち、 本発明のベクターは、 プルキンェ細胞における障害を病因とする 「プ ルキンェ細胞障害性疾患」 の治療用医薬組成物として有用である。 前記医薬組 成物は、 本発明のベクターを薬理学的に許容しうる担体とともに適当なバッフ ァ一に溶解 ·懸濁することによって調製され、 小脳皮質及び/あるいは小脳表 面のクモ膜下腔に注入される。 ·
前記 「プルキンェ細胞障害性疾患」 としては、 脊髄小脳変性症やハンチント ン病を含むポリグルタミン病、ニーマンピック病、毛細血管拡張性運動失調症、 自閉症、 アルツハイマー病、胎児アルコール痺候群 (FAS)、 アルコール中毒、 な らぴに加齢性小脳失調を挙げること力 Sできる。
本発明のベクターに連結される 「治療用遺伝子」 とは、 プルキンェ細胞で発 現された場合、 前記したプルキンェ細胞障害性疾患の治療に有用な遺伝子であ つて、 その治療対象とする疾患に合わせて、 以下のように選択することができ る。
ポリグルタミン病の治療を目的とした場合は、 GTPase CRAG (Qin et al. J. cell Biol. 2006 Feb 13 ; 172 (4) :497-504. )、 ubiquitin chain assembly factor E4B (UFD2a) (Matsumoto et al. EMB0 J. 2004 Feb 11； 23 (3)： 659-69. ) , ATPase VCP/p97 (Hirabayashi et al. Cell Death Differ. 2001 Oct ; 8 (10) : 977 - 84. )、 分子シ ャ ぺ 口 ン HDJ"- 2 HSDJ ( Cummings et al. Nat Genet. 1998 Jun; l9 (2)： 148-54. )や分子シャぺ口ン BiP (Kozutsumi et al. Nature. 1988 Mar 31 ; 332 (6163) : 462- 4. )、 小胞体蛋白質分解を促進する分子： ER degradation enhancing alpha- mannosidase -丄 ike protein (EDEM) (Oda et al. Science. 2003 Feb 28 ;299 (5611) : 1394- 7. )、 ERのセンサー分子 (Endoplasmic reticulum (ER) stress transducer) ： CREB/ATF family member OASIS (Kondo et al. Nat Cell Biol. 2005 Feb ; 7 (2) : 186- 94. )、 IRE1 (Welihinda and Kaufman. J Biol Chem. 1996 Jul 26 ; 271 (30) : 18181- 7. )、 PERK, ATF6 (Yoshida et al. J Biol Chem. 1998 Dec 11 ; 273 (50) : 33741-9. ) をコードする遺伝子を用いることができる。 また、脊髄小脳変性症 1型、 2型、 6型の治療を目的とした場合は、 ataxin-1, ataxin- 2、 α la電位依存型カルシウムチャネル、 PKC y遺伝子をコードする遺 伝子に対する siRNA、 ハンチントン病の治療を目的とした場合は、 Huntingtin に対する siRNAを用いて、 これら遺伝子の発現を抑制してもよい。
ニーマンピック病の治療を目的とした場合は、 スフインゴミエリナーゼをコ ードする遺伝子を治療用遺伝子として用いることができる。 毛細血管拡張性運 動失調症の治療を目的とした場合は、 AT- mutated (atm)、 自閉症の治療を目的と した場合は、 Reelinや Bel - 2をコードする遺伝子を治療用遺伝子として用いる ことができる。 アルツハイマー病の治療を目的とした場合は、 ネプリライシン をコードする遺伝子を治療用遺伝子として用いることができる。 さらに、 胎児 アルコール症候群 (FAS)、 アルコール中毒、及ぴ加齢性小脳失調の治療を目的と した場合は、 Bcl-2、 DNF、 NGF をコードする遺伝子を治療用遺伝子として用い ることができる。 .
こうした遺伝子治療の薬理評価は、 治療対象となる疾患の種類により異なる が、 脊髄小脳変性症の場合、 ベクターを、 小脳皮質及び/あるいは小脳表面の クモ膜下腔に投与した後、 細胞学的にはプルキンェ細胞、 星状細胞や籠細胞を 含む小脳の神経細胞の変十生脱落の防止によって、さらに臨床的（動物の場合は行 動学的）には小脳失調の改善程度により行うことができる。
本発明の医薬組成物は、 好ましくは、 小脳表面のクモ膜下腔に注入すること により、 投与される。 注入されたベクターは、 注入部位周辺のプルキンェ細胞 のみに限局することなく、 プルキンェ細胞全体に高い親和性で、 かつ広範囲に 治療用遺伝子を送達することができる。 また、 小脳表面のクモ膜下腔への本発 明のベクターの注入は、 ヘルぺスウィルスやアデノ随伴ウィルスで報告された 脳深部に位置する下オリ一ブ核ゃ小脳核への注入に比べて簡便で、 脳実質の損 傷を抑制できるため、 臨床応用に優れる。
投与にあたっては、 注入の際、 脳圧を安定して維持させる観点から、 好まし ぐは、 一定した速度で注入可能な手段、 例えばマウスでは、 ハミルトンシリン ジとそれを取りつけることができるマイクロマニピュレータ一及び注入のため のマイクルインジェクションポンプ等を用いることが望ましい。 注入速度及ぴ 投与量は、 脳圧を安定して維持できる範囲であれば特に限定されるものではな く、 個体の年齢、 体重、 疾患状態等に応じて、 適宜設定され得る。 例えばマウ スの場合、 10nl/分〜 800nl/分、 好ましくは、 50nl/分〜 400nl/分、 より好まし くは、 lOOnl/分〜 200nl/分、 計 2〜8 1であることが望ましい。
本発明の医薬組成物の投与量は、 治療効果を発揮させるに適した量であれば 特に限定されるものではなく、 個体の年齢、 体重、 疾患状態等に応じて、 適宜 設定され得る。 また、 本発明の治療剤の投与回数は、 治療効果を発揮させるに 十分な回数であればよい。 アデノ随伴ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 センダイ
Figure imgf000018_0001
を用いた場合、 長期の遺伝子発現が確認されて いるため 1回の投与でもよいが、 組み込まれる遺伝子のコピー数を増加させ、 より広範囲の細胞に導入させるためには、 治療効果を見ながら、 小脳表面の場 所を変更して 3回程度投与してもよい。
5 . 小脳プルキン工細胞障害性疾患 モデル動物
本発明のベクターを非ヒト哺轧動物のクモ膜下腔に注入することにより、 対 象動物のプルキンェ細胞特異的に特定遺伝子の発現を抑制したり、 過剰発現さ せることができる。
使用可能な非ヒト哺乳動物は、 特に限定されないが、 マウス、 ラット、 ゥサ ギ、 ゥマ、 ヒッジ、 ィヌ、 ネコ、 サルを挙げることができる。 特にマウス、 ラ ット以外の動物ではトランスジエニックマウスを作出するのが極めて困難であ るため、 本発明のベクターの使用は非常に有効である。
たとえば、 本発明のベクターに外来遺伝子として、 前記した小脳疾患遺伝子 (異常伸長した CAGリピートを持つ ataxin- 1、 ataxin-2, ataxin-3, a la電位 依存型カルシウムチャネル、 Huntingtinをコードする遺伝子や変異を持つ PKC γ コードする遺伝ナ (Klebe S. et al. ew mutations in protein kinase Cgamraa associated with spinocerebellar ataxia type 14. Ann Neurol. 2005 Nov ; 58 (5)：720-9)などを非ヒト哺乳動物に導入して発現させれば、当該遺伝子 が関与する小脳プルキンェ細胞障害性疾患を発症させることができる。 このよ うなトランスジエニック動物は、 小脳プルキンェ細胞障害性疾患のモデル動物 や小脳機能研究用モデル動物として有用である。 6 . プルキンェ細胞指向性ウィルスベクター作製用培養液及ぴキット 本発明はまた、 カテブシン K阻害活性を有する物質を含んで成る、 プルキン ェ細胞指向性ウィルスベクター作製用培養液や、 そのような培養液 （カテブシ ン K阻害活性'を有する物質と細胞培養液、 またはカテブシン K阻害活性を有す る物質を含む細胞培養液） を構成要素として含む、 プルキンェ細胞指向性ウイ ルスベクター作製用キットも提供する。
本発明の培養液は、 ΜΕΜ、 α -ΜΕΜ、 D- ΜΕΜ、 ΒΜΕ、 RPMI- 1640、 D- MEM/F- 12、 Ham' s F- 10、 Ham' s F- 12 等、 公知の培養液にカテブシン K阻害活性を有する物質 を添加して調製される。 カテブシン K阻害活性を有する物質としては、 カテブ シン K阻害剤：たとえば、 Cathepsin K inhibitor I、 Cathepsin K inhibitor II、 Cathepsin K inhibitor III (いずれも、 メルク カルビオケム社製等） のほか、 カテブシン阻害剤：たとえば、 Cathepsin inhibitor IN Cathepsin inhibitor II、 Cathepsin inhibitor III (いずれも、 メルク 'カルビオケム社製等） などを適 宜用いることができるが、 これらに琅定されるものではない。
前記培養液は、 ウィルス産生時において p H 7 . 2〜p H 8 . 0が維持され ているように、 HEPES 等の p H低下を防ぐ効果のある試薬を適宜含んでいても よい。
本発明のキットは、 前記した必須の構成要素 （カテブシン K阻害活性を有す る物質と細胞培養液、 またはカテブシン K阻害活性を有する物質を含む細胞培 養液） のほか、 ウィルスプラスミ ドトランスフエクシヨン用の塩化カルシウム 溶液や Hank' s 平衡塩溶液 （Hank' s Balanced Salt Solution： HBSS)、 リン酸 バッファー、 ろ過滅菌用フィルター （径 0. 22 のものなど） 等を含んでいて もよい。 塩化カルシウムは、 たとえば、.36. 76 g CaCl22H20に精製水 100 mlを加 え、 ろ過滅菌することにより調製される。 また、 Hank' s 平衡塩溶液 (2xHBSS) は、 たとえば、 NaCl 8. 2g (final 0. 28M)、 HEPES 5. 95g (final 0. 05M)、 Na2HP04 0. 108g (final 1. 5mM)、 H20 400mlを混合し、 5 N NaOHで pH 7. 05に調製し、 精製水を加えて 500 mlにすることにより調製される。 実施例
以下、 実施例により本発明をより詳細に説明するが、 本発明はこれらの実施 例に限定されるものではなレ 実施例 1 ： トランスフエクション後の培養時間がウィルスのプルキンェ細胞選 択性に与える影響
く方法 >
(1)ウィルスの産生
以下の操作を、 P2実験室で行なった。 ウィルス産生には、 HEK293FT細胞を用 レヽた。培養液は通常用 ヽられてレ、る、 10%ゥシ血清を加えた Dulbecco， s modified Eagle ' s medium (D- MEM)を使用した。 対数増殖期の HEK293FT細胞をリン酸緩 衝化生理食塩水（Mg2+と Ca2+とを含有しない） [PBS (—）]に分散させ、ついで、 10cm ディッシュ（ファルコン社製）あたり 5 X 105細胞となるように播種した。播種後 の lOctnディッシュに、 10重量％ゥシ胎仔血清含.有 D- MEMlOmlを添加し、その後、 細胞を、 5体積 %C02， 37°Cで培養し 。 24時間後、 前記ディッシュ中の培養液 を、新し 、培養液（10重量％ゥシ胎仔血清含有 D- MEM) 10mlと交換した。その後、 細胞を、 5体積。/。 C02， 37°Cで 0. 5時間培養した。
一方、 pCAGkGPlR (St. Jude Chi ldren' s Research Hospital) 6 μ g, pCAG4RTR2 (St. Jude Chi ldren' s Research Hospital) 2 g, pCAG-VSV-G (St. Jude Chi ldren' s Research Hospital) 2 g, pCL20c MSCV~GFP (St. Jude Chi ldren s Research Hospital, George Washington Univers ity) 10 gてれてれを 450 μ 1 滅菌水に溶解させ、 プラスミド溶液を得た。 '
•pCAGkGPIR : gag (ウィルスの構造蛋白質をコード）と pol (逆転写酵素をコード） を含むパッケージングプラスミド。
• pCAG4RTR2 : tat (転写調節遺伝子）を含むプラスミド。 rev を削除してあるた め、 ウィルス粒子は宿主内で複製することができない。
- pCAG-VSV-G : VSV-Gは Vesicular somatitis virus glycoproteinの略。 レン チウィルスの本来の Envelopeでは CD4陽性細胞にしか感染できない。これをリ ン月旨質をターゲットとする VSV (Vesicular stomatitis virus) Envelopeに置 換し、 神経を含むさまざまな細胞に感染可能としたエンベローププラスミド。 • pCL20c MSCV-GFP :レンチウイルスのメインべクタ一 pCL20cにおいて、 2つの LTR内に MSCVプロモーターを配置し、 これに GFP遺伝子を連結させたプラスミ ド （図 1 )。
このようにウィルス産生に不可欠な遺伝子を 4つのプラスミドに分割し、.複 製に必要な領域等を削除することにより、 産生されたウィルスは感染能を持つ 一方、 感染後は自己増殖能が欠如するため安全性が増す。
得られたプラスミド溶液に 2. 5M CaCl2 50 t lを添加して攪拌し、 2xHBSS 〔組 成： 50mM HEPES、 OniM NaCl, 1. 5mM Na2HP04, PH7. 05) ] 500 1を添加し、 すばや く攪拌した。
前記ディッシュにプラスミド溶液を均等に滴下し、 穏やかにディッシュ内の 培地と混合した。 その後、 細胞を、 5 体積。/。 C02， 35°Cで培養した。 以下、 バイ オハザ一ド対策用安全キヤビネットの中で操作を行なった。
16時間後、前記ディッシュ中の培地を、新しい培地（10重量。/。ゥシ胎仔血清含 有 D - MEM) 10ml と交換した。 さらに細胞を、 5体積 °/。C02， 37°Cで培養しトラン スフエクシヨン後から 40時間でウィルスを含む培養液を回収した（40h virus)。 その後、新しい培養液を加えてさらに 24時間培養し、 トランスフエクシヨン後 64時間 （64h virus)でウィルスを含む培養液を回収した（図 2参照）。
(2)濃縮
前記（1)で回収した培地は、. それぞれ 50ml遠心管に移し、 1000rpm(120 X g)、 4分間遠心分離して、上清を得た。得られた上清を、フィルター（ミリポア社製、 0. 22 μ πι径）に通した。得られた濾液を、ベックマン社製ローター SW28. 1を用い た超遠心分離 (25，000rpm，' 2 時間、 4°C)に供してウィルス粒子を沈殿させ、 上 清を除去した。
得られたウィルス粒子沈殿物を PBS (-）に懸濁し、 最終量を 200 1 とし、 感 染用ウィルス液を得た。 なお、 すぐに使用しないウィルス液を、 20 1 ずつ分 注し、 -80°Cで保存した。
(3)ウィルス力価の測定
(i) GFPの蛍光を指標とする方法
対数増殖期の HELA細胞を PBS (-)に分散させ、ついで、 12ゥェルディッシュ（ィ ヮキ硝子社製）に 1ゥエルあたり 5 X 104細胞となるように播種した。 播種後の 12ゥヱルディッシュに、 10重量。/。ゥシ胎仔血清含有 D- MEMを、 1ml/ゥエルとな るように添加し、 その後、 細胞を、 5体積。/。 C02, 37°Cで 24時間培養した。 ウィルス液を 103〜105倍となるように前記ゥエル内の培地に添カ卩した。また、 同時に、 Hexadimethrine Bromide (SIGMA社製、商品名： ポリプレン）を 6 μ g/ml となるように各ゥヱルに添力卩した。 その後、 細胞を 5体積％ C02， 37°Cで 88時 間培養した。
ゥエルの中の緑色蛍光蛋白質 (GFP)発現細胞を蛍光顕微鏡（ォリンパス社製 ■ 商品名： CKX41)下でセルカウンター（ァズワン社製、 商品名：数取器）を用いて計 測し、 ウィルスの力価を算出した。 10x希釈ウィルス液を添加した中、 Y個の細 胞の GFP 発現細胞が見出された場合、 ウィルス力価は、 Y X lO!TU/ral (TU: transductionunit)として算出される。 ·
(ii) 培養細胞（HeLa細胞）のゲノムに組み込まれるプロウィルスのコピー数 による評価 （Izopet et al. J Med Virol. 1998 Jan；54 (1)：54-9. )
HeLa細胞を 10cmディッシュで培養し、播種 24時間後にウィルス液を感染さ せる。 感染 3日後に 5. 0 X 106個の細胞を得た。 これと平行して同数の LAV - 8E5 細胞（ATCC社， Manassas, VA, USA)を得た。 LAV- 8E5細胞は 1細胞に HIV1型の プロウィルスを 1コピー持っており、 これをスタンダードとした。 これらの細 胞からゲノム DNAを抽出し、 最終的に 100 1の TEバッファーに溶解した。 こ のうち Ι μ ΐを用レヽ、 HIVプロウイノレスの RRE (rev responsive element) こ含ま れる 290ベースペアの領域を、 以下のプライマーを用いて増幅した：
5' -ATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTA-3 ' (配列番号 9 )、 5' -CAGACTGTGAGTTGCAA CAGATGCTGT-3' (配列番号 1 0 )。
ゲノムに組み込まれるプロウィルスのコピー数はゲノム DNAを段階希釈して 求めた。 すなわち、 バンドが現れなくなる直前の希釈倍率を決定し、 LAV- 8E5 細胞を用いたスタンダードと比較することで、 5. 0 X 106個の HeLa細胞あたり 何個のプロウイルスが組み込まれているか（ゲノムコピー数 Zゥィルス液 lml) を計算した。
(4)マウス小脳クモ膜下腔へのベクタ一の接種
マウス（SLC供給、 4〜： 10週齢）に、ペントバルビタール（商品名：ネンブターノレ） を、 腹腔内投与 （40mg/kg body weight) にて麻酔し、 以下の操作を、 バイオハ ザ一ド対策用安全キャビネットの中で行なった。
麻酔後、 マウスを、 小動物固定装置 〔ナリシゲ社製、 商品名： SG- 4〕 を用いて 固定した。 また、 体温コントローラー 〔FST社製、 商品名：体温コントロールシ ステム（マウス用） FST- HPSM〕 にて、 マウス体温を 37°Cとなるように維持した。 マウスの頭部の毛を刈った後、 Bregmaより数ミリ吻側から小脳直上にかけて皮 膚を切開した。 ついで、実体顕微鏡（ニコン社製、商品名 1SMZ645)下で、 Bregma より 5〜7mtn尾側の正中部の頭蓋骨に、マイクロドリル〔浦和工業社製、商品名： パワーコントローラー UC100+HB1 (ドリル）〕 を用いて、 内径 2〜3删の穴を開け た。 また、 注射 #1"を用いて、 骨の下の硬膜及ぴクモ膜に穴を開けた。
得られたレンチウィルスベクターを、商品名：レックスフィルマイクロシリン ジ (WPI社製、 10 1容量）に充填し、フレックスフィルマイクロシリンジをマイ クロマニピュレーターに取りつけたウルトラマイクロポンプ 2 (WPI 社製）にセ ットした。 .
マイクロシリンジの針先を小脳直上に開けこ硬膜の穴より約 0. 5mm刺入し、 クモ膜下腔に留置後、 前記レンチウィルスベクターを、 ウルトラマイクロポン プ 2専用デジタルコントローラー Mi cro4 (商品名、 WPI社製）を用いて、 lOOnl/ 分の速度で 40分間、 計 4 μ Ι注入した。
注入後、切開したマウスの皮膚を、縫合糸付き眼科用微小針 (夏目製作所社製、 商品名.眼科用弱弩針 C67 - 0)で縫合した。 その後、 固定装置からマウスをはず し、ヒーティングパッド（昭和精機工業社製、商品名：ゴムマットヒーター SG - 15) 上に置いたケージ (安全キャビネッ ト内）で観察した。 マウスが、 麻酔から覚醒 した後、 マウスケージを ΗΕΡΑフィルター付の感染 '動物用ラック（トキヮ科学器 械株式会社製、商品名：バイオクリーンガブセルュニット T- BCC- Μ4)内で飼育し た。
接種後 7 日目のマウスについて、 4%ホルムアルデヒ ドーリン酸緩衝液で灌流 固定後、 脳を摘出した。 蛍光実体顕微鏡を用いて脳全体の写真と GFPの蛍光写 真を撮影後、 厚さ 50 111、 あるいは 100 mの小脳矢状断切片をマイクロスラ ィサー （堂阪ィーェム社製 商品名 ： DTK-1000) を用いて作製した。 作製され た脳切片を、 一次抗体 [Mouse monoclonal ant i-parvalbumin (星状細胞、 籠細胞 のマーカー） ： SIGMA社製、 あるいは Mouse monoclonal anti-GFAP (グリア細胞 のマーカー)：ケ コン子:!:製、あ レヽ ίま Mouse monoclonal anti— neuron—specif ic nuclear protein (Neu^、 顆粒細胞のマーカー）：ケミコン社製、 あるいは mouse monoclonal ant i-mGluR2 (ゴルジ細胞のマーカー） i生理学研究所重本隆ー教授 より譲り受け）と共に 24時間室温でインキュベーションし、 ついで、 二次抗体 (Alexa fluor 568 - conjugated anti-mouse IgG： Invitrogen社製)で 2時間、 室温でィンキュベーシヨンし、顕微鏡用標本を得た。その後、蛍光顕微鏡 (Leica 社製 商品名 ： DMI 6000B)及び共焦点顕微鏡 （CarlZeiss 社製 商品名 ： LSM5 Pascal) で標本の観察を行なうことにより発現 GFP蛋白質の局在と発現細胞の 種類を調べた。
ぐ結果 >
トランスフエクシヨン後 40 時間で培養液中に放出されたウィルスの接種で は、全 GFP発現細胞のうち約半分 (51%)がプルキンェ細胞であった。パーグマン グリア（22%)、 星状細胞/籠細胞（16%)がこれに続いた （図 2及ぴ図 3 )。 一方、 トランスフヱクション後、 40時間から 64時間で培養液中に放出されたウィル ス（64 h virus)の接種では、 GFP発現プルキンェ細胞の割合は 15%、 星状細胞/ 籠細胞 (4%)に減少し、バーグマングリアは 77%にまで增加した（図 2及び図 3 )。 表 1に示すように、 トランスフエクシヨン後 40時間の培養液の PHは 7. 2で あるが、 トランスフエクション後 64時間後の培養液の pHは 7. 0に低下する。 したがって、プルキンェ細胞への親和性の低下は培養液の pHの変化によるもの ではないかと考えた。
[表 1 ]
pHs of virus-containing medium samples and titers of virus stocks
Host cell Culture period3 pHb Biological titer (TU/ml)
40 h 7.2 5.1 ± 2.6 x 108 4
HE 293FT 64 h 7.0 4.4 ± 2.1 108 4
40 h 7.0C 2.5 ± 2.1 x 108 3 aTime (h) after transfection. bpH of conditioned medium at harvest.
cpH of conditioned medium was adjusted to 7.0 by HCI. dNumber of cultures that were independently conducted. 実施例 2：プルキンェ細胞選択性に対するウィルス産生時の培養液の pHの影響 実施例 1の結果に基づき、培養液の pHどプルキンェ細胞選択性の関係につい て検討した。
ぐ方法 >
実施例 1に従い、トランスフエクシヨン後 40時間のウィルスを含む培養液に 希塩酸を加えて pHを 7. 0に調節した後、 ウィルスを精製し、同様にマウス小脳 に接種し、 7 日後の脳切片を観察した。 さらに HEK293FT細胞より増殖が遅く、 したがつて培養液の増殖に伴う酸性化も遅!/ヽ HEK293T細胞を用いて同様の実験 を行った。
ぐ結果 >
トランスフエクシヨン後 40時間の培養液の pH (7. 2)を 0. 2だけ酸性側にシフ ト（pH7. 0)させ、同じようにウィルスをマウス小脳に接種すると、予想通り トラ ンスフエクション後 64時間で回収したときとほぼ同様の結果を得た。すなわち、 GFP発現プルキンェ細胞 14%、 バーグマングリア 72%、 星状細胞/籠細胞 1. 7% であった （図 2の 40h virus (piU )、 .及ぴ図 4 )。 さらに HEK293FT細胞より育 ちの遅い HEK293T細胞を用いると培養液の酸性化が遅くなり、 同じようにウイ ルスを産生させても、 プルキンェ細胞への親和性が高いウィルスが得られるこ とがわかった。 このことは細胞膜の構成成分であるリン脂質 （フォスファチジ ルセリン） と結合能を持つ VSV-Gエンベロープを用いても、 プルキンェ細胞へ の選択性は、ウィルス産生時の培養液の pHに大きく影響されることを示してい る。 実施例 3 ：プルキンェ細胞選択性に対する血清の影響
<方法 >
表 1に示す Lotの異なる 9種のゥシ血清を用いて、 実施例 1と同様の手順で ウィルスを産生させ、 それぞれのプルキンェ細胞への選択性を検討した。 [表 2 ] s s s
Seru2 3 19m No. Suppliers Origin LOT No.
GIBCO USA 1175763
'^GJB^O.' ' : ： 'V '',ヽ : 1Ϊ2.14677 EQUITECH-BIO, INC. USA SFB30-1540
Figure imgf000026_0001
HyClone Laboratories USA ANK19840
(::;' ;A無.さ ;:' Bioloaical-lndustries .:,lsFael.W¾'¾: 71654-3
SF; Serum free: HEK293T cells were transfectea in the culture medium containing the serum S7. The serum was removed 24 h after the transfection. く結果 >
図 5に示すとおり、 プルキンェ細胞への選択性は血清の Lotの違いにより大 きく異なることが明らかになった。 さらに血清を加えなかった場合でもウィル スは産生されるが、 プルキンェ細胞への選択性が低く、 さまざまな細胞に遺伝 子発現することが確認された。 ' 実施例 4 ：プルキンェ細胞選択性に対するプロテアーゼ阻害剤の影響 ぐ方法 >
血清の代わりに、 表 3に示す様々な種類のプロテアーゼ阻害剤の存在下で、 実施例 1の手順にしたがい HEK293T細胞にウィルスを産生させ、 精製したウイ ルスのマウス小脳における遺伝子発現のプルキンェ細胞選択性を検討した。
Figure imgf000027_0001
Serum-free - 5 7.0 ± 1.5 7
Serum free
Serum-free (+ Insulin, Transferrin, Selene) 4 3.6土 1.3 5
Biological Industries larael (Lot No.716543) 40
4 2.6 ± 0.4 5 pW.2 10 %
Biological Industries Israel (Lot No.716543) 64 h
4 2.4 ± 0.5 6 pH7.0 10 %
Biological Industries Israel (Lot No.716543) 40 h
3 3.4土 1.2 5
Serum (+) pH7.0 10 %
HyClone Laboratories, Inc. 0 USA (Lot No. APA20504) 10 % 3(2) 2.1 ± 1.4 5
HyClene Laboratories, Inc. 1 USA (Lot No. ANK19840) 10 % 2 ND 2
EQUrTECH-BIO, Inc. USA (Lot No. SFB30-1540) 10 % 4 6.9 ± 2.2 6
13旧 CO Mexico (Lot No. 1214677) 10 % 3 6.4 ± 0.6 5
CGS 27023A 4 3.4 ± 1.4 5
Metallo proteinase inhibitor
TIMP-1 1 6J3 1
Serine & cysteine proteinase Proteinase inhibitor cocktail (EDTAfee)
6 2.3 + 0.7 7 inhibitors [AEBSF, Aprotinin, Leupeptin)
Ca hepsin inhibitor I 5 8.3土 2.6 β
Cystein* proteinase mhibitor
Cathepsin K inhibitor 6 4.8 ± 0.6 7
Serine proteinase inhibitor
Aspartate proteinase inhibitor
ウィルスはすべて lxl09 TU/mlの力価に合わせた後、 マウス小脳に接種し、 1 週間後に厚さ 100 μ ηιの小脳矢状断切片を作製した。共焦点レーザー顕微鏡（20 倍の対物レンズ）を用いて切片を 2 !11の厚みで切片の下から上までスキャンし GFPのシグナルを 3次元的に再構成した。 評価は以下の 2つの方法により行つ た。
(1)観察視野 （0. %mm2) における、 GFPを発現している全細胞中のプルキンェ細 胞の割合（％)を求めた。 これはウィルス感染のプルキンェ細胞への選択性 (Selectivity)を表" Γ。
(2)観察視野における、 全プルキンェ細胞中の GFP 発現プルキンェ細胞の割合 (%)を求めた。これはゥィルスのプルキンェ細胞への感染効率（efficiency)を表 す。
く結果〉
(1)プルキンェ細胞への選択性 （図 6 )
血清もプロテアーゼ阻害剤も添加せず、 D- MEM のみの培地で産生したウィル スベクターでは、 プルキンェ細胞への選択性は 48%であった （GFPを発現して いる細胞のうち約半分がプルキンェ細胞）。血清を加えた培地で産生させたウイ ルスでは、選択性が大きく上昇するもの（GIBC0、メキシコ産血清など）もあった 力 ほとんど変わらないもの（HyClone 社製血清）もあった。 これに対し、 血清 を加えずにプロテアーゼ阻害剤を用いたものでは、 TIMP- 1を除く使用した薬剤 いずれにおいてもプルキンェ細胞への選択性が大きく上昇した。 特に力テプシ ン K阻害剤を加えたもの顕著であつた。
(2)プルキンェ細胞の遺伝子発現効率 （図 7 )
血清もプロテアーゼ阻害剤も添加せず、 D- MEM のみの培地で産生したウィル スベクターでは、 プルキンェ細胞への遺伝子発現効率は 37%であった （観察視 野の全プルキンェ細胞中 37%の細胞が GFP遺伝子を発現していた）。 選択性の 結果とは異なり、 プルキンェ細胞における遺伝子発現効率は、 使用する血清の Lot を変化させても有意な上昇は見られなかった。 同様にプロテアーゼ阻害剤 の添加でも、 5種類中 3種類で有意な上昇は見られなかった。 しかし、 カテブ シン Kを添加したものでは、 プルキンェ細胞の遺伝子発現効率は 86%と、 著し い上昇が見られた。 以上の結果から、 血清を添加する通常のプロトコールでレンチウィルスべク ターを産生する場合、 ウィルスべクターのプルキンェ細胞への選択性と遺伝子 発現効率は培地中のプロテアーゼの働きにより、 影響を受けていると考えられ た。 この現象には、 特にシスティンプロテアーゼファミリーの一つ、 力テプシ ン Kが大きな役割を果たしていると考えられ、 ウィルス産生時の培地にカテブ シン Kの阻害剤を加えることで、 プルキンェ細胞に極めて選択性が高く、 かつ 親和性も高いウィルスを産生することが可能となることが明らかとなった。 実施例 5 ：プルキンェ細胞選択性とウィルス VSV-Gに対するカテブシン K阻害 剤の影響
1 . 培養液の pHと培養液中のカテブシン K活性
<方法 >
実施例 1の手順でトランスフエクション後 40時間の培養液 (pH7. 2)と 64時間 (pH7. 0)の培養液を得る。 これら 2つの培養液中のカテブシン K活性を Cathepsin K Detection Kit (メノレク カルビオケム社製） を用いて測定する。
2 . カテブシン Kによる VSV- Gの切断
<方法 >
40時間ウィルスと 64時間ウィルスを産生、 回収する。 またトランスフエク シヨン後 40時間の培養液をカテブシン Kで処理、 あるいは pHを希塩酸を用い て 7. 0に低下させた後、 ウィルスを回収する。 これら 4種のウィルスの VSV-G 蛋白質の切断の状態を、 直接アミノ末端シークェンシングを行い、 どこで切断 されているのか確認する。
3 . ウィルスをカテブシン Kで処理することで、 プルキンェ細胞選択性が低下 すること
<方法 >
実施例 1の手順に従い、トランスフヱクシヨン後 40時間でウィルス粒子を含 む培養液を得る。 この培養液をカテブシン Kで 2時間処理する。 その後超遠心 を行ないウィルスを回収、 マウス小脳に接種する。 1 週間後にウィルスのプル キンェ細胞選択性が低下しているのを確認する。 カテブシン Kに関しては、 す でに HEK293T 細胞から mRNA 'を抽出し、 RT-PCR 法を用いて遺伝子を得ている (HEK293T細胞から RT - PCRでカテブシン K遺伝子が得られたことは、 HEK293T 細胞がカテブシン K を発現していることを示している）。 さらにカテブシン K 遺伝子を pcDNA3. 1ベクターにサブクローエングし、これを用いて HEK293T細胞 をトランスフエクシヨンし、 3 日後に培養液を回収したが、 この培養液にカテ プシン Kが+分量含まれることも、 rabbit polyclonal anti-cathepsin K抗体
(BioVision社製） を用いたウェスタンプロット法にて確認している。 このよ うにして得られたカテブシン Kを用いてウィルスを処理する。 実施例 6 ：プルキンェ細胞障害遺伝子を用いた疾患モデルマウスの作出
<方法 >
脊髄小脳変性症 3型 (MJD病）の原因遺伝子は ataxin- 3であり、患者ではこの 遺伝子内に存在する CAGリピートが異常伸長レている。 そこで CAGリピートが 異常伸長した ataxin- 3を、レンチウィルスベクターを用いてプルキンェ細胞に 発現させることにより、 MJD病のモデルマウスを作出した。
く結果 >
CAGリピートが異常伸長した ataxin- 3を MSCVプロモーターの制御下で発現 するようにベクタープラスミドを作製した（図 8 A)。次に実施例 1の手順に従レ、、 40時間ウィルスを得た。 なお、 ウィルス産生の宿主細胞として HEK293T細胞を 用いた。 得られたウィルスをマウス小脳に接種し、 2 力月後に小脳失調の程度 をロータロッド （室町機械社製、 MK- 660C)にて解析した。 ロッド （棒） は停止 状態から次第に加速し 180秒後に 40回転/分の速度になるように調節し、マウ スがロッドに乗っている時間を測定した。 実験は 8回繰り返した。 ウィルスで 小脳に GFPを発現させたマウスは、 ウィルスを接種していないコントロールマ ウスとロータロッドの成績に差がないことはあらかじめ確認している。 これに 対して、 ウィルスを接種したマウスは、 ウィルスを接種していないコントロー ルのマウスに比べて、 有意に短時間でロッドから落下し、 運動失調が出現して いることが示された（図 8 B)。 実験終了後、マウスを灌流固定し、小脳切片を作 製して観察したところ、 プルキンェ細胞内に ataxin - 3 の凝集塊が認められた (図 8 C矢印）。
このように、 ウィルスを用いて小脳疾患原因遺伝子をプルキンェ細胞に発現 することにより、 小脳疾患モデルマウスの作出が可能であることが示された。 実施例 7 ：脊髄小脳変性症モデルマウスを用いた治療用遺伝子発現ウィルスの 治療効果の検討
<方法 >
プルキンェ細胞特異的 L7プロモーターの制御下で、 CAGリピートが異常伸長 した脊髄小脳変性症 3型遺伝子 ataxin- 3 [Q69]を発現するように配置した DNA コンス トラクト（図 9 A)を作製した。 これをマウス受精卵に接種し、小脳プルキ ンェ細胞特異的に ataxin- 3 [Q69]を高発現する トランスジエニックマウス （脊 髄小脳変性症モデルマウス） を 3ライン得た。 これらのマウスの小脳に治療用 遺伝子候補である CRAG、 あるいは VCP/p97の 522番目のシスティンをスレオニ ンに変換した VCP (C522T)を発現するウィルスベクター（図 1 O A)を接種し、 運 動失調が回復するかを観察した（図 1 0 B-E)。
<結果 >
得られた 3つのラインの脊髄小脳変个生症モデルマウスのうち、 a lineと b line は生後すぐの時点から運動失調が極めて強く（図 9 B)、小脳の萎縮も顕著であつ た（図 9 C, D)。 これに対し、' c lineの運動失調の程度は野生型と a， b lineと 野生型の中間であった（図 9 B)。 生後 30 日の c lineのモデルマウスの小脳に CRAGを発現するウィルスを接種し、 1週間おきにロータロッドテスト（ロッドは 静止状態から、 180秒で 40回転 Z分まで加速）を施行した。接種 1週間後では、 接種していないモデルマウスとほとんど差は認められなかつた。しかしその後、 ウィルスを接種したマウスは徐々に成績が向上した（図 9 D)。すなわち、 ウィル スを用いたプルキンェ細胞選択的な CRAGの発現により、脊髄小脳変性症 3型モ デルマウスの運動障害が顕著に回復した。より運動失調が強い b lineマウス（生 後 21日）に CRAGまたは GFPを発現するレンチウィルスベクターを接種したとこ ろ、.4週後にロータロッドの成績の有意な回復が観察された（図 1 0 D)。 8週後 にはさらに長い間加速するロータロッドに乗ることができた （何も接種してい ないマウスと GFP発現レンチウィルスベクターを接種したマウスでは、 20秒弱 しかのることができなかったのに対し、 CRAG発現ウィルスベクターを接種した ものでは 40秒以上ものることができた）。 接種 2ヶ月後に定速 5回転でロータ 口ッド試験を 6回行ったと！ろ、 何も接種していないマウスと GFP発現レンチ ウィルスベクターを接種したマウスでは、 何度行ってもロッドが回転するとす ぐに落ちたのに対し、 CRAG発現レンチウィルスベクターを接種したマウスでは 回数を重ねるごとに乗っていられる時間が長くなった（図 1 O E)。 このことは CRAGや VCP (C522T)発現により小脳が司る運動学習機能も回復したことを示し ている。
ウィルスベクター接種 2ヶ月後に b lineマウスを灌流固定し小脳切片を作製 した。小脳切片は抗 HAタグ抗体 （図 1 1 A, C, E)、 と抗カルビンディン抗体を用 レヽて二重免疫組織染色した（図 1 1 B， D， E)。何も発現していない切片ではプルキ ンェ細胞層は大きく乱れ、 細胞内部に ataxin- 3を含む封入体を認めた（図 1 1 A，B)。 これに対し、 CRAGや VCP (C522T)発現させた切片では大部分の封入体が消 失し、 プルキンェ細胞層も 1〜2層と野生型に近い状態であった（図 1 1 C_F)。 小脳皮質における封入体の数 (図 1 1 G)、 小脳皮質分子層の厚さ（図 1 1 H)を測 定したところ、 CRAGや VCP (C522T)発現させた切片で封入体の数の有意な減少と 分子層の厚さの有意な増大を認めた。 実施例 8 ：
図 1 2に示されるように、従来の L7プロモーター（L7-1)を基に、種々の縮小 型 L7プロモーター (L7-2, L7-3, L7- 4， L7- 5, L7-6, L7-7)を作製し、 レンチ ウィルスベクターを用いて、この縮小型プロモーター制御下で GFPを発現させ、 プルキンェ細胞選択性を CMVプロモーター、 MSCVプロモーター、 あるいは従来 の L7プロモーター（L7- 1)の場合と比較した。 なお、 L7- 1〜L7- 7の配列をそれ ぞれ配列表の配列番号 1〜 7に示す。
<方法 >
(1)ウィルスの産生
以下の操作を、 P2実験室で行なった。 ウィルス産生には、 HEK293FT細胞を用 いた。培養液は通常用いられている、 10%ゥシ血清を加えた Dulbecco' s modified Eagle' s medium (D- MEM)を使用した。 対数増殖期の HEK293FT細胞をリン酸緩 衝化生理食塩水 (Mg2+と Ca2+とを含有しない） [PBS (—）]に分散させ、ついで、 10cm ディッシュ（フアルコン社製)あたり 5 X 10s細胞となるように播種した。播種後 の 10cmディッシュに、 10重量。/。ゥシ胎仔血清含有 D- MEMlOmlを添加し、その後、 細胞を、 5体積 %C02， 37°Cで培養した。 24時間後、 前記ディッシュ中の培養液 を、新しい培養液（10重量％ゥシ胎仔血清含有 D- MEM) 10mlと交換した。その後、 細胞を、 5体積。 /0C02， 37°Cで 0. 5時間培養した。
一方、 pCAGkGPlR (St. Jude Chi ldren s Research Hospital) 6 μ g, pCAG4RTR2 (St. Jude Chi ldren s Research Hospital) 2 μ g, pCAG - VSV_G (St. Jude Chi ldren s Research Hospital) 2 μ g, pCL20c L7-X-GFP 又は pCL20c MSCV-GFP (St. Jude Chi ldren s Research Hospital / George Washington University) 10 μ gそれぞれを 450 μ 1滅菌水に溶解させ、 プラスミド溶液を得 た。
•pCAGkGPIR : gag (ウィルスの構造蛋白質をコード）と pol (逆転写酵素をコード） を含むパッケージングプラスミド。
• PCAG4RTR2 : tat (転写調節遺伝子） 含むプラスミド。 rev を削除してあるた め、 ウィルス粒子は宿主内で複製することができない。
· pCAGS-VSVG : VSVGは Vesicular somat itis virus glycoproteinの略。 レン チウィルスの本来の Envelopeでは CD4陽性細胞にしか感染できない。これを細 胞膜の構成成分であるリン腌質 （フォスファチジルセリン） をターゲットとす る VSVの Envelopeに置換することで、神経を含むさまざまな細胞に感染するこ とが可能となる。
· pCL20c MSCV-GFP：レンチウィルスのメインベクター pCL20cのプロモーターを MSCVプロモーターに置換し、 2つの LTR内に GFPを連結させたプラスミド （図 D o
• pCL20c L7-X-GFP : レンチウイノレスのメインベクター pCL20c のプロモーター を L7プロモータ （L7-1) 又はその縮小型 （L7- 2〜7) に置換し、 2つの LTR内 に GFPを連結させたプラスミド （図 1 3に pCL20c L7- 4 - GFPの構造を、 またそ の全配列を配列表の配列番号 8に示す)。
得られたプラスミド溶液に 2. 5M CaCl2 50 μ 1を添加して攪拌し、 2xHBSS 〔組 成： 50mM HEPES、 OmM NaCl, 1. 5raM Na2HP04, pH7. 05) ] 500 μ ΐを添カ卩し、 すばや く攪拌した。
前記ディッシュにプラスミド溶液を均等に滴下し、 穏やかにディッシュ内の 培地と混合した。 その後、 細胞を、 5 体積 %C02, 35°Cで培養した。 以下、 バイ オハザ一ド対策用安全キヤビネットの中で操作を行なった。
16時間後、前記ディッシュ中の培地を、新しい培地（10重量％ゥシ胎仔血清含 有 D- MEM) 10ml と交換した。 さらに細胞を、 5体積。/。 C02， 37°Cで培養しトラン スフヱクシヨン後から 40時間でウィルスを含む培養液を回収した（40h virus)。 (2)濃縮
前記（1)で回収した培地は、 それぞれ 50ml遠心管に移し、 1000rpm(120 X g)、 4分間遠心分離して、上清を得た。得られた上清を、フィルター（ミリポア社製、 0. 22 ^ m )に通した。得られた濾液を、ベックマン社製ローター SW28. 1を用い た超遠心分離（25，000rpm， 2 時間、 4°C)に供してウィルス粒子を沈殿させ、 上 清を除去した。
得られたウィルス粒子沈殿物を PBS (-)に懸濁し、 最終量を 200 i l とし、 感 染用ウィルス液を得た。 なお、 すぐ 使用しないウィルス液を、 20 μ 1 ずつ分 注し、 -80°Cで保存した。
(3)ウィルス力価の測定
培養細胞（HeLa細胞）のゲノムに組み込まれるプロウィルスのコピー数によつ て評価した (Izopet et al. J Med Virol. 1998 Jan; 54 (1) : 54-9. )。 HeLa細胞 を 10cmディッシュで培養し、 播種 24時間後にウィルス液を感染させる。 感染
3日後に 5. 0 X 106個の細胞を得た。 これと平行して同数の LAV- 8E5細胞（ATCC 社， Manassas, VA, USA)を得た。 LAV- 8E5細胞は 1 '細胞に HIVl型のプロウィル スを 1コピー持っており、 これをスタンダードとした。 これらの細胞からゲノ ム DNAを抽出し、最終的に 100 （ 1の TEバッファ一に溶解した。 このうち 1 1 を用い、 HIVプロウィルスの RRE (rev responsive element)に含まれる 290ベー スペアの領域を、 以下のプライマーを用いて增幅した：
5， -ATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTA-3 ' (配列番号 9 )
5' -CAGACTGTGAGTTGCAACAGATGCTGT-3' (配列番号 1 0 )。
ゲノムに組み込まれるュピー数はゲノム DNAを段階希釈して求めた。すなわち、 バンドが現れなくなる直前の希釈倍率を決定し、 LAV- 8E5細胞を用いたスタン ダードと'比較することで、 5. 0 X 106個の HeLa細胞あたり何個のプロウィルス が組み込まれているか （ゲノムコピー数/ウィルス液 1ml) を決定した。 (4)培養小脳プルキンェ細胞への遺伝子導入実験
胎生 2 0あるいは 2 1日のウィスターラットの小脳を用いて、 12ゥェルディッ シュに以下の手順で培養した。 1. 0 X 107個 /ml の密度の小脳細胞懸濁液を 10%FBS入りの DMEM/F12で作製した。予め poly- L- ornithineでコーテイングし た直径 13mmのプラスチック力バースリップ (住友ベータライト社製、 Sumilon MS- 80060) の上に、懸濁液を 1ゥヱルあたり 20ml使用し （細胞 20万個分）、 直 径約 6mmになるように薄く伸ばした。 その後、 5% C02、 37°Cに保たれた加湿培 養機の中に 2時間静置した。 細胞が力パースリップに貼りついた後、 上清を吸 引除去し 37°Cに温めた培養液 （以下の成分） を 800mlずつ加えた。 培養液の成 分： DMEM-nutrient mixture of Ham' s F - 12 (シグマ社^ )+ bovine insulin (lOmg/ml)、 bovine serum albumin (lOOmg/ml)、 gentamicin (5mg/ml)、 glutamine (200mg/ml) 、 human apotransf erin (lOOmg/ml) 、 rostegerone (40nM) 、 putrescine (lOOnM)、 sodium selenite (30nM)、 triiodothyronine (0. 5ng/ml) 0 次に 2- 4xl05ゲノムコピー Zmlの力価のウィルス液を lm 1加えて感染させた。 翌日 （24時間後） に最終濃度が 1%になるように FBSを加えた。
14日後に培養細胞の GFP蛍光写真を撮像し、 40個のプルキンェ細胞を無作為 に選んで、 その蛍光強度の平均を測定した。 CMV プロモーターを使用した場合 の平均 GFP蛍光強度を 100%として評価した。
(5)マウス小脳クモ膜下腔へのベタタ一の接種
マウス（SLC供給、 4〜： 10週齢）に、ベントバルビタール（商品名：ネンブタール） を、 腹腔内投与 （40mg/kg body weight) にて麻酔し、 以下の操作を、 バイオハ ザ一ド対策用安全キヤビネットの中で行なった。
麻酔後、 マウスを、 小動物固定装置 〔ナリシゲ社製、 商品名： SG- 4〕 を用いて 固定した。 また、 体温コントローラー 〔FST社製、 商品名：体温コントロールシ ステム（マウス用） FST- HPSM〕 にて、 マウス体温を 37°Cとなるように維持した。 マウスの頭部の毛を刈った後、 Bregmaより数ミリ吻側から小脳直上にかけて皮 膚を切開した。ついで、実体顕微鏡（二コン社製、商品名 1SMZ645)下で、 Bregma より 5〜7mm尾側の正中部の頭蓋骨に、マイクロドリル〔浦和工業社製、商品名： ノ ヮ一コントローラー UC100+HB1 (ドリル）〕 を用いて、 内径 2〜3讓の穴を開け た。 また、 注射針を用いて、 骨の下の硬膜及びクモ膜に穴を開けた。 得られたレンチウィルスべクターを、商品名：レックスフィルマイクロシリン ジ (WPI社製、 10 ^ 1容量）に充填し、フレックスフィルマイクロシリンジをマイ クロマニピュレーターに取りつけたウルトラマイクロポンプ 2 (WPI 社製）にセ ットした。
マイクロシリンジの針先を小脳直上に開けた硬膜の穴より約 0. 5mm刺入し、 クモ膜下腔に留置後、 得られたレンチウィルスベクターを、 ウルトラマイクロ ポンプ 2 専用デジタルコントローラー Micro4 (商品名、 WPI 社製）を用いて、 lOOnl/分の速度で 40分間、 計 4 μ I注入した。
注入後、切開したマウスの皮膚を、縫合糸付き眼科用微小針 (夏目製作所社製、 商品名.眼科用弱弩針 C67-0)で縫合した。 その後、 固定装置からマウスをはず し、ヒーティングパッド（昭和精機工業社製、商品名：ゴムマツトヒーター SG- 15) 上に置いたケージ (安全キャビネット内）で観察した。 マウスが、 麻酔から覚醒 した後、 マウスケージを ΗΕΡΑフィル.ター付の感染動物用ラック（トキヮ科学器 械株式会社製、商品名：バイオクリ一ンガプセルュニット T-BCC- 4)内で飼育し た。
接種後 7 日目のマウスについて、 4%ホルムアルデヒドーリン酸緩衝液で灌流 固定後、 脳を摘出した。 蛍光実体顕微鏡を用いて脳全体の写真と GFPの蛍光写 真を撮影後、 厚さ 50 ^ m、 あるいは 100 / mの小脳矢状断切片をマイクロスラ ィサー （堂阪ィーェム社製 商品名 ： DTK- 1000) を用いて作製した。 作製され た脳切片を、 一次抗体 [Mouse monoclonal anti-parvalbumin (星状細胞、 籠細胞 のマーカー） ： SIGMA社製、 あるいは Mouse monoclonal anti-GFAP (グリア細胞 のマーカー)：ケ コン社 ^、あ レヽ Mouse monoclonal anti-neuron-specific nuclear protein (NeuN、 顆粒細胞のマーカー）：ケミコン社製、 あるいは mouse monoclonal anti-mGluR2 (ゴルジ細胞のマーカー） ：生理学研究所重本隆一教授 より譲り受け）と共に 24時間室温でインキュベーションし、 ついで、 二次抗体 (Alexa fluor 568 - conjugated ant i -mouse IgG： Invitrogen社製)で 2時間、 室温でィンキュベーショ.ンし、顕微鏡用標本を得た。その後、蛍光顕微鏡 (Leica 社製 商品名 ： DMI 6000B)及び共焦点顕微鏡 （CarlZeiss 社製 商品名 ： LSM5 Pascal) で標本の観察を行なうことにより発現 GFP蛋白質の局在と発現細胞の 種類を調べた。 <結果〉
図 1 4は、 培養小脳神経細胞に、 レンチウィルスベクターを用いて各種プロ モーター制御下で GFPを発現させたときの導入率 （発現割合） を示す。 （a)は、 全 GFP 発現細胞中のプルキンェ細胞の割合： GFP発現プルキンェ細胞数 ZGFP 発現細胞数を示す。 CMVプロモーターや MSCVプロモーターを用いた場合、 GFP 発現細胞のほとんどがプルキンェ細胞以外であるのに対し、 L7- 1〜L7 - 4ではプ ルキンェ細胞にしか遺伝子発現が起こらなかった。 L7-5、 L7-6では GFP発現細 胞が存在しなかった。 L7- 7 ではプルキンェ細胞に対する特異性が低下し、 GFP 発現細胞の約半分はプルキンェ細胞以外であった。 （b)は、全プルキンェ細胞中 の GFP発現プルキンェ細胞の割合： GFP発現プルキンェ細胞数 Z全プルキンェ 細胞数を示す。 CMVプロモーターでは全プルキンェ細胞の約 5分の 1、 L7- 1で は約 3分の 1のプルキンェ細胞にしか GFP発現が見られない。これに対し、 L7 - 4 ではほぼ 100%、 すなわち存在するすべてのプルキンェ細胞に GFPが発現して いる。 少なくとも 4回の独立した小脳神経細胞培養標本を用いた結果の平均を 示している。 また使用したウィルスベクターはほぼ同じ力価 （2- 4xl05ゲノムコ ピー/ ml) のものを用いている。
図 1 5は、 培養小脳プルキンェ細胞に、 レンチウィルスベクターを用いて各 種プロモーター制御下で GFPを発現させたときの蛍光強度（a)を示す。 40個の プルキンェ細胞を無作為に選び、 冷却 CCDカメラで蛍光画像を取り込んだ後、 その蛍光強度を IPLabイメージングソフトウエアー （Scanalytics社製） を用 いて測定した。 （b)は、 HEK293T細胞に CMVプロモーター制御下で GFPを発現す るレンチウイルスべクタ一を、 さまざまな M0Iで感染させたときの GFP蛍光強 度を示すグラフである。無作為に 40個の HEK293T細胞を選ぴ、その蛍光強度を IPLabイメージングソフトウエアーを用いて測定した。 MOI 10から 1000にかけ て、 蛍光強度は M0Iの対数にほぼ比例した。
図 1 6は、 培養小脳プルキンェ細胞に、 レンチウィルスベクターを用いて MSCVプロモーター、 従来の L7プロモーター（L7-1)あるいはその縮小型プロモ 一ター（L7- 2， L7-4, L7-5, L7 - 7)制御下で GFPを発現させた結果を示す。 左の パネルは、 プルキンェ細胞特異的な抗カルビンディン抗体を用いた蛍光免疫染 色写真を示す。 ただし MSCVプロモーターを用いた場合 （左上） のみ、 抗カルビ ンディン抗体に加えて顆粒細胞特異的な抗 NeuN抗体も用いて染色した（プルキ ンェ細胞と顆粒細胞が赤く見える）。中央のパネルはそれぞれのウィルスべクタ 一によつて発現した GFPの蛍光写真を示す。 右のパネルは左と中央のパネルを 重ね合わせたもの（Overlay)である。 MSCV プロモーターを用いた場合は、 プル キンェ細.胞、 顆粒細胞に加えてグリア細胞 （矢印） や顆粒細胞とプルキンェ細 胞の中間サイズの細胞体を持つ細胞 （矢頭） にも GFPの発現が見られた。 これ に対し、 L7- 1、 L7- 2、 L7- 4ではプルキンェ細胞のみに GFPの発現が見られた。 特に、 L7 - 4では存在するすべてのプルキンェ細胞に GFPが発現し、 さらに GFP の発現も強く、プロモーター活性が従来の L7- 1より顕著に高いことが確認され た。
図 1 5は、 各種プロモーターを組み込んだレンチウィルスベクターによるマ ウス小脳への遺伝子発現実験の結果を示す。 （a- d)は、 レンチウィルスベクター を用いて、従来の L7プロモーター（L? - 1)制御下で GFPを発現させたときの GFP の蛍光写真である (力価： 3· 7 χ 105ゲノムコピー Zml (c)， （d)は、 抗 GFP抗 体を用いて免疫染色した写真 （これにより蛍光は増強する） である。 （e-h)は、 従来の L7-1プロモーターの代わりに、 L7- 4を持つレンチウィルスベクター (力 価： 2. 4 x 105ゲノムコピー/ ml) を用いた場合の小脳プルキンェ細胞の GFP蛍 光写真である。ほぼ同じ力価（ほぼ同じ数のプロウィルスを染色体に導入する） を用いているにもかかわらず、 L7- 4を用いた場合には、 L7-1を用いた場合に比 較して、 GFPを発現するプルキンェ細胞の数、 GFP発現量が顕著に高いことが確 認された。 本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考とし て本明細書中にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明によれば、 小脳プルキンェ細胞に高い選択性を有するベクターを、 血 清を使用することなく作製することができる。 本発明のベクターは、 小脳が司 る運動学習や協調運動の分子レベルでのメカニズム解明、 及び脊髄小脳変性症 等のプルキンェ細胞障害性疾患の遺伝子治療など、 神経科学分野において基礎 研究から臨床応用まで幅広く利用可能である 配列表フリーテキスト
配列番号 1一 L7 - 1
配列番号 2— L7 - 2
配列番号 3— L7-3
配列番号 4 -L7-4
配列番号 5— L7-5
配列番号 6— L7 - 6
配列番号 7— L7 - 7
配列番号 8 -pCL20c L7-4-GFP
配列番号 9一人工配列の説明：プライマー 配列番号 1 0—人工配列の説明：プライマー

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ウィルス由来プラスミドベクターに改変型 L7プロモーターと外来遺伝子 を機能しうる態様で連結して成る小脳プルキンェ細胞指向性ベクターであって、 前記改変型 L7プロモーターが下記 a)又は b)の DNAからなることを特徴とする ' 刖記べクタ一：
a) 配列番号 3又は 4に示される塩基配列を有する DNA
b) 配列番号 3又は 4に示される塩基配列と相捕的な配列を有する DNA とスト リンジヱントな条件下でハイブリダイズし、 a)の DNAと同等のプルキンェ細胞 特異的プロモーター活性を有する DNA。
2 . 前記ウィルスが、 アデノウイルス、 アデノ随伴ウィルス、 レトロウィル ス、 ヘルぺスウィルス、 センダイウィルス、 ¾ぴレンチウィルスから選ばれる ものである、 請求項 1に記載のベクター。
3 . 前記ウィルスがレンチウィルスである、 請求項 1に記載のベクター。
4 . 前記ベクターによって産生されるウィルスの蛋白質が実質的に分解修飾 を受けていない状態にあることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか 1項に記 載のベクター。
5 . レンチウィルスプラスミドベクターに外来遺伝子を機能しうる態様で連 結して成る小脳プルキンェ細胞指向性べクタ一であって、 前記べクターによつ て産生されるウィルスの蛋白質が実質的に分解修飾を受けていない状態にある ことを特徴とするベクター。
6 . 前記外来遺伝子が、 CMVプロモーター、 MSCVプロモーター、 CAGプロモ 一ター、 プルキンェ細胞特異的 L7プロモーター、神経細胞特異的 NSEプロモー ター、及び j3 -actinプロモーターから選ばれるいずれかのプロモーターの支配 下に連結されている、 請求項 5に記載のベクター。
7 . . 前記蛋白質が、 ウィルスエンベロープ上に存在する糖蛋白質である、 請 求項 4又は 6に記載のベクター。
8 . 前記ベクターが、 プロテアーゼ阻害剤を含む培養液中で産生されたもの である、 請求項 1〜 7の！/、ずれか 1項に記載のベタタ一。
9 . 前記プロテアーゼ阻害剤がカテブシン K阻害活性を有するものである、 請求項 8に記載のベクター。
1 0 . 前記ベクターが、 p H 7 . 2〜p H 8 . 0の培養液中で産生されたも のである、 請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載のべクタ一。
1 1 . 前記ベクターが、 血清を含まない培養液中で産生されたものである、 請求項 1〜 1 0のいずれか 1項に記載のベクター。
1 2 . 前記外来遺伝子がブルキンェ細胞障害性疾患の治療用遺伝子又は当該 疾患遺伝子である、 請求項 1〜1 1のいずれか 1項に記載のベクター。
1 3 . 前記、冶療用遺伝子が、 GTPase CRAG、 ubiquitin chain assembly f actor E4B (UFD2a) , ATPase VCP/p97、 HDJ- 2、 HSDJ及ぴ BiPを含む分子シャペロン、 YAPdeltaC を含 む細胞 死抑 制 分子 、 ER degradation enhancing alpha-mannosidase-like protein (EDEM)を含む小胞体蛋白質分解促進分子、 CREB/ATF family member OASIS, IRE1、 PERK及び ATF6を含む ERセンサ一分子、 スフィンゴミエリナーゼ、 AT— mutated (atm)、 Reelin、 Bel— 2、ネプリライシン、 BDNF、 ならびに NGFをコードする遺伝子から選ばれるいずれか 1つ又は 2っ以 上、 あるレ、は ataxin- 1、 ataxin- 2、 ataxin- 3、 a la電位依存型カノレシゥムチヤ ネル、 及び PKC yをコードする遺伝子から選ばれるいずれか 1つ又は 2つ以上 の siRNAである、 請求項 1 2に記載のベクター。
1 4 . 前記疾患遺伝子が、 異常伸長した CAG リピートを持つ ataxin_l、 ataxin一 2、 ataxin_3、 huntingtin、 び《 la カノレシクムチヤネノレ =ι ードする遺伝子、 ならびに変異を持つ PKC yをコードする遺伝子から選ばれる いずれか 1つ又は 2つ以上である、 請求項 1 1に記載のベクター。
1 5 . 請求項 1 ~ 1 4のいずれか 1項に記載のベクターを含む、 小脳プルキ ンェ細胞障害性疾患の治療用医薬組成物。
1 6 . 小脳プルキンェ細胞障害性疾患が、 脊髄小脳変性症、 及ぴハンチント ン病を含むポリグルタミン病、ニーマンピック病、毛細血管拡張性運動失調症、 自閉症、 アルツハイマー病、 胎児アルコール症候群、 アルコール中毒、 ならび に加齢性小脳失調から選ばれるいずれかである、 請求項 1 5に記載の医薬組成 物。
1 7 . 請求項 1〜1 4のいずれか 1項に記載のベクターを導入された非ヒト 哺乳動物。
1 8 . 異常伸長した CAG リピートを持つ ataxin- 1、 ataxin- 2、 ataxin - 3、 huntingtin,及ぴ a la電位依存型カルシウムチャネルコードする遺伝子、 なら びに変異を持つ PKC T/をコードする遺伝子から選ばれるいずれか 1つ又は 2つ 以上を導入され、 小脳プルキンェ細胞障害性疾患のモデル動物である、 請求項 1 7に記載の非ヒト哺乳動物。
1 9 . ウィルス由来ベクタープラスミドに配列番号 3又は 4で示される塩基 配列を有する改変型 L7プロモーターを、外来遺伝子に機能しうる態様で連結す るか、 あるいはレンチウィルスプラスミドベクターに外来遗伝子を機能しうる 態様で連結して宿主細胞に導入し、 前記細胞をプロテアーゼ阻害剤を含む培養 液中で培養して、 ウィルスを産生させることを特徴とする、 プルキンェ細胞指 向性ウィルスベクターの作製方法。
2 0 . 前記プロテアーゼ阻害剤がカテブシン. K阻害活性を有するものである、 請求項 1 9に記載の方法。 .
2 1 . 前記培養液が p H 7 . 2〜p H 8 . 0である、 請求項 1 9又は 2 0に 記載の方法。
2 2 . 前記培養液が血清を含まないものである、 請求項 1 9〜2 1のいずれ か 1項に記載の方法。
2 3 . カテブシン K阻害活性を有する物質を含んで成る、 プルキンェ細胞指 向性ウィルスベクター作製用培養液。
2 4 . カテブシン K阻害活性を有する物質と細胞培養液、 またはカテブシン K阻害活性を有する物質を含む細胞培養液を構成要素として含む、 プルキンェ 細胞指向性ウィルスベクタ一作製用キット。
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