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WO2007037533A9 - Therapeutic or diagnostic application of ppp1r3d gene - Google Patents

Therapeutic or diagnostic application of ppp1r3d gene

Info

Publication number
WO2007037533A9
WO2007037533A9 PCT/JP2006/320009 JP2006320009W WO2007037533A9 WO 2007037533 A9 WO2007037533 A9 WO 2007037533A9 JP 2006320009 W JP2006320009 W JP 2006320009W WO 2007037533 A9 WO2007037533 A9 WO 2007037533A9
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
gene
protein
ppp
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2006/320009
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
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WO2007037533A1 (en
Inventor
Shinichirou Niwa
Yasutaka Makino
Tomoki Ikuta
Kazuya Arai
Takayuki Shindou
Hiromichi Ogura
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Link Genomics Inc
Original Assignee
Link Genomics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Link Genomics Inc filed Critical Link Genomics Inc
Priority to JP2007537776A priority Critical patent/JPWO2007037533A1/en
Publication of WO2007037533A1 publication Critical patent/WO2007037533A1/en
Publication of WO2007037533A9 publication Critical patent/WO2007037533A9/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a P P P 1 R 3 D gene that is a gene specifically amplified in cancer, its therapeutic or diagnostic use, and the like.
  • Cancers Malignant tumors (cancers) are characterized by lethality due to generalization through proliferation, invasion, and metastasis. Local therapies such as surgical resection or radiation therapy cannot adequately address metastatic recurrent cancer, and the development of systemic pharmacotherapy is expected to improve the outcome of cancer treatment in the future. Yes.
  • Chemotherapy which is the current center of cancer drug therapy, often uses cell killing agents that directly act on the DNA and / or RNA of cancer cells and cause the cells to die. Bone marrow cells, germ cells, hair matrix
  • 3 ⁇ 4-It acted on normal cells such as cells and gastrointestinal epithelial cells, which had many divisions, and had strong side effects.
  • recent advances in molecular cell biology have elucidated the mechanisms involved in cancer cell invasion, proliferation, and metastasis, and the development of molecular targeted drugs that specifically act on the specific mechanisms of cancer cells. Attention has been paid.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • Yretza genetic name: gefitinib
  • Herceptin gene: trastuzumab
  • HER-2 human epidermal growth factor receptor 2
  • W ⁇ 94 4 Z 0 0 1 3 6 human epidermal growth factor receptor 2
  • Japanese colon cancer tends to increase year by year, and the number of deaths is lung cancer and stomach It is in 3rd place. By age, 60s is the most common, followed by 50s and 70s.
  • the cause of the increase in colorectal cancer may be due to genetic factors or environmental factors, but it has been pointed out that it may be due to westernization of the diet, especially excessive consumption of animal fat.
  • Development of an effective molecular target drug for colorectal cancer is awaited.
  • about half of the tumor markers used for diagnosis (CEA, CA 19-9) are positive even in advanced colorectal cancer, with no organ specificity, and higher performance diagnostic agents. Development is desired. Disclosure of the invention
  • the present inventors have found that the gene that is frequently amplified in cancer (especially colorectal cancer) is the PPP 1 R 3 D gene. I found out. Furthermore, the present inventors have found that the proliferation of cancer cells can be suppressed by inhibiting the expression of PPP 1 R 3 D protein in colorectal cancer cell lines and cervical cancer cell lines. It came to complete. That is, the present invention provides a cancer therapeutic agent, a screening method for a candidate substance having a cancer-suppressing action, a cancer diagnostic agent, a cancer diagnostic kit, a cancer diagnostic method, and the like described below. provide.
  • a cancer therapeutic agent comprising, as an active ingredient, a substance that inhibits the expression of PPP1R3D gene.
  • the cancer therapeutic agent according to (1) above comprising a substance selected from the group consisting of: (3) A cancer therapeutic agent comprising a substance that inhibits the activity of PPP1R3D protein as an active ingredient.
  • the cancer therapeutic agent according to (3) above comprising a substance selected from the group consisting of:
  • a screening method comprising a step of selecting a compound that reduces the expression level as compared with a case where a test compound is not contacted.
  • a method for screening a PPP 1 R 3 D protein activity inhibitor (a) contacting the PPP 1 R 3 D protein with a test compound,
  • a screening method comprising the step of selecting a compound that binds to the PPP 1 R 3 D protein.
  • a cancer therapeutic agent comprising the antibody according to (9) above.
  • a cancer diagnostic agent comprising the antibody according to (9) above.
  • a cancer diagnostic agent comprising a base sequence that can be hybridized to a PPP 1 R3D gene or a part of the base sequence thereof under stringent high-precipitation conditions.
  • (2 7) A method for treating cancer, comprising a step of administering a PPP 1 R 3 D gene expression inhibitor to a patient.
  • a method for treating cancer comprising the step of administering to a patient an inhibitor of PPP 1 R 3 D protein activity.
  • a cancer therapeutic agent containing a PPP 1 R 3 D gene expression inhibitor as an active ingredient SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, Alternatively, a cancer therapeutic agent comprising a polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 8.
  • FIG. 1 is a histogram showing the frequency of PPP 1 R 3D gene versus the degree of gene amplification in 200 samples from colon cancer patients.
  • Figure 2 shows an optical micrograph (phase difference) showing the results of RNA i analysis when s 1 RNA of the PPP 1 R 3 D gene was transfected into the colon cancer cell lines DLD_1 and RKO E6. Image).
  • Figure 3 is a graph showing the results of quantitative RT-PCR evaluation of the RNA i effect when siRNA of the PPP 1 R 3 D gene was transfected into colon cancer cell lines DLD-1 and RKOE 6. is there.
  • Figure 4 is a graph showing the results of evaluating the RNA i effect by measuring the number of living cells when siRNA of the PPP 1 R 3 D gene was transfected into colon cancer cell lines DL D-1 and RKOE 6. It is.
  • Fig. 5 is an optical micrograph (fluorescence image) of a portion (6 cells) of cancer cells in a sample tissue derived from a colon cancer patient analyzed by the FISH method.
  • Figures 6A and B are graphs showing the results of (A) serum derived from a colon cancer patient and (B) serum derived from a healthy subject, respectively, analyzed by mass spectrometry.
  • 7A to C show the correspondence between the peak shown in FIG. 6 and amino acids (or amino acid sequences) determined by MS / MS analysis.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of verifying the RNAi effect by measuring the number of viable cells when sciRNA of the PPP1R3D gene was transfected into the cervical cancer cell line HeLa cell line.
  • Fig. 9 is an optical micrograph (differential interference image) showing the result of detailed observation of the dynamics of the experiment in Fig. 8 taken in a time-series and under a microscope.
  • the present inventors used a specimen derived from a colorectal cancer patient to verify the gene amplified by the array CGH method and to identify a gene amplification region specific to colorectal cancer.
  • the human PPP 1 R 3 D (.Proteinphosphatase 1, regu 1 atorysubunit 3 D) gene was found to be frequent in specimens from colon cancer patients. It was.
  • PPP1R3D PPP1R6 (Protein phosphatase 1 and regulatory subunit 3D) is a glycogen-binding protein that binds to protein phosphatase 1 (PP1) and participates in glycogen metabolism.
  • PP1 binds to more than 20 different proteins and is responsible for various intracellular regulation by dephosphorylation from reversibly phosphorylated proteins. For example, it regulates glycogen metabolism by glycogen binding protein, regulates muscle contraction by myosin binding protein, regulates in the nucleus, and changes its binding protein by signals from outside the cell.
  • glycogen binding protein regulates glycogen metabolism by glycogen binding protein
  • myosin binding protein regulates muscle contraction by myosin binding protein
  • PP 1 activates glycogen synthase by dephosphorylation and regulates glycogen synthesis.
  • glycogen binding subunits of PP1 including PPP1R6.
  • GM PPP1R3
  • GM PPP1R3
  • GM PPP1R3
  • PPP1R4 Liver-specific GL
  • PPP1R5 PPP1R3C
  • PPP1R3C PPP1R5
  • PPP1R3D PPP1R6
  • PPP1R6 is highly expressed in skeletal muscles and the heart, and has been reported to be expressed at moderate to low levels in other organs (brain, placenta, lung, liver, kidney, sputum) (Armstrong, CG, et al. (1997) FEBS Lett. 18, 210-214).
  • PPP1R3D PPP1R6
  • PPP1R6 PPP1R6
  • V / I XF-sequence
  • MAPKs Mitogen-act ivated protein kinases
  • S / T P-sequence
  • MAPK-activated protein kinase-2 MAPK-activated protein kinase-2
  • Calmodul in- There is a sequence consistent with the LXRXXSL-sequence (Stokoe, D., et al. (1993) Biochem. J.
  • colon cancer-derived cell lines (LOVO, KM12, COL0320), lung cancer-derived cell lines (H322, PC10, H157, SBC5, ⁇ 209), stomach cancer-derived cell lines ( ⁇ 7, ⁇ 0 ⁇ ), ovarian cancer-derived cell lines ( ⁇ 2780) , 2008) has been reported (Takakura, S., et al. (2001) Int. J. Oncology 18, 817-824)).
  • uterine cancer cell line HeLa cells there is a report that the induction of apoptosis by RNAi was 2.1 times that of the control (McKeigan, JP, et al. (2005) Nature Cell Biology). 7 (6), 591-600).
  • RNA i RNA NA interference
  • cancer can be treated by suppressing the expression of the PPP 1 R 3 D gene. It is also possible to diagnose cancer by measuring the expression level of the PPP 1 R 3 D gene.
  • the cancer therapeutic agent, screening method, diagnostic agent and the like of the present invention will be described in detail.
  • the present invention includes (1) a cancer therapeutic agent containing a PPP 1 R 3 D gene expression inhibitor as an active ingredient, and (2) a PPP 1 R 3 D protein activity inhibitor as an active ingredient. Provide cancer treatment.
  • PPP 1 R 3 D gene refers to a 3 4 8 1 base sequence registered under the Accession No .: N M — 0 0 6 2 4 2 on the NCBI nucleotide base.
  • G means PPP 1 R 3 D gene (SEQ ID NO: 1) (Armstrong, CG, et al. (1997) FEBS Lett. 418, 210-214), but is not limited to this.
  • the base of the gene A stringent hyperidase such as a variant that is altered by having one or more base substitutions, deletions, additions, or insertions in the sequence, or a complementary sequence thereof.
  • a gene consisting of a polynucleotide having a base sequence that can be highly pre-synthesized under a running condition is also included in the “PPP 1 R 3 D gene” used in this specification.
  • stringent conditions may be low stringent conditions, medium stringent conditions, or high stringent conditions.
  • Low stringency conditions are, for example, conditions at 5 XSSC, 5 X Denhal solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32.
  • “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42.
  • “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50. Under these conditions, it can be expected that DNA having high homology can be obtained efficiently as the temperature is increased. However, there are several factors that can influence the stringency of the hybridization, such as temperature, probe concentration, probe length, intensity, time, and salt concentration. The same stringency can be achieved by selecting it as appropriate.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 for example, 70 0 when calculated using the default parameters by homology search software such as FASTA and BLAST. % Or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 9 1% or more, 9 2% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96 Polynucleotides having% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more identity can be mentioned.
  • inhibition of gene expression means any event in a series of events from gene to protein production (for example, transcription (production of mRNA), translation (production of protein)) By inhibiting the production of the protein encoded by the gene.
  • PPP 1 R 3 D protein refers to the “Accession No .: NP” in the NC BI protein database.
  • a human PPP 1 R 3 D protein (SEQ ID NO: 2) consisting of 2 9 9 amino acid residues registered under 0 0 6 2 3 3 and an activity substantially equivalent to this protein (eg, PP1 binding activity, One or more activities selected from glycogen binding activity), and from amino acid sequences in which deletion, substitution, insertion, and / or addition of one or more amino acid residues to the amino acid sequence of this protein occurs.
  • a mutant protein consisting of 2 9 9 amino acid residues registered under 0 0 6 2 3 3 and an activity substantially equivalent to this protein (eg, PP1 binding activity, One or more activities selected from glycogen binding activity), and from amino acid sequences in which deletion, substitution, insertion, and / or addition of one or more amino acid residues to the amino acid sequence of this protein occurs.
  • the amino acid mutation site and number in the above mutant protein are not particularly limited as long as the mutant protein retains substantially the same activity as the original protein, but the number of mutations is, for example, 1 to 50.
  • the smaller the number of mutations the better.
  • such a mutant protein has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and about 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 9 2 % Or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more of amino acid sequences having identity
  • a protein having substantially the same activity as the original protein In general, the larger the homology value, the better.
  • the PPP 1 R 3 D protein includes a “partial peptide” of the PPP 1 R 3 D protein.
  • a partial peptide of the PPP 1 R 3 D protein a partial peptide consisting of a partial amino acid sequence of the amino acid sequence of the PPP 1 R 3 D protein (SEQ ID NO: 2) is preferable. Any one having the same activity as that of the aforementioned PPP 1 R 3 D protein may be used.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 at least 20, preferably at least 50, more preferably at least 70, more preferably at least 100, most preferably at least And a polypeptide having an amino acid sequence consisting of 20 amino acid residues.
  • these polypeptides are paired with a portion involved in the activity of the PPP 1 R 3 D protein. Contains the corresponding amino acid sequence.
  • the partial peptide used in the present invention is one or more of the above-mentioned polypeptides in the amino acid sequence (for example, about 1 to 20 and more preferably about 1 to 10). Further preferably, about 1 to 5 amino acid residues may be changed by deletion, addition, substitution, or insertion.
  • the PPP1R3D protein used in the present invention can be prepared from cells or tissues expressing the protein. These proteins can also be synthesized by a known peptide synthesizer, or prepared by a recombinant method using an appropriate host cell selected from prokaryotic organisms or eukaryotic organisms. Can do.
  • the P P.1 R 3 D protein used in the present invention may be derived from any species, but is preferably derived from human.
  • “Substantially the same activity” indicates that these activities are qualitatively equivalent. Therefore, the activities (PP1 binding activity, glycogen binding activity, etc.) are equivalent (for example, about 0.01 to: 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to However, quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different. These activities can be measured according to known methods described in the literature such as Armstrong, CG, et al. (1997) FEBS Lett. 418, 210-214. For example, screening methods described later are used. Can be measured according to
  • B LA ST and Gapped B LAS T programs the default parameters of each program are used.
  • cancer therapeutic agent includes anticancer agents, cancer metastasis inhibitors, cancer cell apoptosis inducers, cancer cell proliferation inhibitors, cancer cell infiltration inhibitors, cancer preventive agents, and the like. Used in meaning.
  • cancer (or cancer) and “tumor” are used as terms having the same meaning.
  • the present invention provides a cancer therapeutic agent containing a PPP 1 R 3 D gene expression inhibitor as an active ingredient.
  • PPP 1 R 3 D gene expression inhibitor is not limited as long as it inhibits the expression of the PPP 1 R 3 D gene.
  • PPP 1 R 3 D A substance that inhibits transcription from a gene to PPP 1 R 3 D mRNA
  • PPP 1 R 3 D mRNA a substance that inhibits translation from PPP 1 R 3 D mRNA to PPP 1 R 3 D protein.
  • substances that inhibit transcription from P P P 1 R 3 D gene to P P P 1 R 3 D mRNA include:
  • substances that inhibit translation from PPP 1 R 3 D mRNA to PPP 1 R 3 D protein include: (e) a polynucleotide having an RNA i action on PPP 1 R 3 D mRNA or a part thereof (for example, siRNA),
  • nucleic acid means R N A or DN A.
  • nucleic acid may contain not only purine and pyrimidine bases but also those with other heterocyclic bases that have been modified. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleosides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, for example, one or more hydroxyl groups are replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or ethers, amines, etc. It may be converted to a functional group.
  • RNA i is a phenomenon in which the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene are both inhibited when a double-stranded RNA having the same or similar sequence as the target gene sequence is introduced into the cell.
  • Examples of RNA used here include double-stranded RNA that causes RNA interference of 19 to 30 bases in length, such as ds RNA (doublestrand RNA), si RNA (small interfering RNA), or sh RNA ( shorthairpin RNA).
  • dsRNA doublestrand RNA
  • siRNA small interfering RNA
  • sh RNA shorthairpin RNA
  • the length of the double-stranded RNA that exhibits the RNAi effect used in the present invention is usually 19 to 30 bases, preferably 20 to 27 bases, more preferably 21.
  • ⁇ 25 salt most preferably 21-23 bases.
  • si R N A used in Example 3
  • antisense nucleic acid or “antisense polynucleotide” is complementary to at least a portion of a DNA region of interest.
  • the antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • the antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA). They may be double stranded DNA, single stranded DNA, double stranded RNA, single stranded RNA, or even a DNA: RNA hybrid.
  • modified nucleic acids include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and those that are resistant to degradation of polynucleotide amides and oligonucleotide amides. is not.
  • the antisense nucleic acid to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side.
  • the nucleic acid thus prepared can be transformed into a desired animal using a known method.
  • the sequence of the antisense nucleic acid is preferably a sequence complementary to the endogenous gene of the animal to be transformed or a part thereof, but is completely complementary as long as the gene expression can be effectively suppressed. It doesn't have to be.
  • an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 'end of the mRNA of the PPPP1R3D gene is effective in inhibiting gene translation.
  • a sequence complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used.
  • Antisense nucleic acid effective for inhibiting gene translation is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more of the transcript of the target gene. % Complementarity.
  • the length of the antisense nucleic acid is at least about 10 bases (for example, about 10 to 40 bases), preferably about 15 bases or more. More preferably about 100 bases or more, and still more preferably about 500 bases or more.
  • Antisense nucleic acids can be designed with reference to known literature (for example, Hirashima and Inoue, Laboratory for Neonatal Chemistry 2 Replication and Expression of Nucleic Acid ⁇ V Gene, edited by The Japanese Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin, 1 9 9 3, p. 3 1 9 ⁇ 3 4 7), J. Kawakamieta 1, V ol. 8, p. 2 4 7, 1 9 9 2; V o 1.8, p. 3 9 5, 1 9 9 2; S. T. C rookeetal., Ed , Antisense Research and Applications, CRCP ress, 1 9 9 3 etc.).
  • a nucleic acid having a lipozyme activity that specifically cleaves a transcription product of a PPP 1 R 3D gene can be used as an active ingredient.
  • ribozyme activity refers to a nucleic acid that cleaves site-specifically mRNA, which is a transcription product of a target gene. Ribozymes have a strength of 40 nucleotides or more, such as the group I intron type and MRNA contained in RNase P. The hammerhead type is about 40 nucleotides called the hairpin type. Some have an active domain (protein nucleic acid enzyme, 1990, 35, p. 2 191).
  • FEBSL ett 1 9 8 8, 2 2 8, p. 2 2 8; FEBSL ett, 1 9 8 8, 2 3 9, p. 2 8 5; protein Reference can be made to nucleic acid enzymes, 1 990, 3 5, p. 2 1 9 1; Nucl Acids Res, 1 9 8 9, 1 7, p.
  • hairpin ribozymes see, for example, Nature, 1 986, 3 2 3, p. 3 4 9; Nuc 1 A cids R es, 1 9 9 1, 1 9, p. 6 7 5 1; You can refer to Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology, 1 992, 30, p.
  • a compound other than a nucleic acid that inhibits the transcriptional activity of the PPP 1 R 3 D gene can be used as an active ingredient.
  • Such compounds bind to factors involved in the expression and transcription of the PPP 1 R 3 D gene, for example. It is a compound.
  • Such a compound may be a natural product or a synthetic compound.
  • Such a compound can be obtained by the screening method described below. 1. 2 Cancer treatments containing inhibitors of PPP 1 R 3 D protein activity
  • the present invention also provides a cancer therapeutic agent containing a PPP 1 R 3 D protein activity inhibitor.
  • inhibitors of P P P 1 R 3 D protein activity include, for example,
  • antibody means an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, as long as it binds to the PPP 1 R 3 D protein of the present invention, in addition to the polyclonal antibody and the monoclonal antibody described above, a human antibody, a human recombinant human form Antibodies, antibody fragments thereof, and modified antibodies are also included.
  • Antibodies that bind to PPP1R3D protein can be prepared by methods known to those skilled in the art. Details of the anti-PPPP1R3D antibody will be described later.
  • a PPP 1 R 3 D protein mutant having a dominant negative property with respect to the PPP 1 R 3 D protein refers to an endogenous wild-type PPP by expressing a gene encoding the same. 1 Refers to a protein that has the function of eliminating or reducing the activity of R 3 D protein (Kunihiro Tsuchida, Gene Activity Inhibition Experiment, edited by Yoshikazu Tahira, Yodosha (see 2 0 0 1) 2 6-3 2 etc.).
  • a compound other than the above antibody or mutant that binds to the PPP 1 R 3 D protein can be used as an active ingredient.
  • a compound is, for example, a compound that binds to the PPP 1 R 3 D protein and inhibits its activity.
  • Such compounds may be natural products or synthetic compounds.
  • Such a compound can be obtained by the screening method described below.
  • the above-mentioned substance capable of inhibiting the activity of the PPP1R3D protein of the present invention can be used as a cancer therapeutic agent.
  • the present invention also provides a method for screening a candidate compound having a cancer suppressing action.
  • One preferred embodiment is a method using as an index the binding between the PPP 1 R 3 D protein and the test compound.
  • a compound that binds to PPP1R3D protein is expected to have an effect of inhibiting the activity of PPPP1R3D protein.
  • P P P 1 R 3 D protein is contacted with a test compound.
  • the PPP 1 R 3 D protein may be a purified form of the PPP 1 R 3 D protein, for example, a form expressed intracellularly or extracellularly, depending on the indicator for detecting binding to the test compound. Or it can be in the form of an affinity ram.
  • the test compound used in this method can be appropriately labeled as necessary. Examples of the label include a radiolabel and a fluorescent label.
  • test compound used for this method.
  • natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, peptides, etc. as well as compound libraries, gene library expression products, cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, oceans Examples include, but are not limited to, biological extracts and plant extracts.
  • the binding between the PPP1R3D protein and the test compound can be detected by, for example, a label attached to the test compound bound to the PPP1R3D protein.
  • a change in the activity of the PPP1R3D protein caused by the binding of the test compound to the PPP1R3D protein expressed inside or outside the cell can also be detected as an index.
  • the binding activity between a protein and a test compound can be measured by a known method (for example, measurement such as PP1 binding activity, glycogen binding activity (Armstrong, CG, et al. (1997) FEBS Lett 418, 210-214)).
  • test compound that binds to PPP 1 R 3 D protein and inhibits its activity is then selected.
  • the compound isolated by this method is expected to have a cancer suppressing action and is useful as a cancer therapeutic agent.
  • Another embodiment of the screening method of the present invention is a method using the expression of the PPP 1 R 3 D gene as an index.
  • a test compound is brought into contact with a cell expressing the PPP 1 R 3 D gene.
  • the origin of the “cell” used include, but are not limited to, cells derived from pets, livestock, etc. such as humans, mice, cats, cats, dogs, lions, hedgehogs, and birds.
  • PPP 1 R 3 D gene-expressing cell refers to a cell expressing an endogenous PPP 1 R 3 D gene or an exogenous PPP 1 R 3 D gene introduced and the gene is expressed. Cells can be used. Cells in which an exogenous PPP 1 R 3 D gene is expressed can usually be prepared by introducing an expression vector into which a PPP 1 R 3 D gene has been inserted into a host cell. The expression vector is produced by general genetic engineering techniques. Can be made.
  • test compound used in this method is not particularly limited.
  • natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, single compounds such as proteins and peptides, compound libraries, expression products of gene libraries, Cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, etc. are used.
  • Contacting a test compound with cells expressing the PPP 1 R 3 D gene is usually performed by adding the test compound to the culture medium of cells expressing the PPP 1 R 3 D gene, respectively. I'm not limited to this method.
  • the test compound is a protein or the like
  • “contact” can be performed by introducing a DNA vector that expresses the protein into the cell.
  • the expression level of the PPP 1 R 3 D gene is then measured.
  • gene expression includes both transcription and translation.
  • the expression level of the gene can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, mRNA is extracted from cells expressing the PPP 1 R 3D gene according to a conventional method, and transcription of the gene is carried out by performing Northern hybridization or RT-PCR using this mRNA as a cocoon. Level measurements can be made.
  • the promoter region of the PPP 1 R 3 D gene is isolated according to a conventional method, and a gene that can be detected downstream using a labeled gene (for example, luminescence, fluorescence, color development, etc.
  • the transcription level of the gene can also be measured by observing the activity of the marker gene.
  • protein fractions are collected from cells expressing the PPP 1 R 3 D gene, and the expression level of the PPP 1 R 3 D protein is detected by electrophoresis such as SDS-PAGE. Can also be done.
  • PPP 1 R 3 The antibody used for detection of D protein is not particularly limited as long as it is a detectable antibody. For example, both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used.
  • a compound that decreases the expression level is then selected as compared with the case where the test compound is not contacted (control).
  • Compounds selected in this way become candidate compounds for cancer therapeutics.
  • the present invention also provides an anti-PPPP1R3D antibody, a cancer therapeutic agent containing the antibody, and the like.
  • the cancer therapeutic agent is used for targeted therapy or targeted drug delivery of cancer.
  • anti-PPP 1 R 3D antibody includes an antibody that specifically binds to a PPP 1 R 3 D protein (including fragments (partial peptides) or salts thereof).
  • the anti-PPP 1 R 3D antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the class of the antibody is not particularly limited, and includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE. IgG or IgM is preferable, and IgG is more preferable in consideration of ease of purification.
  • antibody used herein is used to include any antibody fragment or derivative.
  • F ab, F ab ' 2 , CDR humanized antibody, multifunctional antibody, single chain antibody (Sc FV).
  • the antibody of the present invention can be produced by a known method. Methods for producing such antibodies are well known in the art (see, for example, Harrowow E. & Lane D., Antibody, Cold Spring Harbor Laboratory Pres (1 9 8 8))).
  • the protein used as the sensitizing antigen is usually P P P 1 R 3 D protein or a salt thereof.
  • the PPP 1 R 3 D protein includes a partial peptide thereof, which is not limited to, for example, a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, 20 These are partial peptides having 40 or more, 60 or more, 80 or more, 100 or more consecutive amino acid sequence portions. As these fragments, for example, amino (N) terminal fragment and carboxy (C) terminal fragment are used.
  • one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 6)) amino acid residues in the amino acid sequence are deleted. It may be a substitution, insertion and / or addition.
  • salts of the PPP 1 R 3 D protein or partial peptide thereof used herein include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, sulfuric acid), or salts with organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid). Etc. are used.
  • the PPP 1 R 3 D protein of the present invention used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is not limited to the animal species from which it is derived, but is preferably a protein derived from a mammal such as a mouse or human, particularly from human. Protein is preferred.
  • PPP 1 R 3 D protein a partial peptide thereof or a salt thereof (in the present specification, these are collectively referred to as “PPP 1 R 3 D protein”) as an antigen.
  • Administer to animals such as rats, mice, and rabbits.
  • the antigen dose per animal is 0.1 to 1 when no adjuvant is used! OO mg, l to 100 g when adjuvant is used.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Immunity is It is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally.
  • the immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 2 to 5 weeks. Then, antibody-producing cells are collected 1 to 60 days after the last immunization day, preferably 1 to 14 days later.
  • antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, and peripheral blood cells, and spleen cells or local lymph node cells are preferred.
  • Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed in order to obtain a hybridoma.
  • Generally available cell lines of animals such as mice can be used as the myeloma cells to be fused with antibody-producing cells.
  • the cell line to be used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells.
  • HAT selection medium including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine
  • myeloma cells include mouse myeloma cell lines such as X 6 3 A g. 8. 65 3, NSIZ 1—A g 4-1, NS 0-1 and rat myeloma cell lines such as YB 2-0. It is done.
  • Cell fusion consists of 1 XI 0 6 to 1 XI 0 7 ml antibody-producing cells and 2 X 1 0 5 to 1 in animal cell culture media such as serum-free DM EM, RPMI — 1 6 40 2 X 1 0 6 or Roh m 1 of the myeloma cells were mixed (antibody producing cells and the myeloma cells cell ratio 2: 1 to 3: 1 is preferred), under the promoter present cells fused fusion reaction I do.
  • the cell fusion promoter polyethylene dalycol having an average molecular weight of 1000 to 600,000 Dalton can be used.
  • antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device using electrical stimulation (for example, electoral position).
  • the screening for hybridomas is not particularly limited, as long as the usual method is followed.
  • a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma can be collected and screened by an enzyme immunoassay, a radioimmunoassay, or the like. Cloning of fused cells is performed by limiting dilution.
  • a hybridoma which is a cell producing a monoclonal antibody that reacts with the PPP 1 R 3 D protein, is established.
  • a normal cell culture method As a method for collecting a monoclonal antibody from the hybridoma obtained as described above, a normal cell culture method, ascites formation method, or the like can be employed.
  • hypridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium, MEM medium or serum-free medium containing 10% urushi fetal serum under normal culture conditions (for example, 37) 5% C_ ⁇ 2 concentration) 7 cultured ⁇ 1 4 days to obtain the culture supernatant antibody.
  • an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium, MEM medium or serum-free medium containing 10% urushi fetal serum under normal culture conditions (for example, 37) 5% C_ ⁇ 2 concentration) 7 cultured ⁇ 1 4 days to obtain the culture supernatant antibody.
  • intraperitoneally mammalian the same species animal-derived myeloma cells administered eight drive re dormer about 1 XI 0 7 cells is mass proliferating High Priestess do
  • the above antigen is used in mammals such as rats, mice, and rabbits. To be administered.
  • the dose of antigen per animal is 0.1 to LOO mg when no adjuvant is used, and 10 to 100 g when adjuvant is used.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally. Further, the immunization interval is not particularly limited, and immunization is carried out 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 2 to 5 weeks.
  • enzyme immunoassay enzyme immunoassay (ELISA (enz ume— 1 inked mmu nosorbentassy) or EIA (enz ym ei mm unoassay)
  • RIA radioimmunoassay
  • the polyclonal antibody in the antiserum is applied to an affinity column fixed with ⁇ ⁇ ⁇ 1 R 3 D protein, and the antibody that reacts with ⁇ ⁇ ⁇ 1 R 3 D protein (column adsorbed fraction) is collected. To do.
  • the reactivity of the polyclonal antibody in the antiserum against P P P 1 R 3 D protein can be measured by the ⁇ L I S method.
  • the F ab or F ab ' 2 fragment can be prepared by digestion with a conventional protease (eg, pepsin or papain).
  • a conventional protease eg, pepsin or papain.
  • Humanized antibodies are described, for example, by Riec hma nn et al. (Riec hma nn JM o 1 B iol. O ct 5; 2 0 3 (3): 8 2 5-8 1 9 8 8), and J ones et al. Jones et al. Nature 3 2 1: 5 2 2-5 2 5, 1 986 6).
  • Chimeric antibodies include, for example, “Experimental Medicine (Special Issue), Vol. 1. 6, No. 10, 1 9 8 8”, Japanese Patent Publication No. 3-7 3 2 80, etc. Humanized antibodies are described in, for example, “Nature Genetics, Vol. 1 5, p. 1 4 6-1 5 6, 1 9 9 7 ”,“ Nature Genet
  • the antibody that binds to the PPP1R3D protein of the present invention can be used for the purpose of, for example, suppressing the proliferation of cancer cells or metastasis.
  • a human antibody or a human antibody is preferred in order to reduce immunogenicity.
  • the antibody When used as a diagnostic agent, the antibody may be labeled with a labeling substance for monitoring (eg, radioisotopes, fluorescent substances, etc.) ⁇ If necessary, label with radioactive substances, fluorescent compounds, etc. can do.
  • a labeling substance for monitoring eg, radioisotopes, fluorescent substances, etc.
  • label with radioactive substances, fluorescent compounds, etc. can do.
  • fluorescent labeling compounds are fluorescein isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin and fluorescamine, as well as using a bioluminescent compound to label the antibody PPP 1 R 3 D antibody You can also.
  • the presence of a bioluminescent protein is measured by detecting the presence of fluorescence.
  • Important bioluminescent compounds for this purpose are luciferin, luciferase and aequorin.
  • the antibody of the present invention also t can be used to specifically detect the PPP 1 R 3 D protein or the like present in test samples such as body fluids or tissues, the PPP 1 R 3 D protein or the like For preparation of antibody column used for purification, detection of PPP 1 R 3 D protein, etc. in each fraction during purification, analysis of PPP 1 R 3 D protein behavior in the test cells, etc. Can be used for
  • the anti-PPP 1 R 3 D antibody used in the present invention itself may decrease the activity of the antigen in the therapeutic agent or diagnostic agent of the present invention. It can be an agent having a neutralizing activity, but can be used in combination with other agents for producing a therapeutic effect, if necessary. Therefore, the present invention provides, in another aspect, a combination of an anti-PPPP 1 R 3 D antibody and another drug for use in targeted therapy or targeted imaging of cancer (eg, colorectal cancer). And compositions containing such complexes are also provided. According to such an embodiment, the anti-PPP 1 R 3 D antibody used in the present invention is used to label other drugs having a therapeutic effect or a labeling agent for diagnosis, and the PPP 1 R 3 D protein. It can be delivered to highly expressed target sites.
  • Examples of the “other drug” used in the present invention include a viral vector or a non-viral vector for introducing a gene into a target, such as a radioisotope, a therapeutic protein, or a small molecule drug. .
  • examples of the “radioisotope” include radioactive halogen elements such as fluorine-18, iodine- 125 (1251), and iodine-1311. These radioactive halogen elements can also be widely used as radiotherapeutic agents or radiodiagnostic agents by labeling them with antibodies or peptides in the same manner as the above-mentioned radioactive metal elements. For example, 1 25 I or 1 3 1 ® over de of the I by known methods chloramine T method or the like, can be attached to an antibody or antibody fragment.
  • yttrium 1 90 9 0 Y
  • rhenium 1 1 8 6 1 8 6 R e
  • rhenium— 1 8 8 1 88 Re
  • metal chelator When labeling an antibody with a radioactive isotope, a metal chelator is usually used.
  • metal chelating agents include EDTA, DTPA, diaminodithio compound, cyclam, and D0TA.
  • chelating agents may be pre-bonded to the antibody and then labeled with a radioactive metal, or there may be a method of forming a radioactive metal chelate and then binding to the antibody and labeling.
  • site-in force that activates cells responsible for immunity is preferable.
  • toxins such as ricin and diphtheria toxin can be used to directly kill colon cancer cells.
  • a cDNA encoding the fusion protein is constructed by linking the cDNA encoding the therapeutic protein to the cDNA encoding the antibody or antibody fragment, and this DNA is either prokaryotic or eukaryotic.
  • a fusion antibody can be produced by inserting the expression vector into a biological expression vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • “Small molecule drug” is used herein to mean a diagnostic or therapeutic compound other than “radioisotope” or “therapeutic protein”.
  • small molecule drugs include alkylating agents such as nitrogen mustard and cyclophosphamide, antimetabolites such as 5-fluorouracil and mesotrexe, daunomycin, bleomycin, mitomycin C, daunorubicin, Anti-cancer drugs such as antibiotics such as doxorubicin, plant alcohols such as vincristine, vinblastine, vindesine, hormonal drugs such as evening moxifen, dexamethasone (Clinical Oncology (Edited by Japan Clinical Oncology Society 1 9 9 6) Chemotherapy Inc.)), or steroids such as hyethcortisone, prednisone, non-sterolides such as aspirin, indomethacin, immunoregulators such as gold chimare, penicillamine, cyclophosphine Immunosuppression such
  • daunomycin and antibody can be bound by binding between daunomycin and the amino group of the antibody via glutaraldehyde, or by binding the amino group of daunomycin and the carboxyl group of the antibody via water-soluble carpositimide. How to make Etc.
  • a viral vector modified so as to bind to the anti-PPP 1 R 3 D antibody of the present invention can be used (for example, adenoviral vector (Wang, P., eta 1. ( 1 9 9 5) Soma tic Celand Molec. Genet. 2 1, 4 2 9-44 1), retroviral vector (Naviaux RK, eta 1. (1 9 9 6) J. Virol 7 0 , 5 7 0 1-5 7 0 5), and lentiviral vectors (N aldini, L. (1 9 9 8) Curr. O pin.
  • adenoviral vector Wang, P., eta 1. ( 1 9 9 5) Soma tic Celand Molec. Genet. 2 1, 4 2 9-44 1
  • retroviral vector Naviaux RK, eta 1. (1 9 9 6) J. Virol 7 0 , 5 7 0 1-5 7 0 5
  • lentiviral vectors N aldini, L. (1 9 9 8) Cur
  • B iotechno include 9, 4 5 7-4 6 3)
  • Such viral vectors include cell proliferation-related genes, apoptosis-related genes, immune regulatory genes, and other target sites (eg, colon cancer), for example, to induce apoptosis of cancer cells.
  • a gene that produces a therapeutic effect is incorporated.
  • a viral vector that binds to an anti-PPP 1 R 3 D antibody, when administered together with an anti-PPP 1 R 3 D antibody to a patient in need of gene therapy, ie, an antigen recognized by the anti-PPP 1 R 3 D antibody (ie, PPP 1 R 3 D) can be targeted to the existing site.
  • the anti-PPPP1R3D antibody and the other drug can be combined chemically or genetically.
  • “chemical bond” includes ionic bond, hydrogen bond, covalent bond, bond by intermolecular force, bond by hydrophobic interaction, etc.
  • “gene engineering bond” For example, when the fusion protein consisting of an antibody and a therapeutic protein is produced using a technique such as genetic recombination, the binding mode between the antibody and the therapeutic protein is included. To do.
  • Therapeutic agent containing a PPP 1 R 3 D gene expression inhibitor of the present invention a cancer therapeutic agent containing a PPP 1 R 3 D protein activity inhibitor, the anti-PPP 1 R 3 of the present invention
  • Anti-PPP 1 R 3D antibody to be used is either a viral or non-viral vector carrying a radioisotope, therapeutic protein, small molecule drug, and therapeutic gene, or any combination of these and chemical
  • a therapeutic agent that has been genetically engineered can be formulated based on a known method.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be added as necessary according to a conventional method.
  • surfactants for example, surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity promoters, taste masking
  • the present invention is not limited to these, and other commonly used carriers can be appropriately used.
  • Examples of the dosage form of the therapeutic agent of the present invention include tablets, powders, pills, powders, granules, fine granules, soft * hard capsules, film coating agents, and pellets as oral preparations.
  • Agents, sublingual agents, pastes, etc., parenteral agents include injections, suppositories, transdermal agents, ointments, plasters, liquids for external use, etc.
  • the optimum dosage form can be selected.
  • An inhibitor of PPP1R3D protein activity (or expression of PPP1R3D gene) as an active ingredient may be contained in the preparation in an amount of 0.1 to 99.9% by weight.
  • the dose of the active ingredient of the drug of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., but in the case of oral administration, for example, generally for patients (as 60 kg) About 0. l mg per day :: I, 0 00 mg, preferably about 1.0: L 0 0 mg, more preferably about 1.0 to 50 mg It is.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc.
  • the patient (for 60 kg) ) About 0.1 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg is preferably administered intravenously. is there.
  • the final decision can be made as appropriate based on the judgment of a doctor or veterinarian in consideration of the type of dosage form, administration method, patient age and weight, patient symptoms, and the like.
  • the preparations thus obtained should be administered to, for example, humans and other mammals (eg rats, rabbits, hidges, bushes, bushes, cats, dogs, monkeys, etc.) Can do.
  • mammals eg rats, rabbits, hidges, bushes, bushes, cats, dogs, monkeys, etc.
  • An amount converted per 60 kg can be administered.
  • the therapeutic agent of the present invention is cancer (for example, colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder).
  • cancer for example, colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder.
  • Prevention / treatment of uterine cancer eg cervical cancer, uterine body cancer
  • testicular cancer thyroid cancer
  • knee cancer ovarian cancer
  • brain tumor blood tumor, etc.
  • the agent of the present invention is a P P P 1 R 3 D protein activity inhibitor or P
  • the agent of the present invention may contain both a PPP 1 R 3 D protein activity inhibitor and a P P P 1 R 3 D gene expression inhibitor.
  • the antisense nucleic acid when used, the antisense nucleic acid is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, or the like. Thereafter, it can be administered according to known means.
  • Antisense nucleic acids can be used alone or with a physiologically recognized carrier. They can also be formulated and administered via a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter.
  • a combination of a virus vector such as a recombinant adenovirus particle and an anti-PPP 1 R 3 D antibody when used for cancer treatment, these may be used alone, Is used with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a carrier a carrier as described above and a water isotonic solution such as water, physiological saline, glucose, and human albumin are preferable.
  • additives, preservatives, preservatives, balance, etc. that are usually used in pharmaceutics can also be added.
  • the pharmaceutical composition thus prepared can be administered by an appropriate administration form and administration route depending on the disease to be treated. Examples of dosage forms include emulsions, syrups, capsules, tablets, granules, injections, ointments and the like.
  • Anti-P of the present invention include emulsions, syrups, capsules, tablets, granules, injections, ointments and the like.
  • PP 1 R 3D antibody When administering viral vector particles or pharmaceutical compositions containing them for treatment, it is usual to administer 10 3 to 10 15 viral particles at a time per adult. Is preferred, but may vary depending on the disease state and the target cell 'tissue properties.
  • the administration frequency may be once to several times a day, the administration period may be from 1 day to several months or more, and one to several doses are set as one set, and many sets are administered intermittently over a long period of time May be.
  • the virus vector particles or virus vector nucleic acid molecules used in the present invention can be used for detection of specific cells and / or tissues, or diagnosis of disease states.
  • a viral vector particle obtained by incorporating a detectable marker gene into a nucleic acid molecule of a viral vector and transfecting it into an appropriate host cell can be combined with an anti-PPP 1 R 3 D antibody in tumor cells.
  • an anti-PPP 1 R 3 D antibody in tumor cells.
  • the present invention also provides a diagnostic agent for cancer.
  • the cancer diagnostic agent of the present invention comprises: (a) an antibody against the PPP 1 R 3 D protein, or (b) a stringent hybridization with the PPP 1 R 3 D gene or a partial nucleotide sequence thereof. It contains a polynucleotide comprising a base sequence that can hybridize under conditions.
  • the diagnostic method using the anti-PPP 1 R 3 D antibody of the present invention includes, for example, (a) a step of contacting a biological sample derived from a subject with an antibody against the PPP 1 R 3 D protein, and (B) detecting and / or quantifying the binding between the antibody in the sample and the PPP 1 R 3 D protein or its partial peptide or salt thereof.
  • the labeled anti-PPP 1 R 3 D antibody is used to detect the binding between the PPP 1 R 3 D protein or a fragment thereof and the anti-PPP 1 R 3 D antibody. And / or quantified.
  • subject-derived biological sample refers to a subject-derived tissue, cell, or body fluid (for example, blood (including whole blood, plasma, serum, etc.), urine, lymph, saliva, sweat, semen, etc. ) including.
  • a “subject” is usually a human subject who is or is expected to undergo a cancer screening, such as a human subject who has or is suspected of having cancer. included.
  • cancers examples include colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, Uterine cancer (example: cervical cancer, endometrial cancer), testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc., especially colorectal cancer preferable.
  • Immunoassays to detect the expression of PPP 1 R 3 D in a biological sample from a subject as described above are suspected of having cancer (eg, colorectal cancer).
  • a biological sample taken from a subject at risk of cancer is contacted with an anti-PPPP 1 R 3 D antibody under conditions that produce specific antigen-antibody binding, and then immunospecific binding by the antibody Includes measuring the amount.
  • Such antibody binding is used to detect the presence and / or increased expression of the PPP 1 R 3 D protein.
  • detection of increased PPP 1 R 3 D protein expression is an indicator of disease state.
  • the level of PPP 1 R 3 D protein in the biological sample may be compared with the level of a healthy person who does not have cancer.
  • a biological sample such as a serum sample is contacted with a solid support or carrier such as nitrocellulose for the purpose of immobilizing all proteins present in the sample.
  • the support is then washed with buffer and subsequently treated with detectably labeled anti-PPPP1R3D antibody.
  • the solid support is then washed twice with buffer to remove unbound antibody.
  • the amount of bound antibody on the solid support is measured according to well-known methods. Detection conditions suitable for each measurement can be appropriately determined by those skilled in the art using conventional test methods.
  • the antibody is conjugated to an enzyme, such as that used in the enzyme immunoassay (EIA) [V oi 1 er, “Enzyme-labeled immunosorbent assay” (ELISA), 1 9 7 8, Diagnostic Horizons, 2: 1-7, M icrobiological A ssociates Q uarterly Pub 1 ication, Walkersvi 1 1 e. MD; J. CI in. Pat.
  • EIA enzyme immunoassay
  • Enzymes that can be used to attach a detectable label to an antibody include, but are not limited to, peroxidase and alkaline phosphatase. This detection can also be achieved by a colorimetric method using a chromogenic substrate for the enzyme.
  • RIA radioimmunoassay
  • sandwich immunoassay immunometric method
  • FIA fluorescence immunoassay
  • TRFIA time-resolved fluorescence immunoassay
  • EIA enzyme Immunoassay
  • LIA Luminescent immunoassay
  • ELIA Electrochemiluminescence immunoassay
  • Latex agglutination Immunoprecipitation Atssey, Precipitation reaction, Gel diffusion precipitation reaction, Immunodiffusion assay
  • Examples include an agglutination assay, a complement binding assay, an immunoradiometric assay, a fluorescence immunoassay, and an immunoassay selected from the group consisting of protein A immunoassay (WO 0 0Z 1 4).
  • 2 2 7 Gazette page 39, line 25, 4 to page 4, 2nd line, line 8, EP 1 1 1 1 04 7 A, paragraph 2, [0 1 1 5], page 19, line 3 to line
  • various diseases related to PPP 1 R 3 D protein dysfunction can be diagnosed. can do. For example, if an increase in the concentration of PPP 1 R 3 D protein is detected, for example, the disease may be caused by overexpression of PPP 1 R 3 D protein (eg, cancer (eg, large intestine cancer)) Can be diagnosed as being highly prone or likely to be affected in the future.
  • PPP 1 R 3 D protein eg, cancer (eg, large intestine cancer)
  • the anti-PPP 1 R 3D antibody of the present invention can also be used for in vivo diagnosis.
  • the preparation and use of antibody preparations that can be used herein are well known in the art.
  • antibody-chelating agents are described in Nuc 1. Med. Biol. 1 9 9 0 1 7: 24 7- 2 54.
  • a probe or primer designed based on the base sequence of the PPP 1 R 3 D gene can be used.
  • a diagnostic method can, for example, (a) be hybridized under a high-hydidization condition that is stringent in the biological sample derived from the subject and the base sequence of the PPP 1 R 3 D gene or a fragment thereof.
  • quantifying can, for example, (a) be hybridized under a high-hydidization condition that is stringent in the biological sample derived from the subject and the base sequence of the PPP 1 R 3 D gene or a fragment thereof.
  • the DNA (or gene fragment thereof) of the PPP 1 R 3 D gene in a biological sample derived from a subject is detected and determined or quantified using the probe.
  • the length of the base sequence used as a probe is, for example, 12 bases or more, 15 bases or more, 18 bases or more, 21 bases or more, 24 bases or more, 27 bases or more, 30 bases or more, or even longer It can be a polynucleotide fragment.
  • low, medium or high stringency conditions as described above may be used.
  • “a base sequence that can be hyperpredified under a high predation condition that is stringent to the base sequence of the PPP 1 R 3 D gene or a fragment thereof” includes the PPP 1 R 3 D gene.
  • a base sequence (antisense polynucleotide) complementary to the base sequence of the fragment is also included.
  • Methods of probe and nucleic acid hydridization are known to those skilled in the art, for example, WO 8 90 6 6 98, EP—A 0 2 0 0 3 6 2, US Pat. No. 2, 9 1-5, 0 8 2, EP—A 0 0 6 3 8 7 9, EP—A 0 1 7 3 2 5 1, EP—A 0 1 2 8 0 1 8.
  • a polynucleotide probe or primer can be used to detect or quantify the target sequence using known techniques.
  • Such known methods include, for example, Southern hybridization, Northern hybridization, RT-PCR method, PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, 8 7 4-8 7 9 (1 9 8 9)), Proceedingsofthe National Academy or Sciences of United States of America, Vol. 8 6, 2 7 6 6-2 7 7 0 (1 9 8 9) ), FISH method, DNA chip or array CGH (Combolic Genetic Hybridization) method can be used. Quantitative detection can be performed by quantitative RT-PCR.
  • the array C GH method applies the chromosome C GH method (K allioniemi, A. eta 1. (1 9 9 2) Science 2 5 8, 8 1 8-8 2 1); Using a DNA chip in which genomic DNA fragments (BAC, PAC, YAC, etc.) covering the chromosomal region are densely spotted, the cancer-derived DNA and normal DNA labeled with different dyes are placed on the slide. This is a method to detect DNA copy number abnormalities in cancer with high resolution by simultaneously hybridizing to the genomic DNA fragment and detecting its binding state (Pinke 1, D. eta 1. (1 9 9 8) N at. G enet. 2 0, 2 0 7-2 1
  • the mRNA level of the PPP 1 R 3 D in the cell is determined based on the standard gene (housekeeping gene (eg, S haper, N. L. et al., J. Mammary G land B iol. N eop 1 asia 3 (1 9 9 8) 3 1 5-3 2 4; Wu, YY and Rees, J. L., A cta D erm: V enereol. 8 0 (2 0 0 0) 2— 3) mRNA levels and preferably RT-PCR Can also be compared.
  • the standard gene housekeeping gene (eg, S haper, N. L. et al., J. Mammary G land B iol. N eop 1 asia 3 (1 9 9 8) 3 1 5-3 2 4; Wu, YY and Rees, J. L., A cta D erm: V enereol. 8 0 (2 0 0 0) 2—
  • the target sequence (DNA, mRNA, etc.) is detected and quantified by the method described above and overexpression of the PPP 1 R 3 D gene is confirmed, for example, overexpression of PPP 1 R 3 D It can be diagnosed that there is a high possibility that the disease is caused (for example, cancer (eg, colorectal cancer)) or that the disease is likely to be affected in the future.
  • cancer eg, colorectal cancer
  • the presence of the target protein or fragment thereof in the test sample can be identified using a mass spectrometer (MS). That is, by using a mass spectrometer, the amino acid sequence of a target protein or a fragment thereof can be determined, and it is determined whether or not a PPP 1 R 3 D protein is present in a biological sample derived from a subject. can do.
  • Mass spectrometry is a method for determining the mass of a sample by ionizing a sample such as a protein or peptide using MS, separating it according to the obtained mass Z charge (mZz), and measuring its intensity. . From the results of mass spectrometry, individual amino acids constituting the amino acid sequence of proteins and peptides can be identified.
  • MALD I matrix assisted laser desorption
  • ESI electrospray ionization
  • EI gas phase
  • FD field desorption
  • MALDI matrix assisted laser desorption
  • ESI electrospray ionization
  • FD field desorption
  • MALDI matrix assisted laser desorption
  • ESI electrospray ionization
  • EI gas phase
  • FD field desorption
  • MALDI matrix assisted laser desorption
  • ESI electrospray ionization
  • CI gas phase
  • FD field desorption
  • LC-ESI MSZMS Q-T FMS
  • MALD I-TO FMS etc.
  • amino acid sequencing methods using sequencers eg, gas phase sequencers
  • the present invention also provides a kit for detecting and Z or quantifying a PPP 1 R 3 D protein or a fragment thereof in a body fluid sample of a subject containing an anti-PPP 1 R 3 D antibody as a cancer marker. . Furthermore, the PPP 1 R 3 D gene or the PPP 1 R 3 D gene in a biological sample derived from a subject, which contains a base sequence that can be hybridized under high hybridization conditions, to the base sequence of the PPP 1 R 3 D gene or a part thereof. It also provides a kit for detecting and quantifying the fragment as a single cancer. These kits are used to detect cancer markers by the above-described immunological techniques or hyperpredation methods.
  • cancers examples include colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, and uterus.
  • cervical cancer, endometrial cancer testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc., but colorectal cancer is particularly preferred.
  • cancer marker refers to a subject's body fluid (eg, blood, urine, lymph, saliva, sweat, semen, etc.) or cells or tissues that are not derived from normal tissues, or This refers to a molecule that is selectively upregulated in cancer cells or tissues, and the presence of the molecule in the body fluid or cells or tissues of a subject indicates or suggests the presence of cancer.
  • the kit of the first embodiment contains a component for detecting and / or quantifying PPP 1 R 3 D antigen (including PPP 1 R 3 D protein and its partial peptide) in a body fluid sample from a subject.
  • PPP 1 R 3 D antigen including PPP 1 R 3 D protein and its partial peptide
  • Such components detect the level of PPP 1 R 3 D in, for example, tissue sections or body fluid samples such as blood and urine. And or used to quantify obtain.
  • Such antibodies may be labeled with radioactivity, fluorescence, colorimetry, or enzyme labeling.
  • the kit of the present invention may contain a labeled secondary antibody.
  • the kit according to the second embodiment contains a polynucleotide having a base sequence that can be hybridized under hybridization conditions stringent to the base sequence of the PPP 1 R 3D gene or a part thereof.
  • the kit of the present invention may contain the above-described polynucleotide immobilized on a DNA chip.
  • the kit of the present invention includes an anti-PPP 1 R 3D antibody, a PPP 1 R 3D gene or a part of its base sequence, a stringent high sequence, a base sequence that can be hybridized under hybridization conditions, and the like.
  • containers and labels may be included.
  • the label on or associated with the container may indicate that the drug is used to detect colorectal cancer markers.
  • other items such as instructions for use may be further included.
  • Example 1 Identification of colon cancer specific amplification gene by array C GH method
  • sample preparation of 200 colorectal cancer specimens and verification based on the array CGH method were performed.
  • FIG. 1 is a histogram showing the frequency of amplification of PPP 1 R 3 D gene in 200 colorectal cancer patients.
  • Table 2 shows the amplification degree (GZR value) and frequency of 200 PPP specimens of the PPP 1 R 3 D gene in colorectal cancer patients.
  • the average value shows the average value for samples with a GZ R value of 1.2 or more.
  • the PPP 1 R 3 D gene was amplified in 64.5% of 20 0 colorectal cancer patients, with an average amplification of 1.8. .
  • the maximum value was 2.7, and remarkable amplification occurred very frequently.
  • Example 2 Verification of gene amplification in a colon cell line derived from the large intestine
  • the degree of amplification in a colon cancer-derived cultured cell line was verified for a high-frequency gene region in colon cancer patients.
  • Cultured cell lines were DLD-1 and RKO E6, which are colon cancer-derived cell lines. Genomic DNA was extracted from the cultured cells according to the protocol attached to the kit using Blood & CellCu1ture DNAKite (QIAGEN).
  • Table 3 shows the degree of amplification (GZR value) of the PPP 1 R 3 D gene in a cell line derived from colorectal cancer. As shown, in colorectal cancer-derived cell lines Also found that amplification occurred in the PPP 1 R 3 D gene, located in BAC C lone RP 1 1— 2 8 G 1 8.
  • the PPP 1 R 3 D gene which was frequently amplified in 200 colorectal cancer patients, was a colon cancer-derived cell line, and gene amplification was observed at the genomic level.
  • RNA i analysis was performed and the phenotype was observed.
  • the cell line was purchased from ATCC and cultured according to the attached protocol.
  • s i RN A a specific 21 mer within the gene was selected and s 1 RNA was synthesized with the sequence as the target (commissioned to QIAGEN).
  • siRNA was introduced into cells using RNA i FECT (QIAGEN) and siRNA of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ according to the attached protocol.
  • RNA i FECT QIAGEN
  • siRNA of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ according to the attached protocol As a control, N egative Control 1 siRNA (QI AG EN) was used. The cells were observed under an inverted microscope for 4 days after introduction into the cells.
  • cDNA was synthesized according to the attached protocol using Super Sc r i p t I I I F i r s t — S t r a n d S y n t h e s i S S y s t e rn f o r R T-P C R (I n v i t ro g e n).
  • Quantitative RT-PCRR was performed using this cDNA as a saddle. Quantitative PCR was performed using SYBRG reen RT—PCRR eagents (A p 1 ied B iosys te rn s) according to the attached protocol. iosyst em s). Primers synthesized the following sequences (* commissioned to PERON). Primer sequence:
  • RNAi analysis of the PPP1R3D gene was performed using DLD-1 and RKO E6, which are cell lines derived from colorectal cancer.
  • Figures 2A and 2B show the observation images on day 4 after Transfeetion of siRNA of R ⁇ ⁇ 1 R 3 D gene in DLD_ 1 and RK ⁇ E 6 cells, respectively (upper: X 4 0; lower row: X 2 0 0).
  • a, b, and c are s i R N A 3 species of the P P P 1 R 3 D gene, and N C represents a negative control.
  • phenotypic observations showed that the number of cells in both cells a, b, and c was significantly reduced compared to N egative Control (NO) (Fig. 2).
  • Figure 3A and Figure 3B show that the cells were collected 24 hours after Transfeetion of siRNA of PPP 1 R 3 D gene in D LD-1 and RKOE 6 cells, respectively, and quantitative RT-PCR was performed. The results are shown. As an endogenous control, the relative ratio to NC was shown using the relative ratio of GAPDH. As shown, as a result of confirming the effect at the RNA level with quantitative RT_PCR, the expression level of all three types of siRNA was markedly decreased in all cells (Fig. 3).
  • Fig. 4 A and Fig. 4 B show that the number of viable cells was measured with the measurement reagent using the cells on day 4 after Transfeetion of siRNA of PPP 1 R 3 D gene to DLD-1 and RKOE 6 cells, respectively. Results are shown. The graph shows the relative amount to NC. As shown, N egative Control (N Compared to C), the number of cells was significantly reduced (Fig. 4). In all of the cells, all three types of siRNA (a, b, c) of the PPP 1 R 3 D gene were significant in the t-test (P> 0.01).
  • Example 4 Functional analysis by RNAI analysis using a colon-derived normal cell line
  • the RNAI analysis was performed using a cell line derived from a normal tissue of the large intestine. Verify that is cancer specific.
  • RNA For the cell line, use CCD 18 CO purchased from AT C. Culture conditions are according to the attached protocol. For s i RN A, the a, b or c sequence of Example 3 is used. For introduction of si RNA into cells, L i pof e cta min e 2200 (Invitrogen) is used, and 25 nM of siRNA is introduced into cells according to the attached protocol. As a control, N ega tiv e C o n t r o ls i RNA (Q I AGE N) is used. Observe under an inverted microscope for 5 days after introduction.
  • Example 5 Evaluation of gene amplification
  • Figure 5 shows optical micrographs (fluorescence images) of some of the cancer cells (6 cells) observed in each sample tissue (A to J). As shown, more than 3 spots were found in cancer cells. It was confirmed that the PPP 1 R 3 D gene region was amplified in 10 specimens whose gene amplification degree (G / R) was 1.2 or more by the array CGH method. It was also shown that gene amplification occurred from the early stage to the late stage of the disease state. This indicates that the P P P 1 R 3 D gene region can be applied not only as a molecular target for cancer drugs but also in cancer diagnosis by FISH.
  • Example 6 Detection of PPP 1 R 3 D protein in blood by mass spectrometry
  • Serum specimens of colon cancer patients 10; L and healthy specimens 10 L are diluted with 500 L of diluted buffer solution (10 mM Tris HC1 ph 7.4 + 150 mM NaCl), then ProteomeLab IgY-12 SC Proteome partitioning kit (BECKMAN COULTER: A24618) was used to remove a large amount of serum proteins such as albumin and globulin. Dithiothreitol (Wako: 049-08972) was added to the obtained fraction to a final concentration of 10 mM, and the reduction reaction was performed at 60 for 30 minutes.
  • diluted buffer solution 10 mM Tris HC1 ph 7.4 + 150 mM NaCl
  • odoacetamide SIGMA: 144-48-9
  • SIGMA 144-48-9
  • the alkylation reaction was carried out at room temperature for 30 minutes in the dark.
  • add 4 times the volume of cold acetone (with Wako: 014-08681, —20) to the reaction solution, let stand at 80 for 1 hour, and centrifuge at 15,000 xg for 30 minutes to precipitate the protein. It was collected.
  • the recovered protein was dissolved in 80 L of 2M urea + 100 mM ammonium bicarbonate solution. After dissolution, a portion was subjected to measurement of protein concentration by the BCA method. Trypsin (Promega: V511C) was added to the sample protein at 1/50 (w / w), and digestion was performed at 37 ° C for 16 hours. 2) Analysis using Nano-HPLC direct mass spectrometer
  • FIG. 6A and FIG. 6B show the results of analysis of (A) serum derived from colorectal cancer patients and (B) serum derived from healthy subjects by the above method, respectively.
  • Figures 7A-C show the peaks shown in Figure 6 as determined by MS / MS analysis. Shows the correspondence with amino acids (or amino acid sequences).
  • the growth inhibition effect was observed by knocking down the PPP 1 R 3 D gene, but what effect was observed in the cervical cancer cell line was determined by the RNAi analysis method described above. , evaluated.
  • RNAi analysis was performed using the above three siRNAs. Introducing s i R N A into cells using O 1 i g o f e c t am i n e (I n v i t r o g e n)
  • FIG. 8 shows the results of measuring the number of viable cells (MTT assay) with the measurement reagent using the cells on the 4th day after Transfeetion of the PPP1 R 3 D gene siRNA to HeLa cells.
  • the graph shows the relative amount with respect to NC (Negative control siRNA (Qiagen)).
  • NC Negative control siRNA (Qiagen)
  • differential interference images were taken under a microscope, and their dynamics were observed in detail. Specifically, after transfection of siRNA (a, b, c) in HeLa cells, differential interference images of the same field were observed 1, 2, 3, and 4 days later. The results are shown in Fig. 9. NC used negative control siRNA (Qiagen). Compared with NC, the growth rate was suppressed and cell death was induced (partially indicated by arrows). In the figure, a, b, and c correspond to siRNA a, siRNA b, and siRNA c in FIG. 8, respectively. As shown in Fig. 9, induction of cell death was observed in a, b, and c where growth inhibition was observed.
  • NC used negative control siRNA (Qiagen). Compared with NC, the growth rate was suppressed and cell death was induced (partially indicated by arrows).
  • a, b, and c correspond to siRNA a, siRNA b, and siRNA c in FIG. 8, respectively.
  • the present invention provides cancer therapeutic agents, diagnostic agents, diagnostic methods, therapeutic methods, kits used therefor, and the like. Therefore, the present invention is useful in fields such as cancer diagnosis or targeted therapy.

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Abstract

It is intended to provide a therapeutic agent for cancer containing an expression inhibitor or activity inhibitor of PPP1R3D protein; a method for screening a compound which can be used as an active ingredient of such a therapeutic agent; an antibody against the PPP1R3D protein; a diagnostic agent for cancer/a diagnostic method for cancer using the antibody and the like.

Description

明細書  Specification

P P P 1 R 3 D遺伝子の治療的又は診断的用途 技術分野 Therapeutic or diagnostic uses of P P P 1 R 3 D gene

本発明は、 がんにおいて特異的に増幅している遺伝子である P P P 1 R 3 D遺伝子、 その治療的又は診断的用途などに関する。 背景技術  The present invention relates to a P P P 1 R 3 D gene that is a gene specifically amplified in cancer, its therapeutic or diagnostic use, and the like. Background art

悪性腫瘍 （がん） の特徴として、 増殖 · 浸潤 · 転移を経て全身化する ことによる致死があげられる。 外科的な切除または放射線治療のような 局所療法では、 転移性再発がんに対して十分な対処はできず、 全身療法 である薬物療法の発展が、 今後のがん治療成績の向上に期待されている。 がん薬物療法の現在の中心である化学療法は、 直接がん細胞の D N A および または R N Aに作用し、 細胞を死に至らせる殺細胞薬剤を用い る場合が多いが、 がん細胞以外の、 例えば、 骨髄細胞、 生殖細胞、 毛母  Malignant tumors (cancers) are characterized by lethality due to generalization through proliferation, invasion, and metastasis. Local therapies such as surgical resection or radiation therapy cannot adequately address metastatic recurrent cancer, and the development of systemic pharmacotherapy is expected to improve the outcome of cancer treatment in the future. Yes. Chemotherapy, which is the current center of cancer drug therapy, often uses cell killing agents that directly act on the DNA and / or RNA of cancer cells and cause the cells to die. Bone marrow cells, germ cells, hair matrix

¾ -- 細胞、 消化管上皮細胞など分裂がさかんな正常細胞に対しても作用し、 強い副作用をもたらしていた。 一方、 近年の分子細胞生物学の進歩によ り、 がん細胞の浸潤 ·増殖 · 転移などにかかわるメカニズムが解明され、 そのがん細胞の特定メカニズムに特異的に作用する分子標的薬の開発が 注目されている。 代表例として、 非小細胞肺がんの治療に効果のある E G F R (上皮成長因子受容体） 、 チロシンキナーゼ阻害剤であるィレツ サ （一般名 ： ゲフイチニブ） （W 0 9 6ノ 3 3 9 8 0 ) 、 乳がんの治療 に効果のある H E R— 2 (ヒ ト上皮成長因子受容体 2 ) のヒ ト化モノク 口一ナル抗体のハーセプチン （一般名 ： トラスッズマブ） （W〇 9 4 Z 0 0 1 3 6 ) などがあげられる。 しかしながら、 現状では未だ有効な分 子標的薬は少なく、 今後更なる各がん種に対する有効な分子標的薬の開 発が望まれている。  ¾-It acted on normal cells such as cells and gastrointestinal epithelial cells, which had many divisions, and had strong side effects. On the other hand, recent advances in molecular cell biology have elucidated the mechanisms involved in cancer cell invasion, proliferation, and metastasis, and the development of molecular targeted drugs that specifically act on the specific mechanisms of cancer cells. Attention has been paid. Representative examples are EGFR (epidermal growth factor receptor) effective for the treatment of non-small cell lung cancer, Yretza (generic name: gefitinib), a tyrosine kinase inhibitor (W 0 9 6 3 3 9 8 0), Herceptin (generic name: trastuzumab), a humanized monoclonal antibody of HER-2 (human epidermal growth factor receptor 2) effective in the treatment of breast cancer, etc. (W〇94 4 Z 0 0 1 3 6), etc. Can be given. However, there are still few effective molecular targeted drugs at present, and further development of effective molecular targeted drugs for each cancer type is desired in the future.

日本人の大腸がんは年々増加の傾向にあり、 死亡数は、 肺がん、 胃が んに次いで 3位になっている。 年齢別では 6 0歳代が一番多く、 次いで 5 0歳代、 7 0歳代の順である。 大腸がんの増加の原因には、 遺伝的要 因、 環境的要因などが考えられるが、 食生活の西欧化、 特に動物性脂肪 の取りすぎが原因ではないかと指摘されている。 大腸がんの有効な分子 標的薬の開発が待たれている。 また、 診断に用いられている腫瘍マーカ 一 （C E A， C A 1 9— 9 ) は、 進行大腸がんであっても約半数が陽性 を示すのみで、 臓器特異性も無く、 より高性能な診断薬の開発が望まれ ている。 発明の開示 Japanese colon cancer tends to increase year by year, and the number of deaths is lung cancer and stomach It is in 3rd place. By age, 60s is the most common, followed by 50s and 70s. The cause of the increase in colorectal cancer may be due to genetic factors or environmental factors, but it has been pointed out that it may be due to westernization of the diet, especially excessive consumption of animal fat. Development of an effective molecular target drug for colorectal cancer is awaited. In addition, about half of the tumor markers used for diagnosis (CEA, CA 19-9) are positive even in advanced colorectal cancer, with no organ specificity, and higher performance diagnostic agents. Development is desired. Disclosure of the invention

上記のような状況下で、 がんを治療および または診断するための新 たな薬剤または方法が求められている。  Under these circumstances, new drugs or methods are needed to treat and / or diagnose cancer.

特に、 がんに対して特異性の高い治療薬および または診断薬が求め られている。  In particular, there is a need for therapeutic and / or diagnostic agents with high specificity for cancer.

上記のような状況に鑑み、 本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 が ん （特に、 大腸がん） において高頻度に増幅が起きている遺伝子が、 P P P 1 R 3 D遺伝子であることを見出した。 本発明者らはさらに、 大腸 がん細胞株ならびに子宮頸がん細胞株において P P P 1 R 3 Dタンパク 質の発現を阻害することによって、 癌細胞の増殖を抑制し得ることを見 出し、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、 以下に記載す るがん治療剤、 がん抑制作用を有する候補物質のスクリ一二ング方法、 がん診断剤、 がん診断用キッ ト、 がんの診断方法などを提供する。 In view of the above situation, as a result of intensive studies, the present inventors have found that the gene that is frequently amplified in cancer (especially colorectal cancer) is the PPP 1 R 3 D gene. I found out. Furthermore, the present inventors have found that the proliferation of cancer cells can be suppressed by inhibiting the expression of PPP 1 R 3 D protein in colorectal cancer cell lines and cervical cancer cell lines. It came to complete. That is, the present invention provides a cancer therapeutic agent, a screening method for a candidate substance having a cancer-suppressing action, a cancer diagnostic agent, a cancer diagnostic kit, a cancer diagnostic method, and the like described below. provide.

( 1 ) P P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有する がん治療剤。 (1) A cancer therapeutic agent comprising, as an active ingredient, a substance that inhibits the expression of PPP1R3D gene.

( 2 ) 上記 P P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻害物質が、  (2) The P P P 1 R 3 D gene expression inhibitor is

( a ) P P P 1 R 3 D遺伝子の発現を R N A i効果により阻害する作 用を有する核酸、  (a) a nucleic acid having an action of inhibiting the expression of the P P P 1 R 3 D gene by the R N Ai effect,

( b ) P P P 1 R 3 D遺伝子もしくはその一部、 またはその転写産物 に対するアンチセンス核酸、 (c ) P P P 1 R 3 D遺伝子またはその一部に対するデコイ核酸、(b) an antisense nucleic acid against the PPP 1 R 3 D gene or part thereof, or a transcript thereof, (c) a decoy nucleic acid for the PPP 1 R 3 D gene or a part thereof,

( d ) P P P 1 R 3 D遺伝子またはその一部に対してドミナントネガ ティブに作用する P P P 1 R 3 D遺伝子変異体 (d) P P P 1 R 3 D gene mutant that acts dominantly on P P P 1 R 3 D gene or part thereof

( e ) P P P 1 R 3 D遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザィ ム活性を有する核酸、  (e) a nucleic acid having a ribozyme activity that specifically cleaves a transcript of the PPP1R3D gene,

および and

( f ) P P P 1 R 3 D遺伝子の転写または P P P 1 R 3 D mRNA の翻訳を阻害する化合物 （上記核酸を除く）  (f) Compounds that inhibit the transcription of PPP1R3D gene or translation of PPP1R3D mRNA (excluding the above nucleic acids)

からなる群から選択される物質を含む、 上記 （ 1 ) に記載のがん治療剤。 ( 3) P P P 1 R 3 Dタンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有 するがん治療剤。 The cancer therapeutic agent according to (1) above, comprising a substance selected from the group consisting of: (3) A cancer therapeutic agent comprising a substance that inhibits the activity of PPP1R3D protein as an active ingredient.

(4) 上記 P P P 1 R 3 Dタンパク質の活性阻害物質が、  (4) The P P P 1 R 3 D protein activity inhibitor is

(a) 該 P P P 1 R 3 Dタンパク質に対する抗体、  (a) an antibody against said P P P 1 R 3 D protein,

( b ) 該 P P P 1 R 3 Dタンパク質に対してドミナントネガティブの 性質を有する P P P 1 R 3 Dタンパク質変異体、 および、  (b) a PPP1R3D protein variant having a dominant negative property with respect to the PPPP1R3D protein, and

(c ) 該 P P P 1 R 3 Dタンパク質に結合する化合物 （上記抗体およ び変異体を除く）  (c) Compound that binds to the P P P 1 R 3 D protein (excluding the above-mentioned antibodies and variants)

からなる群から選択される物質を含む、 上記 （ 3) に記載のがん治療剤。 The cancer therapeutic agent according to (3) above, comprising a substance selected from the group consisting of:

( 5 ) 上記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 上記 （ 1 ) 〜 (4) のいずれかに記載のがん治療剤。  (5) The cancer therapeutic agent according to any one of (1) to (4) above, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer.

( 6 ) P P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻害物質をスクリーニングする方法 であって、  (6) A method for screening a PPP 1 R 3 D gene expression inhibitor,

( a ) P P P 1 R 3 D遺伝子を発現する細胞に、 被検化合物を接触さ せる工程、  (a) a step of contacting a test compound with a cell expressing a PPP1R3D gene,

( b ) 該 P P P 1 R 3 D遺伝子の発現レベルを測定する工程、 および (b) measuring the expression level of the P P P 1 R 3 D gene; and

(c ) 被検化合物を接触させない場合と比較して、 該発現レベルを低 下させる化合物を選択する工程を包含する、 スクリーニング方法。 (c) A screening method comprising a step of selecting a compound that reduces the expression level as compared with a case where a test compound is not contacted.

( 7 ) P P P 1 R 3 D夕ンパク質の活性阻害物質をスクリーニングする 方法であって、 ( a) P P P 1 R 3 Dタンパク質と被検化合物どを接触させる工程、(7) A method for screening a PPP 1 R 3 D protein activity inhibitor, (a) contacting the PPP 1 R 3 D protein with a test compound,

(b) 該 P P P 1 R 3 Dタンパク質と被検化合物との結合活性を測定 する工程、 および (b) measuring the binding activity between the PPP1R3D protein and the test compound; and

(c ) 該 P P P 1 R 3 Dタンパク質と結合する化合物を選択する工程 を包含する、 スクリーニング方法。  (c) A screening method comprising the step of selecting a compound that binds to the PPP 1 R 3 D protein.

( 8 ) 上記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 上記 （6 ) また は （ 7 ) に記載の方法。  (8) The method according to (6) or (7) above, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer.

( 9 ) P P P 1 R 3 Dタンパク質に対する抗体。  (9) An antibody against PPP1R3D protein.

( 1 0 ) 上記 （ 9 ) に記載の抗体を含有するがん治療剤。  (10) A cancer therapeutic agent comprising the antibody according to (9) above.

( 1 1 ) 放射性同位元素、 治療タンパク質、 低分子の薬剤、 または治療 遺伝子を担持したベクターをさらに含有する、 上記 （ 1 0 ) に記載のが ん治療剤。  (11) The cancer treatment agent according to (10), further comprising a vector carrying a radioisotope, a therapeutic protein, a low molecular drug, or a therapeutic gene.

( 1 2 ) 上記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 上記 （ 1 0 ) または （ 1 1 ) に記載のがん治療剤。  (1 2) The cancer therapeutic agent according to (1 0) or (1 1) above, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer.

( 1 3 ) 上記 （ 9 ) に記載の抗体を含有するがん診断剤。  (1 3) A cancer diagnostic agent comprising the antibody according to (9) above.

( 1 4) P P P 1 R 3 D遺伝子またはその一部の塩基配列にス トリンジ ェン卜なハイプリダイゼ一ション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配 列を含有するがん診断剤。  (14) A cancer diagnostic agent comprising a base sequence that can be hybridized to a PPP 1 R3D gene or a part of the base sequence thereof under stringent high-precipitation conditions.

( 1 5 ) 上記がんが大腸がんである、 上記 （ 1 3) または （ 1 4) に記 載のがん診断剤。  (15) The cancer diagnostic agent according to (13) or (14), wherein the cancer is colorectal cancer.

( 1 6 ) 上記 （ 9 ) に記載の抗体を含有するがん診断用キッ ト。  (16) A cancer diagnostic kit containing the antibody described in (9) above.

( 1 7 ) P P P 1 R 3 D遺伝子またはその一部の塩基配列にス 卜リンジ ェン卜なハイプリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配 列からなるポリヌクレオチドを含有するがん診断用キッ ト。  (17) A cancer diagnostic kit containing a polynucleotide comprising a base sequence that can be hybridized to a PPP 1 R 3D gene or a part of the base sequence under a high-hybridization condition. G.

( 1 8 ) 上記がんが大腸がんである、 上記 （ 1 6 ) または （ 1 7 ) に記 載のがん診断用キッ ト。  (18) The cancer diagnostic kit as described in (16) or (17) above, wherein the cancer is colon cancer.

( 1 9 ) 被験者由来の生体試料中の P P P 1 R 3 Dタンパク質または P P P 1 R 3 D遺伝子をがんマ一カーとして検出および/または定量する 方法。 ( 2 0 ) 前記生体試料が、 全血、 血清、 まだは血漿である、 上記 （ 1 9 ) に記載の方法。 (19) A method for detecting and / or quantifying PPP 1 R 3 D protein or PPP 1 R 3 D gene in a biological sample derived from a subject as a cancer marker. (20) The method according to (19), wherein the biological sample is whole blood, serum, or still plasma.

( 2 1 ) 質量分析装置を用いて、 P P P 1 R 3 Dタンパク質を検出およ び または定量する、 上記 （ 1 9). または （2 0) に記載の方法。  (2 1) The method according to (19) or (20) above, wherein PPP 1 R 3 D protein is detected and quantified using a mass spectrometer.

( 2 2 ) 抗 P P P 1 R 3 D抗体を用いて、 P P P 1 R 3 Dタンパク質を 検出および Zまたは定量する、 上記 （ 1 9 ) 〜 （ 2 1 ) のいずれかに記 載の方法。  (2 2) The method according to any one of (19) to (21) above, wherein PPP1R3D protein is detected and Z or quantified using an anti-PPPP1R3D antibody.

(2 3 ) ( a) 被験者由来の生体試料と、 P P P 1 R 3 Dタンパク質に 対する抗体とを接触させる工程、 および  (2 3) (a) contacting the biological sample derived from the subject with an antibody against the P P P 1 R 3 D protein, and

( b ) 上記試料中での上記抗体と、 P P P 1 R 3.Dタンパク質との結 合を検出および Zまたは定量する工程、  (b) detecting and Z or quantifying the binding between the antibody in the sample and the P P P 1 R 3.D protein,

を包含する、 上記 （2 2 ) に記載の方法。 The method according to (2 2), comprising:

( 24 ) ( a) 被験者由来の生体試料と、 P P P 1 R 3 D遺伝子または その断片の塩基配列にス トリンジェントなハイプリダイゼーショ ン条件 下でハイプリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドとを接触 させる工程、 および  (24) (a) A biological sample derived from a subject, and a polynucleotide having a base sequence that can be hyper-precipitated under stringent hyper-precipitation conditions to the base sequence of the PPP 1 R 3 D gene or a fragment thereof. Contacting, and

(b) 上記試料中での上記ポリヌクレオチドと、 P P P 1 R 3 D遺伝 子またはその断片とのハイプリダイゼーションを検出および Zまたは定 量する工程、  (b) detecting and Z or quantifying the hybridization between the polynucleotide in the sample and the PPP 1 R 3 D gene or a fragment thereof,

を包含する、 上記 （ 1 9 ) または （2 0 ) に記載の方法。 The method according to (19) or (20) above, comprising:

(2 5 ) がんの診断に用いるための上記 （ 1 9 ) 〜 （ 2 4) のいずれか に記載の方法。  (2 5) The method according to any one of (19) to (24) above for use in cancer diagnosis.

(2 6 ) 前記がんが、 大腸がんである、 上記 （ 2 5 ) に記載の方法。 (2 6) The method according to (25) above, wherein the cancer is colorectal cancer.

(2 7 ) P P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻害物質を患者に投与する工程を 包含する、 がん治療方法。 (2 7) A method for treating cancer, comprising a step of administering a PPP 1 R 3 D gene expression inhibitor to a patient.

( 2 8 ) P P P 1 R 3 D夕ンパク質の活性阻害物質を患者に投与するェ 程を包含する、 がん治療方法。  (28) A method for treating cancer comprising the step of administering to a patient an inhibitor of PPP 1 R 3 D protein activity.

(2 9 ) がんを治療するための医薬の製造のための、 P P P 1 R 3 D遺 伝子の発現阻害物質の使用。 ( 3 0 ) がんを治療するための医薬の製造のための、 P P P 1 R 3 D夕 ンパク質の活性阻害物質の使用。 (2 9) Use of a PPP 1 R 3 D gene expression inhibitor for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer. (30) Use of a PPP 1 R 3 D protein activity inhibitor for the manufacture of a medicament for treating cancer.

( 3 1 ) 配列番号 3、 配列番号 4、 配列番号 5、 配列番号 6、 配列番号 7、 または配列番号 8の塩基配列を有する、 ポリヌクレオチド。  (3 1) A polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 8.

( 3 2 ) P P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有す るがん治療剤であって、 配列番号 3、 配列番号 4、 配列番号 5、 配列番 号 6、 配列番号 7、 または配列番号 8の塩基配列を有するポリヌクレオ チドを含有する、 がん治療剤。  (3 2) A cancer therapeutic agent containing a PPP 1 R 3 D gene expression inhibitor as an active ingredient, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, Alternatively, a cancer therapeutic agent comprising a polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 8.

本発明により、 がん （例えば、 大腸がん） の治療および Zまたは診断 に有用な新規な薬剤、 キッ トおよび方法、 ならびに.がん抑制作用を有す る候補化合物のスクリ一二ング方法が提供される。 図面の簡単な説明  According to the present invention, there are provided a novel drug, kit and method useful for the treatment and Z or diagnosis of cancer (for example, colorectal cancer), and a screening method for a candidate compound having a cancer suppressing action. Provided. Brief Description of Drawings

図 1は、 P P P 1 R 3 D遺伝子の大腸がん患者由来の 2 0 0検体にお ける遺伝子増幅度に対する頻度を示すヒス トグラムである。  FIG. 1 is a histogram showing the frequency of PPP 1 R 3D gene versus the degree of gene amplification in 200 samples from colon cancer patients.

図 2は、 大腸がん細胞株 D L D _ 1および R KO E 6に、 P P P 1 R 3 D遺伝子の s 1 RNAをトランスフエク トした場合の、 RNA i解析 の結果を示す光学顕微鏡写真（位相差像）である。  Figure 2 shows an optical micrograph (phase difference) showing the results of RNA i analysis when s 1 RNA of the PPP 1 R 3 D gene was transfected into the colon cancer cell lines DLD_1 and RKO E6. Image).

図 3は、 大腸がん細胞株 D L D— 1および RKOE 6に P P P 1 R 3 D遺伝子の s i RNAを 卜ランスフエク トした場合の、 RNA i効果を 定量的 R T— P C Rにより評価した結果を示すグラフである。  Figure 3 is a graph showing the results of quantitative RT-PCR evaluation of the RNA i effect when siRNA of the PPP 1 R 3 D gene was transfected into colon cancer cell lines DLD-1 and RKOE 6. is there.

図 4は、 大腸がん細胞株 DL D— 1および RKOE 6に P P P 1 R 3 D遺伝子の s i RNAを トランスフエク トした場合の、 生細胞数測定に よる RNA i効果を評価した結果を示すグラフである。  Figure 4 is a graph showing the results of evaluating the RNA i effect by measuring the number of living cells when siRNA of the PPP 1 R 3 D gene was transfected into colon cancer cell lines DL D-1 and RKOE 6. It is.

図 5は、 FISH 法で解析した大腸癌患者由来の検体組織のがん細胞の 一部 （ 6細胞分） の光学顕微鏡写真（蛍光像）である。  Fig. 5 is an optical micrograph (fluorescence image) of a portion (6 cells) of cancer cells in a sample tissue derived from a colon cancer patient analyzed by the FISH method.

図 6 Aおよび Bは、 質量分析により解析した （A) 大腸がん患者由来 の血清および （B) 健常者由来の血清についての結果をそれぞれ示すグ ラフである。 図 7 A〜Cは、 M S/M S解析によって決定された、 図 6に示すピー クとアミノ酸 （またはアミノ酸配列） との対応関係を示す。 Figures 6A and B are graphs showing the results of (A) serum derived from a colon cancer patient and (B) serum derived from a healthy subject, respectively, analyzed by mass spectrometry. 7A to C show the correspondence between the peak shown in FIG. 6 and amino acids (or amino acid sequences) determined by MS / MS analysis.

図 8は、 子宮頸癌細胞株 HeLa 細胞株に P P P 1 R 3 D遺伝子の s i R NAをトランスフエク トした場合の、 RNA i効果を生細胞数測定に より検証した結果を示すグラフである。  FIG. 8 is a graph showing the results of verifying the RNAi effect by measuring the number of viable cells when sciRNA of the PPP1R3D gene was transfected into the cervical cancer cell line HeLa cell line.

図 9は、 図 8の実験を時系列に従い、 顕微鏡下で撮影し、 その動態を 詳細に観察した結果を示す光学顕微鏡写真（微分干渉像）である。 発明を実施するための最良の形態  Fig. 9 is an optical micrograph (differential interference image) showing the result of detailed observation of the dynamics of the experiment in Fig. 8 taken in a time-series and under a microscope. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

本発明者らは、 大腸がん患者由来の検体を用いて.アレイ C GH法によ る増幅遺伝子の検証を行い、 大腸がん特異的な遺伝子増幅領域を特定し た。 検体において高頻度に増幅が起きている領域のうち、 ヒ ト P P P 1 R 3 D (.P r o t e i n p h o s p h a t a s e 1， r e g u 1 a t o r y s u b u n i t 3 D ) 遺伝子が大腸がん患者由来の検体 において高頻度であることを見出した。  The present inventors used a specimen derived from a colorectal cancer patient to verify the gene amplified by the array CGH method and to identify a gene amplification region specific to colorectal cancer. Of the regions where amplification occurs frequently in the specimen, the human PPP 1 R 3 D (.Proteinphosphatase 1, regu 1 atorysubunit 3 D) gene was found to be frequent in specimens from colon cancer patients. It was.

PPP1R3D (PPP1R6) (Protein phosphatase 1 ， regulatory subunit 3D) は、 Protein phosphatase 1 (PP1)と結合し、 グリコーゲン代謝に関 与する、 グリコーゲン結合タンパク質である。  PPP1R3D (PPP1R6) (Protein phosphatase 1 and regulatory subunit 3D) is a glycogen-binding protein that binds to protein phosphatase 1 (PP1) and participates in glycogen metabolism.

PP1 は 20 以上の異なるタンパク質と結合し、 可逆的なリン酸化タン パク質から脱リン酸化することで、 細胞内の様々な調節を担っている。 例えば、 グリコーゲン結合タンパク質によりグリコーゲン代謝を調節し たり、 ミオシン結合タンパク質により筋収縮を調節したり、 核内での調 節を行ったり、 細胞外からのシグナルによりその結合するタンパク質を 変え、 多様な機能を担っている （Hubbard, M. J. & Cohen, P. (1993) Trends Biochem. Sci. 18, 172-177 ； Johnson, D. F. , et al. (1996) Eur. J. Biochem. 239, 317-325. ) 0 PP1 binds to more than 20 different proteins and is responsible for various intracellular regulation by dephosphorylation from reversibly phosphorylated proteins. For example, it regulates glycogen metabolism by glycogen binding protein, regulates muscle contraction by myosin binding protein, regulates in the nucleus, and changes its binding protein by signals from outside the cell. (Hubbard, MJ & Cohen, P. (1993) Trends Biochem. Sci. 18, 172-177; Johnson, DF, et al. (1996) Eur. J. Biochem. 239, 317-325.) 0

グリコーゲン代謝において、 PP 1 はグリコーゲンシン夕一ゼを脱リン 酸化することで活性化させ、 グリコーゲン合成を調節している。 PP1 の グリコーゲン結合サブユニッ トは、 PPP1R6 を含め 4 つ知られている。 GM(PPP1R3)は骨格筋特異的なグリコ一ゲン結合サブユニッ ト （Stralfors, P. , et a J. (1985) Eur. J. Biochem. 149, 295-303 ； Tang, P. M.， et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 15782-15789 ； Chen, Y. H. , et al. (1994) . Diabetes 43, 1234- 1241. )、. ラッ トで同定された肝臓特異 的な GL (PPP1R4) (Doherty, M. J. , et al. (1995) FEBS Lett. 375, 284-298. ) 、 骨格筋と肝臓で発現の高い PPP1R5 (PPP1R3C) (Doherty, M. J. , et al. (1996) FEBS Lett. 399, 339-343. ) で あ る 。 In glycogen metabolism, PP 1 activates glycogen synthase by dephosphorylation and regulates glycogen synthesis. There are four known glycogen binding subunits of PP1, including PPP1R6. GM (PPP1R3) is a skeletal muscle-specific glycogen-binding subunit (Stralfors, P., et a J. (1985) Eur. J. Biochem. 149, 295-303; Tang, PM, et al. (1991). ) J. Biol. Chem. 266, 15782-15789; Chen, YH, et al. (1994). Diabetes 43, 1234- 1241.) ,. Liver-specific GL (PPP1R4) (Doherty identified in rats) , MJ, et al. (1995) FEBS Lett. 375, 284-298.), PPP1R5 (PPP1R3C) highly expressed in skeletal muscle and liver (Doherty, MJ, et al. (1996) FEBS Lett. 399, 339- 343.)

PPP1R3D(PPP1R6)は、 骨格筋と心臓で高い発現がみられ、 他の臓器（脳 · 胎盤 · 肺 · 肝 · 腎 · 塍）においても中〜低レベルでの発現が報告されて いる（Armstrong, C. G. , et al. (1997) FEBS Lett. 18, 210-214)。 PPP1R3D (PPP1R6) is highly expressed in skeletal muscles and the heart, and has been reported to be expressed at moderate to low levels in other organs (brain, placenta, lung, liver, kidney, sputum) (Armstrong, CG, et al. (1997) FEBS Lett. 18, 210-214).

PPP1R3D (PPP1R6) は、 N 末端側には PP1 結合部位と して知られる- (R/K) (V/I) XF-配列 （Eglofi, M. P. , et al. (1997) EMB0 J. 16， 1876-1887. )、 Mi togen-act ivated protein kinases (MAPKs)により リ ン酸化を受ける - PX(S/T)P-配列、 MAPK-activated protein kinase-2 (MAP- KAP-K2)や Calmodul in- dependent protein kinase- 2 により リン酸 化を受ける- LXRXXSL-配列 （Stokoe, D. , et al. (1993) Biochem. J. 296, 843-849. ) と一致する配列がある。 一方、 GM に含まれる、 cAMP - dependent protein kinase (PKA)のリ ン酸化部位や、 GL に含まれる、 Phosphorylase αの結合部位は含まず、 機能の役割分担が推測される。 がんとの関連については、 大腸がん由来細胞株 SW480で相対的に発現 が高い遺伝子と して報告された 8， 447 遺伝子に含まれている （W0 01/94629)。 また、 大腸がん由来細胞株（LOVO, KM12, COL0320) , 肺がん 由来細胞株（H322， PC10, H157, SBC5, Η209)、 胃がん由来細胞株（ΜΚΝ7, ΚΑΤ0ΙΠ)、 卵巣がん由来細胞株（Α2780, 2008)での発現が報告されてい る（Takakura, S.， et al. (2001) Int. J. Oncology 18, 817-824· )。 また、 子宮がん由来細胞株 HeLa 細胞において、 RNAi によりアポトー シスの誘導が対照と比較して 2. 1 倍量認められたとの報告がある (McKeigan, J. P. ， et al. (2005) Nature Cell Biology 7(6)， 591- 600 )。 本発明者らは、 P P P 1 R 3 D遺伝子の発現を R N A i ( R NA千 渉） によつて抑制することによってがん細胞の増殖を抑制できることも 確認した。 したがって、 P P P 1 R 3 D遺伝子の発現を抑制することに よって、 がんを治療することが可能となる。 また、 P P P 1 R 3 D遺伝 子の発現量を測定することによってがんの診断を行うことも可能となる。 以下、 本発明のがん治療剤、 スクリーニング方法、 診断剤などについ て詳細に説明する。 PPP1R3D (PPP1R6) is known as a PP1 binding site on the N-terminal side-(R / K) (V / I) XF-sequence (Eglofi, MP, et al. (1997) EMB0 J. 16, 1876 -1887.), Phosphorylated by Mitogen-act ivated protein kinases (MAPKs)-PX (S / T) P-sequence, MAPK-activated protein kinase-2 (MAP-KAP-K2) and Calmodul in- There is a sequence consistent with the LXRXXSL-sequence (Stokoe, D., et al. (1993) Biochem. J. 296, 843-849.) that is phosphorylated by dependent protein kinase-2. On the other hand, it does not include the phosphorylation site of cAMP-dependent protein kinase (PKA) contained in GM and the binding site of Phosphorylase α contained in GL. The association with cancer is included in 8,447 genes reported as genes with relatively high expression in colorectal cancer-derived cell line SW480 (W01 / 94629). In addition, colon cancer-derived cell lines (LOVO, KM12, COL0320), lung cancer-derived cell lines (H322, PC10, H157, SBC5, Η209), stomach cancer-derived cell lines (ΜΚΝ7, ΚΑΤ0ΙΠ), ovarian cancer-derived cell lines (Α2780) , 2008) has been reported (Takakura, S., et al. (2001) Int. J. Oncology 18, 817-824)). In addition, in uterine cancer cell line HeLa cells, there is a report that the induction of apoptosis by RNAi was 2.1 times that of the control (McKeigan, JP, et al. (2005) Nature Cell Biology). 7 (6), 591-600). The present inventors have also confirmed that the proliferation of cancer cells can be suppressed by suppressing the expression of the PPP 1 R 3 D gene by RNA i (RNA NA interference). Therefore, cancer can be treated by suppressing the expression of the PPP 1 R 3 D gene. It is also possible to diagnose cancer by measuring the expression level of the PPP 1 R 3 D gene. Hereinafter, the cancer therapeutic agent, screening method, diagnostic agent and the like of the present invention will be described in detail.

1. がん抑制作用を有する薬剤 1. Drugs that suppress cancer

まず、 本発明は、 （ 1 ) P P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻害物質を有効 成分として含有するがん治療剤、 及び （ 2 ) P P P 1 R 3 Dタンパク質 の活性阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。  First, the present invention includes (1) a cancer therapeutic agent containing a PPP 1 R 3 D gene expression inhibitor as an active ingredient, and (2) a PPP 1 R 3 D protein activity inhibitor as an active ingredient. Provide cancer treatment.

本明細書中、 「P P P 1 R 3 D遺伝子」 という場合、 N C B I ヌクレ ォチドデー夕ベースにおいて、 A c c e s s i o n N o . ： N M_ 0 0 6 2 4 2で登録されている 3 4 8 1塩基からなるヒ ト P P P 1 R 3 D 遺伝子 （配列番号 1 ) を意味する （Armstrong, C. G.， et al. (1997) FEBS Lett. 418, 210- 214)が、. これに限定されず、 例えば、 当該遺伝子 の塩基配列において 1つ以上の塩基の置換、 欠失、 付加、 または挿入な どを有することによって変化している変異体のような、 当該遺伝子の塩 基配列またはその相補配列にス トリ ンジェントなハイプリダイゼ一ショ ン条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドか らなる遺伝子も本明細書中で使用する 「P P P 1 R 3 D遺伝子」 に含ま れるものとする。  In the present specification, the term “PPP 1 R 3 D gene” refers to a 3 4 8 1 base sequence registered under the Accession No .: N M — 0 0 6 2 4 2 on the NCBI nucleotide base. G means PPP 1 R 3 D gene (SEQ ID NO: 1) (Armstrong, CG, et al. (1997) FEBS Lett. 418, 210-214), but is not limited to this. For example, the base of the gene A stringent hyperidase such as a variant that is altered by having one or more base substitutions, deletions, additions, or insertions in the sequence, or a complementary sequence thereof. A gene consisting of a polynucleotide having a base sequence that can be highly pre-synthesized under a running condition is also included in the “PPP 1 R 3 D gene” used in this specification.

ハイプリダイゼーショ ンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ' クローニング （M o l e c u l a r C l o n i n g T h i r d E d i t i o n , J . S a m b r o o k e t a 1 . , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b . P r e s s . 2 0 0 1 ) に記載の方法などに従って行うことができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に 従って行うことができる。 ここで、 「ス トリンジェン卜な条件」 は、 低 ス トリンジェン卜な条件、 中ス トリ ンジェントな条件及び高ス トリンジ ェントな条件のいずれでもよい。 「低ス トリンジェン卜な条件」 は、 例 えば、 5 X S S C、 5 Xデンハル卜溶液、 0. 5 % S D S , 5 0 %ホル ムアミ ド、 3 2での条件である。 また、 「中ス トリ ンジェン卜な条件」 は、 例えば、 5 X S S C、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5 % S D S、 5 0 %ホルムアミ ド、 4 2での条件である。 「高ス トリ ンジェントな条 件」 は、 例えば、 5 X S S C、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5 % S D S、 5 0 %ホルムアミ ド、 5 0 の条件である。 これらの条件において、 温 度を上げるほど高い相同性を有する D N Aが効率的に得られることが期 待できる。 ただし、 ハイブリダィゼ一シヨンのストリンジエンシーに影 響する要素としては温度、 プローブ濃度、 プローブの長さ、 ィ ン強度、 時間、 塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら要素を 適宜選択することで同様のス トリンジエンシーを実現することが可能で ある。 Hydration is a known method or a method similar thereto, such as molecular cloning cloning (Molecular Cloning Third Edition, J. Sambrooketa 1, Old Spr ing Harbor Lab. Pres. 2 0 0 1) and the like. Also, when using a commercially available library, follow the method described in the attached instruction manual. Therefore, it can be performed. Here, the “stringent conditions” may be low stringent conditions, medium stringent conditions, or high stringent conditions. “Low stringency conditions” are, for example, conditions at 5 XSSC, 5 X Denhal solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32. Further, “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42. “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50. Under these conditions, it can be expected that DNA having high homology can be obtained efficiently as the temperature is increased. However, there are several factors that can influence the stringency of the hybridization, such as temperature, probe concentration, probe length, intensity, time, and salt concentration. The same stringency can be achieved by selecting it as appropriate.

ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチドとしては、 FA S TA、 B L AS Tなどの相同性検索ソフ トウエアにより、 デフォルトのパラメ一夕 一を用いて計算したときに、 配列番号 1の塩基配列と、 例えば、 7 0 % 以上、 7 5 %以上、 8 0 %以上、 8 5 %以上、 9 0 %以上、 9 1 %以上、 9 2 %以上、 9 3 %以上、 9 4 %以上、 9 5 %以上、 9 6 %以上、 9 7 %以上、 9 8 %以上、 9 9 %以上の同一性を有するポリヌクレオチド をあげることができる。  As a polynucleotide that can be hybridized, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, for example, 70 0 when calculated using the default parameters by homology search software such as FASTA and BLAST. % Or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 9 1% or more, 9 2% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96 Polynucleotides having% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more identity can be mentioned.

本明細書中、 「遺伝子の発現阻害」 とは、 遺伝子からタンパク質生成 までの一連の事象 （例えば、 転写 （mRNAの生成） 、 翻訳 （タンパク 質の生成） を含む） のうちのいずれかの事象を阻害することによってそ の遺伝子によってコードされるタンパク質の生成を阻害することを意味 するものとする。  In the present specification, “inhibition of gene expression” means any event in a series of events from gene to protein production (for example, transcription (production of mRNA), translation (production of protein)) By inhibiting the production of the protein encoded by the gene.

本明細書中、 「P P P 1 R 3 Dタンパク質」 という場合、 NC B I 夕 ンパク質データベースにおいて、 A c c e s s i o n N o. ： N P 0 0 6 2 3 3で登録されている 2 9 9アミノ酸残基からなるヒ ト P P P 1 R 3 Dタンパク質 （配列番号 2 ) およびこのタンパク質と実質的に同 質の活性 （例えば、 PP1 結合活性、 グリコーゲン結合活性から選択され る一種以上の活性） を保持し、 このタンパク質のアミノ酸配列に対して 1〜複数個のアミノ酸残基の欠失、 置換、 挿入、 及び または付加が生 じたアミノ酸配列からなる変異タンパク質をいう。 In the present specification, the term “PPP 1 R 3 D protein” refers to the “Accession No .: NP” in the NC BI protein database. A human PPP 1 R 3 D protein (SEQ ID NO: 2) consisting of 2 9 9 amino acid residues registered under 0 0 6 2 3 3 and an activity substantially equivalent to this protein (eg, PP1 binding activity, One or more activities selected from glycogen binding activity), and from amino acid sequences in which deletion, substitution, insertion, and / or addition of one or more amino acid residues to the amino acid sequence of this protein occurs. A mutant protein.

上記変異タンパク質における、 アミノ酸の変異部位および個数は、 変 異タンパク質が元のタンパク質と実質的に同質の活性を保持している限 り特に制限はないが、 変異個数は、 例えば、 1〜 5 0個、 1〜4 0個、 ：!〜 3 0個、 ：！〜 2 5個、 ：！〜 2 0個、 1〜： 1 5個、 1〜： 1 0個、 ：！〜 9個、 ：！〜 8個、 ：！〜 7個、 ：！〜 6個 （ 1〜数個） 、 ：！〜 5個、 1〜4 個、 1〜 3個、 1〜 2個、 1個である。 変異個数は一般的に少ない程好 ましい。 また、 このような変異タンパク質は、 配列番号 2のアミノ酸配 列と約 7 0 %以上、 7 5 %以上、 8 0 %以上、 8 5 %以上、 9 0 %以上、 9 1 %以上、 9 2 %以上、 9 3 %以上、 9 4 %以上、 9 5 %以上、 9 6 %以上、 9 7 %以上、 9 8 %以上、 9 9 %以上の同一性を有するアミ ノ酸配列を有し、 かつ元のタンパク質と実質的に同質の活性を有する夕 ンパク質を含む。 上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。  The amino acid mutation site and number in the above mutant protein are not particularly limited as long as the mutant protein retains substantially the same activity as the original protein, but the number of mutations is, for example, 1 to 50. Pieces, 1 to 40 pieces,:! To 30 pieces,:! ~ 2 5! ~ 20 pieces, 1 ~: 1 5 pieces, 1 ~: 1 0 pieces,:! ~ Nine, :! ~ 8 pcs! ~ Seven, :! ~ 6 pieces (1 ~ several pieces) ~ 5, 1-4, 1-3, 1-2, 1 In general, the smaller the number of mutations, the better. In addition, such a mutant protein has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and about 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 9 2 % Or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more of amino acid sequences having identity And a protein having substantially the same activity as the original protein. In general, the larger the homology value, the better.

上記 P P P 1 R 3 Dタンパク質には、 P P P 1 R 3 Dタンパク質の 「部分ペプチド」 も含まれる。 P P P 1 R 3 Dタンパク質の部分べプチ ドとしては、 P P P 1 R 3 Dタンパク質のアミノ酸配列 （配列番号 2) の一部の連続するァミノ酸の配列からなる部分べプチドであって、 好ま しくは、 前述の P P P 1 R 3 Dタンパク質の活性と同様の活性を有する ものであればいずれのものでも良い。 例えば、 配列番号 2で表されるァ ミノ酸配列において、 少なくとも 2 0個、 好ましくは少なくとも 5 0個、 さらに好ましくは少なく とも 7 0個、 より好ましくは少なくとも 1 0 0 個、 最も好ましくは少なく とも 2 0 0個のアミノ酸残基からなるアミノ 酸配列を有するポリペプチドなどが挙げられる。 好ましくは、 これらの ポリペプチドは、 P P P 1 R 3 Dタンパク質の活性に関与する部分に対 応するアミノ酸配列を含有する。 また、 本発明で使用される部分べプチ ドは、 上記のポリペプチドにおいて、 そのアミノ酸配列中の 1 または複 数個 （例えば、 1〜 2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さら により好ましくは 1〜 5個程度） のアミノ酸残基が欠失、 付加、 置換、 または挿入により変更されているものでもよい。 The PPP 1 R 3 D protein includes a “partial peptide” of the PPP 1 R 3 D protein. As a partial peptide of the PPP 1 R 3 D protein, a partial peptide consisting of a partial amino acid sequence of the amino acid sequence of the PPP 1 R 3 D protein (SEQ ID NO: 2) is preferable. Any one having the same activity as that of the aforementioned PPP 1 R 3 D protein may be used. For example, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, at least 20, preferably at least 50, more preferably at least 70, more preferably at least 100, most preferably at least And a polypeptide having an amino acid sequence consisting of 20 amino acid residues. Preferably, these polypeptides are paired with a portion involved in the activity of the PPP 1 R 3 D protein. Contains the corresponding amino acid sequence. In addition, the partial peptide used in the present invention is one or more of the above-mentioned polypeptides in the amino acid sequence (for example, about 1 to 20 and more preferably about 1 to 10). Further preferably, about 1 to 5 amino acid residues may be changed by deletion, addition, substitution, or insertion.

本発明で用いる P P P 1 R 3 Dタンパク質は、 そのタンパク質を発現 している細胞や組織から調製することができる。 また、 これらのタンパ ク質は、 公知のペプチド合成機によっても合成できるし、 原核生物ある いは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によつ ても調製することができる。 本発明で用いる P P P.1 R 3 Dタンパク質 は、 いずれの種由来のものでもよいが、 好ましくはヒ ト由来である。  The PPP1R3D protein used in the present invention can be prepared from cells or tissues expressing the protein. These proteins can also be synthesized by a known peptide synthesizer, or prepared by a recombinant method using an appropriate host cell selected from prokaryotic organisms or eukaryotic organisms. Can do. The P P P.1 R 3 D protein used in the present invention may be derived from any species, but is preferably derived from human.

「実質的に同質の活性」 とは、 それらの活性が性質的に同等であるこ とを示す。 したがって、 活性 （PP1 結合活性、 グリコーゲン結合活性な ど） が同等 （例えば、 約 0. 0 1〜 ： 1 0 0倍、 好ましくは約 0. 5〜 2 0倍、 より好ましくは約 0. 5〜 2倍） であることが好ましいが、 これ らの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていても よい。 これらの活性の測定は、 Armstrong, C. G. , et al. (1997) FEBS Lett. 418, 210-214 などの文献に記載の公知の方法に準じて行うこと ができるが、 例えば、 後に記載するスクリーニング方法に従って測定す ることができる。  “Substantially the same activity” indicates that these activities are qualitatively equivalent. Therefore, the activities (PP1 binding activity, glycogen binding activity, etc.) are equivalent (for example, about 0.01 to: 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to However, quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different. These activities can be measured according to known methods described in the literature such as Armstrong, CG, et al. (1997) FEBS Lett. 418, 210-214. For example, screening methods described later are used. Can be measured according to

なお、 アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 カーリンおよびアルチュ ールによるアルゴリズム B LA S T ( p r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 7 2 2 6 4 - 2 2 6 8 , 1 9 9 0 ; p r o c . N a t l . A c a d. S c i U S A 9 0 : 5 8 7 3， 1 9 9 3 ) を用いて決定できる。 B L A S Tのアルゴリズムに基づいた B L A S T Nや B LA S T Xと呼ばれるプログラムが開発されている （A l t s c h u l S F， e t a 1 ： J M o l B i o l 2 1 5 : 4 0 3 , 1 9 9 0 ) 。 B L A S T Nを用いて塩基配列を解析する場合は、 ノ、。ラメ一夕一は、 例えば s c o r e = 1 0 0、 wo r d l e n g t h = 1 2とする。 また、 B L A S T Xを用いてアミノ酸配列を解析する場合 は、 ノ ラメ一夕一は、 例えば s c o r e = 5 0、 wo r d l e n g t h = 3とする。 B LA S Tと G a p p e d B LAS Tプログラムを用い る場合は、 各プログラムのデフォルトパラメ一夕一を用いる。 The identity of amino acid sequences and nucleotide sequences is determined by the algorithm by Carlin and Arthur B LA ST (proc. Natl. A cad. Sci. USA 8 7 2 2 6 4-2 2 6 8, 1 9 9 0; proc. Natl. A cad. Sci USA 9 0: 5 8 7 3, 1 9 9 3). Programs called BLASTN and B LA STX based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, eta 1: JMol B iol 2 1 5: 4 0 3, 1 9 9 0). No, when analyzing the base sequence using BLASTN. Lame Isseki one is, for example scor e = 1 0 0, wo rdlength = 1 2 In addition, when analyzing amino acid sequences using BLASTX, it is assumed that, for example, score = 50 and wordlength = 3. When using B LA ST and Gapped B LAS T programs, the default parameters of each program are used.

本明細書中、 「がん治療剤」 という用語は、 抗癌剤、 癌転移阻害剤、 癌細胞のアポトーシス誘導剤、 癌細胞の増殖抑制剤、 癌細胞の浸潤抑制 剤、 がん予防剤等を含む意味で使用される。 なお、 本願明細書中、 用語 「癌 （または、 がん） 」 と 「腫瘍」 とは同じ意味を有する用語として使 用される。  In the present specification, the term “cancer therapeutic agent” includes anticancer agents, cancer metastasis inhibitors, cancer cell apoptosis inducers, cancer cell proliferation inhibitors, cancer cell infiltration inhibitors, cancer preventive agents, and the like. Used in meaning. In the present specification, the terms “cancer (or cancer)” and “tumor” are used as terms having the same meaning.

1. 1 P P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻害物質を含有するがん治療1. Cancer treatments containing substances that inhibit the expression of the 1 P P P 1 R 3 D gene

M M

本発明は、 1つの実施形態において、 P P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻 害物質を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。  In one embodiment, the present invention provides a cancer therapeutic agent containing a PPP 1 R 3 D gene expression inhibitor as an active ingredient.

本明細書中、 「P P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻害物質」 には、 P P P 1 R 3 D遺伝子の発現を阻害するものであれば制限はないが、 例えば、 ( i ) P P P 1 R 3 D遺伝子から P P P 1 R 3 D mRNAへの転写を 阻害する物質、 および （ i i ) P P P l R 3 D mRNAから P P P 1 R 3 D夕ンパク質への翻訳を阻害する物質が含まれる。  In the present specification, the “PPP 1 R 3 D gene expression inhibitor” is not limited as long as it inhibits the expression of the PPP 1 R 3 D gene. For example, (i) PPP 1 R 3 D A substance that inhibits transcription from a gene to PPP 1 R 3 D mRNA, and (ii) a substance that inhibits translation from PPP 1 R 3 D mRNA to PPP 1 R 3 D protein.

P P P 1 R 3 D遺伝子から P P P 1 R 3 D mRNAへの転写を阻害 する物質の例としては、  Examples of substances that inhibit transcription from P P P 1 R 3 D gene to P P P 1 R 3 D mRNA include:

( a) P P P 1 R 3 D遺伝子またはその一部に対するアンチセンス核酸、 (a) an antisense nucleic acid for the P P P 1 R 3 D gene or a part thereof,

(b) P P P 1 R 3 D遺伝子またはその一部に対するデコイ核酸、(b) a decoy nucleic acid for the P P P 1 R 3 D gene or a part thereof,

( c ) P P P 1 R 3 D遺伝子またはその一部に対してドミナントネガテ イブに作用する P P P 1 R 3 D遺伝子変異体、 あるいは (c) a P P P 1 R 3 D gene variant acting on a dominant negative for the P P P 1 R 3 D gene or a part thereof, or

(d) その他の転写阻害化合物  (d) Other transcription inhibitor compounds

などが含まれる。 Etc. are included.

また、 P P P 1 R 3 D mRNAから P P P 1 R 3 Dタンパク質への 翻訳を阻害する物質の例としては、 ( e ) P P P 1 R 3 D mRNAまたはその一部に対して RNA i作用 を有するポリヌクレオチド （例えば、 s i RN A) 、 Examples of substances that inhibit translation from PPP 1 R 3 D mRNA to PPP 1 R 3 D protein include: (e) a polynucleotide having an RNA i action on PPP 1 R 3 D mRNA or a part thereof (for example, siRNA),

( f ) P P P 1 R 3 D mR N Aまたはその一部に対するアンチセンス ポリヌクレオチド、  (f) an antisense polynucleotide against PPP1R3DmRNA or a part thereof,

( g ) P P P 1 R 3 D mRNAまたはその一部に対してリボザィム活 性を有するポリヌクレオチド、 あるいは  (g) a polynucleotide having ribozyme activity on PPP1R3D mRNA or a part thereof, or

(h) その他の翻訳阻害化合物  (h) Other translation inhibitor compounds

などが含まれる。 Etc. are included.

本明細書中、 「核酸」 とは R N Aまたは DN Aを意味する。 ここでい う 「核酸」 は、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修 飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいてもよい。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化 されたプリ ンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジ ン、 あるいはその他の複素環を含むものであって良い。 修飾されたヌク レオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた、 糖部分が修飾されてい て良く、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置 換されているか、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されて いてよい。  In the present specification, “nucleic acid” means R N A or DN A. As used herein, “nucleic acid” may contain not only purine and pyrimidine bases but also those with other heterocyclic bases that have been modified. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleosides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, for example, one or more hydroxyl groups are replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or ethers, amines, etc. It may be converted to a functional group.

本発明のがん治療剤においては、 P P P 1 R 3 D遺伝子の発現を RN A i効果により阻害する作用を有する核酸を有効成分として用いること ができる。 RNA i とは、 標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列 を有する二重鎖 RNAを細胞内に導入すると、 導入した外来遺伝子およ び標的内在性遺伝子の発現がいずれも阻害される現象のことをいう。 こ こで用いられる R N Aとしては、 例えば、 1 9〜 3 0塩基長の R N A干 渉を生ずる二重鎖 RNA、 例えば、 d s RNA (d o u b l e s t r a n d RNA) , s i RNA ( s ma l l i n t e r f e r i n g RNA) 又は s h RNA ( s h o r t h a i r p i n RNA) が挙 げられる。 このような RNAは、 リボソームなどの送達システムにより 所望の部位に局所送達させることも可能であり、 また上記二重鎖 R N A が生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができ る。 このような二重鎖 RNA (d s RNA、 s i RNAまたは s h RN A) の調製方法、 使用方法などは、 多くの文献から公知である （特表 2In the cancer therapeutic agent of the present invention, a nucleic acid having an action of inhibiting the expression of the PPP 1 R 3D gene by the RNAi effect can be used as an active ingredient. RNA i is a phenomenon in which the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene are both inhibited when a double-stranded RNA having the same or similar sequence as the target gene sequence is introduced into the cell. Say. Examples of RNA used here include double-stranded RNA that causes RNA interference of 19 to 30 bases in length, such as ds RNA (doublestrand RNA), si RNA (small interfering RNA), or sh RNA ( shorthairpin RNA). Such RNA can be locally delivered to a desired site by a delivery system such as ribosome. This can be expressed locally using a vector that produces. Methods for preparing and using such double-stranded RNA (dsRNA, siRNA or shRNA) are known from many literatures (Special Table 2).

0 0 2 - 5 1 6 0 6 2号 ； 米国公開許第 2 0 0 2 / 0 8 6 3 5 6 A 号 ； N a t u r e G e n e t i c s , 2 4 ( 2 ) ， F e b. ，0 0 2-5 1 6 0 6 2; US Publication No. 2 0 0 2/0 8 6 3 5 6 A; N at tur ge net tic s, 2 4 (2), F e b.

1 8 0 - 1 8 3 ； G e n e ： s i s , 2 6 ( 4 ) ， A P r i 1 ，1 8 0-1 8 3; G e ne: s i s, 2 6 (4), A P r i 1,

2 4 0 - 2 4 4 ； N a t u r e , S p e . 2 1 , 4 0 7 ： 6 8 0 2，2 4 0-2 4 4 ； N a tu r e, S p e. 2 1, 4 0 7: 6 8 0 2,

3 1 9 - 2 0 ， G e n e s & D e V . , V ο 1 . 1 6 ， ( 8 )3 1 9-2 0, Genes & De V., V ο 1. 1 6, (8)

A p r . 1 6 ， 9 4 8 - 9 5 8 ； Ρ r ο c . Ν a t 1 . A c a d . A p r. 1 6, 9 4 8-9 5 8; Ρ r ο c. Ν a t 1. A c a d.

「 「 「 "" "

S c i . U S A. ， 9 9 ( 8 ) , 1 6 A p r .. , o o 1 o — oS c i. U S A., 9 9 (8), 1 6 Ap r .., o o 1 o — o

2 0 ， S c i e n c e , 2 9 6 ( 5 5 6 7 ) ， 1 9 A P r . ， o o 0 - 5 5 3 ； P r o c N a t 1 . A c a d ' S c i . U2 0, S c i e n c e, 2 9 6 (5 5 6 7), 19 A P r., O o 0-5 5 3; P ro c Nat 1. A c a d 'S c i. U

S A A p r . 3 0， 9 9 ： 9 , 6 0 4 7 - 6 0 5 2 ； N a t u r e B i o t e c h n o 1 o g y , V o l . 2 0 ( 5 ) ， M a y， 4 9 7 - 5 0 0 ； N a t u r e B i o t e c h n o 1 o g y，SAA pr. 30, 9 9: 9, 6 0 4 7-6 0 52; Nature Biotechno 1 ogy, Vol. 2 0 (5), May, 4 9 7-50 0; Nature B iotechno 1 ogy,

V o 1 . 2 0 ( 5 ) , M a y, 5 0 0 - 5 0 8 ； N u c 1 e i cV o 1 .2 0 (5), May, 5 0 0-5 0 8; N u c 1 e i c

A c i d s R e s . ， M a y 1 5など） 。 A c i d s R e s., May 15, etc.).

本発明で用いられる R NA i効果を奏する二重鎖 R N Aの長さは、 通 常、 1 9〜 3 0塩基、 好ましくは 2 0 〜 2 7塩基、 よ Ό好ましくは 2 1 The length of the double-stranded RNA that exhibits the RNAi effect used in the present invention is usually 19 to 30 bases, preferably 20 to 27 bases, more preferably 21.

〜 2 5塩 、 最も好ましくは 2 1〜 2 3塩基である。 本発明においては 具体的には、 下記 s i R N A (実施例 3で使用） を用いることができる~ 25 salt, most preferably 21-23 bases. In the present invention, specifically, the following si R N A (used in Example 3) can be used.

(表 1 ) (table 1 )

Figure imgf000016_0001
本明細書中、 「アンチセンス核酸」 、 または 「アンチセンスポリヌク レオチド」 とは、 ある対象となる DNA領域の少なく とも一部に相補的 なポリヌクレオチドを有し、 そのポリヌクレオチドが当該領域の少なく とも一部とハイプリダイズすることができる核酸のことをいう。 本発明 のアンチセンス核酸は、 RNA、 DNA、 あるいは修飾された核酸 （R NA、 DNA) である。 本発明のアンチセンス核酸は、 RNA、 DNA、 あるいは修飾された核酸 （RNA、 DNA) である。 それらは二本鎖 D NA、 一本鎖 DNA、 二本鎖 RNA、 一本鎖 RNA、 さらに DNA : R NAハイブリ ツ ドであってもよい。 修飾された核酸の具体例としては、 核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 さらにはポリヌクレオチ ドアミ ドゃオリゴヌクレオチドアミ ドの分解に抵抗性を有するものなど が挙げられるが、 それらに限定されるものではない。
Figure imgf000016_0001
As used herein, “antisense nucleic acid” or “antisense polynucleotide” is complementary to at least a portion of a DNA region of interest. A nucleic acid having a polynucleotide which can be hybridized with at least a part of the region. The antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA). The antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA). They may be double stranded DNA, single stranded DNA, double stranded RNA, single stranded RNA, or even a DNA: RNA hybrid. Specific examples of modified nucleic acids include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and those that are resistant to degradation of polynucleotide amides and oligonucleotide amides. is not.

使用されるアンチセンス核酸は、 適当なプロモーターの下流に連結さ れ、 好ましくは 3 ' 側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。 こ のようにして調製された核酸は、 公知の方法を用いることで、 所望の動 物へ形質転換できる。 アンチセンス核酸の配列は、 形質転換される動物 が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好まし いが、 遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、 完全に相補的で なくてもよい。  The antisense nucleic acid to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side. The nucleic acid thus prepared can be transformed into a desired animal using a known method. The sequence of the antisense nucleic acid is preferably a sequence complementary to the endogenous gene of the animal to be transformed or a part thereof, but is completely complementary as long as the gene expression can be effectively suppressed. It doesn't have to be.

例えば、 P P P 1 R 3 D遺伝子の mR N Aの 5 ' 端近傍の非翻訳領域 に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、 遺伝子の翻訳阻害に効果的 である。 コード領域もしくは 3 ' 側の非翻訳領域に相補的な配列も使用 することができる。 遺伝子の翻訳阻害に効果的なアンチセンス核酸は、 標的遺伝子の転写産物に対して約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相補性を 有する。  For example, designing an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 'end of the mRNA of the PPPP1R3D gene is effective in inhibiting gene translation. A sequence complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used. Antisense nucleic acid effective for inhibiting gene translation is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more of the transcript of the target gene. % Complementarity.

アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、 アンチセンス核酸の長さは少なくとも約 1 0塩基以上 （例えば、 1 0〜 40個程度） 、 好ましくは約 1 5塩基以上であり、 より好ましくは約 1 0 0塩基以上であり、 さらに好ましくは約 5 0 0塩基以上である。 アン チセンス核酸は公知の文献を参照して設計することができる （例えば、 平島および井上、 新生化学実験講座 2 核酸 Γ V遺伝子の複製と発現、 日本生化学会編、 東京化学同人、 1 9 9 3、 p. 3 1 9— 3 4 7 ) 、 J . K a w a k a m i e t a 1 . ， P h a r m T e c h J a p a n . V o l . 8 , p . 2 4 7 , 1 9 9 2 ； V o 1. 8， p. 3 9 5 , 1 9 9 2 ; S . T . C r o o k e e t a l . , e d. , An t i s e n s e R e s e a r c h a n d Ap p l i c a t i o n s , C R C P r e s s , 1 9 9 3など参照） 。 In order to effectively suppress the expression of a target gene using an antisense nucleic acid, the length of the antisense nucleic acid is at least about 10 bases (for example, about 10 to 40 bases), preferably about 15 bases or more. More preferably about 100 bases or more, and still more preferably about 500 bases or more. Antisense nucleic acids can be designed with reference to known literature (for example, Hirashima and Inoue, Laboratory for Neonatal Chemistry 2 Replication and Expression of Nucleic Acid Γ V Gene, edited by The Japanese Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin, 1 9 9 3, p. 3 1 9− 3 4 7), J. Kawakamieta 1, V ol. 8, p. 2 4 7, 1 9 9 2; V o 1.8, p. 3 9 5, 1 9 9 2; S. T. C rookeetal., Ed , Antisense Research and Applications, CRCP ress, 1 9 9 3 etc.).

また、 本発明のがん治療剤においては、 P P P 1 R 3 D遺伝子の転写 産物を特異的に切断するリポザィム活性を有する核酸を有効成分として 用いることができる。 ここでいう 「リボザィム活性.」 とは、 ターゲッ ト とする遺伝子の転写産物である mR N Aを部位特異的に切断する核酸の ことをいう。 リボザィムには、 グループ Iイントロン型や R N a s e P に含まれる M l RNAのように 4 0 0ヌクレオチド以上の大きさのも のもある力 ハンマーへッ ド型ゃヘアピン型と呼ばれる 40ヌクレオチ ド程度の活性ドメインを有するものもある （タンパク質核酸酵素、 1 9 9 0、 3 5、 p . 2 1 9 1 ) 。 ノ、ンマ一ヘッ ド型リボザィムについては、 例えば、 F E B S L e t t , 1 9 8 8， 2 2 8 , p. 2 2 8 ； F E B S L e t t , 1 9 8 8 , 2 3 9 , p. 2 8 5 ； タンパク質核酸酵素， 1 9 9 0 , 3 5 , p . 2 1 9 1 ; N u c l A c i d s R e s , 1 9 8 9 , 1 7， p . 7 0 5 9などを参照することができる。 また、 ヘアピ ン型リボザィムについては、 例えば、 N a t u r e , 1 9 8 6， 3 2 3 , p. 3 4 9 ； N u c 1 A c i d s R e s , 1 9 9 1 , 1 9， p. 6 7 5 1 ; 菊池洋， 化学と生物， 1 9 9 2 , 3 0 , p . 1 1 2などを参照 することができる。 このようなリボザィムを用いて本発明における P P P 1 R 3 D遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、 該遺伝子の発 現を阻害することができる。  In addition, in the cancer therapeutic agent of the present invention, a nucleic acid having a lipozyme activity that specifically cleaves a transcription product of a PPP 1 R 3D gene can be used as an active ingredient. As used herein, “ribozyme activity” refers to a nucleic acid that cleaves site-specifically mRNA, which is a transcription product of a target gene. Ribozymes have a strength of 40 nucleotides or more, such as the group I intron type and MRNA contained in RNase P. The hammerhead type is about 40 nucleotides called the hairpin type. Some have an active domain (protein nucleic acid enzyme, 1990, 35, p. 2 191). For example, FEBSL ett, 1 9 8 8, 2 2 8, p. 2 2 8; FEBSL ett, 1 9 8 8, 2 3 9, p. 2 8 5; protein Reference can be made to nucleic acid enzymes, 1 990, 3 5, p. 2 1 9 1; Nucl Acids Res, 1 9 8 9, 1 7, p. For hairpin ribozymes, see, for example, Nature, 1 986, 3 2 3, p. 3 4 9; Nuc 1 A cids R es, 1 9 9 1, 1 9, p. 6 7 5 1; You can refer to Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology, 1 992, 30, p. By specifically cleaving the transcription product of the PPP 1 R 3 D gene in the present invention using such a ribozyme, the expression of the gene can be inhibited.

さらに、 本発明は、 P P P 1 R 3 D遺伝子の転写活性を阻害する核酸 以外の化合物を有効成分として用いることができる。 そのような化合物 は、 例えば、 P P P 1 R 3 D遺伝子の発現 · 転写に関与する因子に結合 する化合物である。 このような化合物は、 天然物でも合成化合物でもよ レ このような化合物は、 後述のスクリーニング方法によって、 取得す ることが可能である。 1. 2 P P P 1 R 3 Dタンパク質の活性阻害物質を含有するがん 治療剤 Furthermore, in the present invention, a compound other than a nucleic acid that inhibits the transcriptional activity of the PPP 1 R 3 D gene can be used as an active ingredient. Such compounds bind to factors involved in the expression and transcription of the PPP 1 R 3 D gene, for example. It is a compound. Such a compound may be a natural product or a synthetic compound. Such a compound can be obtained by the screening method described below. 1. 2 Cancer treatments containing inhibitors of PPP 1 R 3 D protein activity

本発明はまた、 別の実施形態において、 P P P 1 R 3 Dタンパク質の 活性阻害物質を含有するがん治療剤を提供する。  In another embodiment, the present invention also provides a cancer therapeutic agent containing a PPP 1 R 3 D protein activity inhibitor.

本明細書中、 「P P P 1 R 3 Dタンパク質の活性阻害物質」 には、 例 えば、  In this specification, “inhibitors of P P P 1 R 3 D protein activity” include, for example,

( a) P P P 1 R 3 Dタンパク質に結合する抗体、  (a) an antibody that binds to the P P P 1 R 3 D protein,

( b ) P P P 1 R 3 Dタンパク質に対してドミナントネガティブの性 質を有する P P P 1 R 3 Dタンパク質変異体、 あるいは  (b) a P P P 1 R 3 D protein variant having a dominant negative property to the P P P 1 R 3 D protein, or

( c ) P P P 1 R 3 D夕ンパク質に結合する化合物 （上記抗体および 変異体を除く）  (c) Compounds that bind to PPP1R3D proteins (excluding antibodies and mutants above)

などが含まれる。 Etc. are included.

本明細書における 「抗体」 とはタンパク質の全長又は断片に反応する 抗体を意味する。 本発明の抗体の形態には、 特に制限はなく、 本発明の P P P 1 R 3 D夕ンパク質に結合する限り、 上記ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体のほかに、 ヒ ト抗体、 遺伝子組み換えによるヒ ト型 化抗体、 さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。 P P P 1 R 3 D タンパク質に結合する抗体 （抗 P P P 1 R 3 D抗体） は、 当業者に公知 の方法により調製することが可能である。 なお、 抗 P P P 1 R 3 D抗体 の詳細については後述する。  As used herein, “antibody” means an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, as long as it binds to the PPP 1 R 3 D protein of the present invention, in addition to the polyclonal antibody and the monoclonal antibody described above, a human antibody, a human recombinant human form Antibodies, antibody fragments thereof, and modified antibodies are also included. Antibodies that bind to PPP1R3D protein (anti-PPPP1R3D antibodies) can be prepared by methods known to those skilled in the art. Details of the anti-PPPP1R3D antibody will be described later.

本明細書における 「P P P 1 R 3 Dタンパク質に対してドミナントネ ガティブの性質を有する P P P 1 R 3 Dタンパク質変異体」 とは、 それ をコードする遺伝子を発現させることによって、 内在性の野生型 P P P 1 R 3 Dタンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタン パク質を指す （土田邦博著、 遺伝子の活性阻害実験法 多比良和誠編、 羊土社 （ 2 0 0 1 ) 2 6 - 3 2など参照） 。 In this specification, “a PPP 1 R 3 D protein mutant having a dominant negative property with respect to the PPP 1 R 3 D protein” refers to an endogenous wild-type PPP by expressing a gene encoding the same. 1 Refers to a protein that has the function of eliminating or reducing the activity of R 3 D protein (Kunihiro Tsuchida, Gene Activity Inhibition Experiment, edited by Yoshikazu Tahira, Yodosha (see 2 0 0 1) 2 6-3 2 etc.).

さらに、 本発明においては、 P P P 1 R 3 Dタンパク質の活性を阻害 し得る物質として、 P P P 1 R 3 Dタンパク質に結合する、 上記抗体ま たは変異体以外の化合物を有効成分として用いることができる。 そのよ うな化合物は、 例えば、 P P P 1 R 3 Dタンパク質に結合し、 その活性 を阻害する化合物である。 このような化合物は、 天然物でも合成化合物 でもよい。 このような化合物は、 後述のスクリーニング方法によって、 取得することが可能である。  Furthermore, in the present invention, as a substance capable of inhibiting the activity of the PPP 1 R 3 D protein, a compound other than the above antibody or mutant that binds to the PPP 1 R 3 D protein can be used as an active ingredient. . Such a compound is, for example, a compound that binds to the PPP 1 R 3 D protein and inhibits its activity. Such compounds may be natural products or synthetic compounds. Such a compound can be obtained by the screening method described below.

上記した本発明の P P P 1 R 3 Dタンパク質の活性を阻害し得る物質 は、 がん治療剤として使用することができる。  The above-mentioned substance capable of inhibiting the activity of the PPP1R3D protein of the present invention can be used as a cancer therapeutic agent.

2. P P P 1 R 3 Dタンパク質の活性もしくは発現を阻害する物質の スクリーニング方法 2. Screening method for substances that inhibit the activity or expression of P P P 1 R 3 D protein

本発明は、 がん抑制作用を有する候補化合物のスクリ一二ング方法を も提供する。  The present invention also provides a method for screening a candidate compound having a cancer suppressing action.

一つの好ましい態様は、 P P P 1 R 3 Dタンパク質と被検化合物との 結合を指標とする方法である。 通常、 P P P 1 R 3 Dタンパク質と結合 する化合物は、 P P P 1 R 3 Dタンパク質の活性を阻害する効果を有す ることが期待される。 ここで、 該化合物は、 P P P 1 R 3 Dタンパク質 の活性部位に結合することが好ましい。 本方法においては、 まず、 P P P 1 R 3 Dタンパク質と被検化合物とを接触させる。 P P P 1 R 3 D夕 ンパク質は、 被検化合物との結合を検出するための指標に応じて、 例え ば、 P P P 1 R 3 Dタンパク質の精製された形態、 細胞内または細胞外 に発現した形態、 あるいはァフィ二ティ一力ラムに結合した形態であり 得る。 この方法に用いる被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いる ことができる。 標識としては、 例えば、 放射標識、 蛍光標識等を挙げる ことができる。  One preferred embodiment is a method using as an index the binding between the PPP 1 R 3 D protein and the test compound. Usually, a compound that binds to PPP1R3D protein is expected to have an effect of inhibiting the activity of PPPP1R3D protein. Here, it is preferable that the compound binds to the active site of the PPP1R3D protein. In this method, first, P P P 1 R 3 D protein is contacted with a test compound. The PPP 1 R 3 D protein may be a purified form of the PPP 1 R 3 D protein, for example, a form expressed intracellularly or extracellularly, depending on the indicator for detecting binding to the test compound. Or it can be in the form of an affinity ram. The test compound used in this method can be appropriately labeled as necessary. Examples of the label include a radiolabel and a fluorescent label.

本方法においては、 次いで、 P P P 1 R 3 Dタンパク質と被検化合物 との結合を検出する。 本方法に用いる被検化合物としては、 特に制限はない。 例えば、 天然 化合物、 有機化合物、 無機化合物、 タンパク質、 ペプチドなどの単一化 合物、 並びに、 化合物ライブラリー、 遺伝子ライブラリーの発現産物、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海洋生物抽出物、 植物 抽出物等が挙げられるが、 これらに限定されない。 Next, in this method, the binding between the PPP 1 R 3 D protein and the test compound is detected. There is no restriction | limiting in particular as a test compound used for this method. For example, natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, peptides, etc., as well as compound libraries, gene library expression products, cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, oceans Examples include, but are not limited to, biological extracts and plant extracts.

P P P 1 R 3 Dタンパク質と被検化合物との結合は、 例えば、 P P P 1 R 3 Dタンパク質に結合した被検化合物に付された標識によって検出 ― することができる。 また、 細胞内または細胞外に発現している P P P 1 R 3 Dタンパク質への被検化合物の結合により生じる P P P 1 R 3 D夕 ンパク質の活性の変化を指標として検出することもできる。 タンパク質 . と被検化合物との結合活性は、 公知の手法によって測定することができ る （例えば、 PP1 結合活性、 グ リ コーゲン結合活性な どの測定 (Armstrong, C. G. , et al. (1997) FEBS Lett. 418, 210-214) ) 。  The binding between the PPP1R3D protein and the test compound can be detected by, for example, a label attached to the test compound bound to the PPP1R3D protein. In addition, a change in the activity of the PPP1R3D protein caused by the binding of the test compound to the PPP1R3D protein expressed inside or outside the cell can also be detected as an index. The binding activity between a protein and a test compound can be measured by a known method (for example, measurement such as PP1 binding activity, glycogen binding activity (Armstrong, CG, et al. (1997) FEBS Lett 418, 210-214)).

本方法においては、 次いで、 P P P 1 R 3 Dタンパク質と結合し、 そ の活性を阻害する被検化合物を選択する。  In this method, a test compound that binds to PPP 1 R 3 D protein and inhibits its activity is then selected.

本方法により単離される化合物は、 がん抑制作用を有することが期待 され、 がん治療剤として有用である。  The compound isolated by this method is expected to have a cancer suppressing action and is useful as a cancer therapeutic agent.

本発明のスクリーニング方法の他の態様は、 P P P 1 R 3 D遺伝子の 発現を指標とする方法である。  Another embodiment of the screening method of the present invention is a method using the expression of the PPP 1 R 3 D gene as an index.

本方法においては、 まず、 P P P 1 R 3 D遺伝子を発現する細胞に、 被検化合物を接触させる。 用いられる 「細胞」 の由来としては、 ヒ ト、 マウス、 ネコ、 ィヌ、 ゥシ、 ヒッジ、 トリなど、 ペッ ト、 家畜等に由来 する細胞が挙げられるが、 これら由来に制限されない。 「P P P 1 R 3 D遺伝子を発現する細胞」 としては、 内因性の P P P 1 R 3 D遺伝子を 発現している細胞、 または外因性の P P P 1 R 3 D遺伝子が導入され、 該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。 外因性の P P P 1 R 3 D遺伝子が発現した細胞は、 通常、 それぞれ P P P 1 R 3 D遺伝 子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製する ことができる。 該発現べクタ一は、 一般的な遺伝子工学技術によって作 製することができる。 In this method, first, a test compound is brought into contact with a cell expressing the PPP 1 R 3 D gene. Examples of the origin of the “cell” used include, but are not limited to, cells derived from pets, livestock, etc. such as humans, mice, cats, cats, dogs, lions, hedgehogs, and birds. “PPP 1 R 3 D gene-expressing cell” refers to a cell expressing an endogenous PPP 1 R 3 D gene or an exogenous PPP 1 R 3 D gene introduced and the gene is expressed. Cells can be used. Cells in which an exogenous PPP 1 R 3 D gene is expressed can usually be prepared by introducing an expression vector into which a PPP 1 R 3 D gene has been inserted into a host cell. The expression vector is produced by general genetic engineering techniques. Can be made.

本方法に用いる被検化合物としては、 特に制限はないが、 例えば、 天 然化合物、 有機化合物、 無機化合物、 タンパク質、 ペプチドなどの単一 化合物、 並びに、 化合物ライブラリー、 遺伝子ライブラリ一の発現産物、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海洋生物抽出物、 植物 抽出物等が用いられる。  The test compound used in this method is not particularly limited. For example, natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, single compounds such as proteins and peptides, compound libraries, expression products of gene libraries, Cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, etc. are used.

P P P 1 R 3 D遺伝子を発現する細胞への被検化合物の 「接触」 は、 - 通常、 それぞれ P P P 1 R 3 D遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化 合物を添加することによって行うカ^ この方法に限定されない。 被検化 合物がタンパク質等の場合には、 該タンパク質を発現する D N Aベクタ 一を、 該細胞へ導入することにより、 「接触」 を行うことができる。  “Contacting” a test compound with cells expressing the PPP 1 R 3 D gene is usually performed by adding the test compound to the culture medium of cells expressing the PPP 1 R 3 D gene, respectively. I'm not limited to this method. When the test compound is a protein or the like, “contact” can be performed by introducing a DNA vector that expresses the protein into the cell.

本方法においては、 次いで、 該 P P P 1 R 3 D遺伝子の発現レベルを 測定する。 ここで 「遺伝子の発現」 には、 転写および翻訳の双方が含ま れる。 遺伝子の発現レベルの測定は、 当業者に公知の方法によって行う ことができる。 例えば、 P P P 1 R 3 D遺伝子を発現する細胞から mR NAを常法に従って抽出し、 この mRNAを铸型としたノーザンハイブ リダイゼーション法または RT— P C R法を実施することによって該遺 伝子の転写レベルの測定を行うことができる。 あるいは、 P P P 1 R 3 D遺伝子のプロモーター領域を常法に従って単離し、 その下流に標識遺 伝子 （例えば、 ルシフェラーゼ、 G F P、 ガラク トシダーゼ等の発光、 蛍光、 発色などを指標に検出可能な遺伝子が挙げられるが、 これらに限 定されない） をつなげ、 その標識遺伝子の活性を見ることによっても該 遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。 また、 P P P 1 R 3 D 遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、 それぞれ P P P 1 R 3 Dタンパク質の発現を S D S— P A G E等の電気泳動法で検出する ことにより、 遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。 さらに、 P P P 1 R 3 Dタンパク質に対する抗体を用いて、 ウエスタンブロッテ イ ング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することによ り、 遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。 P P P 1 R 3 Dタンパク質の検出に用いる抗体としては、 検出可能な抗体であれば、 特に制限はないが、 例えばモノクローナル抗体、 またはポリクローナル 抗体の両方を利用することができる。 In this method, the expression level of the PPP 1 R 3 D gene is then measured. Here, “gene expression” includes both transcription and translation. The expression level of the gene can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, mRNA is extracted from cells expressing the PPP 1 R 3D gene according to a conventional method, and transcription of the gene is carried out by performing Northern hybridization or RT-PCR using this mRNA as a cocoon. Level measurements can be made. Alternatively, the promoter region of the PPP 1 R 3 D gene is isolated according to a conventional method, and a gene that can be detected downstream using a labeled gene (for example, luminescence, fluorescence, color development, etc. of luciferase, GFP, galactosidase, etc.) The transcription level of the gene can also be measured by observing the activity of the marker gene. In addition, protein fractions are collected from cells expressing the PPP 1 R 3 D gene, and the expression level of the PPP 1 R 3 D protein is detected by electrophoresis such as SDS-PAGE. Can also be done. Furthermore, it is also possible to measure the translation level of a gene by detecting the expression of the protein by performing Western blotting using an antibody against the PPP 1 R 3 D protein. . PPP 1 R 3 The antibody used for detection of D protein is not particularly limited as long as it is a detectable antibody. For example, both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used.

本方法においては、 次いで、 被検化合物を接触させない場合 （コント ロール） と比較して、 該発現レベルを低下させる化合物を選択する。 こ のようにして選択された化合物は、 がん治療剤のための候補化合物とな る。  In this method, a compound that decreases the expression level is then selected as compared with the case where the test compound is not contacted (control). Compounds selected in this way become candidate compounds for cancer therapeutics.

3. 抗 P P P 1 R 3 D抗体及びこの抗体を含有する治療剤、 複合体お よび組成物 3. Anti-PPPP1R3D antibody and therapeutic agent, complex and composition containing this antibody

本発明はまた、 抗 P P P 1 R 3 D抗体、 この抗体を含有するがん治療 剤などを提供する。 本発明の 1つの好ましい態様では、 上記がん治療剤 は、 がんの標的化療法または標的化薬物送達のために使用される。 3. 1 抗 P P P 1 R 3 D抗体  The present invention also provides an anti-PPPP1R3D antibody, a cancer therapeutic agent containing the antibody, and the like. In one preferred embodiment of the present invention, the cancer therapeutic agent is used for targeted therapy or targeted drug delivery of cancer. 3.1 Anti-P P P 1 R 3 D antibody

本明細書中、 「抗 P P P 1 R 3 D抗体」 には、 P P P 1 R 3 Dタンパ ク質 （その断片 （部分ペプチド） もしくはその塩を含む） に特異的に結 合する抗体が含まれる。 本発明において使用する抗 P P P 1 R 3 D抗体 は、 ポリクロ一ナル抗体であってもよいし、 モノクローナル抗体であつ てもよい。 抗体のクラスは、 特に限定されず、 I g G、 I gM、 I gA、 I g D、 または I g E等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含 する。 好ましくは、 I g Gまたは I gMであり、 精製の容易性等を考慮 すると、 より好ましくは I g Gである。 また、 ここでいう 「抗体」 とい う用語は、 任意の抗体断片または誘導体を含む意味で用いられ、 例えば、 F a b , F a b ' 2、 C D R、 ヒ ト化抗体、 多機能抗体、 単鎖抗体 （S c F V ) などを含む。 本発明の抗体は、 公知の方法で製造することがで きる。 このような抗体の製造法は当該分野で周知である （例えば H a r l ow E . & L a n e D. ， An t i b o d y, C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s ( 1 9 8 8 ) を参照） 。 In the present specification, “anti-PPP 1 R 3D antibody” includes an antibody that specifically binds to a PPP 1 R 3 D protein (including fragments (partial peptides) or salts thereof). The anti-PPP 1 R 3D antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. The class of the antibody is not particularly limited, and includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE. IgG or IgM is preferable, and IgG is more preferable in consideration of ease of purification. The term “antibody” used herein is used to include any antibody fragment or derivative. For example, F ab, F ab ' 2 , CDR, humanized antibody, multifunctional antibody, single chain antibody (Sc FV). The antibody of the present invention can be produced by a known method. Methods for producing such antibodies are well known in the art (see, for example, Harrowow E. & Lane D., Antibody, Cold Spring Harbor Laboratory Pres (1 9 8 8))).

( 1 ) 抗原の調製  (1) Preparation of antigen

本発明において、 感作抗原として使用されるタンパク質は、 通常、 P P P 1 R 3 D夕ンパク質またはその塩である。 上記 P P P 1 R 3 Dタン パク質には、 その部分ペプチドも含まれ、 これは、 限定されることはな いが、 例えば、 配列番号 2のアミノ酸配列の断片であって、 例えば、 2 0個以上、 4 0個以上、 6 0個以上、 8 0個以上、 1 0 0個以上の、 連 続するアミノ酸配列部分を有する部分ペプチドである。 これらの断片と して、 例えば、 ァミノ （N) 末端断片やカルボキシ （C) 末端断片が用 いられる。 本発明で用いられる部分ペプチドは、 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 個 （ 1〜 6個） ） のアミノ酸残基が欠失、 置換、.挿入及び 又は付加さ れたものであってもよい。 ここで用いられる P P P 1 R 3 Dタンパク質 またはその部分ペプチドの塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸） との塩などが用いられる。 抗体取得の感作抗原として使用される本発明 の P P P 1 R 3 Dタンパク質は、 その由来となる動物種に制限されない が哺乳動物、 例えばマウス、 ヒ ト由来のタンパク質が好ましく、 特にヒ ト由来のタンパク質が好ましい。  In the present invention, the protein used as the sensitizing antigen is usually P P P 1 R 3 D protein or a salt thereof. The PPP 1 R 3 D protein includes a partial peptide thereof, which is not limited to, for example, a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, 20 These are partial peptides having 40 or more, 60 or more, 80 or more, 100 or more consecutive amino acid sequence portions. As these fragments, for example, amino (N) terminal fragment and carboxy (C) terminal fragment are used. In the partial peptide used in the present invention, one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 6)) amino acid residues in the amino acid sequence are deleted. It may be a substitution, insertion and / or addition. Examples of salts of the PPP 1 R 3 D protein or partial peptide thereof used herein include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, sulfuric acid), or salts with organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid). Etc. are used. The PPP 1 R 3 D protein of the present invention used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is not limited to the animal species from which it is derived, but is preferably a protein derived from a mammal such as a mouse or human, particularly from human. Protein is preferred.

( 2 ) P P P 1 R 3 Dタンパク質に対するモノクローナル抗体の作製 ( i ) 抗体産生細胞の採取  (2) Production of monoclonal antibody against PPP1R3D protein (i) Collection of antibody-producing cells

上記のような P P P 1 R 3 Dタンパク質、 その部分べプチド又はその 塩 （本明細書中、 抗体に関する説明では、 これらをまとめて、 「P P P 1 R 3 Dタンパク質」 という。 ） を抗原として、 哺乳動物、 例えばラッ ト、 マウス、 ゥサギなどに投与する。 抗原の動物 1匹当たりの投与量は、 アジュバントを用いないときは 0. 1〜：！ O O mgであり、 アジュバン トを用いるときは l〜 1 0 0 gである。 アジュバントとしては、 フロ イン 卜完全アジュバン ト （ F C A) 、 フロイン ト不完全アジュバン ト (F I A) 、 水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。 免疫は、 主として静脈内、 皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。 ま た、 免疫の間隔は特に限定されず、 数日から数週間間隔、 好ましくは 2 〜 5週間間隔で、 1〜 1 0回、 好ましくは 2〜 5回免疫を行う。 そして、 最終の免疫日から 1〜 6 0日後、 好ましくは 1〜 1 4日後に抗体産生細 胞を採集する。 抗体産生細胞としては、 脾臓細胞、 リンパ節細胞、 末梢 血細胞等が挙げられるが、 脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。 The above-mentioned PPP 1 R 3 D protein, a partial peptide thereof or a salt thereof (in the present specification, these are collectively referred to as “PPP 1 R 3 D protein”) as an antigen. Administer to animals such as rats, mice, and rabbits. The antigen dose per animal is 0.1 to 1 when no adjuvant is used! OO mg, l to 100 g when adjuvant is used. Examples of adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunity is It is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally. Further, the immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 2 to 5 weeks. Then, antibody-producing cells are collected 1 to 60 days after the last immunization day, preferably 1 to 14 days later. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, and peripheral blood cells, and spleen cells or local lymph node cells are preferred.

( i i ) 細胞融合  (i i) Cell fusion

ハイプリ ドーマを得るため、 抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞 融合を行う。 抗体産生細胞と融合させるミエ口一マ細胞として、 マウス などの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用する,ことができる。 使用 する細胞株としては、 薬剤選択性を有し、 未融合の状態では HAT選択 培地 （ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジンを含む） で生存でき ず、 抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが 好ましい。 ミエローマ細胞としては、 例えば X 6 3 A g. 8. 6 5 3、 N S I Z 1— A g 4— 1、 N S 0ノ 1などのマウスミエローマ細胞株、 YB 2ノ 0などのラッ トミエローマ細胞株が挙げられる。  Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed in order to obtain a hybridoma. Generally available cell lines of animals such as mice can be used as the myeloma cells to be fused with antibody-producing cells. The cell line to be used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. It is preferable to have Examples of myeloma cells include mouse myeloma cell lines such as X 6 3 A g. 8. 65 3, NSIZ 1—A g 4-1, NS 0-1 and rat myeloma cell lines such as YB 2-0. It is done.

次に、 上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。 細胞 融合は、 血清を含まない DM EM、 R P M I — 1 6 4 0培地などの動物 細胞培養用培地中で、 1 X I 06〜 1 X I 07個 m l の抗体産生細胞 と 2 X 1 05〜 2 X 1 06個ノ m 1 のミエローマ細胞とを混合し （抗体 産生細胞とミエローマ細胞との細胞比 2 ： 1〜 3 ： 1が好ましい） 、 細 胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。 細胞融合促進剤として、 平 均分子量 1 0 0 0〜 6 0 0 0ダルトンのポリエチレンダリコール等を使 用することができる。 また、 電気刺激 （例えばエレク ト口ポレーショ ン） を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ 細胞とを融合させることもできる。 Next, the myeloma cell and the antibody-producing cell are fused. Cell fusion consists of 1 XI 0 6 to 1 XI 0 7 ml antibody-producing cells and 2 X 1 0 5 to 1 in animal cell culture media such as serum-free DM EM, RPMI — 1 6 40 2 X 1 0 6 or Roh m 1 of the myeloma cells were mixed (antibody producing cells and the myeloma cells cell ratio 2: 1 to 3: 1 is preferred), under the promoter present cells fused fusion reaction I do. As the cell fusion promoter, polyethylene dalycol having an average molecular weight of 1000 to 600,000 Dalton can be used. In addition, antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device using electrical stimulation (for example, electoral position).

( i i i ) ハイプリ ドーマの選別及びクローニング  (i i i) Selection and cloning of high-pridoma

細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリ ドーマを選別する。 そ の方法として、 細胞懸濁液を例えばゥシ胎児血清含有 R PM I — 1 64 0培地などで適当に希釈後、 マイクロタイ夕一プレート上に 3 X 1 0 5 個/ w e 1 1 程度まき、 各ゥエルに選択培地を加え、 以後適当に選択培 地を交換して培養を行う。 その結果、 選択培地で培養開始後、 1 4日前 後から生育してくる細胞をハイプリ ドーマとして得ることができる。 次に、 増殖してきたハイプリ ドーマの培養上清中に、 P P P 1 R 3 D 夕ンパク質に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。 ハ イブリ ドーマのスクリーニングは、 通常の方法に従えばよく、 特に限定 されるものではない。 例えば、 ハイプリ ドーマとして生育したゥエルに 含まれる培養上清の一部を採集し、 酵素免疫測定法、 放射性免疫測定法 等によってスクリーニングすることができる。 融合細胞のクローニング は、 限界希釈法等により行う。 そして、 最終的に、 P P P 1 R 3 Dタン パク質と反応するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイプリ ド 一マを樹立する。 Select the desired hybridoma from the cells after cell fusion treatment. As a method for this, cell suspensions, for example, containing rabbit fetal serum R PM I — 1 64 After appropriate dilution, etc. 0 medium, 3 X 1 0 5 cells in microtiter evening one plate / we 1 1 about Maki, a selective medium to each Ueru added, the culture is performed by appropriately replacing the selective culture place . As a result, cells that grow 14 days before or after the start of culture in the selective medium can be obtained as a hybridoma. Next, the culture supernatant of the growing hybridoma is screened for the presence of antibodies that react with the PPP 1 R 3 D protein. The screening for hybridomas is not particularly limited, as long as the usual method is followed. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma can be collected and screened by an enzyme immunoassay, a radioimmunoassay, or the like. Cloning of fused cells is performed by limiting dilution. Finally, a hybridoma, which is a cell producing a monoclonal antibody that reacts with the PPP 1 R 3 D protein, is established.

( i V ) モノクローナル抗体の採取  (i V) Monoclonal antibody collection

上記のようにして得たハイプリ ドーマからモノクローナル抗体を採取 する方法として、 通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することが できる。 細胞培養法においては、 ハイプリ ドーマを 1 0 %ゥシ胎児血清 含有 R P M I - 1 6 4 0培地、 M E M培地又は無血清培地等の動物細胞 培養培地中で、 通常の培養条件 （例えば 3 7で、 5 % C〇2濃度） で 7 ~ 1 4日間培養し、 その培養上清から抗体を取得する。 腹水形成法の 場合は、 ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内に八イブ リ ドーマを約 1 X I 0 7個投与し、 ハイプリ ドーマを大量に増殖させる。 そして、 1〜 2週間後に腹水を採取する。 上記抗体の採取方法において 抗体の精製が必要とされる場合は、 硫安塩析法、 イオン交換クロマトグ ラフィー、 ゲル濾過、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなどの公知の 方法を適宜選択して、 又はこれらを組み合わせることにより精製するこ とができる。 As a method for collecting a monoclonal antibody from the hybridoma obtained as described above, a normal cell culture method, ascites formation method, or the like can be employed. In the cell culture method, hypridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium, MEM medium or serum-free medium containing 10% urushi fetal serum under normal culture conditions (for example, 37) 5% C_〇 2 concentration) 7 cultured ~ 1 4 days to obtain the culture supernatant antibody. For ascites formation method, intraperitoneally mammalian the same species animal-derived myeloma cells administered eight drive re dormer about 1 XI 0 7 cells, is mass proliferating High Priestess dormer. Ascites is collected after 1-2 weeks. When antibody purification is required in the antibody collection method, known methods such as ammonium sulfate salting out, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, etc. are appropriately selected, or a combination thereof is used. Can be purified.

( 3 ) P P P 1 R 3 Dタンパク質に対するポリクローナル抗体の作製 まず、 上記した抗原を哺乳動物、 例えばラッ ト、 マウス、 ゥサギなど に投与する。 抗原の動物 1匹当たりの投与量は、 アジュバントを用いな いときは 0. 1〜： L O O mgであり， アジュバントを用いるときは 1 0 〜 1 0 0 0 gである。 アジュバントとしては、 フロイント完全アジュ バント （F C A) 、 フロイント不完全アジュバント （F I A) 、 水酸化 アルミニウムアジュバント等が挙げられる。 免疫は、 主として静脈内、 皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。 また、 免疫の間隔は 特に限定されず、 数日から数週間間隔、 好ましくは 2〜 5週間間隔で、 1〜 1 0回、 好ましくは 2〜 5回免疫を行う。 そして、 最終の免疫日か ら 6〜 6 0 日後に、 酵素免疫測定法 （E L I S A ( e n z ume— 1 i n k e d i mmu n o s o r b e n t a s s y,) 又は E I A ( e n z ym e i mm u n o a s s a y) ) 、 放射性免疫測定法 （R I A ; r a d i o i mmu n o a s s a y) 等で抗体価を測定 、 最大 の抗体価を示した日に採血し、 抗血清を得る。 (3) Preparation of polyclonal antibody against PPP 1 R 3 D protein First, the above antigen is used in mammals such as rats, mice, and rabbits. To be administered. The dose of antigen per animal is 0.1 to LOO mg when no adjuvant is used, and 10 to 100 g when adjuvant is used. Examples of adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally. Further, the immunization interval is not particularly limited, and immunization is carried out 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 2 to 5 weeks. 6 to 60 days after the final immunization, enzyme immunoassay (ELISA (enz ume— 1 inked mmu nosorbentassy) or EIA (enz ym ei mm unoassay)), radioimmunoassay (RIA; radioi The antibody titer is measured by mmu noassay) and blood is collected on the day when the maximum antibody titer is shown to obtain antiserum.

次いで、 例えば、 抗血清中のポリクローナル抗体を、 . Ρ Ρ Ρ 1 R 3 D タンパク質で固定されたァフィ二ティーカラムにかけて Ρ Ρ Ρ 1 R 3 D タンパク質と反応する抗体 （カラム吸着画分） を採取する。 P P P 1 R 3 Dタンパク質に対する抗血清中のポリクローナル抗体の反応性は、 Ε L I S Α法などで測定することができる。  Next, for example, the polyclonal antibody in the antiserum is applied to an affinity column fixed with Ρ Ρ Ρ 1 R 3 D protein, and the antibody that reacts with Ρ Ρ Ρ 1 R 3 D protein (column adsorbed fraction) is collected. To do. The reactivity of the polyclonal antibody in the antiserum against P P P 1 R 3 D protein can be measured by the ΕL I S method.

(4) 抗体の断片など  (4) Antibody fragments

F a bまたは F a b ' 2断片は、 従来の方法によるプロテア一ゼ （例 えば、 ペプシンまたはパパイン） を用いた消化により作製することがで きる。 ヒ ト化抗体は、 例えば R i e c hma n nら （R i e c hma n n J M o 1 B i o l . O c t 5 ; 2 0 3 (3 ) : 8 2 5 - 8 1 9 8 8 ) 、 および J o n e s ら （ J o n e s ら N a t u r e 3 2 1 ： 5 2 2 - 5 2 5 , 1 9 8 6 ) に記載のような方法の 1つにより調製 することができる。 The F ab or F ab ' 2 fragment can be prepared by digestion with a conventional protease (eg, pepsin or papain). Humanized antibodies are described, for example, by Riec hma nn et al. (Riec hma nn JM o 1 B iol. O ct 5; 2 0 3 (3): 8 2 5-8 1 9 8 8), and J ones et al. Jones et al. Nature 3 2 1: 5 2 2-5 2 5, 1 986 6).

また、 キメラ抗体は、 例えば、 「実験医学 （臨時増刊号） 、 V o l . 1. 6， N o. 1 0 , 1 9 8 8」 、 特公平 3— 7 3 2 8 0号公報等を、 ヒ ト化抗体は、 例えば、 「 N a t u r e G e n e t i c s , V o l . 1 5 , p. 1 4 6 - 1 5 6 , 1 9 9 7」 、 「N a t u r e G e n e tChimeric antibodies include, for example, “Experimental Medicine (Special Issue), Vol. 1. 6, No. 10, 1 9 8 8”, Japanese Patent Publication No. 3-7 3 2 80, etc. Humanized antibodies are described in, for example, “Nature Genetics, Vol. 1 5, p. 1 4 6-1 5 6, 1 9 9 7 ”,“ Nature Genet

1 c s , V o l . 7， p. 1 3 - 2 1 , 1 9 9 4」 、 特表平 4一 5 04 3 6 5号公報、 国際出願公開 W09 4 * 2 5 5 8 5号公報等、 「日経サ ィエンス、 6月号、 第 4 0〜第 5 0頁、 1 9 9 5年」 、 「N a t u r e V o l . 3 6 8 , p. 8 5 6 - 8 5 9 , 1 9 94」 、 特表平 6— 5 0 01 cs, V ol. 7, p. 1 3-2 1, 1 9 94, Special Publication Hei 41 4 04 5 6 5, International Application Publication W09 4 * 2 5 5 8 5, etc. "Nikkei Science, June issue, pages 40 to 50, 1 995", "Nature Vol. 3 6 8, p. 8 5 6-8 5 9, 1 9 94" Special table flat 6— 5 0 0

2 3 3号公報等を参考にそれぞれ製造することができる。 本発明の P P P 1 R 3 Dタンパク質に結合する抗体は、 例えば、 癌細胞の増殖もしく は転移の抑制等を目的とした使用が考えられる。 得られた抗体を人体に 投与する目的 （抗体治療） で使用する場合には、 免疫原性を低下させる ため、 ヒ 卜抗体やヒ ト型抗体が好ましい。 Each can be manufactured with reference to No. 2 3 No. 3, etc. The antibody that binds to the PPP1R3D protein of the present invention can be used for the purpose of, for example, suppressing the proliferation of cancer cells or metastasis. When the obtained antibody is used for the purpose of administering it to the human body (antibody therapy), a human antibody or a human antibody is preferred in order to reduce immunogenicity.

抗体は、 診断剤として用いる場合は、 モニタリング等のための標識物 質 （例えば、 放射性同位元素、 蛍光物質など） で標識されていてもよい < 必要に応じて、 放射性物質、 蛍光化合物などにより標識することができ る。 最も慣用の蛍光標識化合物の中には、 フルォレセインイソチオシァ ネート、 ローダミン、 フィコエリ トリンおよびフルォレスカミンがある, 同様に、 生体発光性化合物を用いて、 抗体 P P P 1 R 3 D抗体を標識す ることもできる。 生体発光性タンパク質の存在は、 蛍光の存在を検出す ることによって測定される。 この標識目的に重要な生体発光性化合物は， ルシフェリ ン、 ルシフェラ一ゼおよびイエクオリンである。  When used as a diagnostic agent, the antibody may be labeled with a labeling substance for monitoring (eg, radioisotopes, fluorescent substances, etc.) <If necessary, label with radioactive substances, fluorescent compounds, etc. can do. Among the most commonly used fluorescent labeling compounds are fluorescein isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin and fluorescamine, as well as using a bioluminescent compound to label the antibody PPP 1 R 3 D antibody You can also. The presence of a bioluminescent protein is measured by detecting the presence of fluorescence. Important bioluminescent compounds for this purpose are luciferin, luciferase and aequorin.

なお、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する P P P 1 R 3 Dタンパク質等を特異的に検出するために使用することができる t また、 P P P 1 R 3 Dタンパク質等を精製するために使用する抗体カラ ムの作製、 精製時の各分画中の P P P 1 R 3 Dタンパク質等の検出、 被 検細胞内における P P P 1 R 3 D夕ンパク質の挙動の分析などのために 使用することができる。 Incidentally, the antibody of the present invention, also t can be used to specifically detect the PPP 1 R 3 D protein or the like present in test samples such as body fluids or tissues, the PPP 1 R 3 D protein or the like For preparation of antibody column used for purification, detection of PPP 1 R 3 D protein, etc. in each fraction during purification, analysis of PPP 1 R 3 D protein behavior in the test cells, etc. Can be used for

3. 2 抗 P P P 1 R 3 D抗体を含有する複合体など 3.2 Complexes containing anti-PPPP1R3D antibody

また、 本発明において使用する抗 P P P 1 R 3 D抗体は、 本発明の治 療剤または診断剤において、 それ自体が、 抗原の活性を減弱させるよう な中和活性を有する薬剤 （a g e n t ) であり得るが、 必要に応じて、 治療効果を奏するための他の薬剤と組み合わせて用いることができる。 したがって、 本発明は、 もう一つの態様において、 がん （例えば、 大腸 がん） の標的化療法または標的化イメージング等に使用するための、 抗 P P P 1 R 3 D抗体と他の薬剤との複合体、 そのような複合体を含有す る組成物などをも提供する。 このような態様によれば、 本発明において 使用する抗 P P P 1 R 3 D抗体を用いて、 治療効果を奏する他の薬剤ま たは診断のための標識剤などを、 P P P 1 R 3 Dタンパク質を高発現す る標的部位へ送達することができる。 In addition, the anti-PPP 1 R 3 D antibody used in the present invention itself may decrease the activity of the antigen in the therapeutic agent or diagnostic agent of the present invention. It can be an agent having a neutralizing activity, but can be used in combination with other agents for producing a therapeutic effect, if necessary. Therefore, the present invention provides, in another aspect, a combination of an anti-PPPP 1 R 3 D antibody and another drug for use in targeted therapy or targeted imaging of cancer (eg, colorectal cancer). And compositions containing such complexes are also provided. According to such an embodiment, the anti-PPP 1 R 3 D antibody used in the present invention is used to label other drugs having a therapeutic effect or a labeling agent for diagnosis, and the PPP 1 R 3 D protein. It can be delivered to highly expressed target sites.

本発明において用いられる 「その他の薬剤」 としては、 例えば、 放射 性同位元素、 治療タンパク質、 または低分子の薬剤など、 標的への遺伝 子導入のためのウィルスベクターもしくは非ウィルスベクターなどが例 示される。  Examples of the “other drug” used in the present invention include a viral vector or a non-viral vector for introducing a gene into a target, such as a radioisotope, a therapeutic protein, or a small molecule drug. .

本発明において、 「放射性同位元素」 の例としては、 フッ素— 1 8、 ヨウ素一 1 2 5 (125 1 ) 、 およびヨウ素— 1 3 1などの放射性ハロゲ ン元素が挙げられる。 これらの放射性ハロゲン元素も上述の放射性金属 元素と同様に抗体やべプチドに標識して、 放射性治治療剤あるいは放射 性診断剤として広く利用し得る。 例えば、 1 25 I または1 3 1 Iでのョー ド化は、 クロラミン T法等の公知の方法により、 抗体または抗体断片に 結合させることができる。 さらに、 診断用としてはテクネチウム一 9 9 m、 インジウム— 1 1 1およびガリウム— 6 7 ( 6 7 G a ) など、 また 治療用としてはイッ トリウム一 9 0 ( 9 0 Y) 、 レニウム一 1 8 6 ( 1 8 6 R e ) またはレニウム— 1 8 8 ( 1 88 R e ) などが使用され得る。 放 射性同位元素を用いて抗体に標識する場合には、 通常、 金属キレート剤 が用いられる。 金属キレート剤としては、 EDTA、 DT PA、 ジアミ ノジチォ化合物、 サイクラム、 および D〇 T Aなどが知られている。 こ れらのキレート剤は抗体に予め結合しておき、 その後放射性金属で標識 する場合と、 放射性金属キレ一トを形成後、 抗体に結合して標識する方 法がある。 本発明において、 「治療タンパク質」 の例としては、 免疫を担う細胞 を活性化するサイ ト力インが好適で.あり、 例えば、 ヒ トインターロイキ ン 2、 ヒ ト顆粒球一マクロファージ一コロニー刺激因子、 ヒ トマクロフ ァージコロニー刺激因子、 ヒ トインターロイキン 1 2等が挙げられる。 また、 大腸がん細胞を直接殺傷するため、 リシンやジフテリア毒素など の毒素を用いることができる。 例えば、 治療タンパク質との融合抗体に ついては、 抗体または抗体断片をコードする c D N Aに治療タンパク質 をコードする c D N Aを連結させ、 融合抗体をコードする D N Aを構築 し、 この D N Aを原核生物または真核生物用の発現ベクターに挿入し、 この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現 させ、 融合抗体を製造することができる。 In the present invention, examples of the “radioisotope” include radioactive halogen elements such as fluorine-18, iodine- 125 (1251), and iodine-1311. These radioactive halogen elements can also be widely used as radiotherapeutic agents or radiodiagnostic agents by labeling them with antibodies or peptides in the same manner as the above-mentioned radioactive metal elements. For example, 1 25 I or 1 3 1 ® over de of the I by known methods chloramine T method or the like, can be attached to an antibody or antibody fragment. In addition, for diagnostic purposes, technetium-99 m, indium-1 1 1 and gallium-6 7 ( 6 7 Ga), etc., and for therapeutic purposes, yttrium 1 90 ( 9 0 Y), rhenium 1 1 8 6 ( 1 8 6 R e) or rhenium— 1 8 8 ( 1 88 Re) can be used. When labeling an antibody with a radioactive isotope, a metal chelator is usually used. Known metal chelating agents include EDTA, DTPA, diaminodithio compound, cyclam, and D0TA. These chelating agents may be pre-bonded to the antibody and then labeled with a radioactive metal, or there may be a method of forming a radioactive metal chelate and then binding to the antibody and labeling. In the present invention, as an example of “therapeutic protein”, site-in force that activates cells responsible for immunity is preferable. For example, human interleukin-2, human granulocyte-one macrophage-one colony stimulation Factors, human macrophage colony stimulating factor, human interleukin 12 and the like. In addition, toxins such as ricin and diphtheria toxin can be used to directly kill colon cancer cells. For example, for a fusion antibody with a therapeutic protein, a cDNA encoding the fusion protein is constructed by linking the cDNA encoding the therapeutic protein to the cDNA encoding the antibody or antibody fragment, and this DNA is either prokaryotic or eukaryotic. A fusion antibody can be produced by inserting the expression vector into a biological expression vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.

「低分子の薬剤」 は、 本明細書中で 「放射性同位元素」 や 「治療タン パク質」 等以外の診断または治療用化合物を意味するものとして用いら れる。 「低分子の薬剤」 の例としては、 ナイ トロジェン · マスタード、 サイクロファスフアミ ドなどのアルキル化剤、 5—フルォロウラシル、 メソ トレキセー卜などの代謝拮抗剤、 ダウノマイシン、 ブレオマイシン、 マイ トマイシン C , ダウノルビシン、 ドキソルビシンなどの抗生物質、 ビンクリスチン、 ビンブラスチン、 ビンデシンのような植物アル力ロイ ド、 夕モキシフェン、 デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤 （臨 床腫瘍学 （日本臨床腫瘍研究会編 1 9 9 6年 癌と化学療法社） ） 、 またはハイ ド口コーチゾン、 プレドニゾンなどのステロイ ド剤、 ァスピ リン、 イン ドメ夕シンなどの非ステロイ ド剤、 金チォマレ一卜、 ぺニシ ラミンなどの免疫調節剤、 サイクロフォスフアミ ド、 ァザチォプリンな どの免疫抑制剤、 マレイン酸クロルフエ二ラミン、 クレマシチンのよう な抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤 （炎症と抗炎症療法 昭和 5 7年 医歯 薬出版株式会社） などがあげられる。 例えば、 ダウノマイシンと抗体を 結合させる方法としては、 グルタールアルデヒ ドを介してダウノマイシ ンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、 水溶性カルポジイミ ドを介し てダウノマイシンのァミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法 等があげられる。 “Small molecule drug” is used herein to mean a diagnostic or therapeutic compound other than “radioisotope” or “therapeutic protein”. Examples of “small molecule drugs” include alkylating agents such as nitrogen mustard and cyclophosphamide, antimetabolites such as 5-fluorouracil and mesotrexe, daunomycin, bleomycin, mitomycin C, daunorubicin, Anti-cancer drugs such as antibiotics such as doxorubicin, plant alcohols such as vincristine, vinblastine, vindesine, hormonal drugs such as evening moxifen, dexamethasone (Clinical Oncology (Edited by Japan Clinical Oncology Society 1 9 9 6) Chemotherapy Inc.)), or steroids such as hyethcortisone, prednisone, non-sterolides such as aspirin, indomethacin, immunoregulators such as gold chimare, penicillamine, cyclophosphine Immunosuppression such as amide and azathioprine Agent, maleic acid Kurorufue two Ramin, such as anti-inflammatory agents, antihistamines, such as such as Kuremashichin (inflammation and anti-inflammatory therapy in 1982 years Biomedical drug Publishing Co., Ltd.) and the like. For example, daunomycin and antibody can be bound by binding between daunomycin and the amino group of the antibody via glutaraldehyde, or by binding the amino group of daunomycin and the carboxyl group of the antibody via water-soluble carpositimide. How to make Etc.

「ウィルスベクター」 の例としては、 本発明の抗 P P P 1 R 3 D抗体 に結合し得るように改変されたウィルスベクターが使用し得る （例えば、 アデノウィルスベクター （Wa n g , P. , e t a 1. ( 1 9 9 5) S oma t i c C e l l a n d M o l e c . G e n e t . 2 1， 4 2 9 - 44 1 ) 、 レトロウイルスベクター （N a v i a u x R. K. , e t a 1 . ( 1 9 9 6 ) J . V i r o l 7 0 , 5 7 0 1 - 5 7 0 5 ) 、 レンチウィルスベクター （N a l d i n i , L . ( 1 9 9 8 ) C u r r . O p i n . B i o t e c h n o に 9， 4 5 7— 4 6 3 ) などが挙げられる） 。 このようなウィルスべク 夕一には、 細胞増殖関連遺伝子、 アポトーシス関連遺伝子、 免疫制御遺 伝子等の、 標的部位 （例えば、 大腸がん） において、 例えば、 癌細胞の アポトーシスを誘導するなどの治療効果を奏する遺伝子 （治療遺伝子） が組み込まれる。 抗 P P P 1 R 3 D抗体に結合するウィルスベクターは、 抗 P P P 1 R 3 D抗体と共に遺伝子治療を必要とする患者に投与された 場合、 抗 P P P 1 R 3 D抗体が認識する抗原 （すなわち、 P P P 1 R 3 D) が存在する部位に標的化することができる。  As an example of “viral vector”, a viral vector modified so as to bind to the anti-PPP 1 R 3 D antibody of the present invention can be used (for example, adenoviral vector (Wang, P., eta 1. ( 1 9 9 5) Soma tic Celand Molec. Genet. 2 1, 4 2 9-44 1), retroviral vector (Naviaux RK, eta 1. (1 9 9 6) J. Virol 7 0 , 5 7 0 1-5 7 0 5), and lentiviral vectors (N aldini, L. (1 9 9 8) Curr. O pin. B iotechno include 9, 4 5 7-4 6 3) ) Such viral vectors include cell proliferation-related genes, apoptosis-related genes, immune regulatory genes, and other target sites (eg, colon cancer), for example, to induce apoptosis of cancer cells. A gene that produces a therapeutic effect (therapeutic gene) is incorporated. A viral vector that binds to an anti-PPP 1 R 3 D antibody, when administered together with an anti-PPP 1 R 3 D antibody to a patient in need of gene therapy, ie, an antigen recognized by the anti-PPP 1 R 3 D antibody (ie, PPP 1 R 3 D) can be targeted to the existing site.

抗 P P P 1 R 3 D抗体と上記他の薬剤とは、 化学的または遺伝子工学 的に結合され得る。 ここで、 「化学的な結合」 には、 イオン結合、 水素 結合、 共有結合、 分子間力による結合、 疎水性相互作用による結合など が含まれるものとし、 「遺伝子工学的な結合」 には、 例えば、 抗体と治 療夕ンパク質とからなる融合夕ンパク質を遺伝子組換えなどの技術を用 いて作製した場合の、 抗体と治療夕ンパク質との間の結合様式などが含 まれるものとする。  The anti-PPPP1R3D antibody and the other drug can be combined chemically or genetically. Here, “chemical bond” includes ionic bond, hydrogen bond, covalent bond, bond by intermolecular force, bond by hydrophobic interaction, etc., and “gene engineering bond” For example, when the fusion protein consisting of an antibody and a therapeutic protein is produced using a technique such as genetic recombination, the binding mode between the antibody and the therapeutic protein is included. To do.

4. 製剤化および製剤の投与方法 4. Formulation and administration method

本発明の P P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻害物質を含有するがん治療剤、 P P P 1 R 3 D夕ンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療剤、 本発 明の抗 P P P 1 R 3 D抗体を含有する治療剤、 または本発明において使 用する抗 P P P 1 R 3 D抗体が、 放射性同位元素、 治療タンパク質、 低 分子の薬剤、 および治療遺伝子を担持したウィルスベクターもしくは非 ウィルスベクターのうちのいずれか、 またはこれらの任意の組み合わせ と化学的または遺伝子工学的に結合されている治療剤は、 公知の手法に 基づいて製剤化することができる。 Therapeutic agent containing a PPP 1 R 3 D gene expression inhibitor of the present invention, a cancer therapeutic agent containing a PPP 1 R 3 D protein activity inhibitor, the anti-PPP 1 R 3 of the present invention A therapeutic agent containing D antibody or used in the present invention Anti-PPP 1 R 3D antibody to be used is either a viral or non-viral vector carrying a radioisotope, therapeutic protein, small molecule drug, and therapeutic gene, or any combination of these and chemical Alternatively, a therapeutic agent that has been genetically engineered can be formulated based on a known method.

本発明の治療剤の製剤化にあたっては、 常法に従い、 必要に応じて薬 学的に許容される担体を添加することができる。 例えば、 界面活性剤、 賦形剤、 着色料、 着香料、 保存料、 安定剤、 緩衝剤、 懸濁剤、 等張化剤、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 流動性促進剤、 矯味剤等が挙げられるが、 こ れらに制限されず、 その他常用の担体を適宜使用することができる。 具 体的には、 軽質無水ケィ酸、 乳糖、 結晶セルロース、 マンニトール、 デ ンプン、 カルメロースカルシウム、 カルメロースナトリウム、 ヒ ドロキ シプロピルセルロース、 ヒ ドロキシプロピルメチルセルロース、 ポリビ 二ルァセ夕一ルジェチルァミノアセテート、 ポリ ビニルピロリ ドン、 ゼ ラチン、 中鎖脂肪酸トリダリセライ ド、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ 油 6 0、 白糖、 カルボキシメチルセルロース、 コーンスターチ、 無機塩 類等を挙げることができる。  In formulating the therapeutic agent of the present invention, a pharmaceutically acceptable carrier can be added as necessary according to a conventional method. For example, surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity promoters, taste masking However, the present invention is not limited to these, and other commonly used carriers can be appropriately used. Specifically, light anhydrous carboxylic acid, lactose, crystalline cellulose, mannitol, starch, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinyl alcohol Acetate, polyvinylpyrrolidone, gelatin, medium-chain fatty acid tridallylide, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethylcellulose, corn starch, inorganic salts, and the like.

本発明の治療剤の剤型の種類としては、 例えば、 経口剤として錠剤、 粉末剤、 丸剤、 散剤、 顆粒剤、 細粒剤、 軟 *硬カプセル剤、 フィルムコ 一ティ ング剤、 ペレッ ト剤、 舌下剤、 ペース ト剤等、 非経口剤として注 射剤、 坐剤、 経皮剤、 軟膏剤、 硬膏剤、 外用液剤等が挙げられ、 当業者 においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができ る。 有効成分としての P P P 1 R 3 D夕ンパク質の活性 （または P P P 1 R 3 D遺伝子の発現） 阻害物質は、 製剤中 0. 1から 9 9. 9重量％ 含有することができる。  Examples of the dosage form of the therapeutic agent of the present invention include tablets, powders, pills, powders, granules, fine granules, soft * hard capsules, film coating agents, and pellets as oral preparations. Agents, sublingual agents, pastes, etc., parenteral agents include injections, suppositories, transdermal agents, ointments, plasters, liquids for external use, etc. The optimum dosage form can be selected. An inhibitor of PPP1R3D protein activity (or expression of PPP1R3D gene) as an active ingredient may be contained in the preparation in an amount of 0.1 to 99.9% by weight.

本発明の薬剤の有効成分の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法などにより差はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 患者 (6 0 k gとして） に対して一日につき約 0. l mg〜： I , 0 0 0mg、 好ましくは約 1. 0〜： L 0 0 mg、 より好ましくは約 1. 0〜 5 0mg である。 非経口的に投与する場合は、 その一回投与量は投与対象、 対象 臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形で は通常例えば、 患者 （ 6 0 k gに対して） 、 一日につき約 0 . 0 1から 3 0 m g程度、 好ましくは約 0 . 1から 2 0 m g程度、 より好ましくは 約 0 . 1〜 1 0 m g程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 しかしながら、 最終的には、 剤型の種類、 投与方法、 患者の年齢や体重、 患者の症状等を考慮して、 医師または獣医師の判断により適宜決定する ことができる。 The dose of the active ingredient of the drug of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., but in the case of oral administration, for example, generally for patients (as 60 kg) About 0. l mg per day :: I, 0 00 mg, preferably about 1.0: L 0 0 mg, more preferably about 1.0 to 50 mg It is. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of an injection, for example, the patient (for 60 kg) ) About 0.1 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg is preferably administered intravenously. is there. However, the final decision can be made as appropriate based on the judgment of a doctor or veterinarian in consideration of the type of dosage form, administration method, patient age and weight, patient symptoms, and the like.

このようにして得られる製剤は、 例えば、 ヒ トやその他の哺乳動物 (例えば、 ラッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 .ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。 ヒ ト以外の動物の場合も、 上記の The preparations thus obtained should be administered to, for example, humans and other mammals (eg rats, rabbits, hidges, bushes, bushes, cats, dogs, monkeys, etc.) Can do. For animals other than humans,

6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。 An amount converted per 60 kg can be administered.

本発明の治療剤は、 がん （例えば、 大腸がん、 胃がん、 肺がん、 乳が ん、 前立腺がん、 食道がん、 肝臓がん、 胆道がん、 脾臓がん、 腎がん、 膀胱がん、 子宮がん （例 ： 子宮頸がん、 子宮体がん） 、 精巣がん、 甲状 腺がん、 膝臓がん、 卵巣がん、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 · 治療、 好ましくは、 大腸がんの予防 · 治療に用いられる。  The therapeutic agent of the present invention is cancer (for example, colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder). Prevention / treatment of uterine cancer (eg cervical cancer, uterine body cancer), testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc., preferably Used for the prevention and treatment of colorectal cancer.

本発明の薬剤は、 P P P 1 R 3 Dタンパク質の活性阻害物質または P The agent of the present invention is a P P P 1 R 3 D protein activity inhibitor or P

P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有しているため、 抗癌剤、 癌転移阻害剤、 癌細胞のアポトーシス誘導剤等として使用し得 る。 対象となる細胞、 組織、 臓器、 または癌の種類は特定のものに限定 されない。 また、 本発明の薬剤は、 P P P 1 R 3 Dタンパク質の活性阻 害物質および P P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻害物質の両方を含んでいて も良い。 Since it contains a P P 1 R 3 D gene expression inhibitor as an active ingredient, it can be used as an anticancer agent, a cancer metastasis inhibitor, a cancer cell apoptosis inducer, and the like. The target cell, tissue, organ, or cancer type is not limited to a specific type. The agent of the present invention may contain both a PPP 1 R 3 D protein activity inhibitor and a P P P 1 R 3 D gene expression inhibitor.

本発明の治療剤において、 アンチセンス核酸を用いる場合、 該アンチ センス核酸を単独あるいはレ 卜ロウィルスベクター、 アデノウイルスべ クタ一、 アデノウイルスァソシエーテツ ドウィルスベクターなどの適当 なベクターに挿入した後、 公知の手段に従って投与することができる。 アンチセンス核酸は、 単独で、 あるいは生理学的に認められる担体とと もに製剤化し、 遺伝子銃やハイ ドロゲルカテーテルのようなカテーテル によつて投与することができる。 In the therapeutic agent of the present invention, when an antisense nucleic acid is used, the antisense nucleic acid is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, or the like. Thereafter, it can be administered according to known means. Antisense nucleic acids can be used alone or with a physiologically recognized carrier. They can also be formulated and administered via a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter.

また、 本発明において組換えアデノウィルス粒子のようなウィルスべ クタ一と抗 P P P 1 R 3 D抗体との組み合わせを癌治療のために使用す る場合は、 これら単独で使用してもよいが、 一般には製薬的に許容でき る担体と共に使用される。 そのような担体としては、 既に上記したよう な担体、 ならびに水、 生理食塩水、 グルコース、 ヒ トアルブミン等の水 性等張溶液が好ましい。 更に、 製薬的に通常使用される添加剤、 保存剤、 防腐剤、 衡量等を添加することもできる。 そのように調製した医薬組成 物は、 治療すべき疾病に依存して適切な投与形態、，投与経路によって投 与することができる。 投与形態としては、 例えば、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル、 錠剤、 顆粒剤、 注射剤、 軟膏等が挙げられる。 本発明の抗 P In the present invention, when a combination of a virus vector such as a recombinant adenovirus particle and an anti-PPP 1 R 3 D antibody is used for cancer treatment, these may be used alone, Is used with a pharmaceutically acceptable carrier. As such a carrier, a carrier as described above and a water isotonic solution such as water, physiological saline, glucose, and human albumin are preferable. Furthermore, additives, preservatives, preservatives, balance, etc. that are usually used in pharmaceutics can also be added. The pharmaceutical composition thus prepared can be administered by an appropriate administration form and administration route depending on the disease to be treated. Examples of dosage forms include emulsions, syrups, capsules, tablets, granules, injections, ointments and the like. Anti-P of the present invention

P P 1 R 3 D抗体—ウィルスベクター粒子またはこれを含む医薬組成物 を治療のために投与する場合は、 通常成人一人当たり 1回に 1 0 3〜 1 0 1 5個のウィルス粒子を投与するのが好ましいが、 疾病の状態や標的 細胞 ' 組織の性質によって変更してよい。 投与回数は、 1 日 1回〜数回 でよく、 投与期間は 1 日〜数ケ月以上にわたってもよく、 1〜数回の投 入を 1セッ トとして、 長期にわたって断続的に多数セッ トを投与しても よい。 また、 本発明において使用されるウィルスベクター粒子またはゥ ィルスベクター核酸分子は、 特定の細胞および または組織の検出、 ま たは疾病状態の診断に使用することができる。 例えば、 ウィルスベクタ 一の核酸分子に検出可能なマーカー遺伝子を組込み、 これを適切な宿主 細胞に トランスフエクションして得られたウィルスベクタ一粒子は、 抗 P P P 1 R 3 D抗体と組み合わせて腫瘍細胞を検出診断するために使用 することができる。 あるいは、 抗 P P P 1 R 3 D抗体に検出可能な標識 を結合させて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。 PP 1 R 3D antibody—When administering viral vector particles or pharmaceutical compositions containing them for treatment, it is usual to administer 10 3 to 10 15 viral particles at a time per adult. Is preferred, but may vary depending on the disease state and the target cell 'tissue properties. The administration frequency may be once to several times a day, the administration period may be from 1 day to several months or more, and one to several doses are set as one set, and many sets are administered intermittently over a long period of time May be. In addition, the virus vector particles or virus vector nucleic acid molecules used in the present invention can be used for detection of specific cells and / or tissues, or diagnosis of disease states. For example, a viral vector particle obtained by incorporating a detectable marker gene into a nucleic acid molecule of a viral vector and transfecting it into an appropriate host cell can be combined with an anti-PPP 1 R 3 D antibody in tumor cells. Can be used to detect and diagnose Alternatively, it can be used to detect and diagnose tumor cells by binding a detectable label to the anti-PPPP 1 R 3 D antibody.

5 . がんの診断剤及び診断方法 5. Cancer diagnostic agents and methods

本発明はまた、 がんの診断剤を提供する。 1つの好ましい態様におい て、 本発明のがんの診断剤は、 （ a) P P P 1 R 3 Dタンパク質に対す る抗体、 又は （b) P P P 1 R 3 D遺伝子またはその一部の塩基配列に ス トリンジェン卜なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可 能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。 The present invention also provides a diagnostic agent for cancer. In one preferred embodiment The cancer diagnostic agent of the present invention comprises: (a) an antibody against the PPP 1 R 3 D protein, or (b) a stringent hybridization with the PPP 1 R 3 D gene or a partial nucleotide sequence thereof. It contains a polynucleotide comprising a base sequence that can hybridize under conditions.

5. 1 抗 P P P 1 R 3 D抗体を用いる診断剤及び診断方法 5.1 Diagnostic agent and diagnostic method using anti-PPPP1R3D antibody

P P P 1 R 3 Dタンパク質に対する抗体は、 P P P 1 R 3 Dタンパク 質等を特異的に認識することができるので、 被検液中の P P P 1 R 3 D タンパク質を定量することができる。 具体的には、 本発明の抗 P P P 1 R 3 D抗体を用いる診断方法は、 例えば、 （ a) 被験者由来の生体試料 と、 P P P 1 R 3 Dタンパク質に対する抗体とを接触させる工程、 およ び （b) 前記試料中での前記抗体と、 P P P 1 R 3 Dタンパク質もしく はその部分べプチドまたはその塩との結合を検出および または定量す る工程を包含する。 好ましくは、 上記検出および Zまたは定量する工程 において、 標識された抗 P P P 1 R 3 D抗体を用いて、 P P P 1 R 3 D タンパク質またはその断片と抗 P P P 1 R 3 D抗体との結合が検出およ び/または定量される。  Since the antibody against PPP1R3D protein can specifically recognize PPP1R3D protein and the like, PPP1R3D protein in the test solution can be quantified. Specifically, the diagnostic method using the anti-PPP 1 R 3 D antibody of the present invention includes, for example, (a) a step of contacting a biological sample derived from a subject with an antibody against the PPP 1 R 3 D protein, and (B) detecting and / or quantifying the binding between the antibody in the sample and the PPP 1 R 3 D protein or its partial peptide or salt thereof. Preferably, in the detection and Z or quantification step, the labeled anti-PPP 1 R 3 D antibody is used to detect the binding between the PPP 1 R 3 D protein or a fragment thereof and the anti-PPP 1 R 3 D antibody. And / or quantified.

本明細書中、 「被験者由来の生体試料」 は、 被験者由来の組織、 細胞、 または体液 （例えば、 血液 （全血、 血漿、 血清等を含む） 、 尿、 リンパ 液、 唾液、 汗、 精液等） を含む。 また、 「被験者」 は、 通常、 がん検診 を受ける、 または受けることが望まれるヒ ト被験体であり、 がんに罹患 しているか、 または罹患していると疑われるヒ ト被験体等が含まれる。 このようながんの例としては、 大腸がん、 胃がん、 肺がん、 乳がん、 前 立腺がん、 食道がん、 肝臓がん、 胆道がん、 脾臓がん、 腎がん、 膀胱が ん、 子宮がん （例 ： 子宮頸がん、 子宮体がん） 、 精巣がん、 甲状腺がん、 膝臓がん、 卵巣がん、 脳腫瘍、 血液腫瘍などが含まれるが、 とりわけ、 大腸がんが好ましい。  In the present specification, “subject-derived biological sample” refers to a subject-derived tissue, cell, or body fluid (for example, blood (including whole blood, plasma, serum, etc.), urine, lymph, saliva, sweat, semen, etc. ) including. A “subject” is usually a human subject who is or is expected to undergo a cancer screening, such as a human subject who has or is suspected of having cancer. included. Examples of such cancers are colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, Uterine cancer (example: cervical cancer, endometrial cancer), testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc., especially colorectal cancer preferable.

上記のような被験者由来の生体試料における P P P 1 R 3 Dの発現を 検出するための免疫測定は、 がん （例えば、 大腸がん） を有すると疑わ れるか、 がんの危険性を有する被験体から採取した生体試料を、 特異的 抗原一抗体結合を生じさせる条件下で抗 P P P 1 R 3 D抗体と接触させ、 次いで、 抗体による免疫特異的結合量を測定することを包含する。 この ような抗体の結合.を使用して、 P P P 1 R 3 Dタンパク質の存在および または増大した発現が検出される。 この場合、 増大した P P P 1 R 3 Dタンパク質発現の検出が疾病状態の指標となる。 必要に応じて、 生体 試料中の P P P 1 R 3 Dタンパク質のレベルを、 がんを有しない健常者 のレベルと比較してもよい。 Immunoassays to detect the expression of PPP 1 R 3 D in a biological sample from a subject as described above are suspected of having cancer (eg, colorectal cancer). A biological sample taken from a subject at risk of cancer is contacted with an anti-PPPP 1 R 3 D antibody under conditions that produce specific antigen-antibody binding, and then immunospecific binding by the antibody Includes measuring the amount. Such antibody binding is used to detect the presence and / or increased expression of the PPP 1 R 3 D protein. In this case, detection of increased PPP 1 R 3 D protein expression is an indicator of disease state. If necessary, the level of PPP 1 R 3 D protein in the biological sample may be compared with the level of a healthy person who does not have cancer.

上記免疫測定法の 1つの態様では、 例えば、 血清試料などの生体試料 を、 試料中に存在する全部のタンパク質を固定する目的で、 ニトロセル ロースなどの固相支持体または担体と接触させる。 次いで、 この支持体 を緩衝液で洗浄し、 続いて検出可能に標識した抗 P P P 1 R 3 D抗体に より処理する。 次いで、 この固相支持体を緩衝液で 2回洗浄し、 未結合 抗体を除去する。 固相支持体上の結合した抗体の量を、 周知の方法に従 つて測定する。 各測定に適する検出条件は、 慣用的な試験方法を使用し て当業者により適宜決定され得る。  In one embodiment of the immunoassay, for example, a biological sample such as a serum sample is contacted with a solid support or carrier such as nitrocellulose for the purpose of immobilizing all proteins present in the sample. The support is then washed with buffer and subsequently treated with detectably labeled anti-PPPP1R3D antibody. The solid support is then washed twice with buffer to remove unbound antibody. The amount of bound antibody on the solid support is measured according to well-known methods. Detection conditions suitable for each measurement can be appropriately determined by those skilled in the art using conventional test methods.

抗 P P P 1 R 3 D抗体を検出可能に標識する方法の 1つにおいて、 当 該抗体を、 酵素、 例えば、 酵素ィムノアッセィ （E I A) に使用される もののような酵素に結合させる [V o i 1 e r , A. による 「酵素標識 した免疫吸着アツセィ」 （ "T h e E n z yme L i n k e d I mmu n o s o r b e n t A s s a y) ( E L I S A ) , 1 9 7 8 , D i a g n o s t i c H o r i z o n s , 2 ： 1〜 7 , M i c r o b i o l o g i c a l A s s o c i a t e s Q u a r t e r l y P u b 1 i c a t i o n , W a l k e r s v i 1 1 e . M D ； V o i 1 e r , A. による J . C I i n . P a t h o l . ， 3 1 : 5 0 7〜 5 2 0， 1 9 7 8 : B u t i e r , J . E . による M e t h . E n z ymo 1 . , 7 3 : 4 8 2〜 5 2 3， 1 9 8 1 ] 。 抗体に結合する酵素を、 例 えば分光光度測定により、 可視手段による蛍光測定により検出すること ができる化学分子が生成されるような方法で、 適当な基質、 好ましくは 色素原性基質と反応させる。 抗体に検出可能な標識を付けるために使用 することができる酵素は、 ペルォキシダーゼおよびアル力リ性ホスファ 夕ーゼを包含するが、 これらに限定されない。 この検出はまた、 酵素に 対する色素原性基質を用いる比色法により達成することができる。 In one method for detectably labeling an anti-PPP 1 R 3 D antibody, the antibody is conjugated to an enzyme, such as that used in the enzyme immunoassay (EIA) [V oi 1 er, “Enzyme-labeled immunosorbent assay” (ELISA), 1 9 7 8, Diagnostic Horizons, 2: 1-7, M icrobiological A ssociates Q uarterly Pub 1 ication, Walkersvi 1 1 e. MD; J. CI in. Pat. By V oi 1 er, A., 3 1: 5 0 7-5 2 0, 1 9 7 8: B utier , J. E. by Meth. E nz ymo 1., 7 3: 4 8 2 ~ 5 2 3, 1 9 8 1] Fluorescence by visible means, eg by spectrophotometry In such a way that a chemical molecule is generated that can be detected by measurement, and suitable substrates, preferably React with chromogenic substrate. Enzymes that can be used to attach a detectable label to an antibody include, but are not limited to, peroxidase and alkaline phosphatase. This detection can also be achieved by a colorimetric method using a chromogenic substrate for the enzyme.

その他の本発明において使用し得る方法としては、 ラジオィムノアツ セィ （R I A) 、 サンドイッチ免疫測定法、 ィムノメ トリック法、 ネフ ロメ トリー、 蛍光免疫測定法 （F I A) 、 時間分解蛍光免疫測定法 （T R F I A) 、 酵素免疫測定法 （E I A) 、 発光免疫測定法 （L I A) 、 電気化学発光免疫測定法 （E C L I A) 、 ラテックス凝集法、 免疫沈降 アツセィ、 沈降素反応法、 ゲル拡散沈降素反応法、 免疫拡散検定法、 凝 集素検定法、 補体結合検定法、 免疫放射分析検定法、 蛍光免疫検定法、 およびプロティン A免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法な どが挙げられる （WO 0 0Z 1 4 2 2 7号公報第 3 9頁第 2 5行〜第 4 2頁第 8行、 E P 1 1 1 1 04 7 A 2号公報段落 [ 0 1 1 5 ] 第 1 9頁 第 3 5行〜第 2 0頁第 47行など参照） 。  Other methods that can be used in the present invention include radioimmunoassay (RIA), sandwich immunoassay, immunometric method, nephrometry, fluorescence immunoassay (FIA), time-resolved fluorescence immunoassay (TRFIA), enzyme Immunoassay (EIA), Luminescent immunoassay (LIA), Electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA), Latex agglutination, Immunoprecipitation Atssey, Precipitation reaction, Gel diffusion precipitation reaction, Immunodiffusion assay, Examples include an agglutination assay, a complement binding assay, an immunoradiometric assay, a fluorescence immunoassay, and an immunoassay selected from the group consisting of protein A immunoassay (WO 0 0Z 1 4). 2 2 7 Gazette, page 39, line 25, 4 to page 4, 2nd line, line 8, EP 1 1 1 1 04 7 A, paragraph 2, [0 1 1 5], page 19, line 3 to line 5 (See page 20, line 47).

以上のように、 本発明の抗体を用いる、 生体内での P P P 1 R 3 D夕 ンパク質の定量法を利用することにより、 P P P 1 R 3 Dタンパク質の 機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。 例えば、 P P P 1 R 3 Dタンパク質の濃度増加が検出された場合は、 例えば、 P P P 1 R 3 Dタンパク質の過剰発現に起因する疾患 （例えば、 がん （例 ： 大 腸がん） ） である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断 することができる。  As described above, by utilizing the in vivo PPP 1 R 3 D protein quantification method using the antibody of the present invention, various diseases related to PPP 1 R 3 D protein dysfunction can be diagnosed. can do. For example, if an increase in the concentration of PPP 1 R 3 D protein is detected, for example, the disease may be caused by overexpression of PPP 1 R 3 D protein (eg, cancer (eg, large intestine cancer)) Can be diagnosed as being highly prone or likely to be affected in the future.

なお、 本発明の抗 P P P 1 R 3 D抗体は、 i n v i v oでの診断に 用いることもできる。 ここで使用し得る抗体調製物の調製および使用方 法は当該分野でよく知られている。 例えば、 抗体—キレート剤について、 N u c 1. M e d . B i o l . 1 9 9 0 1 7 : 24 7 - 2 54 に記載されている。 また、 磁気共鳴イメージングで用いる標識としての 常磁性イオンを有する抗体については、 例えば、 M a g n e t i c R e s o n a n c e i n e d i c i n e 1 9 9 1 2 2 : 3 3 9 - 3 4 2に記載されている The anti-PPP 1 R 3D antibody of the present invention can also be used for in vivo diagnosis. The preparation and use of antibody preparations that can be used herein are well known in the art. For example, antibody-chelating agents are described in Nuc 1. Med. Biol. 1 9 9 0 1 7: 24 7- 2 54. For antibodies having paramagnetic ions as labels used in magnetic resonance imaging, for example, magneto-resonanceinedicine 1 9 9 1 2 2: 3 3 9 -Listed in 3 4 2

5. 2 ポリヌクレオチド （例えば、 DNA) プローブを用いる診 断剤及び診断方法 5.2 Diagnostic agents and diagnostic methods using polynucleotide (eg, DNA) probes

本発明の診断方法においては、 P P P 1 R 3 D遺伝子の塩基配列に基 づいて設計されるプローブ又はプライマ一を用いることができる。 具体 的には、 そのような診断方法は、 例えば、 （ a) 被験者由来の生体試料 と、 P P P 1 R 3 D遺伝子またはその断片の塩基配列にストリンジェン 卜なハイプリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列か らなるポリ ヌク レオチ ド （プローブ） とを接触させる工程、 および (b) 前記試料中での前記ポリヌクレオチドと、 P P P 1 R 3 D遺伝子 またはその断片とのハイプリダイゼーションを検出およびノまたは定量 する工程を包含する。  In the diagnostic method of the present invention, a probe or primer designed based on the base sequence of the PPP 1 R 3 D gene can be used. Specifically, such a diagnostic method can, for example, (a) be hybridized under a high-hydidization condition that is stringent in the biological sample derived from the subject and the base sequence of the PPP 1 R 3 D gene or a fragment thereof. A step of contacting a polynucleotide (probe) comprising a simple nucleotide sequence; and (b) detecting and detecting the hybridization of the polynucleotide in the sample with the PPP 1 R 3 D gene or a fragment thereof. Or quantifying.

上記本発明の方法では、 被験者由来の生体試料中の P P P 1 R 3 D遺 伝子の DNA (またはその遺伝子断片） を、 上記プローブを使用して検 出およびノまたは定量する。 プローブとして用いる塩基配列の長さは、 例えば、 1 2塩基以上、 1 5塩基以上、 1 8塩基以上、 2 1塩基以上、 24塩基以上、 2 7塩基以上、 3 0塩基以上、 またはさらに長い長さの ポリヌクレオチド断片であり得る。 ハイブリダィゼーシヨンには、 上記 した低、 中又は高ス トリンジェン卜な条件を使用し得る。 なお、 本明細 書中、 「P P P 1 R 3 D遺伝子またはその断片の塩基配列にス トリンジ ェン卜なハイプリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配 列」 には、 P P P 1 R 3 D遺伝子またはその断片の塩基配列に相補的な 塩基配列 （アンチセンスポリヌクレオチド） も含まれるものとする。 プ ローブおよび核酸のハイプリダイゼーションの方法は当業者に知られて おり、 例えば国際公開公報第 8 9 0 6 6 9 8号、 E P— A 0 2 0 0 3 6 2、 米国特許第 2 , 9 1 5， 0 8 2号、 E P— A 0 0 6 3 8 7 9、 E P— A 0 1 7 3 2 5 1、 E P— A 0 1 2 8 0 1 8に記載されている。 本発明の診断方法においては、 P P P 1 R 3 D遺伝子に対する特異的 ポリヌクレオチドプローブまたはプライマ一を用いて、 公知の手法を用 いて標的配列を検出または定量することができる。 そのような公知の手 法として、 例えば、 サザンハイブリダィゼ一シヨン、 ノーザンハイブリ ダイゼ一シヨン、 R T— P C R法、 P C R— S S C P法 （G e n om i c s， 第 5巻， 8 7 4〜 8 7 9頁 （ 1 9 8 9年） ） 、 P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e my o r S c i e n c e s o f t h e U n i t e d S t a t e s o f Ame r i c a , 第 8 6巻， 2 7 6 6〜 2 7 7 0頁 （ 1 9 8 9年） ） 、 F I S H法、 DNAチップあるいはアレイ C GH (C omp a r a t i v e G e n om i c Hy b r i d i z a t i on) 法などを用レ る ことができる。 定量的な検出は、 定量 R T— P C Rによって実施可能で ある。 In the method of the present invention, the DNA (or gene fragment thereof) of the PPP 1 R 3 D gene in a biological sample derived from a subject is detected and determined or quantified using the probe. The length of the base sequence used as a probe is, for example, 12 bases or more, 15 bases or more, 18 bases or more, 21 bases or more, 24 bases or more, 27 bases or more, 30 bases or more, or even longer It can be a polynucleotide fragment. For hybridization, low, medium or high stringency conditions as described above may be used. In the present specification, “a base sequence that can be hyperpredified under a high predation condition that is stringent to the base sequence of the PPP 1 R 3 D gene or a fragment thereof” includes the PPP 1 R 3 D gene. Alternatively, a base sequence (antisense polynucleotide) complementary to the base sequence of the fragment is also included. Methods of probe and nucleic acid hydridization are known to those skilled in the art, for example, WO 8 90 6 6 98, EP—A 0 2 0 0 3 6 2, US Pat. No. 2, 9 1-5, 0 8 2, EP—A 0 0 6 3 8 7 9, EP—A 0 1 7 3 2 5 1, EP—A 0 1 2 8 0 1 8. In the diagnostic method of the present invention, specific for the PPP 1 R 3 D gene A polynucleotide probe or primer can be used to detect or quantify the target sequence using known techniques. Such known methods include, for example, Southern hybridization, Northern hybridization, RT-PCR method, PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, 8 7 4-8 7 9 (1 9 8 9)), Proceedingsofthe National Academy or Sciences of United States of America, Vol. 8 6, 2 7 6 6-2 7 7 0 (1 9 8 9) ), FISH method, DNA chip or array CGH (Combolic Genetic Hybridization) method can be used. Quantitative detection can be performed by quantitative RT-PCR.

アレイ C GH法は、 染色体 C GH法 （K a l l i o n i e m i , A. e t a 1 . ( 1 9 9 2 ) S c i e n c e 2 5 8， 8 1 8 - 8 2 1 ) を応用し;^方法で、 スライ ド上に染色体領域をカバ一するゲノム D NA断片 （BAC， PAC， YACなど） を高密度にスポッ トした D N Aチップを用いて、 別々の色素で標識したがん由来 D N Aと正常 D N A を、 スライ ド上のゲノム DN A断片に対して同時にハイブリダィゼーシ ヨンを行い、 その結合状態を検出することにより、 がんにおける DNA コピー数異常を高解像度に検出する方法である （P i n k e 1， D . e t a 1. ( 1 9 9 8 ) N a t . G e n e t . 2 0 , 2 0 7 - 2 1 The array C GH method applies the chromosome C GH method (K allioniemi, A. eta 1. (1 9 9 2) Science 2 5 8, 8 1 8-8 2 1); Using a DNA chip in which genomic DNA fragments (BAC, PAC, YAC, etc.) covering the chromosomal region are densely spotted, the cancer-derived DNA and normal DNA labeled with different dyes are placed on the slide. This is a method to detect DNA copy number abnormalities in cancer with high resolution by simultaneously hybridizing to the genomic DNA fragment and detecting its binding state (Pinke 1, D. eta 1. (1 9 9 8) N at. G enet. 2 0, 2 0 7-2 1

1 ) o 1) o

なお、 本発明においては、 P P P 1 R 3 D遺伝子の発現が上方制御さ れるか否かを検出するために、 細胞の P P P 1 R 3 Dの mRNAレベル を標準遺伝子 （ハウスキーピング遺伝子 （例えば、 S h a p e r , N. L . ら、 J . M amm a r y G l a n d B i o l . N e o p 1 a s i a 3 ( 1 9 9 8 ) 3 1 5 - 3 2 4 ; Wu , Y. Y. および R e e s , J . L . , A c t a D e r m: V e n e r e o l . 8 0 ( 2 0 0 0 ) 2— 3 ) の mRNAレベルと、 好ましくは R T— P C R によって比較することもできる。 In the present invention, in order to detect whether the expression of the PPP 1 R 3 D gene is up-regulated, the mRNA level of the PPP 1 R 3 D in the cell is determined based on the standard gene (housekeeping gene (eg, S haper, N. L. et al., J. Mammary G land B iol. N eop 1 asia 3 (1 9 9 8) 3 1 5-3 2 4; Wu, YY and Rees, J. L., A cta D erm: V enereol. 8 0 (2 0 0 0) 2— 3) mRNA levels and preferably RT-PCR Can also be compared.

上記のような手法によって標的配列 （DNA、 mR NAなど） を検 出 · 定量し、 P P P 1 R 3 D遺伝子の発現過多が確認された場合は、 例 えば、 P P P 1 R 3 Dの過剰発現に起因する疾患 （例えば、 がん （例 ： 大腸がん） ） である可能性が高い、 あるいは将来罹患する可能性が高い と診断することができる。  If the target sequence (DNA, mRNA, etc.) is detected and quantified by the method described above and overexpression of the PPP 1 R 3 D gene is confirmed, for example, overexpression of PPP 1 R 3 D It can be diagnosed that there is a high possibility that the disease is caused (for example, cancer (eg, colorectal cancer)) or that the disease is likely to be affected in the future.

5. 3 質量分析装置を用いる診断方法 5.3 Diagnosis method using mass spectrometer

本発明の診断方法の別の実施形態では、 被検試料中の標的夕ンパク質 またはその断片の存在を、 質量分析装置 （MS ) を,用いて同定すること ができる。 すなわち、 質量分析装置を用いることによって、 標的タンパ ク質またはその断片のアミノ酸配列の決定を行うことができ、 被験者由 来の生体試料中に P P P 1 R 3 Dタンパク質が存在するか否かを判定す ることができる。 質量分析法は、 MSを用いてタンパク質やペプチドの ような試料をイオン化し、 得られた質量 Z電荷 （mZz ) に従って分離 し、 その強度を測定することにより、 試料の質量を決定する方法である。 その質量分析の結果から、 夕ンパク質やべプチドのアミノ酸配列を構成 する個々のアミノ酸を同定することができる。  In another embodiment of the diagnostic method of the present invention, the presence of the target protein or fragment thereof in the test sample can be identified using a mass spectrometer (MS). That is, by using a mass spectrometer, the amino acid sequence of a target protein or a fragment thereof can be determined, and it is determined whether or not a PPP 1 R 3 D protein is present in a biological sample derived from a subject. can do. Mass spectrometry is a method for determining the mass of a sample by ionizing a sample such as a protein or peptide using MS, separating it according to the obtained mass Z charge (mZz), and measuring its intensity. . From the results of mass spectrometry, individual amino acids constituting the amino acid sequence of proteins and peptides can be identified.

イオン化には、 マトリクスアシステツ ドレーザーデソープションィォ ン化法 （MALD I ) 、 エレク トロスプレーイオン化法 （E S I ) 、 気 相法 （E I , C I ) 、 電界脱離 （FD) 法など種々の方法が使用され得 る。 イオン分離には、 イオン化法と相性のよいイオン分離法が用いられ、 例えば、 M A L D I の場合には、 飛行時間型 （ t i me o f f 1 i g h t ： TO F) 質量分析計、 E S Iの場合には、 四重極型 （QMS) 、 イオントラップ型、 磁場型などの質量分析計がそれぞれ用いられる。 質 量分析装置は、 タンデムで用いられることもある。 例えば、 L C— E S I MSZMS、 Q—T〇 F MS、 MALD I — TO F M S等が挙 げられる。 なお、 その他のアミノ酸配列決定法、 例えば、 シークェンサ 一 （例 ： 気相シークェンサ一） によるアミノ酸配列決定法が利用されて もよい。 There are various ionization methods such as matrix assisted laser desorption (MALD I), electrospray ionization (ESI), gas phase (EI, CI), and field desorption (FD). The method can be used. For ion separation, an ion separation method that is compatible with the ionization method is used. For example, in the case of MALDI, a time-of-flight type (time off 1 ight: TO F) mass spectrometer, and in the case of ESI, four Mass spectrometers such as a quadrupole type (QMS), ion trap type, and magnetic field type are used. Mass spectrometers are sometimes used in tandem. For example, LC-ESI MSZMS, Q-T FMS, MALD I-TO FMS, etc. It should be noted that other amino acid sequencing methods, such as amino acid sequencing methods using sequencers (eg, gas phase sequencers), are used. Also good.

5 . 4 診断用キッ 卜 5.4 Diagnostic kit

本発明はまた、 抗 P P P 1 R 3 D抗体を含有する、 被験者の体液試料 中の P P P 1 R 3 Dタンパク質またはその断片をがんマーカーとして検 出および Zまたは定量するためのキッ トを提供する。 さらに、 P P P 1 R 3 D遺伝子またはその一部の塩基配列にス 卜リンジェン卜なハイプリ ダイゼーシヨン条件下でハイブリダィズ可能な塩基配列を含有する、 被 験者由来の生体試料中の P P P 1 R 3 D遺伝子またはその断片をがんマ 一力一として検出およびノまたは定量するためのキツ トをも提供する。 これらのキッ トは、 上述の免疫学的手法またはハイプリダイゼーション 法等により、 がんマーカーを検出するために用いられる。 このようなが んとしては、 例えば、 大腸がん、 胃がん、 肺がん、 乳がん、 前立腺がん、 食道がん、 肝臓がん、 胆道がん、 脾臓がん、 腎がん、 膀胱がん、 子宮が ん （例 ： 子宮頸がん、 子宮体がん） 、 精巣がん、 甲状腺がん、 膝臓がん、 卵巣がん、 脳腫瘍、 血液腫瘍などが含まれるが、 とりわけ、 大腸がんが 好ましい。  The present invention also provides a kit for detecting and Z or quantifying a PPP 1 R 3 D protein or a fragment thereof in a body fluid sample of a subject containing an anti-PPP 1 R 3 D antibody as a cancer marker. . Furthermore, the PPP 1 R 3 D gene or the PPP 1 R 3 D gene in a biological sample derived from a subject, which contains a base sequence that can be hybridized under high hybridization conditions, to the base sequence of the PPP 1 R 3 D gene or a part thereof. It also provides a kit for detecting and quantifying the fragment as a single cancer. These kits are used to detect cancer markers by the above-described immunological techniques or hyperpredation methods. Examples of such cancers include colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, and uterus. (Examples: cervical cancer, endometrial cancer), testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc., but colorectal cancer is particularly preferred.

本明細書中、 「がんマーカー」 とは、 被験者の体液 （例えば、 血液、 尿、 リンパ液、 唾液、 汗、 精液等） または細胞もしくは組織中における、 正常組織に由来していないか、 あるいはがん細胞または組織において選 択的に発現の亢進している分子のことをいい、 被験者の体液または細胞 もしくは組織中における当該分子の存在ががんの存在を示すかまたは示 唆するものをいう。  In the present specification, the term “cancer marker” refers to a subject's body fluid (eg, blood, urine, lymph, saliva, sweat, semen, etc.) or cells or tissues that are not derived from normal tissues, or This refers to a molecule that is selectively upregulated in cancer cells or tissues, and the presence of the molecule in the body fluid or cells or tissues of a subject indicates or suggests the presence of cancer.

上記第一の態様のキッ トは、 被験者からの体液試料中の P P P 1 R 3 D抗原 （ P P P 1 R 3 Dタンパク質およびその部分ペプチドを含む） を 検出および または定量する成分を含有する。 例えば、 P P P 1 R 3 D タンパク質が E L I S Aで検出および または定量される場合、 このよ うな成分は、 例えば、 組織切片、 または血液や尿のような体液試料中の P P P 1 R 3 Dのレベルを検出および または定量するために使用され 得る。 このような抗体は放射能、 蛍光、 比色、 または酵素標識で標識さ れていてもよい。 本発明のキッ トは、 標識された二次抗体を含有してい てもよい。 The kit of the first embodiment contains a component for detecting and / or quantifying PPP 1 R 3 D antigen (including PPP 1 R 3 D protein and its partial peptide) in a body fluid sample from a subject. For example, if PPP 1 R 3 D protein is detected and / or quantified by ELISA, such components detect the level of PPP 1 R 3 D in, for example, tissue sections or body fluid samples such as blood and urine. And or used to quantify obtain. Such antibodies may be labeled with radioactivity, fluorescence, colorimetry, or enzyme labeling. The kit of the present invention may contain a labeled secondary antibody.

上記第二の態様のキッ トは、 P P P 1 R 3 D遺伝子またはその一部の 塩基配列にストリンジェン卜なハイブリダイゼーション条件下でハイブ リダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。 例えば、 本発明のキッ トは、 DN Aチップ上に固定された上記ポリヌクレオチド を含有し得る。  The kit according to the second embodiment contains a polynucleotide having a base sequence that can be hybridized under hybridization conditions stringent to the base sequence of the PPP 1 R 3D gene or a part thereof. For example, the kit of the present invention may contain the above-described polynucleotide immobilized on a DNA chip.

本発明のキッ トは、 抗 P P P 1 R 3 D抗体、 P P P 1 R 3 D遺伝子ま たはその一部の塩基配列にス トリンジェン卜なハイ,ブリダイゼーション 条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列等の他に、 容器およびラベルを 含んでいてもよい。 容器上のまたは容器に伴うラベルには、 薬剤が大腸 がんマーカーの検出に使用されることが示されていてもよい。 また、 他 のアイテム、 例えば、 使用説明書等がさらに含まれていてもよい。  The kit of the present invention includes an anti-PPP 1 R 3D antibody, a PPP 1 R 3D gene or a part of its base sequence, a stringent high sequence, a base sequence that can be hybridized under hybridization conditions, and the like. In addition, containers and labels may be included. The label on or associated with the container may indicate that the drug is used to detect colorectal cancer markers. In addition, other items such as instructions for use may be further included.

以下、 本発明を実施例を用いてより具体的に説明するが、 本発明の範 囲は、 これらの実施例によって限定されない。 実施例  Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited by these examples. Example

実施例 1 ： アレイ C GH法による大腸がん特異的増幅遺伝子の同定 Example 1: Identification of colon cancer specific amplification gene by array C GH method

本実施例では、 大腸がん特異的な遺伝子増幅領域を特定するために、 大腸がん検体 2 0 0症例のサンプル調製およびアレイ C GH法に基づく 検証を実施した。  In this example, in order to identify a gene amplification region specific to colorectal cancer, sample preparation of 200 colorectal cancer specimens and verification based on the array CGH method were performed.

その結果、 大腸がん検体において高頻度に増幅が起きている領域の内、 公共 D Bでの遺伝子情報 （NC B I ： h t t p ： //www. n c b i . n 1 m. n i h . g o v/) を利用し、 精査した結果、 使用した B AC C l o n e R P 1 1 — 2 8 G 1 8に位置している、 P P P 1 R 3 D (P r o t e i n p h o s p h a t a s e 1， r e g u l a t o r y s u b u n i t 3 D) (N C B I A c c e s s i o n N o. ： NM_0 0 6 24 2 ) 遺伝子が大腸がん患者において高頻度で高 値であることを見出した （図 1 , 表 2 ) 。 図 1は、 P P P 1 R 3 D遺伝 子の大腸がん患者 2 0 0検体での増幅度に対する頻度を示すヒス トグラ ムである。 また、 下記の表 2は、 P P P 1 R 3 D遺伝子の大腸がん患者 2 0 0検体での増幅度 （GZR値） および頻度を示す。 平均値は、 GZ R値が 1. 2以上の検体での平均値を示している。 As a result, the gene information (NC BI: http: //www.ncbi.n1m.nih.gov/) in the public DB is used in the region where amplification occurs frequently in colorectal cancer specimens. As a result of close examination, BAC C lone RP 1 1 — 2 8 G 1 8 used, PPP 1 R 3 D (Proteinphosphatase 1, regulatorysubunit 3 D) (NCBIA ccession No .: NM_0 0 6 24 2) Genes frequently and frequently in colorectal cancer patients It was found to be a value (Fig. 1, Table 2). FIG. 1 is a histogram showing the frequency of amplification of PPP 1 R 3 D gene in 200 colorectal cancer patients. Table 2 below shows the amplification degree (GZR value) and frequency of 200 PPP specimens of the PPP 1 R 3 D gene in colorectal cancer patients. The average value shows the average value for samples with a GZ R value of 1.2 or more.

表 2に示されるように、 P P P 1 R 3 D遺伝子は、 2 0 0検体の大腸 がん患者の 64. 5 %において増幅が認められ、 その増幅度の平均値は、 1. 8であった。 最大値は 2. 7であり、 非常に高頻度で顕著な増幅が 起こっていた。  As shown in Table 2, the PPP 1 R 3 D gene was amplified in 64.5% of 20 0 colorectal cancer patients, with an average amplification of 1.8. . The maximum value was 2.7, and remarkable amplification occurred very frequently.

(表 2 ) (Table 2)

Figure imgf000043_0001
実施例 2 ： 大腸由来培養細胞株での遺伝子増幅度の検証
Figure imgf000043_0001
Example 2: Verification of gene amplification in a colon cell line derived from the large intestine

本実施例では、 大腸がん患者において高頻度で高値な遺伝子領域につ いて、 大腸がん由来培養細胞株での増幅度を検証した。  In this example, the degree of amplification in a colon cancer-derived cultured cell line was verified for a high-frequency gene region in colon cancer patients.

<サンプル調製 >  <Sample preparation>

培養細胞株は、 大腸がん由来の細胞株である D L D— 1および RKO E 6を使用した。 培養細胞より B l o o d & C e l l C u 1 t u r e DN A K i t (Q I A G E N) を使用して、 キッ ト添付のプロ トコールに従い、 ゲノム DNAを抽出した。  Cultured cell lines were DLD-1 and RKO E6, which are colon cancer-derived cell lines. Genomic DNA was extracted from the cultured cells according to the protocol attached to the kit using Blood & CellCu1ture DNAKite (QIAGEN).

ぐアレイ C GH>  Array C GH>

遺伝子領域の増幅を確認するために、 アレイ C GHを実施した。 方法 の詳細は実施例 1 と同様に実施した。  Array C GH was performed to confirm gene region amplification. The details of the method were the same as in Example 1.

結果  Result

表 3に、 P P P 1 R 3 D遺伝子の大腸がん由来の細胞株での増幅度 (GZR値） を示した。 示されるように、 大腸がん由来細胞株において も、 BAC C l o n e R P 1 1— 2 8 G 1 8に位置している、 P P P 1 R 3 D遺伝子で増幅が起きていることを見出した。 Table 3 shows the degree of amplification (GZR value) of the PPP 1 R 3 D gene in a cell line derived from colorectal cancer. As shown, in colorectal cancer-derived cell lines Also found that amplification occurred in the PPP 1 R 3 D gene, located in BAC C lone RP 1 1— 2 8 G 1 8.

(表 3 ) (Table 3)

Figure imgf000044_0001
これらの結果により、 大腸がん由来の細胞株 （D LD— 1、 RKOE 6 ) においても、 P P P 1 R 3 D遺伝子が増幅して.いることが確認され た。 よって、 がんにおける P P P 1 R 3 D遺伝子の機能解析に使用可能 な培養細胞が選択された。 実施例 3 ： 大腸がん細胞株を用いた R N A i解析による機能解析
Figure imgf000044_0001
Based on these results, it was confirmed that the PPP 1 R 3 D gene was also amplified in the colon cancer-derived cell lines (D LD-1, RKOE 6). Therefore, cultured cells that could be used for functional analysis of the PPP 1 R 3 D gene in cancer were selected. Example 3: Functional analysis by RNA i analysis using colorectal cancer cell lines

本実施例では、 大腸がん患者 2 0 0検体において高頻度に増幅が認め られた P P P 1 R 3 D遺伝子について、 大腸がん由来の細胞株であり、 且つ、 ゲノムレベルで遺伝子の増幅が認められた細胞株 （D LD _ 1、 RKOE 6 ) を用いて、 RNA i解析を行い、 その表現型を観察した。  In this example, the PPP 1 R 3 D gene, which was frequently amplified in 200 colorectal cancer patients, was a colon cancer-derived cell line, and gene amplification was observed at the genomic level. Using the obtained cell lines (D LD — 1, RKOE 6), RNA i analysis was performed and the phenotype was observed.

<R N A 1解析 >  <R N A 1 analysis>

細胞株は AT C Cより購入し、 添付のプロ トコールに従い培養を行つ た。 s i R N Aは遺伝子内の特異的な 2 1 me rを選択しその配列を標 的とする s 1 RNAを合成した （Q I A G E Nに合成委託） 。  The cell line was purchased from ATCC and cultured according to the attached protocol. For s i RN A, a specific 21 mer within the gene was selected and s 1 RNA was synthesized with the sequence as the target (commissioned to QIAGEN).

(表 4) (Table 4)

Figure imgf000044_0002
s i RNAの D L D— 1および RK〇 E 6細胞内への導入は、 RNA i F E C T (Q I A G E N) を使用し、 Ι Ο Ο η Μの s i R NAを添付 のプロ トコールに従い細胞に導入した。 対照には N e g a t i v e C o n t r o 1 s i RNA (Q I AG E N) を使用した。 細胞に導入後 4日間、 倒立顕微鏡下で観察した。
Figure imgf000044_0002
siRNA was introduced into cells using RNA i FECT (QIAGEN) and siRNA of Ι Ο η η に 従 い according to the attached protocol. As a control, N egative Control 1 siRNA (QI AG EN) was used. The cells were observed under an inverted microscope for 4 days after introduction into the cells.

ぐ定量的 R T— P C R解析〉 .  Quantitative RT-PCR analysis>.

定量的 R T— P C R法を用いて、 s i R N Aの効果を mR N Aレベル で検証した。 s i R N A導入後 2 4時間の細胞から、 M i c r o— t o — M i d i T o t a l RNA P u r i f i c a t i o n S y s t e m ( I n v i t r o g e n ) を使用して、 添付のプロ トコールに 従い、 全 RNAを抽出した。 その後、 S u p e r S c r i p t I I I F i r s t — S t r a n d S y n t h e s i s S y s t e rn f o r R T- P C R ( I n v i t r o g e n) を使用して、 添付のプロ ト コールに従い、 c DNAを合成した。  The effect of siRNA was verified at the mRNA level using a quantitative RT-PCR method. Total RNA was extracted from the cells 24 hours after introduction of siRNA using MicroT o —Mid iT o t a lRNAPu r if i c i t i o nSy s te tem (Inv rt g o n) according to the attached protocol. Subsequently, cDNA was synthesized according to the attached protocol using Super Sc r i p t I I I F i r s t — S t r a n d S y n t h e s i S S y s t e rn f o r R T-P C R (I n v i t ro g e n).

この c D N Aを錶型にして、 定量的 R T— P C Rを実施した。 定量的 P C Rは、 S Y B R G r e e n R T— P C R R e a g e n t s ( A p 1 i e d B i o s y s t e rn s ) を使用して、 添付のプロ ト コールに従い、 7 5 0 0 R e a l -T i me P C R S y s t e rn (A p p l i e d B i o s y s t em s ) を用いて実施した。 プライ マーは、 以下の配列を合成し （〇 P E R ONに合成委託） 使用した。 プライマ一配列 ：  Quantitative RT-PCRR was performed using this cDNA as a saddle. Quantitative PCR was performed using SYBRG reen RT—PCRR eagents (A p 1 ied B iosys te rn s) according to the attached protocol. iosyst em s). Primers synthesized the following sequences (* commissioned to PERON). Primer sequence:

5， — AC GTTT T C AC C TT C GGC TTT C— 3 ' (配列番号 9 )  5, — AC GTTT T C AC C TT C GGC TTT C— 3 '(SEQ ID NO: 9)

5， - GC GTG GT TG C GAC AT GTG - 3 ' (配列番号 1 0 ) 相対比を算出するための標準遺伝子には G l y c e r a l d e h y d e— 3— p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e 、GAP D H ) C o n t r o l R e a g e n t s '(A p p l i e d B i o s y s t e m s ) を用いて G A P D Hの発現量を求め、 相対比を算出した。 <生細胞数の測定 > 5,-GC GTG GT TG C GAC AT GTG-3 '(SEQ ID NO: 10) The standard gene for calculating the relative ratio is G lyceraldehyde— 3—phosphatedehydrogenas e, GAP DH) Control Reagents' (A pplied Biosystems) was used to determine the expression level of GAPDH, and the relative ratio was calculated. <Measurement of the number of living cells>

s i RNA導入後の生細胞数を A 1 a m a r B l u e ( B i o s o u r c e ) を用いて、 添付のプロ トコールに従い、 Wa 1 1 a c 1 4 2 0 Mu l t i .l a b e 1 /L um i n e s c e n c e C o u n t e r ARVO (P e r k i n E l me r ) により測定した。 結果  Using the A 1 amar Blue (Biosource), the number of viable cells after siRNA transfer was determined according to the attached protocol. Wa 1 1 ac 1 4 2 0 Mu lti .labe 1 / L um inescence Counter ARVO (P erkin Elmer)). Result

大腸がん由来の細胞株である D L D— 1、 RKO E 6を用いて、 P P P 1 R 3 D遺伝子の RNA i解析を実施した。  RNAi analysis of the PPP1R3D gene was performed using DLD-1 and RKO E6, which are cell lines derived from colorectal cancer.

図 2 Aおよび図 2 Bに、 それぞれ D L D _ 1およ.び R K〇 E 6細胞に Ρ Ρ Ρ 1 R 3 D遺伝子の s i RNAを T r a n s f e e t i o n後、 4 日目の観察像を示す （上段 ： X 4 0 ; 下段 ： X 2 0 0 ) 。 a， b， およ び cは、 それぞれ P P P 1 R 3 D遺伝子の s i R N A 3種であり、 N C はネガティブコントロールを示す。 示されるように、 表現型の観察では、 いずれの細胞においても、 a、 b、 および c 3種類の s i RNA共に N e g a t i v e C o n t r o l (NO と比較して顕著に細胞数が減 少していた （図 2 ) 。  Figures 2A and 2B show the observation images on day 4 after Transfeetion of siRNA of R Ρ Ρ 1 R 3 D gene in DLD_ 1 and RK〇 E 6 cells, respectively (upper: X 4 0; lower row: X 2 0 0). a, b, and c are s i R N A 3 species of the P P P 1 R 3 D gene, and N C represents a negative control. As shown, phenotypic observations showed that the number of cells in both cells a, b, and c was significantly reduced compared to N egative Control (NO) (Fig. 2).

図 3 Aおよび図 3 Bには、 それぞれ D LD— 1および RKOE 6細胞 に P P P 1 R 3 D遺伝子の s i RNAを T r a n s f e e t i o nして 2 4時間後に細胞を回収し、 定量的 R T— P C Rを行った結果を示す。 内在性コントロールとして、 G A P DHの相対比を用いて、 NCに対す る相対量を示した。 示されるように、 R N Aレベルでの効果を定量的 R T _ P C Rで確認した結果、 いずれの細胞においても、 三種類の s i R NA共に顕著に発現量が減少していた （図 3) 。  Figure 3A and Figure 3B show that the cells were collected 24 hours after Transfeetion of siRNA of PPP 1 R 3 D gene in D LD-1 and RKOE 6 cells, respectively, and quantitative RT-PCR was performed. The results are shown. As an endogenous control, the relative ratio to NC was shown using the relative ratio of GAPDH. As shown, as a result of confirming the effect at the RNA level with quantitative RT_PCR, the expression level of all three types of siRNA was markedly decreased in all cells (Fig. 3).

図 4 Aおよび図 4 Bには、 それぞれ D L D— 1および R K O E 6細胞 に P P P 1 R 3 D遺伝子の s i RNAを T r a n s f e e t i o n後、 4日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞数を測定した結果を示す。 グラフは N Cに対する相対量を示した。 示されるように、 生細胞数の測 定を行った結果、 表現型同様、 N e g a t i v e C o n t r o l (N C) と比較して顕著に細胞数が減少していた （図 4) 。 いずれの細胞に おいても、 P P P 1 R 3 D遺伝子の s i RNA 3種 （ a， b， c ) 全て について、 t検定において有意 （ Pく 0. 0 1 ) であった。 Fig. 4 A and Fig. 4 B show that the number of viable cells was measured with the measurement reagent using the cells on day 4 after Transfeetion of siRNA of PPP 1 R 3 D gene to DLD-1 and RKOE 6 cells, respectively. Results are shown. The graph shows the relative amount to NC. As shown, N egative Control (N Compared to C), the number of cells was significantly reduced (Fig. 4). In all of the cells, all three types of siRNA (a, b, c) of the PPP 1 R 3 D gene were significant in the t-test (P> 0.01).

よって、 RNA i効果により P P P 1 R 3 D遺伝子の発現が抑制され た結果、 D L D— 1および RKO E 6において、 顕著にがん細胞の増殖 が抑制されることが見出された。 実施例 4 ： 大腸由来正常細胞株を用いた RN A i解析による機能解析 本実施例では、 大腸の正常組織由来の細胞株を用いて RN A i解析を 実施することにより、 標的遺伝子の抑制効果ががん特異的であることを 検証する。  Therefore, it was found that the proliferation of cancer cells was remarkably suppressed in DLD-1 and RKO E6 as a result of the expression of the PPPP1R3D gene being suppressed by the RNAi effect. Example 4: Functional analysis by RNAI analysis using a colon-derived normal cell line In this example, the RNAI analysis was performed using a cell line derived from a normal tissue of the large intestine. Verify that is cancer specific.

ぐ R N A i解析〉  R N A i analysis>

細胞株は AT Cじより購入した C CD 1 8 C Oを使用する。 培養条件 は、 添付のプロ トコールに従う。 s i R N Aは、 実施例 3の a、 bまた は c配列を使用する。 s i RNAの細胞内への導入は、 L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 ( I n v i t r o g e n) を使用し、 2 5 nM の s i RNAを添付のプロ 卜コールに従い細胞に導入する。 対照には N e g a t i v e C o n t r o l s i RNA (Q I AGE N) を使用 する。 導入後 5日間、 倒立顕微鏡下で観察する。  For the cell line, use CCD 18 CO purchased from AT C. Culture conditions are according to the attached protocol. For s i RN A, the a, b or c sequence of Example 3 is used. For introduction of si RNA into cells, L i pof e cta min e 2200 (Invitrogen) is used, and 25 nM of siRNA is introduced into cells according to the attached protocol. As a control, N ega tiv e C o n t r o ls i RNA (Q I AGE N) is used. Observe under an inverted microscope for 5 days after introduction.

<定量的 R T _ P C R解析 >  <Quantitative R T _P C R analysis>

実施例 3の記載方法と同様に実施する。  Carry out in the same way as described in Example 3.

ぐ生細胞数の測定 >  Measurement of the number of living cells>

実施例 3の記載方法と同様に実施する。 実施例 5 ： 遺伝子増幅の評価  Carry out in the same way as described in Example 3. Example 5: Evaluation of gene amplification

検体組織のがん細胞において P P P 1 R 3 D遺伝子領域で遺伝子増幅 がおきていることを、 当該技術分野で公知の FISH法により評価した。 アレイ CGH 法により、 遺伝子増幅度（G/R)が 1.2 以上であった検体組 織 （大腸癌患者由来） を用いて、 P P P 1 R 3 D遺伝子が位置する BAC Clone RP11-28G18 の DNA Probe でハイブリダイゼーションを実施した。 口 ¾ It was evaluated by the FISH method known in the art that gene amplification occurred in the PPP 1 R 3 D gene region in cancer cells of the specimen tissue. Using a sample tissue (derived from a colon cancer patient) with a gene amplification degree (G / R) of 1.2 or higher by the array CGH method, the BAC containing the PPP 1 R 3 D gene is located. Hybridization was performed with Clone RP11-28G18 DNA Probe. Mouth ¾

図 5は、 各検体組織（A〜J)で観察したがん細胞の一部（6 細胞分）の光 学顕微鏡写真 （蛍光像） を示す。 示されるように、 がん細胞においてシ グナルが 3スポッ ト以上見出された。 アレイ CGH法により遺伝子増幅度 (G/R)が 1.2以上であった 10検体において、 P P P 1 R 3 D遺伝子領域 が増幅していることが確認された。 また、 病態ステージの初期から後期 にわたり遺伝子増幅が起きていることが示された。 このことは、 P P P 1 R 3 D遺伝子領域が、 がん治療薬の分子標的としてだけでなく、 FISH 法によるがん診断に応用できることを示している。 実施例 6 ： 質量分析による血中 P P P 1 R 3 D夕ンパク質の検出  Figure 5 shows optical micrographs (fluorescence images) of some of the cancer cells (6 cells) observed in each sample tissue (A to J). As shown, more than 3 spots were found in cancer cells. It was confirmed that the PPP 1 R 3 D gene region was amplified in 10 specimens whose gene amplification degree (G / R) was 1.2 or more by the array CGH method. It was also shown that gene amplification occurred from the early stage to the late stage of the disease state. This indicates that the P P P 1 R 3 D gene region can be applied not only as a molecular target for cancer drugs but also in cancer diagnosis by FISH. Example 6: Detection of PPP 1 R 3 D protein in blood by mass spectrometry

1 ) 血液検体の前処理  1) Pretreatment of blood sample

大腸癌患者の血清検体 10; L及び健常者血清検体 10 Lを、 希釈バッ フ ァ溶液 （ 10mM Tris HC1 ph 7.4+150mM NaCl ) 500 L で希釈後、 ProteomeLab IgY-12 SC プロテオームパーティ シ ョ ニングキ ッ ト (BECKMAN COULTER： A24618) を用いてアルブミン、 グロブリ ン等の血 清中多量蛋白質を除去した。 得られた画分に終濃度 10mM となるように ジチオスレィ トール （Wako:049- 08972) を加え、 還元反応を 60 で 30 分間行った。 反応終了後、 終濃度 10mM となるようにョードアセトアミ ド （SIGMA:144- 48- 9) を加え、 アルキル化反応を室温で 30 分間、 遮光 状態で行った。 反応終了後、 反応液の 4 倍量の冷アセトン （Wako:014- 08681, —20で） を加え、 一 80でに 1 時間静置した後に 15, 000 x g で 30 分間遠心してタンパク質を沈殿として回収した。 回収したタンパク 質は 80 L の 2M尿素 + 100mM重炭酸アンモニゥム溶液に溶解した。 溶 解後に一部を BCA法による夕ンパク質濃度測定に供した。 試料タンパク 質と 1/50 (w/w)となるようにトリプシン （Promega： V511C) を加え、 37°Cで 16時間消化反応を行った。 2 ) Nano-HPLC直結質量分析装置による解析 Serum specimens of colon cancer patients 10; L and healthy specimens 10 L are diluted with 500 L of diluted buffer solution (10 mM Tris HC1 ph 7.4 + 150 mM NaCl), then ProteomeLab IgY-12 SC Proteome partitioning kit (BECKMAN COULTER: A24618) was used to remove a large amount of serum proteins such as albumin and globulin. Dithiothreitol (Wako: 049-08972) was added to the obtained fraction to a final concentration of 10 mM, and the reduction reaction was performed at 60 for 30 minutes. After completion of the reaction, odoacetamide (SIGMA: 144-48-9) was added to a final concentration of 10 mM, and the alkylation reaction was carried out at room temperature for 30 minutes in the dark. After completion of the reaction, add 4 times the volume of cold acetone (with Wako: 014-08681, —20) to the reaction solution, let stand at 80 for 1 hour, and centrifuge at 15,000 xg for 30 minutes to precipitate the protein. It was collected. The recovered protein was dissolved in 80 L of 2M urea + 100 mM ammonium bicarbonate solution. After dissolution, a portion was subjected to measurement of protein concentration by the BCA method. Trypsin (Promega: V511C) was added to the sample protein at 1/50 (w / w), and digestion was performed at 37 ° C for 16 hours. 2) Analysis using Nano-HPLC direct mass spectrometer

ペプチド断片 0.7^g 量を ; α-Precolumn cartridge (C18 PepMap300, 5 m, 300A, 300 ΠΙ i. d. x 5 mm LC PACKINGS: 163589) と直結させた ナノ カ ラ ム （Π8 PepMap 3 m, 100 A , 75 m i. d. x 150 圆 LC PACKINGS:160321) によ り分離した。 HPLC 装置は Ultimate Plus (LC PACKINGS)を用いた。 流速は 200nL/min、 0. ギ酸 (Wako:062-02901 ) 含有 2 ァセトニトリル （MERCK: 1287229) と 0. ギ酸含有 9( ァセトニ トリルの濃度勾配が 0.57¾/minの直線グラジェン卜を設定して解析を行 つた。 Nano- HPLCで分離した試料は PicoTip (New Objective:FS360-20- 10-D-20) を通して直結したイオントラップ型質量分析装置に連続的に 導入した。 質量分析装置は HCT Plus (Bruker Dal tonics)を用いた。 試 料のイオン化はキヤピラリー電圧 1500V、 エンドプレートオフセッ ト値 500V、 ドライガス流量 12 L/niin、 ドライガス温度 250°Cの条件で行った。 イオントラップの設定は標的 m/z の前後 1 Da の取り込みとし、 MRM モ —ドでの MS/MS解析を行った。  Peptide fragment 0.7 ^ g nano-column (Π8 PepMap 3 m, 100 A, 75) directly coupled with α-Precolumn cartridge (C18 PepMap300, 5 m, 300A, 300 ΠΙ id x 5 mm LC PACKINGS: 163589) m id x 150 圆 LC PACKINGS: 160321). As the HPLC apparatus, Ultimate Plus (LC PACKINGS) was used. Flow rate is 200nL / min, 0.2. Formic acid (Wako: 062-02901) -containing 2-acetonitrile (MERCK: 1287229) and 0. Formic acid-containing 9 (acetonitol concentration gradient 0.57¾ / min. Samples separated by Nano-HPLC were continuously introduced into an ion trap mass spectrometer directly connected through PicoTip (New Objective: FS360-20-10-D-20). The sample was ionized under the conditions of a capillary voltage of 1500 V, an end plate offset value of 500 V, a dry gas flow rate of 12 L / niin, and a dry gas temperature of 250 ° C. MS / MS analysis was performed in MRM mode, taking 1 Da before and after m / z.

3 ) データ解析 3) Data analysis

質量分析装置から得た全分析デ一夕は Data Analysis ソフ トウェア (Bruker Daltonics) を介して出力した。 出力した全データ中から標的 分子の分析データのみを抽出した。 抽出したデータの中から各分析時間 における MS/MSデ一夕を精査し、 標的分子のフラグメントイオンに相当 する質量を持つイオンピークの有無を解析した。 |g¾  All analysis data obtained from the mass spectrometer was output via Data Analysis software (Bruker Daltonics). Only target molecule analysis data was extracted from all the output data. From the extracted data, we examined the MS / MS data at each analysis time and analyzed the presence or absence of an ion peak with a mass corresponding to the fragment ion of the target molecule. | g¾

図 6 Aおよび図 6 Bは、 （ A ) 大腸がん患者由来の血清、 および (B) 健常者由来の血清について、 上記の方法で解析した結果をそれぞ れ示す。  FIG. 6A and FIG. 6B show the results of analysis of (A) serum derived from colorectal cancer patients and (B) serum derived from healthy subjects by the above method, respectively.

図 7 A〜Cは、 MS/MS 解析によって決定された、 図 6に示すピークと アミノ酸 （またはアミノ酸配列） との対応関係を示す。 Figures 7A-C show the peaks shown in Figure 6 as determined by MS / MS analysis. Shows the correspondence with amino acids (or amino acid sequences).

図 6および図 7に示されるように.、 標的分子のフラグメントイオンに 相当するイオンピークが、 大腸がん患者由来の血清中に明確に認められ た。 すなわち、 図 7 Bに示すように、 少なく とも C末端側から G S I G L D S Cという部分配列が決定され、 これは、 P P P 1 R 3 Dタンパク 質のアミノ酸配列 （配列番号 2 ) 中の 1 8 4位〜 1 9 1位のアミノ酸配 列に相当する。 よって、 図 7 Aに示すように、 アミノ酸配列 1 8 3位〜 1 94位の標的ペプチドフラグメント （配列番号 1 1 ) が同定された。 このような部分配列に対応するイオンピークは健常者血清を用いた解析 では認められなかった （図 7 Cを参照） 。 よって、， この標的分子 （すな わち、 P P P 1 R 3 Dタンパク質） は癌特異的に血中存在量が増加して いる可能性が強く示唆された。 実施例 7 ： 子宮頸がん由来株 HeLa細胞株での RNAi効果の評価  As shown in Fig. 6 and Fig. 7, an ion peak corresponding to the fragment ion of the target molecule was clearly observed in the serum from colon cancer patients. That is, as shown in FIG. 7B, a partial sequence called GSIGLDSC is determined at least from the C-terminal side, and this is determined from positions 1 84 to 1 in the amino acid sequence of the PPP 1 R 3 D protein (SEQ ID NO: 2). 9 Corresponds to the amino acid sequence at position 1. Therefore, as shown in FIG. 7A, a target peptide fragment (SEQ ID NO: 1 1) having amino acid sequence 1 83 from position 3 to position 1 94 was identified. Such an ion peak corresponding to the partial sequence was not observed in the analysis using normal serum (see Fig. 7C). Therefore, it was strongly suggested that this target molecule (that is, PPP 1 R 3 D protein) may have increased cancer-specific blood abundance. Example 7: Evaluation of RNAi effect in cervical cancer-derived strain HeLa cell line

大腸がん細胞株では、 P P P 1 R 3 D遺伝子のノックダウンにより、 増殖抑制効果が認められたが、 子宮頸がん細胞株においてどのような効 果が認められるのか、 前述の RNAi解析法により、 評価した。  In the colon cancer cell line, the growth inhibition effect was observed by knocking down the PPP 1 R 3 D gene, but what effect was observed in the cervical cancer cell line was determined by the RNAi analysis method described above. , evaluated.

子宮頸がん由来細胞の HeLa細胞株を用いて、 前出の 3種の siRNAを 用いて RNAi 解析を実施した。 s i R N Aの細胞内への導入は、 O 1 i g o f e c t am i n e ( I n v i t r o g e n ) を使用し、 1 0 0 Using the HeLa cell line of cervical cancer-derived cells, RNAi analysis was performed using the above three siRNAs. Introducing s i R N A into cells using O 1 i g o f e c t am i n e (I n v i t r o g e n)

11^1の 5 i RN Aを添付のプロ トコールに従い細胞に導入した。 対照に は N e g a t i v e C o n t r o l s i RNA (Q I AGE N) を 使用した。 . 11 ^ 1 5 i RN A was introduced into the cells according to the attached protocol. As a control, Nega tiv corn ol s si RNA (Q I AGE N) was used. .

図 8は、 HeLa 細胞に P P P 1 R 3 D遺伝子の s i R NAを T r a n s f e e t i o n後、 4日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞数を 測定 （MTT assay) した結果を示す。 グラフは N C (Negat ive control siRNA(Qiagen 社製））に対する相対量を示した。 図に示されるように、 ? ? 1 1¾ 30遺伝子の 5 i R N A 3種 （ a , b , c ) それぞれ、 siRNA aにおいて 9 , siRNA bにおいて 17%, s iRNA cにおいて 29 の増 殖抑制効果が認められた （Pく 0.01の t検定において有意）。 FIG. 8 shows the results of measuring the number of viable cells (MTT assay) with the measurement reagent using the cells on the 4th day after Transfeetion of the PPP1 R 3 D gene siRNA to HeLa cells. The graph shows the relative amount with respect to NC (Negative control siRNA (Qiagen)). As shown in the figure, 1 1¾ 30 gene 5 iRNA 3 types (a, b, c), 9 siRNA a, 17% siRNA b, 29 29 siRNA c (29) Significant in t-test).

さらに、 時系列に従い、 顕微鏡下で微分干渉像を撮影し、 その動態を 詳細に観察 した。 具体的には、 HeLa 細胞に siRNA (a, b, c) を Transfection 後、 1， 2, 3, 4 日後の同視野の微分干渉像を観察した。 その結果を図 9に示す。 NC は Negative control s iRNA (Qiagen社製）を 使用した。 NC と比較して増殖速度の抑制と、 細胞死の誘導（一部を矢印 で示す）が確認された。 図中、 a、 b、 および cはそれぞれ、 図 8の s i RNA a、 s i RNA b、 および s i RNA cに対応する。 図 9に示 されるように、 増殖抑制が認められた a， b, cにおいて細胞死の誘導が 認められた。  In addition, according to the time series, differential interference images were taken under a microscope, and their dynamics were observed in detail. Specifically, after transfection of siRNA (a, b, c) in HeLa cells, differential interference images of the same field were observed 1, 2, 3, and 4 days later. The results are shown in Fig. 9. NC used negative control siRNA (Qiagen). Compared with NC, the growth rate was suppressed and cell death was induced (partially indicated by arrows). In the figure, a, b, and c correspond to siRNA a, siRNA b, and siRNA c in FIG. 8, respectively. As shown in Fig. 9, induction of cell death was observed in a, b, and c where growth inhibition was observed.

この結果より P P P 1 R 3 D遺伝子機能の阻害が大腸がんだけでなく、 子宮頸がんにおいても抗腫瘍性効果を示すことが示唆された。 産業上の利用可能性  This result suggests that inhibition of P P P 1 R 3 D gene function shows an antitumor effect not only in colorectal cancer but also in cervical cancer. Industrial applicability

本発明は、 がんの治療剤、 診断剤、 診断方法、 治療方法、 ならびにそ れに使用するキッ トなどを提供する。 したがって、 本発明は、 がんの診 断、 または標的治療等の分野において有用である。  The present invention provides cancer therapeutic agents, diagnostic agents, diagnostic methods, therapeutic methods, kits used therefor, and the like. Therefore, the present invention is useful in fields such as cancer diagnosis or targeted therapy.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims 1 . P P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するが ん治療剤。 1. P P P 1 R 3 D gene expression inhibitor as an active ingredient. 2 . 前記 P P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻害物質が、 2.The P P P 1 R 3 D gene expression inhibitor is ( ) P P P 1 R 3 D遺伝子の発現を R N A 1効果により阻害する作 用を有する核酸、  () A nucleic acid having the action of inhibiting the expression of P P P 1 R 3 D gene by the R N A 1 effect, ( b ) P P P 1 R 3 D遺伝子の転写産物またはその一部に対するアン チセンス核酸、  (b) an antisense nucleic acid for the transcription product of PPP 1 R 3 D gene or a part thereof, および and ( c ) P P P 1 R 3 D遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザィ ム活性を有する核酸、  (c) a nucleic acid having a ribozyme activity that specifically cleaves a transcript of the PPP1R3D gene, からなる群から選択される物質を含む、 請求項 1 に記載のがん治療剤。 The cancer therapeutic agent according to claim 1, comprising a substance selected from the group consisting of: 3 . P P P 1 R 3 Dタンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有す るがん治療剤。 3. P P P 1 R 3 A cancer therapeutic agent containing a substance that inhibits the activity of 3D protein as an active ingredient. 4 . 前記 P P P 1 R 3 D夕ンパク質の活性阻害物質が、  4. The P P P 1 R 3 D protein activity inhibitor is 該 P P P 1 R 3 Dタンパク質に対する抗体、  An antibody against the P P P 1 R 3 D protein, を含む、 請求項 3に記載のがん治療剤。 The cancer therapeutic agent of Claim 3 containing this. 5 . 前記がんが大腸がんまたは子宮頸がんである、 請求項 1〜 4のいず れかに記載のがん治療剤。  5. The cancer therapeutic agent according to any one of claims 1 to 4, wherein the cancer is colon cancer or cervical cancer. 6 . P P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻害物質をスクリ一二ングする方法で あって、  6. A method of screening for P P P 1 R 3 D gene expression inhibitor, ( a ) P P P 1 R 3 D遺伝子を発現する細胞に、 被検化合物を接触さ せる工程、  (a) a step of contacting a test compound with a cell expressing a PPP1R3D gene, ( b ) 該 P P P 1 R 3 D遺伝子の発現レベルを測定する工程、 および (b) measuring the expression level of the P P P 1 R 3 D gene; and ( c ) 被検化合物を接触させない場合と比較して、 該発現レベルを低 下させる化合物を選択する工程を包含する、 スクリーニング方法。 (c) A screening method comprising a step of selecting a compound that reduces the expression level as compared with a case where a test compound is not contacted. 7 . P P P 1 R 3 Dタンパク質の活性阻害物質をスクリーニングする方 法であって、 ( a ) P P P 1 R 3 Dタンパク質と被検化合物とを接触させる工程、7. A method for screening for inhibitors of PPP 1 R 3 D protein activity comprising: (a) contacting the PPP 1 R 3 D protein with a test compound; (b) 該 P P P 1 R 3 Dタンパク質と被検化合物との結合活性を測定 する工程、 および (b) measuring the binding activity between the PPP1R3D protein and the test compound; and ( c ) 該 P P P 1 R 3 Dタンパク質と結合する化合物を選択する工程 を包含する、 スクリーニング方法。  (c) A screening method comprising the step of selecting a compound that binds to the PPP 1 R 3 D protein. 8. 前記がんが大腸がんまたは子宮頸がんである、 請求項 6または 7に 記載の方法。  8. The method according to claim 6 or 7, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer. 9. P P P 1 R 3 Dタンパク質に対する抗体。  9. Antibodies against PPP1R3D protein. 1 0. 請求項 9に記載の抗体を含有するがん治療剤。  1 0. A cancer therapeutic agent comprising the antibody according to claim 9. 1 1. 放射性同位元素、 治療タンパク質、 低分子の.薬剤、 または治療遺 伝子を担持したベクターをさらに含有する、 請求項 1 0に記載のがん治 療剤。 1 1. The cancer therapeutic agent according to claim 10, further comprising a vector carrying a radioisotope, a therapeutic protein, a low molecular weight drug, or a therapeutic gene. 1 2. 前記がんが大腸がんまたは子宮頸がんである、 請求項 1 0または 1 1に記載のがん洽療剤。  1 2. The cancer therapeutic agent according to claim 10 or 11, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer. 1 3. 請求項 9に記載の抗体を含有するがん診断剤。 1 3. A cancer diagnostic agent comprising the antibody according to claim 9. 1 4. P P P 1 R 3 D遺伝子またはその一部の塩基配列にス トリンジェ ン卜なハイプリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列 を含有するがん診断剤。  1 4. P P P 1 R 3D gene or a part of its base sequence is a diagnostic agent for cancer containing a base sequence that can be hyper-predated under stringent high-prediction conditions. 1 5. 前記がんが大腸がんである、 請求項 1 3または 1 4に記載のがん 診断剤。  1 5. The cancer diagnostic agent according to claim 13 or 14, wherein the cancer is colorectal cancer. 1 6. 請求項 9に記載の抗体を含有するがん診断用キッ ト。  1 6. A cancer diagnostic kit comprising the antibody according to claim 9. 1 7. P P P 1 R 3 D遺伝子またはその一部の塩基配列にス 卜リンジェ ン卜なハイプリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列 からなるポリヌクレオチドを含有するがん診断用キッ ト。 1 7. P P P 1 R 3D cancer diagnostic kit containing a polynucleotide consisting of a base sequence that can be hyper-precipitated under a high-precipitation condition that is stringent to the base sequence of a 3D gene or part thereof. 1 8. 前記がんが大腸がんである、 請求項 1 6または 1 7に記載のがん 診断用キッ ト。 1 8. The cancer diagnostic kit according to claim 16 or 17, wherein the cancer is colon cancer. 1 9. 被験者由来の生体試料中の P P P 1 R 3 Dタンパク質または P P P 1 R 3 D遺伝子をがんマーカ一として検出および Zまたは定量する方 法。 1 9. A method of detecting and Z or quantifying PPP 1 R 3 D protein or PPP 1 R 3 D gene as a cancer marker in a biological sample derived from a subject. 2 0. 前記生体試料が、 全血、 血清、 または血漿である、 請求項 1 9に 記載の方法。 20. The method according to claim 19, wherein the biological sample is whole blood, serum, or plasma. 2 1. 質量分析装置を用いて、 P P P 1 R 3 Dタンパク質を検出および Zまたは定量する、 請求項 1 9または 2 0に記載の方法。  2 1. The method according to claim 19 or 20, wherein PPP 1 R 3 D protein is detected and Z or quantified using a mass spectrometer. 2 2. 抗 P P P 1 R 3 D抗体を用いて、 P P P 1 R 3 Dタンパク質を検 出および または定量する、 請求項 1 9〜 2 1 のいずれかに記載の方法。 2 2. The method according to any one of claims 19 to 21, wherein the PPP1R3D protein is detected and / or quantified using an anti-PPPP1R3D antibody. 2 3. ( a) 被験者由来の生体試料と、 P P P 1 R 3 Dタンパク質に対 する抗体とを接触させる工程、 および 2 3. (a) contacting the biological sample derived from the subject with an antibody against the PPPP1R3D protein, and (b) 前記試料中での前記抗体と、 P P P 1 R 3 Dタンパク質との結 合を検出および または定量する工程、  (b) detecting and / or quantifying the binding between the antibody and the P P P 1 R 3 D protein in the sample; を包含する、 請求項 2 2に記載の方法。 The method according to claim 22, comprising: 2 4. ( a ) 被験者由来の生体試料と、 P P P 1 R 3 D遺伝子またはそ の断片の塩基配列にス トリンジェントなハイプリダイゼーション条件下 でハイプリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドとを接触さ せる工程、 および  2 4. (a) Contacting a biological sample derived from a subject with a polynucleotide comprising a base sequence that can be hyper-precipitated under stringent high prehydidization conditions with the base sequence of the PPP 1 R 3D gene or fragment thereof. The process of (b) 前記試料中での前記ポリヌクレオチドと、 P P P 1 R 3 D遺伝 子またはその断片とのハイプリダイゼ一ションを検出および または定 量する工程、  (b) detecting and / or quantifying the hybridization of the polynucleotide in the sample with the PPP 1 R 3 D gene or a fragment thereof, を包含する、 請求項 1 9または 2 0に記載の方法。 The method according to claim 19 or 20, comprising: 2 5. がんの診断に用いるための請求項 1 9〜 2 4のいずれかに記載の 方法。 2 5. The method according to any one of claims 19 to 24, which is used for diagnosis of cancer. 2 6. 前記がんが、 大腸がんである、 請求項 2 5に記載の方法。  2 6. The method according to claim 25, wherein the cancer is colorectal cancer. 2 7. 配列番号 3、 配列番号 4、 配列番号 5、 配列番号 6、 配列番号 7、 または配列番号 8の塩基配列を有する、 ポリヌクレオチド。 2 7. A polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 8. 2 8. P P P 1 R 3 D遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有する がん治療剤であって、 配列番号 3、 配列番号 4、 配列番号 5、 配列番号 6、 配列番号 7、 または配列番号 8の塩基配列を有するポリヌクレオチ ドを含有する、 がん治療剤。 2 8. A cancer therapeutic agent containing a PPP 1 R 3 D gene expression inhibitor as an active ingredient, comprising SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: A cancer therapeutic agent comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence of 8.
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