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WO2007029361A1 - 短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸含有徐放性マイクロスフェア及びその製造法 - Google Patents

短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸含有徐放性マイクロスフェア及びその製造法 Download PDF

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WO2007029361A1
WO2007029361A1 PCT/JP2006/304089 JP2006304089W WO2007029361A1 WO 2007029361 A1 WO2007029361 A1 WO 2007029361A1 JP 2006304089 W JP2006304089 W JP 2006304089W WO 2007029361 A1 WO2007029361 A1 WO 2007029361A1
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WO
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sustained
acid
short
release
sirna
Prior art date
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PCT/JP2006/304089
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroaki Okada
Yuki Takashima
Naoyuki Murata
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences
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Publication date
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Priority to US12/065,255 priority patent/US20100310670A1/en
Priority to JP2007534248A priority patent/JPWO2007029361A1/ja
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Definitions

  • the present invention relates to a short-term ribonucleic acid (siRNA; small interfering RNA) that suppresses the expression of a specific protein, particularly a protein related to a disease.
  • the present invention relates to a sustained-release microsphere that releases siRNA stably and continuously and a method for producing the same. This sustained-release microsphere is particularly useful as an injection, and can also be administered to mucous membranes such as nose, bronchus and lung.
  • antisense technology is known as a technology that has a sequence that pairs with a specific gene involved in a disease and suppresses the expression of that gene.
  • synthesized oligo-RNA and oligo-DNA, and their derivatives and RNA / DNA chimera molecules have been designed recently.
  • the biggest barrier to antisense drug development is how to incorporate drugs into cells.
  • RNAi RNA interference, RNA interference
  • siRNA small interfering RNA
  • siRNA is used in a smaller amount than the conventional antisense method. It has been attracting attention because of its effectiveness, and it has been reported that 21-29 base pair (bp) siRNA effectively knocks down the target gene.
  • JP 2005-192556 A discloses a long dsRNA for RNAi in which gene expression is effectively suppressed regardless of the target site, and interferon response with reduced force and cytotoxicity is reduced ( Interference double-stranded RNA) has been reported.
  • Patent Document 1 JP 2005-192556 A discloses a long dsRNA for RNAi in which gene expression is effectively suppressed regardless of the target site, and interferon response with reduced force and cytotoxicity is reduced ( Interference double-stranded RNA) has been reported.
  • JP 2005-508306 discloses a method for inhibiting gene expression in mammals by RNAi and the application of the composition therefor to academic and therapeutic fields.
  • Patent Document 2 JP 2005-508306 discloses a method for inhibiting gene expression in mammals by RNAi and the application of the composition therefor to academic and therapeutic fields.
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-73573 reports a method for suppressing the production of prion protein, which is considered as a causative factor of mad cow disease, which is one of intractable diseases, and the application of RNAi technology as its application.
  • JP-T-2004-535813 discloses a method for selective post-transcriptional silencing of exogenous gene expression of viral origin in mammalian cells using siRNA.
  • Patent Document 4 JP-T-2004-535813 discloses a method for selective post-transcriptional silencing of exogenous gene expression of viral origin in mammalian cells using siRNA.
  • J Drug Target, 12, 393-404 (2004) discloses a biodegradable polymer consisting of an oligonucleotide bound to an antisense oligonucleotide, a ribozyme, a ribonucleic acid such as siRNA, and a lipid-soluble substance such as cholesterol.
  • a biodegradable polymer consisting of an oligonucleotide bound to an antisense oligonucleotide, a ribozyme, a ribonucleic acid such as siRNA, and a lipid-soluble substance such as cholesterol.
  • sustained-release formulation technology conventionally, biodegradable polymers, drugs, additives, solvents, etc. have been appropriately prepared in order to produce a dosage form in which the drug is gradually released at a constant rate.
  • Another method has been used to produce a single composition of microspheres by spray drying or other manufacturing methods.
  • As a method for producing a microsphere preparation an aqueous solution of a bioactive peptide or the like is used as an inner aqueous phase, and an organic solvent solution of a biodegradable polymer is used as an oil phase.
  • W / O emulsion is added to water or the like, and W / 0 / W
  • a process for producing sustained release microspheres from emulsion is well known.
  • the initial drug release and the release rate during the subsequent release period must be appropriately adjusted.
  • the initial drug release and release rate were adjusted.
  • sustained-release preparations as a general production method of a sustained-release drug delivery system (DDS) drug, a coacervation method, an emulsion phase separation method are used.
  • a coacervation method an emulsion phase separation method are used.
  • encapsulation by spray drying and solvent evaporation in an organic or aqueous phase are known.
  • the solvent evaporation method in the aqueous phase is the most frequently used, which is largely the emulsion evaporation method (W / 0 / W; Water / Oil / Water) and the single emulsion evaporation method (0 / W; ⁇ il / Water).
  • the W / O / W method which is mainly used for encapsulating water-soluble drugs such as peptides or proteins, contains a biodegradable polymer containing a drug-containing aqueous solution produced by dissolving the drug in an aqueous solution.
  • a primary emulsion is formed in water by dispersing it in an organic solvent, and then dispersed in an aqueous phase.
  • the 0 / W method which is mainly used for encapsulating fat-soluble drugs, dissolves (oils) the drug and biodegradable polymer together in an organic solvent or mixture of organic solvents. And then dispersing this in the aqueous phase.
  • the organic solvent phase polymer is dispersed in the aqueous phase, and the organic solvent is removed by extraction or evaporation to reduce the solubility of the polymer, resulting in solidification. Will form a microsphere
  • microspheres produced by the W / 0 / W method have increased porosity compared to microspheres produced by the 0 / W method, so that the initial release rate of the drug is relatively large as the surface area increases. There is a feature that is high.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-192556
  • Patent Document 2 Japanese Translation of Special Publication 2005-508306
  • Patent Document 3 JP-A-2005-73573
  • Patent Literature 4 Japanese Translation of Special Publication 2004-535813
  • Non-Patent Document 1 E. K Gaidamakova.J. Control Release, 74,341 (2001)
  • Non-Patent Document 2 Alim Khan, Mustapha Beenboubetra. J Drug Target, 12, 393-404 (20
  • An object of the present invention is to provide sustained-release microspheres, in which short-chain deoxyribonucleic acid or short-chain ribonucleic acid is stably encapsulated and can suppress the expression of a specific protein, particularly a protein related to a disease, over a long period of time.
  • An object of the present invention is to provide a sustained-release microsphere containing a basic substance capable of forming a complex with these nucleic acids and a method for producing the same.
  • One method is to make a long-term sustained-release injection.
  • sustained-release microsphere preparation containing a nucleic acid.
  • a basic substance having a positive charge is short.
  • sustained release microspheres prepared through microspheres, especially w / w type emulsion, with high encapsulation rate of short-chain deoxyribonucleic acid or short-chain ribonucleic acid The present invention has been completed.
  • the present invention provides a sustained-release microsphere preparation using a biodegradable polymer containing a short-chain deoxyribonucleic acid or a short-chain ribonucleic acid and a basic substance having a positive charge.
  • a microcapsule such as a w / w in-liquid drying method is produced.
  • the intended sustained-release microsphere preparation can be obtained by encapsulating short-chain deoxyribonucleic acid or short-chain ribonucleic acid in a so-called biodegradable polymer having biodegradability and biocompatibility.
  • sustained-release microsphere according to any one of 1 to 3 above, which is a siRNA having a short-chain ribonucleic acid length of 15 to 30 bases.
  • the basic substance having a positive charge is arginine, polyethyleneimine (PEI), cell-permeable peptide, poly-L-lysine, poly-L-ornithine, or siLentFect (registered trademark).
  • PEI polyethyleneimine
  • cell-permeable peptide poly-L-lysine
  • poly-L-ornithine poly-L-ornithine
  • siLentFect registered trademark
  • the positively charged basic substance is selected from the group consisting of polyethyleneimine (PEI), cell penetrating peptide, poly-L-lysine, poly-L-onorenitine or siLentFect (registered trademark) 7.
  • PEI polyethyleneimine
  • cell penetrating peptide cell penetrating peptide
  • poly-L-lysine cell penetrating peptide
  • poly-L-onorenitine poly-L-onorenitine
  • siLentFect registered trademark
  • sustained release according to any one of 1 to 7 above, further comprising a biodegradable polymer. Jusei microsphere.
  • a pharmaceutical composition comprising the sustained-release microsphere according to any one of 1 to 10 above as an active ingredient.
  • a pile cancer agent comprising the sustained-release microsphere according to any one of the above-mentioned:! To 10 as an active ingredient, wherein the short-chain deoxyribonucleic acid or the short-chain ribonucleic acid can suppress tumor cell growth
  • biodegradable polymer is a copolymer of polylactic acid and polyglycolic acid or lactic acid and glycolic acid.
  • a short-chain deoxyribonucleic acid or a short-chain ribonucleic acid can be contained in a sustained-release microsphere with a high encapsulation rate, and a short It also facilitates the uptake of long-chain deoxyribonucleic acid or short-chain ribonucleic acid into cells, which need only improve the stability outside the cells and tissues.
  • sustained-release microsphere preparation of the present invention particularly a w / o / w type emulsion, is used for preparation.
  • Produced sustained-release microspheres protect short-chain deoxyribonucleic acid or short-chain ribonucleic acid, which are normally easily degraded by enzymes in blood or cells, from enzymatic degradation, and are stable and durable. Slow release of short-chain deoxyribonucleic acid or short-chain ribonucleic acid as a component
  • RNAi effect can be obtained with an extremely small amount of short-chain ribonucleic acid.
  • the sustained-release microspheres of the present invention can release a nucleic acid as a drug over a period of 1 week to 6 months, and can suppress specific gene expression not transiently but continuously. .
  • FIG. 1 Biodegradable-biocompatible polymer (PLGA) together with different amounts of arginine and phosphorothioate-type antisense oligo DNA that suppresses the production of VEGF, an angiogenesis inhibitor. ) Is a graph showing the encapsulation rate (%) of antisense oligo DNA in microspheres prepared by encapsulation. (Example 3)
  • FIG. 3 is a graph showing the inhibition rate of VEGF production when siRNA is transfected into S-180 cells using a basic substance having a positive charge and a commercially available gene transfer reagent as a carrier. (Example 6)
  • FIG. 4 is a graph showing siRNA release characteristics from siRNA-containing PLGA microspheres.
  • FIG. 5 shows changes in tumor volume over time after administration of different concentrations of siRNA into tumor-bearing mice.
  • X is siRNA-untreated control
  • black circle is siRNA 1 ⁇ M
  • white circle is siRNA 2 ⁇
  • black triangle is siRNA 5 ⁇
  • white triangle is siRNA 10 ⁇ M
  • FIG. 6 A graph showing changes in tumor volume over time after siRNA-containing PLGA microspheres were administered into tumor-bearing mice.
  • Nucleic acid means deoxyribonucleic acid (DNA) and Z or ribonucleic acid (thigh).
  • Short-chain deoxyribonucleic acid or short-chain ribonucleic acid refers to a short-chain DNA or RNA antisense and its active derivative, a ribozyme, and a short double-stranded RNA (dsRNA; double-stranded RNA).
  • dsRNA short double-stranded RNA
  • siRNA small interfering RNA
  • siRNA can be produced using cells by using force DNA or RNA obtained by synthesis, or can be obtained commercially.
  • miRNA miRNA having a stem loop structure is also included.
  • miRNA may be included as single-stranded RNA or as double-stranded RNA (miRNA precursor) of around 70 bases. When it is contained as double-stranded RNA (miRNA precursor) of around 70 bases, single-stranded RNA is produced by the action of Dicer.
  • siRNA precursor double-stranded RNA
  • short-chain deoxyribonucleic acid or short-chain ribonucleic acid includes nucleic acid aptamer and decoy nucleic acid (bait-type nucleic acid). Nucleic acid aptamer specifically binds to the target protein Oligonucleotide (RNA / DNA) of 10 to 85 bases, preferably 20 to 60 bases, has the ability to enter into protein pockets, form a stable three-dimensional structure, and inhibit its function.
  • VEGF growth factors
  • PDGF vascular endothelial growth factor
  • bFGF growth factor
  • nerves vascular endothelial growth factor
  • enzymes kinases, proteolytic enzymes
  • signal transduction factors receptors
  • PSMA membrane proteins
  • NF- ⁇ B, B2F transcription factors
  • Decoy nuclear acid is a kind of Abama, and it can bind to the target gene and block the expression of the target gene.
  • decoy type nucleic acid examples include a double-stranded type and a ribbon type decoy nucleic acid having improved resistance to nuclease in serum.
  • decoy nucleic acid that recognizes NF- ⁇ B protein, HIV transcription growth factor (Tat protein), NS3 protease of hepatitis C virus, and the like.
  • Tat protein HIV transcription growth factor
  • NS3 protease of hepatitis C virus and the like.
  • short-chain deoxyribonucleic acid or short-chain ribonucleic acid also includes CpG oligonucleic acid.
  • CpG oligonucleic acid is an oligonucleic acid of about 20 to 30 bases containing a CpG motif in which cytosine (C) and guanine (G) such as GACGTT are usually lined up. It has a specific immune response stimulating effect. In addition, depending on the sequence, it has an inhibitory effect on immune responses. In addition to the CpG motif, it is also known that single-stranded or double-stranded RNA controls immunity, and these RNAs are also included in “short-chain deoxyribonucleic acid or short-chain ribonucleic acid”.
  • the "short-chain deoxyribonucleic acid or short-chain ribonucleic acid" of the present invention includes those in which the chemical structure is partially modified in order to improve the stability and affinity in the body. For example, introduction of a modified base of a nucleic acid molecule, modification of a phosphate bond, a derivative at the 2 ′ position of a pentose, introduction of a fluoro group into the ribose ring, substitution of an oxygen atom in the pentose with a sulfur atom 4 ′ ⁇ Including but not limited to thionucleic acid.
  • a single-stranded nucleic acid is represented by a base
  • a double-stranded nucleic acid is represented by a base or a base pair (bp).
  • double-stranded nucleic acids an example For example, 30 base pairs and 30 base pairs represent the same length.
  • the length of the “short-chain doxyribonucleic acid or short-chain ribonucleic acid” of the present invention is 10 to 85 bases, preferably 15 to 60 bases, more preferably 15 to 30 bases.
  • siRNA is RNA-interfering (RNAi) that inhibits the synthesis of the target protein by degrading mRNA in a very small amount in a cell in a cell-specific manner and suppressing the expression of a specific gene. Has the characteristics to cause.
  • RNAi is one of the knockdown techniques of target genes using siRNA, and is widely used to search for new genes that induce cell functions and differentiation, determine intracellular signaling pathways, and create knockdown cell lines and animals. It is also expected to be used in research areas.
  • siRNA is expected to be a gene therapy drug with few side effects because it can transiently and directly suppress the expression of genes related to diseases.
  • siRNA examples include, for example, production of vascular endothelial growth factor and its receptor, production of Be ⁇ 2 protein, which is said to be involved in canceration of cells, human immunodeficiency virus (HIV) And hepatitis C virus, triinfenoreza, SARS, replication of viruses causing infectious diseases of West Nile fever, tumor necrosis factor (tumor necrosis factor involved in immune and inflammatory diseases) , TNF-a, TNF- ⁇ ), mono force in, interleukin (IL), chemokine, colony stimulating factor (CSF), vascular endothelial growth factor (VEGF) Production of causative factors and related factors of various diseases, such as expression of Fas gene that induces apoptosis of cells, which is one of the factors of liver damage that occurs during infection and liver transplantation, and production of apoptosis inhibitory factors such as cFLIP Can be mentioned nucleic acid short chain showing the effect that win, is no to be limited thereto.
  • HAV human immuno
  • the tumor can be treated by blocking angiogenesis at the tumor site, and further silencing the expression of an apoptosis inhibitor at the tumor site As a result, the tumor can be treated by causing apoptosis in the tumor cells.
  • a synergistic effect can be obtained by silencing the expression of both vascular endothelial growth factor and apoptosis inhibitor at the tumor site.
  • Gene transfer carrier refers to plasmids including short-chain ribonucleic acid (dsRNA, siRNA, etc.) It means a basic carrier having a positive charge capable of forming a complex by electrostatically interacting with siRNA for specifically introducing a nucleic acid such as DNA into a target cell.
  • dsRNA short-chain ribonucleic acid
  • siRNA siRNA
  • a "basic substance having a positive charge” is a gene transfer carrier in terms of function, as long as it has a positive charge and can electrostatically interact with siRNA to form a complex.
  • a substance known as a gene transfer carrier can be used. Specific examples include positively charged lipids, ribosomes made of these, polymers, and dendrimers.
  • a carrier for gene transfer as a carrier is indispensable.
  • the method for producing a microparticle preparation according to the present invention includes a short-chain deoxyribonucleic acid and a short-chain ribonucleic acid by electrostatically interacting a negatively charged short-chain deoxyribonucleic acid and a short-chain ribonucleic acid with a positively charged gene carrier.
  • Nucleic acids are encapsulated in high molecular weight materials at a high rate, and short-chain deoxyribonucleic acid and short-chain ribonucleic acid and gene carrier complexes are released from the microparticle preparation in vivo, effectively short-chained into target cells.
  • Deoxyribonucleic acid or short ribonucleic acid can be introduced.
  • the gene transfer carrier is not particularly limited, but has a positive charge and can interact electrostatically with siRNA to form a complex, such as a positively charged lipid, a ribosome composed of this, a polymer, a dendrimer, etc. is there.
  • the “positively charged lipid” includes, for example, dimethyldiocta decyl ammonium bromide (DDAB), trimethyl-2,3-dioleoxypropyl ammonium chloride (DOTMA), Nl-2,3-dioleoyloxypropyl- ⁇ , ⁇ , ⁇ -trimethylammonium chloride (DOTAP), ⁇ -2,3-dioleoyloxy-1-propyltrimethylammonium Methyl sulfite (DOTAP methosulfate), cholesteryl 3 ⁇ - ⁇ -dimethylaminoethylcarbamate hydride chloride (DC-Choi), 1,2-dimyristyloxypropyl-3_dimethyl-hydroxyethylamine monum bromide (DMRIE ), 2,3-Dioleoxy-N-2 sperminecarboxamidoethyl _N, N-dimethylammonium trifluoroadate (DOSPA),
  • Polymer having a positive charge includes polyethyleneimine (PEI, Linear or branched), block copolymer consisting of polyethylene glycol and poly-L-lysine, and other commercially available gene introduction reagents such as Lipofectamine (registered trademark), Lipofe ctamine plus (registered trademark), jet Examples include PEI (registered trademark), Oligofectamine (registered trademark), siLentFect (registered trademark), DMRIE-C (registered trademark), Transfectin-Lipid (registered trademark), and Effectene (registered trademark).
  • PEI polyethyleneimine
  • Oligofectamine registered trademark
  • siLentFect registered trademark
  • DMRIE-C registered trademark
  • Transfectin-Lipid registered trademark
  • Effectene registered trademark
  • polyethyleneimine includes branched PEI including linear PE primary, secondary, and tertiary amines, and any of them can be used. Also, the molecular weight of PEI is not limited. In addition, PEI that has been chemically modified such as decalyzed can be used.
  • Other examples include basic substances such as arginine, polyarginine, poly-L-lysine, polyornithine, spermine, protamine, and chitosan.
  • the "dendrimer” includes a polyamidamine dendrimer, a polyamidoamine star paste dendrimer, a dendrilic polylysine, and a cyclodextrin 'dendrimer conjugate.
  • cell-permeable peptides such as Tat and derivatives thereof, and nuclear translocation signals such as NF- ⁇ can be mentioned.
  • examples of positively charged substances in the production of fine particles include arginine, polyethyleneimine, poly-L-lysine, -L-ornithine, and poly siLentFect (registered trademark). .
  • Preferable "basic substance having a positive charge” includes, for example, arginine, particularly L (+) _ arginine, polyethyleneimine, particularly branched polyethyleneimine (PEI), cell-permeable peptide, Examples include poly-L-lysine, poly L-ornithine, and siLentFect (registered trademark).
  • Poly-L-lysine preferably consists of 3 or more lysine residues, more preferably 4 or more lysine residues, particularly preferably 10 or more lysine residues.
  • a polymeric positively charged basic substance such as polyethyleneimine, cell permeable peptide, poly-L-lysine, poly-L-ornithine, siLentFect (registered trademark) is preferable.
  • cationic polymer such as polyethyleneimine, cell permeable peptide, poly-L-lysine, poly-L-ornithine, siLentFect (registered trademark) is preferable.
  • cationic polymer such as polyethyleneimine, cell permeable peptide, poly-L-lysine, poly-L-ornithine, siLentFect (registered trademark) is preferable.
  • cationic polymer such as polyethyleneimine, cell permeable peptide, poly-L-lysine, poly-L-ornithine, siLentFect (registered trademark) is preferable.
  • a plurality of basic substances having a positive charge may be used in combination.
  • Biodegradable polymer used in the present invention means a biodegradable and biocompatible polymer, and is not particularly limited, but is gradually degraded over a long period of time, such as siRNA.
  • Aliphatic polymers such as polylactic acid, polydaricholic acid, and polyhydroxylatasan
  • polypolymers such as poly-histanoacrylates
  • polyesters and their constituents are acceptable as long as they can release such drugs continuously. The ability to list copolymers with monomer power.
  • the particularly preferable polymer substance constituting the preparation is polylactic acid or a copolymer having a molar ratio of lactic acid to polyglycolic acid or glycolic acid of 50/50 to 90/10.
  • the ability to mention polylactic acid glycolic acid is not limited to this.
  • short-chain deoxyribonucleic acid or short-chain ribonucleic acid and "basic substance having a positive charge” are encapsulated in a biodegradable polymer.
  • the state in which short-chain deoxyribonucleic acid or short-chain ribonucleic acid and a basic substance having a positive charge are contained in a matrix-like biodegradable polymer is also a short-chain deoxyribonucleic acid or a short-chain ribonucleic acid.
  • Substances and biodegradable polymers exist in an associated state, meaning they are not easily degraded.
  • “encapsulation” is sometimes referred to as “encapsulation” or “enclosure”.
  • sustained release microsphere refers to sustained release having an effect of maintaining the effect of suppressing the expression of a specific gene by controlling the release or elution of short-chain doxyribonucleic acid or ribonucleic acid.
  • the fine particle preparation is not particularly limited as long as it has re-, re-, and sustained-release properties, such as for injection and mucosal administration.
  • sustained-release microparticle preparations can contain known pharmaceutically acceptable additives.
  • “microsphere” is sometimes referred to as “sustained release fine particle preparation”, “microcapsule” or “microparticle” for convenience.
  • the microspheres of the present invention are W / 0 / W, s / o / w, W / O, 0 / W
  • Emulsion such as S / W is manufactured by applying a known method such as freeze drying The power to do S.
  • the form of emulsion is preferably w / o / w type.
  • the sustained-release microsphere formulation based on w / o / w of the present invention is a capsule-based technology, for example,
  • the internal aqueous phase prepared by dissolving siRNA was rapidly stirred into an oil phase dissolved in a biodegradable polymer organic solvent to form W / O emulsion, which was dissolved in the external water phase.
  • a water-soluble drug such as a low molecular weight compound, ribonucleic acid, peptide, etc., preferably a short-chain ribonucleic acid or a short-chain deoxyribonucleic acid, and if necessary, a drug encapsulating agent, a basic substance having a positive charge
  • the biodegradability of the internal aqueous phase prepared by dissolving in a buffer solution prepared with an inorganic substance such as water or phosphoric acid, or in a solution made of a polymer having a surface-active action such as polybutyl alcohol
  • W1 / 0 emulsion was prepared by stirring at high speed into an oil phase obtained by dissolving a biodegradable polymer such as polylactic acid / glycolic acid having biocompatibility in an organic solvent such as dichloromethane.
  • Add to the outer aqueous phase solution such as a liqueur solution with stirring, stir to give w / o /
  • Fine particles encapsulating a drug are produced by removing an organic solvent such as nomethane and freeze-drying.
  • the average diameter of the fine particles is several ⁇ to several hundreds / im, preferably 10 / im to 150 / im, more preferably 20 ⁇ m to 45 ⁇ m, and particularly preferably 20 ⁇ m to 30 ⁇ m. If the diameter of the microparticles is smaller than this, the cells are phagocytosed, the nucleic acids in the microparticles are decomposed in the cells, and it becomes difficult to introduce the nucleic acids into the microparticles. If it is larger than this, the liquid containing fine particles becomes a suspension, which makes administration difficult by injection. When the microspheres of the present invention are administered subcutaneously, they remain subcutaneously without entering the blood vessels and can gradually release nucleic acids.
  • microspheres are not particularly limited, and w / o / w or s /
  • an organic solvent such as hexane, which is compatible with the continuous oil phase in the outer oil phase but does not dissolve the biodegradable polymer, via emulsion and s / o suspension. It is recommended to add gradually.
  • the addition amount of the basic substance having a positive charge is 1% or more, preferably 2% or more, more preferably 5% or more by weight ratio with respect to the inner aqueous phase, and exhibits good formulation characteristics. In order to maintain it, it is 15% or less, preferably 10% or less.
  • the water used here refers to purified water, distilled water, ultrapure water, and sterilized water.
  • the solvent removal method of emulsion is usually a force for distilling off the solvent while stirring lightly at normal temperature and normal pressure.
  • the pressure may be reduced or a gas may be blown onto the surface or the middle of the solution.
  • a solvent removal in a supercritical fluid or a spray drying method can be employed.
  • the emulsion may be s / o / w, w / o, o / w, s / o in addition to w / o / w.
  • sustained-release microspheres containing the short-chain deoxyribonucleic acid or the short-chain ribonucleic acid of the present invention can be administered to a subject in various forms as a pharmaceutical composition, that is, a sustained-release microsphere preparation.
  • the sustained-release microsphere preparation of the present invention containing the short-chain deoxyribonucleic acid or the short-chain ribonucleic acid is useful for cancer, infectious diseases caused by viruses, immune diseases, inflammatory diseases, and liver transplantation. It is useful for treating various diseases such as liver diseases, diabetic retinopathy, intractable diseases such as age-related macular disease, and lifestyle-related diseases.
  • Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition containing the microspheres of the present invention include parenteral administration by injection, carrier, etc., and include intradermal, subcutaneous, intramuscular, eyeball, joint, It can be administered to organ tissue or tumor tissue.
  • the pharmaceutical composition includes a carrier, a diluent and an excipient which are produced by a known method and are usually used in the pharmaceutical field. For example, gelling agents, lactose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • An injection is prepared by suspending or emulsifying microspheres in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections.
  • physiological saline As aqueous solutions for injection, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants are used, and it can be used in combination with polyalcohols such as polyethylene glycol, nonionic surfactants, etc. . Sesame oil, soybean oil, etc. can be used as the oily liquid.
  • a pharmaceutically effective amount of the composition of the present invention is administered to the patient.
  • administering a pharmaceutically effective amount refers to administering to a patient an appropriate level of drug for treating various diseases.
  • Pharmaceutical composition of the present invention The frequency of administration of the product is appropriately selected according to the patient's symptoms.
  • the amount of short-chain doxyribonucleic acid or short-chain ribonucleic acid contained in the microsphere per kg body weight is 0.0001 to 1000 mg, preferably 0.0001 to 10 mg, more preferably 0.0001 to 0.1 mg.
  • the amount of microsphere is 0.1 mg to 100 mg, preferably 0.2 mg to 50 mg per kg of body weight.
  • the short-chain deoxyribonucleic acid or the short-chain ribonucleic acid of the present invention is a short-chain deoxyribonucleic acid for at least 1 week to 6 months or more, preferably 1 month to 4 months or more.
  • the pharmaceutical composition containing the microsphere of the present invention as an active ingredient may be administered, for example, once a week to 6 months, preferably once a month to 4 months.
  • the present invention provides a medically effective amount of a sustained-release microsphere of the present invention to a subject in need of treatment, thereby causing cancer, infectious diseases caused by viruses, immune diseases, inflammatory diseases.
  • the present invention relates to cancer of the sustained-release microsphere of the present invention, infectious diseases caused by viruses, immune diseases, inflammatory diseases, liver damage occurring at the time of liver transplantation, diabetic retinopathy, aging
  • infectious diseases caused by viruses, immune diseases, inflammatory diseases, liver damage occurring at the time of liver transplantation, diabetic retinopathy, aging
  • VEGF antisense that binds complementarily to messenger RNA (mRNA) involved in the production of vascular endothelial growth factor (VEGF) and inhibits VEGF production by inhibiting the translational step in the gene expression process
  • mRNA messenger RNA
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the solution was added to a 0.25% polybulal alcohol solution of L with stirring, and stirred at 3,000 mm for 15 minutes to obtain w / o / w emulsion. Furthermore, by stirring at 250 mm for 3 hours,
  • the supernatant was removed after distilling off the tongue and centrifuging. After washing 3 times with distilled water, the collected particles were lyophilized to obtain antisense-containing microspheres.
  • 0 emulsion was added to 500 mL of a 0.25% polybulal alcohol solution with stirring, and stirred at 3,000 mm for 3 minutes to obtain w / o / w emulsion. Furthermore, it is stirred for 3 hours at 250 ⁇ m.
  • Dichloromethane was distilled off by stirring, and the supernatant was removed after centrifugation. After washing 3 times with distilled water, the recovered particles were lyophilized to obtain siRNA-containing microspheres.
  • the antisense oligo DNA-containing microspheres prepared in Example 1 were observed with an electron microscope, and the microscopic photographic power ferret horizontal diameter was measured to calculate the average particle diameter.
  • take 25 mg of microspheres in a test tube add 0.5 mL of acetonitrile to dissolve the PLGA component, add 0.5 mL of pH 6.0 phosphate buffer to this, shake for 2 hours, and then add 5,000 ⁇ m. Centrifugation was carried out for 20 minutes, and HPLC measurement was performed on the supernatant, and the amount of antisense oligo DNA encapsulated in the microsphere was determined.
  • the total mass of the prescription amount of the solid component at the time of particle preparation is 10
  • the ratio of the amount of the antisense oligo DNA measured relative to this was calculated as the encapsulation rate (%) of the antisense oligo DNA in the microsphere.
  • the HPLC analysis conditions are as follows.
  • SHIMADZU HPLC system SCL-lOAvp system controller, LClOADvp pump, DGU-12A degasser, SPD-lOAvp UV detector, SIL-lOAvp autoinjector, C T ⁇ -10ASvp column oven, C-R8A printer
  • the prepared anti-sense oligo DNA-containing microspheres can be observed by microscope to be spherical particles, and the average particle size of the microspheres can be easily passed through the injection needle at 30 to 45 ⁇ m.
  • the particle size was confirmed to be a size that can be applied as an injection.
  • the encapsulation rate of the antisense oligo DNA in the microsphere varies depending on the proportion of arginine added to the inner aqueous phase at the time of particle preparation. Inclusion rate increases with the increase, especially when arginine of 7.5% by weight or more is added to the inner aqueous phase, the encapsulation rate is as high as about 80%, and salt with positive charge such as arginine. It was shown that antisense oligo DNA-containing microspheres with a high encapsulation rate can be prepared by adding appropriate amounts of basic substances. [0081] Example 4 Using the residual rate as an index, the release of antisense DNA from microspheres
  • Example 1 Weigh 25 mg of the microsphere prepared in Example 1 into a test tube with a stopper, and add 1.5 mL of 0.1 M phosphate buffer solution at pH 7.4 at 37 ° C, and use a rotary stirrer at 37 ° C. A 28-day release test was conducted. After a certain time, the supernatant was removed after centrifugation at 5,000 rpm for 20 minutes, and 0.5 mL of acetonitrile was added to the resulting precipitate (microsphere) to dissolve the PLGA component. Add 0.5 mL of pH 6.0 phosphate buffer, mix vigorously, shake for 2 hours, centrifuge at 5,000 rpm for 20 minutes, perform HPLC measurement on the supernatant, and remain in the microsphere.
  • pH 6.0 phosphate buffer mix vigorously, shake for 2 hours, centrifuge at 5,000 rpm for 20 minutes
  • the amount of antisense DNA was determined.
  • the amount of antisense DNA in the microspheres before the test was defined as 100%, and the ratio of the amount of antisense DNA in the microspheres at each time relative to this was calculated as the residual rate (%). Using this residual rate as an index, we evaluated the release of antisense DNA from microspheres.
  • Microspheres prepared by adding 5% or more of arginine to the inner aqueous phase were shown to stably and stably release antisense DNA over 2 months.
  • Engrafted cells suspended in serum-containing DMEM medium Mouse kidney-derived cancer cells Sarcomal80 (S-180) are seeded in 24-well culture plates at a density of IX 10 5 cells / well, 37 ° C, 5% CO Pre-cultured under conditions. After 24 hours, the cells were washed with phosphate buffered saline (PBS) and then replaced with serum-free medium RPMI1640. 0.13 ⁇ g of siRNA used in Example 2 or antisense oligo DNA 3.25 used in Example 1 xg was added to each well of the culture plate, and transfection (transduction) was performed for 12 hours under conditions of 37 ° C and 5% C °. Then, after washing the cells with PBS, add serum-free medium RPMI1640 and leave at 37 ° C under 5% CO.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the amount of VEGF in the medium up to 2 hours was measured by enzyme immunoassay (ELISA method).
  • the amount of VEGF per unit in each sample medium was calculated as the VEGF production inhibition rate (%), assuming that the amount of VEGF per unit cell in the medium containing only cells was 100%.
  • siRNA showed a higher inhibition rate of VEGF production than antisense oligo DNA.
  • the dosage of siRNA at this time was 1/25 times that of antisense oligo DNA, and it was found that a high RNAi effect can be obtained with an extremely small amount of short-chain ribonucleic acid.
  • Antisense DN A has been ineffective after 3 days and has a short action time.
  • suppression was observed for the 3 days of the experiment, but the suppression rate gradually decreased, and the duration of the effect is usually about 1 week. It was suggested that a long-term sustained-release preparation of short-chain ribonucleic acid is necessary for this experimental ability to continue its action.
  • siRNA siRNA
  • the cells were washed with phosphate buffered saline (PBS), then replaced with serum-free medium RPMI1640, and siRNA alone (0.13 ⁇ g) or the above-prepared siRNA and carrier complex was cultured. Attached to each hole of the plate, it was transferred under conditions of 37 ° C and 5% CO. After 12 hours, the cells were washed with PBS, and then the serum-free medium RPMI1640 was removed and allowed to stand at 37 ° C. and 5% CO. After 12 hours, the amount of VEGF in the medium was measured by ELISA, and the VEGF production inhibition rate (%) was calculated in the same manner as in Example 5.
  • PBS phosphate buffered saline
  • siRNA alone 0.13 ⁇ g
  • siRNA and carrier complex was cultured. Attached to each hole of the plate, it was transferred under conditions of 37 ° C and 5% CO. After 12 hours, the cells were washed with PBS, and then the serum-free medium RPMI1640 was
  • microspheres prepared in Example 2 were observed with an electron microscope, and the horizontal diameter of the ferret was measured from the micrograph to calculate the average particle size. Also, take 25 mg of microspheres in a test tube, add 0.5 mL of acetonitrile to dissolve the PLGA component, add 0.5 mL of pH 6.0 phosphate buffer to this, shake for 2 hours, and then add 2 mL at 5,000 rpm. The supernatant was subjected to HPLC measurement, and the amount of siRNA encapsulated in the microsphere was determined. The total mass of the prescription amount of the solid component at the time of particle preparation was taken as 100%, and the ratio of the measured siRNA amount to this was calculated as the encapsulation rate (%) of siRNA in the microsphere.
  • HPLC analysis conditions are the same as in Example 3.
  • Example 2 It was confirmed by microscopic observation that the prepared microspheres were spherical particles in any of the microspheres in which only siRNA was encapsulated, siRNA and arginine were encapsulated, and siRNA and PEI were encapsulated.
  • the average particle size of the microspheres is a particle size that can easily pass through a normal injection needle at 30 to 45 / im, and is a size that can be used as an injection agent. Particles were confirmed.
  • the siRNA encapsulation rate in the microspheres was about 48% when only siRNA was encapsulated, compared to about 64% when arginine, a positively charged base material, was added.
  • a high encapsulation rate of about 80% was shown. Based on the above, in order to encapsulate siRNA in microspheres at a high encapsulation rate, it is effective to add siRNA together with a positively charged substance, and in particular, PEI used as a gene introduction agent is used. It was shown that the addition efficiency was further increased by the addition.
  • Example 2 25 mg of the microsphere prepared in Example 2 was weighed into a test tube with a stopper, added with 1.5 mL of ⁇ 7.4 0.1 ⁇ phosphate buffer at 37 ° C, and 37 ° C using a rotary stirrer. A 28-day release test was conducted under C. After a certain time, the mixture was centrifuged at 5,000 rpm for 20 minutes, the supernatant was removed, and 0.5 mL of acetonitrile was added to the resulting precipitate to dissolve the PLGA component. Add 0.5 mL of pH 6.0 phosphate buffer, shake for 2 hours, centrifuge at 5,000 rpm for 2 minutes, and perform HPLC measurement on the supernatant.
  • Residual amount of siRNA in microspheres Asked.
  • the amount of siRNA in the microsphere before the test was defined as 100%, and the ratio of the remaining amount of siRNA in the microsphere at each time was calculated as the residual rate (%). Using this residual rate as an index, the release of siRNA from the microsphere was evaluated.
  • HPLC analysis conditions are the same as in Example 3.
  • Example 7 the microspheres prepared in Example 2 were found to show sustained release characteristics as evaluated by an in vitro release test using a buffer solution.
  • an experiment was conducted for the purpose of evaluating the VEGF production inhibitory effect of siRNA-containing microspheres in an experimental system using cells.
  • S-180 cells suspended in DMEM medium were seeded in a 24-well culture plate at a density of 1 X 10 5 cells / well, and maintained at 37 ° C and 5% CO for 24 hours. Pre-cultured. After washing the cells with PBS, the medium was changed to serum-free medium RPMI1640, and microspheres consisting only of PLGA, microspheres containing only siRNA and microphones containing arginine and siRNA were prepared in Example 2. A mesh chamber with 10 mg each was set on top of the cells in each hole and allowed to stand at 37 ° C and 5% CO. Collect the medium after 12 hours The amount of VEGF in the medium was measured by ELISA.
  • the amount of VEGF per unit cell when using siRNA and siRNA / arginine-containing microspheres is defined as 100% VEGF amount per unit cell in the medium when using PLGA-only microspheres.
  • the ratio was calculated as the VEGF production inhibition rate (%).
  • a chamber containing microspheres was removed every 48 hours, and this chamber was newly precultured.
  • the VEGF amount in the medium after 12 hours was measured in the same manner as described above. The above operation was continued for 17 days, and the RNAi effect of siRNA released from the microspheres over 17 days was evaluated.
  • VEGF production inhibition rate was not significantly different between the microspheres encapsulating siRNA and siRNA and arginine.
  • the VEGF production inhibition rate decreased over time, and the continuous RNAi effect by siRNA was not obtained.
  • siRNA microspheres encapsulated with arginine lasted up to 5 days, as compared with microspheres encapsulated with siRNA alone.
  • Example 10 Evaluation of siRNA effect in vivo using changes in tumor volume as an index Experiments were conducted with the aim of evaluating siRNA effects in vivo by administering different concentrations of siRNA to tumor-bearing mice and using changes in tumor volume as an index.
  • the S-180 cells (5 ⁇ 10 6 cells / 300 ⁇ L) were subcutaneously injected into the back of 8-week-old ICR female mice and transplanted. Six days after transplantation, it was judged that a tumor-bearing mouse was produced when the volume of the formed tumor reached 50 mm 3 or more, and it was used in the following experiments.
  • the siRNA used in Example 2 with different concentrations of sputum was administered, the major axis and minor axis of the tumor were measured after 1, 3, 5, 7, 10, 14 days, and the tumor volume was calculated using the following formula .
  • Tumor volume (mm 3 ) (Tumor minor axis) 2 X Tumor major axis / 2
  • Example 9 when siRNA alone was administered to tumor-bearing mice alone, a significant RNAi effect was observed. The effect was transient, and the duration of the effect was approximately 7 days even if it was long. It was. From this, an experiment was conducted for the purpose of evaluating the RNAi effect in vivo using the siRNA-containing microspheres prepared in Example 2.
  • Tumor-bearing mice were produced in the same manner as in Example 9, and the following experiment was conducted 6 days after transplantation of cancer cells in which the tumor volume reached 50 mm 3 or more.
  • the amount of siRNA to be added to the inner aqueous phase in Example 2 was set to 350 ⁇ M in 25 ⁇ L.
  • W / o / w dry in liquid Prepared by dry method.
  • Microspheres consisting of only PLGA and no PBS and siRNA were administered intratumorally to tumor-bearing mice as controls.
  • a PBS solution in which 10 mg of siRNA-containing microspheres were suspended was administered into tumor-bearing mice. Tumor volume was measured in the same manner as in Example 7 every 2 days after administration.
  • siRNA-containing microspheres As shown in FIG. 6, the growth of the tumor volume was marked in the control, whereas the siRNA-containing microsphere was found to suppress the tumor growth.
  • the RNAi effect of siRNA-containing microspheres is significantly suppressed when siRNA-containing microspheres encapsulated with arginine and PEI are used, compared to microspheres encapsulating siRNA alone, and the effect is prolonged over a period of about 1 month. It became clear that it lasted.
  • siRNA is released into a microsphere by encapsulating it in a biodegradable polymer with a positively charged basic substance as the carrier, releasing siRNA stably and continuously over a long period of time. It has been shown that long-term sustained-release microspheres can be prepared that have sustained RNAi effects in
  • siRNA that suppresses the production of cFLIP cellular FLICE-inhibitory protein
  • siRNA that suppresses the production of cFLIP cellular FLICE-inhibitory protein
  • siRNA that degrades mRNA and inhibits cFLIP synthesis A long-term sustained-release fine particle encapsulated in PLGA was prepared.
  • Anti-mouse cFLIP at a concentration of 40 ⁇ (23 bp, molecular weight 14544) 25 / i L, anti-mouse VEGF (21 bp, molecular weight 13345.4) at a concentration of 40 ⁇ , 25 x L and branched polyethyleneimine ( PEI, molecular weight 25 kDa, and an inner water Ne th by dissolving Sigma Ltd.) 500 mu g to 0.4% poly Bulle alcohol solution of 100 mu L.
  • PLGA 0.5 g used in Example 1 was dissolved in 3 mL dichloromethane to form an oil phase. The inner aqueous phase and the oil phase are mixed and stirred at 10,000 ⁇ m for 2 minutes to prepare emulsion.
  • the mixture was stirred at 250 mm for 3 hours to distill off dichloromethane, and after centrifugation, the supernatant was removed. Left. After washing 3 times with distilled water, the recovered particles were lyophilized to obtain siRNA-containing microspheres.
  • the average particle size of the obtained microspheres was about 23 ⁇ m, and the siRNA content was about 83%.
  • sustained-release microsphere of the present invention in particular, the w / o / w type sustained-release microsphere.
  • siRNA small interfering RNA

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Abstract

　短鎖デオキシリボ核酸または短鎖リボ核酸を有効成分とする徐放性マイクロスフェア製剤において、その徐放性を改善し、長期にわたって有効な製剤を提供する。短鎖デオキシリボ核酸または短鎖リボ核酸が安定に封入され、疾患に関与するような特定のタンパク質の発現を長期間にわたって抑制できる、注射可能、または経粘膜投与可能な微細粒子製剤およびその製造法を提供する。 　短鎖デオキシリボ核酸または短鎖リボ核酸、特にsiRNAを有効成分とする徐放性マイクロスフェア製剤、特にw1/o/w2型エマルションを経て調製される徐放性マイクロスフェアにおいて、生体内分解性ポリマー中にアルギニン、ポリエチレンイミン、細胞透過性ペプチド、ポリ-L－リジン、ポリ－Ｌ－オルニチン等の正電荷を持つ塩基性物質を含有させることを特徴とする。

Description

明 細 書
短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸含有徐放性マイクロスフェア及び その製造法
技術分野
[0001] 本発明は、特定のタンパク質、特に疾患に関係するタンパク質の発現を抑制する短 鎖リボ核酸（siRNA; small interfering RNA)を生体内分解性ポリマーに内包させた、 長期間にわたって必要量の siRNAを安定にかつ持続的に放出する徐放性マイクロス フェア及びその製造方法に関する。本徐放性マイクロスフェアは、特に注射剤として 有用であり、また、鼻、気管支、肺等の粘膜に対する投与も可能である。
背景技術
[0002] 近年、ヒトゲノムの塩基配列が解読され、ヒト遺伝子情報の全貌が明らかとなった。
また、それに引続いて機能ゲノミタスの研究が精力的に行われ、各種ヒト遺伝子の詳 細が明らかにされつつある。それにともなって、細胞シグナル伝達機構、細胞の増殖 •分化機構等が解明され、また、タンパク質発現の促進'抑制による生体機能の変化 、あるいは遺伝子異常と各種疾患の関係等が明らかにされつつあるとともに、それら ヒト遺伝子を医療へ応用するための研究が弓 Iき続き活発に行われてレ、る。
[0003] 特に、疾病に関与する特定遺伝子と対合する配列を持ち、その遺伝子の発現を抑 制する技術として所謂アンチセンス技術が知られている。実際には、合成したオリゴ R NAやオリゴ DNA、最近ではその誘導体や RNA/DNAキメラ分子などがデザイン されている。アンチセンス医薬開発の最大の関門は、細胞内に如何に医薬を取り込 ませるかである。
[0004] 特に最近、短い一本鎖のアンチセンス DNA、 RNAを用いたアンチセンス療法や、短 鎖の二本鎖 RNA (dsRNA ; double stranded RNA)を用いて RNAi (RNA interference, R NA干渉）によって細胞内で配列特異的に mRNAを分解して特定の遺伝子の発現を 抑制する siRNA (small interfering RNA)技術力、難治性疾患治療のための新しい薬 物治療方法として注目されている。
[0005] また、近年に至り、特に後者の siRNAは、従来のアンチセンス法に比べ、より少量で 有効であることから注目されており、特に 21〜29塩基対 (bp)の siRNAが効果的に目的 遺伝子をノックダウンすることが報告されてレ、る。
例えば、特開 2005-192556号公報は、標的とする部位によらず、効果的に遺伝子 発現が抑制され、し力、も細胞毒性が低ぐインターフェロン応答が軽減された RNAi用 の長鎖 dsRNA (干渉用二本鎖 RNA)について報告している。 （特許文献 1)
特表 2005-508306号公報は、 RNAiによる哺乳類における遺伝子発現の阻害方法 およびそのための組成物の学術的および治療領域への応用について報告している 。 （特許文献 2)
特開 2005-73573号公報は、難治性疾患のひとつである狂牛病の原因因子とされて レ、るプリオンタンパク質の産生抑制方法およびその応用としての RNAi技術の適用に ついて報告している。 （特許文献 3)
特表 2004-535813号公報は、 siRNAを用いた哺乳類動物細胞におけるウィルス起 源の外因性遺伝子の発現の選択的な転写後サイレンシング方法について報告して いる。 （特許文献 4)
一方、遺伝子を用いた製剤においても、副作用を抑制し、より効果的にその遺伝子 製剤の治療効果を発揮させるために、通常の薬剤の服用や投与と同様に、生体内 の標的部位に確実に、あるいはターゲットとする特定組織に特異的に目的遺伝子を 取り込ませるための所謂ドラッグデリバリーシステム（DDS)が利用されている。しかし 、このドラッグデリバリーシステムは、遺伝子を単独で使用した場合では難しぐ遺伝 子キャリアーと併用することで達成することが試みられている。例えば、細胞表面に存 在するレセプターを標的とし、レセプターに対するリガンドを遺伝子キャリアーに修飾 することが試みられている。例えば、 J. Control Release, 74,341(2001)は、 VEGFを遺 伝子キャリアーに修飾することを報告している。 （非特許文献 1)
また、 J Drug Target, 12, 393-404 (2004)は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボ ザィム、 siRNAなどのリボ核酸、コレステロールなどの脂溶性物質を結合したオリゴヌ クレオチドを生体内分解性ポリマーであるポリ乳酸/ダリコール酸に含有させた徐放 性粒子の調製について報告しており、さらにこれら徐放性粒子の放出特性や生体内 での遺伝子発現抑制効果について報告している。 （非特許文献 2) しかし、これら遺伝子製剤を実用化しょうとするとき、これら短鎖リボ核酸ゃリボ核酸 は、極性が著しく高いために生体膜透過性が低ぐまた、生体内へ投与した場合、体 内の酵素によって極めて速やかに代謝されてしまうため、消化管や血液中に投与し ても十分な効果が期待できず、また、局所投与においても作用が持続しないなどの 問題があった。
[0007] 徐放性製剤技術については、従来、薬物が一定の速度で徐々に放出される剤形を 製造するために、生分解性高分子、薬物、添加剤、溶媒などが適切に調製された一 つの混合液を用いて噴霧乾燥法又は他の製造法によって 1つの組成のマイクロスフ エアを製造する方法を使用してきた。マイクロスフェア製剤の製法として、生理活性ぺ プチド等の水溶液を内水相とし、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を油相とす る w/〇エマルシヨンを水等に加え、 W/0/Wエマルシヨンから徐放性マイクロスフェア を製造する方法がよく知られている。徐放性マイクロスフェアの剤形が生体内で一定 の期間最適の薬理学的効果を示すためには、薬物の初期放出量と以後の放出期間 の放出速度が適切に調節されなければならない。これまでは、前述したパラメータ、 すなわち生分解性高分子の種類、濃度、薬物の含量、放出速度を調節するための 添加剤の量、溶媒の量などを変えながらマイクロスフェアを製造することにより、薬物 の初期放出量と放出速度を調節した。
[0008] また、徐放性製剤については、徐放性薬物送達システム (DDS; Drug Delivery Syst em)製剤の一般的な製造方法としては、コアセルべーシヨン法 (coacervation)、乳濁液 相分離法又は噴霧乾燥によるカプセル化及び有機又は水相中の溶媒蒸発法などが 知られている。このような方法のなかでも水相中溶媒蒸発法が最も多く使用されてお り、これは大きく乳化蒸発法 (W/0/W; Water/Oil/Water)と単一乳化蒸発法 (0/W; 〇il/Water)とに分類される。
[0009] このうちペプチド又は蛋白質のような水溶性薬物の封入に主として使用される W/〇 /W法は、水溶液に薬物を溶解して製造した薬物含有水溶液を生分解性高分子を含 有する有機溶媒に分散させて 1次ェマルジヨンを形成 (water in oil)した後、これを水 相に分散させる方法である。また、脂溶性薬物の封入に主として使用される 0/W法 は、有機溶媒又は有機溶媒の混合物に薬物と生分解性高分子を共に溶解 (oil)させ た後、これを水相に分散させる方法である。両方法は共に、有機溶媒相の高分子が 水相に分散される過程で、有機溶媒が抽出又は蒸発などにより除去されて、高分子 の溶解度が減少することにより、固形化され、その結果、微粒球を形成することになる
。一般に、 W/0/W法により製造された微粒球は、 0/W法により製造された微粒球に 比べて多孔性が増加するので、表面積が大きくなつて、薬物の初期放出速度が相対 的に高いという特徴がある。
特許文献 1：特開 2005-192556号公報
特許文献 2：特表 2005-508306号公報
特許文献 3：特開 2005-73573号公報
特許文献 4：特表 2004-535813号公報
非特許文献 1 : E. K Gaidamakova.J. Control Release, 74,341(2001)
非特許文献 2 : Alim Khan, Mustapha Beenboubetra. J Drug Target, 12, 393-404 (20
04)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明の目的は、短鎖デォキシリボ核酸または短鎖リボ核酸が安定に封入され、 特定のタンパク質、特に疾患に関係するタンパク質の発現を長期間にわたって抑制 し得る徐放性マイクロスフェア、特にこれら核酸と複合体を形成し得る塩基性物質と を含んでいる徐放性マイクロスフェア及びその製造方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0011] 一般に、核酸、ペプチド、タンパク質等からなる医薬製剤を経口あるいは非経口投 与した場合、生体内の多くの酵素によって分解されるため、これら医薬製剤の効果は 速やかに消失してしまう。これを改善するため様々な工夫がなされている。そのうちの
1つの方法が、長期徐放性注射剤とすることである。
[0012] 本発明者らは、上記課題を解決するため、核酸を含有する徐放性マイクロスフェア 製剤について鋭意研究を重ねた結果、マイクロカプセルィ匕において、正電荷を持つ 塩基性物質が、短鎖デォキシリボ核酸または短鎖リボ核酸を高い封入率で、マイクロ スフエア特に wん /w型エマルシヨンを経て調製した徐放性マイクロスフェアに含有さ せることを見出し、本発明を完成するに至った。
[0013] 即ち、本発明は、短鎖デォキシリボ核酸または短鎖リボ核酸と正電荷を持つ塩基性 物質を含有した生体内分解性ポリマーによる徐放性マイクロスフェア製剤を提供する ものである。
[0014] 本発明によれば、短鎖デォキシリボ核酸および短鎖リボ核酸を、安定にかつ持続 的に標的細胞に送達させるため、 wん /w液中乾燥法などのマイクロカプセルの製造
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法により、短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を、生体分解性および生体適合 性を持つ所謂生体内分解性ポリマー中に封入することにより目的とする徐放性マイク ロスフェア製剤を得ることができる。
[0015] より具体的には以下の通りである。
[0016] 1.有効成分としての短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸と 1重量％〜： 10重量％ の静電気的に相互作用してこれら核酸と複合体を形成し得る正電荷とを有する塩基 性物質とを含んでなる徐放性マイクロスフェア。
[0017] 2.短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸が、一本鎖または二本鎖構造を有し、長 さが 15〜85塩基である上記 1に記載の徐放性マイクロスフェア。
[0018] 3.短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸力 S、一本鎖または二本鎖構造を有し、長 さが 15〜30塩基である上記 1に記載の徐放性マイクロスフェア。
[0019] 4.短鎖リボ核酸力 長さが 15〜30塩基の siRNAである上記 1〜3のいずれかに記載 の徐放性マイクロスフェア。
[0020] 5.正電荷を有する塩基性物質力 カチオン性ポリマーである上記 1〜4のいずれか に記載の徐放性マイクロスフェア。
[0021] 6.正電荷を有する塩基性物質が、アルギニン、ポリエチレンィミン (PEI)、細胞透過 性ペプチド、ポリ -L-リジン、ポリ— L—オル二チン又は siLentFect (登録商標）である 上記 1〜4のいずれかに記載の徐放性マイクロスフェア。
[0022] 7.正電荷を有する塩基性物質が、ポリエチレンィミン (PEI)、細胞透過性ペプチド、 ポリ- L-リジン、ポリ—L—オノレニチン又は siLentFect (登録商標）からなる群から選択 される上記 6に記載の徐放性マイクロスフェア。
[0023] 8.さらに、生体内分解性ポリマーを含んでなる上記 1〜7のいずれかに記載の徐放 十生マイクロスフェア。
[0024] 9.生体内分解性ポリマーが、ポリ乳酸とポリグリコール酸又は乳酸とグリコール酸の 共重合体である上記 8に記載の徐放性マイクロスフェア。
[0025] 10.皮内、皮下あるいは筋肉内、眼球、関節、 S蔵器組織、腫瘍組織に注射可能な、 有効成分として短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を有する上記 1〜9に記載の 徐放†生マイクロスフェア。
[0026] 11.上記 1〜： 10のいずれかに記載の徐放性マイクロスフェアを有効成分として含む 医薬組成物。
[0027] 12.短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸が腫瘍細胞の増殖を抑制し得る、上記 ：!〜 10のいずれかに記載の徐放性マイクロスフェアを有効成分として含む杭がん剤
[0028] 13.正電荷を持つ塩基性物質の存在下に、 siRNAを溶解して調製した内水相を、生 体内分解性ポリマーの有機溶媒に溶解してなる油相に高速撹拌することによって W1 /0エマルシヨンとなし、これを外水相溶液に攪拌しながら添加して w /o/wとなし、さら
1 2 に乾燥することを特徴とする w /o/w液中乾燥法による上記 1〜： 10に記載の徐放性
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マイクロスフェアの製造方法。
[0029] 14. w /o/w又は s/o/wエマルシヨンを経て、 w/o、 o/w又は s/oエマルシヨンを超臨界
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流体中で脱溶媒又はスプレードライすることを特徴とする上記 1〜 10に記載の徐放 性マイクロスフェアの製造方法。
[0030] 15. w/oエマルシヨン又は s/oサスペンションを経て、外油相に油相連続相とは相溶 性があるが生体内分解性ポリマーを溶解しない有機溶媒を徐々に添加して当該短 鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を内封させることを特徴とする上記 14に記載 の製造方法。
[0031] 16.生体内分解性ポリマーが、ポリ乳酸とポリグリコール酸又は乳酸とグリール酸の 共重合体である上記 15に記載の製造方法。
発明の効果
[0032] 本発明によれば、正電荷を持つ物質を用いることで、短鎖デォキシリボ核酸または 短鎖リボ核酸を高封入率で徐放性マイクロスフェアに含有させることができ、かつ、短 鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸の細胞や組織外での安定性を向上させるばか りでなぐ細胞への取り込みも促進する。
[0033] また、本発明の徐放性マイクロスフェア製剤、特に w /o/w型エマルシヨンを経て調
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製された徐放性マイクロスフェアは、通常なら血中又は細胞中の酵素で容易に分解 される短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を、酵素分解から保護し、また、安定 かつ持続的に有効成分としての短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を徐放する
[0034] また、本発明によれば、極めて少量の短鎖リボ核酸で高レ、 RNAi効果が得られる。
[0035] 本発明の徐放性マイクロスフェアは、医薬としての核酸を 1週間から 6ヶ月にわたって 徐放することができ、特定の遺伝子発現を一過性ではなく持続的に抑制することがで きる。
[0036] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-254966号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0037] [図 1]血管新生抑制因子である VEGFの産生を抑制する作用を持つホスホロチォェ ート型アンチセンスオリゴ DNAを、異なる添加量のアルギニンと共に生体分解性-生 体適合性高分子 (PLGA)に封入して調製したマイクロスフェア中のアンチセンスオリ ゴ DNAの封入率（％)を示した図である。 （実施例 3)
[図 2]血管新生抑制因子である VEGFの mRNAを遺伝子レベルで分解し、 VEGF産生 を抑制する作用を持つ短鎖リボ核酸（siRNA)と、ホスホロチォエート型アンチセンス オリゴ DNAを、マウス由来癌細胞（S-180)にトランスフヱクシヨン (形質導入）した後の 、細胞からの VEGF産生抑制率を示す図である。 （実施例 5) 黒い丸印は siRNA、白 い丸印はアンチセンスオリゴ DNAをトランスフエクシヨンした場合を示す。 （平均値 ± S. D.， n=3)
[図 3]正電荷を持つ塩基性物質および市販遺伝子導入試薬をキャリア一として siRNA を S-180細胞にトランスフエクシヨンした際の、 VEGF産生抑制率を示す図である。 （実 施例 6)
[図 4]siRNA含有 PLGAマイクロスフェアからの siRNA放出特性を示す図である。 白レヽ 丸印は siRNAのみを含有するマイクロスフェア、黒い丸印はアルギニンとともに siRNA を封入したマイクロスフェア、黒い三角印は PEIとともに siRNAを封入したマイクロスフ エアを示す。 （平均値土 S.D., n=3) (実施例 8)
[図 5]担癌マウスの腫瘍内に異なる濃度の siRNAを投与した後の、経時的な腫瘍体積 変化を示す図である。 Xは siRNA未投与のコントロール、黒い丸印は siRNA 1 μ M、白 レヽ丸印は siRNA 2 μ Μ、黒い三角印は siRNA 5 μ Μ、白い三角印は siRNA 10 μ M、白 い四角印は siRNA 15 μ Μを投与した図である。 （平均値土 S.E., η=4) (実施例 10) [図 6]siRNA含有 PLGAマイクロスフヱァを担癌マウスの腫瘍内に投与した後の、経時 的な腫瘍体積変化を示す図である。 白い丸印は PBSのみを投与、白い三角印は siRN Aを含有しなレ、 PLGAマイクロスフェア、黒い丸印は siRNAのみを含有するマイクロスフ エア (siRNA投与量： 1.3 μ /マウス）、黒レ、三角印はアルギニンとともに siRNAを封入し たマイクロスフェア（siRNA投与量： 1.7 μ g/マウス）、黒い四角印は PEIとともに siRNA を封入したマイクロスフェア（siRNA投与量： 2.1 /i g/マウス）を示す。 （平均値土 S.E., n =5) (実施例 11)
発明を実施するための最良の形態
[0038] 本明細書、本発明において用いられる用語の意味は次のとおりである。
[0039] 「核酸」とは、デォキシリボ核酸 (DNA)及び Zまたはリボ核酸 (腿)を意味する。
[0040] 「短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸」とは、短鎖の DNA又は RNAのアンチセ ンスおよびその活性誘導体、リボザィム、さらには短鎖の二本鎖 RNA (dsRNA; double stranded RNA)を意する。例えば、 small interfering RNA (siRNA)と称される 15〜30 塩基対 (bp)、好ましくは 21〜29bpのリボ核酸を意味する。 siRNAは、合成することによ つて得られる力 DNAあるいは RNAによって細胞を用いて産生することもできるし、巿 販のものを入手することもできる。また、ステムループ構造を有する miRNA (micro RN A)も含まれる。 miRNAは、 1本鎖 RNAとして含まれていてもよぐまた 70塩基前後の 2 本鎖 RNA (miRNA前駆体）として含まれてレ、てもよレ、。 70塩基前後の 2本鎖 RNA (miR NA前駆体）として含まれている場合、ダイサ一の作用により 1本鎖 RNAが生じる。さら に、「短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸」には、核酸アブタマ一およびデコイ核 酸（おとり型核酸）が含まれる。核酸アブタマ一とは、標的たんぱく質に特異的に結合 する 10〜85塩基、好ましくは 20〜60塩基のオリゴヌクレオチド（RNA/DNA)で、たんぱ く質のポケットに入り込み、安定な 3次元構造を形成、機能阻害する能力を有し、抗 体より高い親和性と特異性を持ち、抗体とは異なる機能阻害を示す。実際に、成長 因子（VEGF、 PDGF、 bFGF)、ホルモン（Neurop印 tide Y， LHRH, Vasopressin),酵素 (キナーゼ、タンパク質分解酵素）、シグナル伝達因子、受容体 (Neurotensin受容体 1)、膜タンパク質（PSMA)、転写因子（NF- κ B、 B2F)、ウィルスタンパク質などさまざ まなタンパク質に結合するアブタマ一が挙げられるがこれに限定されない。デコイ核 酸は、アブタマ一の 1種であり、標的遺伝子と結合し目的の遺伝子の発現を阻止する こと力 Sできる。デコイ型核酸としては、 2本鎖型および血清中での核酸分解酵素に対 する抵抗性が向上したリボン型デコイ核酸が挙げられる。たとえば、 NF- κ Bタンパク 質、 HIV転写増殖因子（Tatタンパク質）、 C型肝炎ウィルスの NS 3プロテアーゼなどを 認識するデコイ核酸が挙げられる。さらに、短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸」 には CpGオリゴ核酸も含まれる。 CpGオリゴ核酸は、通常、 GACGTTなどのシトシン（ C)、グァニン（G)が並ぶ CpGモチーフを含む 20〜30塩基程度のオリゴ核酸で、 自然 免疫の賦活作用、および抗原と同時投与することによって抗原特異的な免疫反応の 賦活作用を持っている。また、配列によっては、免疫反応の抑制作用を持っている。 また、 CpGモチーフ以外にも、一本鎖または二本鎖の RNAが免疫を制御することも知 られており、これら RNAも「短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸」に含まれる。これ らは、単独または抗原とともにマイクロスフェアに封入して、 CpGオリゴ核酸、一本鎖 R NA、または二本鎖 RNAを強力なアジュバントとしたシングルショットのワクチンとして有 効であり、また、免疫抑制剤や自己免疫疾患治療剤として有効である。
[0041] また、本発明の「短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸」は、体内安定性や親和 性を高めるために、一部化学構造を修飾したものも含む。たとえば、核酸分子の修飾 塩基の導入、リン酸結合部の改変、五炭糖 2'位の誘導体、リボース環にフルォロ基の 導入、五炭糖中の酸素原子を硫黄原子に置換した 4' -チォ核酸などを含むがこれに 限定されない。
[0042] 本発明において、塩基の長さを表現するとき、 1本鎖核酸の場合は、塩基であらわ し、 2本鎖核酸の場合、塩基または塩基対 (bp)であらわす。 2本鎖核酸において、例 えば、 30塩基という場合も、 30塩基対という場合も同じ長さを表す。本発明の「短鎖デ ォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸」の長さは、 10〜85塩基、好ましくは 15〜60塩基、さ らに好ましくは 15〜30塩基である。
[0043] siRNAは、細胞内において極めて少量で配列特異的に mRNAを分解し、特定の遺 伝子発現を抑制することにより、 目的タンパク質の合成を阻害する RNA干渉 (RNA in terfering; RNAi)を引き起こす特徴を有する。前記 RNAiは、 siRNAによる目的遺伝子 のノックダウン技術のひとつであり、細胞の機能や分化を誘導する新規遺伝子の探 索、細胞内シグナル伝達経路の決定、ノックダウン細胞株 ·動物の作製など幅広い研 究領域での利用も期待されている。また、 siRNAは、疾病に関連する遺伝子の発現を 一過的に直接的かつ特異的に抑制できるため、副作用の少ない遺伝子治療薬とし ても期待されている。
[0044] 当該 siRNAの具体例としては、例えば、血管内皮増殖因子およびこの受容体の産 生、細胞の癌化に関与すると言われている Be卜 2タンパク質の産生、 human immunod eficiency virus (HIV)や C型 · Β型肝炎ウィルス、トリインフノレエンザ、 SARS、ウェストナ ィル熱の伝染性疾患を引き起こすウィルスの複製、免疫性疾患や炎症性疾患に関 与する S重瘍壊死因子（tumor necrosis factor, TNF- a、 TNF- β )やモノ力イン、インタ 一ロイキン（IL)、ケモカイン、コロニー刺激因子（CSF)、血管内皮増殖因子（VEGF) などのサイト力インおよびその受容体の産生、ウィルス感染や肝移植時に生じる肝障 害の要因のひとつである細胞のアポトーシスを誘導する Fas遺伝子の発現、 cFLIP等 のアポトーシス阻害因子の産生など、様々な疾患の原因因子および関連因子の産 生を抑制する作用を示す短鎖の核酸を挙げることができるが、これらに限定されるも のではない。例えば、腫瘍部位において血管内皮増殖因子の発現をサンレンシング させることにより、腫瘍部位における血管新生を阻止することにより腫瘍を治療するこ とができる、さらに腫瘍部位においてアポトーシス阻害因子の発現をサイレンシングさ せることにより、腫瘍細胞にアポトーシスを起こさせ腫瘍を治療することができる。また 、腫瘍部位において血管内皮増殖因子とアポトーシス阻害因子の両方の発現をサイ レンシングさせることにより相乗的な効果が得られる。
[0045] 「遺伝子導入キャリアー」とは、短鎖リボ核酸（dsRNA、 siRNAなど）をはじめプラスミド 、 DNAなどの核酸を標的細胞に特異的に導入するための、 siRNAと静電気的に相互 作用して複合体を形成することが可能な、正電荷を有する塩基性のキャリアーを意味 する。
[0046] 「正電荷を持つ塩基性物質」とは、機能的に言うならば遺伝子導入キャリアーであり 、正電荷を持ち、 siRNAと静電気的に相互作用して複合体を形成できるものであれば よぐ遺伝子導入キャリア一として知られている物質を用いることができる。具体的に は、正電荷を持つ脂質やこれからなるリボソーム、高分子、デンドリマーなどである。
[0047] 短鎖リボ核酸（dsRNA、 siRNAなど）をはじめプラスミド DNAなどの核酸を標的細胞に 特異的に導入するためには、運び手となる遺伝子導入キャリアーが必要不可欠とな る。本発明における微粒子製剤の製造法は、負の電荷を帯びた短鎖デォキシリボ核 酸及び短鎖リボ核酸と正電荷の遺伝子キャリアーを静電気的に相互作用させること により、短鎖デォキシリボ核酸及び短鎖リボ核酸を高い割合で高分子物質内に封じ 込め、かつ、短鎖デォキシリボ核酸及び短鎖リボ核酸と遺伝子キャリアーとの複合体 が生体内で微粒子製剤から放出され、効果的に標的細胞内に短鎖デォキシリボ核 酸又は短鎖リボ核酸を導入できる。遺伝子導入キャリア一は特に限定しないが、正電 荷を持ち、 siRNAと静電気的に相互作用して複合体を形成できるものであり、正電荷 を持つ脂質やこれからなるリボソーム、高分子、デンドリマーなどである。
[0048] さらに具体的には、前記「正電荷を持つ脂質」としては、例えば、ジメチルジォクタ デシルアンモニゥムブロミド（DDAB)、トリメチル -2,3-ジォレイルォキシプロピルアン モニゥムクロリド（DOTMA)、 N-l-2,3-ジォレオイルォキシプロピル- Ν,Ν,Ν-トリメチル アンモニゥムクロリド（DOTAP)、 Ν- 2, 3-ジォレオイルォキシ -1-プロピルトリメチルアン モニゥムメチルサルファイト（DOTAP methosulfate)、コレステリル 3 β -Ν-ジメチルアミ ノエチルカルバメートハイド口クロリド（DC-Choi)、 1 ,2 -ジミリスチルォキシプロピル- 3_ ジメチル-ヒドロキシェチルアミンモニゥムブロミド（DMRIE)、 2，3-ジォレイルォキシ -N -2スペルミンカルボキシアミドエチル _N,N-ジメチルアンモニゥムトリフルォロアデテー ト（DOSPA)、〇，〇 ' -ジテトラデカノィル -N- a -トリメチルアンモニオアセチルジェタノ ーノレアミンク口ライドなどを挙げることができる。
[0049] 「正電荷を持つ高分子（カチオン性ポリマー）」としては、ポリェチエレンィミン（PEI、 直鎖型もしくは分岐型）、ポリエチレングリコールとポリ- L-リジンからなるブロック共重 合体など力 S、また、市販の遺伝子導入試薬として、 Lipofectamine (登録商標）、 Lipofe ctamine plus (登録商標）、 jet PEI (登録商標）、 Oligofectamine (登録商標）、 siLentFe ct (登録商標）、 DMRIE-C (登録商標）、 Transfectin-Lipid (登録商標）、 Effectene (登 録商標）などを挙げることができる。このうち、ポリエチレンィミン（PEI)には、直鎖 PE 1級、 2級、 3級ァミンを含む分岐 PEIとが存在するがいずれも用いることができる。また 、 PEIの分子量も限定されない。さらに脱ァシルイ匕等の化学修飾された PEIも用レ、るこ とができる。
[0050] その他、アルギニン、ポリアルギニン、ポリ -L-リジン、ポリオル二チン、スペルミン、 プロタミン、キトサンなどの塩基性物質を挙げることができる。
[0051] また、「デンドリマー」としては、ポリアミドァミンデンドリマー、ポリアミドアミンスターパ 一ストデンドリマー、デンドリリックポリリジン、サイクロデキストリン'デンドリマー結合体
、スターバーストデンドリマーなどを挙げる事ができる。
[0052] さらに、 Tatなどの細胞透過性ペプチドおよびその誘導体や、 NF- κ βなどの核移 行シグナルを挙げることができる。
[0053] また、微粒子の製造にぉレ、て、正電荷の物質として、たとえば、アルギニン、ポリエ チレンィミン、ポリ- L-リジン、 -L-オル二チン、ポリ siLentFect (登録商標）が挙げられ る。
[0054] 好ましい「正電荷を持つ塩基性物質」としては、例えば、アルギニン、特に L(+)_アル ギニン、ポリエチレンィミン、特に分岐型ポリエチレンィミン（PEI)、細胞透過性べプチ ド、ポリ- L-リジン、ポリ L—オル二チン、 siLentFect (登録商標）を例示することがで きる。ポリ- L-リジンは好ましくは 3つ以上のリジン残基、さらに好ましくは 4つ以上のリ ジン残基、特に好ましくは 10個以上のリジン残基からなる。さらに、ポリエチレンィミン 、細胞透過性ペプチド、ポリ -L-リジン、ポリ—L—オル二チン、 siLentFect (登録商標 )等のポリマー性の正電荷を持つ塩基性物質（カチオン性ポリマー）が好ましい。しか し、これらに限定されるものではない。
[0055] また、上記の正電荷を持つ塩基性物質の複数を組み合わせて用いてもよい。
[0056] これらの正電荷を持つ塩基性物質は、核酸と会合し、核酸をマイクロスフェアに取り 込む機能を有する。さらに、ポリエチレンィミン、細胞透過性ペプチド、ポリ- L-リジン、 ポリ—L—オル二チン、 siLentFect (登録商標）等のポリマーを用いた場合、マイクロス フェアの細胞への導入効率を高くすることが可能である。
[0057] 本発明で用いられる「生体内分解性ポリマー」とは、生体分解性および生体適合性 の高分子を意味し、特に限定されるものではないが、長期にわたり徐々に分解され、 siRNAなどの薬物を持続的に放出できるものであればよぐ脂肪族高分子（ポリ乳酸、 ポリダリコール酸、ポリヒドロキシラタサンなど）、ポリ-ひ-シァノアクリル酸エステル、ポ リエステルなどのホモポリマーおよびこれらの構成モノマー力 なるコポリマーなどを 挙げ'ること力 Sできる。
[0058] 本発明においては、製剤を構成する特に好ましい高分子物質としては、ポリ乳酸も しくは乳酸とポリグリコール酸もしくはグリコール酸のモル比が 50/50〜90/10の共重 合体であるポリ乳酸グリコール酸を挙げることができる力 これに限定されるものでは ない。
[0059] 本発明において、「短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸」および「正電荷を持 つ塩基性物質」は生体内分解性ポリマー中に封入されるが、「封入」とはカプセル状 あるいはマトリックス状の生体内分解性ポリマー中に短鎖デォキシリボ核酸もしくは短 鎖リボ核酸および正電荷を持つ塩基性物質が含まれる状態も、短鎖デォキシリボ核 酸もしくは短鎖リボ核酸、正電荷を持つ塩基性物質ならびに生体内分解性ポリマー が会合した状態で存在し、容易には分解しな状態もさす。本発明において、「封入」 を「内封」あるいは「内包」ということもある。
[0060] 本発明において、「徐放性マイクロスフェア」とは、短鎖デォキシリボ核酸またはリボ 核酸の放出もしくは溶出を制御することで特定遺伝子の発現を抑制する効果を持続 できる作用を有する徐放性微粒子製剤をレ、レ、、徐放性を有するものであれば注射剤 用、粘膜投与剤用等とくに限定されない。これらの持続放出性微粒子製剤は、薬学 的に許容しうる公知の添加物を含むことができる。なお、本記載において、「マイクロ スフエア」を便宜上、「持続放出性微粒子製剤」、「マイクロカプセル」もしくは「マイクロ 粒子」とレ、う場合もある。本発明のマイクロスフェアは W /0/W、 s/o/w、 W/〇、 0/W
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、 S/W等のエマルシヨンを公知の方法、例えば凍結乾燥を適用することによって製造 すること力 Sできる。エマルシヨンの形態は好ましくは、 w /o/w型である。
1 2
[0061] 本発明の w /o/wに基づく徐放性マイクロスフェア製剤は、カプセルィ匕技術、例え
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ば、それ自体公知の w /o/w液中乾燥法により、正電荷を持つ塩基性物質の存在下
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に、 siRNAを溶解して調製した内水相を、生体内分解性ポリマーの有機溶媒に溶解 してなる油相に高速撹拌することによって W /〇エマルシヨンとなし、これを外水相溶
1
液に攪拌しながら添加して w /o/wとなし、さらに乾燥することにより製造すること力 Sで
1 2
きる。即ち、低分子化合物、リボ核酸、ペプチドなどの水溶性薬物、好ましくは短鎖リ ボ核酸又は短鎖デォキシリボ核酸の水溶性薬物ならびに必要に応じて薬物封入化 剤を、正電荷を持つ塩基性物質の存在下に、水、リン酸などの無機物で調製される 緩衝液、もしくはポリビュルアルコールなどの界面活性作用を持つ高分子からなる溶 液に溶解して調製した内水相を、生体分解性および生体適合性を持つポリ乳酸 ·グ リコール酸等の生体内分解性ポリマーをジクロロメタンなどの有機溶媒に溶解してな る油相に高速撹拌することによって W1/0ェマルジヨンを調製し、これをポリビエルァ ルコール溶液等の外水相溶液に攪拌しながら添加し、攪拌して w /o/wとなし、ジクロ
1 2
ノレメタン等の有機溶媒を除去して凍結乾燥することによって薬物を内封した微粒子を 製造するものである。微粒子の平均径は、数 μ πι〜数 100 /i m、好ましくは 10 /i m〜15 0 /i m、さらに好ましくは 20 μ m〜45 μ m、特に好ましくは 20 μ m〜30 μ mである。微粒 子の径がこれより小さくナノオーダーであると細胞に貪食され、細胞内で微粒子中の 核酸が分解されてしまい、また微粒子中に核酸を導入するのが困難になる。また、こ れより大きいと微粒子を含む液は懸濁液となり注射による投与が困難になってしまう。 本発明のマイクロスフェアは、皮下投与した場合、血管中に入ることなく皮下に留まり 核酸を徐々に放出し得る。
[0062] これらマイクロスフェアの製造方法は、特に限定されるものではなく、 w /o/w又は s/
1 2 o/wエマルシヨンを経て、 w/o、 o/w又は Sんエマルシヨンを超臨界流体中で脱溶媒又 はスプレードライすることによって達成される。
[0063] siRNAを内封させるにあたって、 wんエマルシヨンおよび s/oサスペンションを経て、 外油相に油相連続相とは相溶性があるが生体内分解性ポリマーを溶解しない有機 溶媒、例えばへキサンを徐々に添加することが推奨される。 [0064] 正電荷を持つ塩基性物質の添加量は、内水相に対し、重量比で 1 %以上、好まし くは 2%以上、より好ましくは 5%以上であり、良好な製剤特性を維持するためには 15 %以下、好ましくは 10%以下である。なお、ここで用いられる水とは、精製水、蒸留水 、超純水、滅菌水をいう。
[0065] エマルシヨンの脱溶媒方法は、通常は常温、常圧で軽く撹拌しながら溶媒を留去さ せる力 減圧にしたり気体を溶液の表面乃至中部に吹き付けてもよい。また、超臨界 流体中での脱溶媒あるいはスプレードライ法等を採用することができる。また、ェマル ジョンは、 w /o/wのほか、 s/o/w、 w/o、 o/w、 s/oであってもよい。
1 2
[0066] 本発明の短鎖デォキシリボ核酸または短鎖リボ核酸を含む徐放性マイクロスフェア は、医薬組成物、すなわち徐放性マイクロスフヱァ製剤として、種々の形態で被験体 に投与することができる。
[0067] それゆえ、上記短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を含有する本発明の徐放 性マイクロスフェア製剤は、癌、ウィルスによる感染性疾患、免疫性疾患、炎症性疾 患、肝移植時に生じる肝障害、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑症などの難治性疾患 力 生活習慣病など様々な疾病を治療するのに有用である。
[0068] 本発明のマイクロスフェアを含む医薬組成物の投与形態としては、注射剤、坦め込 み剤などによる非経口投与を挙げることができ、皮内、皮下、筋肉内、眼球、関節、 臓器組織、腫瘍組織に投与することができる。医薬組成物は、公知の方法によって 製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえ ば、錠剤用の担体、賦形剤としては、ゲル化剤、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなど が使用される。注射剤は、マイクロスフェアを通常注射剤に用いられる無菌の水性も しくは油性液に懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては 、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、ポリエチレ ングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良レ、。油性 液としては、ゴマ油、大豆油などを使用することができる。
[0069] 投与量は、疾患の重篤度等により適宜決定できるが、本発明の組成物の医薬的に 有効量を患者に投与する。ここで、「医薬的に有効量を投与する」とは、各種疾患を 治療するのに適切なレベルの薬剤を患者に投与することをいう。本発明の医薬組成 物の投与回数は適宜患者の症状に応じて選択される。例えば、体重 lkg当り、マイク ロスフェアに含ませる短鎖デォキシリボ核酸または短鎖リボ核酸の量で 0.0001〜1000 mg、好ましくは 0.0001〜10mg、さらに好ましくは 0.0001〜0.1mgでよレ、。また、マイクロ スフエアの量で、体重 lkg当たり 0.1mg〜100mg、好ましくは 0.2mg〜50mgである。
[0070] 本発明の短鎖デォキシリボ核酸または短鎖リボ核酸を含むマイクロスフェアを被験 体に投与した場合、少なくとも 1週間〜 6ヶ月以上、好ましくは 1ヶ月〜4ヶ月以上にわ たって短鎖デォキシリボ核酸または短鎖リボ核酸を放出することが可能である。従つ て、本発明のマイクロスフヱァを有効成分として含む医薬組成物は、例えば、 1週間 〜6ヶ月、好ましくは 1ヶ月〜4ヶ月に 1度投与すればよい。
[0071] さらに、本発明は本発明の徐放性マイクロスフェアを治療を必要とする被験体に医 学上有効量を投与して、癌、ウィルスによる感染性疾患、免疫性疾患、炎症性疾患、 肝移植時に生じる肝障害、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑症などの難治性疾患から 生活習慣病など様々な疾病を治療する方法を包含する。
[0072] さらに、本発明は、本発明の徐放性マイクロスフェアの癌、ウィルスによる感染性疾 患、免疫性疾患、炎症性疾患、肝移植時に生じる肝障害、糖尿病性網膜症、加齢性 黄斑症などの難治性疾患から生活習慣病など様々な疾病を治療する医薬組成物の 製造への使用を包含する。
実施例
[0073] 本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に よって限定されるものではない。
[0074] 実施例 1 アンチセンス含有マイクロスフェアの調製法：
血管内皮増殖因子（VEGF)の産生に関与するメッセンジャー RNA (mRNA)と相補 的に結合し、遺伝子発現過程における翻訳段階を阻害することによって VEGFの産 生を抑制する効果を持つ抗マウス VEGFアンチセンスオリゴ DNAを、生分解性で生体 適合性の高分子に封入した徐放性マイクロスフェアの調製法を確立することを目的と して実験を行った。
[0075] 2 mMアンチセンスオリゴ DNA (21 base,分子量 6360.2、ホスホロチォエート型） 20
μ Lおよび内水相液量に対して 0.1〜10%量の L(+)_アルギニン（Sigma製）を、 100 /i L の 0.4%ポリビュルアルコール溶液に溶解して内水相とし、生体分解性'生体適合性 のポリ乳酸/ダリコール酸（PLGA、乳酸/ダリコール酸 = 75/25、 Wako製） 0.5 gをジク ロロメタン 2 mLに溶解して油相とした。内水相と油相を混合し、 10,000 rpmで 3分間高 速撹拌を行い wんエマルシヨンを調製した。次に、調製した wんエマルシヨンを 500 m
1 1
Lの 0.25%ポリビュルアルコール溶液に撹拌しながら添カ卩し、 3,000卬 mで 15分間撹 拌して w /o/wエマルシヨンを得た。さらに、 250卬 mで 3時間撹拌することでジクロロメ
1 2
タンを留去し、遠心分離後、上清を除去した。蒸留水で 3回洗浄した後、回収した粒 子を凍結乾燥し、アンチセンス含有マイクロスフェアを得た。
[0076] 実施例 2 siRNA含有長期徐放件マイクロスフェアの調製法:
VEGFの産生に関与する mRNAを分解して VEGFの合成を阻害する作用を持つ短 鎖リボ核酸 siRNAを、 PLGAに封入した長期持続放出性微粒子の調製法を確立する ことを目的として実験を行った。
[0077] 350 nM濃度の抗マウス VEGF siRNA (21bp、分子量 13345.4) 25 β Lと L(+)_アルギ ニン 7.5 あるいは分岐型ポリエチレンィミン（PEI、分子量 25 kDa、 Sigma製） 5 μ gを 、 100 /i Lの 0.4%ポリビニルアルコール溶液に溶解して内水相とした。実施例 1で用 いた PLGA 0.5 gを 3 mLジクロロメタンに溶解して油相とした。内水相と油相を混合し、 10,000卬 mで 2分間高速撹拌を行い w /oエマルシヨンを調製した。次に、調製した w /
1 1
0エマルシヨンを 500 mLの 0.25%ポリビュルアルコール溶液に撹拌しながら添加し、 3， 000卬 mで 3分間撹拌して w /o / wエマルシヨンを得た。さらに、 250卬 mで 3時間撹
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拌することでジクロロメタンを留去し、遠心分離後、上清を除去した。蒸留水で 3回洗 浄した後、回収した粒子を凍結乾燥し、 siRNA含有マイクロスフェアを得た。
[0078] 実施例 3 アンチセンスオリゴ DNAの封入率（％)：
実施例 1で調製したアンチセンスオリゴ DNA含有マイクロスフヱァを電子顕微鏡で 観察し、さらに顕微鏡写真力 フェレ一水平径を測定して平均粒子径を算出した。ま た、マイクロスフェア 25 mgを試験管にとり、ァセトニトリル 0.5 mLを加えて PLGA成分を 溶解し、これに、 pH6.0リン酸緩衝液 0.5 mLを加えて 2時間振とうした後、 5,000卬 mで 20分間遠心分離し、上清について HPLC測定を行レ、、マイクロスフェアに封入された アンチセンスオリゴ DNA量を求めた。粒子調製時の固形成分の処方量の総質量を 10 0%とし、これに対する測定されたアンチセンスオリゴ DNA量の割合をマイクロスフェア へのアンチセンスオリゴ DNAの封入率（％)として算出した。 HPLCの分析条件は以下 のとおりである。
[0079] 装置：
SHIMADZU製 HPLCシステム（SCL-lOAvpシステムコントローラー、 LClOADvpポンプ 、 DGU- 12Aデガッサー、 SPD- lOAvp UV検出器、 SIL-lOAvpオートインジェクター、 C T〇-10ASvpカラムオーブン、 C-R8Aプリンター）
カラム：
TSKgel Oligo DNA RP、 4.6 mm X 15 cm、 TOSOH
移動相：
A; 0.1 M triethylamine acid (TEAA)
B ;ァセトニトリノレ
A/B (90/10)→A/B (70/30)
リニアグラジェント（45分）
流 速： lmL/min
検 出； UV (260 nm)
注入量： 10 /i L
(結果）
調製されたアンチセンスオリゴ DNA含有マイクロスフェアは、球形の粒子であること が顕微鏡により観察され、また、マイクロスフェアの平均粒子径は、いずれも 30〜45 β mで注射針を容易に通過し得る粒子径であり、注射剤として応用可能な大きさの粒 子であることが確認された。
[0080] 図 1に示すように、マイクロスフェアへのアンチセンスオリゴ DNAの封入率は、粒子 調製時の内水相へのアルギニンの添カ卩割合によつて変化し、アルギニン添カ卩率の増 加に伴い封入率は増大し、特に、内水相に対して 7.5重量％以上のアルギニンを添 加することで封入率は約 80%もの高い値を示し、アルギニンなどの正電荷を持つ塩 基性物質を適当量添カ卩することで高い封入率のアンチセンスオリゴ DNA含有マイクロ スフエアが調製可能であることが示された。 [0081] 実施例 4 残存率を指標として、マイクロスフェアからのアンチセンス DNAの放出件を 籠
実施例 1で調製したマイクロスフェア 25 mgを栓付試験管に秤量し、 37°Cの pH7.4の 0.1 Mリン酸緩衝液 1.5 mLをカ卩え、回転撹拌装置を用いて 37°C下で 28日間の放出試 験を行った。一定時間後、 5,000 rpmで 20分間遠心分離した後上清を除去し、得られ た沈殿物（マイクロスフェア）にァセトニトリル 0.5 mLを加えて PLGA成分を溶解した。 これに、 pH6.0リン酸緩衝液 0.5 mLを加えて強く混合し、 2時間振とうした後、 5,000 rp mで 20分間遠心分離し、上清について HPLC測定を行レ、、マイクロスフェアに残存し ているアンチセンス DNA量を求めた。試験前のマイクロスフェア中のアンチセンス DN A量を 100%とし、これに対する各時間のマイクロスフェア中のアンチセンス DNA量の 割合を残存率（％)として算出した。この残存率を指標として、マイクロスフェアからの アンチセンス DNAの放出'性を言平価した。
[0082] HPLCの分析条件は、実施例 3と同じである。
[0083] (結果）
内水相にアルギニンを 5%以上添カ卩して調製したマイクロスフェアは、 2ヶ月間にわ たってアンチセンス DNAを持続的に安定に放出することが示された。
[0084] 実施例 5 VEGF産生抑制率（％)：
血清を含む DMEM培地に懸濁した培着細胞：マウス腎由来癌細胞 Sarcomal80 (S-18 0)を I X 105個/穴の密度で 24穴培養プレートに播種し、 37°C、 5%CO条件下で前培 養した。 24時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS)で洗浄したのち無血清培地 RPMI1640に培地交換し、実施例 2で用いた siRNA 0.13 μ gまたは実施例 1で用いた アンチセンスオリゴ DNA 3.25 x gを培養プレートの各穴に添加して 37°C、 5%C〇条 件下で 12時間トランスフエクシヨン (形質導入）を行った。その後、細胞を PBSで洗浄し たのち無血清培地 RPMI1640を加え、 37°C、 5%CO条件下で静置し、 12時間ごとに 7
2時間までの培地中の VEGF量を酵素免疫測定法（ELISA法）で測定した。細胞のみ の培地中の単位細胞あたりの VEGF量を 100%とし、これに対する各試料培地中の単 位あたりの VEGF量の割合を VEGF産生抑制率（％)として算出した。
[0085] (結果） 図 2に示すように、アンチセンスオリゴ DNAに比べ、 siRNAは高い VEGF産生抑制率 を示した。このときの siRNAの投与量はアンチセンスオリゴ DNAの 1/25倍であり、極め て少量の短鎖リボ核酸で高い RNAi効果が得られることが判明した。アンチセンス DN Aは 3日で効果が消失しており、作用時間が短いことが問題である。また、 siRNAにお いては実験を行った 3日間は抑制が見られたが次第に抑制率が低下しており、効果 の持続は通常 1週間程度とされている。この実験力 も作用の持続には短鎖リボ核酸 の長期徐放性製剤の必要性が示唆された。
[0086] 実施例 6 VEGF産牛抑制率（％)：
VEGF産生抑制効果を示す siRNAを塩基性物質および市販導入試薬とともに細胞 内に導入した際の RNAi効果を評価し、遺伝子キャリアーの必要性を検討することを 目的として実験を行った。
[0087] 遺伝子導入キャリア一として、 L(+) -アルギニン（7.5 μ g)、分岐型ポリエチレンィミン（ PEI、 Mw2.5 kDa、 0.1 /i g)、 jetPEl (0.8 mし、 N/P比 =2)、 Lipofectamine (2 μ g)、 SiLe ntfect (1.6 i g)用レ、、これらの物質と実施例 2で用いた siRNA (0.13 g)をそれぞれ 混合し、複合体を調製した。実施例 5と同様に S-180細胞を、血清を含む DMEM培地 に懸濁したのち、 1 X 105個/穴の密度で 24穴培養プレートに播種し、 37°C、 5%CO 条件下で前培養した。 24時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS)で洗浄したの ち無血清培地 RPMI1640に培地交換し、 siRNA単独（0.13 μ g)もしくは上記調製した si RNAとキャリアーとの複合体を培養プレートの各穴に添カ卩し、 37°C、 5%CO条件下で トランスフエクシヨンした。 12時間後、細胞を PBSで洗浄したのち無血清培地 RPMI164 0をカロえ、 37°C、 5%CO条件下に静置した。 12時間後、 ELISA法で培地中の VEGF量 を測定し、実施例 5と同様に VEGF産生抑制率（％)を算出した。
[0088] (結果）
図 3に示すように、正電荷を持つ遺伝子キャリアーと負電荷の siRNAを静電気的に 相互作用させた複合体として投与することで、 siRNA単独投与に比べ、 VEGF産生抑 制率が著しく向上することが明らかとなった。この結果は、 siRNAを細胞内に送達させ 、高い RNAi効果を誘導するには、遺伝子キャリアーが必要であることを示唆している [0089] 実施例 7 マイクロスフェアへの siRNAの封入率（％)：
実施例 2で調製されたマイクロスフェアを電子顕微鏡で観察し、さらに顕微鏡写真 からフェレ一水平径を測定し平均粒子径を算出した。また、マイクロスフェア 25 mgを 試験管にとり、ァセトニトリル 0.5 mLを加えて PLGA成分を溶解し、これに、 pH6.0リン 酸緩衝液 0.5 mLをカ卩えて 2時間振とうした後、 5,000 rpmで 2分間遠心分離し、上清に ついて HPLC測定を行レ、、マイクロスフェアに封入された siRNA量を求めた。粒子調 製時の固形成分の処方量の総質量を 100%とし、これに対する測定された siRNA量 の割合をマイクロスフェアへの siRNAの封入率（％)として算出した。
[0090] HPLCの分析条件は実施例 3と同じである。
[0091] (結果）
実施例 2調製されたマイクロスフェアは、 siRNAのみを封入、 siRNAとアルギニン封 入、 siRNAと PEI封入したいずれのマイクロスフェアにおいても、球形の粒子であること が顕微鏡観察により確認された。また、表 1に示すように、マイクロスフェアの平均粒 子径は、いずれも 30〜45 /i mで通常の注射針を容易に通過し得る粒子径であり、注 射剤として使用可能な大きさの粒子であることが確認された。マイクロスフェアへの siR NA封入率は、 siRNAのみを封入した場合には約 48%であったのに対し、正電荷の塩 基物質であるアルギニンを添加した場合に約 64%と大きぐさらに PEIを添加した場合 においては約 80%の高い封入率を示した。以上のことから、高封入率で siRNAをマイ クロスフェアに封入するためには、正電荷の物質とともに siRNAを添カ卩することが効果 的であり、特に、遺伝子導入剤としても用いられる PEIを添加することで、より封入効率 が高まることが示された。
[表 1]
Figure imgf000023_0001
実施例 8 マイクロスフェアからの siRNAの放出举動：
siRNAを PLGAに内封したマイクロスフェアからの siRNAの放出挙動を検討すること を目的として実験を行った。
[0093] 実施例 2で調製されたマイクロスフェア 25 mgを栓付試験管に秤量し、 37°Cの ρΗ7·4 の 0.1 Μリン酸緩衝液 1.5 mLを加え、回転撹拌装置を用いて 37°C下で 28日間の放出 試験を行った。一定時間後、 5,000 rpmで 20分間遠心分離し、上清を除去後、得られ た沈殿物にァセトニトリル 0.5 mLを加えて PLGA成分を溶解した。これに、 pH6.0リン 酸緩衝液 0.5 mLをカ卩えて 2時間振とうした後、 5,000 rpmで 2分間遠心分離し、上清に ついて HPLC測定を行レ、、マイクロスフェア中の siRNA残存量を求めた。試験前のマ イクロスフェア中の siRNA量を 100%とし、これに対する各時間のマイクロスフェア中の siRNA残存量の割合を残存率（％)として算出した。この残存率を指標として、マイクロ スフエアからの siRNAの放出性を評価した。
[0094] HPLCの分析条件は、実施例 3と同じである。
[0095] (結果）
図 4に示すように、アルギニンや PEIを添加したマイクロスフェアでは、 siRNAのみを 封入したマイクロスフェアに比べ、初期バーストが小さぐ 28日間にわたって持続的に siRNAが放出されることが認められた。このことからマイクロスフェアの調製段階にお いて内水層にアルギニンや PEIなどの正電荷を持つ塩基性物質を添加することで封 入率の向上と初期バーストの改善、放出速度の制御が可能であることが示された。
[0096] 実施例 9 VEGF産生抑制効果を評価：
実施例 2で調製されたマイクロスフェアは、実施例 7で示されたように緩衝液を用い た in vitro放出性試験による評価では持続的な放出特性を示すことが明らかとなった こと力 、次に、細胞を用いた実験系で実施例 5、 6と同様に、 siRNA含有マイクロスフ エアによる VEGF産生抑制効果を評価することを目的として実験を行った。
[0097] 実施例 5と同様に DMEM培地に懸濁させた S-180細胞を 1 X 105個/穴の密度で 24穴 培養プレートに播種し 37°C、 5%CO条件下、 24時間、前培養した。細胞を PBSで洗 浄した後、無血清培地 RPMI1640に培地交換し、実施例 2で調製された PLGAのみか らなるマイクロスフェア、 siRNAのみを含有したマイクロスフェアならびにアルギニンと si RNAを含有したマイクスフエアをそれぞれ 10 mg入れたメッシュ付きチャンバ一を各穴 の細胞上部にセットし、 37°C、 5%CO条件下で静置した。 12時間後に培地を採取し 、培地中の VEGF量を ELISA法によって測定した。 PLGAのみ力 なるマイクロスフエ ァを用いた場合の培地中の単位細胞あたりの VEGF量を 100%とし、これに対する siR NA含有マイクロスフェアおよび siRNA/アルギニン含有マイクロスフェアを用いた場合 の単位あたりの VEGF量の割合を VEGF産生抑制率（％)として算出した。ここでは、 無血清培地を使用しているため、長期間生細胞を維持するのが困難であったため、 4 8時間ごとにマイクロスフェア入りのチャンバ一を外し、このチャンバ一を新たに前培 養しておいた新鮮な細胞の上部に再セットし、上記同様、 12時間後の培地中 VEGF 量を測定した。上記操作を 17日間継続して行い、マイクロスフェアから持続的に放出 される siRNAの 17日間にわたる RNAi効果を評価した。
(結果）
表 2に示すように、試験開始 12時間後は、 VEGF産生抑制率は siRNAのみを封入、 s iRNAとアルギニンを封入したマイクロスフェア間の VEGF産生抑制効果に大きな差は 認められなかった。し力し、 siRNAのみを封入したマイクロスフェアにおいては、 12時 間以降、経時的に VEGF産生抑制率の低下が認められ、持続的な siRNAによる RNAi 効果が得られなかった。これに対し、アルギニンを共に封入した siRNAマイクロスフエ ァにおいては、 siRNAのみを封入したマイクロスフェアに比べ、顕著な RNAi効果力 5日まで持続することが示された。
[表 2]
Figure imgf000025_0001
実施例 10 腫瘍体積の変化を指標 した生体内における siRNA効果の評価： 担癌マウスに異なる濃度の siRNAを投与し、腫瘍体積の変化を指標として、生体内 における siRNAの効果を評価することを目的として実験を行った。
[0100] 担癌マウスの作製：実施例 5と同様に S-180細胞を血清を含む DMEM培地中で、 37 °C、 5%CO条件下前培養した。細胞を PBSで洗浄した後無血清培地 RPMI1640に懸
2
濁した。この S-180細胞（5 X 106個/ 300 μ L)を、 8週令 ICR雌性マウスの背部皮下に 注射し、移植した。移植 6日後、形成される腫瘍の体積が 50 mm3以上に到達した時 点で担癌マウスが作製されたと判断し、以下の実験に用いた。
[0101] 前記方法によって S-180移植後 6日目の担癌マウスの腫瘍内に、 1、 2、 5、 10、 15 μ
Μの異なる濃度の実施例 2で用いた siRNAを投与し、 1、 3、 5、 7、 10、 14日後に腫瘍の 長径と短径を測定し、次式を用いて腫瘍の体積を算出した。
[0102] 腫瘍体積 (mm3) = (腫瘍の短径) 2 X腫瘍の長径 /2
(結果）
図 5に示すように、 siRNA未投与のコントロールにおいては、経時的な腫瘍体積の 増大が認められた力 siRNA溶液を腫瘍内に投与したマウスにおいては、いずれの 投与濃度においても顕著に腫瘍の増殖が抑制された。また、腫瘍の増殖は、 siRNA の濃度依存的に抑制される傾向が認められた。しかし、 siRNA投与後 7日を過ぎると、 腫瘍体積は急激に増大する傾向が認められ、いずれの濃度においても siRNA単独を 単回投与した場合には、長期間の RNAi効果の持続が得られないことが明らかとなつ た。
[0103] 実施例 11 siRNA含有マイクロスフェアを用いた生体内での RNAi効果の評価：
実施例 9において、担癌マウスに siRNAを単独で単回投与した場合、顕著な RNAi 効果が認められた力 その効果は一過性であり、長いものでも効果の持続期間は約 7 日であった。このことから、実施例 2で調製された siRNA含有マイクロスフェアを用いて 、生体内での RNAi効果を評価することを目的として実験を行った。
[0104] 担癌マウスは、実施例 9と同様の方法で作製し、腫瘍体積が 50 mm3以上の大きさに 到達した癌細胞移植 6日後に以下の実験を行った。
[0105] なお、 siRNA含有マイクロスフェアは、実施例 2で内水相中に添加する siRNA量を 35 0 nMを 25 μ Lとしたが、これを 20 μ Μを 25 μ Lとし、実施例 2に示した w /o/w液中乾 燥法により調製した。
[0106] PBSおよび siRNAを含有しなレ、PLGAのみから成るマイクロスフェアをコントロールと して担癌マウスに腫瘍内投与した。また、 siRNA含有マイクロスフェア 10 mgを懸濁し た PBS溶液を担癌マウスの腫瘍内に投与した。投与後 2日ごとに腫瘍体積を実施例 7 と同様の方法で測定した。
[0107] (結果）
図 6に示すように、コントロールにおいては腫瘍体積の増殖が著しぐこれに対し、 si RNA含有マイクロスフヱァでは、腫瘍増殖は抑制されることが認められた。 siRNA含有 マイクロスフェアによる RNAi効果は、 siRNAのみを封入したマイクロスフェアに比べ、 アルギニンや PEIを共に封入した siRNA含有マイクロスフェアを用いた場合に顕著に 抑制され、その効果は約 1ヶ月間もの長期にわたって持続することが明らかとなった。 以上のことから、 siRNAを正電荷の塩基性物質をキャリア一として生体分解性高分子 に封入してマイクロスフェアとすることで、長期間にわたって安定にかつ持続的に siR NAを放出し、生体内における持続的な RNAi効果を得る長期徐放性マイクロスフェア が調製可能であることが示された。
[0108] 実施例 12 anti-cFLIP iRNA含有長期徐放性マイクロスフェアの調製
アポトーシス阻害因子である cFLIP (cellular FLICE-inhibitory protein)の産生に関 与する mRNAを分解して cFLIPの合成を阻害する作用を持つ短鎖リボ核酸 siRNAと V EGF産生を抑制する siRNAを、伴に、 PLGAに封入した長期徐放性微粒子を調製法 した。
[0109] 40 μ Μの濃度の抗マウス cFLIP (23 bp、分子量 14544) 25 /i L、 40 μ Μの濃度の抗 マウス VEGF (21 bp、分子量 13345.4) 25 x Lと分岐型ポリエチレンィミン（PEI、分子量 25 kDa、 Sigma製） 500 μ gを 100 μ Lの 0.4%ポリビュルアルコール溶液に溶解して内水 ネ目とした。実施例 1で用いた PLGA 0.5 gを 3 mLジクロロメタンに溶解して油相にした。 内水相と油相を混合し、 10,000卬 mで 2分間高速攪拌を行い wんエマルシヨンを調製
1
した。次に、調製した w エマルシヨンを 500 mLの 0.25%ポリビュルアルコール溶液
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に撹拌しながら添カ卩し、 3,000卬 mで 3分間撹拌して w /o/wエマルシヨンを得た。さら
1 2
に、 250卬 mで 3時間攪拌することでジクロロメタンを留去し、遠心分離後、上清を除 去した。蒸留水で 3回洗浄した後、回収した粒子を凍結乾燥し、 siRNA含有マイクロス フェアを得た。
[0110] 得られたマイクロスフェアの平均粒子径は約 23 μ m、 siRNA含有率は約 83%であった
[0111] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
[0112] 本発明の徐放性マイクロスフェア、特に w /o/w型徐放性マイクロスフェアによれば
1 2
、徐放性マイクロスフェアー中に従来に比べてより多量の siRNA (small interfering RN A)を封入することが可能となり、長期にわたった薬剤放出が可能となる。
[0113] したがって、遺伝子治療における遺伝子製剤としての有用性が大いに期待される。

Claims

請求の範囲
[I] 有効成分としての短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸と 1重量％〜： 10重量％ の静電気的に相互作用してこれら核酸と複合体を形成し得る正電荷とを有する塩基 性物質とを含んでなる徐放性マイクロスフェア。
[2] 短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸が、一本鎖または二本鎖構造を有し、長さ が 10〜85塩基である請求項 1に記載の徐放性マイクロスフェア。
[3] 短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸が、一本鎖または二本鎖構造を有し、長さ が 15〜30塩基である請求項 1に記載の徐放性マイクロスフェア。
[4] 短鎖リボ核酸が、長さが 15〜30塩基の siRNAである請求項 1〜3のいずれか 1項に 記載の徐放性マイクロスフェア。
[5] 正電荷を有する塩基性物質が、カチオン性ポリマーである請求項 1〜4のいずれか
1項に記載の徐放性マイクロスフェア。
[6] 正電荷を有する塩基性物質が、アルギニン、ポリエチレンィミン (PEI)、細胞透過性 ペプチド、ポリ-しリジン、ポリ— L—オル二チン又は siLentFect (登録商標）からなる 群から選択される請求項:!〜 5のいずれか 1項に記載の徐放性マイクロスフェア。
[7] 正電荷を有する塩基性物質が、ポリエチレンィミン (PEI)、細胞透過性ペプチド、ポ リ- L-リジン、ポリ—L—オル二チン又は siLentFect (登録商標）からなる群から選択さ れる請求項 6に記載の徐放性マイクロスフェア。
[8] さらに、生体内分解性ポリマーを含んでなる請求項 1〜7のいずれ力 4項に記載の 徐放†生マイクロスフェア。
[9] 生体内分解性ポリマーが、ポリ乳酸とポリグリコール酸又は乳酸とグリコール酸の共 重合体である請求項 8に記載の徐放性マイクロスフェア。
[10] 皮内、皮下、筋肉内、眼球、関節、臓器組織または腫瘍組織に注射可能な、有効 成分として短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を有する請求項 1〜9のいずれか
1項に記載の徐放性マイクロスフェア。
[II] 請求項 1〜： 10のいずれ力 1項に記載の徐放性マイクロスフェアを有効成分として含 む医薬組成物。
[12] 短鎖デォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸が腫瘍細胞の増殖を抑制し得る、請求項 ：!〜 10のいずれ力 1項に記載の徐放性マイクロスフェアを有効成分として含む杭がん 剤。
[13] 正電荷を持つ塩基性物質の存在下に、 siRNAを溶解して調製した内水相を、生体 内分解性ポリマーの有機溶媒に溶解してなる油相に高速撹拌することによって W1/0 エマルシヨンとなし、これを外水相溶液に攪拌しながら添カ卩して wん /wとなし、さらに
1 2
乾燥することを特徴とする w /o/w液中乾燥法による請求項 1〜： 10に記載の徐放性
1 2
マイクロスフェアの製造方法。
[14] w /o/w又は s/o/wエマルシヨンを経て、 w/o、 o/w又は s/oエマルシヨンを超臨界流
1 2
体中で脱溶媒又はスプレードライすることを特徴とする請求項:!〜 10に記載の徐放 性マイクロスフェアの製造方法。
[15] wんエマルシヨン又は sんサスペンションを経て、外油相に油相連続相とは相溶性が あるが生体内分解性ポリマーを溶解しなレ、有機溶媒を徐々に添加して当該短鎖デ ォキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を内封させることを特徴とする請求項 14に記載の 製造方法。
[16] 生体内分解性ポリマーが、ポリ乳酸とポリグリコール酸又は乳酸とグリコール酸の共 重合体である請求項 15に記載の製造方法。
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