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WO2007032316A1 - 微小流路チップ - Google Patents

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WO2007032316A1
WO2007032316A1 PCT/JP2006/317996 JP2006317996W WO2007032316A1 WO 2007032316 A1 WO2007032316 A1 WO 2007032316A1 JP 2006317996 W JP2006317996 W JP 2006317996W WO 2007032316 A1 WO2007032316 A1 WO 2007032316A1
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WO
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capillary
microchannel chip
substrate
capillaries
grooves
Prior art date
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Application number
PCT/JP2006/317996
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ryuichi Sekizawa
Hideaki Hisamoto
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METABOSCREEN CO Ltd
Original Assignee
METABOSCREEN CO Ltd
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Publication date
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Priority to CN2006800336124A priority patent/CN101263392B/zh
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Definitions

  • the present invention relates to a microchannel chip capable of allowing a fluid to pass through a plurality of minute capillaries and performing a necessary function by chemistry modification in the capillaries to detect data.
  • a microchannel is formed on a glass or plastic substrate using a microfabrication technique, and a necessary molecule or other biochemistry such as reaction or separation is performed by a functional molecule fixed in the channel.
  • a functional molecule fixed in the channel For example, an integrated chip called / z TAS (Micro Total Analysis System) is known as a chip for performing scientific operation and detection.
  • nucleic acids including DNA fragments of various sizes on a microscale, or amino acid 'peptide' proteins
  • a microchip for capillary gel electrophoresis used for separating organic molecules, metal ions, etc. (see, for example, Patent Document 1).
  • grooves having a required width and depth for channel formation are provided in a lattice shape on the surface of the substrate, and a square-shaped pillar for channel formation is formed in a part of the grooves.
  • Patent Document 2 in which the surface of the substrate on which the groove is provided is covered with a transparent cover made of transparent glass.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-157855
  • Patent Document 2 JP 2005-140681 A
  • microfabrication technology such as wet etching is indispensable. In these methods, if a single flow path pattern is formed, the cost for changing the flow path pattern becomes very high, and the flow rate is very high. Lack of road pattern flexibility.
  • the present invention has been made in view of such a technical problem, and a micro-flow that can simultaneously measure various chemical / biochemical functions using a micro-channel formed on a substrate.
  • the purpose is to provide road chips.
  • the microchannel chip of the present invention has a plurality of grooves connected in parallel or in series on a substrate, and is provided with different chemical modifications. Are embedded in the plurality of grooves, respectively, and fluid is supplied to the plurality of embedded capillaries to obtain detection data.
  • the capillary is embedded in the groove on the substrate formed in advance, for example, even when the inspection item is replaced, it is possible to replace the capillary. And has a flexible structure.
  • the capillaries are considered to have different chemical modifications, so that multiple items of chemical-biochemical functions can be measured simultaneously without interfering with each other.
  • microchannel chip of the present invention different chemical modifications have a broad meaning and are not limited to the chemical field, but in a wide range of fields such as the biochemical field, the pharmaceutical field, the environmental measurement field, and the molecular biological field.
  • chemical operations such as mixing, reaction, separation, etc. can be performed.
  • a plurality of animal globulin G immunoglobulin G; IgG
  • Simultaneous detection and calibration are possible.
  • ELISA immunoassay or enzyme immunoassay
  • ELISA refers to the substance to be measured on a microplate on which an antibody (protein) that specifically reacts with the substance to be measured (test substance) is immobilized. It is a method to determine the concentration of the test substance by measuring the enzyme activity of the enzyme-labeled substance bound to the plate by spectrophotometry by adding and reacting with the enzyme-labeled antigen at the same time.
  • the light is analyzed so that it is scanned simultaneously or sequentially with excessive or reflected light, and calibration is performed.
  • the analysis it is possible to obtain data from the image processing power using a thermal lens microscope, a fluorescence microscope, a CCD camera, or the like.
  • the antigen may be fixed to the pillar.
  • microchannel chip of the present invention it is possible to simultaneously measure chemical / biochemical functions of various items using a microchannel formed on a substrate. Work requiring a large number of chemical operations can be performed in a very short time, and the chip structure that can be mass-produced can be worked at a very low cost.
  • FIG. 1 is a perspective sectional view of an essential part of an embodiment of a microchannel chip of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view of a first used for the embodiment of the microchannel chip of the present invention.
  • FIG. 3 is a perspective cross-sectional view of a first used for the embodiment of the microchannel chip of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic view of a substrate used in an embodiment of a microchannel chip of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic perspective view of a substrate used in the embodiment of the microchannel chip of the present invention.
  • FIG. 6 is a plan view before embedding a capillary in the embodiment of the microchannel chip of the present invention.
  • FIG. 7 is a plan view after embedding a capillary in the embodiment of the microchannel chip of the present invention.
  • FIG. 8 is a schematic diagram for explaining a process for coating a required reagent on a scabbard in the embodiment of the microchannel chip of the present invention.
  • FIG. 9 is a schematic diagram illustrating a reaction process using a required reagent in the first embodiment of the microchannel chip according to the present invention.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing a model showing a measurement method in which an ELISA method is applied to the microchannel chip of the present invention.
  • FIG. 11 is a diagram showing signal intensities between five capillaries when the microchannel chip in FIG. 10 is used.
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing an experimental example in a model using a fluorescein release capillary that works on the microchannel chip of the present invention.
  • FIG. 13 is a diagram showing the relationship between the measured pH value and the fluorescence intensity in the model shown in FIG. ⁇ 14]
  • FIG. 13 is a diagram showing that a substrate release capillary that can be used for enzyme activity measurement functions as a microchannel chip, and shows data obtained by measuring enzyme activity using the substrate release capillary of the present invention as an experimental example.
  • FIG. 15 is a diagram showing that a substrate release capillary usable for enzyme activity measurement functions as a microchannel chip, and is a diagram showing data in an assembly using a microtiter plate as a comparative example.
  • FIG. 16 is a diagram showing a fluorescence image showing a state in the capillary after the reagent is released as an experimental example relating to the microchannel chip of the present invention, and is a diagram showing a fluorescence image of the trypsin substrate-release library.
  • FIG. 17 is a diagram showing a fluorescence image showing a state in the capillary after the reagent is released as an experimental example relating to the microchannel chip of the present invention, and is a diagram showing a fluorescence image of the fluorescein-released capillary.
  • FIG. 18 is a diagram showing a calibration curve with respect to antigen concentration for chicken IgG and goat IgG that are not limited to human IgG, using the model shown in FIG.
  • FIG. 1 shows a cross section of the main part of the microchannel chip of this embodiment.
  • the microchannel chip of this embodiment uses a substrate 10 made of polydimethylsiloxane (PDMS), which is a polymer material substrate, and has four grooves formed on the surface 11 of the substrate 10. 13-16, 4 prismatic Capillaries 21-24 are buried. One end sides of the four prismatic capillaries 21 to 24 are formed so as to face the flow path 12.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the substrate 10 may have a pattern in which grooves are arranged in a lattice shape as described in Patent Document 2 described above, or the number of substrates 10 may be embedded in order to embed many types of capillaries. It may be such that only grooves are formed.
  • the substrate 10 has a flat plate shape in the present embodiment, but may have another shape capable of holding a capillary. Since this substrate 10 is a polymer material, it has some flexibility, and when the capillaries are embedded, the capillaries are inserted while slightly expanding the grooves to be inserted, and the capillaries are arranged in the grooves. In this case, the capillary can be held in the groove without any gap.
  • the substrate can also comprise, for example, silicon rubber such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polydiphenylsiloxane, glass or other polymeric material forces.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • polydiphenylsiloxane glass or other polymeric material forces.
  • a groove having an extremely small cross section having a width of about 300 microns and a depth of about 300 microns can be formed. Since the side and bottom sides have the same dimensions, it is possible to embed without questioning which direction is the side and which is the bottom.
  • the capillary channel has a 100 micron angle and the outer shape is 300 micron square, and the groove size and the outer shape of the first are the same size.
  • the four prismatic capillaries 21 to 24 embedded in the grooves 13 to 16 are flexible micro prisms made of silica glass with different chemical modifications and different chemical functions. It is a member, and prismatic channels 25 to 28 are formed inside, and substances that cause reactions such as antibodies and enzymes are fixed to the inner walls of the channels 25 to 28.
  • one capillary is fixed with a reagent for testing the eye, and the next one is fixing the reagent for testing the hepatitis. It can be applied to other tests such as cancer and sexually transmitted diseases. By flowing common blood to these four different capillaries, independent testing is not necessary for each of these four plagues, and a positive or negative determination can be made in a single test. This is particularly effective when the treatment is urgent. As a combination of such pillars, for example, multiple types of hepatitis may be examined simultaneously. If there are various types such as viruses, or combinations of various types such as viruses, it is also possible to check combinations of them at once.
  • Examples of using blood include bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, or doping test, which may be arranged in such a manner that, for example, tests for hyperlipidemia, diabetes, fatty liver, etc. may be performed simultaneously. As such, the examination may be performed simultaneously using a plurality of capillarys using body fluids such as urine and blood.
  • the microchannel chip of the present invention can be applied to calibration of specific forces such as site force-in, hormones, and environmental hormones. Furthermore, for applications in the food field, it can be used for calibration of pesticides and bacteria in foods, and it is possible to specify hazardous substances.
  • microchannel chip of the present embodiment detection by ELISA is possible as will be described later, and antibodies are immobilized on the inner walls of the four prismatic capillaries 21 to 24, and an antigen solution is supplied.
  • ELISA electrospray saline
  • antibodies are immobilized on the inner walls of the four prismatic capillaries 21 to 24, and an antigen solution is supplied.
  • it has a structure in which an antigen-antibody reaction occurs and calibration and the like are realized, and is particularly effective at the time of disease diagnosis or virus diagnosis.
  • FIGS. 2 and 3 are a top view and a cross-sectional view of the capillaries 21 and 22, and the capillaries 21 and 22 each have prismatic channels 25 and 26 for different chemical modifications.
  • the first and second capillaries 21 and 22 can also be configured using other glass or synthetic resin material made of silica glass.
  • the shape of the inner wall is such that a prismatic hollow portion is formed, but it may be a cylindrical shape or other shapes.
  • the inner wall of the capillary is chemically modified for ion sensing, molecular sensing, pH sensing, filtering, concentration, antigen-antibody reaction, enzyme reaction, catalytic reaction, immune reaction, oil / water separation or flow control, and is made into a chemical modification part.
  • the force of glass or plastic force is one example of the former.
  • the former there is also a silica glass force.
  • lica capillary tubing sold by Polymicro, USA). Since such a square-shaped pillar has a square outer cross-sectional shape, the substrate has a square cross-sectional shape and the same dimensions as the cavity outer shape, and a part of the groove has a required length. By embedding the required number of cut capillary capillaries, a desired pattern of microchannels can be easily and freely formed.
  • At least one surface of the capillary of the microchannel chip according to the present invention is transparent. In that case, it is possible to easily recognize the progress and result of the chemical operation in the microchannel, and it is also suitable for calibration by ELISA as described later.
  • the cross-sectional shape of the inner wall of the pillar is not limited to a specific shape, but it is more preferably a substantially square shape considering the above-mentioned chemical functions more reliably. Yes.
  • FIGS. 4 to 7 are views showing the relationship between the substrate 10 and the groove 19 serving as a flow path
  • FIG. 4 is a plan view with a part omitted
  • FIG. 5 is a perspective view.
  • a substrate 10 having a polymer material force such as glass polydimethylsiloxane (PDMS) is formed with grooves 19 in a lattice shape in the vertical and horizontal directions and surrounded by the grooves 19.
  • the surface of the matrix is formed in a square shape that also projects the groove bottom force.
  • PDMS glass polydimethylsiloxane
  • the grooves 19 are formed vertically and horizontally in the form of a lattice, the distance between the lattice points in the horizontal direction of one groove and the distance between the lattice points in the vertical direction are substantially equal. It is also possible to change the distance between lattice points in the vertical direction.
  • capillaries 21 to 24 are prepared as shown in FIG. 6, and as shown in FIG. 7, each of them is arranged in parallel with a portion of a groove extending in the vertical direction.
  • four kinds of capillaries 21-24 are buried so that A dummy capillary 18 for closing the channel is buried in the part that needs to be closed as a groove.
  • this dummy capillary 18 for example, a flexible square capillary is cut into a required number and a required length, and each flow path is closed by filling with PDMS or the like. Since such a dummy capillary is embedded in the flow path, the flow path at a specific location is closed and a required flow path pattern is formed in the micro flow path chip.
  • the flow path pattern shown in Fig. 7 has four types of capillary pillars 21-24 arranged in parallel in the horizontal direction. Then, the fluid is introduced from the flow path 12a formed by the groove on the inlet side, passes through each of the capillaries 21 to 24, and the fluid introduced from the flow path 12b on the outlet side is discharged. When two or more different types of fluid are introduced, it is possible to introduce the fluid by opening the flow path 12a at two or more places.
  • a capillary may be embedded on the substrate, and then a required cover may be attached.
  • a cover for example, a transparent sheet or transparent film made of glass or plastic can be used. In this case, the internal state of the microchannel can be visually observed from the outside.
  • a method for manufacturing a pill with a reagent immobilized thereon will be briefly described.
  • a substance that functions as a reagent is dissolved in a methanol (MeOH) solution, and this solution is injected into the channel 31 having a square cross section of the capillary 30.
  • the solution injected into the channel 31 having a square cross section becomes hollow when sealed with air, and is fixed to the inner wall of the capillary 30 after being naturally dried for about 24 hours.
  • a trypsin substrate for fluorescence detection (benzoy ⁇ L-arginine 4-methyl-coumaryl-7-amide; Bz-Arg-MCA)
  • a reagent for pH detection fluorescein
  • polyethylene polyethylene
  • Glycol can be dissolved in a methanol (MeOH) solution, introduced into the channel 31 of the capillary 30 and then fixed to the inner wall of the capillary 30 through natural drying for about 24 hours.
  • FIG. 9 is a diagram showing the state of the capillary 32 in the detection operation.
  • a membrane with a fixed reagent is formed on the inner wall of the channel 33 with a square cross section of the capillary 32 by the manufacturing method shown in Fig. 8, etc.
  • reagent components are present.
  • the sample solution is introduced into the capillary 32 by capillary action.
  • the reagent is released from the membrane on which the reagent is fixed, and the required reaction such as color development or fluorescence is displayed. An elephant will appear.
  • Fig. 9 shows an example in which a reagent is released from a film formed on the inner wall.
  • the reaction is such that a color is generated by a chemical reaction, and the flow of a cross-section square of the capillary 32 as in an enzyme reaction.
  • An example of the inner wall force of channel 33 is that the substrate is released to cause a color reaction.
  • As the enzyme reaction it is also possible to use a capillary that is accompanied by the release of the substrate or the enzyme itself.
  • microchannel chip of the present invention will be described in detail based on experimental examples conducted by the present inventors.
  • FIG. 10 is a model showing a measurement method to which the ELISA method is applied, and is an example in which an enzymatic reaction was examined in a human IgG reaction system.
  • grooves are formed in a lattice shape on the substrate 40, and five square capillary pillars 43a to 43d, 43e are arranged in parallel and embedded therein.
  • a dummy capillary 42 is attached to a groove that is not used as a flow path.
  • a valve capillary 41 made of poly-N-isopropylacrylamide, a thermosensitive polymer, is formed!
  • the valve capillaries 41 can control the opening and closing of the flow path by temperature.
  • FIG. 11 is a diagram showing the signal strength between the five capillaries when the microchannel chip of FIG. 10 is used. There was a variation of about 19% between the signal intensities, but it was demonstrated that significant data could be obtained.
  • FIG. 12 is a diagram showing an experimental example in a model using a fluorescein-release capillary.
  • the sample solution whose pH value is to be measured is supplied to the central groove with respect to the substrate 50, and the central ends of the fluorescein release capillary 51, 52 disposed on both sides of the substrate 50 are open.
  • the sample solution is also introduced into the fluorescein release cavities 51 and 52.
  • FIG. 12 is a photographic part showing that the fluorescent light actually starts to appear over time
  • FIG. 13 is a correlation diagram between the fluorescent intensity AF and the pH value. Using a fluorescein-release capillary, a sufficient intensity change appears at pH values of 4-8, which has been demonstrated to be significant as detection data.
  • FIGs. 14 and 15 are diagrams showing that the substrate release capillary usable for enzyme activity measurement functions as a microchannel chip, and Fig. 14 shows the substrate release capillary of the present invention as an experimental example.
  • FIG. 15 shows data obtained by using a microtiter plate as a comparative example.
  • the signal intensity is weak, but the data equivalent to the assembly using the general-purpose microtiter plate is sufficiently obtained in terms of reaction speed and reaction temperature at the trypsin concentration.
  • the assembly using the substrate release capillary is the one using the microtiter plate. Since it can be made smaller, the work can be carried out at a very low cost.
  • Figures 16 and 17 are fluorescence micrographs of enzyme activity and pH sensing, respectively.
  • the enzyme activity assay uses a trypsin substrate release capillary
  • pH sensing uses a fluorescein release capillary. This is an example in the model. In both cases, fluorescence is observed with a width equal to the width of the inner wall of a roughly square capillary of about 100 microns, and effective measurement is realized.
  • FIG. 18 shows that using the model shown in Fig. 10, chicken IgG and goat Ig are not just human IgG.
  • FIG. 5 is a diagram in which a calibration curve with respect to antigen concentration is prepared for G. In these immunoassays, it was shown that the antigen-antibody reaction occurred in the same manner as the human IgG reaction system explained earlier, and the same calibration results were obtained. Therefore, it was proved that the microchannel chip of the present invention, in which different types of capillaries are arranged side by side and measured simultaneously, is also effective for different enzyme reactions and antigen-antibody reactions.

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Abstract

本発明の微小流路チップでは、基板上に並列若しくは直列に接続される複数の溝が形成され、互いに異なる化学修飾が施されたキャピラリーが前記複数の溝にそれぞれ埋設され、これらの埋設された複数の前記キャピラリーに流体を供給し検出データを取得することができる。当該微小流路チップにより多項目の化学・生化学機能が同時に測定される。この様な微小流路チップは、基板上に形成した微小な流路を用いて多項目の化学・生化学機能を同時に測定することができる。

Description

明 細 書
微小流路チップ
技術分野
[0001] 本発明は複数の微小なキヤビラリ一に流体を通過させ、該キヤビラリ一におけるィ匕 学修飾により所要の機能を発揮してデータの検出が可能な微小流路チップに関する 背景技術
[0002] 従来より、ガラスやプラスチックの基板上に微細加工技術を利用して微小な流路を 形成し、該流路に固定された機能性分子によって必要な反応や分離等の生化学'ィ匕 学的な操作や検出を行うためのチップとして、例えば/ z TAS (Micro Total Analysis Sy stems)と呼ばれる集積化されたチップが知られて 、る。
[0003] また、このような微小流路を基板上に形成した微小流路チップの一例としては、微 小スケールで様々なサイズの DNA断片をはじめとする核酸、あるいは、アミノ酸'ぺ プチド 'タンパク質などの有機分子、金属イオンなどを分離する際などに用いるキヤピ ラリーゲル電気泳動用マイクロチップなども知られている（例えば、特許文献 1参照。 )
[0004] さらに、従来の技術として、基板の表面に流路形成用の所要の幅と深さを有する溝 が格子状に設けられ、この溝の一部に流路形成用の角型キヤビラリ一が密接状に埋 設され、溝が設けられた側の基板の表面が透明ガラス力 なる透明カバーで被覆さ れてなる微小流路デバイスも知られており（例えば、特許文献 2参照。）、このような微 小流路デバイスを用いることで、簡便かつ安価であって、流路パターンを容易かつ自 由自在に変えることができる。
[0005] 特許文献 1 :特開 2001— 157855号公報
特許文献 2 :特開 2005— 140681号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 前述のキヤビラリーゲル電気泳動用マイクロチップやマイクロ TASなどのチップで は、ウエットエッチングのような微細加工技術が必須であり、これらの方法では、ある 1 つの流路パターンを形成してしまうと、その流路パターンを変える場合のコストが非常 に高価になり、流路パターンの融通性が欠けている。
[0007] 前述の特許文献 2に記載された技術では、流路パターンを容易かつ自由自在に変 えることができ、必要に応じて化学的機能^^積することが可能であるが、化学分野' 生化学分野での応用として例えばウィルス検診などでは多項目を同時測定すること で、その検出データの取得までの時間を極めて短くすることが考えられており、前記 文献では具体的なデータの取得までは開示されて 、な 、。
[0008] 本発明は、このような技術的な課題に鑑みなされたものであり、基板上に形成した 微小な流路を用いて多項目の化学 ·生化学機能を同時に測定できるような微小流路 チップの提供を目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 前述の技術的な課題を解決するため、本発明の微小流路チップは、基板上に並列 若しくは直列に接続される複数の溝が形成され、互いに異なる化学修飾が施された キヤビラリ一が前記複数の溝にそれぞれ埋設され、これらの埋設された複数の前記キ ャピラリーに流体を供給し検出データを取得することを特徴する。
[0010] 本発明の微小流路チップによれば、予め形成された基板上の溝にキヤピラリーを埋 め込むため、例えば、検査項目を入れ替えるような場合でも、キヤピラリーを交換す れば対応することができ、融通性に富む構造を有している。また、キヤピラリー同士は 、異なる化学修飾がなされたのものとされ、互いに干渉することなく多項目の化学-生 化学機能を同時に測定できる。
[0011] 本発明の微小流路チップにおいて、異なる化学修飾とは広い意味を有するもので あり、化学分野に限定されず生化学分野、医薬分野、環境測定分野、分子生物分野 などの広い範囲で混合、反応、分離などの化学的操作を実現するものであり、例え ば、多種の動物系免疫グロブリン G (immunogloburin G ;IgG)抗体を固定したキヤビラ リーを並べて配することで、抗原抗体反応による同時検出や同時検量が可能となる。
[0012] 埋設された複数の前記キヤビラリ一に流体を供給することで同時に反応、分離、混 合などの化学的な操作が行われる力 例えば ELISA法などにより発色性の基質を導 入することで、定量ゃ検量などが可能となる。ここで、 ELISA (ィムノアッセィ或いは 酵素免疫測定法法)とは、測定したい物質 (被検物質)と特異的に反応する抗体 (た んぱく質)を固相化したマイクロプレートに、測定したい物質と酵素標識抗原とを同時 に加えて反応させ、プレートに結合した酵素標識物の酵素活性を吸光光度法により 計測して、被検物質の濃度を求める手法であり、並べられた複数のキヤピラリーを透 過或いは反射する光で同時或いは順次走査するように光線を解析し、検量を行う手 法である。解析には、熱レンズ顕微鏡、蛍光顕微鏡、 CCDカメラなどを用いて画像処 理カもデータを得るようにすることが可能である。また、抗原をキヤビラリ一に固定する ように構成しても良い。
発明の効果
[0013] 本発明の微小流路チップを用いることで、基板上に形成した微小な流路を用いて 多項目の化学 ·生化学機能を同時に測定することができ、例えばウィルスの特定など の本来多数の化学的操作が必要な作業も極めて短時間に行うことができ、且つ量産 できるチップ構造力 非常に安価に作業を進めることができる。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]本発明の微小流路チップの実施形態の要部斜視断面図である。
[図 2]本発明の微小流路チップの実施形態に用いられるキヤビラリ一の平面図である
[図 3]本発明の微小流路チップの実施形態に用いられるキヤビラリ一の斜視断面図で ある。
[図 4]本発明の微小流路チップの実施形態に用いられる基板の模式図である。
[図 5]本発明の微小流路チップの実施形態に用いられる基板の斜視模式図である。
[図 6]本発明の微小流路チップの実施形態において、キヤピラリーを埋設する前の平 面図である。
[図 7]本発明の微小流路チップの実施形態において、キヤピラリーを埋設した後の平 面図である。
[図 8]本発明の微小流路チップの実施形態において、キヤビラリ一に所要の試薬をコ 一ティングするプロセスを説明する模式図である。 圆 9]本発明の微小流路チップの実施形態のキヤビラリ一における所要の試薬を利 用した反応プロセスを説明する模式図である。
[図 10]本発明の微小流路チップで ELISA法を適用した測定方法を示すモデルを示 す模式図である。
[図 11]図 10の微小流路チップを用いた時の 5本のキヤビラリ一間における信号強度 を示す図である。
[図 12]本発明の微小流路チップに力かるフルォレセイン放出キヤピラリーを用いたモ デルでの実験例を示す模式図である。
[図 13]図 12に示したモデルでの pH測定値と蛍光強度の関係を示す図である。 圆 14]酵素活性測定に利用可能な基質放出キヤビラリ一が微小流路チップとして機 能することを示す図であって、実験例としての本発明の基質放出キヤピラリーを用い て酵素活性を測定したデータを示す図である。
圆 15]酵素活性測定に利用可能な基質放出キヤビラリ一が微小流路チップとして機 能することを示す図であって、比較例としてマイクロタイタープレートを用いたアツセィ でのデータを示す図である。
圆 16]本発明の微小流路チップにかかる実験例として試薬放出後のキヤピラリー内 の状態を示す蛍光画像を示す図であり、トリプシン基質放出キヤビラリ一の蛍光画像 を示す図である。
圆 17]本発明の微小流路チップにかかる実験例として試薬放出後のキヤピラリー内 の状態を示す蛍光画像を示す図であり、フルォレセイン放出キヤビラリ一の蛍光画像 を示す図である。
[図 18]図 10で示したモデルを利用して、ヒト IgGだけではなぐチキン IgGとャギ IgG につ 、ても抗原濃度に対する検量線を示した図である。
発明を実施するための最良の形態
図面を参照しながら、本実施形態の微小流路チップについて説明する。本実施形 態の微小流路チップの要部断面を図 1に示す。本実施形態の微小流路チップは、図 1に示すように、高分子材料基板であるポリジメチルシロキサン (PDMS)からなる基 板 10を使用し、基板 10の表面 11に形成された 4つの溝 13〜16に、 4本の角柱状の キヤピラリー 21〜24がそれぞれ埋設されている。 4本の角柱状のキヤピラリー 21〜2 4の一端側は、流路 12に臨むように形成されている。
[0016] 基板 10は、前述の特許文献 2に記載される格子状に溝が配設されるようなパターン を有していても良ぐ或いは、多種類のキヤピラリーを埋設するために、その本数だけ 溝が形成されているようなものであっても良い。基板 10は、本実施形態では平板状 であるが、キヤピラリーを保持できる他の形状であっても良い。この基板 10は、高分 子材料であることから多少の可とう性を有しており、キヤピラリーを埋設する際に挿入 部分となる溝をやや広げながらキヤピラリーを挿入し、溝内にキヤピラリーを配置した 際には隙間無くキヤピラリーを溝内に保持することができる。基板は例えば、ポリジメ チルシロキサン（PDMS)やポリジフエ-ルシロキサンなどのシリコンゴム、ガラスまた はその他の高分子材料力も構成することができる。
[0017] ここで、溝の寸法については、一例として幅 300ミクロン、深さ 300ミクロン程度の極 めて小さな断面正方形状の溝とすることができ、正方形の断面とすることで、キヤビラ リーの側面と底面側が同じ寸法になることから、どちらが側面でどちらが底面というよ うな方向性を問題にせずに埋設することができる。また、キヤピラリーの流路は 100ミ クロン角であり、外形は 300ミクロン角であって、溝のサイズとキヤビラリ一の外形は同 じサイズとされる。
[0018] このような溝 13〜16に埋設される 4本の角柱状のキヤピラリー 21〜24は、異なる化 学修飾を施し異なる化学機能を付加したシリカガラスカゝらなる可とう性の微小角柱部 材であり、その内部に角柱状の流路 25〜28が形成され、その流路 25〜28の内壁 に抗体や酵素などの反応を起因させる物質が固定される。
[0019] 例えば、流路を通過させる流体を人の血液とする場合では、 1つのキヤピラリーがェ ィズ検査用の試薬を固定したものとされ、次のキヤビラリ一が肝炎検査用の試薬を固 定したものとされ、他のキヤビラリ一が例えばガンと性病などの検査に適用できる。こ のような 4つの異なるキヤビラリ一に共通の血液を流すことで、これらの 4つの疫病に 関してそれぞれ独立した検査は不要となり、一回の検査で陽性又は陰性の判断がで きることになり、特に処置に緊急性を有する場合に極めて有効である。このようなキヤ ピラリーの組み合わせとしては、例えば肝炎の複数の型について同時に検査するよう な組み合わせや、ウィルスの如き種々のタイプのものがある場合に、どの種類かを一 度に検査するための組み合わせなども可能である。また、血液を利用する例としては 、例えば高脂血症、糖尿病、脂肪肝などの検査を同時に行うようなそれぞれキヤビラ リーを配列させても良ぐ膀胱ガン、前立腺ガン、子宮ガン、或いはドーピング検査な どのように、尿や血液などの体液を利用し複数のキヤピラリーを用いて同時に検査を するようにしても良い。また、本発明の微小流路チップをサイト力イン、ホルモン、環境 ホルモンなどの特定ゃ検量などに適用することも可能である。更に、食品分野への応 用としては、食品中の農薬や細菌の検出ゃ検量に用いることができ、有害物質の特 定も可能である。また、また、生化学分野では、細胞中の各種の分子、例えば各種の 蛋白質、核酸、生理活性低分子などの成分分析や細胞内の各種の酵素活性の検出 ゃ検量などが実現可能とされる。更に温泉などの鉱水に含まれる複数の金属イオン などを検量するための組み合わせなどがあげられる。
[0020] 本実施形態の微小流路チップにおいては、後述するように ELISA法による検出が 可能であり、 4本の角柱状のキヤピラリー 21〜24の内壁に抗体を固定し、抗原溶液 を供給することで、抗原抗体反応が生じて、検量などが実現される構造を有しており 、疾患の診断やウィルス診断時に特に有効である。
[0021] 図 2及び図 3はキヤピラリー 21、 22の上面図と断面図であり、キヤピラリー 21、 22に は、異なる化学修飾のための内部に角柱状の流路 25、 26を有している。キヤビラリ 一 21、 22は、本実施形態においては、シリカガラスにより構成される力 他のガラス や合成樹脂材などを用いて構成することも可能である。内壁の形状は、本実施形態 においては、角柱状の空洞部が形成されるものとされるが、円筒形状やその他の形 状であっても良い。キヤピラリー内壁は、イオンセンシング、分子センシング、 pHセン シング、フィルタリング、濃縮、抗原抗体反応、酵素反応、触媒反応、免疫反応、油水 分離または流量制御のために化学修飾されて、化学修飾部にされていてもよい。そ の場合には、分子認識、反応、分離、検出などの多種類の化学的機能を 1つの微小 流路チップに自由自在に集積ィ匕することができる。また、キヤビラリ一は例えば、ガラ スまたはプラスチック力もなる力 前者の一例としては、シリカガラス力もなり、外形の 横断面形状が正方形である可撓性角型キヤビラリ一（商品名： Square flexible fosed si lica capillary tubing,米国 Polymicro社が販売）が使われる。このような角型キヤビラリ 一は外形の横断面形状が正方形であるので、横断面形状が正方形であってキヤビラ リー外形と同じ寸法の溝を基板に設け、その溝の一部に所要長さに切断した所要本 数の同キヤピラリーを埋め込むことで、所望パターンの微小流路を容易かつ自由自 在に形成することができる。
[0022] 本発明に係る微小流路チップのキヤビラリ一は、少なくともその一面が透明であるの が好ましい。その場合には、微小流路における化学操作の進行状況や結果などを容 易に認識することができ、後述するような ELISA法による検量にも好適である。なお、 キヤビラリ一の内壁の横断面形状は、特定の形状に限定されるものではないが、前記 の化学的機能をより確実に発揮させることなどを考慮すると、略方形であるのがより好 ましい。
[0023] 次に、図 4乃至図 7を参照して、本実施形態の微小流路チップの組み立てについ て説明する。図 4及び図 5は、基板 10と流路となる溝 19の関係を示す図であり、図 4 は一部を省略して示す平面図、図 5は斜視図である。図 4及び図 5に示すように、ガラ スゃポリジメチルシロキサン (PDMS)のような高分子材料力もなる基板 10には、縦横 に格子状に溝 19が形成され、その溝 19に囲まれてマトリクス状に正方形状に溝底部 力も突出する形状の表面が形成される。縦横に格子状に溝 19が形成されることから 、 1つの溝の横方向の格子点間の距離と縦方向の格子点間の距離は略同等である 力 横方向の格子点間の距離と縦方向の格子点間の距離を変えることもできる。
[0024] このような基板 10を用いて、 4種類のキヤピラリー 21〜24が図 6に示すように準備さ れ、図 7に示すように、それぞれ縦方向に延在される溝の部分に並列となるように 4種 類のキヤピラリー 21〜24が埋設される。溝として塞ぐ必要がある部分には、流路閉鎖 用のダミーキヤピラリー 18が埋設される。このダミーキヤピラリー 18は、例えば、可撓 性角型キヤピラリーを所要本数、所要長さに切断し、それぞれの流路を PDMSなど の充填により閉鎖したものが使われる。このようなダミーキヤピラリーが流路に埋設さ れたことにより、微小流路チップには、特定箇所の流路が閉鎖されて所要の流路パタ ーンが形成されることになる。
[0025] 図 7に示す流路パターンは、横方向に 4種類のキヤピラリー 21〜24が並列に配さ れ、その入り口側の溝からなる流路 12aから流体が導入され、それぞれのキヤビラリ一 21〜24を透過し、出口側の流路 12bから導入された流体が排出される。異なる 2種 類以上の流体を流入させる場合には、流路 12aを 2力所以上で開口して流体を導入 するようにすることも可會である。
[0026] 図示を省略しているが、基板上にはキヤピラリーを埋設した後、所要のカバーを取り 付けるようにすることもできる。カバーとして、例えば、ガラスまたはプラスチックからな る透明シートまたは透明フィルムを用いることができ、この場合は、微小流路の内部 状態を外部から目視することができる。
[0027] 次に図 8を参照しながら、試薬を固定ィ匕させたキヤビラリ一の製法について簡単に 説明する。図 8の例では、メタノール (MeOH)溶液に試薬として機能する物質が溶 解され、この溶液がキヤピラリー 30の断面正方形の流路 31に注入される。断面正方 形の流路 31に注入された溶液は、空気を封入することで中空状となり、 24時間程度 の自然乾燥を経てキヤピラリー 30の内壁に固定されるようになる。例えば、試薬を放 出するキヤビラリ一としては、蛍光検出用トリプシン基質 (benzoy卜 L- arginine 4-methy l-coumaryl-7-amide； Bz- Arg- MCA)や pH検出用試薬 (fluorescein)とポリエチレングリ コールをメタノール (MeOH)溶液に溶解させて、キヤピラリー 30の流路 31に導入後 、 24時間程度の自然乾燥を経てキヤピラリー 30の内壁に固定されるようにすることが できる。
[0028] また、例えば、 ELISA法による検出が可能なキヤピラリー 30を得るためには、抗体 を予め断面正方形の流路 31の内壁に固定ィ匕しておくことが好ましぐ後述するような 抗原、酵素標識抗体、基質を順次供給することで、 ELISA法による識別が実現され ることになる。
[0029] 図 9は検出作業におけるキヤピラリー 32の状態を示した図である。キヤピラリー 32の 断面正方形の流路 33の内壁には図 8に示した製法などにより、試薬を固定ィ匕した膜 が形成されており、特に断面正方形の 4つの角部に乾燥後の残差のように試薬成分 が存在する。この状態で、キヤピラリー 32には試料となる溶液が毛細管現象により導 入される。試料がキヤピラリー 32の断面正方形の流路 33に導入されることで、試薬を 固定ィ匕した膜から試薬が放出され、所要の反応例えば発色や蛍光を示すなどの現 象が現れることになる。
[0030] 図 9は内壁に形成された膜から試薬を放出する例であるが、化学的に反応を生じさ せて発色するような反応と、酵素反応のようにキヤピラリー 32の断面正方形の流路 33 の内壁力 基質を放出して発色反応を生じさせる例が挙げられる。なお、酵素系の 反応としては、基質の放出の場合や酵素自体の放出を伴うキヤピラリーを用いること も可能である。
[0031] 次に、本件発明者が行った実験例に基づき、更に本発明の微小流路チップについ て詳しく説明する。
[0032] 図 10は、 ELISA法を適用した測定方法を示すモデルであり、ヒト IgGの反応系で 酵素反応を調べた例である。先ず、基板 40上に格子状に溝部が形成され、そこに 5 つの角型キヤピラリー 43a〜43d、 43eが並列に並べられて埋設されている。流路とし て利用されない溝部にはダミーキヤピラリー 42が取り付けられている。 5つの並列す る角型キヤピラリー 43a〜43d、 43eの入り口には、感温性高分子であるポリ N—イソ プロピルアクリルアミド力 なるバルブキヤピラリー 41が形成されて!、る。このバルブキ ャピラリー 41により流路を温度で開閉制御することができる。
[0033] 概ね以上のような構造の微小流路チップにぉ 、て、先ず、ャギ抗ヒト IgG抗体を固 定した 5つの角型キヤピラリー 43a〜43d、 43eを並べ、チップを作成した。検証のた め、バルブキヤピラリー 41を開くように操作した上で、抗原溶液を入り口 44から導入 し、排出口 45から導出するようにして、各角型キヤピラリー 43a〜43d、 43e自体を抗 原溶液で満たし、次いでバルブキヤピラリー 41を閉じて反応を進行させた。次いで、 同様に酵素標識抗体溶液 (Anti-IgG-HRP)、赤色色素を生成する基質溶液 (TOSS, 4 AA)を反応させて、熱レンズ顕微鏡 (励起波長 532nm、検出波長 658nm)によ つて観測した。
[0034] 抗原'酵素抗体溶液を導入し基質溶液を導入すると酵素反応が進行して，熱レン ズ顕微鏡信号強度は約 60秒で一定値に達した。次にこの系で十分に抗原抗体反応 が完了する時間を調べた。その結果抗原抗体反応を 12分以上行った場合，熱レンズ 信号強度は一定となった。このことから，抗体固定キヤビラリ一内での総反応時間は 3 0分程度であり，迅速なィムノアツセィが可能であることがわ力つた。 [0035] 図 11は図 10の微小流路チップを用いた時の 5本のキヤビラリ一間における信号強 度を示す図である。信号強度の間には、約 19%程度のばらつきが見られたが、有意 なデータが取得できることが実証された。
[0036] 図 12はフルォレセイン放出キヤピラリーを用いたモデルでの実験例を示す図である 。基板 50に対して中央の溝に pH値が測定されるべき試料溶液が供給されるように構 成されており、その両側に配設されたフルォレセイン放出キヤピラリー 51, 52の中央 側端部は開口しており、その開口部力も試料溶液がフルォレセイン放出キヤビラリ一 51, 52の内部に導入される。
[0037] 図 12の写真部分は、実際に経時的に蛍光を呈するようになったところを示す写真 部分であり、図 13は蛍光強度 A Fと pH値の相関図である。フルォレセイン放出キヤピ ラリーを用いて、 pH値 4〜8で十分な強度変化が現れ、検出データとして有意である ことが実証されている。
[0038] 図 14と図 15は酵素活性測定に利用可能な基質放出キヤビラリ一が微小流路チッ プとして機能することを示す図であり、図 14は実験例としての本発明の基質放出キヤ ピラリーを用いて酵素活性を測定したデータであり、図 15は比較例としてマイクロタイ タープレートを用いたアツセィでのデータである。基質放出キヤピラリーを用いたアツ セィでは、信号強度が弱くなるものの、トリプシン濃度において反応速度や反応温度 の点で十分に汎用のマイクロタイタープレートを用いたアツセィと同格のデータが得ら れており、特に検量線が飽和するまでの曲線が相似であることから、多項目同時での 計測に有利であることが示されており、基質放出キヤピラリーを用いたアツセィはマイ クロタイタープレートを用いたアツセィに比べて小さくできることから、非常に安価に作 業を進めることができる。
[0039] 図 16及び図 17はそれぞれ酵素活性アツセィと pHセンシングについての蛍光顕微 鏡写真であり、酵素活性アツセィはトリプシン基質放出キヤピラリーを用いたものであ り、 pHセンシングはフルォレセイン放出キヤピラリーを用いたモデルでの例である。 両方とも約 100ミクロンの略方形のキヤピラリーの流路内壁の幅に等しい幅で、蛍光 が観測されており、有効な計測が実現されている。
[0040] 図 18は図 10で示したモデルを利用して、ヒト IgGだけではなぐチキン IgGとャギ Ig Gにつ ヽても抗原濃度に対する検量線を作成した図である。これらィムノアッセィに おいても、先に説明したヒト IgGの反応系と同様に、抗原抗体反応が生じて、同様な 検量結果が得られることが示された。従って、異なる酵素反応や抗原抗体反応に対 しても、異なる種類のキヤピラリーを並べて配置し、同時に測定するという本発明の微 小流路チップが有効であることが実証できた。
上述の実施形態では、異なる酵素反応や抗原抗体反応に対応して配置されるとこ ろの異なる種類のキヤピラリーを並列に配設した例について説明したが、各キヤビラリ 一に供給される液体に共通性があれば良ぐ各キヤピラリー同士を直列接続させるよ うにしても良い。

Claims

請求の範囲
[1] 基板上に並列若しくは直列に接続される複数の溝が形成され、互いに異なる化学修 飾が施されたキヤビラリ一が前記複数の溝にそれぞれ埋設され、これらの埋設された 複数の前記キヤビラリ一に流体を供給し検出データを取得することを特徴とする微小 流路チップ。
[2] 前記キヤビラリ一は抗体を当該キヤビラリ一の内壁に固定した抗体固定キヤビラリ一 であり、前記流体は抗原溶液であることを特徴とする請求項 1記載の微小流路チップ
[3] 前記キヤビラリ一は抗原を当該キヤビラリ一の内壁に固定した抗原固定キヤビラリ一 であり、前記流体は抗体溶液であることを特徴とする請求項 1記載の微小流路チップ
[4] 溶液を前記キヤビラリ一に導入した後、前記キヤビラリ一の両端はシリコンオイルで封 止されることを特徴とする請求項 1記載の微小流路チップ。
[5] 基板上に並列若しくは直列に接続される複数の溝が形成され、抗体を固定したキヤ ピラリーが前記複数の溝にそれぞれ埋設され、これらの埋設された複数の前記キヤピ ラリーに抗原溶液を供給し検出データを取得することを特徴する微小流路チップ。
[6] 基板上に並列若しくは直列に接続される複数の溝が形成され、抗原を固定したキヤ ピラリーが前記複数の溝にそれぞれ埋設され、これらの埋設された複数の前記キヤピ ラリーに抗体溶液を供給し検出データを取得することを特徴する微小流路チップ。
[7] ELISA法により前記キヤビラリ一に発色反応を生じさせ、その発色濃度力 検出デ ータを取得することを特徴とする請求項 1、請求項 5、若しくは請求項 6記載の微小流 路チップ。
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