WO2007031152A1 - Method and device for producing ball- or tubular-shaped synthetic membranes - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to a process for the production of spherical or tubular artificial membranes from self-assembling film-forming molecules, in particular from lipids, in which the film-forming molecules are contacted in layers from two sides with a solution, in particular an aqueous solution, and a device for Implementation of this procedure.
- membranes One of the tasks that membranes have to fulfill in nature is the formation of compartments that delimit the enclosed areas from the environment. Thereby, e.g. high osmolarity (high ion concentration) is maintained within the cell against low osmolarity outside the cell. Only special processes can be used to exchange substances. Membranes also have cohesiveness and stability, for example, to provide a transport pathway for nerve cells in different cell components.
- lipid membranes are also of great importance to biotechnology.
- Various methods have been developed to produce lipid vesicles. As early as the mid-sixties of the last century, it was observed that lipid films swell in aqueous solution, ie, water penetrates into the lipid film and forms vesicles of various sizes. By applying electric fields or As the temperature increased, the process of vesicle formation could be accelerated. A spontaneous formation of very small vesicles (100 nm to 250 nm) could be achieved on a microchip. In this case, an organic phase containing lipid in dissolved form was hydrodynamically focused by means of two laterally inflowing aqueous solutions. At the interface between the organic phase and the aqueous solution, the vesicles are formed.
- the preparation methods are based on the property of lipids or other self-assembling film-forming molecules to spontaneously assemble into an ordered, single or multi-layered (so-called unilamellar or multilamellar) membrane. There will be no chemical (Covalent) bonds formed, but there are only interactions between the lipids, so that the structures can be easily changed under appropriate conditions in their shape or composition.
- membrane hoses were drawn from spherical vesicles, e.g. by means of a pipette, in which there is a slight negative pressure.
- the hoses thus produced usually have a diameter in the range of 20 to 200 nm, the maximum length which has been described is a few hundred micrometers.
- the membrane tubes are only stable as long as they are attached at both ends, i. they form back when the vacuum of the pipette is released.
- the pipette method has also been used to create networks of nanochannels that connect different vesicles or vesicles with biological cells. However, since these channels are only metastable, arbitrary arrangements of networks are not possible. It has also been observed that lipid tubing in fluid systems forms from cell membranes or vesicles, which regress as the flow is stopped.
- the object of the invention is to provide a solution with which such artificial membranes in spherical or tubular form reproducible, stable and largely automated can be produced.
- This object is achieved by a method of the type described in the present invention that the film-forming molecules on a two-channel microchip separating, microporous separating intermediate layer is applied and the two channels are each filled with an aqueous solution and that then between the two Channels a pressure difference is generated.
- a method of the type described in the present invention that the film-forming molecules on a two-channel microchip separating, microporous separating intermediate layer is applied and the two channels are each filled with an aqueous solution and that then between the two Channels a pressure difference is generated.
- spherical, ie spherical structures and also tubular structures of self-assembling film-forming molecules, in particular of lipids, with diameters up to a few micrometers can be produced on a microchip.
- the pore-containing intermediate layer between the two channels of the microchip is coated with a film-like layer of the film-forming molecules, ie, such a film is applied to the intermediate layer.
- the film-forming molecules are preferably contained in an organic solution as a solvent.
- the two channels are filled with water or an aqueous solution.
- the forming membrane structures are then forced through the pores in the direction of the side facing away from the film, so to speak, extruded, depending on the dimensions of the micropores and the pressure difference or the flow velocity in the channels reproducible three-dimensional structures artificial membranes can be generated.
- These membranes can be used as microreactors or transport channels for biotechnological or pharmaceutical applications.
- the aqueous solution is sucked out of a channel. If the pressure difference is small, spherical and cylindrical, tori-shaped compartments (tori) are preferably formed. If no shear forces act on the back of the micropores, the membranes or vesicles formed adhere there.
- Producing a high pressure difference (by sucking on the side facing away from the film) produces tubes that can reach a length of more than 1.5 cm. These hoses are stable even when the pressure difference is stopped ie they no longer change their diameter. They are flexible against movement, ie they can be moved or rotated in any direction.
- the diameter of the lipid tubes is (presumably) determined by the diameter of the pores in the thin intermediate layer, which can be varied.
- the geometry of the microchip can be easily changed, e.g. the design of the channels, the filling holes and the pattern of the pores. Any number of membrane structures can thus be generated simultaneously and arranged as desired.
- volume flow of the order of 1 to 100 .mu.l / min. aspirated, with larger volumetric flows, i. large pressure differences, tubular membranes arise.
- volume flows refer to microchips with channels in the order of 100 ⁇ m wide and 30 ⁇ m high.
- an intermediate layer is used with pores whose diameter is in the order of 2 to 3 microns.
- aqueous solutions are introduced into the two channels.
- Organic solutions can also be used.
- the invention also provides an apparatus for performing the method described above, which has a microchip with two channels, which are separated by a microporous intermediate layer, wherein a channel with a pressure difference between the two channels generating device is connected.
- This device for generating a pressure difference is preferably designed as a pump, so that the pressure difference is generated by the fact that from the (rear) channel, the aqueous solution is sucked off with the forming membranes.
- the micropores in the intermediate layer have diameters in the order of a few microns.
- the channels are between 10 and 100 microns wide and high.
- the method described above and the device described above enable automated reproducible production of microreactors or micro-tubes of homogeneous size.
- By separating the areas in front of and behind the thin intermediate layer it is possible to directly fill the membranes or vesicles, or any desired number of substances can be passed through the lipid tubes in a targeted manner, ie. the solution enclosed within the structures may be different than the surrounding solution. No further purification / separation steps are required. Since all processes take place on a microchip and in an aqueous phase, further reaction / manipulation / analysis steps can be carried out directly on the chip.
- the vesicles can be used as microreactors, eg for carrying out and analyzing biochemical / chemical reactions. Since they can be produced at high speed (presumably up to 100 vesicles per second and per pore) and in always identical size, can they are used as carriers of active ingredients in pharmacy / medicine, as well as for drug development. The range of application can be extended by inserting membrane proteins into the vesicle membrane.
- the membrane hoses are generated stress-free and not bound to a vesicle. As long as sufficient material is available during production, the diameter of the channels does not become smaller with increasing length or retracts again after the pressure difference has disappeared. It is likely that they can be prepared by suitable methods, e.g. optical busting or micromanipulation can be interconnected so that complex but changeable networks of lipid tubing can be constructed. Both structural types, both spherical and tubular membranes, can further contribute to solving fundamental issues in cell biology (e.g., how to transport substances along a lipid tube, etc.).
- 1 is a side view of an apparatus for performing the method
- FIG. 1 a an enlarged detail of FIG. 1,
- 3 shows a schematic representation of a lipid molecule, a unilamellar lipid membrane and a multi-lamellar lipid membrane
- 4 is a schematic representation of a spherical vesicle
- FIG. 5 shows a schematic representation of a lipid tube
- Fig. 6 is a photograph of a with a
- FIG. 8 is an illustration of lipid tubes formed on the intermediate layer
- An apparatus for carrying out the method for producing spherical or tubular artificial membranes from self-assembling film-forming molecules, in particular from lipids, has a microchip, generally designated 1.
- This microchip 1 has two channels 2, 3, which are contained in two PDMS (silicon) layers of the microchip. Between the two channels 2, 3 an intermediate layer 4 is arranged, which preferably consists of silicon, in particular SiO 2 / Si 3 N 4 .
- the intermediate layer 4 is provided with micropores in a size of for example 2.5 microns.
- the microchip 1 On the underside, the microchip 1 has a glass carrier 5 for stabilization.
- a micropore 6 of the intermediate layer 4 is shown. Furthermore, a forming spherical membrane in the region of the pore 6 is indicated and designated 7.
- lipid film e.g. 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine.
- lipids and amphiphilic molecules can be used, or in other words, self-assembling film-forming molecules.
- the channels 2 and 3 are filled with water or an aqueous solution, which may also be different aqueous solutions.
- the lipid film is now pressed through the pores 7. This can be done by positive pressure on the side of the lipid film (the channel 2 side facing), but preferably by negative pressure on the other side of the intermediate layer 4, that is adjacent to the channel 3. For this purpose, preferably at the output of the channel 3 is not shown Pump connected.
- a pressure difference between the channel 2 and the channel 3 a flow is generated in front of or behind the micropores 6. The magnitude of the pressure difference acting on the micropores 6 influences the resulting membrane structures.
- tubular membranes are generated, which can reach a length of up to 1.5 cm and more. These tubular membranes are stable, even if no pressure difference exists, ie they no longer change their diameter. They are flexible against movement, ie they can be moved or rotated in any direction.
- the diameter of the lipid tubes is presumably determined by the diameter of the micropores 6 in the intermediate layer 4, which can be varied within the limits of photolithography.
- the geometry of the microchip can be easily changed, e.g. the design of the channels 2, 3 of the filling openings and the pattern of the micropores 6.
- any number of lipid structures can be generated simultaneously and arranged arbitrarily.
- lipid molecule and lipid membranes forming therefrom are shown schematically by way of example in FIG.
- a single lipid molecule is shown on the left in FIG. 3, it has a polar head group 8 and two nonpolar hydrocarbon chains 9, 10.
- FIG. 3 shows a unilamellar lipid membrane 11, as arranged in an aqueous solution, with the polar head groups pointing outwards.
- FIG. 3 shows a lipid film or a multilamellar lipid membrane 12.
- FIGS. 4 and 5 are illustrated by the method. end membrane structures.
- FIG. 4 shows a spherical membrane or, in the case of lipids, a spherical vesicle 13,
- FIG. 5 shows a tubular membrane 14.
- FIG. 6 shows the intermediate layer 4 of SiO 2 / Si 3 N 4 with an exemplary width of 100 ⁇ m and pores with a diameter of approximately 2.5 ⁇ m, the intermediate layer being covered with a lipid film which is dyed with a fluorescent dye.
- FIG. 7 it can be seen that lipid vesicles have formed on the micropores due to the pressure difference between the channels 2, 3 on both sides of the intermediate layer 4.
- FIG. 8 shows the intermediate layer 4 of SiO 2 / Si 3 N 4 with the individual micropores.
- FIG. 9 shows the lipid tubes forming in the direction of flow.
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Abstract
Description
"Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von kuαel- oder schlauchförmigen künstlichen Membranen""Method and device for the production of tubular or tubular artificial membranes"
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von kugel- oder schlauchförmigen künstlichen Membranen aus selbstorganisierenden filmbildenden Molekülen, insbesondere aus Lipiden, bei welchem die filmbildenden Moleküle schichtförmig von zwei Seiten mit einer Lösung, insbesondere einer wassrigen Lösung, in Kontakt gebracht werden, sowie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.The invention relates to a process for the production of spherical or tubular artificial membranes from self-assembling film-forming molecules, in particular from lipids, in which the film-forming molecules are contacted in layers from two sides with a solution, in particular an aqueous solution, and a device for Implementation of this procedure.
Künstliche Membranen, insbesondere aus Lipiden, sind bereits seit langer Zeit im Blickpunkt der Forschung. Diese Membranen sind einfache Modelle für biologische Membranen, die Zellen bzw. Zellbestandteile umgeben und an der zelluläre Prozesse, wie z.B. die Endo-/Exocytose, d.h. der Transport von Substanzen durch die Membran, beobachtet werden können.Artificial membranes, especially lipids, have long been in the focus of research. These membranes are simple models of biological membranes that surround cells or cellular constituents and participate in cellular processes, such as cell proliferation. the endo- / exocytosis, i. the transport of substances through the membrane, can be observed.
Eine Aufgabe, die Membranen in der Natur erfüllen, ist die Bildung von Kompartimenten, die die jeweils eingeschlossenen Bereiche von der Umgebung abgrenzen. Dadurch kann z.B. eine hohe Osmolarität (hohe Ionenkonzentration) innerhalb der Zelle gegenüber einer geringen Osmolarität außerhalb der Zelle aufrechterhalten werden. Nur durch spezielle Prozesse kann ein Austausch von Substanzen erfolgen. Membranen besitzen weiterhin Zusammenhalt und Stabilität, z.B., um in Nervenzellen einen Transportweg für unterschiedliche ZeIl- bestandteile zu bilden.One of the tasks that membranes have to fulfill in nature is the formation of compartments that delimit the enclosed areas from the environment. Thereby, e.g. high osmolarity (high ion concentration) is maintained within the cell against low osmolarity outside the cell. Only special processes can be used to exchange substances. Membranes also have cohesiveness and stability, for example, to provide a transport pathway for nerve cells in different cell components.
Aufgrund ihres Potentials, Mikroreaktoren oder Schläuche zu bilden, sind Lipidmembranen auch für die Biotechnologie von großer Bedeutung. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um lipide Vesikel herzustellen. Bereits Mitte der 60er Jahre des letzten Jahrhunderts wurde beobachtet, dass Lipidfilme in wässriger Lösung schwellen, d.h. Wasser dringt in den Lipidfilm ein, und sich Vesikel verschiedener Größe formen. Durch Anlegen elektrischer Felder oder Er- höhung der Temperatur konnte der Prozess der Vesikelbildung beschleunigt werden. Eine spontane Bildung von sehr kleinen Vesikeln (100 nm bis 250 nm) konnte auf einem Mikrochip erreicht werden. Dabei wurde eine organische Phase, die Lipi- de in gelöster Form enthält, durch zwei seitlich zufließende wässrige Lösungen hydrodynamisch fokussiert. An der Grenzfläche zwischen der organischen Phase und der wässri- gen Lösung werden die Vesikel gebildet.Because of their potential to form microreactors or tubing, lipid membranes are also of great importance to biotechnology. Various methods have been developed to produce lipid vesicles. As early as the mid-sixties of the last century, it was observed that lipid films swell in aqueous solution, ie, water penetrates into the lipid film and forms vesicles of various sizes. By applying electric fields or As the temperature increased, the process of vesicle formation could be accelerated. A spontaneous formation of very small vesicles (100 nm to 250 nm) could be achieved on a microchip. In this case, an organic phase containing lipid in dissolved form was hydrodynamically focused by means of two laterally inflowing aqueous solutions. At the interface between the organic phase and the aqueous solution, the vesicles are formed.
Diese bekannten Herstellungsverfahren ermöglichen bisher keine direkte Kontrolle über die Größe der Vesikel, es liegt vielmehr eine breite Verteilung vor, die von Durchmessern im nm-Bereich bis zu Durchmessern von ca. 50 μm reicht. Eine Verbesserung der Größenverteilung wurde durch die Extrusion von Vesikelsuspensionen durch poröse Folien mit definierter Porengröße erreicht.These known production methods do not hitherto allow any direct control over the size of the vesicles, but there is a broad distribution, ranging from diameters in the nm range up to diameters of about 50 microns. An improvement in size distribution was achieved by the extrusion of vesicle suspensions through porous films of defined pore size.
Allen bisher bekannten Herstellungsverfahren ist gemeinsam, dass während der Bildung der Membran ein Bereich der Lösung eingeschlossen wird. Dabei ist die Lösung im Inneren der Lipidstruktur identisch mit der Lösung außerhalb. Die äußere Lösung kann durch Verdünnung bzw. Abzentrifugieren der Vesikelsuspension abgetrennt werden. In vielen Anwendungen sollen in den Vesikeln Reaktionen unterschiedlicher Substanzen durchgeführt und untersucht werden. Hierzu können durch verschiedene Prozesse, z.B. Mikroinjektionen, Elek- troporation oder Fusion zweier unterschiedlich gefüllter Vesikel, weitere Substanzen in ein Vesikel eingeführt werden.All previously known production methods have in common that during the formation of the membrane, a region of the solution is included. The solution inside the lipid structure is identical to the solution outside. The outer solution can be separated by dilution or centrifugation of the vesicle suspension. In many applications reactions of different substances should be carried out and investigated in the vesicles. For this purpose, by various processes, e.g. Microinjections, electroporation or fusion of two differently filled vesicles, further substances are introduced into a vesicle.
Die Herstellungsverfahren basieren auf der Eigenschaft von Lipiden oder anderen selbstorganisierenden filmbildenden Molekülen, sich spontan zu einer geordneten, ein- oder mehrschichtigen (sogenannte uni- oder multilamellaren) Membran zusammenzulagern. Dabei werden keine chemischen (kovalenten) Bindungen gebildet, sondern es treten nur Wechselwirkungen zwischen den Lipiden auf, so dass sich die Strukturen unter entsprechenden Bedingungen leicht in ihrer Form oder Zusammensetzung verändern lassen.The preparation methods are based on the property of lipids or other self-assembling film-forming molecules to spontaneously assemble into an ordered, single or multi-layered (so-called unilamellar or multilamellar) membrane. There will be no chemical (Covalent) bonds formed, but there are only interactions between the lipids, so that the structures can be easily changed under appropriate conditions in their shape or composition.
So wurden ausgehend von sphärischen Vesikeln Membranschläuche gezogen, z.B. mittels einer Pipette, in der ein leichter Unterdruck besteht. Die so hergestellten Schläuche haben üblicherweise einen Durchmesser im Bereich von 20 bis 200 nm, die maximale Länge, die beschrieben wurde, liegt bei einigen hundert Mikrometern. Bei diesem Herstellungsverfahren sind die Membranschläuche nur stabil, solange sie an beiden Enden befestigt sind, d.h. sie bilden sich zurück, wenn der Unterdruck der Pipette gelöst wird. Mit der Pipettenmethode wurden weiterhin Netzwerke von Nanokanälen hergestellt, die verschiedene Vesikel bzw. Vesikel mit biologischen Zellen verbinden. Da diese Kanäle jedoch nur metastabil sind, sind beliebige Anordnungen von Netzwerken nicht möglich. Es wurde ebenfalls beobachtet, dass sich lipide Schläuche in fließenden Systemen aus Zellmembranen oder Vesikeln ausbilden, die sich zurückbilden, sobald der Fluss gestoppt wird.Thus, membrane hoses were drawn from spherical vesicles, e.g. by means of a pipette, in which there is a slight negative pressure. The hoses thus produced usually have a diameter in the range of 20 to 200 nm, the maximum length which has been described is a few hundred micrometers. In this manufacturing process, the membrane tubes are only stable as long as they are attached at both ends, i. they form back when the vacuum of the pipette is released. The pipette method has also been used to create networks of nanochannels that connect different vesicles or vesicles with biological cells. However, since these channels are only metastable, arbitrary arrangements of networks are not possible. It has also been observed that lipid tubing in fluid systems forms from cell membranes or vesicles, which regress as the flow is stopped.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Lösung zu schaffen, mit der derartige künstliche Membranen in Kugel- oder Schlauchform reproduzierbar, stabil und weitgehend automatisiert hergestellt werden können.The object of the invention is to provide a solution with which such artificial membranes in spherical or tubular form reproducible, stable and largely automated can be produced.
Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren der eingangs bezeichneten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass die filmbildenden Moleküle auf eine zwei Kanäle eines Mikro- chips trennende, Mikroporen aufweisende Zwischenschicht aufgebracht wird und die beiden Kanäle jeweils mit einer wässrigen Lösung befüllt werden und dass anschließend zwischen den beiden Kanälen eine Druckdifferenz erzeugt wird. Mit einem solchen Verfahren lassen sich kugelförmige, d.h. sphärische Strukturen und auch schlauchförmige Strukturen aus selbstorganisierenden filmbildenden Molekülen, insbesondere aus Lipiden, mit Durchmessern bis zu wenigen Mikrometern auf einem Mikrochip herstellen. Dazu wird die Poren aufweisende Zwischenschicht zwischen den beiden Kanälen des Mikrochips mit einer filmartigen Schicht aus den filmbildenden Molekülen beschichtet, d.h. ein solcher Film wird auf die Zwischenschicht aufgetragen. Dazu sind die filmbildenden Moleküle vorzugsweise in einer organischen Lösung als Lösungsmittel enthalten. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels werden die beiden Kanäle mit Wasser bzw. einer wässrigen Lösung befüllt. Durch Erzeugung einer Druckdifferenz zwischen den beiden Kanälen werden dann die sich bildenden Membranstrukturen durch die Poren in Richtung der filmabgewandten Seite hindurchgedrückt, also quasi extru- diert, wobei je nach Dimensionierung der Mikroporen und der Druckdifferenz bzw. der Flussgeschwindigkeit in den Kanälen reproduzierbar dreidimensionale Strukturen aus künstlichen Membranen erzeugt werden können. Diese Membranen können als Mikroreaktoren oder Transportkanäle für biotechnologische oder auch pharmazeutische Anwendungen eingesetzt werden.This object is achieved by a method of the type described in the present invention that the film-forming molecules on a two-channel microchip separating, microporous separating intermediate layer is applied and the two channels are each filled with an aqueous solution and that then between the two Channels a pressure difference is generated. With such a method, spherical, ie spherical structures and also tubular structures of self-assembling film-forming molecules, in particular of lipids, with diameters up to a few micrometers can be produced on a microchip. For this purpose, the pore-containing intermediate layer between the two channels of the microchip is coated with a film-like layer of the film-forming molecules, ie, such a film is applied to the intermediate layer. For this, the film-forming molecules are preferably contained in an organic solution as a solvent. After evaporation of the solvent, the two channels are filled with water or an aqueous solution. By generating a pressure difference between the two channels, the forming membrane structures are then forced through the pores in the direction of the side facing away from the film, so to speak, extruded, depending on the dimensions of the micropores and the pressure difference or the flow velocity in the channels reproducible three-dimensional structures artificial membranes can be generated. These membranes can be used as microreactors or transport channels for biotechnological or pharmaceutical applications.
Zur Erzeugung der Druckdifferenz ist bevorzugt vorgesehen, dass die wässrige Lösung aus einem Kanal abgesaugt wird. Wenn die Druckdifferenz gering ist, bilden sich bevorzugt sphärische und zylinderförmige, auch ringförmige Komparti- mente (Tori) sind zu beobachten. Sofern keine Scherkräfte an der Rückseite der Mikroporen einwirken, bleiben die gebildeten Membranen bzw. Vesikeln dort haften.To generate the pressure difference, it is preferably provided that the aqueous solution is sucked out of a channel. If the pressure difference is small, spherical and cylindrical, tori-shaped compartments (tori) are preferably formed. If no shear forces act on the back of the micropores, the membranes or vesicles formed adhere there.
Erzeugt man eine hohe Druckdifferenz (durch Saugen auf der filmabgewandten Seite) , werden Schläuche erzeugt, die eine Länge von mehr als 1,5 cm erreichen können. Diese Schläuche sind stabil, auch wenn die Druckdifferenz gestoppt wird, d.h. sie verändern nicht mehr ihren Durchmesser. Sie sind flexibel gegenüber Bewegung, d.h. sie können bewegt oder in beliebige Richtungen gedreht werden.Producing a high pressure difference (by sucking on the side facing away from the film) produces tubes that can reach a length of more than 1.5 cm. These hoses are stable even when the pressure difference is stopped ie they no longer change their diameter. They are flexible against movement, ie they can be moved or rotated in any direction.
Der Durchmesser der Lipidschläuche wird (vermutlich) durch den Durchmesser der Poren in der dünnen Zwischenschicht bestimmt, der variiert werden kann. Ebenso kann die Geometrie des Mikrochips leicht verändert werden, z.B. das Design der Kanäle, der Einfüllöffnungen und das Muster der Poren. Damit können beliebig viele Membranstrukturen simultan erzeugt und beliebig angeordnet werden.The diameter of the lipid tubes is (presumably) determined by the diameter of the pores in the thin intermediate layer, which can be varied. Likewise, the geometry of the microchip can be easily changed, e.g. the design of the channels, the filling holes and the pattern of the pores. Any number of membrane structures can thus be generated simultaneously and arranged as desired.
Je nachdem, ob kugelförmige oder schlauchförmige künstliche Membranen erzeugt werden sollen, wird ein Volumenstrom in der Größenordnung von 1 bis 100 μl/min. abgesaugt, wobei bei größeren Volumenströmen, d.h. großen Druckdifferenzen, schlauchförmige Membranen entstehen. Diese Volumenströme beziehen sich auf Mikrochips mit Kanälen in einer Größenordnung von 100 μm Breite und 30 μm Höhe.Depending on whether spherical or tubular artificial membranes are to be produced, a volume flow of the order of 1 to 100 .mu.l / min. aspirated, with larger volumetric flows, i. large pressure differences, tubular membranes arise. These volume flows refer to microchips with channels in the order of 100 μm wide and 30 μm high.
Bevorzugt ist vorgesehen, dass eine Zwischenschicht mit Poren verwendet wird, deren Durchmesser in der Größenordnung von 2 bis 3 μm liegen.It is preferably provided that an intermediate layer is used with pores whose diameter is in the order of 2 to 3 microns.
In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung ist vorgesehen, dass in die beiden Kanäle unterschiedliche wässrige Lösungen eingefüllt werden. Es können auch organische Lösungen verwendet werden.In a further advantageous embodiment, it is provided that different aqueous solutions are introduced into the two channels. Organic solutions can also be used.
Zur Lösung der eingangs gestellten Aufgabe sieht die Erfindung auch eine Vorrichtung zur Durchführung des vorbeschriebenen Verfahrens vor, welche einen Mikrochip mit zwei Kanälen aufweist, die durch eine Mikroporen aufweisende Zwischenschicht voneinander getrennt sind, wobei ein Kanal mit einer eine Druckdifferenz zwischen den beiden Kanälen erzeugende Einrichtung verbunden ist.To achieve the object set forth, the invention also provides an apparatus for performing the method described above, which has a microchip with two channels, which are separated by a microporous intermediate layer, wherein a channel with a pressure difference between the two channels generating device is connected.
Diese Einrichtung zur Erzeugung einer Druckdifferenz ist bevorzugt als Pumpe ausgebildet, so dass die Druckdifferenz dadurch erzeugt wird, dass aus dem (rückwärtigen) Kanal die wässrige Lösung mit den sich bildenden Membranen abgesaugt wird.This device for generating a pressure difference is preferably designed as a pump, so that the pressure difference is generated by the fact that from the (rear) channel, the aqueous solution is sucked off with the forming membranes.
Bevorzugt ist vorgesehen, dass die Mikroporen in der Zwischenschicht Durchmesser in der Größenordnung von wenigen μm aufweisen.It is preferably provided that the micropores in the intermediate layer have diameters in the order of a few microns.
Ferner hat es sich als bevorzugt herausgestellt, dass die Kanäle zwischen 10 und 100 μm breit und hoch sind.Furthermore, it has been found preferable that the channels are between 10 and 100 microns wide and high.
Das vorbeschriebene Verfahren und die vorbeschriebene Vorrichtung ermöglichen eine automatisierte reproduzierbare Erzeugung von Mikroreaktoren oder Mikroschläuchen homogener Größe. Durch die Trennung der Bereiche vor und hinter der dünnen Zwischenschicht kann direkt eine Befüllung der Membranen bzw. Vesikel erfolgen bzw. können beliebig viele Substanzen gezielt durch die Lipidschläuche geleitet werden, d.h. die innerhalb der Strukturen eingeschlossene Lösung kann eine andere sein als die umgebende Lösung. Keine weiteren Aufreinigungs-/Abtrennungsschritte sind erforderlich. Da sämtliche Vorgänge auf einem Mikrochip und in wässriger Phase erfolgen, können weitere Reaktions-/Ma- nipulations-/Analyseschritte direkt im Anschluss auf dem Chip durchgeführt werden.The method described above and the device described above enable automated reproducible production of microreactors or micro-tubes of homogeneous size. By separating the areas in front of and behind the thin intermediate layer, it is possible to directly fill the membranes or vesicles, or any desired number of substances can be passed through the lipid tubes in a targeted manner, ie. the solution enclosed within the structures may be different than the surrounding solution. No further purification / separation steps are required. Since all processes take place on a microchip and in an aqueous phase, further reaction / manipulation / analysis steps can be carried out directly on the chip.
Die Vesikel können als Mikroreaktoren eingesetzt werden, z.B. für die Durchführung und Analyse von bio- /chemischen Reaktionen. Da sie mit hoher Geschwindigkeit (von vermutlich bis zu 100 Vesikel pro Sekunde und pro Pore) und in stets identischer Größe hergestellt werden können, können sie als Träger von Wirkstoffen in der Pharmazie/Medizin Anwendung finden, ebenso für die Medikamententwicklung. Das Anwendungsspektrum läßt sich durch Einfügen von Membranproteinen in die Vesikelmembran noch erweitern.The vesicles can be used as microreactors, eg for carrying out and analyzing biochemical / chemical reactions. Since they can be produced at high speed (presumably up to 100 vesicles per second and per pore) and in always identical size, can they are used as carriers of active ingredients in pharmacy / medicine, as well as for drug development. The range of application can be extended by inserting membrane proteins into the vesicle membrane.
Die Membranschläuche sind spannungsfrei erzeugt und nicht an ein Vesikel gebunden. Solange bei der Herstellung ausreichend Material zur Verfügung steht, wird der Durchmesser der Kanäle nicht mit zunehmender Länge geringer oder zieht sich nach Wegfall der Druckdifferenz wieder zurück. Es ist wahrscheinlich, dass sie sich durch geeignete Methoden, z.B. optisches Trappen oder Mikromanipulation untereinander verbinden lassen, so dass komplizierte, aber veränderbare Netzwerke aus Lipidschläuchen aufgebaut werden können. Beide Strukturtypen, sowohl kugelförmige als auch schlauchförmige Membranen, können weiterhin dazu beitragen, grundlegende Fragestellungen in der Zellbiologie zu lösen (z.B. wie der Transport von Substanzen entlang eines Lipidschlau- ches erfolgt usw.) .The membrane hoses are generated stress-free and not bound to a vesicle. As long as sufficient material is available during production, the diameter of the channels does not become smaller with increasing length or retracts again after the pressure difference has disappeared. It is likely that they can be prepared by suitable methods, e.g. optical busting or micromanipulation can be interconnected so that complex but changeable networks of lipid tubing can be constructed. Both structural types, both spherical and tubular membranes, can further contribute to solving fundamental issues in cell biology (e.g., how to transport substances along a lipid tube, etc.).
Die Erfindung ist nachstehend anhand der Zeichnungen beispielhaft näher erläutert. Diese zeigen in:The invention is explained in more detail below with reference to the drawings by way of example. These show in:
Fig. 1 eine Seitenansicht auf eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens,1 is a side view of an apparatus for performing the method,
Fig. Ia ein vergrößertes Detail der Figur 1,1 a an enlarged detail of FIG. 1,
Fig. 2 eine Explosionsdarstellung der Figur 1,2 is an exploded view of Figure 1,
Fig. 3 eine schematische Darstellung eines Lipidmoleküls, einer unilamellaren Lipidmembran und einer multi- lamellaren Lipidmembran, Fig. 4 eine schematische Darstellung eines kugelförmigen Vesikels,3 shows a schematic representation of a lipid molecule, a unilamellar lipid membrane and a multi-lamellar lipid membrane, 4 is a schematic representation of a spherical vesicle,
Fig. 5 eine schematische Darstellung eines Lipid- schlauches,5 shows a schematic representation of a lipid tube,
Fig. 6 eine fotographische Darstellung einer mit einemFig. 6 is a photograph of a with a
Lipidfilm überdeckten Zwischenschicht der Vorrichtung,Lipid film covered intermediate layer of the device,
Fig. 7 eine fotographische Darstellung der an den Poren der Zwischenschicht gebildeten lipiden Vesikel,7 shows a photographic representation of the lipid vesicles formed on the pores of the intermediate layer,
Fig. 8 eine Darstellung von an der Zwischenschicht gebildeten Lipidschläuchen und8 is an illustration of lipid tubes formed on the intermediate layer and FIG
Fig. 9 in anderer Darstellung die gebildeten Lipid- schläuche .9 shows in another illustration the lipid tubes formed.
Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur Herstellung von kugel- oder schlauchförmigen künstlichen Membranen aus selbstorganisierenden filmbildenden Molekülen, insbesondere aus Lipiden, weist einen allgemein mit 1 bezeichneten Mikrochip auf. Dieser Mikrochip 1 weist zwei Kanäle 2, 3 auf, die in zwei PDMS (Silikon) -Schichten des Mikrochips enthalten sind. Zwischen den beiden Kanälen 2, 3 ist eine Zwischenschicht 4 angeordnet, die vorzugsweise aus Silizium besteht, insbesondere SiO2/Si3N4. Die Zwischenschicht 4 ist mit Mikroporen in einer Größe von beispielsweise 2,5 μm versehen. Unterseitig weist der Mikrochip 1 zur Stabilisierung einen Glasträger 5 auf.An apparatus for carrying out the method for producing spherical or tubular artificial membranes from self-assembling film-forming molecules, in particular from lipids, has a microchip, generally designated 1. This microchip 1 has two channels 2, 3, which are contained in two PDMS (silicon) layers of the microchip. Between the two channels 2, 3 an intermediate layer 4 is arranged, which preferably consists of silicon, in particular SiO 2 / Si 3 N 4 . The intermediate layer 4 is provided with micropores in a size of for example 2.5 microns. On the underside, the microchip 1 has a glass carrier 5 for stabilization.
In der vergrößerten Detaildarstellung gemäß Figur Ia ist - S -In the enlarged detail illustration according to FIG. 1a - S -
eine Mikropore 6 der Zwischenschicht 4 gezeigt. Ferner ist eine sich bildende kugelförmige Membran im Bereich der Pore 6 angedeutet und mit 7 bezeichnet.a micropore 6 of the intermediate layer 4 is shown. Furthermore, a forming spherical membrane in the region of the pore 6 is indicated and designated 7.
Auf die dünne Zwischenschicht 4 wird ein Lipidfilm aufgetragen, z.B. 1, 2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine. Selbstverständlich können auch eine Vielzahl anderer Lipide und amphiphiler Moleküle verwendet werden oder in anderer Bezeichnung selbstorganisierende filmbildende Moleküle. Die Kanäle 2 und 3 werden mit Wasser bzw. einer wässrigen Lösung befüllt, dabei kann es sich auch um unterschiedliche wässrige Lösungen handeln.On the thin intermediate layer 4, a lipid film is applied, e.g. 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine. Of course, a variety of other lipids and amphiphilic molecules can be used, or in other words, self-assembling film-forming molecules. The channels 2 and 3 are filled with water or an aqueous solution, which may also be different aqueous solutions.
Der Lipidfilm wird nun durch die Poren 7 gepresst. Dies kann durch positiven Druck auf der Seite des Lipidfilms (dem Kanal 2 zugewandte Seite) erfolgen, bevorzugt aber durch Unterdruck auf der anderen Seite der Zwischenschicht 4, also angrenzend an den Kanal 3. Dazu ist bevorzugt an den Ausgang des Kanals 3 eine nicht dargestellte Pumpe angeschlossen. Durch Anlegen einer Druckdifferenz zwischen dem Kanal 2 und dem Kanal 3 wird ein Fluss vor bzw. hinter den Mikroporen 6 erzeugt. Die Höhe der Druckdifferenz, die auf die Mikroporen 6 einwirkt, beeinflusst die entstehenden Membranstrukturen.The lipid film is now pressed through the pores 7. This can be done by positive pressure on the side of the lipid film (the channel 2 side facing), but preferably by negative pressure on the other side of the intermediate layer 4, that is adjacent to the channel 3. For this purpose, preferably at the output of the channel 3 is not shown Pump connected. By applying a pressure difference between the channel 2 and the channel 3, a flow is generated in front of or behind the micropores 6. The magnitude of the pressure difference acting on the micropores 6 influences the resulting membrane structures.
Für kleine Druckdifferenzen, welche Volumenströme in der Größenordnung von 1 μl/min. bei einer Breite von 100 μm und einer Höhe von 30 μm der Kanäle 2, 3 verursachen, bilden sich bevorzugt kugelförmige und zylinderförmige Vesikel. Auch ringförmige Kompartimente sind zu beobachten. Sofern keine Scherkräfte an der Rückseite der Mikroporen 6 einwirken, bleiben die gebildeten Vesikel dort haften.For small pressure differences, which volume flows in the order of 1 .mu.l / min. cause at a width of 100 microns and a height of 30 microns of the channels 2, 3, preferably form spherical and cylindrical vesicles. Also annular compartments can be observed. If no shear forces act on the back of the micropores 6, the vesicles formed adhere there.
Erzeugt man demgegenüber eine hohe Druckdifferenz durch Saugen auf der Rückseite, so dass Volumenströme von bis zu 100 μl/min. entstehen, werden schlauchförmige Membranen erzeugt, die eine Länge von bis zu 1,5 cm und mehr erreichen können. Diese schlauchförmigen Membranen sind stabil, auch wenn keine Druckdifferenz mehr besteht, d.h. sie verändern ihren Durchmesser nicht mehr. Sie sind flexibel gegenüber Bewegung, d.h. sie können bewegt oder in beliebige Richtungen gedreht werden.On the other hand, if a high pressure difference is produced Suction on the back, allowing flow rates of up to 100 μl / min. arise, tubular membranes are generated, which can reach a length of up to 1.5 cm and more. These tubular membranes are stable, even if no pressure difference exists, ie they no longer change their diameter. They are flexible against movement, ie they can be moved or rotated in any direction.
Der Durchmesser der Lipidschläuche (schlauchförmige Membranen) wird vermutlich durch den Durchmesser der Mikro- poren 6 in der Zwischenschicht 4 bestimmt, welcher innerhalb der Grenzen der Photolitographie variiert werden kann. Ebenso kann die Geometrie des Mikrochips leicht verändert werden, z.B. das Design der Kanäle 2, 3 der Einfüllöffnungen und das Muster der Mikroporen 6. Damit können beliebig viele Lipidstrukturen simultan erzeugt und beliebig angeordnet werden.The diameter of the lipid tubes (tubular membranes) is presumably determined by the diameter of the micropores 6 in the intermediate layer 4, which can be varied within the limits of photolithography. Likewise, the geometry of the microchip can be easily changed, e.g. the design of the channels 2, 3 of the filling openings and the pattern of the micropores 6. Thus, any number of lipid structures can be generated simultaneously and arranged arbitrarily.
Zur besseren Erläuterung sind beispielhaft schematisch in der Figur 3 ein Lipidmolekül und daraus sich bildende Lipidmembranen dargestellt. Ein einzelnes Lipidmolekül ist links in Figur 3 dargestellt, es weist eine polare Kopfgruppe 8 und zwei unpolare Kohlenwasserstoffketten 9, 10 auf.For a better explanation, a lipid molecule and lipid membranes forming therefrom are shown schematically by way of example in FIG. A single lipid molecule is shown on the left in FIG. 3, it has a polar head group 8 and two nonpolar hydrocarbon chains 9, 10.
In der mittleren Darstellung der Figur 3 ist eine uni- lamellare Lipidmembran 11 gezeigt, wie sie sich in einer wässrigen Lösung anordnet, und zwar mit den polaren Kopf- gruppen nach außen.3 shows a unilamellar lipid membrane 11, as arranged in an aqueous solution, with the polar head groups pointing outwards.
Die rechte Darstellung der Figur 3 zeigt einen Lipidfilm bzw. eine multilamellare Lipidmembran 12.The right-hand representation of FIG. 3 shows a lipid film or a multilamellar lipid membrane 12.
Die Figuren 4 und 5 zeigen sich durch das Verfahren bil- dende Membranstrukturen. Figur 4 zeigt eine kugelförmige Membran bzw. bei Lipiden ein sphärisches Vesikel 13, in Figur 5 ist eine schlauchförmige Membran 14 dargestellt.FIGS. 4 and 5 are illustrated by the method. end membrane structures. FIG. 4 shows a spherical membrane or, in the case of lipids, a spherical vesicle 13, FIG. 5 shows a tubular membrane 14.
In den Figuren 6 bis 9 sind experimentelle Ergebnisse gezeigt .In Figures 6 to 9 experimental results are shown.
Figur 6 zeigt die Zwischenschicht 4 aus SiO2/Si3N4 mit einer beispielhaften Breite von 100 μm und Poren mit einem Durchmesser von ungefähr 2,5 μm, die Zwischenschicht ist mit einem Lipidfilm überdeckt, der mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefärbt ist.FIG. 6 shows the intermediate layer 4 of SiO 2 / Si 3 N 4 with an exemplary width of 100 μm and pores with a diameter of approximately 2.5 μm, the intermediate layer being covered with a lipid film which is dyed with a fluorescent dye.
In Figur 7 ist zu erkennen, dass sich durch die Druckdifferenz zwischen den Kanälen 2, 3 beiderseits der Zwischenschicht 4 an den Mikroporen lipide Vesikel ausgebildet haben.In FIG. 7 it can be seen that lipid vesicles have formed on the micropores due to the pressure difference between the channels 2, 3 on both sides of the intermediate layer 4.
Figuren 8 und 9 zeigen in ähnlicher Darstellung wie in Figuren 6 und 7 die Bildung von Lipidschläuchen bei hohen Druckdifferenzen. In der Figur 8 ist die Zwischenschicht 4 aus SiO2/Si3N4 mit den einzelnen Mikroporen zu erkennen. Figur 9 zeigt die in Flussrichtung verlaufenden, sich bildenden Lipidschläuche. Figures 8 and 9 show in a similar representation as in Figures 6 and 7, the formation of lipid tubes at high pressure differences. FIG. 8 shows the intermediate layer 4 of SiO 2 / Si 3 N 4 with the individual micropores. FIG. 9 shows the lipid tubes forming in the direction of flow.
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