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WO2007037341A1 - 光電流を用いた被検物質の特異的検出方法、それに用いられる電極、測定用セルおよび測定装置 - Google Patents

光電流を用いた被検物質の特異的検出方法、それに用いられる電極、測定用セルおよび測定装置 Download PDF

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Publication number
WO2007037341A1
WO2007037341A1 PCT/JP2006/319356 JP2006319356W WO2007037341A1 WO 2007037341 A1 WO2007037341 A1 WO 2007037341A1 JP 2006319356 W JP2006319356 W JP 2006319356W WO 2007037341 A1 WO2007037341 A1 WO 2007037341A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
working electrode
substance
test substance
sensitizing dye
electrode
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2006/319356
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Makoto Bekki
Hitoshi Ohara
Shuji Sonezaki
Koki Kanehira
Yumi Ogami
Hiroshi Ishikawa
Yumi Osaki
Hiromasa Tokudome
Yoko Yamada
Masahiro Miyauchi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toto Ltd
Original Assignee
Toto Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toto Ltd filed Critical Toto Ltd
Priority to EP06798404.7A priority Critical patent/EP1947452B1/en
Priority to CN200680044421.8A priority patent/CN101317087B/zh
Priority to US11/992,858 priority patent/US8092670B2/en
Priority to JP2007509796A priority patent/JP4086090B2/ja
Publication of WO2007037341A1 publication Critical patent/WO2007037341A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes

Definitions

  • the present invention relates to a method for specifically detecting a test substance having specific binding properties such as a nucleic acid, an exogenous endocrine disrupting substance, and an antigen using a photocurrent, an electrode used therefor, a measuring cell, and a measuring apparatus. .
  • a DNA analysis method is known in which a sample DNA is hybridized with a DNA probe having a base sequence complementary to the sample DNA and labeled with a fluorescent substance, and a fluorescent signal is detected at that time.
  • a fluorescent signal is detected at that time.
  • a gene sample denatured into a single strand is hybridized with a single-stranded nucleic acid probe having complementarity thereto, and then a double-stranded recognizer such as an intercalator is added.
  • a double-stranded recognizer such as an intercalator
  • an exogenous endocrine disruptor binds to a target DNA through a protein such as a receptor, thereby affecting the expression of the DNA and causing toxicity.
  • exogenous endocrine disruptors bind to DNA indirectly through proteins such as receptors that do not bind directly to DNA. For this reason, it is not easy to evaluate the binding of conventional methods such as prestaging using DNA binding.
  • a solar cell that generates photoelectric energy by using a sensitizing dye is known (for example, see JP-A-1 220380).
  • This solar cell has a polycrystalline metal oxide semiconductor and has a sensitizing dye layer formed over its surface area over a wide range.
  • the present inventors can supply electrons to an oxidized sensitizing dye as an electrolyte medium in specific detection of a test substance using a photocurrent generated by photoexcitation of a sensitizing dye.
  • a salt electrolyte an aprotic solvent, and at least one solvent selected from protic solvent power
  • the test substance can be easily and highly sensitively using a photocurrent. The knowledge that it can detect and quantify correctly was obtained.
  • the present invention provides a method, electrode, measurement cell, and measurement capable of detecting and quantifying a test substance having specific binding properties with high sensitivity, simply and accurately using photocurrent. Its purpose is to provide a device.
  • a working electrode to which a test substance to which a sensitizing dye is bound is fixed via a probe substance is brought into contact with an electrolyte medium together with a counter electrode, and the working electrode is irradiated with light.
  • the sensitizing dye is photoexcited, and a photocurrent flowing between the working electrode and the counter electrode due to electron transfer from the photoexcited sensitizing dye to the working electrode is detected.
  • a specific detection method comprising:
  • the working electrode has an electron-accepting layer containing an electron-accepting material that can accept electrons emitted by the sensitizing dye in response to photoexcitation, and the probe material is carried on the surface of the electron-accepting layer.
  • the electron acceptor is an oxide semiconductor having an energy level lower than the lowest unoccupied molecular orbital (LUMO) energy level of the sensitizing dye;
  • LUMO lowest unoccupied molecular orbital
  • a method in which the electrolyte medium comprises an electrolyte composed of a salt capable of supplying electrons to an oxidized sensitizing dye, and an aprotic solvent and at least one solvent selected from protic solvent power.
  • an electrode used as a working electrode in the above method comprising a conductive substrate,
  • An electron-accepting layer comprising an electron-accepting material formed on the conductive substrate and capable of accepting electrons emitted by the sensitizing dye in response to photoexcitation.
  • the working electrode is a working electrode
  • the measurement cell The measurement cell
  • FIG. 1 is a diagram for explaining the principle of a dye-sensitized solar cell.
  • the immobilization of the test substance to the probe substance shows the case where the test substance is pre-labeled with a sensitizing dye, and (b) shows The case where a sensitizing dye capable of intercalation is added to double-stranded nucleic acid is shown respectively.
  • FIG. 3 shows the process of immobilizing the test substance on the probe substance when the test substance is a ligand, the mediator is a receptor protein molecule, and the probe substance is a double-stranded nucleic acid.
  • FIG. 4 is a diagram showing a measurement cell in which a light source is arranged, and a portion 21 surrounded by a dotted line in the figure is a measurement cell.
  • FIG. 5 is a plan view of the measurement cell shown in FIG.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view of an example of another measurement cell.
  • FIG. 7 is an exploded perspective view of the measurement cell shown in FIG.
  • FIG. 8 Step of immobilizing a test substance on a probe substance when the test substance and the second test substance that compete with each other are antigens and the probe substance is an antibody
  • FIG. 9 is a diagram showing an example of an apparatus using a flow-type measurement cell and a patterned working electrode.
  • FIG. 10 is a diagram showing an example of a patterned working electrode.
  • A is a plan view of the working electrode
  • (b) is a sectional view of the working electrode
  • (c) is a working electrode of another embodiment. A sectional view is shown
  • (d) is a sectional view of another working electrode.
  • FIG. 11 is a diagram showing another example of a patterned working electrode, (a) is a plan view of the working electrode, (b) is a cross-sectional view of the working electrode, and (c) is an action of another embodiment. Cross-sectional views of the electrodes are shown.
  • FIG. 12 is a diagram showing an example of a light source used for a patterned working electrode.
  • FIG. 13 is a diagram showing another example of a light source used for a patterned working electrode.
  • FIG. 14 is a diagram showing an example of a measuring apparatus equipped with a light source moving type light irradiation mechanism, where (a) shows an overall perspective view and (b) shows a top view thereof.
  • FIG. 15 is a diagram showing an example of a measuring apparatus equipped with a cell moving type light irradiation mechanism, where (a) shows an overall perspective view and (b) shows a top view thereof.
  • a diagram showing an example of a light source moving type light irradiation mechanism in the apparatus shown in FIG. ⁇ 17] is a view showing an example of a cell movement type light irradiation mechanism in the apparatus shown in FIG. 15 ⁇ 18] is a view showing an example of a measuring device provided with the light irradiation mechanism, and (a) is a view showing FIGS. (B) shows an example of a device equipped with a cell movement function type mechanism shown in FIGS. 15 and 17, respectively.
  • FIG. 19 is a schematic perspective view of an example of a photocurrent detection device using a manufacturing method such as MEMS.
  • FIG. 20 is a configuration diagram of the photocurrent detection device shown in FIG.
  • FIG. 21 is an exploded perspective view of the detection chip shown in FIG.
  • FIG. 22 is a graph showing detected current values measured in Example 1, where (a) shows an FTO electrode and (b) shows an ITO electrode.
  • FIG. 23 is a graph showing the difference between the detected current values of complementary DNA and non-complementary DNA measured in Example 2.
  • PM corresponds to the case where DNA complementary to the probe is used
  • MM corresponds to the case where DNA complementary to the probe is used!
  • FIGS. 24A and 24B are diagrams showing detected current values measured in Example 3, wherein (a) shows an electrolyte solution containing iodine, and (b) shows a case using an electrolyte solution not containing iodine.
  • FIG. 25 is a view showing a schematic diagram of a working electrode prepared in Example 5 and having DNA immobilized on 49 power points.
  • FIG. 26 is a graph showing the change over time of the photocurrent measured in Example 6.
  • FIG. 27 is a graph showing the change over time of the photocurrent measured in Example 7.
  • FIG. 28 is a graph showing the change over time of the photocurrent measured in Example 8.
  • FIG. 29 is a graph showing the change over time of the photocurrent measured in Example 9.
  • FIG. 30 shows photocurrent values measured using various electrolytes in Example 10.
  • PM corresponds to the case of using the exact match probe
  • SNP to the single nucleotide mutant probe
  • MM to the case of using the complete mismatch probe.
  • FIG. 31 is a graph showing photocurrent values measured using various concentrations of acetonitrile in Example 11.
  • PM is a perfect match probe
  • SNP is a single nucleotide variant probe
  • MM corresponds to the case of using completely mismatched probes.
  • FIG. 32 is a graph showing photocurrent values measured using various electrolytes in Example 13.
  • FIG. 33 is a graph showing photocurrent values of single nucleotide polymorphisms (SNPs) measured in Example 14 using an aqueous electrolyte solution.
  • FIG. 34 is a graph showing the photocurrent values measured for rhodamine-labeled protein and unlabeled protein in Example 16.
  • FIG. 36 is a diagram showing the result of data processing of the photocurrent obtained in FIG. 35.
  • FIG. 37 is a diagram showing a photocurrent waveform measured in Example 17 using a mixed solution of ferricyanite potassium and water as an electrolytic solution.
  • a working electrode to which a test substance to which a sensitizing dye is bound is fixed via a probe substance is brought into contact with an electrolyte medium together with a counter electrode, and the working electrode is irradiated with light to
  • the sensitizing dye is photoexcited, and a photocurrent flowing between the working electrode and the counter electrode due to electron transfer from the photoexcited sensitizing dye to the working electrode is detected.
  • the working electrode has an electron-accepting layer containing an electron-accepting material that can accept electrons emitted by the sensitizing dye in response to photoexcitation, and the probe material is supported on the surface of the electron-accepting layer.
  • the electron acceptor is an oxide semiconductor having an energy level lower than the lowest unoccupied molecular orbital (LUMO) energy level of the sensitizing dye.
  • the electrolyte medium includes an electrolyte made of a salt that can supply electrons to the oxidized sensitizing dye, and at least one solvent selected from an aprotic solvent and a protic solvent.
  • an electrolyte medium is used, the sensitivity and accuracy of photocurrent detection for analytes are dramatically improved compared to conventional electrolytes such as those commonly used in solar cells. To do. The reason for this is not clear, but is thought to be as follows. Note that the following description is merely a hypothesis and does not limit the present invention.
  • Figure 1 shows a dye-sensitized solar cell. The figure explaining the principle of is shown.
  • the general composition of the electrolyte medium used in solar cells is I
  • the electrolyte medium used in the present invention includes a salt electrolyte capable of supplying electrons to the oxidized sensitizing dye, an aprotic solvent and at least one solvent selected from protic solvent power, and, if desired, And an additive. That is, the electrolyte used in the present invention comprises a reducing agent that supplies electrons to the oxidized sensitizing dye, and does not contain an oxidizing agent that accepts electrons from the counter electrode.
  • Preferred examples of electrolytes include I
  • Metal iodides such as 2; iodine salts of quaternary ammonium compounds such as tetraalkylammonium chloride, pyridinumumumide and imidazolium iodide; metal bromides such as LiBr, NaBr, KBr, CsBr and CaBr; Tetraalkylammobromide, pyridiumbromide
  • Iodine etc. Brominated salts of quaternary ammonium compounds; metal complexes such as ferrocyanate and ferricium ions; thiosulfates such as sodium thiosulfate, ammonium thiosulfate, potassium thiosulfate, calcium thiosulfate; sulfite And sulfites such as sodium, potassium sulfite, ammonium sulfite, iron sulfite, sodium hydrogen sulfite and calcium sulfite; and mixtures thereof. More preferable examples of electrolytes include Lilya Tetraalkyl Ammonium Muodide, Pyridinum Muodide, Imidazol Muodide, etc. Examples thereof include iodine salts of ammonium compounds and mixtures thereof, and particularly preferred is Lil or tetraalkylammodium.
  • the electrolyte concentration of the electrolyte medium is preferably 0.001 to 15M, more preferably 0.01 to LOM.
  • the solvent used in the present invention is an aprotic solvent, a protic solvent, or a mixture thereof. That is, a polar solvent system mainly containing water and a buffer solution component, or a non-polar polar solvent can be used.
  • Aprotic polar solvents include -tolyl such as acetononitrile, carbonates such as propylene carbonate and ethylene carbonate, and complex such as 1,3 dimethylimidazolinone, 3-methyloxazolinone and dialkylimidazolium salts.
  • dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, sulfolane and the like can be used.
  • the electrolyte is made of a salt that can supply electrons to an oxidized sensitizing dye, specifically I
  • the buffer is mainly used, and acetonitrile is included, so that the detection of the protein can be detected accurately by maintaining the binding between the proteins and reducing the reduction of the anion. It becomes possible.
  • the electrolyte medium can be used after gelation (solidification).
  • gelling methods can be performed by techniques such as polymer addition, oil gelling agent addition, polymerization including polyfunctional monomers, and polymer crosslinking reaction.
  • polymer used for the gel electrolyte matrix include polyacrylonitrile, polyvinylidene fluoride, and the like.
  • a sample solution containing a test substance, a working electrode, and a counter electrode are prepared.
  • the working electrode used in the present invention is an electrode provided on the surface with a probe substance capable of specifically binding directly or indirectly to a test substance. That is, the probe substance is not only a substance that specifically binds directly to the test substance, but also a conjugate obtained by specifically binding the test substance to a mediator such as a receptor protein molecule. Can be combined It may be a new substance.
  • the sample solution is brought into contact with the working electrode to specifically bind the test substance directly or indirectly to the probe substance, and the sensitizing dye is fixed to the working electrode by this binding.
  • a sensitizing dye is a substance that can emit electrons to the working electrode in response to photoexcitation. Either a test substance or a mediating substance is labeled in advance, or a conjugate of the test substance and the probe substance is intercalated. When using sensitizing dyes that can be changed, simply add them to the sample solution.
  • the test substance can be detected with high sensitivity.
  • this detected current has a high correlation with the concentration of the test sample in the sample solution, the test sample can be quantitatively measured based on the measured current amount or electric quantity.
  • test substance in the method of the present invention is not limited as long as it has a specific binding property, and various substances may be used.
  • a probe substance capable of specifically binding directly or indirectly to the test substance is supported on the surface of the working electrode, whereby the test substance is directly or indirectly attached to the probe substance. It is possible to detect by binding specifically.
  • test substance and a probe substance that can specifically bind to each other. That is, according to a preferred embodiment of the present invention, it is preferable that a substance having specific binding properties be a test substance and a substance that specifically binds to the test substance be supported on the working electrode as a probe substance. As a result, the test substance can be directly bound and detected on the working electrode.
  • a substance having specific binding properties be a test substance and a substance that specifically binds to the test substance be supported on the working electrode as a probe substance.
  • the test substance can be directly bound and detected on the working electrode.
  • Preferred examples of the combination of the test substance and the probe substance in this embodiment include a single-stranded nucleic acid and a combination of single-stranded nucleic acids having complementarity to the nucleic acid, and a combination of antigen and antibody. .
  • the test substance is a single-stranded nucleic acid and the probe substance is a single-stranded nucleic acid having complementarity to the nucleic acid.
  • Figures 2 (a) and 2 (b) show the specific binding process of the test substance to the working electrode.
  • a single-stranded nucleic acid 1 as a test substance is hybridized with a single-stranded nucleic acid 4 having complementarity as a probe substance carried on the working electrode 3, and Forms double-stranded nucleic acid 7.
  • the length of base pairs constituting the test substance is not limited as long as it has a complementary portion with the nucleic acid serving as the probe substance.
  • the substance preferably has a complementary portion of 15 bp or more to the nucleic acid. According to the method of the present invention, even when a nucleic acid having a base length of 200 bp, 500 bp, or lOOOObp is relatively long, a specific bond formation between the probe substance and the test substance nucleic acid is highly sensitive. It can be detected as current.
  • Sample liquids containing single-stranded nucleic acids as test substances include blood such as peripheral venous blood, white blood cells, serum, urine, feces, semen, saliva, cultured cells, and various organ cells.
  • Nucleic acids can be extracted from various specimen samples containing nucleic acids such as cells by a known method. At this time, the destruction of the cells in the specimen sample can be performed, for example, by vibrating the carrier by applying an external force to a physical action such as shaking or ultrasonic waves. In addition, using a nucleic acid extraction solution, it is possible to release nucleic acids with cellular force.
  • nucleic acid elution solutions examples include solutions containing surfactants such as SDS, Triton-X, and Tween-20, saponins, EDTA, proteases, and the like.
  • surfactants such as SDS, Triton-X, and Tween-20
  • saponins such as SDS, Triton-X, and Tween-20
  • saponins such as SDS, Triton-X, and Tween-20
  • saponins such as SDS, Triton-X, and Tween-20
  • saponins such as SDS, Triton-X, and Tween-20
  • saponins such as SDS, Triton-X, and Tween-20
  • saponins such as SDS, Triton-X, and Tween-20
  • saponins such as SDS, Triton-X, and Tween-20
  • saponins such as SDS, Triton-X, and Tween-20
  • saponins
  • detection is preferably performed after amplifying the gene by a known method.
  • a typical method for amplifying a gene would be a method using an enzyme such as polymerase chain reaction (PCR).
  • enzymes used for gene amplification include DNA-dependent DNA polymerases such as DNA polymerase, Taq polymerase, DNA-dependent RNA polymerases such as RNA polymerase I, Q Examples include RNA-dependent RNA polymerases such as ⁇ replicase, and PCR is a method using Taq polymerase because it can preferably be continuously amplified only by adjusting the temperature.
  • the nucleic acid is specifically labeled with a sensitizing dye during the amplification.
  • a sensitizing dye during the amplification.
  • I can do it.
  • it can be performed by incorporating aminoallyl-modified dUTP into DNA. This molecule is incorporated with the same efficiency as unmodified dUTP.
  • the fluorescent dye activated by N-hydroxysuccinimide reacts specifically with the modified dUTP, resulting in a test substance uniformly labeled with the sensitizing dye. .
  • the crude nucleic acid solution or purified nucleic acid solution obtained as described above is first heated at a temperature of 90 to 98 ° C, preferably 95 ° C or higher.
  • a single-stranded nucleic acid can be prepared by denaturation.
  • the test substance and the probe substance may indirectly and specifically bind. That is, according to another preferred embodiment of the present invention, a substance having specific binding properties is used as a test substance, a substance that specifically binds to the test substance is used as a mediator, and the mediator and It is preferable that a functionally bondable substance is supported on the working electrode as a probe substance. Thus, even a substance that cannot specifically bind to the probe substance can be detected by specifically binding indirectly to the working electrode via a mediator substance.
  • preferred examples of the combination of the test substance, the mediator, and the probe substance include a ligand, a receptor protein molecule that can accept the ligand, and a molecule that can specifically bind to the receptor protein molecule.
  • a combination of nucleic acids of a single strand can be mentioned.
  • the ligand include exogenous endocrine disrupting substances (environmental hormones).
  • An exogenous endocrine disrupting substance is a substance that binds to DNA via a receptor protein molecule and produces toxicity by affecting its gene expression. According to the method of the present invention, it is brought about by a test substance. The binding of proteins such as receptors to DNA can be monitored easily.
  • the specific binding process of the test substance to the working electrode in this embodiment is shown in FIG. As shown in FIG. 3, a ligand 10 as a test substance first specifically binds to a receptor protein molecule 11 as a mediator. Then, the receptor protein molecule 13 to which the ligand is bound specifically binds to the double-stranded nucleic acid 14 as the probe substance.
  • a single probe substance is caused to react with a plurality of identical test substances derived from different acquisition routes at the same time, and the amount of the test substance varies depending on the origin of the sample. It is also possible to quantify the test substance derived from the intended acquisition route.
  • a specific application example is expression profile analysis by competitive hybridization on a microarray. This is to analyze the difference in the expression pattern of a specific gene between cells, so that test substances labeled with different fluorescent dyes can be hybridized competitively with the same probe substance. Is. In the present invention, by using such a method, there is an unprecedented advantage that an expression difference analysis between cells can be performed electrochemically.
  • the test substance in order to detect the presence of a test substance with a photocurrent, the test substance is directly or indirectly specifically bound to the probe substance in the presence of a sensitizing dye, The sensitizing dye is fixed to the working electrode by binding. Therefore, in the method of the present invention, as shown in FIG. 2 (a) and FIG. 3, the test substance 1 is! /, And the mediator 11 is previously labeled with the sensitizing dyes 2 and 12. be able to.
  • a conjugate of the test substance and the probe substance 7 (for example, double-stranded nucleic acid after hybridization) can be intercalated sensitizing dye.
  • the sensitizing dye can be fixed to the probe substance by adding the sensitizing dye to the sample solution.
  • the test substance when the test substance is a single-stranded nucleic acid, it is preferable to label one sensitizing dye per molecule of the test substance.
  • the labeling position on the single-stranded nucleic acid is set at either the 5 'end or 3' end of the single-stranded nucleic acid from the viewpoint of easily forming a specific bond between the test substance and the probe substance. From the viewpoint of further simplifying the labeling step that is preferred, it is more preferable to use the 5 ′ end of the test substance.
  • the present invention it is preferable to label two or more sensitizing dyes per molecule of the test substance in order to increase the amount of the sensitizing dye supported per molecule of the test substance. .
  • the amount of the dye supported per unit specific surface area of the working electrode on which the electron accepting material is formed can be increased, and the photocurrent response can be observed with higher sensitivity.
  • the sensitizing dye used in the present invention is a substance that can emit electrons to the working electrode in response to photoexcitation, can transition to the photoexcited state by irradiation with a light source, and can be changed from the excited state to the working electrode. What is necessary is just to be able to take an electronic state in which electrons can be injected. Therefore, use Any sensitizing dye may be used as long as it can take the above-described electronic state with the working electrode, particularly the electron-accepting layer. Therefore, various sensitizing dyes can be used, and expensive dyes must be used. There is no.
  • the sensitizing dyes to be labeled on the test substances may be any substances that can be excited by light of different wavelengths. It suffices if each test substance can be excited individually by selecting the wavelength. For example, using multiple sensitizing dyes corresponding to multiple analytes and irradiating light with different excitation wavelengths for each sensitizing dye, signals are detected individually even if multiple probes are on the same spot. This is possible.
  • the number of test substances is not limited, but considering the wavelength of light irradiated from the light source and the absorption characteristics of the sensitizing dye, 1 to 5 types may be appropriate.
  • the sensitizing dye that can be used in this embodiment only needs to be photoexcited in the wavelength region of the irradiation light, and the absorption maximum is not necessarily in the wavelength region.
  • the presence or absence of the light absorption reaction of the sensitizing dye at a specific wavelength can be measured using an ultraviolet-visible spectrophotometer (for example, UV-3150, manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the sensitizing dye include metal complexes and organic dyes.
  • Preferred examples of the metal complex include metal phthalocyanines such as copper phthalocyanine and titanium phthalocyanine; chlorophyll or derivatives thereof; hemin, ruthenium described in JP-A-1 220380 and JP-A-5-504023, And osmium, iron and zinc complexes such as cis di cyanate bis (2,2,1-bibiligilu, 4,4-dicarboxylate) ruthenium (II)).
  • organic dyes include metal-free phthalocyanine, 9-phenol-xanthene dyes, cyanine dyes, methocyanine dyes, xanthene dyes, triphenylenomethane dyes, atridine dyes, oxazine dyes, coumarin dyes. And melocyanin dyes, oral dasyanin dyes, polymethine dyes, indigo dyes, and the like.
  • the sensitizing dye Cy3 Amersham Biosciences, Cy3 5, Cy5, Cy5 5 , C y 7, Cy7 5, C y 9;... Mol Molecular Probe Co.
  • the sensitizing dye that can be intercalated with the double-stranded nucleic acid include attalizin orange and ethidium bromide.
  • a sensitizing dye is used, a double-stranded nucleic acid labeled with a sensitizing dye is formed simply by adding to the sample solution after hybridization of the nucleic acid, so that the single-stranded nucleic acid is labeled in advance. There is no need to do.
  • the working electrode used in the present invention is an electrode having the probe substance on its surface, and is an electrode that can accept electrons emitted by a sensitizing dye fixed via the probe substance in response to photoexcitation. Therefore, the configuration and material of the working electrode are not limited as long as the above-described electron transfer occurs with the sensitizing dye to be used, and various configurations and materials may be used.
  • the working electrode has an electron accepting layer containing an electron accepting substance capable of accepting electrons emitted from the sensitizing dye in response to photoexcitation, and the surface of the electron accepting layer Is preferably provided with a probe substance.
  • the working electrode further comprises a conductive substrate, and an electron-accepting layer is formed on the conductive substrate.
  • An electrode of this embodiment is shown in FIGS.
  • the working electrode 3 shown in FIGS. 2 and 3 includes a conductive substrate 5 and an electron-accepting layer 6 formed on the conductive substrate 5 and containing an electron-accepting substance. Then, the probe substance 4 is carried on the surface of the electron accepting layer 6.
  • the electron accepting layer 6 in the present invention comprises an electron accepting substance capable of accepting electrons emitted by the sensitizing dye fixed via the probe substance 4 in response to photoexcitation.
  • the electron-accepting substance can be a substance that can take an energy level at which electrons can be injected from the photoexcited labeling dye.
  • the energy level (A) at which electrons can be injected from the photoexcited labeling dye means the conduction band (conduction band: CB), for example, when a semiconductor is used as the electron-accepting material.
  • the electron acceptor used in the present invention is lower than the LUMO energy level of this A level force sensitizing dye. Levels, in other words, those that have an energy level lower than the LUMO energy level of the sensitizing dye.
  • Examples of the electron acceptor include simple semiconductors such as silicon and germanium; acids such as titanium, tin, zinc, iron, tungsten, zirconium, hafnium, strontium, indium, cerium, yttrium, lanthanum, vanadium, niobium, and tantalum.
  • Velocite semiconductors such as strontium titanate, calcium titanate, sodium titanate, barium titanate, lithium niobate, etc .; cadmium, dumbbell, lead, silver, antimony, bismuth sulfate semiconductors Cadmium and lead selenium nitride semiconductors; Cadmium telluride semiconductors; Zinc, gallium, indium, cadmium and other phosphorus semiconductors; gallium arsenide, copper indium selenium, copper indium sulfide compound semiconductors Is mentioned. Note that the semiconductors listed above may be misaligned between intrinsic semiconductors and impurity semiconductors! /.
  • the electron accepting material uses an oxide semiconductor.
  • ITO indium-tin-tin oxide
  • fluorine fluorine
  • Elementally doped tin oxide can be used.
  • ITO and FTO have the property of functioning not only as an electron-accepting layer but also as a conductive substrate. By using these materials, only the electron-accepting layer functions as a working electrode without using a conductive substrate. It can be done.
  • the semiconductor When a semiconductor is used as the electron-accepting substance, the semiconductor may be either a single crystal or a polycrystal, but preferably has a porosity rather than a more dense one that a polycrystal is preferred. .
  • the specific surface area is increased, and a large amount of the test substance and sensitizing dye can be adsorbed to detect the test substance with higher sensitivity. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the electron-accepting layer is porous, and the diameter of each hole is preferably 3 to: LOOOn m, more preferably 10 to: LOOnm. .
  • the surface area of the electron accepting layer formed on the conductive substrate is preferably 10 times or more of the projected area, and more preferably 100 times or more. It is preferable that The upper limit of this surface area is not particularly limited, but will usually be about 1000 times.
  • the particle size of the electron-accepting material particles that make up the electron-accepting layer The average particle diameter using the converted diameter is preferably 5 to 200 nm as primary particles, more preferably 8 to 100 nm, and still more preferably 20 to 60 nm.
  • the average particle size of the electron-accepting substance fine particles (secondary particles) in the dispersion is preferably 0.01 to L00 ⁇ m.
  • an electron-accepting layer may be formed by using fine particles of an electron-accepting material having a large particle size, for example, about 300 nm.
  • the detection sensitivity can be increased by increasing the surface area of the electron-accepting layer 6 and fixing a large number of probe molecules. Since the size of the biomolecule is about 0.1 to 20 nm, the pore diameter formed by the concavo-convex structure is preferably 20 nm or more and 150 nm or less. If the space entrance caused by the concavo-convex structure is less than that, the specific surface area increases, but the biomolecule cannot be bound to the probe, and the detection signal decreases. If the unevenness is rough, the surface area will not increase so much, so the signal intensity will not increase much. A more preferable range suitable for sensing biomolecules is 50 nm or more and 150 nm or less.
  • a pillar structure in which nanoscale pillars (pillars) are regularly arranged on the surface as the convex structure.
  • a method for producing the same there are various methods in which a known type of anodic acid-alumina having pores with a nanometer scale is used as a mold. There are a method of removing the alumina mold by etching after filling the ceramic mold with a ceramic sol, and a method of performing a heat treatment after releasing the filled ceramic sol from the mold.
  • Examples of a method for producing a pillar-shaped nanostructure include a method for producing a nanostructure on a transparent substrate and a transparent conductive layer described in JP-A-2004-130171.
  • a method is used in which a anodic acid-alumina mold is filled with titasol, heat-treated at 300 to 400 ° C., and then removed by etching. As a result, titania nanotubes and nanowires are formed as nanostructures.
  • pores generated by firing an inorganic-organic hybrid precursor containing a ceramic component and forming a gas phase by acid-sodium decomposition of an organic substance are employed as a concave structure.
  • the inorganic-organic hybrid precursor coexists with a metal-oxygen network structure and an organic polymer produced by oxidation of an organometallic compound (metal alkoxide) and subsequent polycondensation reaction.
  • commercially available titanium oxide particles for example For example, an anatase type crystal manufactured by Tika Co., Ltd., trade name AMT-600 (average particle size 30 nm, etc.) or an organic polymer or the like is added to the titanium oxide dispersion.
  • a glyme-based solvent HO-(-CH CH 0) -R
  • n 1 to 10
  • R is an alkyl group or aryl group
  • titanium oxide particles are dispersed and an organic polymer is added as a dispersion aid.
  • the dispersion liquid of this composition is coated on the support by an appropriate method (dip coating method, spray coating method, spinner coating method, blade coating method, roller coating method, wiper bar coating method, reverse roll coating method). 200-800. When calcined with C, a specific surface area of 40-50 cm 2 per 1 cm 2 (thickness: m) has been achieved.
  • JP 2001-233615 a sol solution composed of tetraalkoxytitanium, ethylene oxide, propylene oxide, ethylene oxide block copolymer, a stabilizer and a solvent is dropped onto the substrate, and the solvent is removed by rotating the substrate at a high speed.
  • An organic-inorganic composite titer film having a three-dimensional structure obtained by evaporation and gelation is sintered at high temperature to remove the block copolymer, thereby achieving a fine three-dimensional concave structure.
  • a method using oligosaccharide (trehalose) as an organic polymer is also disclosed (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-83376), and a ceramic porous membrane having a porosity of 38 to 56% is obtained.
  • the working electrode further comprises a conductive substrate, and the electron accepting layer is formed on the conductive substrate.
  • the conductive base material that can be used in the present invention is not limited to a conductive material such as titanium, but has a conductive material layer on the surface of a glass or plastic support. It's okay. When a conductive base material having this conductive material layer is used, the electron accepting layer is formed on the conductive material layer.
  • the conductive material constituting the conductive material layer examples include metals such as platinum, gold, silver, copper, aluminum, rhodium and indium; conductive ceramics such as carbon, carbide and nitride; and indium Oxide, tin oxide doped with fluorine, oxidation Examples include conductive metal oxides such as tin doped with antimony, acid tandem doped gallium, or zinc oxide doped aluminum. More preferably, indium -Tin complex oxide (ITO), metal oxide (FTO) with tin oxide doped with fluorine.
  • ITO indium -Tin complex oxide
  • FTO metal oxide
  • the conductive substrate can be omitted.
  • the conductive substrate is not limited as long as it is a material that can ensure conductivity, and includes a thin film-like or spot-like conductive material layer that does not itself have a strength as a support.
  • the conductive substrate is not limited as long as it is a material that can ensure conductivity, and includes a thin film-like or spot
  • the conductive substrate is substantially transparent, specifically, the light transmittance is preferably 10% or more, more preferably 50% or more. More preferably, it is 70% or more.
  • the cell is configured such that light is irradiated from the back side of the working electrode (that is, the conductive substrate), and the light transmitted through the working electrode (that is, the conductive substrate and the electron-accepting layer) excites the sensitizing dye. can do.
  • the thickness of the conductive material layer is preferably about 0.02 to: LO / zm.
  • the conductive substrate has a surface resistance of 100 Q Zcm 2 or less, more preferably 40 Q Zcm 2 or less.
  • the lower limit of the surface resistance of the conductive substrate is not particularly limited, but it will usually be about 0.1 l Q Zcm 2 .
  • Examples of a preferable method for forming an electron-accepting layer on a conductive substrate include a method of coating a dispersion or colloidal solution of an electron-accepting material on a conductive support, and a method of conducting a precursor of semiconductor fine particles. Examples thereof include a method of applying a fine particle film by applying it on a porous support and hydrolyzing it with moisture in the air (sol-gel method), a sputtering method, a CVD method, a PVD method, and a vapor deposition method.
  • a method for preparing a dispersion of semiconductor fine particles as an electron-accepting substance includes a method of grinding with a mortar, a method of dispersing while grinding using a mill, or a method of synthesizing semiconductors
  • a method of precipitating as fine particles and using it as it is can be mentioned.
  • the dispersion medium at this time include water or various organic solvents (for example, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, dichloromethane, acetone, acetonitrile, ethyl acetate, and the like).
  • a polymer, a surfactant, an acid, a chelating agent, or the like may be used as a dispersion aid if necessary.
  • Preferable examples of the coating method of the electron-accepting substance dispersion or colloid solution include Roller method, dipping method for the recurrence system, air knife method, blade method for the metering system, etc.
  • the thickness of the electron accepting layer is preferably 0.1 to 200 111, and more preferably 0.1.
  • the coating amount of the semiconductor fine particles per lm2 of the conductive substrate is preferably 0.5 to 400 g, more preferably 5 to LOOg.
  • the electron acceptor comprises an indium-tin composite oxide (ITO) or a metal oxide (FTO) doped with fluorine in tin oxide
  • the thickness of the receiving layer is preferably lnm or more, more preferably ⁇ ! ⁇ 1 ⁇ m.
  • a preferable heat treatment temperature is 40 to 700 ° C, more preferably 100 to 600 ° C.
  • a preferable heat treatment time is about 10 minutes to 10 hours.
  • a high temperature treatment is performed.
  • film formation methods that do not favor the formation of films include methods such as pressing, low-temperature heating, electron beam irradiation, microwave irradiation, electrophoresis, sputtering, CVD, PVD, and vapor deposition. Is mentioned.
  • a probe substance is supported on the surface of the electron accepting layer of the working electrode thus obtained.
  • Loading of the probe substance on the working electrode can be performed according to a known method.
  • a single-stranded nucleic acid when used as a probe substance, An oxidation layer can be formed on the electrode surface, and the nucleic acid probe and the working electrode can be bonded through this oxidation layer.
  • the nucleic acid probe can be immobilized on the working electrode by introducing a functional group at the end of the nucleic acid.
  • the nucleic acid probe into which the functional group has been introduced can be immobilized on the carrier as it is by the immobilization reaction.
  • Introduction of a functional group at the end of a nucleic acid can be performed using an enzymatic reaction or a DNA synthesizer.
  • the enzyme used in the enzymatic reaction include terminal deoxynucleotidyl transferase, poly A polymerase, polynucleotide force innate, DNA polymerase, polynucleotide adenyl transferase, and RNA ligase.
  • functional groups can be introduced by polymerase chain reaction (PCR method), nick translation, or random primer method. The functional group can be introduced at the 3 'end, 5' end or random position, which can be introduced at any part of the nucleic acid.
  • an amine, carboxylic acid, sulfonic acid, thiol, hydroxyl group, phosphoric acid or the like can be suitably used as a functional group for immobilization of the nucleic acid probe to the working electrode.
  • a material that crosslinks between the working electrode and the nucleic acid probe can be used in order to firmly fix the nucleic acid probe to the working electrode.
  • a cross-linking material include silane coupling agents, titanate coupling agents, and conductive polymers such as polythiophene, polyacetylene, polypyrrole, and polyaline.
  • the nucleic acid probe can be immobilized efficiently by a simple operation called physical adsorption.
  • Physical adsorption of the nucleic acid probe to the electrode surface can be performed, for example, as follows.
  • the electrode surface is cleaned with distilled water and alcohol using an ultrasonic cleaner. Thereafter, the electrode is inserted into a buffer containing the nucleic acid probe, and the nucleic acid probe is adsorbed on the surface of the carrier.
  • non-specific adsorption can be suppressed by adding a blocking agent after adsorption of the nucleic acid probe.
  • a blocking agent As a usable blocking agent, a site on the surface of the electron-accepting layer, which is adsorbed by a nucleic acid probe, can be filled, and an electron-accepting substance can Although it is not limited as long as it is a substance that can be adsorbed by chemical adsorption or physical adsorption, it is preferably a substance having a functional group that can be adsorbed via chemical bonds.
  • the blocking agent when titanium oxide is used as the electron-accepting layer, preferred examples of the blocking agent are adsorbable to titanium oxide such as carboxylic acid group, phosphoric acid group, sulfonic acid group, hydroxyl group, amino group, pyridyl group, and amide. And a substance having a functional group.
  • the probe substance is divided and supported on the working electrode for each of the plurality of regions separated from each other, and light irradiation by the light source is performed individually for each region. Is preferred.
  • a plurality of samples can be measured on one working electrode, so that DNA chip integration can be performed.
  • a plurality of regions separated from each other carrying the probe substance on the working electrode are patterned, and each of the regions is scanned with the light irradiated with the light source power. It is preferable that detection or quantification of the test substance is continuously performed for a sample in the region in one operation.
  • a plurality of types of probe substances can be carried on each of the plurality of regions separated from each other on the working electrode.
  • a large number of samples can be simultaneously measured by multiplying the number of regions by the number of types of probe substances in each region.
  • the present invention it is possible to carry a different probe substance in each of a plurality of regions separated from each other on the working electrode. As a result, the number of types of probe substances corresponding to the number of the divided regions can be carried, so that measurement of many types of test substances can be performed simultaneously.
  • This embodiment can be preferably used for multi-item analysis of single nucleotide polymorphism analysis (SNPs), because different analytes can be analyzed for each region.
  • SNPs single nucleotide polymorphism analysis
  • the counter electrode used in the present invention is not particularly limited as long as a current can flow between the counter electrode and the working electrode when it is brought into contact with the electrolyte medium, and insulating support such as glass, plastic, ceramics, etc.
  • a metal or conductive oxide deposited on the body can be used.
  • a metal thin film as a counter electrode is 5 ⁇ m or less, preferably in the range of 3 nm to 3 ⁇ m. It can also be formed by a method such as vapor deposition or sputtering so as to have a film thickness of the enclosure.
  • materials that can be used for the counter electrode include conductive polymers such as platinum, gold, noradium, nickel, carbon, and polythiophene, and conductive ceramics such as oxide, carbide, and nitride. Is platinum or carbon, most preferably platinum. These materials can be formed into a thin film by the same method as the electron-accepting layer.
  • the sample liquid is brought into contact with the working electrode in the presence of the sensitizing dye, and the test substance is directly or indirectly specifically bound to the probe substance. Is fixed to the working electrode.
  • the detection sensitivity of the test substance by the working electrode can be improved by using the buffer solution of the present invention described later as the solvent of the sample solution.
  • hybridization with a single-stranded nucleic acid as a probe substance is performed. Can react. The hybridization reaction is preferred, and the temperature ranges from 37 to 72 ° C, but the optimum temperature varies depending on the base sequence and length of the probe used.
  • a sensitizing dye capable of intercalating with a conjugate of a test substance and a probe substance (for example, a double-stranded nucleic acid after hybridization).
  • the conjugate can be specifically labeled with the sensitizing dye by adding the sensitizing dye to the sample solution.
  • the working electrode in which the test substance is specifically bound directly or indirectly to the probe substance is washed with a washing solution, so that the test without binding to the working electrode is performed. It is preferred to remove the material.
  • the cleaning liquid at this time may further contain a surfactant.
  • a working electrode on which a test substance is fixed together with a sensitizing dye is brought into contact with an electrolyte medium together with a counter electrode, and the sensitizing dye is photoexcited by irradiating the working electrode with light.
  • the counter electrode and the counter electrode due to electron transfer from the photoexcited sensitizing dye to the working electrode.
  • the photocurrent flowing between the poles is detected.
  • the relative positional relationship between the working electrode and the counter electrode is not limited as long as they are not electrically short-circuited with each other and are in contact with the electrolyte medium. You may arrange
  • FIG. 4 and FIG. An example of such a measurement cell is shown in FIG. 4 and FIG.
  • the measurement cell 21 shown in FIGS. 4 and 5 is formed by filling the gap 24 formed between the working electrode 22 and the counter electrode 23 with the electrolytic solution.
  • the working electrode 22 includes a conductive base material 26 and an electron accepting layer 27, and is arranged so that the electron accepting layer 27 side is in contact with the electrolytic solution.
  • a space 24 for accommodating the electrolytic solution is secured by inserting an insulation spacer 25 between the working electrode 22 and the counter electrode 23.
  • the distance between the electrodes is preferably several tens of meters in view of the work accuracy, which is preferably shorter in order to efficiently perform the acid-reduction cycle. Further, if a manufacturing method such as so-called MEMS is used, it is possible to make the distance between electrodes closer.
  • a light source 28 is disposed above the working electrode 22 via a light source cover 29. That is, the cell is irradiated with light from the back side of the working electrode 22 (that is, the conductive substrate), and the light transmitted through the working electrode (that is, the conductive substrate and the electron-accepting layer) excites the sensitizing dye. Is configured. However, it goes without saying that light may be irradiated from the back side of the counter electrode by configuring the counter electrode with a light-transmitting material, or light may be irradiated in parallel to the working electrode and the counter electrode.
  • the light source used in the present invention is not limited as long as it can irradiate light having a wavelength that can photoexcite the labeling dye.
  • Preferred examples include fluorescent lamps, black lights, sterilizing lamps, incandescent lamps, low-pressure mercury lamps, high-pressure mercury lamps, and high-pressure lamps.
  • More preferred examples include fluorescent lamps, incandescent lamps, xenon lamps, halogen lamps, metal halide lamps, LEDs (white, blue, green, red), and sunlight. If necessary, only light in a specific wavelength region may be irradiated using a spectroscope or a bandpass filter. Yes.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view of an example of another measurement cell
  • FIG. 7 is an exploded perspective view of the measurement cell.
  • a counter electrode 23 is provided on the substrate 30, and the substrate 30 has an electrolyte solution or A cleaning liquid supply hole 31 and a discharge hole 32 are formed, and an insulating spacer 25 having a space 24 for accommodating an electrolytic solution is disposed on the counter electrode 23, and a working electrode 22 is disposed on the insulating spacer 25.
  • a plurality of electron-accepting layers 27 are formed on the surface of the working electrode 22 facing the space 24 so as to be separated from each other.
  • a working electrode contact 33 is provided through the substrate 30 so as not to interfere with the counter electrode 23.
  • the contact 33 for the working electrode is taken out by using the probe bonded to the electron accepting layer 27 as an electrical contact.
  • a pressing member 34 is provided on the working electrode 22, and through holes 35 are formed in the pressing member 34 at positions corresponding to the plurality of electron accepting layers 27.
  • the working electrode 22 is irradiated with light from the light source 28 through the through hole 35.
  • An ammeter 36 is connected between the working electrode 22 and the counter electrode 23, and the photocurrent flowing through the system by light irradiation is measured by the ammeter.
  • the wavelength selection means is changed from the light source. It is possible to individually excite a plurality of dyes by irradiating with light of a specific wavelength via.
  • wavelength selection means include a spectroscope, a colored glass filter, an interference filter, a bandpass filter, and the like. It is also possible to use multiple light sources that can irradiate light of different wavelengths depending on the type of sensitizing dye. Examples of preferred light sources in this case include laser light and LEDs that emit light of a specific wavelength. May be used. Further, in order to efficiently irradiate the working electrode with light, light may be guided using quartz, glass, or a liquid light guide.
  • the light emitted from the light source force is essentially free of ultraviolet rays! /, Or the light irradiation from the light source is performed via the means for removing the ultraviolet rays. It is preferable. This effectively suppresses the background current due to photoexcitation of the electron-accepting substance itself, that is, noise, which can be generated when the irradiation light contains ultraviolet light having a wavelength of 400 nm or less, and enables more accurate measurement. .
  • sensitizing dyes Since it can be excited by absorption of visible light, even if ultraviolet rays are removed, it is possible to detect photocurrent with high sensitivity by irradiation with visible light.
  • Preferable examples of means for removing ultraviolet rays include an optical filter and a spectroscope.
  • an optical filter or a spectroscope By using an optical filter or a spectroscope, it is possible to control the wavelength of the irradiation light, and it is possible to excite only the sensitizing dye while preventing photoexcitation of the working electrode itself.
  • preferable optical filters include colored glass filters such as ultraviolet cut filters.
  • An example of a preferable spectroscope is a spectroscope with a built-in diffraction grating in that it allows strict wavelength control.
  • the cutoff wavelength shown in Table 1 is calculated by substituting the known band gap into the following equation for the electron acceptor to be used. It is preferable to remove light having a shorter wavelength. Thus, the generation of knock ground current can be effectively suppressed according to the characteristics of the electron accepting substance.
  • the cutoff wavelength may be set longer than the wavelength shown in Table 1 for completeness.
  • the band gap is the narrowest among the constituent components, and the wavelength is preferably shorter than the cutoff wavelength of the components.
  • the ammeter 36 is connected between the working electrode 22 and the counter electrode 23, and the photocurrent flowing through the system by light irradiation is measured by the ammeter. As a result, the test substance can be detected.
  • the current value at that time reflects the amount of sensitizing dye trapped on the working electrode.
  • the ammeter further comprises means for calculating the concentration of the test substance in the sample solution based on the obtained current amount or electric quantity.
  • the present invention it is possible to measure a process force current value for detecting a photocurrent, and calculate a test substance concentration in the sample solution from the obtained current value or electric quantity.
  • the calculation of the test substance concentration can be performed by comparing the calibration curve of the test substance concentration and the current value or electric quantity prepared in advance with the obtained current value or electric quantity.
  • an accurate current value corresponding to the analyte concentration can be obtained. Suitable.
  • a test substance previously labeled with a sensitizing dye can be used as a competitive substance and can specifically bind to a probe substance that is not labeled with a sensitizing dye.
  • the second test substance can be quantified. It is preferable that the second test substance has a property of easily binding to the probe substance more specifically than the labeled test substance.
  • the test substance and the second test substance are preferably antigens, and the probe substance is preferably an antibody.
  • FIG. 8 shows the process of fixing the test substance and the second test substance to the probe substance in this embodiment.
  • the antigen 41 labeled with the sensitizing dye and the antigen 42 not labeled with the dye compete with each other and specifically bind to the antibody 43. Therefore, as the amount of unlabeled antigen 42 increases, the amount of dye-labeled antigen 43 that specifically binds to the antibody decreases, so that the detected current value decreases as the second analyte concentration increases.
  • a calibration curve can be obtained.
  • FIG. 9 shows the overall structure of the device.
  • the apparatus 50 shown in FIG. 9 includes a flow type measurement cell 51, a light source 52, an electrolyte tank 53, a cleaning liquid tank 54, a supply pump 55, an ammeter 56, and a discharge pump 57.
  • the flow-type measurement cell 51 includes a working electrode 58 that is patterned and a counter electrode 59 that faces the working electrode, and contains an electrolytic solution or a cleaning solution between the working electrode 58 and the counter electrode 59.
  • a flow path that can flow is formed.
  • the electrolyte or cleaning solution supplied into the measurement cell 51 by the supply pump 55 passes through the flow path while contacting the working electrode 58 and the counter electrode 59, and then is discharged by the discharge pump 57. It is configured to be discharged outside. Control of these series of operations and The analysis of the photocurrent value can be performed by a control analysis device (not shown).
  • the working electrode 58 has a plurality of regions separated from each other in which a probe substance is supported on the electron-accepting layer.
  • the working electrode 58 is scanned with light irradiated with a light source force.
  • the sample is configured so that the analyte can be detected or quantified continuously in a single operation. Examples of the working electrode thus patterned are shown in FIGS. 10 (a) to (d) and FIGS. 11 (a) to (c).
  • the working electrode 58 shown in FIGS. 10 (a) and 10 (b) has a plurality of spots 60 carrying the probe substance 58c on the electron accepting layer 58b formed on the entire surface of the conductive substrate 58a. Patterned vertically and horizontally. A lead wire 61 is provided on the conductive base material of the working electrode 58, and the entire working electrode 58 is connected to the ammeter 56 via the lead wire 61. According to this working electrode 58, the light current generated between the counter electrode 59 can be measured for each spot by sequentially irradiating each spot with light. In addition, since the structure of the electrode is relatively simple, it is easy to manufacture the electrode, and there is an advantage that conventional DNA chip manufacturing technology can be used.
  • the electron accepting layer 58b itself is formed in a spot shape as shown in FIG. 10 (c) and the probe material 58c is carried thereon, or as shown in FIG. 10 (d).
  • the conductive base material may be omitted, and the spot-like working electrode 58 may be constituted by only the electron-accepting layer 58b, the probe material 58c may be carried thereon, and the lead wire 61 may be provided on the electron-accepting layer 58b.
  • the latter has the advantage that the manufacturing process can be simplified and the manufacturing cost can be reduced.
  • the light source 52 used for this working electrode it corresponds to the force that is a light source moving vertically and horizontally on the working electrode 58 as shown in FIG. 12, or to each spot of the working electrode 58 as shown in FIG. A plurality of light sources are arranged, and each light source is turned on and off in turn.
  • the working electrode 58 'shown in FIGS. 11 (a) and 11 (b) has an insulating substrate 58d' and a conductive base material 58a, and an electron accepting layer 58b.
  • the probe material 58c ' is supported on the electron-accepting layer 58b'.
  • the conductive material of each spot 60 is individually provided with a lead wire 61, and each spot 60 ′ is connected to the ammeter 56 via the lead wire 61. According to this working electrode 58 ′, the photocurrent generated in each spot can be simultaneously and individually generated by irradiating the entire surface of the working electrode with light simultaneously. Can be measured.
  • the photocurrent at each spot can be measured individually, there is an advantage that the photocurrent generated at other spots is not picked up as noise.
  • the conductive base material is omitted, and the spot-like working electrode 58 ′ is formed only by the electron-accepting layer 58b ′, and the probe material 58c ′ is formed thereon.
  • the manufacturing process can be simplified and the manufacturing cost can be reduced by providing the lead wire 61 ′ on the electron-accepting layer 58 b ′.
  • the light source 52 used for the working electrode 58 ′ corresponds to a force that is a light source that moves vertically and horizontally on the working electrode 58 or each spot of the working electrode 58, as in the case of the working electrode of FIG.
  • a plurality of light sources may be arranged, and each light source may be turned on and off in turn.
  • the sample solution is brought into contact with the working electrode to specifically bind the test substance directly or indirectly to the probe substance, and the sensitizing dye is fixed to the working electrode 58 by this binding.
  • the electron-accepting layer of the working electrode is masked with the spot pattern shown in FIG. 10 to obtain a working electrode 58 in which a plurality of spots 60 carrying the probe substance are patterned in the vertical and horizontal directions.
  • the working electrode 58 thus obtained is attached to the flow type measurement cell 51.
  • the supply pump 55 is operated to feed the electrolytic solution from the electrolytic solution tank 53 into the measuring cell 51.
  • the feeding is stopped.
  • Light is applied to the working electrode 58 from the light source 52, and the photocurrent generated between the working electrode 58 and the counter electrode 59 is measured by an ammeter 56.
  • the photocurrent value it is preferable to adopt a value several tens of seconds after the start of irradiation, at which the photocurrent value becomes stable.
  • the control analysis device not shown
  • the test substance concentration is calculated by comparing the obtained current value with the calibration curve of the test substance concentration and the current value prepared in advance.
  • the supply pump 55 is operated to send the cleaning liquid from the cleaning liquid tank 53 into the measuring cell 51.
  • the electrolyte in the measuring cell 51 is discharged using the discharge pump 57 to measure it. Replace the electrolyte with the electrolyte in the flow path in the cell, and then stop feeding and draining.
  • the next measurement can be performed in the same procedure as described above using the measurement cell 51 cleaned with the cleaning liquid.
  • a plurality of light sources are provided in advance, and the measurement apparatus includes a plurality of fixed light irradiation mechanisms for switching and irradiating the plurality of light sources. preferable.
  • the light source moves in the XY direction with respect to the working electrode in the measurement cell, thereby irradiating an arbitrary region on the working electrode. It is preferable that a light irradiation mechanism of a mold is provided.
  • a light irradiation mechanism of a mold is provided as an apparatus of this aspect.
  • an apparatus in which a light source is attached to an arm movable in the XY directions and a sensor unit as a measurement cell is fixed.
  • An overall perspective view of an example of such a measuring apparatus is shown in FIG. 14 (a), and a top view thereof is shown in FIG. 14 (b).
  • the sensor unit 59 is fixed, and the light source 60 moves to the opening of the sensor unit 59 to irradiate light.
  • a belt drive mechanism that converts the rotation of the motor 61 into a linear motion by the belt 62 is illustrated as the movement mechanism in the XY directions, but other mechanisms, for example, a rack pion mechanism are used as the motor.
  • a mechanism driven by can also be used.
  • the light source may be stopped when the test substance to which the sensitizing dye is bound irradiates the region of the working electrode to which the sensitizing dye is bound via the probe substance during XY movement, or the test substance to which the sensitizing dye is bound.
  • the region of the working electrode to which the substance is fixed via the probe substance may be moved continuously.
  • the light source is fixed, and the measurement cell moves in the XY direction with respect to the fixed light source, whereby any region on the working electrode is obtained.
  • a cell moving type light irradiation mechanism for irradiating light is provided.
  • An example of such an apparatus is an apparatus in which a sensor unit as a measurement cell is attached to a stage movable in the XY directions and a light source is fixed.
  • An overall perspective view of an example of such a measuring apparatus is shown in FIG. 15 (a), and a top view thereof is shown in FIG. 15 (b).
  • the light source 60 is fixed, and the stage 63 on which the sensor unit 59 is mounted moves in the XY direction to irradiate the sensor unit opening.
  • the belt drive mechanism that converts the rotation of the motor 64 into a linear motion by the belt 65 is illustrated as the moving mechanism in the XY direction.
  • Other mechanisms such as a mechanism that drives the rack and pinion mechanism with a motor Can also be used.
  • the sensor unit 59 used at this time only needs to have a structure capable of loading the electrolyte medium of the present invention between the counter electrode and the working electrode.
  • the measurement cell may be stopped when the test substance to which the sensitizing dye is bound irradiates the region of the working electrode fixed via the probe substance during XY movement, or the sensitizing dye
  • the test substance to which is bound may move continuously through the region of the working electrode to which the test substance is immobilized via the probe substance.
  • FIG. 16 shows an apparatus configuration diagram in which the light source 60 is attached to the XY moving mechanism 66 as an example of the light source moving type light irradiation mechanism in the apparatus shown in FIG.
  • FIG. 17 shows an apparatus configuration diagram in which the sensor unit 63 is attached to the XY movement mechanism 66 as an example of the cell movement type light irradiation mechanism in the apparatus shown in FIG.
  • the light source 60 is turned on / off, the XY moving mechanism 66 is controlled, the ammeter 67 is controlled, and the current signal is received by the computer 69 via the interface board 68.
  • the computer 69 may be an externally mounted PC, or an input device 70, a display device 71, and a storage device 72 are also incorporated in the measurement device using a microcomputer incorporated in the device. But you can.
  • the functions of the input device 70, the display device 71, and the storage device can be appropriately assigned to the microcomputer built in the device and the externally mounted PC.
  • An external perspective view of an example of a measuring apparatus equipped with such an irradiation light moving mechanism is shown in FIG.
  • an input device 70 such as keys and buttons for inputting operation conditions, a display device 71 for setting conditions and measurement results, and a storage device can be provided. It is also possible to perform all these functions on an external PC.
  • FIG. 19 A schematic perspective view of an example of a photocurrent detection device using a manufacturing method such as MEMS is shown in FIG. 19, a configuration diagram of this device is shown in FIG. 20, and an exploded perspective view of a detection chip used in this device is shown in FIG. Show.
  • the photocurrent detector 73 is provided with a light source 74, an ammeter 75, a function that can fix the detection chip 76, and a pump 78 that sucks through the suction port 77 of the detection chip 76. Switching between light source 74 (multiple) and working electrode 79 (this example shows an example using the patterning electrode shown in Fig.
  • control of suction pump 77, ammeter 75 and reception of current signal are interface board By computer 81 through 80.
  • the computer 81 uses a microcomputer incorporated in the apparatus, and the input device 82, the display device 83, and the storage device 84 are also incorporated in the measurement device.
  • the input device 81 is provided with keys and buttons for inputting operating conditions and setting conditions, and the display device 82 displays measurement results.
  • the storage device 83 can store the measurement results.
  • the detection chip 76 includes a lower member 85, an electrode substrate 86, a PDMS chip 87, and an upper member 88.
  • the lower member 85 is provided with an opening 89 through which light from the light source 74 passes.
  • the electrode substrate 86 is provided with a working electrode 79, a counter electrode 90, and a terminal 91 for electrical connection with a reading device.
  • the PDMS chip 87 is provided with a liquid flow path 92 and a waste liquid reservoir 93.
  • Solution ports 97 and 98 connected to the electrolyte injection port 94, the cleaning solution injection port 95, and the sample solution injection port 96 of the upper member 88 are provided. 99 are also provided.
  • a buffer solution used in contact with the working electrode a buffer solution containing a buffer containing no carboxyl group, phosphate group and amino group, and a solvent is used. It is preferable to use it.
  • Examples of use in contact with the working electrode include the process of fixing the probe substance to the working electrode, the process of fixing the test substance to the working electrode via the probe substance, and the immobilization of the test substance For example, the working electrode can be cleaned later.
  • the buffer solution containing the said buffering agent the detection sensitivity of the test substance by the photocurrent which does not inhibit the characteristic of a measuring object and a working electrode can be improved dramatically. This tendency is due to the fact that the surface of the working electrode This is particularly noticeable when ronchika is also used.
  • the buffer is not limited as long as it has a chemical structure including a carboxyl group, a phosphate group, and an amino group, and has a buffering action.
  • Rl is an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms which may be substituted with a hydroxyl group
  • X is a sulfonic acid group or a salt thereof
  • A is O or YR2-N (where R2 has the same meaning as R1, and Y is a sulfonic acid group or a salt thereof, or a hydroxyl group)
  • These buffering agents have an advantage of improving measurement accuracy by stably holding a test substance having specific binding properties such as nucleic acid, exogenous endocrine disrupting substance, and antigen.
  • the alkylene group is preferably an ethylene group.
  • buffering agents include 2- [4- (2-hydroxyethyl) 1-piperazyl] ethanesulfonic acid (HEPES), piperazine mono-1,4 bis (2 ethanesulfonic acid) ( PIPES), piperazine 1,4 bis (2 ethanesulfonic acid), sesquisodium salt (PIP ES sesquisodium), and 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) [0104]
  • the alkylene group is preferably a propylene group.
  • Such a buffer include 3- [4- (2-hydroxyethyl) 1-piperazyl] propanesulfonic acid (EPPS), 2-hydroxy-1,3- [4- (2-hydroxyl) 1-piperadyl] propanesulfonic acid (HEPPSO), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), 2-hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPSO), and piperazine-1,4 Bis (2 hydroxyl 3 propane sulfonic acid) (POPSO).
  • EPPS 3- [4- (2-hydroxyethyl) 1-piperazyl] propanesulfonic acid
  • HEPPSO 2-hydroxy-1,3- [4- (2-hydroxyl) 1-piperadyl] propanesulfonic acid
  • MOPS 3-morpholinopropanesulfonic acid
  • MOPSO 2-hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid
  • POPSO piperazine-1,4 Bis (2 hydroxyl 3 propane sulfonic acid
  • the concentration of the buffering agent is preferably 1 to 200 mM, more preferably 1 to 100 mM, and further preferably 10 to 50 mM.
  • the solvent used in the buffer solution is not limited as long as it does not inhibit the properties of the test substance and the working electrode.
  • the pH is preferably set to 5, 0 to 9.0, more preferably 6.0 to 8.0, and even more preferably 6.5 to 7.5.
  • the use of the buffer solution is not limited as long as it is a solution used in contact with the working electrode used in the method of the present invention.
  • the preferred use contains a test substance. Examples include a solvent for a sample solution, a solvent for a probe containing a probe substance that can be specifically or directly bound to a test substance, and a cleaning solution for a measuring cell.
  • This example shows that photoelectric conversion is possible even with a bond via a silane coupling agent.
  • amino groups were introduced on the surface of FTO glass and ITO glass by treating the conductive surface with a silane coupling agent.
  • the dye having the amino group and the active ester group was reacted to fix the dye by a covalent bond. This was irradiated with excitation light and the photocurrent was measured. .
  • the details are as follows.
  • Fluorine-doped tin oxide (F-SnO: FTO) coated glass manufactured by AI Special Glass Co., Ltd., U
  • the solution for coupling treatment was 95% methanol 5% ultrapure water as a solvent, 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) was added to 2 vol%, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. Prepared.
  • the glass was immersed in the solution for coupling treatment and slowly shaken for 15 minutes. Then, the glass was taken out and shaken in methanol about 10 times to remove the excess coupling treatment solution by changing methanol three times. Thereafter, the coupling agent was bonded to the glass by holding at 110 ° C. for 30 minutes. After cooling at room temperature, spacer perforated (5 mm square) tape was applied to the tape, and air remaining on the tape adhesive surface was removed using the tip of a tweezers. Further, a silicon sheet with an opening of 5 mm square was placed on it and brought into close contact therewith.
  • the working electrode thus obtained was incorporated into a flow-type measurement cell (Example 1 of the apparatus).
  • the structure of the cell part is a silicon sheet with a film thickness of 500 m with the aim of creating a space for filling the electrolyte with the working electrode facing the platinum counter electrode, preventing a short circuit due to contact between both electrodes Inserted.
  • the silicon sheet has a hole that is sufficiently larger than 5 mm square, and the electrolyte solution sent here accumulates, and the probe immobilization surface on the working electrode is in contact.
  • the working electrode was connected to a potentiostat (BAS Co., Ltd. ttALS Model 832A) via a spring probe which was in electrical contact, and the platinum electrode was connected via a lead wire connected to the end.
  • a mixed solution was prepared by dissolving 0.01M iodine and 0.1M tetrapropylammodium dye in a mixed solvent of acetonitrile and ethylene carbonate having a volume ratio of 7: 3. This electrolytic solution was filled between the working electrode and the platinum counter electrode incorporated in the flow type measurement cell described above.
  • LED CCS Corporation, Rhodamine, HLV-24GR-NR-3W center wavelength: 530 nm, output: 67 mW, Cy5, HLV-27-NR-R, center wavelength: fixed to a flow-type measurement cell.
  • the surface of the working electrode was irradiated with a light source of 627 nm output (67 mW), and the current flowing between the working electrode and the platinum counter electrode was measured over time. The measurement was performed for 180 seconds. The irradiation of the light source was performed only for 60 seconds after 60 seconds from the start of current measurement. The observed current value was corrected by subtracting the value after 180 seconds from the value after 120 seconds.
  • This example shows the difference in observed current values between complementary and non-complementary DNA.
  • FTO glass was treated with a silane coupling agent to introduce amino groups on the surface.
  • the amino group and the probe DNA were electrostatically bonded, and further irradiated with ultraviolet light to immobilize the probe on the electrode by covalent bond.
  • This and the target DNA labeled with Cy5 were hybridized and irradiated with excitation light, and the photocurrent was measured. The details are as follows.
  • Tin oxide oxide doped with fluorine (F-Sn02: FTO) coated glass manufactured by AI Special Glass Co., Ltd., U membrane, sheet resistance: 15 ⁇ / mouth
  • F-Sn02 fluorine coated glass
  • acetone ultrapure water containing 0.1vol% Tween20
  • Stain and residual organic substances were removed by ultrasonic cleaning for 15 minutes each in ultrapure water.
  • the solution for coupling treatment was 95% methanol, 5% ultrapure water was used as a solvent, 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) was added to 2 vol%, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. Prepared.
  • the glass was immersed in the solution for coupling treatment, and was slowly shaken for 15 minutes. Then, the glass was taken out and shaken in methanol about 10 times to remove the excess coupling treatment solution by changing methanol three times. Thereafter, the coupling agent was bonded to the glass by holding at 110 ° C. for 30 minutes. After cooling at room temperature, spacer perforated (5 mm square) tape was applied to the tape, and air remaining on the tape adhesive surface was removed using the tip of a tweezers. Further, a silicon sheet with an opening of 5 mm square was placed on it and brought into close contact therewith.
  • the probe DNA (5, NH2-ACCTTCATCA AAAACATCATCATCC3 ') prepared in 1 ⁇ dissolved in 2 X SSC was kept at 95 ° C for 5 minutes, then immediately transferred to ice and kept for 10 minutes. It was denatured and filled with 25 IX 1 so as to spread uniformly over the openings on the glass prepared earlier.
  • This working electrode was shaken about 10 times in ultrapure water to remove the SSC components (NaCl and sodium quenate) by changing the ultrapure water twice. Then, it was immersed in boiling water for 2 minutes, removed, and air was blown with force to scatter the remaining water. Subsequently, it was dehydrated by immersion in absolute ethanol at 4 ° C for 1 minute, and the remaining ethanol was scattered by blowing air. Next, a silicon sheet with a 5 mm square opening was placed on the working electrode and brought into close contact therewith.
  • SSC components NaCl and sodium quenate
  • the DNA complementary to the probe (5, GGATGATGATGTTTTTGATGAAGGT-Cy5-3) and the non-complementary DNA (5, T TGAGCAAGTTCAGCCTGGTTAAG) dissolved in 5 X SSC + 0.5% SDS and adjusted to a concentration of ⁇ -Cy5-3 ') is kept at 95 ° C for 5 minutes, then immediately transferred to ice and kept for 10 minutes to denature the DNA so that it spreads evenly over the openings on the working electrode prepared earlier. 1 was filled. Then, cover with a glass slide so that bubbles do not enter the DNA solution, and place it in a plastic container whose vapor pressure is adjusted with wet paper, etc., and incubate overnight at 37 ° C. It was.
  • the prepared glass was removed, and the working electrode was washed with 2 33 + 0.1% SDS heated at 37 for about 2 seconds.
  • the electrode was placed on a glass slide and washed according to the following procedure.
  • the working electrode thus obtained was incorporated into a flow type measurement cell.
  • the cell part is composed of a 500 m thick silicon sheet for the purpose of creating a space for filling the electrolyte with the working electrode facing the platinum counter electrode, preventing a short circuit due to contact between the two electrodes. Inserted.
  • the silicon sheet has a hole that is sufficiently larger than 5 mm square, and the electrolyte sent here accumulates, and the probe fixing surface on the working electrode is in contact. .
  • the working electrode is connected to the potentiostat (BILS Co., Ltd. ALS Model83 2A) via the spring probe that is in electrical contact, and the platinum electrode is connected via the lead wire connected to the end. did.
  • a mixed solution was prepared by dissolving 10 mM iodine and tetrapropylammo-molybdate lOOmM in a mixed solvent of acetonitrile and ethylene carbonate having a volume ratio of 7: 3.
  • This electrolyte was filled between the working electrode and the platinum counter electrode incorporated in the flow type measurement cell described above.
  • an LED CCS Co., Ltd. HLV-27-NR-R center wavelength is 627) is applied to the surface of the working electrode as a light source, and the current flowing between the working electrode and the platinum counter electrode is fixed on the flow type measurement cell.
  • the measurement was performed for 180 seconds.
  • the irradiation of the light source was carried out for 60 seconds only after 60 seconds from the start of current measurement.
  • the observed current value was corrected by subtracting the value after 180 seconds from the value after 120 seconds.
  • This example shows the difference between the current value of the electrolyte containing metal iodine and the current value of the electrolyte! It is better not to contain metal iodine for the detection of single base conversion (SNPs). Shows superiority.
  • FTO glass was treated with a silane coupling agent to introduce amino groups on the surface. This amino group and the probe DNA were electrostatically bonded, and further, ultraviolet light was irradiated to immobilize the probe on the electrode by covalent bonding. This was hybridized with rhodamine-labeled target DNA and irradiated with excitation light, and the photocurrent was measured to detect single base mutations in the target. The details are as follows.
  • Fluorine-doped tin oxide (F-Sn02: FTO) coated glass manufactured by AI Special Glass Co., Ltd., U membrane, sheet resistance: 15 ⁇ / mouth
  • ultrapure water containing 0.1vol% Tween20 and Stain and residual organic substances were removed by ultrasonic cleaning for 15 minutes each in ultrapure water.
  • shaking for 5 minutes in ultrapure water was performed three times with the water changed. Take out the glass and blow it with air to disperse the remaining water and immerse it in force anhydrous methanol to dehydrate it. It was.
  • the solution for coupling treatment was 95% methanol 5% ultrapure water as a solvent, 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) was added to 2 vol%, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. Prepared.
  • the glass was immersed in the solution for coupling treatment and slowly shaken for 15 minutes. Then, the glass was taken out and shaken in methanol about 10 times to remove the excess coupling treatment solution by changing methanol three times. Thereafter, the coupling agent was bonded to the glass by holding at 110 ° C. for 30 minutes. After cooling at room temperature, spacer perforated (5 mm square) tape was applied to the tape, and air remaining on the tape adhesive surface was removed using the tip of a tweezers. Further, a silicon sheet with an opening of 5 mm square was placed on it and brought into close contact therewith.
  • probe DNA prepared by dissolving in 2 X SSC to 1 ⁇ (having a completely complementary base sequence to the target: 5'- NH2- AGGATGGGCCTCAGGTTCATGCCGC-3 'or complementary to the target
  • 5'-NH2-AGGATGGG CCTCGGGTTCATGCCGC-3 ' is kept at 95 ° C for 5 minutes, then immediately transferred to ice and kept for 10 minutes to denature the DNA and prepare in advance 25 1 was filled to evenly spread the openings on the glass.
  • This operation electrode was shaken about 10 times in ultrapure water to remove the SSC components (NaCl and sodium citrate) by changing the ultrapure water twice. Then, it was immersed in boiling water for 2 minutes, removed, and air was blown with force to scatter the remaining water. Subsequently, it was dehydrated by immersion in absolute ethanol at 4 ° C for 1 minute, and the remaining ethanol was scattered by blowing air.
  • SSC components NaCl and sodium citrate
  • the target DNA (Rho-DP53-1: 5 and Rho-GCGGCATGAACCTGAGGCCCATCCT-3), which was dissolved in 5 X SSC + 0.5% SDS and adjusted to a concentration of ⁇ , was held at 95 ° C for 5 minutes. Immediately transferred to ice and held for 10 minutes to denature the DNA, and filled with 101 so as to spread uniformly over the openings on the previously prepared working electrode. And in the DNA solution Covered with a glass slide so that no air bubbles entered, it was placed in a plastic container whose vapor pressure was adjusted with wet paper, etc., and incubated overnight at 37 ° C.
  • the preparation glass was removed, and the working electrode was washed with ultrapure water for about 2 seconds. Next, the electrode was placed on a slide glass cleaning rack and cleaned as follows: o
  • the working electrode thus obtained was incorporated into a flow type measurement cell.
  • the cell part is composed of a 500 m thick silicon sheet for the purpose of creating a space for filling the electrolyte with the working electrode facing the platinum counter electrode, preventing a short circuit due to contact between the two electrodes. Inserted.
  • the silicon sheet has a hole that is sufficiently larger than 5mm square, and the electrolyte sent here accumulates, and the probe fixing surface on the working electrode is in contact.
  • the working electrode is connected to the potentiostat (BILS Co., Ltd. ALS Model83 2A) via the spring probe that is in electrical contact, and the platinum electrode is connected via the lead wire connected to the end. did.
  • the following two types of electrolytes were prepared.
  • Tetrapropylammo-muodoide lOOmM was dissolved using acetonitrile as a solvent.
  • the electrolytic solution was filled between the working electrode and the platinum counter electrode incorporated in the flow type measurement cell described above. Subsequently, the working electrode surface was irradiated with an LED (CCS Co., Ltd. HLV-24GR-NR-3W center wavelength: 530 nm, output: 67 mW) fixed to the flow type measurement cell as a light source, and between the working electrode and the platinum counter electrode Was measured over time. The measurement was performed for 180 seconds, but the light source was irradiated only for 60 seconds after 60 seconds from the start of current measurement. The observed current value was corrected by subtracting the value after 180 seconds from the value after 120 seconds.
  • an LED CCS Co., Ltd. HLV-24GR-NR-3W center wavelength: 530 nm, output: 67 mW
  • single base conversion is detected using a plurality of spots.
  • FTO glass was treated with a silane coupling agent to introduce amino groups on the surface.
  • Probe DNA is carried on a spot formed on the working electrode, and two 5'-end Cy5-labeled target DNAs with different single bases at specific positions are each hybridized to the electrode under specific conditions. Washed with. Pt was formed on the same plane of the working electrode and incorporated into a counter cell, and the working electrode was irradiated with excitation light, the photocurrent was measured, and the photocurrent for each probe DNA was compared. The details are as follows.
  • Fluorine-doped tin oxide (F-Sn02: FTO) coated glass manufactured by AI Special Glass Co., Ltd., U membrane, sheet resistance: 15 ⁇ / mouth
  • acetone ultrapure water containing 0.1vol% Tween20
  • ultrapure water containing 0.1vol% Tween20
  • each of the samples was subjected to ultrasonic cleaning for 15 minutes to remove dirt and residual organic matter. This was shaken in 5M aqueous sodium hydroxide solution for 15 minutes. After that, to remove sodium hydroxide, shaking for 5 minutes in ultrapure water was performed three times with the water changed. The glass was taken out and air was blown to disperse the remaining water, which was then dehydrated by dipping in force anhydrous methanol.
  • the solution for coupling treatment was 95% methanol, 5% ultrapure water was used as a solvent, 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) was added to 2 vol%, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. Prepared.
  • ATMS 3-aminopropyltrimethoxysilane
  • the glass was immersed in the solution for coupling treatment and slowly shaken for 15 minutes. Then, the glass was taken out and shaken in methanol about 10 times to remove the excess coupling treatment solution by changing methanol three times. Thereafter, the coupling agent was bonded to the glass by holding at 110 ° C. for 30 minutes.
  • the probe DNA (Proligo 5-NH2-A GGATGGGCCTCAGGTTCATGCCGC-3 ') prepared in 1 M by dissolving in 2 X SSC was kept at 95 ° C for 5 minutes, then immediately transferred to ice and kept for 10 minutes. Then, the DNA was denatured and 71 1 was filled in each spot opening.
  • UV DNA linker UVP CL-1000 type
  • 120 mJ of ultraviolet light to probe DNA was used as a fixed working electrode.
  • This operation electrode was shaken about 10 times in ultrapure water to remove the SSC components (NaCl and sodium citrate) by changing the ultrapure water twice. Then, it was immersed in boiling water for 2 minutes, removed, and air was blown with force to scatter the remaining water. Subsequently, it was dehydrated by immersion in absolute ethanol at 4 ° C for 1 minute, and the remaining ethanol was scattered by blowing air.
  • SSC components NaCl and sodium citrate
  • target DNA completely complementary to the probe-1) (Proligo 5′-Cy5-GCGGCATGAACCTGAGGCCCA TCCT-3 ′) and its 5 ′ Target DNA-2 with 13th T from the end replaced with G-2) (Proligo 5 and Cy5-GCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCT-3) separately dissolved in 5 X SSC + 0.5% SDS to a concentration of 1 ⁇ each Adjusted. This was kept at 95 ° C for 5 minutes, and then 5 ⁇ 1 was filled into each of three separate spot openings. Then, cover with a glass slide so that air bubbles do not enter the DNA solution, place it in a plastic container whose vapor pressure is adjusted with wet paper, etc., and incubate overnight at 37 ° C. It was.
  • the working electrode thus obtained was incorporated into a flow-type measurement cell (Equipment Example 2), and a light source moving stage (B05-41M manufactured by Suruga Seiki Co., Ltd.) was mounted on the flow-type measurement cell. It was.
  • the structure of the cell part is to arrange the working electrode and platinum counter electrode on the same plane, prevent short-circuiting due to contact between both electrodes, and create a space for filling the electrolyte.
  • a 500 m silicon sheet was inserted. The silicon sheet has a sufficiently large hole for all the spots to enter, and the electrolyte sent here accumulates, and the DNA immobilized on the working electrode comes into contact.
  • Both the working electrode and the counter electrode were in electrical contact with each other, and were connected to a potentiostat (BILS Co., Ltd. ALS Modl832A) via a spring probe.
  • an electrolytic solution a solution in which tetrapropylammodium iodide lOOmM was dissolved in acetonitrile was prepared. This electrolytic solution was filled in the flow type measurement cell described above.
  • the working electrode surface and platinum counter electrode were irradiated by irradiating the working electrode surface with a red LED (CCS Corporation HLV-27-N RR center wavelength is 627) fixed to the light source moving stage.
  • the current flowing during the period was measured over time.
  • the light source moved the ary stage and irradiated each spot with light. Measurement was carried out for 180 seconds for each spot. Irradiation with strong light was performed only for 60 seconds after 60 seconds from the start of current measurement.
  • the observed photocurrent was corrected by subtracting the photocurrent value after 180 seconds from the photocurrent value after 120 seconds.
  • Fluorine-doped tin oxide (F-SnO: FTO) coated glass manufactured by AI Special Glass Co., Ltd., U
  • the solution for the coupling treatment was 95% methanol, 5% ultrapure water was used as a solvent, 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) was added to 2 vol%, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. Prepared.
  • rhodamine-labeled ssDNA (30mer) prepared in 1 ⁇ X by dissolving in 2 X SSC was kept at 95 ° C for 5 minutes, then immediately transferred to ice and kept for 10 minutes to denature the DNA. 2 ⁇ l each was filled into the 49 openings of the PDMS sheet on the glass prepared. Hold this at 75 ° C for 1 hour to evaporate the solvent, peel off the PDMS sheet, and irradiate 120mJ ultraviolet light with UV crosslinker (UVP CL-10000 type) to load rhodamine labeled ssDNA A fixed working electrode and did.
  • UV crosslinker UV crosslinker
  • This working electrode was permeated in 0.2% SDS solution for 15 minutes x 3 times, and then shaken in ultrapure water to remove SSC components (NaCl and sodium citrate). Then, it was immersed in boiling water for 2 minutes, taken out and sprayed with strong air to scatter the remaining water. Subsequently, it was dehydrated by immersion in 4 ° C water-free ethanol for 1 minute, and the remaining ethanol was scattered by blowing air.
  • Figure 25 shows a schematic diagram of the working electrode obtained by immobilizing DNA at the 49 force points thus obtained.
  • photocurrent detection is performed by stopping the light source in each spot area on the working electrode using a mechanism in which the light source moves XY.
  • the apparatus having the light irradiation mechanism shown in Fig. 14 was equipped with the working electrode produced by the method of Example 5, and the photocurrent was measured by stopping the light source in the rhodamine-labeled ssDNA fixation region. At this time, a green laser diode with a beam diameter of lmm, a wavelength of 530 nm, and an output of 50 mW was used as the light source. At the time of light irradiation, 0.1 M tetrapropylammoside dissolved in acetonitrile was filled between the counter electrode and the working electrode.
  • photocurrent detection is performed using a mechanism in which the light source moves in X and Y directions while moving the light source continuously in each spot area on the working electrode.
  • the working electrode produced by the method of Example 5 was attached to the apparatus having the light irradiation mechanism shown in Fig. 14, and the photocurrent measurement was performed while the light source was continuously moved in the rhodamine-labeled ssDNA immobilization region. At this time, a green laser diode with a light beam diameter of 1 mm, a wavelength of 530 nm, and an output of 50 mW was used as the light source. Dissolved in acetonitrile between the counter electrode and working electrode 0.1M Tetrapropylammomouse was charged.
  • This example is an example in which current detection is performed by stopping the light source in each spot area on the working electrode using a mechanism in which the cell stage moves in the X and Y directions.
  • a working electrode produced by the method of Example 5 was attached to the apparatus having the light irradiation mechanism shown in FIG. 15, and the photocurrent was measured by stopping the light source in the rhodamine-labeled ssDNA immobilization region.
  • a green laser diode with a beam diameter of lmm, a wavelength of 530 nm, and an output of 50 mW was used as the light source.
  • 0.1 M tetrapropylammoside dissolved in acetonitrile was filled between the counter electrode and the working electrode.
  • the photocurrent values derived from the immobilized DNA region are detected as separate waveforms.
  • any one point during the light irradiation period can be represented as a representative value, and an average value of any plurality of points can be represented as a representative value.
  • the working electrode produced by the method of Example 5 was attached to the apparatus having the light irradiation mechanism shown in Fig. 15, and the photocurrent was measured while continuously moving the light source to the rhodamine-labeled ssDNA immobilization region.
  • a green laser diode with a light beam diameter of 1 mm, a wavelength of 530 nm, and an output of 50 mW was used as the light source.
  • 0.1 M tetrapropyl ammonium chloride dissolved in acetonitrile was filled between the counter electrode and the working electrode.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • a mixed solution containing either NPr4I (tetrapropylammomoxide), sodium thiosulfate, or sodium sulfite, and acetonitrile is used as the electrolyte. Used as. The concentration of the electrolyte substance was adjusted to 0.2M. On the working electrode side, a perfect match probe, a single nucleotide variant probe, and a perfect mismatch probe were immobilized. Each base sequence is as follows.
  • MM probe 5'-NH2-GCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCT-3
  • the base sequence of the target DNA to be hybridized with these probes is as follows.
  • Target DNA 5 and Rhodamine — GCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCT — 3 '
  • Fluorine-doped tin oxide (F-SnO: FT0) coated glass manufactured by AI Special Glass Co., Ltd., U
  • Membrane sheet resistance: 12 ⁇ / mouth, shape: 50 mm X 26 mm
  • ultrasonic cleaning in acetone and ultrapure water for 15 minutes each to remove dirt and residual organic matter. This was shaken in 5 M aqueous sodium hydroxide solution for 15 minutes. After that, to remove sodium hydroxide, shaking for 5 minutes in ultrapure water was performed three times with the water changed, and the glass was taken out and blown with air to disperse the remaining water.
  • the solution for the coupling treatment was 95% methanol, 5% ultrapure water was used as a solvent, 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) was added to 2 vol%, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. Prepared.
  • ATMS 3-aminopropyltrimethoxysilane
  • the glass was immersed in the solution for coupling treatment, and slowly shaken for 15 minutes. Then, the glass was taken out and shaken in methanol about 10 times to remove the excess coupling treatment solution by changing methanol three times. Thereafter, the coupling agent was bonded to the glass by holding at 110 ° C. for 30 minutes.
  • the seal was peeled off, and the mixture was shaken in a 0.2% SDS solution for 15 minutes x 3 times, and rinsed with 3 changes of ultrapure water. Then, it was immersed in boiling water for 2 minutes, taken out, and air was blown with force to scatter the remaining water. Subsequently, it was dehydrated by immersion in absolute ethanol at 4 ° C for 1 minute, and the remaining ethanol was scattered by blowing air.
  • the working electrode thus obtained was incorporated into a measurement cell, and an XY stage for automatic light source movement was mounted on the measurement cell.
  • the structure of the cell part is a silicon film with a thickness of 500 ⁇ m, with the aim of creating a space for filling the electrolyte with the working electrode and the platinum counter electrode facing each other, preventing short-circuiting between the two electrodes.
  • a sheet was inserted.
  • the silicon sheet has a sufficiently large hole for all the spots to enter, and the electrolyte sent here accumulates, and the DNA immobilized on the working electrode comes into contact.
  • Both the working and counter electrodes were connected to a highly sensitive ammeter via a spring probe that was in electrical contact.
  • the upward force on the back surface of the working electrode was also irradiated with light from a light source fixed on the XY stage for automatic movement, and the current flowing between the working electrode and the platinum counter electrode was measured over time.
  • Working electrode A light-shielding member with the same shape as the spot on the FTO substrate is provided above to prevent light from irradiating adjacent spots, and at the same time, there is no light irradiation spot.
  • the spots were sequentially scanned, and at the same time, the current output at the spots was recorded on the personal computer through a highly sensitive ammeter connected to the personal computer.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • Fluorine-doped tin oxide (F-SnO: FTO) coated glass manufactured by AI Special Glass Co., Ltd., U
  • Membrane sheet resistance: 12 ⁇ / mouth, shape: 50 mm X 26 mm
  • ultrasonic cleaning in acetone and ultrapure water for 15 minutes each to remove dirt and residual organic matter.
  • This was shaken in 5 M aqueous sodium hydroxide solution for 15 minutes.
  • shaking for 5 minutes in ultrapure water was performed three times with the water changed.
  • the glass was taken out and blown with air to disperse the remaining water and immersed in force anhydrous methanol for dehydration.
  • the solution for the coupling treatment was 95% methanol, 5% ultrapure water was used as a solvent, 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) was added to 2 vol%, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. Prepared.
  • Rhodamine-labeled ssDNA 25mer was held at 95 ° C for 10 minutes, then immediately transferred to ice and held for 10 minutes to denature the DNA and prepared in advance Fill the 9 openings of the seal on the glass 5 ⁇ l at a time, evaporate the solvent by holding at 95 ° C for 10 minutes, and then use UV crosslinker (UVP CL-1000 type) for 120mJ UV The labeled ssDNA was immobilized by irradiation with light.
  • the seal was peeled off, and the mixture was shaken 3 times for 15 minutes in 0.2% SDS solution, and rinsed by changing the ultrapure water three times. Then, it was immersed in boiling water for 2 minutes, taken out, and air was blown with force to scatter the remaining water. Subsequently, it was dehydrated by immersion in absolute ethanol at 4 ° C for 1 minute, and the remaining ethanol was scattered by blowing air.
  • dye-labeled single-stranded DNA was detected with an electrolyte using water and each electrolyte substance.
  • rhodamine-labeled ssDNA (30mer) is detected using electrolyte substances Nal, KI, and Cal.
  • a mixed solution containing any one of sodium acid and water was used as an electrolytic solution.
  • the electrolyte concentration is
  • the working electrode produced by the method of Example 12 was attached to the apparatus having the light irradiation mechanism shown in FIG. 2, and the light source was stopped in the rhodamine-labeled ssDNA immobilization region, and the photocurrent was measured. At this time, three concentrations of ssDNA to be immobilized were OnM, 10 nM, and ⁇ .
  • NPr 1 tetrapropylammodium
  • water water
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • a dye-labeled protein is detected by a dye-sensitized biosensor technology.
  • Fluorine-doped tin oxide (F-SnO: FTO) coated glass manufactured by AI Special Glass Co., Ltd., U
  • Membrane, sheet resistance: 15 ⁇ / mouth was used for ultrasonic cleaning for 15 minutes each in ultrapure water containing 0.1 vol% of acetone and Tween 20 in addition to ultra pure water to remove dirt and residual organic matter.
  • the mixture was shaken for 15 minutes in 5M aqueous sodium hydroxide solution, and then shaken for 5 minutes in ultrapure water to remove the sodium hydroxide solution, changing the water three times.
  • the FTO glass was taken out of the ultrapure water and air was blown to disperse the remaining water, which was then immersed in force anhydrous methanol for dehydration. Methanol was also scattered by blowing air to dry the FTO glass.
  • Coupling solution is 95 vol% methanol 5 vol% Ultra pure water mixed solution 3-amino propyltrimethoxysilane (APTMS: AVOCADO) to 2 vol% and stirred for 5 minutes at room temperature And prepared.
  • APITMS 3-amino propyltrimethoxysilane
  • the FTO glass was immersed in this coupling treatment solution and gently shaken for 15 minutes.
  • the FTO glass was taken out and shaken about 10 times in anhydrous methanol to remove the excess coupling solution, and the operation was repeated 3 times with the replacement of anhydrous methanol.
  • the coupling agent was bonded to the glass by holding at 110 ° C. for 30 minutes.
  • oligo DNA labeled with piotin at the end or unlabeled oligo DNA (Proligo: Sequence: 5, -TggCTCCTgACCTggAgTCTTCCAgTgTgA-3,) dissolved in ultrapure water to 1 ⁇ and held at 95 ° C for 5 minutes Then, the DNA was denatured and 7 ⁇ l was dropped on the tape opening (spot electrode). This was held at 95 ° C. for 10 minutes and dried, and then irradiated with 120 mJ of UV light using a UV crosslinker (UVP CL-1000 type) to obtain an oligo DNA-immobilized working electrode.
  • UV crosslinker UV crosslinker
  • the working electrode was washed in a 0.2% SDS aqueous solution for 15 minutes by changing the solution three times. Subsequently, SDS was removed by washing the ultrapure water with shaking about 10 times, changing the ultrapure water three times. After that, it was immersed in boiling water for 2 minutes, taken out and sprayed with strong air to scatter the remaining water. Furthermore, it was dehydrated by immersion in absolute ethanol at 4 ° C for 1 minute, and the remaining ethanol was scattered by blowing air.
  • Streptavidin (labeling ratio: 3.1) labeled with rhodamine using a kit that is commercially available from Molecular Probes Inc. (10 mM HEPES pH7.4 + 150 mM NaCl + 0.05% Tween20) to 10 ug / ml Dilution was performed.
  • the preparation glass was removed, the working electrode was placed on a rack, submerged in a staining vat filled with the above-mentioned buffer solution, and washed by shaking about 10 times, changing the buffer solution three times. The working electrode was immersed in the buffer until just before measurement.
  • the working electrode thus obtained was lightly shaken in ultrapure water immediately before the measurement, and then air was blown to disperse the remaining water and incorporated into a force flow type measurement cell.
  • a working electrode and a gold counter electrode were placed facing each other, and a 500 m thick silicon sheet was inserted between them.
  • the silicon sheet has a sufficiently large hole for all the spot electrodes to enter, and the spot electrode comes into contact with the electrolyte solution by filling this part with the electrolyte solution.
  • the electrolyte was a mixed solution of 1M sodium thiosulfate and 0.1M saline.
  • the working electrode and platinum counter electrode are in electrical contact with each other!
  • dye-labeled single-stranded DNA was detected with an electrolytic solution using water and various electrolyte substances.
  • rhodamine-labeled ssDNA (30mer) was detected by using electrolytes such as hydroquinone, triethananolamine, ferricyanium potassium, NPr 1 (tetrapropylammo-mu-mo
  • a mixed solution containing any one of (Zido) and water was used as an electrolytic solution.
  • the electrolyte concentration is 0.2M.
  • the working electrode produced by the method of Example 12 was attached to the apparatus having the light irradiation mechanism shown in FIG. 14, and the photocurrent was measured by stopping the light source in the rhodamine-labeled ssDNA immobilization region.
  • a liquid mixture containing one of hydroquinone, triethanolamine, NPr I, and water is used as an electrolyte.
  • the photocurrent waveform obtained when used as shown in FIG. Fig. 36 shows the result of data processing of the photocurrent obtained in Fig. 35
  • Fig. 37 shows the photocurrent waveform obtained when a mixed solution containing ferricyanium potassium and water was used as the electrolyte. From the results in Figs. 35 and 36, when hydroquinone and NPr I are used, the photocurrent depends on the amount of ssDNA immobilized.

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Abstract

　特異的結合性を有する被検物質を光電流を用いて高感度で簡便かつ正確に検出および定量することができる方法、電極、測定用セルおよび測定装置が開示される。この方法にあっては、増感色素が結合した被検物質がプローブ物質を介して固定された作用電極を、対電極と共に電解質媒体に接触させ、前記作用電極に光を照射して前記増感色素を光励起させ、光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を検出する。作用電極は、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層を有し、この電子受容層の表面に前記プローブ物質が担持される。電子受容物質は、前記増感色素の最低非占有分子軌道（ＬＵＭＯ）のエネルギー準位よりも低いエネルギー準位を有する酸化物半導体である。電解質媒体は、酸化された状態の増感色素に電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも一種の溶媒とを含んでなる。

Description

明 細 書
光電流を用いた被検物質の特異的検出方法、それに用いられる電極、測 定用セルおよび測定装置
発明の背景
[0001] 発明の分野
本発明は、光電流を用いて、核酸、外因性内分泌攪乱物質、抗原等の特異的結合 性を有する被検物質を特異的に検出する方法、それに用いられる電極、測定用セル 及び測定装置に関する。
背景技術
[0002] 背景 術
生体試料中の DNAを解析する遺伝子診断法が、各種病気の新たな予防および診 断法として、有望視されている。このような DNA解析を簡便かつ正確に行う技術とし て、以下のものが提案されている。
[0003] 被検体 DNAを、これと相補的な塩基配列を有し、かつ蛍光物質を標識された DN Aプローブとハイブリダィズさせ、その際の蛍光シグナルを検出する、 DNAの分析方 法が知られている（例えば、特開平 7— 107999号公報および特開平 11— 315095 号公報参照）。この方法にあっては、ハイブリダィゼーシヨンによる二本鎖 DNAの形 成を色素の蛍光により検出する。
[0004] また、一本鎖に変性された遺伝子サンプルを、これに相補性を有する一本鎖の核 酸プローブとハイブリダィゼーシヨンさせた後、インターカレータ等の二本鎖認識体を 添加して電気化学的に検出する方法が知られている（例えば、特許第 2573443号 公報および表面科学 Vol. 24, No. 11. Pp. 671-676, 2003参照）。
[0005] 一方、近年、ダイォキシンを始めとする外因性内分泌撹乱物質 (環境ホルモン)の 生殖系および神経系等への障害が社会問題化している。現在、外因性内分泌撹乱 毒性の検出は様々な方法によって行われている力 そのような物質はわずか lOppt レベル程度の極めて低い濃度で毒性を示す。このため、そのような低濃度範囲にお ける外因性内分泌撹乱物質の検出方法が望まれている。 [0006] 特に、外因性内分泌撹乱物質は、受容体等のタンパク質を介して標的 DNAに結 合し、それにより当該 DNAの発現等に影響を与え、毒性を生じる。すなわち、外因 性内分泌撹乱物質は、 DNAに直接的に結合するのではなぐ受容体等のタンパク 質を介して間接的 DNAに結合する。そのため、 DNA結合性を用いたプレスタリー- ング等の従来の方法にあっては、その結合の評価は容易ではな 、。
[0007] ところで、増感色素を用いて光力 電気エネルギーを発生させる太陽電池が知られ ている（例えば、特開平 1 220380号公報参照)。この太陽電池は、多結晶の金属 酸化物半導体を有し、かつその表面積に広範囲にわたり増感色素の層が形成され てなるものである。
[0008] そして、このような太陽電池の特性を生物化学的な分析に応用しょうとする試みとし て、色素の光励起により生じる光電流を被検物質 (DNA、蛋白などの生体分子)を 検出に利用する提案がなされている（例えば、中村他「光電変換による新しい DNA 二本鎖検出法」（日本化学会講演予稿集 Vol.81ST N0.2 (2002)第 947頁及び特開 2002— 181777号公報参照）。
発明の概要
[0009] 本発明者らは、今般、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の 特異的検出において、電解質媒体として、酸化された状態の増感色素に電子を供給 しうる塩力 なる電解質と、非プロトン性溶媒およびプロトン性溶媒力 選択される少 なくとも一種の溶媒とを含んでなるものを使用することにより、被検物質を光電流を用 いて高感度で簡便かつ正確に検出および定量することができるとの知見を得た。
[0010] したがって、本発明は、特異的結合性を有する被検物質を光電流を用いて高感度 で簡便かつ正確に検出および定量することができる方法、電極、測定用セル、およ び測定装置の提供をその目的としている。
[0011] すなわち、本発明によれば、増感色素が結合した被検物質がプローブ物質を介し て固定された作用電極を、対電極と共に電解質媒体に接触させ、前記作用電極に 光を照射して前記増感色素を光励起させ、光励起された増感色素から作用電極へ の電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を検出することを含 んでなる被検物質の特異的検出方法であって、 前記作用電極が、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電 子受容物質を含んでなる電子受容層を有し、この電子受容層の表面に前記プロ一 ブ物質が担持され、
前記電子受容物質が、前記増感色素の最低非占有分子軌道 (LUMO)のエネル ギー準位よりも低いエネルギー準位を有する酸ィ匕物半導体であり、
前記電解質媒体が、酸化された状態の増感色素に電子を供給しうる塩からなる電 解質と、非プロトン性溶媒およびプロトン性溶媒力 選択される少なくとも一種の溶媒 とを含んでなる方法が提供される。
[0012] また、本発明によれば、上記方法において作用電極として用いられる電極であって 導電性基材と、
該導電性基材上に形成される、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を 受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層と
を備えたものが提供される。
[0013] さらに、本発明によれば、上記方法に用いられる測定用セルであって、
上記作用電極と、
対電極と、
を備えたものが提供される。
[0014] また、本発明によれば、上記方法に用いられる測定装置であって、
上記測定用セルと、
前記作用電極の表面に光を照射する光源と、
前記作用電極と前記対電極との間を流れる電流を測定する電流計と
を備えたものが提供される。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]色素増感型太陽電池の原理を説明する図である。
[図 2]被検物質が一本鎖の核酸であり、プローブ物質が前記核酸に対して相補性を 有する一本鎖の核酸である場合における、被検物質のプローブ物質への固定ィ匕ェ 程を示す図であり、（a)は被検物質が予め増感色素で標識されてなる場合を、（b)は 二本鎖の核酸にインターカレーシヨン可能な増感色素を添加した場合をそれぞれ示 す。
[図 3]被検物質がリガンドであり、媒介物質が受容体蛋白質分子であり、プローブ物 質が二本鎖の核酸である場合における、被検物質のプローブ物質への固定ィ匕工程 を示す図である。
[図 4]光源が配置された測定用セルを示す図であり、図中の点線で囲まれる部分 21 が測定用セルである。
[図 5]図 4に示される測定用セルの平面図である。
[図 6]他の測定用セルの一例の断面図である。
[図 7]図 6に示した同測定用セルの分解斜視図である。
[図 8]互いに競合する特異的結合性を有する被検物質および第二の被検物質が抗 原であり、プローブ物質が抗体である場合の、被検物質のプローブ物質への固定ィ匕 工程を示す図である。
[図 9]フロー型測定用セルおよびパターユングされた作用電極を用いた装置の一例 を示す図である。
[図 10]パターニングされた作用電極の一例を示す図であり、 (a)は作用電極の平面 図を、（b)は作用電極の断面図を、（c)は別の態様の作用電極の断面図を、（d)はさ らに別の態様の作用電極の断面図をそれぞれ示す。
[図 11]パターニングされた作用電極の他の一例を示す図であり、 (a)は作用電極の 平面図を、（b)は作用電極の断面図を、（c)は別の態様の作用電極の断面図をそれ ぞれ示す。
[図 12]パターユングされた作用電極に用いられる光源の一例を示す図である。
[図 13]パターユングされた作用電極に用いられる光源の他の一例を示す図である。 圆 14]光源移動型の光照射機構を備えた測定装置の一例を示す図であり、 (a)は全 体斜視図を、（b)はその上面図をそれぞれ示す。
圆 15]セル移動型の光照射機構を備えた測定装置の一例を示す図であり、 (a)は全 体斜視図を、（b)はその上面図をそれぞれ示す。
圆 16]図 14に示される装置における光源移動型光照射機構の一例を示す図である 圆 17]図 15に示される装置におけるセル移動型光照射機構の一例を示す図である 圆 18]光照射機構を備えた測定装置の例を示す図であり、 (a)は図 14および 16に 示される光源移動型の機構を備えた装置例を、 (b)は図 15および 17に示されるセル 移動機能型の機構を備えた装置例をそれぞれ示す。
[図 19]MEMSのような製造方法を利用した光電流検出装置の一例の概略斜視図で ある。
[図 20]図 19に示される光電流検出装置の構成図である。
[図 21]図 19に示される検出チップの分解斜視図である。
[図 22]例 1において測定された検出電流値を示すグラフであり、（a)は FTO電極を、 ( b)は ITO電極を用いた場合をそれぞれ示す。
[図 23]例 2にお 、て測定された、相補的 DNAと非相補的 DNAの検出電流値に対す る差を示したグラフである。図中、 PMはプローブと相補的な DNAを、 MMはプロ一 プと非相補的な DNAをそれぞれ使用した場合に対応して!/、る。
圆 24]例 3において測定された検出電流値を示す図であり、 (a)はヨウ素を含む電解 液を、 (b)はヨウ素を含まない電解液を用いた場合をそれぞれ示す。
[図 25]例 5において作製された、 49力所に DNAを固定ィ匕した作用電極の概略図を 示す図である。
[図 26]例 6において測定された光電流の経時変化を示す図である。
[図 27]例 7において測定された光電流の経時変化を示す図である。
[図 28]例 8において測定された光電流の経時変化を示す図である。
[図 29]例 9において測定された光電流の経時変化を示す図である。
[図 30]例 10において各種電解質を用いて測定された光電流値を示す図である。図 中、 PMは完全一致プローブを、 SNPは一塩基変異鎖プローブを、 MMは完全不一 致プローブをそれぞれ使用した場合に対応して 、る。
[図 31]例 11にお 、て、各種濃度のァセトニトリルを用いて測定された光電流値を示 す図である。図中、 PMは完全一致プローブを、 SNPは一塩基変異鎖プローブを、 MMは完全不一致プローブをそれぞれ使用した場合に対応している。
[図 32]例 13にお 、て、各種電解質を用 、て測定された光電流値を示す図である。
[図 33]例 14において、水溶液系の電解液を用いて測定された、一塩基多型（SNPs )の光電流値を示す図である。
[図 34]例 16において、ローダミン標識蛋白質および非標識の蛋白質についてそれぞ れ測定された光電流値を示す図である。
[図 35]例 17において、ヒドロキノン、トリエタノールァミン、および NPr Iのいずれかと
4
水との混合液について測定された光電流値の経時変化を示す図である。
[図 36]図 35で得られた光電流をデータ処理した結果を示す図である。
[図 37]例 17において、フェリシアンィ匕カリウムと水との混合液を電解液として測定され た光電流波形を示す図である。
発明の具体的説明
[0016] 光 流を用いた被檢物皙の特異的枪出
本発明の方法にあっては、増感色素が結合した被検物質がプローブ物質を介して 固定された作用電極を、対電極と共に電解質媒体に接触させ、前記作用電極に光 を照射して前記増感色素を光励起させ、光励起された増感色素から作用電極への 電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を検出する。作用電 極は、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を 含んでなる電子受容層を有し、この電子受容層の表面に前記プローブ物質が担持さ れる。電子受容物質は、前記増感色素の最低非占有分子軌道 (LUMO)のエネル ギー準位よりも低いエネルギー準位を有する酸ィ匕物半導体である。
[0017] このとき、電解質媒体として、酸化された状態の増感色素に電子を供給しうる塩から なる電解質と、非プロトン性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも一種 の溶媒とを含んでなるものを用いる。このような電解質媒体を用いると、太陽電池に おいて一般的に使用されている電解質を初めとする従来の電解質と比べて、被検物 質を光電流による検出感度および精度が飛躍的に向上する。その理由は定かでは ないが、以下のようなものではないかと考えられる。なお、以下の説明はあくまで仮説 であって、本発明を何ら限定するものではない。まず、図 1に、色素増感型太陽電池 の原理を説明する図を示す。太陽電池に用いる電解質媒体の一般的な組成は、 I
2
/N (C H ) IZァセトニトリルである。図 1に示されるように、 N (C H ) Iは、ァセトニ
3 7 4 3 7 4
トリル (CH CN)中で、 N (C H ) +と Γに分離し、また金属 Iは前記厂と結合して I―
3 3 7 4 2 3 の形で溶解する。このとき、生成される I
3—は太陽電池にあってはヨウ素のレドックスサ イタルを回して発電を継続するために必要な物質であるが、上記機構を生物化学的 な分析にぉ 、ては被検物質の検出精度を低下させるものと考えられる。その結果、 太陽電池において一般的に使用されている電解質を使用すると、特に検出の対象 力 NPsの場合、電流値の微弱な差を検出しなければならず、精度の低下が著しく なるのではないかと考えられる。これに対し、本発明に用いる電解質媒体にあっては 、酸化された状態の増感色素に電子を供給しうる塩力もなる電解質を用いるため、 I
2 のような対電極から電子を受容する酸化剤を含まない。従って、 I—のよう
3 な測定精度 を劣化させる成分を生成しないため、検出感度および精度が飛躍的に向上するので はないかと考えられる。
本発明において用いる電解質媒体は、酸化された状態の増感色素に電子を供給 しうる塩力 なる電解質と、非プロトン性溶媒およびプロトン性溶媒力 選択される少 なくとも一種の溶媒と、所望により添加物とを含んでなる。すなわち、本発明に用いる 電解質は、酸化された状態の増感色素に電子を供給する還元剤からなり、対電極か ら電子を受容する酸化剤を含有しない。電解質の好ましい例としては、 I
2や Br
2を含 まないヨウ化物及び Zまたは臭化物、具体的には、 Lil、 Nal、 KI、 Csl、 Cal
2などの 金属ヨウ化物；テトラアルキルアンモニゥムョーダイド、ピリジニゥムョーダイド、イミダゾ リウムョーダイドなど 4級アンモ-ゥム化合物のヨウ素塩； LiBr、 NaBr、 KBr、 CsBr、 CaBrなどの金属臭化物；テトラアルキルアンモ-ゥムブロマイド、ピリジ-ゥムブロマ
2
イドなど 4級アンモ-ゥム化合物の臭素塩；フエロシアン酸塩、フエリシ-ゥムイオンな どの金属錯体;チォ硫酸ナトリウム、チォ硫酸アンモ-ゥム、チォ硫酸カリウム、チォ 硫酸カルシウムなどのチォ硫酸塩；亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモ ユウム、亜硫酸鉄、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カルシウムなどの亜硫酸塩等；およ びそれらの混合物が挙げられる。電解質のより好ましい例としては、 Lilゃテトラアル キルアンモニゥムョーダイド、ピリジニゥムョーダイド、イミダゾリゥムョーダイドなど 4級 アンモ-ゥム化合物のヨウ素塩、およびそれらの混合物が挙げられ、特に好ましくは Lilまたはテトラアルキルアンモ-ゥムョーダイドである。
[0019] 本発明の好ましい態様によれば、電解質媒体の電解質濃度は 0. 001〜15Mであ るのが好ましぐより好ましくは 0. 01〜： LOMである。
[0020] 本発明に用いる溶媒は、非プロトン性溶媒、プロトン性溶媒、またはそれらの混合 物である。すなわち、水を主体に緩衝液成分を混合した極性溶媒系のものや、非プ 口トン性の極性溶媒を用いることができる。非プロトン性の極性溶媒としては、ァセトニ トリルなどの-トリル類、炭酸プロピレンや炭酸エチレンなどのカーボネート類、 1, 3 ジメチルイミダゾリノンや 3—メチルォキサゾリノン、ジアルキルイミダゾリゥム塩など の複素環化合物ゃジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホランなどを用 いることができる。電解質媒体に含まれる溶媒は、複数の種類を混合して用いること ができ、実使用上、検出対象に応じて溶媒組成を適宜変更可能である。例えば、特 に、電解質を、酸化された状態の増感色素に電子を供給しうる塩からなるもの、具体 的には I
2を含まないヨウ化化合物からなるものとし、上記の非プロトン性極性溶媒を使 うことで、微弱な電流値の差を精度よく検出することができ、 SNPの判定に有効であ る。また、タンパク質の測定には、緩衝液を主体とし、ァセトニトリルを含むことで、タン ノ ク質間の結合の保持と、陰イオンの還元能力の低下を抑制することで、精度よぃ検 出が可能となる。
[0021] 本発明の好ましい態様によれば、電解質媒体はゲル化（固体化)させて使用するこ ともできる。ゲルイ匕の方法の例としては、ポリマー添加、オイルゲル化剤添加、多官能 モノマー類を含む重合、ポリマーの架橋反応等の手法により行うことができる。ゲル電 解質のマトリクスに使用されるポリマーの例としては、ポリアクリロニトリル、ポリビ-リデ ンフルオリド等が挙げられる。
[0022] ところで、本発明の方法にあっては、まず、被検物質を含む試料液と、作用電極と、 対電極とを用意する。本発明に用いる作用電極は、被検物質と直接または間接的に 特異的に結合可能なプローブ物質を表面に備えた電極である。すなわち、プローブ 物質は、被検物質と直接、特異的に結合する物質のみならず、被検物質を受容体蛋 白質分子等の媒介物質に特異的に結合させて得られる結合体と特異的に結合可能 な物質であってよい。次いで、増感色素の共存下、試料液を作用電極に接触させて 、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させ、この結合によ り増感色素を作用電極に固定させる。増感色素は、光励起に応じて作用電極に電子 を放出可能な物質であり、被検物質あるいは媒介物質に予め標識させておくか、あ るいは被検物質およびプローブ物質の結合体にインターカレーシヨン可能な増感色 素を用いる場合には試料液に単に添加すればょ ヽ。
[0023] そして、作用電極と対電極とを電解質媒体に接触させた後、作用電極に光を照射 して増感色素を光励起させると、光励起された増感色素から電子受容物質へ電子移 動が起こる。この電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を検 出することにより、被検物質を高い感度で検出することができる。また、この検出電流 は試料液中の被検試料濃度との高 、相関関係を有して 、るので、測定された電流 量または電気量に基づき被検試料の定量測定を行うことができる。
[0024] 被枪物皙およびプローブ物皙
本発明の方法における被検物質としては、特異的な結合性を有する物質であれば 限定されず、種々の物質であってよい。このような被検物質であれば、被検物質と直 接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を作用電極表面に担持させて おくことにより、被検物質をプローブ物質に直接または間接的に特異的に結合させて 検出することが可能となる。
[0025] すなわち、本発明の方法にあっては、被検物質およびプローブ物質として互いに 特異的に結合可能なものを選択することができる。すなわち、本発明の好ましい態様 によれば、特異的な結合性を有する物質を被検物質とし、被検物質と特異的に結合 する物質をプローブ物質として作用電極に担持させるのが好ましい。これにより、作 用電極上に被検物質を直接、特異的に結合させて検出することができる。この態様 における、被検物質およびプローブ物質の組合せの好ましい例としては、一本鎖の 核酸および核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸の組合せ、ならびに抗原お よび抗体の組合せが挙げられる。
[0026] 本発明のより好ましい態様によれば、被検物質を一本鎖の核酸とし、プローブ物質 を核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸とするのが好まし 、。この態様におけ る被検物質の作用電極への特異的結合の工程を図 2 (a)および (b)に示す。これら の図に示されるように、被検物質としての一本鎖の核酸 1は、作用電極 3上に担持さ れたプローブ物質としての相補性を有する一本鎖の核酸 4とハイブリダィズされて、 二本鎖の核酸 7を形成する。
[0027] 一本鎖の核酸を被検物質とする場合、プローブ物質である核酸と相補性部分を有 していればよぐ被検物質を構成する塩基対の長さは限定されないが、プローブ物質 が核酸に対して 15bp以上の相補性部分を有するのが好ましい。本発明の方法によ れば、 200bp、 500bp、 lOOObpの塩基対を有する比較的鎖長の長い核酸であって も、高感度にプローブ物質と被検物質の核酸同士の特異的結合形成を光電流として 検出することができる。
[0028] 被検物質としての一本鎖の核酸を含む試料液は、末梢静脈血のような血液、白血 球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞等の、 核酸を含有する各種検体試料から、公知の方法により核酸を抽出して作製すること ができる。このとき、検体試料中の細胞の破壊は、例えば、振とう、超音波等の物理 的作用を外部力 加えて担体を振動させることにより行なうことができる。また、核酸 抽出溶液を用いて、細胞力も核酸を遊離させることもできる。核酸溶出溶液の例とし ては、 SDS、 Triton-X、 Tween-20のような界面活性剤、サポニン、 EDTA、プロテア —ゼ等を含む溶液が挙げられる。これらの溶液を用いて核酸を溶出する場合、 37°C 以上の温度でインキュベートすることにより反応を促進することができる。
[0029] 本発明のより好ましい態様によれば、被検物質とする遺伝子の含有量が微量であ る場合には、公知の方法により遺伝子を増幅した後検出を行なうのが好ましい。遺伝 子を増幅する方法としては、ポリメラーゼチェインリアクション (PCR)等の酵素を用い る方法が代表的であろう。ここで、遺伝子増幅法に用いられる酵素の例としては、 DN Aポリメラ一ゼ、 Taqポリメラ一ゼのような DNA依存型 DNAポリメラ一ゼ、 RNAポリメ ラーゼ Iのような DNA依存型 RNAポリメラーゼ、 Q βレプリカーゼのような RNA依存 型 RNAポリメラ ゼが挙げられ、好ましくは温度を調節するだけで連続して増幅を繰 り返すことができる点で、 Taqポリメラーゼを用いる PCR法である。
[0030] 本発明の好ましい態様によれば、上記増幅時に特異的に核酸を増感色素で標識 することが出来る。一般的には、 DNAにアミノアリル修飾 dUTPを取り込ませることに より行うことができる。この分子は未修飾の dUTPと同じ効率で取り込まれる。次の力 ップリング段階において、 N—ヒドロキシサクシンイミド（N- hydroxysuccinimide)により 活性化された蛍光色素が修飾 dUTPと特異的に反応し、均一に増感色素で標識さ れた被検物質が得られる。
[0031] 本発明の好ましい態様によれば、上記のようにして得られた核酸の粗抽出液あるい は精製した核酸溶液をまず 90〜98°C、好ましくは 95°C以上の温度で熱変性を施し 、一本鎖核酸を調製することができる。
[0032] 本発明の方法にあっては、被検物質とプローブ物質が間接的に特異的に結合する ものであってもよい。すなわち、本発明の別の好ましい態様によれば、特異的な結合 性を有する物質を被検物質とし、この被検物質と特異的に結合する物質を媒介物質 として共存させ、この媒介物質と特異的に結合可能な物質をプローブ物質として作 用電極に担持させるのが好ましい。これにより、プローブ物質に特異的に結合できな い物質であっても、媒介物質を介して作用電極上に間接的に特異的に結合させて 検出することができる。この態様における、被検物質、媒介物質、およびプローブ物 質の組合せの好ましい例としては、リガンド、このリガンドを受容可能な受容体蛋白質 分子、およびこの受容体蛋白質分子と特異的に結合可能な二本鎖の核酸の組合せ が挙げられる。リガンドの好ましい例としては、外因性内分泌攪乱物質 (環境ホルモン )が挙げられる。外因性内分泌撹乱物質とは、受容体蛋白質分子を介して DNAに結 合し、その遺伝子発現に影響して毒性を生じる物質であるが、本発明の方法によれ ば、被検物質によりもたらされる受容体等のタンパク質の DNAに対する結合性を簡 便にモニタリングすることができる。この態様における被検物質の作用電極への特異 的結合の工程を図 3に示す。図 3に示されるように、被検物質としてのリガンド 10は、 まず、媒介物質である受容体蛋白質分子 11に特異的に結合する。そして、リガンド が結合された受容体蛋白質分子 13が、プローブ物質としての二本鎖の核酸 14に特 異的に結合する。
[0033] 本発明の方法によれば、 1つのプローブ物質に対し、異なる入手経路に由来する 複数の同一被検物質を同時に反応させ、サンプルの由来による被検物質量の差異 を判断することにより、目的とする入手経路に由来する被検物質を定量することも可 能である。具体的な適用例としては、マイクロアレイ上での競合的ハイブリダィゼーシ ヨンによる発現プロフィール解析が挙げられる。これは、細胞間での特定遺伝子の発 現パターンの差異を解析するため、別々の蛍光色素で標識された被検物質を、同一 プローブ物質に対して競合的にハイブリダィゼーシヨンを行わせるものである。本発 明においては、このような手法を用いることにより、細胞間での発現差異解析が電気 化学的に行えるという、従来に無い利点が得られる。
[0034] 增感色素
本発明の方法にあっては、被検物質の存在を光電流で検出するために、増感色素 の共存下、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させて、 該結合により増感色素を作用電極に固定させる。そのために、本発明の方法にあつ ては、図 2 (a)および図 3に示されるように被検物質 1ある!/、は媒介物質 11に予め増 感色素 2, 12で標識しておくことができる。また、図 2 (b)に示されるように被検物質お よびプローブ物質の結合体 7 (例えばノ、イブリダィゼーシヨン後の二本鎖核酸）〖こイン ターカレーシヨン可能な増感色素 8を用いる場合には、試料液に増感色素を添加す ることにより、プローブ物質に増感色素を固定させることができる。
[0035] 本発明の好ましい態様によれば、被検物質が一本鎖の核酸の場合、被検物質 1分 子につき増感色素を一つ標識するのが好ましい。一本鎖の核酸における標識位置 は、容易に被検物質とプローブ物質の特異的な結合を形成させる観点から、一本鎖 の核酸の 5' '末端または 3'末端のいずれかの位置とするのが好ましぐ標識工程を さらに簡便にする観点力 被検物質の 5'末端とするのがさらに好ましい。
[0036] また、本発明の別の好ましい態様によれば、被検物質 1分子あたりの増感色素担持 量を高める為、被検物質 1分子につき増感色素を 2つ以上標識するのが好ましい。こ れにより、電子受容物質の形成された作用電極における単位比表面積あたりの色素 担持量をより多くすることができ、より高感度に光電流応答を観測することができる。
[0037] 本発明に用いる増感色素は、光励起に応じて作用電極に電子を放出可能な物質 であり、光源の照射による光励起状態への遷移が可能であり、かつ励起状態から作 用電極に電子注入できる電子状態を採りうるものであればよい。したがって、用いる 増感色素は、作用電極、特に電子受容層との間において上記電子状態をとることが できるものであればよいことから、多種の増感色素が使用可能であり、高価な色素を 使用する必要がない。
[0038] 複数の被検物質の個別検出を行う態様にあっては、各々の被検物質に標識する増 感色素は、それぞれ異なる波長の光で励起できるものであればよぐ例えば、照射光 の波長を選択することにより各被検物質を個別に励起できればよい。例えば、複数の 被検物質に対応する複数の増感色素を用い、各増感色素毎に異なる励起波長の光 を照射すると、複数のプローブが同一スポット上であっても個別に信号を検出するこ とが可能となる。本発明の方法において、被検物質の数は限定されないが、光源か ら照射される光の波長と増感色素の吸収特性を考慮すると、 1〜5種類が適当であろ う。この態様において使用可能な増感色素は、照射光の波長領域内において光励 起しさえすればよぐ必ずしもその吸収極大が該波長領域にある必要はない。なお、 特定波長における増感色素の光吸収反応の有無は、紫外可視スぺクトロフォトメータ 一 (例えば、島津製作所社製、 UV— 3150)を用いて測定することができる。
[0039] 増感色素の具体例としては、金属錯体ゃ有機色素が挙げられる。金属錯体の好ま しい例としては、銅フタロシアニン、チタ-ルフタロシアニン等の金属フタロシアニン； クロロフィルまたはその誘導体;へミン、特開平 1 220380号公報や特表平 5— 50 4023号公報に記載のルテニウム、オスミウム、鉄及び亜鉛の錯体 (例えばシスージ シァネート ビス（2、 2，一ビビリジルー 4、 4，ージカルボキシレート）ルテニウム（II) ) があげられる。有機色素の好ましい例としては、メタルフリーフタロシアニン、 9—フエ -ルキサンテン系色素、シァニン系色素、メタロシアニン系色素、キサンテン系色素、 トリフエ二ノレメタン系色素、アタリジン系色素、ォキサジン系色素、クマリン系色素、メロ シァニン系色素、口ダシァニン系色素、ポリメチン系色素、インジゴ系色素等が挙げら れる。また、増感色素の別の好ましい例としては、アマシャムバイオサイエンス社製の Cy3、 Cy3. 5、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7、 Cy7. 5、 Cy9 ;モルキュラープローブ社製の A lexaFluor355、 AlexaFluor405、 AlexaFluor430、 AlexaFluor488、 AlexaFlu or532、 AlexaFluor546、 AlexaFluor555、 AlexaFluor568、 AlexaFluor594、 AlexaFluor633、 AlexaFluor647、 AlexaFluor660、 AlexaFluor680、 AlexaF luor700、 AlexaFluor750 ;Dyomics社製の DY— 610、 DY— 615、 DY— 630、 DY— 631、 DY— 633、 DY— 635、 DY— 636、 EVObluelO、 EVOblue30、 DY — 647、 DY— 650、 DY— 651、 DYQ— 660、 DYQ— 661力挙げられる。
[0040] 二本鎖核酸にインターカレーシヨン可能な増感色素の好ましい例としては、アタリジ ンオレンジ、ェチジゥムブロマイドが挙げられる。このような増感色素を用いる場合、 核酸のハイブリダィゼーシヨン後に試料液に添加するだけで増感色素で標識された 二本鎖核酸が形成されるので、予め一本鎖の核酸を標識する必要が無い。
[0041] 作用電極およびその製造
本発明に用いる作用電極は、上記プローブ物質を表面に備えた電極であり、プロ ーブ物質を介して固定された増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能 な電極である。したがって、作用電極の構成および材料は、使用される増感色素との 間で上記電子移動が生じるものであれば限定されず、種々の構成および材料であつ てよい。
[0042] 本発明の好ましい態様によれば、作用電極が増感色素が光励起に応じて放出する 電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層を有し、この電子受容層 の表面にプローブ物質が備えられてなるのが好ましい。また、本発明のより好ましい 態様によれば、作用電極が導電性基材をさらに含んでなり、この導電性基材上に電 子受容層が形成されてなるのが好ましい。この態様の電極は図 2および図 3に示され る。図 2および図 3に示される作用電極 3は、導電性基材 5と、この導電性基材 5上に 形成され、電子受容物質を含んで成る電子受容層 6とを備えてなる。そして、電子受 容層 6の表面にプローブ物質 4が担持される。
[0043] 本発明における電子受容層 6は、プローブ物質 4を介して固定された増感色素が 光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる。すなわち、 電子受容物質は、光励起された標識色素からの電子注入が可能なエネルギー準位 を取り得る物質であることができる。ここで、光励起された標識色素からの電子注入が 可能なエネルギー準位 (A)とは、例えば、電子受容性材料として半導体を用いる場 合には、伝導帯 (コンダクシヨンバンド: CB)を意味する。すなわち、本発明に用いる 電子受容物質は、この Aの準位力 増感色素の LUMOのエネルギー準位よりも卑な 準位、換言すれば、増感色素の LUMOのエネルギー準位よりも低いエネルギー準 位を有するものであればょ 、。
[0044] 電子受容物質としては、シリコン、ゲルマニウムなどの単体半導体；チタン、スズ、亜 鉛、鉄、タングステン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、インジウム、セリウム 、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、タンタル等の酸ィ匕物半導体;チタン酸ス トロンチウム、チタン酸カルシウム、チタン酸ナトリウム、チタン酸バリウム、ニオブ酸力 リウム等のベロブスカイト型半導体;カドミウム、亜鈴、鉛、銀、アンチモン、ビスマスの 硫ィ匕物半導体;カドミウム、鉛のセレンィ匕物半導体;カドミウムのテルルイ匕物半導体； 亜鉛、ガリウム、インジウム、カドミウム等のリンィ匕物半導体;ガリウムヒ素、銅一インジ ゥムーセレンィ匕物、銅 インジウム 硫ィ匕物の化合物半導体が挙げられる。なお、上 記の列挙した半導体は、真性半導体および不純物半導体の!/、ずれであってもよ!/、。
[0045] 一方、本発明の好ましい態様によれば、電子受容物質は酸化物半導体を用いる。
より好ましくは、 TiO、 ZnO、 SnO、 Fe O、 WO、 Nb O、 Ta O、 In O、チタン酸スト口
2 2 2 3 3 2 5 2 3 2 3
ンチウムであり、最も好ましくは TiO、インジウム一スズ複合酸ィ匕物（ITO)またはフッ
2
素がドープされた酸化スズ (FTO)をもちいることができる。 ITOおよび FTOは電子受 容層のみならず導電性基材としても機能する性質を有するため、これらの材料を使 用することにより導電性基材を用いることなく電子受容層のみで作用電極として機能 させることがでさる。
[0046] 電子受容物質として半導体を用いる場合、その半導体は単結晶および多結晶のい ずれであってもよいが、多結晶体が好ましぐさらに緻密なものよりも多孔性を有する ものが好ましい。これにより、比表面積が大きくなり、被検物質および増感色素を多く 吸着させて、より高い感度で被検物質を検出することができる。したがって、本発明の 好ましい態様によれば、電子受容層が多孔性を有しており、各孔の径が 3〜： LOOOn mであるのが好ましぐより好ましくは、 10〜： LOOnmである。
[0047] 本発明の好ま 、態様によれば、電子受容層を導電性基材上に形成した状態での 表面積は、投影面積に対して 10倍以上であることが好ましぐさらに 100倍以上であ ることが好ましい。この表面積の上限には特に限定されないが、通常 1000倍程度で あろう。電子受容層を構成する電子受容物質の微粒子の粒径は、投影面積を円に 換算したときの直径を用いた平均粒径で一次粒子として 5〜200nmであることが好 ましぐより好ましくは 8〜100nmであり、さらに好ましくは 20〜60nmである。また、 分散物中の電子受容性物質の微粒子（二次粒子）の平均粒径としては 0. 01〜： L00 μ mであることが好ましい。また、入射光を散乱させて光捕獲率を向上させる目的で 、粒子サイズの大きな、例えば 300nm程度の電子受容物質の微粒子を併用して、電 子受容層を形成してもよい。
[0048] 凹凸構造によって、電子受容層 6の表面積を大きくしてプローブ分子を多く固定ィ匕 することで検出感度を上げることができる。生体分子の大きさが 0. l〜20nm程度で あるため、凹凸構造により形成される細孔径は 20nm以上 150nm以下が好ましい。 凹凸構造により生じる空間の入口がそれ以下であれば、比表面積は増大するが生体 分子とプローブとの結合ができず、検出信号は低下する。凹凸が粗ければ表面積も あまり増えな 、ため信号強度もそれ程上がらな 、。生体分子のセンシングに好適な、 より好ましい範囲は 50nm以上 150nm以下である。
[0049] 本発明の好ま 、態様によれば、凸構造として、ナノスケールの柱 (ピラー）を表面 に規則正しく並べたピラー構造を採用するのが好ましい。その製法としては種々、知 られている力 ナノメートルスケールの孔を有する陽極酸ィ匕アルミナを铸型として用い る方法が一般的である。铸型にセラミックのゾルを充填、熱処理した後に、エッチング によりアルミナの铸型を除去する方法や、充填したセラミックのゾルを铸型より離型し た後に熱処理する方法がある。ピラー状のナノ構造体を製造する方法としては、特開 2004— 130171で示された透明基体、透明導電層上にナノ構造体を製造する方法 が挙げられる。ここでは、陽極酸ィ匕アルミナの铸型にチタ-ァゾルを充填し、 300〜4 00°Cの熱処理を行った後に铸型をエッチングによって除去する方法が採られて!/、る 。その結果、ナノ構造体としてチタユアのナノチューブやナノワイアが形成される。
[0050] 本発明の好ましい態様によれば、凹構造として、セラミック成分を含む無機-有機ハ イブリツド前駆体を焼成し、有機物の酸ィ匕分解により気相となるために生じる気孔を 採用するのが好ましい。無機-有機ハイブリッド前駆体は、有機金属化合物 (金属ァ ルコキシド)の酸化とそれに続く重縮合反応によって生じる金属-酸素のネットワーク 構造と有機ポリマーなどが共存するものである。また、市販の酸化チタン粒子 (たとえ ばティカ株式会社製アナターゼ型結晶、商品名 AMT— 600 (平均粒径 30nm)など )や酸ィ匕チタン分散液に有機ポリマーなどを添加する方法もある。これらの組成につ いては種々の提案がなされており、たとえば特開平 10-212120ではグライム系溶剤 (HO- (-CH CH 0 ) - R
2 2 η 、 nは 1〜10、 Rはアルキル基あるいはァリール基）に酸ィ匕 チタン粒子を分散させ、さらに分散助剤として有機ポリマーを加える組成が提案され ている。この組成の分散液を適当な方法 (ディップコーティング法、スプレーコーティ ング法、スピナ一コーティング法、ブレードコーティング法、ローラーコーティング法、 ワイパーバーコーティング法、リバースロールコーティング法）によって支持体上に塗 布し、 200〜800。Cで焼成した場合、 1cm2 (厚さ: m)あたり 40〜50cm2の比表面 積が達成されている。また、特開 2001 -233615ではテトラアルコキシチタンとェチレ ンオキサイド、プロピレンオキサイド、エチレンオキサイドブロックコポリマーと安定化 剤と溶剤とからなるゾル溶液を基板上に滴下し、基板を高速回転させることで溶剤を 蒸発させ、ゲル化させることで得られる三次元構造を有する有機無機複合チタ-ァ 薄膜を、高温焼結させてブロックコポリマーを除去することで微細な三次元凹構造を 達成している。さらに、有機ポリマーとしてオリゴ糖 (トレハロース）を用いる方法も開示 されており（特開 2004-83376)、気孔率が 38〜56%のセラミック多孔質膜が得られ ている。
[0051] このように、セラミックの微細な凹凸構造制御方法は種々提案されており、本技術に 適したセラミック電極材料に応用することで、比表面積の大き!/ヽ電極材料の創製が可 能である。
[0052] 本発明の好ましい態様によれば、作用電極が導電性基材をさらに含んでなり、電子 受容層が導電性基材上に形成されてなるのが好ましい。本発明に使用可能な導電 性基材としては、チタン等の金属のように支持体そのものに導電性があるもののみな らず、ガラスもしくはプラスチックの支持体の表面に導電材層を有するものであってよ い。この導電材層を有する導電性基材を使用する場合、電子受容層はその導電材 層上に形成される。導電材層を構成する導電材の例としては、白金、金、銀、銅、ァ ルミ-ゥム、ロジウム、インジウム等の金属;炭素、炭化物、窒化物等の導電性セラミツ タス；およびインジウムースズ複合酸化物、酸化スズにフッ素をドープしたもの、酸化 スズにアンチモンをドープしたもの、酸ィ匕亜鈴にガリウムをドープしたもの、または酸 化亜鉛にアルミニウムをドープしたもの等の導電性の金属酸ィ匕物が挙げられ、より好 ましくは、インジウム-スズ複合酸ィ匕物 (ITO)、酸化スズにフッ素をドープした金属酸 化物 (FTO)である。ただし、前述した通り、電子受容層自体が導電性基材としても機 能する場合にあっては導電性基材は省略可能である。また、本発明において、導電 性基材は、導電性を確保できる材料であれば限定されず、それ自体では支持体とし ての強度を有しない薄膜状またはスポット状の導電材層も包含するものとする。
[0053] 本発明の好ましい態様によれば、導電性基材が実質的に透明、具体的には、光の 透過率が 10%以上であるのが好ましぐより好ましくは 50%以上であり、さらに好まし くは 70%以上である。これにより、作用電極の裏側 (すなわち導電性基材)から光を 照射させて、作用電極 (すなわち導電性基材および電子受容層）を透過した光が増 感色素を励起するようにセルを構成することができる。また、本発明の好ましい態様 によれば、導電材層の厚みは、 0. 02〜： LO /z m程度であるのが好ましい。さらに、本 発明の好ましい態様によれば、導電性基材の表面抵抗が 100 Q Zcm2以下であり、 さらに好ましくは 40 Q Zcm2以下であるのが好ましい。導電性基材の表面抵抗の下 限は特に限定されないが、通常 0. l Q Zcm2程度であろう。
[0054] 導電性基材上への電子受容層の好ましい形成方法の例としては、電子受容物質 の分散液またはコロイド溶液を導電性支持体上に塗布する方法、半導体微粒子の前 駆体を導電性支持体上に塗布し空気中の水分によって加水分解して微粒子膜を得 る方法 (ゾルーゲル法）、スパッタリング法、 CVD法、 PVD法、蒸着法などが挙げられ る。電子受容物質としての半導体微粒子の分散液を作成する方法としては、前述の ゾルーゲル法の他、乳鉢ですり潰す方法、ミルを使って粉砕しながら分散する方法、 あるいは半導体を合成する際に溶媒中で微粒子として析出させそのまま使用する方 法等が挙げられる。このときの分散媒としては水または各種の有機溶媒 (例えばメタノ ール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジクロロメタン、アセトン、ァセトニトリル、 酢酸ェチル等）が挙げられる。分散の際、必要に応じてポリマー、界面活性剤、酸、 もしくはキレート剤などを分散助剤として使用してもよい。
[0055] 電子受容物質の分散液またはコロイド溶液の塗布方法の好ましい例としては、アブ リケーシヨン系としてローラ法、ディップ法、メータリング系としてエアーナイフ法、ブレ ード法等、またアプリケーションとメータリングを同一部分でできるものとして、特公昭
58— 4589号公報【こ開示されて!ヽるワイヤーノ一法、米国特許 2681294号、同 27 61419号、同 2761791号等に記載のスライドホッパ法、エタストルージョン法、カー テン法、スピン法、スプレー法が挙げられる。
[0056] 本発明の好ましい態様によれば、電子受容層が半導体微粒子力 なる場合、電子 受容層の膜厚が 0. 1〜200 111でぁるのが好ましぐょり好ましくは0. 1〜： LOO /z m であり、さらに好ましくは 1〜30 /ζ πι、最も好ましくは 2〜25 /ζ πιである。これにより、 単位投影面積当たりのプローブ物質および固定される増感色素量を増加して光電 流量を多くするとともに、電荷再結合による生成した電子の損失をも低減することが できる。また、導電性基材 lm2当たりの半導体微粒子の塗布量は 0. 5〜400gである のが好ましぐより好ましくは 5〜： LOOgである。
[0057] 本発明の好ま 、態様によれば、電子受容物質がインジウム-スズ複合酸化物 (IT O)または酸化スズにフッ素をドープした金属酸ィ匕物 (FTO)を含んでなる場合、電子 受容層の膜厚が lnm以上であるのが好ましぐより好ましくは ΙΟηπ！〜 1 μ mである。
[0058] 本発明の好ましい態様によれば、半導体微粒子を導電性基材上に塗布した後に 加熱処理を施すのが好ましい。これにより、粒子同士を電気的に接触させ、また、塗 膜強度の向上や支持体との密着性を向上させることができる。好ましい加熱処理温 度は、 40〜700°Cであり、より好ましくは 100〜600°Cである。また、好ましい加熱処 理時間は 10分〜 10時間程度である。
[0059] また、本発明の別の好ま 、態様によれば、ポリマーフィルムなど融点や軟ィ匕点の 低い導電性基材を用いる場合にあっては、熱による劣化を防止するため、高温処理 を用いない方法により膜形成を行うのが好ましぐそのような膜形成方法の例として、 プレス、低温加熱、電子線照射、マイクロ波照射、電気泳動、スパッタリング、 CVD、 PVD、蒸着等の方法が挙げられる。
[0060] こうして得られた作用電極の電子受容層の表面にはプローブ物質が担持される。
作用電極へのプローブ物質の担持は公知の方法に従い行うことができる。本発明の 好ましい態様によれば、プローブ物質として一本鎖の核酸を用いる場合には、作用 電極表面に酸化層を形成させておき、この酸化層を介して核酸プロ ブと作用電極 とを結合させることにより行うことができる。このとき、核酸プローブの作用電極への固 定化は、核酸の末端に官能基を導入することにより行うことができる。これにより、官 能基が導入された核酸プローブはそのまま固定ィ匕反応により担体上に固定化される ことができる。核酸末端への官能基の導入は、酵素反応もしくは DNA合成機を用い て行なうことができる。酵素反応において用いられる酵素としては、例えば、タ—ミナ ルデォキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ポリ Aポリメラーゼ、ポリヌクレオチド力 イネース、 DNAポリメラーゼ、ポリヌクレオチドアデ-ルトランスフェラーゼ、 RNAリガ —ゼを挙げることができる。また、ポリメラ一ゼチェインリアクション (PCR法）、ニックト ランスレーシヨン、ランダムプライマー法により官能基を導入することもできる。官能基 は、核酸のどの部分に導入されてもよぐ 3'末端、 5'末端もしくはランダムな位置に導 人することができる。
[0061] 本発明の好ましい態様によれば、核酸プローブの作用電極への固定ィ匕のため官能 基として、ァミン、カルボン酸、スルホン酸、チオール、水酸基、リン酸等が好適に使 用できる。また、本発明の好ましい態様によれば、核酸プローブを作用電極に強固に 固定ィ匕するためには、作用電極と核酸プローブの間を架橋する材料を使用すること も可能である。そのような架橋材料の好ましい例としては、シランカップリング剤、チタ ネートカップリング剤や、ポリチォフェン、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリア-リン 等の導電性ポリマーが挙げられる。
[0062] 本発明の好ましい態様によれば、核酸プローブの固定化を物理吸着という、より簡 単な操作で効率よく行うことも可能である。電極表面への核酸プローブの物理吸着は 、例えば、以下のように行なうことができる。
まず、電極表面を、超音波洗浄器を用いて蒸留水およびアルコ―ルで洗浄する。 その後、電極を核酸プロ ブを含有する緩衝液に挿入して核酸プロ ブを担体表面 に吸着させる。
[0063] また、核酸プローブの吸着後、ブロッキング剤を添加することにより、非特異的な吸 着を抑制することができる。使用可能なブロッキング剤としては、核酸プローブが吸着 して ヽな 、電子受容層表面のサイトを埋めることができ、かつ電子受容物質に対して 化学吸着あるいは物理吸着等により吸着可能な物質であれば限定されないが、好ま しくは化学結合を介して吸着可能な官能基を有する物質である。例えば、酸化チタン を電子受容層として用いる場合における好ましいブロッキング剤の例としては、カル ボン酸基、リン酸基、スルホン酸基、水酸基、アミノ基、ピリジル基、アミド等の酸化チ タンに吸着可能な官能基を有する物質が挙げられる。
[0064] 本発明の好ましい態様によれば、作用電極上にプローブ物質が互いに分離された 複数の領域毎に区分されて担持されてなり、光源による光照射が各領域に対して個 別に行われるのが好ましい。これにより、複数の試料を一枚の作用電極上で測定す ることができるので、 DNAチップの集積ィ匕等が可能となる。本発明のより好ましい態 様によれば、作用電極上にプローブ物質が担持された、互いに分離された複数の領 域がパター-ングされており、光源力 照射される光でスキャニングしながら、各領域 の試料について被検物質の検出または定量を一度の操作で連続的に行うことが好ま しい。
[0065] 本発明のより好ましい態様によれば、作用電極上の互いに分離された複数の領域 の各領域に複数種類のプローブ物質を担持させることができる。これにより、領域の 個数に、各領域毎のプローブ物質の種類数を乗じた数の、多数のサンプルの測定を 同時に行うことができる。
[0066] 本発明のより好ましい態様によれば、作用電極上の互いに分離された複数の領域 の各領域毎に異なるプローブ物質を担持させることができる。これにより、区分された 領域の数に相当する種類数のプローブ物質を担持させることができるので、多種類 の被検物質の測定を同時に行うことができる。この態様は、各領域毎に異なる被検物 質の分析が可能なため、一塩基多型の解析 (SNPs)の多項目解析に好ましく利用 することができる。
[0067] 対電極
本発明に用いる対電極は、電解質媒体に接触させた場合に作用電極との間に電 流が流れることができるものであれば特に限定されず、ガラス、プラスチック、セラミツ タス等の絶縁性の支持体に、金属もしくは導電性の酸化物を蒸着したものが使用可 能である。また、対電極としての金属薄膜を 5 μ m以下、好ましくは 3nm〜3 μ mの範 囲の膜厚になるように、蒸着やスパッタリングなどの方法により形成して作成すること もできる。対電極に使用可能な材料の好ましい例としては、白金、金、ノラジウム、二 ッケル、カーボン、ポリチォフェン等の導電性ポリマー、酸化物、炭化物、窒化物等の 導電性セラミックス等が挙げられ、より好ましくは、白金、カーボンであり、最も好ましく は白金である。これらの材料は電子受容層の形成方法と同様の方法により薄膜形成 が可能である。
[0068] 測定方法および装置
本発明の方法にあっては、増感色素の共存下、試料液を作用電極に接触させて、 プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させ、この結合により 増感色素を前記作用電極に固定させる。このとき、試料液の溶媒として後述する本 発明の緩衝溶液を用いることにより、作用電極による被検物質の検出感度を向上さ せることができる。
[0069] 本発明の好ましい態様によれば、増感色素で予め標識された一本鎖の核酸を被検 物質とする場合、プローブ物質である一本鎖核酸との間でハイブリダィゼーシヨン反 応を行なうことができる。ハイブリダィゼーシヨン反応の好まし 、温度は 37〜72°Cの 範囲であるが、その最適温度は使用するプローブの塩基配列や長さ等により異なる
[0070] 本発明の別の好ましい態様によれば、被検物質およびプローブ物質の結合体 (例 えばノ、イブリダィゼーシヨン後の二本鎖核酸）にインターカレーシヨン可能な増感色 素を用いる場合には、試料液に増感色素を添加することにより結合体を特異的に増 感色素で標識することができる。
[0071] 本発明の好ましい態様によれば、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に 特異的に結合させた作用電極を洗浄液で洗浄することにより、作用電極に結合しな 力つた被検物質を除去するのが好ましい。このときの洗浄液は、界面活性剤をさらに 含むものであってよい。
[0072] 本発明の方法にあっては、被検物質が増感色素と共に固定された作用電極を、対 電極と共に電解質媒体に接触させ、作用電極に光を照射して増感色素を光励起さ せ、光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電 極との間に流れる光電流を検出する。作用電極および対電極の相対的な位置関係 は、互いに電気的に短絡することなぐなおかつ電解質媒体に接触しさえしていれば 限定されるものではなぐ互いに対向させて配置してもよいし、あるいは同一平面上 に互いに離間させて配置してもよい。なお、作用電極および対電極が同一平面上に 互いに離間させて配置される場合には、作用電極と対電極との間の電気的な短絡を 防止するために絶縁基板上に両電極が設けられるのが望まし 、。
[0073] このような測定用セルの一例を図 4及び図 5に示す。図 4及び図 5に示される測定用 セル 21は、作用電極 22と対電極 23とにより挟まれて形成された空隙 24内に電解液 が充填されてなる。作用電極 22は、導電性基材 26と電子受容層 27とを備えてなり、 電子受容層 27側を電解液に接触させるように配置される。作用電極 22と対電極 23 との間には絶&^ぺーサ 25が挿入されることにより、電解液を収容する空間 24が確 保されている。電極間の距離は酸ィ匕還元のサイクルを効率良く行わせるためには短 い方が好ましぐ工作的な精度との兼ね合いから数十 mであることが望ましい。また 、いわゆる MEMSのような製造方法を利用するのであれば、より近接した電極間距 離とすることも可能である。
[0074] 作用電極 22の上方には光源 28が光源カバー 29を介して配置される。すなわち、 作用電極 22の裏側 (すなわち導電性基材)から光を照射させて、作用電極 (すなわ ち導電性基材および電子受容層）を透過した光が増感色素を励起するようにセルが 構成されている。もっとも、対電極を透光性の材料で構成することにより光を対電極の 裏側から照射してもよぐあるいは、作用電極および対電極に平行に光を照射しても よいのは言うまでもない。本発明に用いる光源としては、標識色素を光励起できる波 長の光を照射できるものであれば限定されず、好ましい例としては、蛍光灯、ブラック ライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水 銀一キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、 LED (白色、青、緑、赤） 、レーザー（coレーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光を用いることが
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でき、より好ましくは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハラ イドランプ、 LED (白色、青、緑、赤）、太陽光等を挙げることができる。また、必要に 応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて特定波長領域の光のみを照射してもよ い。
[0075] 図 6は他の測定用セルの一例の断面図、図 7は同測定用セルの分解斜視図であり 、基板 30上に対電極 23が設けられ、この基板 30には電解液または洗浄液の供給孔 31および排出孔 32が形成され、対電極 23上には電解液を収容する空間 24を有す る絶^ぺーサ 25が配置され、この絶^ぺーサ 25上に作用電極 22が設けられ、 この作用電極 22の空間 24に臨む面に複数の電子受容層 27が離間して形成されて いる。
[0076] そして、対電極 23と干渉しないように前記基板 30を貫通して作用電極用接点 33が 設けられている。この作用電極用接点 33は電子受容層 27に結合したプローブを電 気的接点とすることで電極の取り出しを行って 、る。
[0077] また、前記作用電極 22の上には押え部材 34が設けられ、この押え部材 34には前 記複数の電子受容層 27のそれぞれに対応した位置に貫通孔 35が形成されている。 この貫通孔 35を介して、光源 28からの光が作用電極 22に照射される。そして、作用 電極 22および対電極 23間には電流計 36が接続され、光照射により系内を流れる光 電流が電流計により測定される。
[0078] 本発明の好ましい態様によれば、互いに異なる光波長で励起可能な二種以上の増 感色素を用いて複数種類の被検物質を個別に検出する場合、光源から波長選択手 段を介して特定波長の光を照射することにより、複数の色素を個別に励起することが 可能である。波長選択手段の例としては、分光器、色ガラスフィルタ、干渉フィルタ、 バンドパスフィルタ等が挙げられる。また、増感色素の種類に応じて異なる波長の光 を照射可能な複数の光源を用いてもよぐこの場合の好ましい光源の例としては、特 定波長の光が照射されるレーザ光や LEDを用いてもよい。また、作用極に光を効率よ く照射するため、石英、ガラス、液体ライトガイドを用いて導光してもよい。
[0079] 本発明の好ましい態様によれば、光源力 放射される光がもともと紫外線を実質的 に含まな!/、か、または光源からの光の照射が紫外線を除去する手段を介して行われ るのが好ましい。これにより、照射光に 400nm以下の波長の紫外線が含まれる場合 に発生しうる電子受容物質自体の光励起によるバックグランド電流、すなわちノイズを 効果的に抑制して、より精度の高い測定が可能となる。なお、増感色素は一般的に 可視光の吸収により励起されることができるため、紫外線を除去したとしても可視光の 照射により高い感度で光電流を検出することが可能である。
[0080] 紫外線を除去する手段の好ま ヽ例としては、光学フィルタ、および分光器が挙げ られる。光学フィルタまたは分光器を用いることにより、照射光の波長を制御すること ができ、作用電極自体の光励起を防止しつつ、増感色素のみを励起することが可能 となる。好ましい光学フィルタの例としては、紫外線カットフィルタ等の色ガラスフィル タが挙げられる。好ましい分光器の例としては、厳密な波長制御が可能な点で、回折 格子が内蔵された分光器が挙げられる。
[0081] 紫外線を実質的に含まない光を放出する光源の好ましい例としては、レーザ、無機 エレクト口ルミネッセンス（EL)素子、有機エレクト口ルミネッセンス（EL)素子、発光ダ ィオード (LED)が挙げられる力 最も好ましくは発光ダイオード (LED)またはレーザ ダイオードである。これらによれば、波長分布の狭い制御された光を照射することが でき、小型、軽量、低消費電力、および長寿命といった利点も得られる。
[0082] 本発明のより好ま U、態様によれば、使用する電子受容物質につ!、ての既知のバ ンドギャップを下記式に代入して算出される、表 1に示されるカットオフ波長よりも短い 波長の光を除去することが好ましい。これにより、電子受容物質の特性に応じて、ノ ッ クグランド電流の発生を効果的に抑制できる。
バンドギャップ（eV) = h v = c/ λ = 1239. 8/ λ (mm)
(h:プランク定数、 c :光速）
[0083] [表 1]
表 1
電子受容物質 パンドギャップ 好適なカヅトオフ波長
( e V) ( n m)
ルチル型酸化チタン 3 . 2 3 8 7
アナ夕一ゼ型酸化チタン 3 . 0 4 1 3
酸化亜鉛 3 . 1 4 0 0
チタン酸ストロンチウム 3 . 2 3 8 7
酸化スズ 3 . 5 3 5 4
酸化タングステン 2 . 8 4 4 3
酸化ニオブ 3 . 1 4 0 0
酸化鉄 2 . 2 5 6 4
[0084] なお、電子受容物質には不純物準位を含む場合があるため、万全を期して、カット オフ波長を表 1に示される波長よりも長波長側に設定しても構わない。また、作用電 極が複数の電子受容物質で構成されている場合には、構成成分のうち最もバンドギ ヤップが狭 、成分のカットオフ波長よりも短 、波長を除去するのが好まし 、。
[0085] 前記したように、作用電極 22および対電極 23間には電流計 36が接続され、光照 射により系内を流れる光電流が電流計により測定される。これにより、被検物質を検 出することができる。その際の電流値は作用電極上にトラップされた増感色素の量を 反映する。例えば、被検物質が核酸の場合、相補性のある核酸間で形成された二本 鎖の量が、電流値となり反映される。したがって、得られた電流値から被検物質を定 量することができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、電流計が、得られ た電流量または電気量カゝら試料液中の被検物質濃度を算出する手段をさらに備え てなるのが好ましい。
[0086] 本発明の好ましい態様によれば、光電流を検出する工程力 電流値を測定し、得ら れた電流値または電気量から試料液中の被検物質濃度を算出することができる。こ の被検物質濃度の算出は、予め作成された被検物質濃度と電流値または電気量と の検量線と、得られた電流値または電気量とを対比することにより行うことができる。 本発明の方法にあっては、電流値は作用電極上にトラップされた増感色素の量が反 映されるので、被検物質濃度に対応した正確な電流値が得られるため、定量測定に 適する。 [0087] 本発明の別の好ましい態様によれば、予め増感色素で標識された被検物質を競合 物質として用いて、増感色素で標識されていない、プローブ物質に特異的に結合可 能な第二の被検物質を定量することができる。第二の被検物質はプローブ物質に標 識済被検物質よりも特異的に結合しやすい性質を有するのが好ましい。これら二種 類の被検物質を競合させてプローブ物質に特異的に結合させると、検出される電流 値と第二の被検物質の濃度との間に相関関係が得られる。つまり、色素標識されて いない第二の被検物質の数が増加するにつれ、プローブ物質に特異的に結合する 競合物質の数が減少するため、第二の被検物質濃度の増加につれて、検出電流値 が減少する検量線を得ることができる。したがって、増感色素で標識されていない第 二の被検物質の検出および定量が可能となる。
[0088] 本発明のより好ましい態様によれば、被検物質および第二の被検物質が抗原であ り、プローブ物質が抗体であるのが好ましい。この態様における被検物質および第二 の被検物質のプローブ物質への固定ィ匕工程を図 8に示す。図 8に示されるように、増 感色素で標識された抗原 41と、色素標識されていない抗原 42とが競合して抗体 43 に特異的に結合する。したがって、色素標識されていない抗原 42が増加するにつれ 、抗体に特異的に結合する色素標識された抗原 43が減少するため、第二の被検物 質濃度の増加につれて、検出電流値が減少する検量線を得ることができる。
[0089] フロー型沏 用セル： よびパターユング雷欏 用いた沏 法あ び 置
本発明の方法および装置の好まし 、実施態様の一例として、フロー型測定用セル およびパターユング電極を用いた測定方法および装置について説明する。図 9に、 装置の全体構造を示す。図 9に示される装置 50は、フロー型測定用セル 51と、光源 52と、電解液タンク 53と、洗浄液タンク 54と、供給ポンプ 55と、電流計 56と、排出ポ ンプ 57とを備えてなる。フロー型測定用セル 51は、パターユングされた作用電極 58 と、作用電極に対向する対電極 59とを備えてなり、作用電極 58および対電極 59の 間に、電解液または洗浄液を収容しかつ流すことができる流路が形成される。すなわ ち、供給ポンプ 55により測定用セル 51内に供給された電解液または洗浄液は、作 用電極 58および対電極 59に接触しながら流路を通過した後、排出ポンプ 57により 測定用セル 51外に排出されるように構成されている。これら一連の動作の制御およ び光電流値の解析は図示しない制御解析装置により行われることができる。
[0090] 作用電極 58は、電子受容層上にプローブ物質が担持された、互いに分離された 複数の領域がパターユングされており、光源力も照射される光でスキャニングしなが ら、各領域の試料にっ ヽて被検物質の検出または定量を一度の操作で連続的に行 えるように構成されて 、る。このようにパターユングされた作用電極の例を図 10 (a)〜 (d)および図 11 (a)〜（c)に示す。
[0091] 図 10 (a)および (b)に示される作用電極 58は、導電性基材 58aの全面に形成され た電子受容層 58b上に、プローブ物質 58cが担持された複数のスポット 60が縦横方 向にパター-ングされたものである。そして、この作用電極 58の導電性基材にリード 線 61が施され、このリード線 61を介して作用電極 58全体が電流計 56に接続されて いる。この作用電極 58によれば、各スポットに順次光照射を行うことにより、対電極 59 との間で発生する光電流を各スポット毎に測定することができる。また、電極の構成が 比較的簡単なため電極の作製が容易であり、従来の DNAチップの製造技術を利用 できるとの利点もある。また、変形例として、図 10 (c)に示されるように電子受容層 58 b自体をスポット状に形成してその上にプローブ物質 58cを担持させる、あるいは、図 10 (d)に示されるように導電性基材を省略して電子受容層 58bのみでスポット状の作 用電極 58を構成してその上にプローブ物質 58cを担持させ、かつ電子受容層 58b にリード線 61を施してもよぐ特に後者にあっては、製造工程が簡略ィ匕されるとともに 製造コストも低減できるとの利点がある。この作用電極に使用される光源 52としては、 図 12に示されるように作用電極 58上を縦横方向に移動する光源である力、または図 13に示されるように作用電極 58の各スポットに対応して複数の光源が配列させてお き、各光源を順に点灯および消灯させるものであってょ 、。
[0092] 図 11 (a)および (b)に示される作用電極 58 'は、絶縁基板 58d'に導電性基材 58a ，および電子受容層 58b '力もなる複数のスポット 60'が縦横方向にパターユングされ ており、電子受容層 58b '上にプローブ物質 58c 'が担持される。そして、各スポット 6 0，の導電性基材には個別にリード線 61，が施され、このリード線 61，を介して各スポ ット 60'が電流計 56に接続されている。この作用電極 58 'によれば、作用電極の全 面に光を同時に照射するだけで、各スポットに発生する光電流を同時にかつ個別に 測定することができる。また、各スポットにおける光電流を個別に測定することができ るので、他のスポットで発生した光電流をノイズとして拾うことが無 、との利点もある。 また、変形例として、図 11 (c)に示されるように導電性基材を省略して電子受容層 58 b 'のみでスポット状の作用電極 58 'を構成してその上にプローブ物質 58c 'を担持さ せ、かつ電子受容層 58b 'にリード線 61 'を施してもよぐ製造工程が簡略ィ匕されると ともに製造コストも低減できるとの利点がある。この作用電極 58 'に使用される光源 5 2は、図 9の作用電極の場合と同様、作用電極 58上を縦横方向に移動する光源であ る力、または作用電極 58の各スポットに対応して複数の光源が配列させておき、各 光源を順に点灯および消灯させるものであってよい。
[0093] この装置を使用した測定方法の一例について以下に説明する。
まず、増感色素の共存下、試料液を作用電極に接触させて、プローブ物質に被検 物質を直接または間接的に特異的に結合させ、この結合により増感色素を作用電極 58に固定させる。このとき、作用電極の電子受容層に図 10に示されるスポットパター ンのマスキングを施して、プローブ物質が担持された複数のスポット 60が縦横方向に パター-ングされた作用電極 58を得る。こうして得られた作用電極 58をフロー型測 定用セル 51に装着する。
[0094] 次いで、供給ポンプ 55を作動させて電解液タンク 53から電解液を測定用セル 51 内に送り込み、測定用セル内の流路を電解液で満たした後、送液を停止する。光源 52から作用電極 58に光を照射し、電流計 56により作用電極 58および対電極 59間 に発生する光電流を測定する。この光電流値の測定にあっては、光電流値が安定す る、照射開始後数十秒後の値を採用するのが好ましい。そして、図示しない制御解 析装置において、得られた電流値と、予め作成された被検物質濃度と電流値との検 量線とを対比することにより被検物質濃度が算出される。光電流の測定終了後、供給 ポンプ 55を作動させて洗浄液タンク 53から洗浄液を測定用セル 51内に送り込むと 同時に、測定用セル 51内の電解液を排出ポンプ 57を作動させて排出し、測定用セ ル内の流路内の電解液で洗浄液で置換した後、送液および排液を停止する。これに より、洗浄液で洗浄ィ匕された測定用セル 51を用いて、次の測定を上記同様の手順で 行うことができる。 [0095] 照、射機 を備えた沏 置
本発明の好ましい態様によれば、光源があらかじめ複数個設けられてなり、かつ前 記測定装置が、該複数個の光源を切り替えて照射する、複数固定型の光照射機構 を備えてなるのが好ましい。
[0096] 本発明の別の好ましい態様によれば、前記測定用セル中の作用電極に対し、前記 光源が XY方向へ移動することによって、作用電極上の任意の領域に光照射する、 光源移動型の光照射機構を備えてなるのが好ましい。この態様の装置としては、例 えば、 XY方向に移動可能なアームに光源を取り付け、測定用セルとしてのセンサュ ニットを固定した装置が挙げられる。このような態様の測定装置の一例の全体斜視図 が図 14 (a)に、その上面図が図 14 (b)に示される。図 14に示されるように、センサュ ニット 59は固定されており、センサユニット 59開口部へ光源 60が移動して光照射を 行う。図 14では、 XY方向への移動機構として、モーター 61の回転をベルト 62によつ て直線運動に変換するベルトドライブ機構が例示されているが、その他の機構、たと えばラックピ-オン機構をモーターで駆動する機構なども使用できる。モーター回転 の開始、停止および回転速度を制御することによって、センサユニット内に格納した センサチップ上の生体分子固定ィ匕領域 (スポット）に対し順次光照射を行うことができ 、その際の照射速度や照射時の移動の有無を設定できる。この時使用するセンサュ ニットは本発明の電解質媒体を対電極と作用電極の間に装填できるような構造を有 するものであればよい。光源は、 XY移動時に、前記増感色素が結合した被験物質 がプローブ物質を介して固定された作用電極の領域を照射する際に停止してもよい し、あるいは前記増感色素が結合した被験物質がプローブ物質を介して固定された 作用電極の領域を連続的に移動してもよい。
[0097] 本発明のさらに別の好ましい態様によれば、前記光源が固定され、該固定された光 源に対し、前記測定用セルが XY方向へ移動することによって、作用電極上の任意 の領域に光照射する、セル移動型の光照射機構を備えてなるのが好ましい。この態 様の装置としては、 XY方向に移動可能なステージに測定用セルとしてのセンサュ- ットを取り付け、光源を固定した装置が挙げられる。このような態様の測定装置の一 例の全体斜視図が図 15 (a)に、その上面図が図 15 (b)に示される。図 15に示される ように、光源 60は固定されており、センサユニット 59を載せたステージ 63が XY移動 することで、センサユニット開口部への照射を行う。図 15では、 XY方向への移動機 構として、モーター 64の回転をベルト 65によって直線運動に変換するベルトドライブ 機構が例示されている力 その他の機構、たとえばラックピニオン機構をモーターで 駆動する機構なども使用できる。モーター回転の開始、停止および回転速度を制御 することによって、センサユニット 59内に格納したセンサチップ上の生体分子固定ィ匕 領域 (スポット）に対し順次光照射を行うことができ、その際の照射速度や照射時の移 動の有無を設定できる。この時使用するセンサユニット 59は本発明の電解質媒体を 対電極と作用電極の間に装填できるような構造を有するものであればよい。測定用セ ルは、 XY移動時に、前記増感色素が結合した被験物質がプローブ物質を介して固 定された作用電極の領域を照射する際に停止してもよいし、あるいは前記増感色素 が結合した被験物質がプローブ物質を介して固定された作用電極の領域を連続的 に移動してもよい。
[0098] 図 14に示される装置における光源移動型の光照射機構の一例として、光源 60が X Y移動機構 66に取り付けられた装置構成図を図 16に示す。また、図 15に示される 装置におけるセル移動型の光照射機構の一例として、センサユニット 63が XY移動 機構 66に取り付けられた装置構成図を図 17に示す。図 16および 17に示されるよう に、光源 60のオンオフ、 XY移動機構 66の制御、電流計 67の制御や電流信号の受 信はインターフェースボード 68を介してコンピュータ 69によって行う。この時、コンビ ユータ 69は外部取り付けの PCを用いてもよいし、あるいは、装置内に組み込まれた マイコンを用い、入力装置 70、表示装置 71、および記憶装置 72も測定装置内に組 み込んでもよい。入力装置 70、表示装置 71、および記憶装置（図示せず)の機能を 装置内組込みのマイコンと外部取り付けの PCに適宜振り分けて機能させることもでき る。このような照射光移動機構を備えた測定装置の一例の外観斜視図を図 18に示 す。図 18に示されるように、動作条件入力のためのキー、ボタンなどの入力装置 70、 設定条件や測定結果の表示装置 71、および記憶装置が組み込まれた装置とするこ とができる。また、これらの機能をすベて外付けの PCで行うことも可能である。
[0099] MEMSのような製造方法を利用した光電流検出装置 MEMSのような製造方法を利用した光電流検出装置の一例の概略斜視図を図 19 に、この装置の構成図を図 20に、この装置に使用される検出チップの分解斜視図を 図 21に示す。光電流検出装置 73には光源 74、電流計 75、検出チップ 76を固定で きる機能、検出チップ 76の吸引口 77を介して吸引するポンプ 78が設けられている。 光源 74 (複数個）、作用電極 79の切り替え (本例は図 11に示したパターユング電極 を用いた例を示す）、吸引ポンプ 77、電流計 75の制御や電流信号の受信はインター フェースボード 80を介してコンピュータ 81によって行う。この時、コンピュータ 81は装 置内に組み込まれたマイコンを用い、入力装置 82、表示装置 83、記憶装置 84も測 定装置に組み込まれている。入力装置 81では動作条件、設定条件の入力のための キー、ボタン設けられ、表示装置 82には測定結果が表示される。記憶装置 83では測 定結果の記憶を行うことができる。検出チップ 76は下部部材 85、電極基板 86、 PD MSチップ 87、上部部材 88から構成されており、下部部材 85には光源 74の光を通 すための開口部 89が備えられている。電極基板 86には作用電極 79、対電極 90、及 び読取装置と電気的に接続するための端子 91が設けられて 、る。 PDMSチップ 87 には送液用流路 92、廃液溜め 93が設けられ、上部部材 88の電解液注入口 94、洗 浄液注入口 95、試料溶液注入口 96に連結した溶液口 97、 98、 99も設けられている 。上記 MEMSのような製造方法を利用した光電流読取装置及び検出チップを用い ることにより、核酸、外因性内分泌攪乱物質、抗原等の特異的結合性を有する被検 物質を微量な試料溶液でかつ簡単な操作で測定することができる。
作用雷極 の接触下で使用される緩衝溶液
本発明の好ましい態様によれば、作用電極との接触下で使用される緩衝溶液とし て、カルボキシル基、リン酸基、およびアミノ基を含まない緩衝剤と、溶媒とを含んで なる緩衝溶液を用いるのが好ましい。作用電極との接触下での使用の例としては、プ ローブ物質を作用電極に固定ィ匕させる処理、被検物質をプローブ物質を介して作用 電極に固定化させる処理、被検物質の固定化後の作用電極を洗浄する処理等が挙 げられる。そして、上記緩衝剤を含む緩衝溶液を用いることにより、測定対象物およ び作用電極の特性を阻害することなぐ光電流による被検物質の検出感度を飛躍的 に向上させることができる。この傾向は、作用電極の表面が酸化チタンやチタン酸スト ロンチウムカもなる場合にぉ 、て、特に顕著である。
[0101] 上記緩衝溶液を使用すると検出感度が飛躍的に向上する理由は定かではないが
、一般的な生化学分野で使用される、リン酸緩衝液、およびァミンもしくはカルボン酸 を主成分とする緩衝溶液と異なり、作用電極との相互作用が起こりにくいためではな いか、と考えられる。すなわち、緩衝剤がカルボキシル基、リン酸基、およびアミノ基を 含むと、これらの基が作用電極に対して何らかの相互作用をして、作用電極上のプロ ーブ物質の剥離や色素から作用電極への電子注入の阻害を引き起こし、その結果 検出電流値の値を低下を招くのではないかと考えられるが、本発明はこれに限定さ れるものではない。
[0102] 上記緩衝剤は、カルボキシル基、リン酸基、およびアミノ基を含まな ヽ化学構造を 有し、かつ緩衝作用を有するものである限り限定されないが、好ましい緩衝剤として は、下記式 (I) :
[化 1]
Figure imgf000035_0001
(式中、 Rlはヒドロキシル基で置換されていてもよい、炭素数が 1〜4のアルキレン基 であり、 Xはスルホン酸基またはその塩であり、 Aは Oまたは YR2— N (ここで、 R2は R1と同義であり、 Yはスルホン酸基もしくはその塩またはヒドロキシル基である） )で表 される化合物が挙げられる。これらの緩衝剤は、核酸、外因性内分泌攪乱物質、抗 原等の特異的結合性を有する被検物質を安定に保持させて測定精度を向上させる といった利点を有する。
[0103] 本発明の好ましい態様によれば、アルキレン基がエチレン基であるのが好ましい。
このような緩衝剤の具体例としては、 2— [4— (2 ヒドロキシェチル） 1—ピぺラジ -ル]エタンスルホン酸（HEPES)、ピペラジン一 1, 4 ビス（2 エタンスルホン酸） ( PIPES)、ピペラジン一 1, 4 ビス（2 エタンスルホン酸）、セスキナトリウム塩（PIP ES sesquisodium)、および 2—モルフオリノエタンスルホン酸 (MES)が挙げられる [0104] 本発明の好ましい態様によれば、アルキレン基がプロピレン基であるのが好ましい。 このような緩衝剤の具体例としては、 3— [4— (2—ヒドロキシェチル） 1—ピぺラジ -ル]プロパンスルホン酸（EPPS)、 2 ヒドロキシ一 3— [4— (2 ヒドロキシェチル)一 1 -ピペラジ -ル]プロパンスルホン酸（HEPPSO)、 3 -モルフォリノプロパンスルホ ン酸（MOPS)、 2 ヒドロキシ一 3 モルフォリノプロパンスルホン酸（MOPSO)、お よびピぺラジン一 1, 4 ビス（2 ヒドロキシル 3 プロパンスルホン酸）（POPSO) が挙げられる。
[0105] 本発明の好ましい態様によれば、緩衝剤の濃度を l〜200mMとするのが好ましく 、より好ましくは l〜100mM、さらに好ましくは 10〜50mMである。
[0106] 上記緩衝溶液に用いる溶媒は、被検物質および作用電極の特性を阻害しな!ヽもの であれば限定されない。
[0107] 本発明の好ましい態様によれば、核酸、外因性内分泌攪乱物質、抗原等の特異的 結合性を有する被検物質を安定に保持させて測定精度を向上させるためには、緩衝 溶液の pHを 5, 0〜9. 0とするの力好ましく、より好ましくは 6. 0〜8. 0、さらに好まし くは 6. 5〜7. 5とする。
[0108] 上記緩衝溶液の用途は、本発明の方法に用いられる作用電極との接触下で使用 される溶液であれば限定されないが、好ましい用途としては、上述の通り、被検物質 を含有する試料液の溶媒、被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプ ローブ物質を含む溶液の溶媒、および作用電極な!/、し測定用セルの洗浄液等が挙 げられる。
実施例
[0109] 以下の例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれらの例に限 定されるものではない。
[0110] 例 1 (参者)
本例はシランカップリング剤を介した結合でも光電変換が可能なことを示すもので ある。具体的には、 FTOガラスおよび ITOガラスの導電面をシランカップリング剤で処 理して表面にアミノ基を導入した。このアミノ基と活性エステル基を持つ色素を反応さ せて、共有結合により色素を固定ィ匕した。これに励起光を照射して光電流を測定した 。その詳細は以下の通りである。
[Oi l 1] フッ素をドープした酸化スズ (F-SnO： FTO)コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、 U
2
膜、シート抵抗： 15 Ω /口）およびスズをドープした酸化インジウム（Sn- InO : IT〇）コー
2 ト硝子 (東洋精密工業株式会社製、 100 Ω /口）をアセトン、 0.1vol% Tween20を含む超 純水、さらに超純水中で各 15分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の 除去を行った。これを 5Mの水酸ィ匕ナトリウム水溶液中で 15分間振盪させた。その後 で水酸ィ匕ナトリウムの除去のために超純水中での 5分間の振盪を水を入れ替えて 3回 行った。ガラスを取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させて力 無水メタノールに 浸漬させて脱水した。
[0112] カップリング処理用の溶液は 95%メタノール 5%超純水を溶媒として、 3-ァミノプロピル トリメトキシシラン (APTMS)を 2vol%となるように加え、室温下で 5分間の攪拌を行って 調製した。
[0113] このカップリング処理用溶液に上記ガラスを浸漬させ、ゆっくりと 15分間振盪させた 。それからガラスを取り出し、メタノール中で 10回ほど振盪させて余剰なカップリング 処理用溶液を除く操作を、メタノールを 3回換えて行った。その後 110°Cで 30分間保 持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温下で冷却した後、これにスぺーサ用 穴あき (5mm角）テープを貼り、ピンセットの先を用いてテープ接着面に残存する空気 を除去した。さらにその上に 5mm角の大きさの開口部が形成されたシリコンシートを載 置して密着させた。
[0114] 続いて 50mM HEPES pH7.0に溶かして 100 μ Μに調整した活性エステル基を持つ口 ~~ダ ン (Tetramethylrhodamine Protein Labeling Kit, Molecular Probes社)、ま 7こ ίま 活性エステル 持つ Cy5 (Cy5 Mono-Reactive Dye Pack, Amersham Biosciences 社)を先に用意したガラス上の開口部に均一に行き渡るように 25 μ 1を充填した。そし て色素溶液中に気泡が入らな 、ようにプレパラートガラスで真上から蓋をして、湿ら せた紙などで蒸気圧が調製されたプラスチック容器に収容し、 37°Cで一晩インキュべ ートさせた。
[0115] インキュベート終了後プレパラートガラスを取り外し、超純水中で振盪させて洗浄し た（10分間 X 3セット)。その後で空気を吹き付けて残水を除去し、室温で乾燥させた [0116] こうして得られた作用電極をフロー型測定セル (装置の実施例 1)に組み込んだ。セ ル部分の構成は作用電極を白金対電極と対向させ、両電極間の接触による短絡を 防止し、電解液を充填するための空間を作り出すことを目的として、膜厚が 500 mの シリコンシートを挿入した。シリコンシートには 5mm角よりも十分大きい穴が空いており 、ここに送液された電解液が溜まり、作用電極上のプローブ固定化面が接触する構 造になっている。作用電極は電気的に接しているスプリングプローブを介して、白金 電極は端部に接続されたリード線を介してポテンシォスタツト (ビー ·エー ·エス株式会 ttALS Model832A)に接続した。電解液として、体積比が 7 : 3のァセトニトリルと炭酸 エチレンの混合溶媒にヨウ素 0.01Mとテトラプロピルアンモ-ゥムョーダイド 0.1Mを溶 解した混合液を用意した。この電解液を先に述べたフロー型測定セルに組み込まれ た作用電極と白金対電極の間に充填させた。続いてフロー型測定セルに固定した L ED (CCS株式会社，ローダミンの場合は HLV- 24GR- NR- 3W中心波長： 530nm 出 力： 67mW、 Cy5の場合は HLV-27-NR-R 中心波長： 627nm 出力： 67mW)を光源と して作用電極表面に照射して、作用電極と白金対電極の間に流れる電流を経時的 に測定した。測定は 180秒間行った力 光源の照射は電流の測定開始 60秒後から 60 秒間のみ実施した。観測した電流値は 120秒後の値から 180秒後の値を差し引くこと で補正を行った。
[0117] その結果、 FTO電極及び ITO電極を用いた場合の光電流値は、それぞれ図 22 (a) および (b)に示される通りであった。これらの図から、色素に由来する光電流はシラン カップリング剤を介した時の方力 介して ヽな 、時よりも大きくなることが確認できた。 このことからシランカップリング剤により色素の固定ィ匕量が増えたこと、およびシラン力 ップリング処理をした後でも電極の導電性が確保されて 、ることが分力つた。以上の こと力 シランカップリング処理を施した FTOガラスおよび ITOガラスは色素増感型バ ィォセンサの作用電極を構成する材料として利用可能であることを示すことが出来た
[0118] 例 2 (参考)
本例は相補的 DNAと非相補的 DNAの観測される電流値の差を示すものである。 具体的には、 FTOガラスをシランカップリング剤で処理して表面にアミノ基を導入した 。このアミノ基とプローブ DNAを静電的に結合させ、さらに紫外光を照射してプローブ を共有結合で電極上に固定化した。これと Cy5で標識したターゲット DNAとをハイプリ ダイゼーシヨンさせて力も励起光を照射して光電流を測定した。その詳細は以下の通 りである。
[0119] フッ素をドープした酸化スズ (F-Sn02： FTO)コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、 U膜、シート抵抗： 15 Ω /口）をアセトン、 0.1vol% Tween20を含む超純水、さらに超純 水中で各 15分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。こ れを 5Mの水酸ィ匕ナトリウム水溶液中で 15分間振盪させた。その後で水酸化ナトリウム の除去のために超純水中での 5分間の振盪を水を入れ替えて 3回行った。ガラスを取 り出して空気を吹き付けて残水を飛散させて力 無水メタノールに浸漬させて脱水し た。
[0120] カップリング処理用の溶液は 95%メタノール 5%超純水を溶媒として、 3-ァミノプロピル トリメトキシシラン (APTMS)を 2vol%となるように加え、室温下で 5分間の攪拌を行って 調製した。
[0121] このカップリング処理用溶液に上記ガラスを浸漬させ、ゆっくりと 15分間振盪させた 。それからガラスを取り出し、メタノール中で 10回ほど振盪させて余剰なカップリング 処理用溶液を除く操作を、メタノールを 3回換えて行った。その後 110°Cで 30分間保 持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温下で冷却した後、これにスぺーサ用 穴あき (5mm角）テープを貼り、ピンセットの先を用いてテープ接着面に残存する空気 を除去した。さらにその上に 5mm角の大きさの開口部が形成されたシリコンシートを載 置して密着させた。
[0122] 続いて 2 X SSCに溶かして 1 μ Μに調製したプローブ DNA(5，NH2-ACCTTCATCA AAAACATCATCATCC3 ' )を 95°Cで 5分間保持した後直ちに氷上に移して 10分間 保持して DNAを変性させ、先に用意したガラス上の開口部に均一に行き渡るように 25 IX 1を充填した。
[0123] これを 75°Cで 1時間保持して溶媒を蒸発させた後でシリコンシートを剥がし、 UVクロ スリンカ一（UVP社 CL-1000型）で 120mJの紫外光を照射して、プローブを固定化した 作用電極とした。
[0124] この作用電極を超純水中で 10回ほど振盪させて SSC成分 (NaClとクェン酸ナトリウム )を除く操作を、超純水を 2回換えて行った。それから沸騰水に 2分間浸漬させ、取り 出して力も空気を吹き付けて残水を飛散させた。続、て 4°Cの無水エタノールに 1分 間浸漬させて脱水し、空気を吹き付けて残エタノールを飛散させた。次に 5mm角の大 きさの開口部が形成されたシリコンシートを作用電極上に載置して密着させた。
[0125] 続いて 5 X SSC + 0.5%SDSに溶かして ΙΟηΜの濃度に調整した、プローブと相補的な DNA (5， GGATGATGATGTTTTTGATGAAGGT- Cy5- 3， )と、非相補的な DNA (5， T TGAGCAAGTTCAGCCTGGTTAAG-Cy5-3 ' )を 95°Cで 5分間保持した後直ちに氷 上に移して 10分間保持して DNAを変性させ、先に用意した作用電極上の開口部に それぞれ均一に行き渡るように 25 1を充填した。そして DNA溶液中に気泡が入らな V、ようにプレパラートガラスで真上力 蓋をして、湿らせた紙などで蒸気圧が調製され たプラスチック容器に収容し、 37°Cで一晩インキュベートさせた。
[0126] インキュベート終了後プレパラートガラスを取り外し、 37でに加温した2 33じ+ 0.1% SDSで作用電極を 2秒間ほど洗浄した。電極をスライドガラスに立てて以下の手順で 洗浄を行った。
(1) 2 X SSC + 0.2%SDS 室温 振盪 3分 X液を換えて 3回
(2) 0.2 X SSC + 0.2%SDS 常温 振盪 3分 X液を換えて 2回
(3) 0.2 X SSC + 0.2%SDS 37°C 振盪 10分 X液を換えて 2回
(4) 0.2 X SSC + 0.2%SDS 常温 振盪 3分 X I回
(5) 0.2 X SSC 常温 振盪 10回 X液を換えて 3回
(6)超純水 常温 振盪 10回 X液を換えて 2回
(7)空気を吹き付けて残水を除去
[0127] こうして得られた作用電極をフロー型測定セルに組み込んだ。セル部分の構成は 作用電極を白金対電極と対向させ、両電極間の接触による短絡を防止し、電解液を 充填するための空間を作り出すことを目的として、膜厚が 500 mのシリコンシートを 挿入した。シリコンシートには 5mm角よりも十分大きい穴が空いており、ここに送液さ れた電解液が溜まり、作用電極上のプローブ固定ィ匕面が接触する構造になっている 。作用電極は電気的に接しているスプリングプローブを介して、白金電極は端部に接 続されたリード線を介してポテンシォスタツト（ビ一'ェ一'エス株式会社 ALS Model83 2A)に接続した。電解液として、体積比力 7 : 3のァセトニトリルと炭酸エチレンの混合 溶媒にヨウ素 10mMとテトラプロピルアンモ-ゥムョーダイド lOOmMを溶解した混合液 を用意した。この電解液を先に述べたフロー型測定セルに組み込まれた作用電極と 白金対電極の間に充填させた。続いてフロー型測定セルに固定した LED (CCS株式 会社 HLV-27-NR-R中心波長は 627應)を光源として作用電極表面に照射して、作 用電極と白金対電極の間に流れる電流を経時的に測定した。測定は 180秒間行った 力 光源の照射は電流の測定開始 60秒後から 60秒間のみ実施した。観測した電流 値は 120秒後の値から 180秒後の値を差し引くことで補正を行った。
[0128] その結果、図 23に示されるように、プローブと相補的な DNAを反応させた時、標識 色素（Cy5)に由来する電流が観測された。一方非相補的な DNAを反応させた時は C y5に由来する電流は観測されな力つた。このことから前述したプローブ固定ィ匕法で作 製した DNAセンサは高感度で特異的であることを示すことが出来た。
[0129] 例 3
本例は金属ヨウ素を含む電解液と含まな!/、電解液の電流値につ!、ての差を示すも のであり、一塩基変換 (SNPs)の検出には金属ヨウ素を含まない方が優れることを示 す。具体的には、 FTOガラスをシランカップリング剤で処理して表面にアミノ基を導 入した。このアミノ基とプローブ DNAを静電的に結合させ、さらに紫外光を照射してプ ローブを共有結合で電極上に固定ィ匕した。これとローダミンで標識したターゲット DN Aとをハイブリダィゼーシヨンさせて力も励起光を照射して光電流を測定し、ターゲット の一塩基変異を検出した。その詳細は以下の通りである。
[0130] フッ素をドープした酸化スズ (F-Sn02： FTO)コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、 U膜、シート抵抗： 15 Ω /口）をアセトン、 0.1vol% Tween20を含む超純水、さらに超純 水中で各 15分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。こ れを 5Mの水酸ィ匕ナトリウム水溶液中で 15分間振盪させた。その後で水酸化ナトリウム の除去のために超純水中での 5分間の振盪を水を入れ替えて 3回行った。ガラスを取 り出して空気を吹き付けて残水を飛散させて力 無水メタノールに浸漬させて脱水し た。
[0131] カップリング処理用の溶液は 95%メタノール 5%超純水を溶媒として、 3-ァミノプロピル トリメトキシシラン (APTMS)を 2vol%となるように加え、室温下で 5分間の攪拌を行って 調製した。
[0132] このカップリング処理用溶液に上記ガラスを浸漬させ、ゆっくりと 15分間振盪させた 。それからガラスを取り出し、メタノール中で 10回ほど振盪させて余剰なカップリング 処理用溶液を除く操作を、メタノールを 3回換えて行った。その後 110°Cで 30分間保 持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温下で冷却した後、これにスぺーサ用 穴あき (5mm角）テープを貼り、ピンセットの先を用いてテープ接着面に残存する空気 を除去した。さらにその上に 5mm角の大きさの開口部が形成されたシリコンシートを載 置して密着させた。
[0133] 続いて 2 X SSCに溶力して 1 μ Μに調製したプローブ DNA (ターゲットと完全に相補 的な塩基配列を持つもの： 5'- NH2- AGGATGGGCCTCAGGTTCATGCCGC- 3'また はターゲットと相補的だが一塩基のみ異なる配列を持つもの： 5'-NH2-AGGATGGG CCTCGGGTTCATGCCGC-3')を 95°Cで 5分間保持した後直ちに氷上に移して 10分 間保持して DNAを変性させ、先に用意したガラス上の開口部に均一に行き渡るように 25 1を充填した。
[0134] これを 75°Cで 1時間保持して溶媒を蒸発させた後でシリコンシートを剥がし、 UVクロ スリンカ一（UVP社 CL-1000型）で 120mJの紫外光を照射して、プローブを固定化した 作用電極とした。
[0135] この作用電極を超純水中で 10回ほど振盪させて SSC成分 (NaClとクェン酸ナトリウム )を除く操作を、超純水を 2回換えて行った。それから沸騰水に 2分間浸漬させ、取り 出して力も空気を吹き付けて残水を飛散させた。続、て 4°Cの無水エタノールに 1分 間浸漬させて脱水し、空気を吹き付けて残エタノールを飛散させた。
[0136] 続いて 5 X SSC + 0.5%SDSに溶かして ΙΟηΜの濃度に調整した、ターゲット DNA(Rho - DP53- 1： 5し Rho- GCGGCATGAACCTGAGGCCCATCCT- 3，）を 95°Cで 5分間保持 した後直ちに氷上に移して 10分間保持して DNAを変性させ、先に用意した作用電極 上の開口部にそれぞれ均一に行き渡るように 10 1を充填した。そして DNA溶液中に 気泡が入らな 、ようにプレパラートガラスで真上力 蓋をして、湿らせた紙などで蒸気 圧が調製されたプラスチック容器に収容し、 37°Cで一晩インキュベートさせた。
[0137] インキュベート終了後プレパラートガラスを取り外し、超純水で作用電極を 2秒間ほ ど洗浄した。次に電極をスライドガラス洗浄用ラックに立てて以下の手順で洗浄を行 つた o
(1) 0.2 X SSC + 0.2% SDS 63°C 3分間浸漬（5Lの水槽を使用）
( 2)超純中水で振盪 10回 X液を換えて 2回
(3)空気を吹き付けて残水を除去
[0138] こうして得られた作用電極をフロー型測定セルに組み込んだ。セル部分の構成は 作用電極を白金対電極と対向させ、両電極間の接触による短絡を防止し、電解液を 充填するための空間を作り出すことを目的として、膜厚が 500 mのシリコンシートを 挿入した。シリコンシートには 5mm角よりも十分大きい穴が空いており、ここに送液さ れた電解液が溜まり、作用電極上のプローブ固定ィ匕面が接触する構造になっている 。作用電極は電気的に接しているスプリングプローブを介して、白金電極は端部に接 続されたリード線を介してポテンシォスタツト（ビ一'ェ一'エス株式会社 ALS Model83 2A)に接続した。電解液として次の二種類を用意した。
(1)電解液 A
ァセトニトリルを溶媒とし、テトラプロピルアンモ-ゥムョーダイド lOOmMを溶解した。
(2)電解液 B
ァセトニトリルを溶媒とし、ヨウ素 10mMとテトラプロピルアンモ-ゥムョーダイド 100m Mを溶解した。
[0139] 上記電解液を先に述べたフロー型測定セルに組み込まれた作用電極と白金対電 極の間にそれぞれ充填させた。続いてフロー型測定セルに固定した LED (CCS株式 会社 HLV-24GR-NR-3W中心波長： 530nm,出力： 67mW)を光源として作用電極表 面に照射して、作用電極と白金対電極の間に流れる電流を経時的に測定した。測定 は 180秒間行ったが、光源の照射は電流の測定開始 60秒後から 60秒間のみ実施し た。観測した電流値は 120秒後の値から 180秒後の値を差し引くことで補正を行った。
[0140] その結果、ヨウ素を含まない電解液 Aおよびヨウ素を含む電解液 Bにおける測定さ れた電流値は、それぞれ図 24 (a)および (b)に示される通りであった。図 24に示され るように、完全相補鎖を固定ィ匕した電極（図中 PM)と一塩基のみ異なる相補鎖を固定 化した電極（図中 SNP)を比較したところ、電解液 Aで測定した場合は平均電流値に 有意差のあることが統計学的に示された (N数: 5、危険率： 1%)。このことから色素増 感現象を利用した電流検出型チップで、核酸配列における一塩基変異を検出できる ことが立証された。
また電解液 Bで測定したところ、電解液 Aに比べて電流値が低ぐ平均電流値に有 意差はな力 た (N数 : 5、危険率：1%)。微弱電流を検出する際はヨウ素を含まない電 解液で測定を行う方がより望ましいことが確認できた。
[0141] 組
本例は、複数のスポットを用いて一塩基変換 (SNPs)を検出した例である。具体的 には、 FTOガラスをシランカップリング剤で処理して表面にアミノ基を導入した。プロ ーブ DNAを作用電極上に形成したスポットに担持し、この電極に、特定の位置の一 塩基が異なる 2つの 5'末端 Cy5標識ターゲット DNAをそれぞれノヽイブリダィゼーシヨン させ、特定の条件で洗浄した。作用電極の同一平面上に Ptを形成して対極としたセ ルへ組み込み、作用電極に励起光を照射して光電流を測定し、プローブ DNAごとの 光電流を比較した。その詳細は以下の通りである。
[0142] 雷極へのプローブの担持
フッ素をドープした酸化スズ (F-Sn02： FTO)コートガラス (エイアイ特殊硝子社製、 U膜、シート抵抗： 15 Ω /口）をアセトン、 0.1vol% Tween20を含む超純水、さらに超純 水中で各 15分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。こ れを 5Mの水酸ィ匕ナトリウム水溶液中で 15分間振盪させた。その後で水酸化ナトリウム の除去のために超純水中での 5分間の振盪を、水を入れ替えて 3回行った。ガラスを 取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させて力 無水メタノールに浸漬させて脱水 した。
[0143] カップリング処理用の溶液は 95%メタノール 5%超純水を溶媒として、 3-ァミノプロピル トリメトキシシラン (APTMS)を 2vol%となるように加え、室温下で 5分間の攪拌を行って 調製した。 [0144] このカップリング処理用溶液に上記ガラスを浸漬させ、ゆっくりと 15分間振盪させた 。それからガラスを取り出し、メタノール中で 10回ほど振盪させて余剰なカップリング 処理用溶液を除く操作を、メタノールを 3回換えて行った。その後 110°Cで 30分間保 持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温下で冷却した後、これにスぺーサ用 穴あきテープ（穴： φ =3πιπι Χ 6スポット、厚さ： 50 m)を貼った。このテープ上に φ =3 mmの大きさの開口部がスポット数分形成されたシリコンシート (厚さ： 1mm)を載置して 密着させた。
[0145] 続いて 2 X SSCに溶かして 1 Mに調製したプローブ DNA (プロリゴ社製 5 -NH2-A GGATGGGCCTCAGGTTCATGCCGC-3')を 95°Cで 5分間保持した後直ちに氷上 に移して 10分間保持して DNAを変性させ、各スポットの開口部に 7 1ずつ充填した。
[0146] これを 75°Cで 1時間保持して溶媒を蒸発させた後でシリコンシートを剥がし、 UVクロ スリンカ一（UVP社 CL-1000型）で 120mJの紫外光を照射して、プローブ DNAを固定 化した作用電極とした。
[0147] この作用電極を超純水中で 10回ほど振盪させて SSC成分 (NaClとクェン酸ナトリウム )を除く操作を、超純水を 2回換えて行った。それから沸騰水に 2分間浸漬させ、取り 出して力も空気を吹き付けて残水を飛散させた。続 、て 4°Cの無水エタノールに 1分 間浸漬させて脱水し、空気を吹き付けて残エタノールを飛散させた。
[0148] ハイブリダィゼーシヨンおよび洗浄
続 、て 5'末端に Cy5標識した 2種類のターゲット DNA、すなわちプローブと完全に相 補的なターゲット DNA- 1) (プロリゴ社製 5'- Cy5- GCGGCATGAACCTGAGGCCCA TCCT-3')と、その 5'末端から 13番目の Tが Gに代わったターゲット DNA-2) (プロリゴ 社製 5し Cy5- GCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCT- 3，）を別々に 5 X SSC + 0.5% SDSに溶力してそれぞれ 1 μ Μの濃度に調整した。これを 95°Cで 5分間保持した後、 それぞれ別々の 3スポットの開口部に 5 μ 1ずつ充填した。そして DNA溶液中に気泡が 入らな 、ようにプレパラートガラスで真上から蓋をして、湿らせた紙などで蒸気圧が調 製されたプラスチック容器に収容し、 37°Cで一晩インキュベートさせた。
[0149] インキュベート終了後プレパラートガラスを取り外し、電極をスライドガラスに立てて 、 63°Cに加温した 2 X SSC + 0.1%SDS中で 3分間振盪したのち、常温の超純水中で軽 く振盪した後、空気を吹き付けて残水を除去した。
[0150] 雌
こうして得られた作用電極をフロー型測定セル (装置の実施例 2)に組み込み、フロ 一型測定セル上には光源移動用ァリ式ステージ (駿河精機 (株)製 B05-41M)を取り 付けた。セル部分の構成は作用電極と白金対電極とを同一平面に配置し、両電極 間に接触による短絡を防止し、電解液を充填するための空間を作り出すことを目的と して、膜厚が 500 mのシリコンシートを挿入した。シリコンシートには全スポットが入る 十分大きい穴が空いており、ここに送液された電解液が溜まり、作用電極上に固定 化された DNAが接触する構造になっている。作用電極、対電極共に、電気的に接し て!、るスプリングプローブを介してポテンシォスタツト（ビ一'ェ一'エス株式会社 ALS Modl832A)に接続した。
[0151] 電解液として、ァセトニトリルにテトラプロピルアンモ-ゥムョーダイド lOOmMを溶解 した溶液を用意した。この電解液を先に述べたフロー型測定セルに充填させた。
[0152] 続いて光源移動用ァリ式ステージに固定した赤色 LED (CCS株式会社 HLV-27-N R-R中心波長は 627應)を光源として作用電極表面に照射して、作用電極と白金対 電極の間に流れる電流を経時的に測定した。光源はァリ式ステージを移動させ、各 スポットに光を照射した。測定は各スポット 180秒間行った力 光の照射は電流の測 定開始 60秒後から 60秒間のみ行った。観測した光電流は 120秒後の光電流値から 18 0秒後の光電流値を差し引くことで補正を行った。
[0153] その結果、ターゲット DNAごとの光電流値、その平均値、標準偏差 (N数は 3)は表 2 に示される通りであった。これら平均値の差の検定をおこなったところ、有意差がある と判定された (危険率 5%)。すなわち、ターゲット DNAの一塩基の違いを検出すること ができた。
[表 2]
Figure imgf000047_0001
[0154] 5
本例は、色素標識一本鎖 DNA固定化作用電極を作製した例である。
[0155] フッ素をドープした酸化スズ (F-SnO： FTO)コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、 U
2
膜、シート抵抗： 12 Ω /口、形状： 50mm X 26mm)をアセトン、 0.1vol% Tween20を含む 超純水、さらに超純水中で各 15分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機 物の除去を行った。これを 5Mの水酸ィ匕ナトリウム水溶液中で 15分間振盪させた。そ の後で水酸ィ匕ナトリウムの除去のために超純水中での 5分間の振盪を水を入れ替え て 3回行った。ガラスを取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させて力 無水メタノ ールに浸漬させて脱水した。
[0156] カップリング処理用の溶液は 95%メタノール 5%超純水を溶媒として、 3-ァミノプロピル トリメトキシシラン (APTMS)を 2vol%となるように加え、室温下で 5分間の攪拌を行って 調製した。
[0157] このカップリング処理用溶液に上記ガラスを浸漬させ、ゆっくりと 15分間振盪させた 。それからガラスを取り出し、メタノール中で 10回ほど振盪させて余剰なカップリング 処理用溶液を除く操作を、メタノールを 3回換えて行った。その後 110°Cで 30分間保 持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温下で冷却した後、 φ =1πιπιの大きさ の開口部が lmm間隔で 49スポット形成された PDMSシート（厚さ： 1.5mm)を載置して 密着させた。
[0158] 続いて 2 X SSCに溶かして 1 μ Μに調製したローダミン標識 ssDNA(30mer)を 95°Cで 5分間保持した後、直ちに氷上に移して 10分間保持して DNAを変性させ、先に用意 したガラス上の PDMSシートの 49開口部に 2 μ 1ずつ充填した。これを 75°Cで 1時間保 持して溶媒を蒸発させた後で PDMSシートを剥がし、 UVクロスリンカ一（UVP社 CL-10 00型)で 120mJの紫外光を照射して、ローダミン標識 ssDNAを固定ィ匕した作用電極と した。
[0159] この作用電極を 0.2%SDS溶液中で 15分間 X 3回浸透させ、その後超純水中で振盪 させて SSC成分 (NaClとクェン酸ナトリウム)を除く操作を行った。それから沸騰水に 2 分間浸漬させ、取り出して力 空気を吹き付けて残水を飛散させた。続いて 4°Cの無 水エタノールに 1分間浸漬させて脱水し、空気を吹き付けて残エタノールを飛散させ た。こうして得られた 49力所に DNAを固定ィ匕した作用電極の概略図を図 25に示す
[0160] 例 6
本例は光源が XY移動する機構を用いて、作用電極上の各スポット領域で光源を 停止させて光電流検出を行った一例である。
[0161] 図 14に示す光照射機構を有する装置に、例 5の方法で作製した作用電極を装着し 、ローダミン標識 ssDNA固定ィ匕領域で光源を停止させて光電流測定した。この時、光 源は光束径が lmm、波長 530nm、出力 50mWの緑色レーザーダイオードを用いた 。光照射時には対電極と作用電極の間にァセトニトリルに溶解した 0. 1Mテトラプロ ピルアンモ-ゥムョージドを充填した。
[0162] その結果は、図 26に示される通りであった。ここでは例 5で作製した 49スポットの固 定ィ匕 DNA領域の 1列のみの結果を示している。図 26から明らかなように、固定化 DN A領域由来の光電流値がそれぞれ分離された波形として検知されている。光電流値 の読み取りは、光照射期間中の任意の 1点を代表値することもでき、任意の複数の点 の平均値を代表値とすることもできる。いずれの場合でも、光照射期間のデータ取得 のタイミングを一定にしてデータを取得する方法が好ましい。
[0163] 例 7
本例は光源が XY移動する機構を用いて、作用電極上の各スポット領域で光源を 連続的に移動させながら光電流検出を行った一例である。
[0164] 図 14に示す光照射機構を有する装置に、例 5の方法で作製した作用電極を装着し 、ローダミン標識 ssDNA固定ィ匕領域を、光源を連続的に移動させながら光電流測定 した。この時、光源は光束径が lmm、波長 530nm、出力 50mWの緑色レーザーダ ィオードを用いた。光照射時には対電極と作用電極の間にァセトニトリルに溶解した 0. 1Mテトラプロピルアンモ-ゥムョージドを充填した。
[0165] その結果は、図 27に示される通りであった。ここでは例 5で作製した 49スポットの固 定ィ匕 DNA領域の 1列のみの結果を示している。図 27から明らかなように、固定化 DN A領域由来の光電流値がそれぞれ分離された波形として検知されている。光電流値 の読み取りは、光照射期間中の最高値を代表値とする方法が簡便である。
[0166] 例 8
本例はセルステージが XY移動する機構を用いて、作用電極上の各スポット領域で 光源を停止させて電流検出を行った一例である。
[0167] 図 15に示す光照射機構を有する装置に、例 5の方法で作製した作用電極を装着し 、ローダミン標識 ssDNA固定ィ匕領域で光源を停止させて光電流測定した。この時、光 源は光束径が lmm、波長 530nm、出力 50mWの緑色レーザーダイオードを用いた 。光照射時には対電極と作用電極の間にァセトニトリルに溶解した 0. 1Mテトラプロ ピルアンモ-ゥムョージドを充填した。
[0168] その結果は図 28に示される通りであった。ここでは例 5で作製した 49スポットの固 定ィ匕 DNA領域の 1列のみの結果を示している。図 28から明らかなように、固定化 DN A領域由来の光電流値がそれぞれ分離された波形として検知されている。光電流値 の読み取りは、光照射期間中の任意の 1点を代表値することもでき、任意の複数の点 の平均値を代表値とすることもできる。いずれの場合でも、光照射期間のデータ取得 のタイミングを一定にしてデータを取得する方法が好ましい。
[0169] 例 9
本例はセルステージが XY移動する機構を用いて、作用電極上の各スポット領域で 光源を連続的に移動させながら光電流検出を行った一例である。
[0170] 図 15に示す光照射機構を有する装置に、例 5の方法で作製した作用電極を装着し 、ローダミン標識 ssDNA固定ィ匕領域に光源を連続的に移動させながら光電流測定し た。この時、光源は光束径が lmm、波長 530nm、出力 50mWの緑色レーザーダイ オードを用いた。光照射時には対電極と作用電極の間にァセトニトリルに溶解した 0. 1Mテトラプロピルアンモニゥムョージドを充填した。
[0171] その結果は図 29に示される通りであった。ここでは例 5で作製した 49スポットの固 定ィ匕 DNA領域の 1列のみの結果を示している。図 29から明らかなように、固定化 DN A領域由来の光電流値がそれぞれ分離された波形として検知されている。光電流値 の読み取りは、光照射期間中の最高値を代表値とする方法が簡便である。
[0172] 例 10
本例は各種の電解質物質および非プロトン性溶媒を用いた電解液により一塩基多 型（SNPs)を検出した例である。
[0173] 本例では、 p53遺伝子の一塩基多型の検出に電解質物質である NPr4I (テトラプロ ピルアンモ-ゥムョージド）、チォ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、のいずれ力とァセ トニトリルを含む混合液を電解液として使用した。電解質物質の濃度は 0.2Mに調製し た。作用電極側には完全一致プローブ、一塩基変異鎖プローブおよび完全不一致 プローブを固定ィ匕した。それぞれの塩基配列は下記のとおりである。
完全一致（PM)プローブ： 5'- NH2- AGGATGGGCCTC GGTTCATGCCGC- 3' 一塩基変異鎖（SNP)プローブ： 5'- NH2- AGGATGGGCCTC£GGTTCATGCCGC - 3'
完全不一致（MM)プローブ： 5'- NH2- GCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCT- 3 これらのプローブとハイブリダィゼーシヨンさせるターゲット DNAの塩基配列は下記 のとおりである。
ターゲット DNA: 5しローダミン— GCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCT— 3'
[0174] フッ素をドープした酸化スズ (F-SnO： FT0)コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、 U
2
膜、シート抵抗： 12 Ω /口、形状： 50mm X 26mm)をアセトン、超純水中で各 15分間の 超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。これを 5Mの水酸ィ匕 ナトリウム水溶液中で 15分間振盪させた。その後水酸ィ匕ナトリウムの除去のために超 純水中での 5分間の振盪を水を入れ替えて 3回行い、ガラスを取り出して空気を吹き 付けて残水を飛散させた。
[0175] カップリング処理用の溶液は 95%メタノール 5%超純水を溶媒として、 3-ァミノプロピル トリメトキシシラン (APTMS)を 2vol%となるように加え、室温下で 5分間の攪拌を行って 調製した。 [0176] このカップリング処理用溶液に上記ガラスを浸漬させ、ゆっくりと 15分間振盪させた 。それからガラスを取り出し、メタノール中で 10回ほど振盪させて余剰なカップリング 処理用溶液を除く操作を、メタノールを 3回換えて行った。その後 110°Cで 30分間保 持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温下で冷却した後、 φ =3πιπιの大きさ の開口部が 9スポット形成された粘着性シール (厚さ： 0.5mm)を載置して密着させた。 続いて 1 μ Μに調製した完全一致鎖、一塩基変異鎖、完全不一致鎖のプローブ DNA (25mer)を 95°Cで 10分間保持した後、直ちに氷上に移して 10分間保持して DNAを変 性させ、先に用意したガラス上のシールの 9開口部に 5 1ずつ充填し、 95°Cで 10分保 持して溶媒を蒸発させた後で、 UVクロスリンカ一（UVP社 CL-1000型）で 120mJの紫 外光を照射して、プローブ DNAを固定化した（各プローブにっき、 3スポットずつ固定 化)。
[0177] その後シールをはがし、 0.2%SDS溶液中で 15分間 X 3回振盪させ、超純水を 3回 入れ替えて濯いだ。それから沸騰水に 2分間浸漬させ、取り出して力も空気を吹き付 けて残水を飛散させた。続いて 4°Cの無水エタノールに 1分間浸漬させて脱水し、空 気を吹き付けて残エタノールを飛散させた。
[0178] その後、 ΙΟΟηΜに調製したターゲット DNAを含む 5 X SSC、 0.5%SDS溶液を、プロ一 ブを固定した電極にのせてカバーガラスで密閉した状態で 37°C · 10時間保温した。 それから室温の 2 X SSC中でカバーガラスをはずし、電極をラックに立て、 40°Cの 2 X SSC、 0.2%SDS溶液中で 30分間振とうした後、水で 2回すすぎ電極を乾燥させた。
[0179] こうして得られた作用電極を測定セルに組み込み、測定セル上には光源自動移動 用 XYステージを取り付けた。セル部分の構成は作用電極と白金対電極とを対向させ 、両電極間に接触による短絡を防止し、電解液を充填するための空間を作り出すこと を目的として、膜厚が 500 μ mのシリコンシートを挿入した。シリコンシートには全スポッ トが入る十分大きい穴が空いており、ここに送液された電解液が溜まり、作用電極上 に固定ィ匕された DNAが接触する構造になっている。作用電極、対電極共に、電気的 に接しているスプリングプローブを介して高感度な電流計に接続した。
[0180] 続いて自動移動用 XYステージに固定した光源により作用電極裏面の上方力も光を 照射し、作用電極と白金対電極の間に流れる電流を経時的に測定した。作用電極の 上方には FTO基板上のスポットと同形状の遮光部材を設けて、隣接するスポットへの 光照射を防止すると同時に、光の無照射スポットを設けた。測定はスポットを順次走 查し、同時にスポットでの電流出力をバソコンに接続された高感度電流計を介してパ ソコンに記'隐した。
[0181] その結果は図 30に示される通りであった。図 30の結果から明らかなように、非プロト ン系の電解液を用いても、一塩基多型（SNPs)を光電流値の差として検出すること ができた。
[0182] 例 11
本例は各種濃度のァセトニトリル含有電解液を用 Vヽて一塩基多型（SNPs)を検出 した例である。
[0183] 本例では、 p53遺伝子の一塩基多型の検出に電解質物質として 0.2Mの NPr4I (テ トラプロピルアンモ-ゥムョージド）と各濃度のァセトニトリルと水を含む混合液を電解 液として使用したこと以外は、例 10と同様にして測定を行った。
[0184] その結果は図 31に示される通りであった。図 31の結果から明らかなように、ァセトニ トリルの濃度が 10〜100%の電解液を用いても、一塩基多型（SNPs)を光電流値の 差として検出することができた。
[0185] 例 12
本例は、色素標識一本鎖 DNA固定化作用電極を作製した例である。
[0186] フッ素をドープした酸化スズ (F-SnO： FTO)コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、 U
2
膜、シート抵抗： 12 Ω /口、形状： 50mm X 26mm)をアセトン、超純水中で各 15分間の 超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。これを 5Mの水酸ィ匕 ナトリウム水溶液中で 15分間振盪させた。その後水酸ィ匕ナトリウムの除去のために超 純水中での 5分間の振盪を水を入れ替えて 3回行った。ガラスを取り出して空気を吹 き付けて残水を飛散させて力 無水メタノールに浸漬させて脱水した。
[0187] カップリング処理用の溶液は 95%メタノール 5%超純水を溶媒として、 3-ァミノプロピル トリメトキシシラン (APTMS)を 2vol%となるように加え、室温下で 5分間の攪拌を行って 調製した。
このカップリング処理用溶液に上記ガラスを浸漬させ、ゆっくりと 15分間振盪させた 。それからガラスを取り出し、メタノール中で 10回ほど振盪させて余剰なカップリング 処理用溶液を除く操作を、メタノールを 3回換えて行った。その後 110°Cで 30分間保 持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温下で冷却した後、 φ =3πιπιの大きさ の開口部が 9スポット形成された粘着性シール (厚さ： 0.5mm)を載置して密着させた。 続いて濃度調整した（100 nM、 10nM、 OnM)ローダミン標識 ssDNA(25mer)を 95°Cで 1 0分間保持した後、直ちに氷上に移して 10分間保持して DNAを変性させ、先に用意 したガラス上のシールの 9開口部に 5 μ 1ずつ充填し、 95°Cで 10分保持して溶媒を蒸 発させた後で、 UVクロスリンカ一（UVP社 CL-1000型）で 120mJの紫外光を照射して、 標識 ssDNAを固定ィ匕した。
[0188] その後シールをはがし、 0.2%SDS溶液中で 15分間 X 3回振盪させ、超純水を 3回 入れ替えて濯いだ。それから沸騰水に 2分間浸漬させ、取り出して力も空気を吹き付 けて残水を飛散させた。続いて 4°Cの無水エタノールに 1分間浸漬させて脱水し、空 気を吹き付けて残エタノールを飛散させた。
[0189] 例 13
本例は水と各電解質物質を用いた電解液により色素標識一本鎖 DNAを検出した 例である。
[0190] 本例では、ローダミン標識 ssDNA(30mer)の検出に電解質物質である Nal、 KI、 Cal
2
、 Lil、 NH I、 NPr I (テトラプロピルアンモ-ゥムョージド）、チォ硫酸ナトリウム、亜硫
4 4
酸ナトリウム、のいずれかと水を含む混合液を電解液として使用した。電解質濃度は
0. 2Mである。検出手順は図 2に示す光照射機構を有する装置に、例 12の方法で作 製した作用電極を装着し、ローダミン標識 ssDNA固定ィ匕領域で光源を停止させて光 電流測定した。このとき、固定化する ssDNAの濃度は OnM、 10nM、および ΙΟΟηΜ の三種類とした。
[0191] その結果を図 32に示される通りであった。図 32の結果から明らかなように、検討し たいずれの電解質でも、 ssDNA固定化量に依存して光電流の増加が認められ、使用 可能であることが明らかになった。
[0192] 例 14
本例は NPr 1 (テトラプロピルアンモ-ゥムョージド）と水を含む混合液を電解液とし て使用し、一塩基多型（SNPs)を検出した例である。
[0193] 本例では、 p53遺伝子の一塩基多型の検出に電解質物質として 0.2Mの NPr 1 (テ
4 トラプロピルアンモ-ゥムョージド）と水の混合液を電解液として使用したこと以外は、 例 10と同様にして測定を行った。
[0194] その結果は図 33に示される通りであった。図 33の結果から明らかなように、水溶液 系の電解液を用いても、一塩基多型（SNPs)を光電流値の差として検出することが できた。
[0195] 例 15
本例は色素増感型バイオセンサ技術により色素標識蛋白質を検出した例である。
[0196] FTOガラスのシランカップリング処理
フッ素をドープした酸化スズ (F- SnO： FTO)コートガラス (エイアイ特殊硝子社製、 U
2
膜、シート抵抗： 15 Ω /口）をアセトン、 Tween20を 0.1vol%含む超純水、さらに超純水 中で各 15分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。次 に 5Mの水酸ィ匕ナトリウム水溶液中で 15分間振盪させ、その後で水酸ィ匕ナトリウムの 除去のために超純水中での 5分間の振盪を、水を入れ替えて 3回行った。超純水から FTOガラスを取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させて力 無水メタノールに浸 漬させて脱水させた。メタノールも空気を吹き付けることで飛散させて FTOガラスを乾 燥させた。
カップリング処理用の溶液は 95vol%メタノール 5vol%超純水の混合溶液に 3-ァミノ プロピルトリメトキシシラン (APTMS： AVOCADO社製）を 2vol%となるようにカロえ、室温 下で 5分間の攪拌を行って調製した。
このカップリング処理用溶液に上記 FTOガラスを浸漬させ、ゆっくりと 15分間振盪さ せた。 FTOガラスを取り出して、無水メタノール中で 10回ほど振盪させて余剰なカップ リング処理用溶液を除く操作を、無水メタノールを入れ替えて 3回行った。その後 110 °Cで 30分間保持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温放置による徐冷後、こ れにスぺーサ用穴あきテープ（穴： φ =3mm X 6スポット、シートの厚み： 50 m)を貼つ た。
[0197] オリゴ DNAの固定化 5，末端にピオチンを標識したオリゴ DNAまたは未標識のオリゴ DNA (プロリゴ社製： 配列は 5，-TggCTCCTgACCTggAgTCTTCCAgTgTgA-3，）を超純水に溶かして 1 μ Μとし、 95°Cで 5分間保持して DNAを変性させ、テープ開口部 (スポット電極）に 7 μ 1ず つ滴下した。これを 95°Cで 10分間保持させて乾燥させた後に UVクロスリンカ一 (UVP 社 CL-1000型)で 120mJの紫外光を照射して、オリゴ DNA固定ィ匕作用電極とした。 この作用電極を 0.2%SDS水溶液中で 15分間振盪させる洗浄を、液を 3回換えて行つ た。続いて超純水中で 10回ほど振盪させる洗浄を、超純水を 3回換えて行うことで SD Sの除去を行った。その後で沸騰水に 2分間浸漬させ、取り出して力 空気を吹き付 けて残水を飛散させた。さらに 4°Cの無水エタノールに 1分間浸漬させて脱水し、空気 を吹き付けて残エタノールを飛散させた。
[0198] ローダミン標識带白皙のインキュベートおよび洗浄
Molecular Probes社から市販されて!、るキットを用いてローダミン標識を行ったストレ プトアビジン（標識比： 3.1)を緩衝液（10mM HEPES pH7.4 + 150mM NaCl + 0.05% T ween20)により 10ug/mlになるよう希釈を行った。
この蛋白質溶液 7 μ 1をスポット電極に滴下してカゝらプレパラートガラスを被せて 37°C で 1時間インキュベートさせた。
インキュベート終了後にプレパラートガラスを取り外し、作用電極をラックに立てて上 記緩衝液を満たした染色バットに沈め、 10回ほど振盪させる洗浄を、緩衝液を 3回換 えて行った。なお作用電極は測定直前まで上記緩衝液に浸漬させてぉ 、た。
[0199] 雌
こうして得られた作用電極は測定直前に超純水中で軽く振盪させ、次に空気を吹き 付けて残水を飛散させて力 フロー型測定セルに組み込んだ。セルは作用電極と白 金対電極とを対向に配置し、その間に膜厚 500 mのシリコンシートを挿入した。シリ コンシートには全てのスポット電極が入るよう十分大きい穴が空いており、この部分に 送液された電解液が充填されることでスポット電極が電解液と接触する構造になって いる。電解液は 1Mのチォ硫酸ナトリウムと 0.1Mの食塩水の混合溶液を用いた。作用 電極と白金対電極はそれぞれ電気的に接して！/ヽるスプリングプローブを介して電流 計 (ADVANTEST社製： R8240)に接続した。 このフロー型測定セルに、各スポット毎に対応した開口部を持つ遮光部材を被せ、 下記電解液を充填させてから、その上に設置された可動式のレーザー光源（中心波 長： 532nm)で各スポットを順次照射して、作用電極と白金対電極との間に流れる光 電流を経時的に測定した。各スポットを 5秒間照射して、 5秒目の光電流値からベース 電流値を差し引くことで補正を行った。
[0200] その結果は、図 34に示される通りであった。図 34の結果から明らかなように、色素 増感型バイオセンサの技術を用いて、蛋白質の検出が可能であることを実証すること ができた。
[0201] 例 17
本例は水と各種の電解質物質を用いた電解液により色素標識一本鎖 DNAを検出 した例である。
[0202] 本例では、ローダミン標識 ssDNA(30mer)の検出に電解質物質であるヒドロキノン、 トリエタノーノレアミン、フェリシアンィ匕カリウム、 NPr 1 (テトラプロピルアンモ-ゥムョー
4
ジド）、のいずれかと水を含む混合液を電解液として使用した。電解質濃度は 0. 2M である。検出手順は図 14に示す光照射機構を有する装置に、例 12の方法で作製し た作用電極を装着し、ローダミン標識 ssDNA固定ィ匕領域で光源を停止させて光電流 測定した。
[0203] ヒドロキノン、トリエタノールァミン、 NPr I、のいずれかと水を含む混合液を電解液と
4
して使用した際に得られた光電流波形は、図 35に示される通りであった。図 35で得 られた光電流をデータ処理した結果を図 36に、フェリシアンィ匕カリウムと水を含む混 合液を電解液として使用した際に得られた光電流波形を図 37に示す。図 35および 3 6の結果よりヒドロキノン、 NPr Iを用いた場合、 ssDNA固定ィ匕量に依存して光電流の
4
増加が認められた力 トリエタノールアミンを用いた場合、微弱な光電流しか検出でき なかった。ただし、図 35から明らかなように、ヒドロキノンを用いた場合には電流が安 定せず、し力もノイズ電流も高いため、ヒドロキノンは高精度な検出には適切ではない 。また、図 37に示されるように、フェリシアンィ匕カリウムを用いた場合は電流が安定せ ず、光電流もほとんど検出されな力つた。これらの結果から、測定に使用したヒドロキ ノン、トリエタノールァミン、フェリシアン化カリウム、 NPr 1 (テトラプロピルアンモ-ゥム ョージド）の各種電解質の内、 NPr 1 (テトラプロピルアンモ-ゥムョージド）のみが高
4
精度な検出に適していることが判明した。

Claims

請求の範囲
[1] 増感色素が結合した被検物質がプローブ物質を介して固定された作用電極を、対 電極と共に電解質媒体に接触させ、前記作用電極に光を照射して前記増感色素を 光励起させ、光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電 極と対電極との間に流れる光電流を検出することを含んでなる被検物質の特異的検 出方法であって、
前記作用電極が、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電 子受容物質を含んでなる電子受容層を有し、この電子受容層の表面に前記プロ一 ブ物質が担持され、
前記電子受容物質が、前記増感色素の最低非占有分子軌道 (LUMO)のエネル ギー準位よりも低いエネルギー準位を有する酸ィ匕物半導体であり、
前記電解質媒体が、酸化された状態の増感色素に電子を供給しうる塩からなる電 解質と、非プロトン性溶媒およびプロトン性溶媒力 選択される少なくとも一種の溶媒 とを含んでなる方法。
[2] 前記電解質媒体の還元電位が、前記増感色素の最高被占有分子軌道 (HOMO) のエネルギー準位よりも高ぐ前記電子受容物質の伝導帯のエネルギー準位よりも 低い、請求項 1に記載の方法。
[3] 前記電解質が、 Iを含まな!/ヽヨウ化物、 Brを含まな ヽ臭化物、チォ硫酸塩、および
2 2
亜硫酸塩力もなる群力も選択される少なくとも一種である、請求項 1または 2に記載の 方法。
[4] 前記電解質が、 Iを含まな!/、ヨウ化物である、請求項 3に記載の方法。
2
[5] 前記ヨウ化物力 テトラアルキルアンモニゥムョーダイドである、請求項 4に記載の方 法。
[6] 前記電解質が、チォ硫酸塩および亜硫酸塩カゝらなる群カゝら選択される少なくとも一 種である、請求項 3に記載の方法。
[7] 前記電解質がチォ硫酸塩であり、該チォ硫酸塩がチォ硫酸ナトリウムである、請求 項 6に記載の方法。
[8] 前記電解質が亜硫酸塩であり、該亜硫酸塩が亜硫酸ナトリウムである、請求項 6〖こ 記載の方法。
[9] 前記溶媒が、非プロトン性溶媒である、請求項 1〜8のいずれか一項に記載の方法
[10] 前記溶媒が、プロトン性溶媒である、請求項 1〜8のいずれか一項に記載の方法。
[11] 前記溶媒が、非プロトン性溶媒とプロトン性溶媒の混合物である、請求項 1〜8のい ずれか一項に記載の方法。
[12] 前記非プロトン性溶媒が、ァセトニトリル (CH CN)である、請求項 1〜9および 11
3
の!、ずれか一項に記載の方法。
[13] 前記プロトン性溶媒が、水である、請求項 1〜8および 10〜12のいずれか一項に 記載の方法。
[14] 前記電子受容層の表面がカチオンィ匕処理されてなる、請求項 1〜13のいずれか一 項に記載の方法。
[15] 前記プローブ物質を電子受容層に担持せしめるために、プローブ物質を含む溶液 を前記作用電極に接触させる、請求項 1〜14のいずれか一項に記載の方法。
[16] 前記作用電極と対電極とを電解質媒体に接触させる前に、前記作用電極を洗浄液 で洗浄する工程をさらに含んでなる、請求項 1〜15のいずれか一項に記載の方法。
[17] 前記被検物質が予め前記増感色素で標識されてなる、請求項 1〜16のいずれか 一項に記載の方法。
[18] 前記被検物質が一本鎖の核酸であり、前記プローブ物質が前記核酸に対して相補 性を有する一本鎖の核酸である、請求項 1〜17のいずれか一項に記載の方法。
[19] 前記相補性を有する核酸が、前記核酸に対して 15bp以上の相補性部分を有する
、請求項 18に記載の方法。
[20] 前記被検物質が予め前記増感色素で標識されてなる核酸であり、前記被検物質 1 分子にっき前記増感色素が 1つ以上標識されて 、る、請求項 18または 19に記載の 方法。
[21] 前記プローブ物質に前記被検物質を結合させる手段が、増感色素の共存下、被検 物質を含む試料液を作用電極に接触させることであり、更に前記試料液が、予め前 記増感色素で標識されてなる、前記被検物質と特異的に結合可能な媒介物質をさら に含んでなり、該媒介物質と前記被検物質との結合物が前記プローブ物質に特異 的に結合する、請求項 1〜16のいずれか一項に記載の方法。
[22] 前記被検物質がリガンドであり、前記媒介物質が受容体蛋白質分子であり、前記プ ローブ物質が二本鎖の核酸である、請求項 21に記載の方法。
[23] 前記被検物質が外因性内分泌攪乱物質である、請求項 21または 22に記載の方 法。
[24] 前記光電流を検出する工程が、電流値または電気量を測定し、得られた電流値ま たは電気量力も前記試料液中の被検物質濃度を算出する、請求項 1〜23のいずれ か一項に記載の方法。
[25] 得られた電流値または電気量から前記試料液中の被検物質濃度を算出する工程 力 予め作成された被検物質濃度と電流値または電気量との検量線と、得られた電 流値または電気量とを対比することにより行われる、請求項 24に記載の方法。
[26] 前記プローブ物質に前記被検物質を結合させる手段が、増感色素の共存下、被検 物質を含む試料液を作用電極に接触させることであり、更に前記試料液が、前記増 感色素で標識されていない、前記プローブ物質に特異的に結合可能な第二の被検 物質をさらに含んでなり、それにより、前記被検物質および第二の被検物質を前記プ ローブ物質に競合させて特異的に結合させ、そして、前記光電流を検出する工程が 、電流値または電気量を測定し、得られた電流値または電気量から前記試料液中の 第二の被検物質濃度を算出することをさらに含んでなる、請求項 24に記載の方法。
[27] 前記得られた電流値または電気量から前記試料液中の第二の被検物質濃度を算 出する工程が、予め作成された第二の被検物質濃度と電流値または電気量との検 量線と、得られた電流値または電気量とを対比することにより行われる、請求項 26に 記載の方法。
[28] 前記被検物質および前記第二の被検物質が抗原であり、前記プローブ物質が抗 体である、請求項 26または 27に記載の方法。
[29] 前記第二の被検物質が、前記被検物質よりも前記プローブ物質に特異的に結合し やす!/ヽ性質を有する、請求項 26〜28の ヽずれか一項に記載の方法。
[30] 前記電子受容物質が、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジ ゥム、酸化タングステン、酸ィ匕タンタル、およびチタン酸ストロンチウム力もなる群から 選択される少なくとも一種を含んでなる、請求項 1〜29のいずれか一項に記載の方 法。
[31] 前記電子受容物質が酸ィ匕チタンまたはチタン酸ストロンチウムである、請求項 30に 記載の方法。
[32] 前記電子受容物質力インジウム-スズ複合酸ィ匕物 (ITO)またはフッ素がドープされ た酸化スズ (FTO)である、請求項 30に記載の方法。
[33] 前記作用電極が導電性基材をさらに含んでなり、前記電子受容層が該導電性基 材上に形成されてなる、請求項 1〜32のいずれか一項に記載の方法。
[34] 前記増感色素が金属錯体色素または有機色素である、請求項 1〜33のいずれか 一項に記載の方法。
[35] 前記増感色素が、金属フタロシアニン；クロロフィルまたはその誘導体；へミン、ルテ ユウム、オスミウム、鉄及び亜鉛の錯体;メタルフリーフタロシアニン、 9-フエ-ルキサ ンテン系色素、シァニン系色素、メタロシアニン系色素、キサンテン系色素、トリフエ二 ノレメタン系色素、アタリジン系色素、ォキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン 系色素、口ダシァニン系色素、ポリメチン系色素、およびインジゴ系色素からなる群か ら選択される少なくとも一種である、請求項 34に記載の方法。
[36] 前記増感色素が、 Cy3、 Cy5、 Cy5.5、 Cy7、 Cy7.5、 Cy9、 FAM、 FITC、 HEX, Rhoda mine、 Rhodamine— Green、 R0X、 TET、 TEXAS RED、 Beckman Dyes2、 Beckman Dye s3、 Beckman Dyes4、フルォレセイン、およびアレクサフルオール（Alexa Fluor)色素 力もなる群力も選択される少なくとも一種である、請求項 34に記載の方法。
[37] 前記被検物質が二種以上存在し、前記各被検物質が互いに異なる波長の光で励 起可能な異なる増感色素で標識され、各増感色素毎に異なる波長の光を照射するこ とにより、前記各被検物質を個別に検出する、請求項 1〜36のいずれか一項に記載 の方法。
[38] 前記作用電極上に前記プローブ物質が互いに分離された複数の領域毎に区分さ れて担持されてなり、前記光照射が各領域に対して個別に行われる、請求項 1〜37 の!、ずれか一項に記載の方法。
[39] 前記電子受容層が前記導電性基材の全面にわたって形成されてなり、前記導電 性基材全体を流れる光電流を検出する、請求項 38に記載の方法。
[40] 前記作用電極が絶縁基板をさらに備えてなり、該絶縁基板上に、前記導電性基材 および前記電子受容層からなるスポットが、互いに分離された複数の領域毎に区分 されて形成されてなり、該各領域の導電性基材毎に流れる光電流を個別に検出する
、請求項 1〜36のいずれか一項に記載の方法。
[41] 前記作用電極が絶縁基板をさらに備えてなり、該絶縁基板上に、前記電子受容層 力 なるスポットが、互いに分離された複数の領域毎に区分されて形成されてなり、 該各領域の電子受容層毎に流れる光電流を個別に検出する、請求項 1〜36のいず れか一項に記載の方法。
[42] 前記作用電極上の互いに分離された複数の領域の各領域に複数種類のプローブ 物質が担持させることにより、複数の試料液の測定を同時に行う、請求項 38〜41の
V、ずれか一項に記載の方法。
[43] 前記作用電極上の互いに分離された複数の領域の各領域毎に異なるプローブ物 質が担持させることにより、複数種類の被検物質の測定を同時に行う、請求項 38〜4
1のいずれか一項に記載の方法。
[44] 前記光が紫外線を実質的に含まない、請求項 1〜43のいずれか一項に記載の方 法。
[45] 前記光の照射が、紫外線を除去する手段を介して行われる、請求項 1〜43のいず れか一項に記載の方法。
[46] 前記紫外線を除去する手段が、光学フィルタまたは分光器である、請求項 45に記 載の方法。
[47] 前記光が、レーザ、無機エレクト口ルミネッセンス (EL)素子、および有機エレクト口 ルミネッセンス (EL)素子、発光ダイオード (LED)からなる群から選択される少なくと も一つの光源力も放出された光である、請求項 44〜46の 、ずれか一項に記載の方 法。
[48] 請求項 1〜47のいずれか一項に記載される方法において作用電極として用いられ る電極であって、 導電性基材と、
該導電性基材上に形成される、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を 受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層と、
を備えた、電極。
[49] 前記電子受容層上に担持される、前記被検物質と直接または間接的に特異的に 結合可能なプローブ物質をさらに備えた、請求項 48に記載の電極。
[50] 前記電子受容物質が、前記増感色素の最低非占有分子軌道 (LUMO)のヱネル ギー準位よりも低 、エネルギー準位を有する物質である、請求項 48または 49に記載 の電極。
[51] 前記電子受容物質が、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジ ゥム、酸化タングステン、酸ィ匕タンタル、およびチタン酸ストロンチウム力もなる群から 選択される少なくとも一種を含んでなる、請求項 48〜50のいずれか一項に記載の電 極。
[52] 前記電子受容物質が酸ィ匕チタンまたはチタン酸ストロンチウムである、請求項 48〜
50の!、ずれか一項に記載の電極。
[53] 前記電子受容物質力インジウム-スズ複合酸ィ匕物 (ITO)またはフッ素がドープされ た酸化スズ (FTO)である、請求項 48〜50のいずれか一項に記載の電極。
[54] 前記電子受容層が多孔性または表面に凹凸構造を有する、請求項 48〜50のいず れか一項に記載の電極。
[55] 前記導電性基材が透明である、請求項 48〜54のいずれか一項に記載の電極。
[56] 前記プローブ物質が、前記電子受容層上の互いに分離された複数の領域毎に区 分されて担持されてなる、請求項 48〜55の 、ずれか一項に記載の電極。
[57] 前記電子受容層が前記導電性基材の全面にわたって形成され、また前記導電性 基材にリード線が接続されてなる、請求項 56に記載の電極。
[58] 絶縁基板をさらに備えてなり、該絶縁基板上に、前記導電性基材および前記電子 受容層からなるスポットが、互いに分離された複数の領域毎に区分されて形成されて なり、該各領域の導電性基材毎に個別にリード線が接続されてなる、請求項 57に記 載の電極。
[59] 請求項 1〜47のいずれか一項に記載の被検物質の特異的検出方法に用いられる 測定用セルであって、
請求項 48〜58のいずれか一項に記載の作用電極と、
対電極と、
を備えた、測定用セル。
[60] 前記作用電極と前記対電極との間に挿入されるスぺーサをさらに備えた、請求項 5
9に記載の測定用セル。
[61] 請求項 1〜47のいずれか一項に記載の被検物質の特異的検出方法に用いられる 測定装置であって、
請求項 59または 60に記載される測定用セルと、
前記作用電極の表面に光を照射する光源と、
前記作用電極と前記対電極との間を流れる電流を測定する電流計と
を備えた、測定装置。
[62] 前記光源が、増感色素の種類に応じて異なる波長の光を照射可能な複数の光源 を備えた、請求項 61に記載の装置。
[63] 前記光源が、波長選択手段をさらに備えてなり、増感色素の種類に応じて異なる波 長の光を照射可能とされてなる、請求項 61に記載の装置。
[64] 前記光源が、紫外線を実質的に含まない光を放出する光源である、請求項 61〜6
3の!、ずれか一項に記載の装置。
[65] 前記光源と前記作用電極との間に、紫外線を除去する手段をさらに備えた、請求 項 61〜63のいずれか一項に記載の装置。
[66] 前記紫外線を除去する手段が、光学フィルタまたは分光器である、請求項 65に記 載の装置。
[67] 前記光源が、レーザ、無機エレクト口ルミネッセンス (EL)素子、および有機エレクト 口ルミネッセンス (EL)素子、発光ダイオード (LED)からなる群から選択される少なく とも一つである、請求項 61〜63のいずれか一項に記載の装置。
[68] 前記光源があらかじめ複数個設けられてなり、かつ前記測定装置が、該複数個の 光源を切り替えて照射する光照射機構をさらに備えてなる、請求項 61〜67のいずれ か一項に記載の装置。
[69] 前記測定用セル中の作用電極に対し、前記光源が XY方向へ移動することによつ て、作用電極上の任意の領域に光照射する光照射機構をさらに備えてなる、請求項
61〜67のいずれか一項に記載の装置。
[70] XY移動時に光源が、前記増感色素が結合した被験物質がプローブ物質を介して 固定された作用電極の領域を照射する際に停止する、請求項 69に記載の装置。
[71] XY移動時に光源が、前記増感色素が結合した被験物質がプローブ物質を介して 固定された作用電極の領域を連続的に移動する、請求項 69に記載の装置。
[72] 前記光源が固定され、該固定された光源に対し、前記測定用セルが XY方向へ移 動することによって、作用電極上の任意の領域に光照射する光照射機構をさらに備 えてなる、請求項 61〜67のいずれか一項に記載の装置。
[73] XY移動時に測定用セルが、前記増感色素が結合した被験物質がプローブ物質を 介して固定された作用電極の領域を照射する際に停止する、請求項 72に記載の装 置。
[74] XY移動時に測定用セルが、前記増感色素が結合した被験物質がプローブ物質を 介して固定された作用電極の領域を連続的に移動する、請求項 72に記載の装置。
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