WO2007023830A1

WO2007023830A1 - シチジンジリン酸コリンの製造法

Info

Publication number: WO2007023830A1
Application number: PCT/JP2006/316451
Authority: WO
Inventors: Yoshitaka Kawamoto; Takayuki Yanagi; Hideki Oda
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 2005-08-23
Filing date: 2006-08-23
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2008-02-23
Also published as: JP5112869B2; JPWO2007023830A1

Abstract

　オロット酸またはウラシルと、コリンまたはホスホリルコリンとからCDP-コリンを生成する活性を有する生体触媒を、媒体中でオロット酸またはウラシル、およびコリンまたはホスホリルコリンに接触させ、媒体中にCDP-コリンを生成蓄積させ、該媒体からCDP-コリンを採取するCDP-コリンの製造法において、オロット酸またはウラシルを、オロット酸またはウラシルを含有するアルカリ性溶液として該媒体に添加することを特徴とするCDP-コリンの製造法を提供する。

Description

明細書

シチジンジリン酸コリンの製造法

技術分野

[0001] 本発明は、医薬品として有用なシチジンジリン酸コリンの製造法に関する。

背景技術

[0002] シチジンジリン酸コリン (以下、 CDP-コリンと略す)の製造法としては、化学的合成法、微生物菌体を用いてシチジン- 5 ' -三リン酸 (以下、 CTPと略す）、シチジン- 5 ' - 二リン酸 (以下、 CDPと略す)またはシチジン- 5 ' -—リン酸 (以下、 CMPと略す)から製造する方法 (特許文献 1、特許文献 2、特許文献 3)等が知られているが、いずれも収率が低い、原料が高価である、などの問題がある。

[0003] 微生物を用いて生産する方法においては、生産性を向上させるために遺伝子組換え微生物を利用して、ゥリジン- 5 ' -—リン酸 (以下、 UMPと略す）とコリンまたはホスホリルコリンとから製造する方法 (特許文献 4)、 CMPとコリンまたはホスホリルコリンとから製造する方法 (特許文献 5)、ォロット酸とコリンまたはホスホリルコリンとから製造する方法 (特許文献 6)、ゥラシルとコリンまたはホスホリルコリンとから製造する方法 (特許文献 7)が報告されている。しかしながら、ォロット酸ゃゥラシルから製造する方法では、ォロット酸ゃゥラシルは水への溶解度が低いため、これら原料を CDP-コリンの生成蓄積を行う媒体へ添加する際には粉末のまま投入する必要があり、多大の手間を要する。ォロット酸ゃゥラシルのアルカリ性溶液中における溶解度が高いことは知られて Vヽるが、ォロット酸またはゥラシルを含有するアルカリ性溶液を該媒体に添加することにより CDP-コリンを効率よく製造できることは知られて、な、。

特許文献 1：特公昭 48-2358号

特許文献 2：特公昭 48-40758号

特許文献 3：特公昭 48-2359号

特許文献 4 :国際公開第 99/49073号パンフレット

特許文献 5：特開 2001-103973号

特許文献 6：特許第 3369236号特許文献 7 :国際公開第 03/95660号パンフレット

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 本発明の目的は、 CDP-コリンの効率のよい製造方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0005] 本発明は、以下の（1)〜）に関する。

(1)ォロット酸またはゥラシルと、コリンまたはホスホリルコリンと力 CDP-コリンを生成する活性を有する生体触媒を、媒体中でォロット酸またはゥラシル、およびコリンまたはホスホリルコリンに接触させ、媒体中に CDP-コリンを生成蓄積させ、該媒体から CD P-コリンを採取する CDP-コリンの製造法において、ォロット酸またはゥラシルを、ォロット酸またはゥラシルを含有するアルカリ性溶液として該媒体に添加することを特徴とする CDP-コリンの製造法。

(2)媒体の pHを CDP-コリンの製造に適した pHに維持するようにォロット酸またはゥラシルを含有するアルカリ性溶液を添加することを特徴とする、上記（1)の CDP-コリンの製造法。

(3)生体触媒が微生物の培養物または該培養物の処理物を含有する生体触媒である、上記（1)または (2)の CDP-コリンの製造法。

(4)微生物がェシエリヒア (Escherichia)属、コリネバタテリゥム (Corvnebacterium)属、バチノレス (Bacillus)属、ストレプトコッカス (Streptococcus)属、シノリゾビゥム (Sinorhiz obium)属、へモフィラス (Haemophilus)属およびサッカロミセス (Saccharomvces)属に属する微生物力もなる群より選ばれる微生物である、上記 (3)の CDP-コリンの製造法

(5)微生物がコリネバタテリゥム (Corvnebacterium)属およびェシエリヒア (Escherichia )属に属する微生物力も選ばれる微生物である、上記 (3)の CDP-コリンの製造法。

(6)微生物がコリネバタテリゥム 'アンモニアゲネス (Corvnebacterium ammoniagenes) およびェシエリヒア.コリ（Escherichia coli)に属する微生物である、上記（3)の CDP-コリンの製造法。

(7)微生物がコリネバタテリゥム 'アンモニアゲネス ATCC21170株およびェシエリヒア' コリ MM294/pCKG55(FERM BP- 3717)株である、上記（3)の CDP-コリンの製造法。発明の効果

[0006] 本発明により、 CDP-コリンを工業的に有利に製造する方法が提供される。

発明を実施するための最良の形態

[0007] 本発明に用いられるォロット酸またはゥラシルを含有するアルカリ性溶液としては、水酸ィ匕ナトリウム溶液、水酸ィ匕カリウム溶液、水酸化リチウム溶液、水酸化カルシウム溶液、水酸化バリウム溶液またはアンモニア水をあげることができる。該アルカリ性溶液の規定度は 0.01〜15規定が好ましぐ 0.1〜12規定がさらに好ましい。アルカリ性溶液中のォロット酸またはゥラシルの濃度は lmmol/L〜2mol/Lが好ましぐ 10mmol/L〜 1.6mol/L力 Sより好ましヽ。

[0008] ォロット酸またはゥラシルを含有するアルカリ性溶液を、ォロット酸またはゥラシルとコリンまたはホスホリルコリンと力 CDP-コリンを生成する活性（以下、 CDP-コリン生成活性と略す)を有する生体触媒とコリンまたはホスホリルコリンとを含有する媒体に添加し、該媒体中で該生体触媒、ォロット酸またはゥラシル、およびコリンまたはホスホリルコリンを接触させることによって媒体中に CDP-コリンを生成蓄積させ、該媒体力も CDP-コリンを採取することによって、 CDP-コリンを製造することができる。

[0009] 該生体触媒とコリンまたはホスホリルコリンを含有する媒体には、必要に応じてォロット酸またはゥラシルゃ他の成分が添加されて、てもよ、。ォロット酸またはゥラシルを含有するアルカリ性溶液を該媒体に添加する場合、該媒体の pHが CDP-コリンの製造に適した pHに維持されるように添加することが好ましい。該 pHとしては、 5〜10、好ましくは 6〜8をあげることができる。該アルカリ性溶液は連続的または断続的に該媒体に添加することができる。

[0010] 本発明に用いられる生体触媒としては、 CDP-コリン生成活性を有する生体触媒であれば、いずれでも用いることができる。

このような生体触媒としては、 CDP-コリン生成活性を有する微生物の培養物、該培養物の処理物等をあげることができる。

微生物としては、元来 CDP-コリン生成活性を有する微生物、および元来 CDP-コリン生成活性はないが、 CDP-コリンを生成する反応を担う酵素（以下、 CDP-コリン生成酵素と略す)をコードする DNAで形質転換された微生物、または該活性を有する他の微生物の細胞を融合させて得られる微生物などをあげることができる。

[0011] 上記微生物としては、ェシエリヒア (Escherichia)属、セラチア (Serratia)属、バチルス（ Bacillus)属、ブレビパクテリゥム (Brevibacterium)属、コリネパクテリゥム (Corvnebacteri um)属、ミクロノくクテリウム (Microbacterium)属、シュ一ドモナス (Pseudomonas)属、ストレプトコッカス (Streptococcus)属、シノリゾビゥム（Sinorhizobium)属、へモフィラス (Hae mophilus)属、アースロノくクタ一 (Arthrobacter)属、オーレオノくクテリゥム (Aureobacte rium)属、セルロモナス（Cellulomonas)属、クラビバクタ一（Clavibacter)属、クルトバタテリゥム（Curtobacterium)属、ピメロノクタ一 (Pimerobacter)属、サッカロマイセス（Sac charomvces) J¾、シゾサッカロマ TTス (Schizosaccharomvces 属、クリュベロマイセス (Kluweromvces)属、トリコスポロン（TrichosDoron)属、シヮニォマイセス（Schwanni omvces)属、ピヒア (Pichia)属、またはキャンディダ属に属する微生物等をあげることができる。

[0012] エシリヒア (Escherichia)属に属する微牛.物しては、 Escherichia coli MM294, Esc hencnia coli XL1- Blue、 Eschencnia coli XL2- Blue、 Eschencnia coli DH丄、 Escherich ia coli MC1000、 Escherichia coli KY3276、 Escherichia coli W1485、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli HB101、 Escherichia coli No.49、 Escherichiac oli W3110、 Es chericnia coli NY49、 Escherichia coli GI698および Escherichia coli TBI等をあげことができる。セラチア (ggimtk)属に属する微生物としては、例えば、 Serratia ficaria、 S erratia fonticola、 aerratia iiauefaciensおよび aerratia marcescens等をめげ、ること:^できる。バチルス (MU )属に属する微生物としては、 Bacillus subtilisおよび Bacillus a myloliauefaciens等をあげることができるブレビパクテリゥム (Brevibacterium)属に属する微生物としては、 Brevibacterium immariophiium, Brevibacterium saccharolvticu Brevibacterium flavumおよび BreviDactenum lactofermentum等をあること力 ²¹ eさる。コリネパクテリゥム (Corynebacterium)属に属する微生物としては、 Corvnebacteriu m glutamicum A丁し Gi»¾032: ^よびし orvnepactenum glutamicum ATCC13869等の Cor vnebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872および Cory nebacterium ammoniagenes

Cor vnebacterium acetoacidophilum ATCC 13870等の Corvnebacterium acetoacidophilum 等をあげることができる。ミクロパクテリゥム (Microbacterium)属に属する微生物として【ま、 Microbactenum ammoniaphilum ATCし 15354等の iicrobactenum ammoniaphilu Microbacterium lactiumおよび Microbacterium lmperiale等をあること力 ²¹ eさる。シユードモナス (Pseudomonas)属に属する微生物としては、 Pseudomonas putida等をあげることができる。ストレプトコッカス (Streptococcus)属に属する微生物としては、 eptococcus pneumoniae^ ¾r¾けること力 C、さる。ンノリゾビゥム (amorhizobium;属に属する微生物としては、 Sinorhizobium mdi 等をあげることができる。へモフィラス（ Haemophilus)属に属する微生物としては、 Haemophilus Μ ^等をあげることができる。アースロバクタ一 (Arthrobacter)属に属する微牛.物しては、 Arthrobacter ci treusおよび Arthrobacter globiformis等をあげるこができる。オーレォバクテリゥム ( ureobacterium) に腐する fi¾牛.物とし飞は、 Aureobacterium flavescens. Aureobacter mm saperdaeおよひ AureoDactenum testaceum めげこと力で^るセノレ口モナス (し ellulomonas) 〖こす 1激牛.物としては、し ellulomonas flavigenaおよびし ellulomon as mla等をあげることができる。クラビバクタ一 (Clavibacter)属に属する微牛.物しては、 clavibacter michiganensisおよびし lavibacter rathavi等をあ hること力 ²¹ eさる。クノレトバクテリゥム（Curtobacterium)属に属する微牛.物しては、 Curtobacterium albidu 2i、し urtobacterium citreumおよびし urtoDacterium lui§ l等をめげ Oこと力できる。ヒメロパクター (Pimerobacter)属に属する微牛.物しては、 Pimerobacter sinmlex等をあげることができる。

サッカロマイセス (Saccharomvces)属に属する微生物としては、 Saccharomvces cere visiae等をあげることができるシゾサッカロマイセス (Schizosaccharomvces)属に属する微生物としては、 Schizosaccharomvces E2mk等をあげることができる。クリュイべ口マイセス (Kluweromvces)属に属する微生物としては、 Kluweromvces lactis等をあげることができる。トリコスポロン（TrichosDoron)属に属する微生物としては、 Trichospor on pullulans等をあげることができるシヮ-ォマイセス (Schwanniomvces)属に属する微生物としては、 Schwanniomvces alluvius等をあげることができるキャンディダ（Can dida)属に属する微生物としては、 Candida utilis等をあげることができる。 [0014] 微生物としては、上記の微生物をあげることができる力ェシエリヒア (Escherichia) 属、コリネパクテリゥム（Corvnebacterium)属、バチルス（Bacillus)属、ストレプトコッカス (Streptococcus)属、シノリゾビゥム (Sinorhizobium)属、へモフィラス (Haemophilus) 属およびサッカロミセス (Saccharomvces)属に属する微生物力なる群より撰ばれる微生物が好ましく用いられ、ェシエリヒア (Escherichia)属、ブレビパクテリゥム (Brevibac terium)属およびコリネパクテリゥム (Corvnebacterium)属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物がさらに好ましく用いられる。

[0015] 上記微生物のうち、元来 CDP-コリン生成活性を有する微生物であっても CDP-コリン生成活性が充分に強くない場合には、該微生物に、 CDP-コリン生成酵素をコードする DNAを有する組換え体 DNAを常法によって導入する力該活性を有する他の微生物の細胞を融合させることにより、該活性の強化された微生物を作製して用いてもよい。

該活性が強化された微生物および該活性が付与された微生物としては、 CDP-コリン生成酵素をコードする DNAを以下に示す方法によって微生物に導入して得られる形質転換体が好ましく用いられる。

[0016] CDP-コリン生成酵素をコードする DNAとしては、例えば、ォロット酸からォロチジン- 5' -一リン酸 (以下、 OMPと略す)を生成する活性を有するォロット酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ [EC 2.4.2.10]、 OMPから UMPを生成する活性を有するォロチジン- 5 ， -モノリン酸デカルボキシラーゼ [EC4.1.1.23]、ゥラシルカもゥリジンを生成する活性を有するゥリジンホスホリラーゼ [EC 2.4.2.3]、ゥリジン力 UMPを生成する活性を有するゥリジンキナーゼ [EC 2.7.1.48]、 UMPからゥリジン- 5，-二リン酸（以下、 UDPと略す）を生成する活性を有するゥリジル酸 'シチジル酸キナーゼ [EC2.7.1.48]、 UDP力らゥリジン- 5' -三リン酸 (以下、 UTPと略す)を生成する活性を有するヌクレオシドニリン酸キナーゼ [EC 2.7.4.6]、 UTPから CTPを生成する活性を有するシチジン- 5， -三リン酸シンセターゼ [EC 6.3.4.2] (以下、 PyrGと略す）をコードする DNA、コリンからホスホリルコリンを生成する活性を有するコリンキナーゼ [EC 2.7.1.32] (以下、 CKIと略す)をコードする DNAおよび CTPとホスホリルコリンカ CDP-コリンを生成する活性を有するコリンリン酸シチジルトランスフェラーゼ [EC 2.7.7.15] (以下、 CCTと略す）をコードする DNA等をあげることができる。

[0017] CDP-コリン生成酵素をコードする DNAとしては、上記の酵素をコードする DNAがあげられ、 PyrG、 CKほたは CCTをコードする DNAが好適に用いられる。

PyrGをコードする DNAは、 Escherichia の染色体よりクローン化され、その全塩基配列が決定されている [J. Biol. Chem. , 261, 5568 (1986) ]。 PyrGをコードする DN Aを有する組換え体 DNAとしては、 Escherichia coliのベクター pUC8「Gene, 19, 25(19 82)]のマルチクローニングサイトの Smal-Pstl部位に Escherichia coli由来の PyrGをコードする DNAを含む 2426ベースペア (以下、 bpと略す)の断片が挿入されたプラスミドである pMW6[Biosci.Biotechnol. Biochem., 61, 956 (1997)]などをあげることがでさる。

[0018] CCTをコードする DNAは、その全塩基配列が決定されて、る [Eur. J. Biochem., 16 9, 477 (1987) ]₀ CCTをコードする DNAを有する組椽ぇ体 DNA しては、 Escherichia ςθϋのベクター pUC18[Gene, 33, 103 (1985) ]のマルチクローユングサイトの Smal部位に酵母由来の CCTをコードする DNAを含む 1296bpの ml断片が挿入されたプラスミド PCC41 [生化学， £Q, 701 (1988)]などをあげることができる。

[0019] CKIをコードする DNAも同様に酵母染色体よりクローンィ匕され、その全塩基配列が決定されている [J. Biol. Chem., 264, 2053 (1989) ]₀ CKIをコードする DNAを有する組換え体 DNAとしては、酵母 Escherichia ςοϋのシャトルベクター YEpM4[Mol. Cell. Biol, 7, 29 (1987) ]に酵母由来のCKIをコードするDNAを含む2692bpの I-Hindm 断片が挿入されたプラスミド pCKlD[J. Biol. Chem., 264, 2053 (1989) ]などをあげることができる。

[0020] 上記のプラスミドは、これらのプラスミドを保持した大腸菌力公知の方法 [Nu Aci ds Res., 7, 1513 (1979)]に従い単離精製できる。

上記のようにして得られるプラスミドから、例えば、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Sambrookら編、し old Spring Harbor Laboratory (2001)に従つて、 CDP-コリン生成酵素をコードする DNAを取得し、該 DNAを発現ベクターに組み込み、組換え体 DNAを作製し、上記微生物を宿主細胞として形質転換を行うことにより、 CDP-コリン生成活性を有する生体触媒を取得することができる。 [0021] 例えば、 PyrG、 CCTまたは CKIをコードする DNAを上記プラスミド pMW6、プラスミド p CC41またはプラスミド pCKIDより取得し、得られた DNAをもとにして、必要に応じて、該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さの DNA断片を調製する。

また、必要に応じて、 CDP-コリン生成酵素をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換した DNAを調製する。該 DNAは CDP -コリン生成酵素の効率的製造に有用である。

[0022] 該 DNA断片、または全長 DNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。この際、 CDP-コリン生成酵素をコードする DNAを、それぞれ別個に発現ベクターに挿入してもよいし、複数の DNAを同じ発現ベクターに挿人してもよい。

該組換えベクターを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入する。

[0023] 宿主細胞としては、上記微生物をあげることができる。

発現ベクターとしては、該宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、 CDP-コリン生成活性に関わる酵素をコードする DNAを転写できる位置にプロモーターを含有して、るものが用いられる。

宿主細胞として、細菌等の原核生物を用いる場合は、 CDP-コリン生成酵素をコードする DNAを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該 DNA、転写終結配列、より構成されたべクタ一であることが好ま、。プロモーターを制御する遺伝子が含まれて!/、てもよ!/、。

[0024] 発現ベクターとしては、例えば、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、 PKK233- 2 [フアルマシア（Pharmacia)社製]、 pSE280 [インビトロジェン（Invitrogen)社製]、 pGEMEX- 1 [プロメガ（Promega)社製]、 pQE- 8 [キアゲン（ QIAGEN)社製]、 pKYP10 (特開昭 58- 110600号）、 pKYP200〔Agric.Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、 pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 277(1989)]、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)] , pBluescriptll SK (―) [ストラタジーン（Stratagene)社製]、 p Trs30 [Escherichia coHJ 109/pTrS30 (FERM BP- 5407)より調製〕、 pTrs32 [Escheric hia coHJM109/pTrS32 (FERM BP- 5408)より調製〕、 pGHA2 [Escherichia coli IGHA2 (FERM BP- 400)より調製、特開昭 60- 221091号〕、 pGKA2 [Escherichi coli IGKA2 ( FERM BP-6798)より調製、特開昭 60-221091号〕、 pTerm2 (米国特許 4686191号、米国特許 4939094号、米国特許 5160735号）、 pSupex、 pUB110、 pTP5、 pC194、 pEG400 [J.BacterioL, 172, 2392 (1990)〕、 pGEX [フアルマシア（Pharmacia)社製]、 pETシステムレバジェン (Novagen)社製]等をあげることができる。

[0025] プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。

例えば、 trpプロモーター（P )

tip、 lacプロモーター、 Pプロモーター、 Pプロモーター、

L R

T7プロモーター等の、 Escherichia coliやファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。また P を 2つ直列させたプロモーター（P X 2)

trp trp 、 tacプロモーター、 lac

T7プロモーター、 letlプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等ち用いることがでさる。

[0026] リボソーム結合配列であるシャインーダルガノ（Shine-Dalgarno)配列と開始コドンとの間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ま、。本発明の組換えベクターにおいては、 CDP-コリン生成酵素をコードする DNAの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好まし、。

[0027] 組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭 63- 248394号）、または Gen e, H, 107 (1982)や Molecular & General Genetics,崖， 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。

[0028] 宿主細胞として酵母を用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEP13 (ATC C37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等をあげることができる。

プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、 PH05 プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 gallプロモ一ター、 gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、 MF a lプロモ一ター、 CUP 1プロモーター等をあげることができる。 [0029] 組換えベクターの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods EnzymoL, 194, 182 ( 1990)〕、スフエロプラスト法〔Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriology, 153,163 (1983)〕、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929(1978) 記載の方法等をあげることができる。

[0030] 微生物が CDP-コリン生成活性の一部しか有して、な、場合、 CDP-コリン生成活性が得られるように、適宜 2種以上の微生物を組み合わせて、 CDP-コリン生成活性を有する生体触媒として用いてもよい。なお、微生物が CDP-コリン生成活性を有している場合でも、 2種以上の微生物を組み合わせることができる。

2種以上の微生物の組合せとしては、上記微生物から選ばれる!/、ずれの組合せでもよぐェシエリヒア (Escherichia)属、セラチア (Serratia)属、バチルス (Bacillus)属、ブレビバクテリゥム (Brevibacterium)属、コリネパクテリゥム (Corvnebacterium)属、ミクロバタテリウム (Microbacterium)鼠、シュ一ドモナス (Pseudomonas)鼠、ストレプトコッカス (Sim Dtococcus)属、シノリゾビゥム（Sinorhizobium)属、へモフィラス（HaemoDhilus)属、ァースロノクタ一 (Arthrobacter)属、オーレオノクテリゥム（Aureobacterium)属、セノレロモナス（Cellulomonas)属、クラビバクタ一（Clavibacter)属、クルトパクテリゥム（Curtobac terium)属、ピメロノくクタ一 (Pimerobacter)属、サッカロマイセス (Saccharomvces)属、シゾサッカロマイセス (Schizosaccharomvces)属、クリュイベロマイセス (Kluweromvces )属、トリコスポロン（TrichosDoron)属、シヮニォマイセス (Schwanniomvces)属、ピヒア (Pichia)属、キャンディダ属等に属する微生物カゝら選ばれる、同一の属に属する微生物、あるいは異なる属に属する微生物の組合せがあげられる。

[0031] 例えば、コリネパクテリゥム属に属する微生物とエシリヒア属に属する微生物の組合せなどをあげることができ、具体的には、 Corvnebacterium ammoniagenes ATCC 21170と Escherichia coli MM294/pCKG55株 (FERM BP- 3717)との組合せ（日本特許第 3369236号、米国特許第 6387667号)等をあげることができる。

CDP-コリン生成活性を有する生体触媒の一つである、 CDP-コリン生成活性を有する微生物の培養物としては、上記の微生物を常法に従って培養して得られる培養物をあげることができる。 [0032] 該微生物が細菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物である場合は、該微生物を培養する培地として、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース、シュクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコ一ル類等を用いることができる。

[0033] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼィン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。

[0034] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。

培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は 15 〜50°Cがよぐ培養時間は、通常 16時間〜 7日間である。培養中の pHは 3〜9に保持することが好ましい。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ性溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。

[0035] 該微生物が形質転換体であって、かつ、該微生物を形質転換するために用いた組換え体 DNAが抗生物質耐性遺伝子を保有してヽる場合は、該微生物を培養する培地に、該組換え体 DNAが保有する抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質を添加してちよい。

生体触媒として 2種以上の微生物の培養物または該培養物の処理物を用いる場合は、それぞれの微生物を上記方法に従って別々にあるいは同一の培地中で培養して得られる培養物等を用いることができる。

[0036] 2種以上の微生物を同一の培地中で培養する場合、これらの微生物を同時に培養しても、一つの微生物の培養中、あるいは培養終了後に残りの微生物を該培地中に培養してちょい。

微生物の培養物の処理物としては、上記の手法で得られる微生物の培養物を界面活性剤、有機溶剤またはリゾチーム等の細胞溶解酵素で処理して得られる処理物があげられる。界面活性剤、有機溶剤または細胞溶解酵素はそれぞれ単独で用いて該培養物を処理してもよいし、これらを組合せて処理してもよい。また、上記の手法で得られる微生物の培養物を濃縮機または乾燥機等で濃縮または乾燥処理して得られる該培養物の濃縮物もしくは乾燥物、該培養物をろ過もしくは遠心分離などで固液分離して得られる細胞、該細胞を乾燥機等で乾燥処理して得られる該細胞の乾燥物、該細胞を界面活性剤、有機溶剤、もしくはリゾチームなどの細胞溶解酵素、またはこれらを組合せて処理して得られる該細胞の処理物等も微生物の培養物の処理物としてあげることができる。

[0037] 該細胞をホモジナイザー等で破砕した後、さらに塩析処理、等電点沈殿処理、有機溶媒沈殿処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理等、通常の酵素の精製手段を施して得られる粗酵素または精製酵素も該培養物の処理物としてあげることができる。

また、上記微生物の培養物の処理物を水不溶性の単体やゲルなどに固定ィ匕し、これを生体触媒として用いてもょヽ。

[0038] 2種以上の微生物の培養物の処理物を用いる場合、該処理物を別々に CDP-コリン生成活性を有する生体触媒として用いてもよぐこれら処理物の混合物を CDP-コリン生成活性を有する生体触媒として用いてもょヽ。

生体触媒の使用量は、該生体触媒の比活性等により異なるが、例えば、酵素源として微生物の培養物または該培養物の処理物の!、ずれかを用いる場合でも、該培養物を遠心分離して得られる湿菌体として、塩ィ匕コリン lmgに対して、 3〜300mg、好ましくは 5〜200mg用いることが好まし!/、。

[0039] コリンまたはホスホリルコリンは、それらの塩として媒体中に添加されてもよい。コリンまたはホスホリルコリンの塩としては、例えば、塩ィ匕コリン、臭化コリン、ヨウ化コリンなどのハロゲン化コリン、重炭酸コリン、硫酸メチルコリン、クェン酸二水素コリン、重酒石酸コリン、塩化ホスホリルコリンなどのホスホリルコリンのハロゲン化物などがあげられるが、コリンまたはホスホリルコリンのハロゲンィ匕物が好ましく用いられ、塩ィ匕コリン、塩ィ匕ホスホリルコリンがさらに好ましく用いられる。

[0040] コリンまたはホスホリルコリンもしくはそれらの塩、およびォロット酸またはゥラシルは、化学合成して得てもよいし、発酵法などにより生物力も得てもよい。また、必ずしも純粋に精製されたものでなくてもよい。また、いずれの基質も市販されており容易に入手可能である。

コリンまたはホスホリルコリンの濃度は、 1 mmol/L〜lmol/Lが好ましく、 10〜100mm ol/Lがさらに好ましい。

[0041] 必要に応じて媒体に添加される他の成分としては、 CDP-コリンの生成に必要なェネルギー供与体、リン酸イオン、マグネシウムイオン、アンモ-ゥムイオン、界面活性剤および有機溶剤などがあげられる。これらの成分は、生体触媒等から必要量が持ち込まれる場合には添加する必要はなヽ。

エネルギー供与体としてはグルコース、フラクトース、シュクロースなどの糖、糖蜜、澱粉加水分解物など、グリシン、ァラニンなどのアミノ酸が用いられる。これらは、 0.02 〜2.0mol/Lの濃度で用いられることが好まし!/、。

[0042] リン酸イオンとしては正リン酸、ピロリン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸などのポリリン酸、ポリメタリン酸、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムなどの無機のリン酸塩などを用いることができる。これらのリン酸イオンは、 1 0〜500mmol/Lの濃度で用いられることが好まし!/、。

マグネシウムイオンとしては硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシゥムなどの無機のマグネシウム塩、クェン酸マグネシウムなどの有機のマグネシウム塩を用いることができる。マグネシウムイオンは 5〜200mmol/Lの濃度で用いられることが好ましい。

[0043] アンモ-ゥムイオンとしてはアンモニア水、アンモニアガス、各種無機あるいは有機のアンモニア塩、酵母エキス、コーンスチープリカーなどを用いることができる。またァンモ -ゥムイオンに代えてグルタミンやグルタミンを含有するペプチドやカザミノ酸などの有機栄養源を用いることもできる。これらのアンモ-ゥムイオンの濃度は lOmmol/ L〜2mol/Lの濃度で用いられることが好まし!/、。

[0044] 界面活性剤としてはジォクチルスルホコハク酸ナトリウム（例えばラビゾール B-80、日本油脂社製)、ラウロイルザルコシネートなどの陰イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレン ·セチルエーテル (例えばノ-オン P-208、日本油脂社製)などの非イオン性界面活性剤、アルキルジメチルァミン (例えば三級アミン FB、日本油脂社製)などの三級アミン類など、 CDP-コリンの生成を促進するものであれば、ずれでも使用できる。これらは通常 0.1〜100g/L、好ましくは l〜50g/Lの範囲で用いられる。

[0045] 有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール (メチルアルコール、ェチルアルコール、ブチルアルコール等）、アセトン、酢酸ェチル、ジメチルスルホキシド等があげられる。これらは通常、 0.1〜100mL/L、好ましくは l〜50mL/Lの濃度で用いられる。

生体触媒、コリンまたはホスホリルコリンもしくはそれらの塩、およびォロット酸またはゥラシルを接触させる媒体としては、生体触媒として使用する微生物を培養するための培地、該微生物の培養物、および培養上清等を用いてもよいし、水性媒体を用いてもよい。

[0046] 水性媒体としては、水、リン酸緩衝液、 HEPES(N- 2-ヒドロキシェチルピペラジン- N- エタンスルホン酸)緩衝液、トリス [トリス (ヒドロキシメチル)ァミノメタン]塩酸緩衝液等の緩衝液をあげることができる。

反応を阻害しなければ媒体に有機溶媒を添加してもよい。有機溶媒としては、ァセトン、酢酸ェチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メチルアルコール、ェチルアルコール、ブタノール等があげられる。

[0047] 媒体中で生体触媒、ォロット酸またはゥラシル、およびコリンまたはホスホコリンを接触させ、該媒体中に CDP-コリンを生成蓄積させる場合、媒体中の pHは通常 5〜10、好ましくは 6〜8に維持し、通常 20〜50°Cで 2〜48時間反応させる。

上記した方法によって、媒体中に CDP-コリンを生成蓄積させることができる。生成蓄積した CDP-コリンは、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析等の通常の単離精製手段により単離精製することができる。

[0048] 上記した CDP-コリンの製造法として、例えば、 Corvnebacterium ammoniagenes AT CC21170と Escherichia coli MM294/pCKG55株 (FERM BP- 3717)を生体触媒として用いて CDP-コリンを生産する方法（日本特許第 3369236号、米国特許第 6387667号）にお、て、ォロット酸またはゥラシルをアルカリ性溶液として添加して CDP-コリンを製造する方法をあげることがでさる。

[0049] また、別の方法としては、 WO99/49073に記載されている UMPとコリンからの CDP-コリンの製造法にぉ、て、ォロット酸またはゥラシルカ UMPを生成する活性を有する生体触媒を加え、ォロット酸またはゥラシルをアルカリ性溶液として添加して CDP-コリンを製造する方法をあげることができる。

以下に本発明の実施例を示す力本発明はこれにより限定されるものではない。実施例 1

[0050] ォロット酸またはゥラシルをアルカリ性溶液として添加する CDP-コリンの生産

Escherichia coli MM294株に酵母由来の CCTおよび CKI遣伝子 Escherichia coli 由来の PvrG遣伝子を組み込んだプラスミド DCKG55を導入した Escherichia coli MM2 94/pCKG55株（日本特許第 3369236号、 FERM BP- 3717)をアンピシリン 50mg/Lを含む L培地 [パクトトリプトン (ディフコ社製） 10g/L、酵母エキス (ディフコ社製) 5g/L、 N aCl 5g/Lを含み pHを 7.2に調整した培地] 200mLの入った 2Lバッフル付き三角フラスコに接種し、 25°Cにて 24時間 220rpmにて回転振とう培養した。この培養液 20mLを、グルコース 5g/L (別殺菌）、ペプトン (極東製薬工業社製) 5g/L、 Na PO 6g/L、 KH P

2 4 2

O 3g /し、 NH CI lg /し、 MgSO - 7H O 250mg/L (別殺菌）およびビタミン Bl 4mg/L (

4 4 4 2

別殺菌）の組成カゝらなる 2.5Lの液体培地 (pH無調整）が入った 5L容培養槽に接種し、培養温度 28°C、攪拌 600rpm、通気量 2.5L/分の培養条件下、 14%アンモニア水を用いて PH7.0に調整しつつ培養を行った。

[0051] 上記種培養液の上清中のグルコースが消費された時点で、 250mLの培養物を無菌的に採取し、グルコース 5g/L (別殺菌）、ペプトン (極東製薬工業社製) 5g/L、 Na PO

2

6g /し、 KH PO 3g /し、 NH CI lg /し、 MgSO - 7H O 250mg/L (別殺菌）およびビタミン

4 2 4 4 4 2

Bl 4mg/L (別殺菌）の組成カゝらなる 2.5Lの液体培地 (pH無調整）が入った 5L容培養槽に接種し、培養温度 28°C、攪拌 600rpm、通気量 2.5L/分の培養条件下、 14%アンモ-ァ水を用いて PH7.0に調整しつつ培養を行った。 [0052] 培養中、培養 11時間目から 24時間目までの間、グルコース 167g/L、ペプトン 167g /Lの組成力もなるフィード液をペリスタポンプにより 30mL/時間の速度にて添カ卩した。一方、し orvneDacterium ammoniagenes ATCC21170株を、グノレコ ~~ス 50g/L、ホリペプトン (大五栄養化学社製) 10g/L、イーストエキス (大五栄養化学社製) 10g/L、尿素 5g/L、 (NH ) SO 5g/ L、 KH PO lg/ L、 K HPO 3g/L、 MgSO - 7H O lg/Lゝ CaC

4 2 4 2 4 2 4 4 2

1 -2H O 0.1g/L、 FeSO - 7H O 10mg/L、 ZnSO - 7H O 10mg/L、 MnSO ·4〜6Η O 2

2 2 4 2 4 2 4 2

0mg/L、 L-システィン 20mg/L、 D-パントテン酸カルシウム 10mg/L、ビタミン Bl 5mg/ L、ニコチン酸 5mg/L、およびピオチン 30 g/L (10規定水酸ィ匕ナトリウム溶液を用いて PH7.2に調整）の組成からなる液体培地 200mLの入った 2Lバッフル付き三角フラスコに接種し、 28°C、 24時間、 220rpmで回転振とう培養した。この培養物 20mLを、ダルコース 100g/L、ポリペプトン 10g/L、 KH PO lg/L, K HPO lg/L, MgSO - 7H O lg

2 4 2 4 4 2

/し、 CaCl -2H O 0. lg/Lゝ FeSO - 7H O 20mg/L、 ZnSO - 7H O lOmg/Lゝ MnSO ·4〜

2 2 4 2 4 2 4

6H O 20mg/L、 β ァラニン 15mg/L、 L-システィン 20mg/L、ビォチン 0.1mg/L、尿

2

素 2g/L (別殺菌）およびビタミン Bl 5mg/L (別殺菌）（10規定水酸ィ匕ナトリウム溶液を用いて PH7.2に調整）の組成からなる 2.5Lの液体培地が入った 5L容培養槽に接種し、 32°C、攪拌 600rpm、通気量 2.5L/分の培養条件下、濃アンモニア水で pHを 6.8に調整しつつ種培養を行った。

[0053] 上記種培養物の上清中のグルコースが消費された時点で、 350mLの培養液を無菌的に採取し、グルコース 180g/L、 KH PO 10g/L、 K HPO 10g/L、 MgSO - 7H O lOg

2 4 2 4 4 2

2 2 4 2 4 2 4

6H O 20mg/L、 β ァラニン 15mg/L、グルタミン酸ナトリウム lg/L、 L-システィン 20

2

mg/L、ピオチン 0.1mg/L、尿素 2g/L (別殺菌）およびビタミン Bl 5mg/L (別殺菌）（1 0規定水酸ィ匕ナトリウム溶液を用いて pH7.2に調整）の組成力もなる 2.5Lの液体培地が入った 5L容培養槽に接種し、 32°C、攪拌 600rpm、通気量 2.5L/分の培養条件下、濃アンモニア水で pHを 6.8に調整しつつ本培養を行った。培養液上清中のダルコ一スが消費された時点で培養を終了した。

[0054] このようにして得られた Escherichia coli MM294/pCKG55株の培養液 500mLと £^11 nebacterium ammonia¾enes ATCC21170株の培養液 185mLをそれぞれ 3本の 2L容培養槽に分注し、それぞれに 60%(w/v)グルコース溶液を 80mL、 25%(w/v)MgSO · 7Η

4 2

Οを 25mL、 25%(w/v)KH PO 160mL、さらに塩化コリンとキシレンをそれぞれ 8.4g/L(6

2 4を

0mM)、 20ml/Lになるように添カ卩した。さらに 1本（ポット 1)には粉末ォロット酸 35mmol /Lを添カ卩した。この混合液を、 32°Cにて攪拌 800rpm、通気量 0.2L/分の条件下、 10 規定の水酸ィ匕ナトリウム溶液にて pHを 7.2に保ちつつ反応を行った。別の 1本 (ポット 2 )は、 800mmol/Lのォロット酸を含む 6規定の水酸化カリウム溶液にて pHを 7.2に保ち、培養槽内にポット 1と同量のォロット酸 (35mmol/L)が添加された時点より、 pH調整剤を 10規定の水酸ィ匕ナトリウム溶液に切り替え pHを 7.2に保ち、 32°Cにて攪拌 800rpm 、通気量 0.2L/分の条件下反応を行った。残りの一本（ポット 3)は、 800mmol/Lのゥラシルを含む 6規定の水酸ィ匕カリウム溶液にて pHを 7.2に保ち、培養槽内にポット 1と同量のゥラシル (35mmol/L)が添加された時点より、 pH調整剤を 10規定の水酸ィ匕ナトリゥム溶液に切り替え pHを 7.2に保ち、 32°Cにて攪拌 800rpm、通気量 0.2L/分の条件下反応を行った。これらの混合液を、 32°Cにて攪拌 800rpm、通気量 0.2L/分の条件下 22時間反応を行った。反応終了後、反応液を遠心分離し、上清を水で 100倍希釈後、高速液体クロマトグラフィー分析にて UV検出器により 256應の吸光度を測定することにより、 CDP-コリンの生成量を定量した。結果を表 1に示す。

[表 1]

以上のとおり、 CDP-コリンの製造法において、ォロット酸またはゥラシルを、ォロット酸またはゥラシルを含有するアルカリ性溶液として添加することにより、 CDP-コリンの生成量が増加し、 CDP-コリンを効率よく製造できた。

産業上の利用可能性 [0057] 本発明により、 CDP-コリンを工業的に有利に製造する方法が提供される。

Claims

請求の範囲

[1] ォロット酸またはゥラシルと、コリンまたはホスホリルコリンとからシチジンジリン酸コリン

(以下、 CDP-コリンと略す)を生成する活性を有する生体触媒を、媒体中でォロット酸またはゥラシル、およびコリンまたはホスホリルコリンに接触させ、媒体中に CDP-コリンを生成蓄積させ、該媒体力 CDP-コリンを採取する CDP-コリンの製造法において、ォロット酸またはゥラシルを、ォロット酸またはゥラシルを含有するアルカリ性溶液として該媒体に添加することを特徴とする CDP-コリンの製造法。

[2] 媒体の pHを CDP-コリンの製造に適した pHに維持するようにォロット酸またはゥラシルを含有するアルカリ性溶液を添加することを特徴とする、請求項 1記載の CDP-コリンの製造法。

[3] 生体触媒が微生物の培養物または該培養物の処理物を含有する生体触媒である、請求項 1または 2記載の CDP-コリンの製造法。

[4] 微生物がェシエリヒア (Escherichia)属、コリネバタテリゥム (Corvnebacterium)属、ノチルス (Bacillus)属、ストレプトコッカス (Streptococcus)属、シノリゾビゥム (Sinorhizobi urn)属、へモフィラス (Haemophilus)属およびサッカロミセス (Saccharomvces)属に属する微生物力もなる群より選ばれる微生物である、請求項 3記載の CDP-コリンの製造法。

[5] 微生物がコリネバタテリゥム (Corvnebacterium)属およびェシエリヒア (Escherichia)属に属する微生物力も選ばれる微生物である、請求項 3記載の CDP-コリンの製造法。

[6] 微生物がコリネバクテリウム*アンモニアゲネス（Corvnebacterium ammoniagenes)およびェシエリヒア'コリ (Escherichia coH)に属する微生物力選ばれる微生物である、請求項 3記載の CDP-コリンの製造法。

[7] 微生物がコリネバタテリゥム 'アンモニアゲネス ATCC21170株およびェシエリヒア'コリ

MM294/pCKG55(FERM BP- 3717)株である、請求項 3記載の CDP-コリンの製造法。