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WO2007023226A2 - Utilisation d'un symbiotique pour le traitement de la dermatite atopique - Google Patents

Utilisation d'un symbiotique pour le traitement de la dermatite atopique Download PDF

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WO2007023226A2
WO2007023226A2 PCT/FR2006/001979 FR2006001979W WO2007023226A2 WO 2007023226 A2 WO2007023226 A2 WO 2007023226A2 FR 2006001979 W FR2006001979 W FR 2006001979W WO 2007023226 A2 WO2007023226 A2 WO 2007023226A2
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WO
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lactose
treatment
bacterium
atopic dermatitis
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English (en)
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Gérard Lacoste
Hubert Desjonqueres
Stéphane PATRIER
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LABORATOIRES LYOCENTRE
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LABORATOIRES LYOCENTRE
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    • A61K2800/92—Oral administration

Definitions

  • Probiotics are living microorganisms that produce a benefit to the health of their host. This beneficial effect is explained in particular by the improvement of the balance of the intestinal flora (1).
  • the best known are the lactobacilli and bifidobacteria that allow, by multiplying in the intestine, to reduce by simple competition the potentially pathogenic bacterial population.
  • Prebiotics are substances that can not be digested by the body and / or have beneficial effects on the person who consumes them by stimulating the growth or activity of certain non-pathogenic bacteria naturally present in the colon. .
  • the limited lifespan and low survival rate of probiotics remain major barriers to their use in therapy.
  • Atopic dermatitis is a dermatosis whose prevalence in children in western countries is between 10 and 25% (2, 3). Its evolution is chronic with frequent improvement in adolescence. Moderate and severe forms, due to the chronicity of pruriginous lesions, unsightly and requiring daily local care, have a significant psychological impact.
  • the basic treatment is based on the regular application of emollients, combined with dietary and lifestyle rules. Flares require the application of corticosteroids or immunosuppressants in topical form. However, relapses are common, chronicity can degrade the quality of life for both the patient and the family, and prolonged use of treatment induces side effects.
  • the pathogenesis of atopic dermatitis is based on a dysregulation of cell-mediated immunity with an imbalance in the Th1 / Th2 ratio, in favor of a Th2-type response.
  • the steady rise in the prevalence of atopic dermatitis in westernized countries would be correlated with the improvement of hygiene conditions.
  • the Children would thus be less exposed to infectious agents during their first months or years of life and thus develop a preferential Th2 response (4-7).
  • Probiotics are living microorganisms, commensals of the digestive tract, that may have antiallergic properties by promoting a Th1 type response (8, 9). Not all probiotics, however, have the same immunological properties.
  • Lactobacillus rhamnosus significantly showed that it induces the production of cytokines favoring the Th1 response [ie IL-12 interleukins, IL-6, tumor necrosis "TNF tumor necrosis factor ⁇ "] without increasing the production of IL-10 (known for its active role in the Th2 response) (10).
  • This strain is therefore of great interest in the treatment of atopic dermatitis.
  • L. rhamnosus GG has been shown to be effective in the prevention of atopic dermatitis (11 and 12) and, to a lesser extent, in the treatment of young children (13-15).
  • the present invention demonstrates the efficacy of symbiotic (probiotic L rhamnosus and prebiotics), in the prevention and treatment of atopic dermatitis, particularly in children over two years of age.
  • the present invention particularly relates to the use of the Lactobacillus rhamnosus Lcr35 (probiotic) strain associated with lactose (especially in combination with a lactose-based medium), in the treatment of atopic dermatitis.
  • Treatment of atopic dermatitis includes curative treatment and / or preventive.
  • the invention also highlights the importance of lactose in the treatment of atopic dermatitis.
  • the strain Lactobacillus rhamnosus Lcr35 is a strain derived from the species Lactobacillus rhamnosus (also called Lactobacillus casei subsp. Rhamnosus), the latter being deposited with the ATCC under the number ATCC 7469.
  • the particular strain Lactobacillus rhamnosus Lcr35 can be obtained according to protocol defined in Example 1.
  • the present invention relates to the use of a product comprising a bacterium Lactobacillus rhamnosus in combination with lactose in the treatment of atopic dermatitis.
  • the bacterium Lactobacillus rhamnosus is in a lactose-based medium.
  • the use is preferably for the manufacture of a medicament, dietary supplement, etc., for treating a patient with atopic dermatitis or for the prevention of such a condition.
  • the treatment or prevention within the meaning of the present invention, comprises the reduction of the allergic risk and the improvement of the state of health of the patient.
  • the product according to the invention is therefore a combination of a probiotic (bacterium Lactobacillus rhamnosus) and a prebiotic (lactose, and more specifically lactose-based medium).
  • a probiotic bacterium Lactobacillus rhamnosus
  • lactose lactose, and more specifically lactose-based medium
  • Such a product can therefore be called symbiotic.
  • Lactose is indeed known for its prebiotic activity; it arrives in the intestine in unprocessed form, it is a food for some bacterial populations of the intestinal flora, which justifies its name of prebiotic.
  • the bacterium considered, entering into the composition of the product is capable of fermenting lactose.
  • the inventors have found that the survival rate of the probiotic was greatly increased when said probiotic was associated with an element necessary for its growth.
  • the probiotic capable of fermenting lactose and, in particular, lactose, necessary for the survival of the probiotic.
  • said bacterium is the Lactobacillus rhamnosus Lcr35 bacterium.
  • the strain L rhamnosus Lcr35 has the capacity to ferment lactose while the strain L. rhamnosus GG for example can not do.
  • a symbiotic as defined in the present invention may of course contain at least two or more different probiotics. It can be a bacterium Lactobacillus rhamnosus with a bacterium of another kind, or it may be at least one or more bacteria of the genus Lactohacillus, of different species.
  • the symbiotic product as described preferably comprises the living bacterium.
  • the present invention therefore notably comprises the use of Lactobacillus rhamnosus Lcr35 in freeze-dried form or in frozen form.
  • a product according to the invention is considered a symbiotic.
  • the bacterium is a probiotic
  • the lactose-based medium is a prebiotic.
  • drug or food preparation or food supplement, etc. is meant any form acceptable pharmacologically, especially in the form of infant formula, product intended for young children, dietary food and diet, dietetic food for oral supplementation, hygiene product, foodstuff or dietetic product for particular medical (or special) purposes, or medical device, or any other adapted form well known to those skilled in the art.
  • the product is preferably in a dosage form suitable for oral administration, for example in the form of an oral suspension or capsule. It can also be in the form of powder or granule to add to food or drink, or to suck.
  • Atopic dermatitis means all conditions diagnosed as atopic dermatitis or atopic eczema, as well as atopic conditions whose symptoms are essentially identical and which also receive identical treatments.
  • the treated patient receiving the product as described is preferably a human, preferably a child.
  • Child means any person under the age of 18, preferably under 15 or under 12 years of age.
  • the patient is preferably a child over 1 year old, especially a child at least 2 years old.
  • the patient considered may be a mammal other than man, for example a monkey, a dog, a cat or a rabbit.
  • a preferred class of patients for use according to the present invention are children between 2 and 12 years of age.
  • Another population of patients likely to receive a product according to the present invention consists of subjects who are allergic to lactose, in particular allergies to cow's milk.
  • the allergies considered are preferably mild or moderate lactose allergies.
  • Treatment of atopic dermatitis includes any action to suppress or reduce the symptoms of atopic dermatitis, as well as any preventive action to prevent, delay or slow down their onset.
  • the duration of treatment is to be defined according to the evolution of atopic dermatitis, it is preferably greater than 2 weeks. It can be 3 months or more, including at least 6 months or a year. It may be appropriate to continue treatment over several years, for example over 2, 5 or 8 years, especially in the case of a preventive application.
  • the product according to the invention is administered at least once a week, preferably at least once a day.
  • a preferred dosage is three times a day.
  • the product according to the invention can be in any suitable form. Suitable forms are well known to those skilled in the art. In particular, they must ensure the survival of the probiotic. Indeed, if the probiotic is not alive at the time of ingestion, the beneficial effects of the symbiotic are absent. It is very important to consider three essential factors that are the atmosphere, the humidity and the temperature. The various means of preserving probiotics are well known to those skilled in the art.
  • the product is in lyophilized form.
  • this form not only ensures excellent preservation, but it also preserves any living bacteria forming part of the product according to the invention. It is important to determine the enumeration of the probiotic when obtaining a freeze-dried product according to the invention.
  • the bacterium contained in the product may be the only freeze-dried element, but preferably, the bacterium is lyophilized with the product containing the medium based in particular on lactose.
  • the product may of course comprise additional constituents, in addition to the bacterium and the lactose base-based medium. Such constituents are either added before lyophilization of the other components, or after (for example, excipients for the galenic shaping of the product).
  • the lactose-based medium is a medium containing at least 5% by weight of lactose, preferably at least 20%.
  • Said medium is preferably sterile, before inoculation with the probiotic.
  • a medium is a culture medium (fermentation) thus containing other substances.
  • the medium is preferably a medium consisting essentially of milk, for example skimmed milk.
  • the lactose-based medium advantageously also contains potato starch. It may also contain maltose dextrin. Any other pharmacologically acceptable compound or excipient may also be included in the composition of a lactose-based medium as defined.
  • the lactose-based medium corresponds to a culture medium compatible with the fermentation of lactose by the probiotic bacterium included in the product according to the invention.
  • the bacterium is cultured on a culture medium, which is optionally subsequently supplemented to form a product according to the invention, that is to say a symbiotic (combination a probiotic and a prebiotic).
  • a symbiotic combination a probiotic and a prebiotic
  • the lactose-based medium is derived from the culture medium of the probiotic.
  • the probiotic used is not seeded or cultured on SRM.
  • the prebiotic corresponds to a culture medium suitable for the probiotic (bacterium)
  • the bacterium when the product according to the invention is ingested (and especially when it is in freeze-dried form and is resuspended before ingestion ), the bacterium is immediately in an environment compatible with its survival. An increased survival rate of probiotics would thus be obtained.
  • the bacterium has been cultured for at least 4 hours, at least 12 hours, preferably between 24 and 48 hours, or more, for example about 72 hours, on a culture medium based on lactose, which is then optionally supplemented. to form the product according to the invention.
  • the invention is indeed based on the effects obtained by the symbiotic, that is to say by the combination of a probiotic (the bacterium of the Lactobacillus rhamnosus species) and a prebiotic (lactose, preferably under form of lactose-based medium).
  • a probiotic the bacterium of the Lactobacillus rhamnosus species
  • lactose lactose, preferably under form of lactose-based medium.
  • lactose lactose, preferably under form of lactose-based medium.
  • the number of bacteria or seeds per gram of product is preferably between 1x10 8 and 1x10 10 .
  • the product Before any freeze-drying of the symbiotic product according to the invention, it is generally in liquid form.
  • the product for use in the treatment of atopic dermatitis, the product preferably comprises a concentration in the medium equal to or greater than 1x10 8 CFU (colony forming units or germs) per ml.
  • the patient is administered approximately between 1x10 8 and 1x10 10 CFU of Lactobacillus rhamnosus per dose.
  • Several doses can be administered daily, for example in the form of 3 daily doses.
  • the doses can be adjusted, in particular according to the diverence of the patient to be treated and its possible reaction to treatment.
  • a particularly preferred bacterium of the species Lactobacillus rhamnosus equivalent to Lactobacillus casei subsp. rhamnosus) capable of fermenting lactose is the Lcr35 strain which can be obtained according to the protocol defined in Example 1. Other protocols are well known to those skilled in the art.
  • a probiotic In choosing a probiotic to obtain a product according to the invention, it is essential to look for a bacterium which has no pathogenic effect and which is preferably known to have good properties with respect to its survival rate. Another parameter to take into account is its resistance to technological processes. It may also be advantageous for the probiotic in question to have resistance to most conventional antibiotics. Conversely, there are situations where the probiotic is preferably sensitive to the majority of known antibiotics. In addition, a strain for use according to the present invention must also have the ability to colonize the intestinal flora. 1
  • the specific strain Lactobacillus rhamnosus Lcr35 is particularly preferred in the context of the present invention because it has the various advantages mentioned above. It is also resistant to streptomycin, tetracycline, erythromycin, nalidixic acid, pipemidic acid, fusidic acid, colistin, polymyxin, sulfamethoxazole and trimethoprim. .
  • the fermentative characters of this strain are particularly advantageous.
  • the invention also relates to the use of lactose alone or in combination with a probiotic, in the treatment or prevention of atopic dermatitis.
  • Figure 1 Genotyping of the strain Lactobacillus rhamnosus Lcr35.
  • Figure 1A Intergenic sequence 16S-23S rDNA;
  • Figure 1B 16S ribosomal DNA.
  • Figure 2 representation of the sequenced regions of Lactobacillus rhamnosus Lcr35.
  • Figures 3A and 3B Comparison of the metabolic profiles of the Lactobacillus rhamnosus Lcr35 and Lactobacillus GG.
  • Example 1 Obtaining the strain ; Lactobacillus rhamnosus Lcr35 lyophilized and conditioning. Reactivation:
  • the commercially available microorganisms (Bacilor® from the Lyocentre laboratory) or from the Lyocentre laboratories' souchore, are put back into activity by sowing with 100 to 200 mg of the freeze-dried product 10mL of skimmed enriched milk medium (glucose 15g / L, extract yeast 5g / L). This tube is placed in an oven at 37 ° C for 72 hours.
  • 1 ml of the culture of this first tube is introduced into a second tube containing 10 ml of sterile enriched milk medium, this tube is placed in an oven at 37 ° C. for 72 hours. This operation is repeated several times so as to obtain the largest population possible, greater than 1x10 9 germs per mL.
  • Lactobacillus casei var. rhamnosus also called Lactobacillus rhamnosus
  • this one is elaborated simultaneously according to 2 different methods of culture: - on simplified medium - on enriched medium 6 001979
  • Simplified medium skimmed milk powder 100g
  • Seeding and cultivation a) Simplified medium Introduce 1 to 2 ml of preculture from the stock base into a vertical laminar airflow hood.
  • the quantities obtained of lyophilized dry product are approximately the following:
  • the lyophilized culture of Lactobacillus casei var. rhamnosus is recovered, crushed and sieved on oscillating type calibrator equipped with a mesh of 60 MESH, a sample is taken for enumeration of lactobacilli.
  • the product is stored in hermetically sealed containers. After titration of Lactobacillus case / var. rhamnosus live, the products are homogenized to obtain a raw material of desired title.
  • EXAMPLE 2 Study of the Effect on Atopic Dermatitis of an LCR35-Based Product
  • the objectives of this study are, on the one hand, the study of the efficacy of Lactobacillus casei variety rhamnosus in combination with a prebiotic in the treatment of moderate to severe atopic dermatitis of the child, on the other hand, the evaluation of adverse effects and the clinical tolerance of this treatment.
  • Atopic dermatitis is a frequent dermatosis (estimated prevalence between 10 and 25% in Western countries) (2, 3). Its evolution is chronic with frequent improvement in adolescence. Moderate and severe forms, due to the chronicity of pruriginous, unsightly lesions requiring daily local care, have a significant psychological impact, can alter the parent / child relationship and affect the quality of life of the child and his family. 1o
  • the basic treatment is based on the regular application of emollients, combined with dietary and hygiene rules. Flares require the application of corticosteroids or immunosuppressants in topical form.
  • the pathogenesis of atopic derr'atitis is based on dysregulation of cell-mediated immunity with Th1 / Th2 ratio disequilibrium in favor of a Th2-type response. There is currently no commercialized treatment to correct this immune dysregulation.
  • Probiotics are commensal microbes of the digestive tract with potentially anti-allergic properties favoring a Th1 response
  • Probiotics have already been shown to be effective in the primary prevention of atopic disease (11) and in a short series in the treatment of atopic dermatitis in infants (13). These studies occur at a very early age and the effectiveness of this treatment is possibly due to the initial colonization of the intestinal microflora.
  • the children were distributed by lot in 2 groups.
  • the first received symbiotic (containing Lactobacillus casei variety rhamnosus in the form of Bacilor®); the second received only the prebiotic (without Lactobacillus casei variety rhamnosus).
  • Randomization was performed before the start of the study, depending on the severity of atopic dermatitis (SCORAD ⁇ OR> 40) and by season (winter, spring, summer, fall).
  • the sachets containing the probiotics (+ prebiotics + metabolites) can not be differentiated either by the patient or by the doctor, bags containing only the prebiotic.
  • the symbiotic comprising Lactobacillus casei variety rhamnosus is administered orally in sachets of Bacilor® (produced by laboratories
  • Lyocentre, Aurillac, France at 1, 5g. Each dose of 1.5g is stored in aluminum bags, airtight. The doses of symbiotic contain about
  • the prebiotic preparation is derived from the fermentation medium of L rhamnosus
  • Lcr35 contains skimmed milk powder (on average 0.344g-33% protein bovine, 52% lactose), potato starch (on average 0.759g) and lactose (on average 0.397g).
  • the preparation doses of symbiotics and prebiotics were given as a powder for oral suspension, three times a day, for 3 months. Patients were asked to dissolve the preparation in water or any other cold liquid of their convenience. None of the patients changed their diet during the study period.
  • the SCORAD score combines the clinical assessment of the intensity and extent of symptoms with a subjective score for pruritus and insomnia indicated by the patient, his or her parents, or both, on a visual scale.
  • the objective SCROAD is between 0 and 83.
  • the score can be 0 to be between 0 and 103.
  • IGA Investigator's Global Assessment
  • topical corticosteroids or immunosuppressants during the previous month were also noted as well as possible side effects.
  • patients 'and / or parents' opinions on the effectiveness of treatment were noted.
  • the parents were contacted 6-12 months after the end of the study to determine if they observed a relapse of the disease after stopping treatment.
  • the baseline rate (which is the baseline rate of the study before any intervention) for age, number of relapses per month, use of topical treatments, SCORAD (total), and objective SCORAD were compared for both groups using the t-test (or the Kruskal-Wallis test for non-parametric data).
  • Prebiotic group Mean (95% CI) 29 (25.3-33.6) 25 (18.5-31.1) 21 (16.0-25.2) 20 (14.2-25.7) Median (EIQ) 29 (21.6-37.7) 19 (14.5-38.0) 19 ( 13.5-27.4) 17 (10.1-30.2)
  • SCORAD SCORing Atopic Dermatitis
  • EIQ interquartile gap
  • IC confidence interval
  • SCORAD SCORing Atopic Dermatitis
  • EIQ interquartile gap
  • IC confidence interval
  • Each probiotic bacterial strain has specific properties and an ability to proliferate and survive in the digestive tract.
  • the L rhamnosus LCR35 strain used in the present study has many interesting properties. It has 96% homology with L rhamnosus GG by comparison of 16S-23S sequences. This signature sequence for the L rhamnosus LCR35 strain is given in FIG. 1.
  • the L. rhamnosus Lcr35 strain has the capacity to ferment lactose whereas the L. rhamnosus GG strain can not.
  • previous studies have demonstrated the ability of L. rhamnosus Lcr35 to perform long-term colonization of the intestinal mucosa after oral administration (20).
  • the evaluation of the efficacy of symbiotics in the treatment of atopic dermatitis is interesting because the combination with adequate prebiotics can improve the survival rate of probiotic strains following ingestion (21).
  • the symbiotic treatment is composed of the culture medium containing the prebiotics, the probiotic but in addition to the metabolites secreted by this probiotic. These metabolites can be defined as eubiotics.
  • the combination (probiotic, prebiotic, eubiotic) is present in the Bacilor® product marketed by the Lyocentre laboratories. Its efficacy in adjunctive symptomatic treatment of diarrhea is recognized and the product is marketed for this therapeutic indication. The duration of the study was set at 3 months to allow sufficient time to evaluate the effects of treatment while limiting the probability of interference with a spontaneous change in intensity of the disease.
  • prebiotics in themselves can have a significant impact on the intestinal flora and can also induce immunological changes.
  • preliminary data suggest that prebiotic consumption may influence parameters related to cell-mediated immunity and thus modify the Th1 / Th2 ratio (25, 26).
  • specific prebiotics can act on the intestinal flora to induce an immunomodulation that may be beneficial in reducing the manifestations of atopic dermatitis.
  • present results demonstrate the importance of prebiotics (especially in combination with probiotics to form symbiotics), however, other potential factors, other than treatments, have been sought to explain the improvement in the patient's condition.
  • Lactobacillus GG a mixture of four strains of probiotics, and a placebo were given to patients with AD suspected of being allergic to cow's milk, for 4 weeks (14). No difference was shown between the treatment groups, either immediately or after 4 weeks of treatment, but in a subgroup [immunoglobulin E (IgE) sensitive children], the Lactobacillus group showed a statistically superior reduction in .SCORAD compared to the placebo group.
  • L. fermentum and placebo were administered for 8 weeks (15). The reduction in SCORAD during the period was significant in the probiotic group but not in the placebo group.
  • Example 3 Lactobacillus rhamnosus Lcr35 signature sequence The identification was carried out by PCR then sequencing of the 16S ribosomal RNA gene and the 16-23S intergenic part. Sequencing is double-stranded sequencing (LI-COR method), followed by alignment with sequences of other strains. The results and strategy are shown in Figures 1 and 2.
  • the strain analyzed belongs to the subspecies Lactobacillus casei subsp rhamnosus. Sequencing almost the entire 16S ribosomal gene does not differentiate Lactobacillus casei subsp casei from Lactobacillus casei subsp rhamnosus also called Lactobacillus rhamnosus.
  • Lactobacillus casei subsp rhamnosus is located in the 16-23S intergenic part.
  • EXAMPLE 4 Comparison between the API profile of Lactobacillus rhamnosus Lcr35 and that of Lactobacillus GG
  • FIGS. 3A and 3B show the API 50 CH metabolic profile of the Lactobacillus rhamnosus LCR35 and Lactobacillus GG strains, for times of 24 and 48 hours.
  • the profile API 50 CH is a gallery "Research” to study the metabolism of 49 sugars and adapted to:
  • API (R) identification is well known to those skilled in the art.
  • Lactobacillus rhamnosus LCR35 and Lactobacillus GG do not have exactly the same profile, especially for lactose.
  • a difference in in vitro behavior with respect to sugar metabolism implies a difference in behavior in vivo.
  • roller M Rechkemmer G
  • Watzl B Prebiotic inulin enriched with oligofructose in combination with the probiotics Lactobacillus rhamnosus and Bifidobacterium lactis modulata intestinal immune functions in rats. J Nutr 2004; 134: 153-156.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'un produit comprenant une bactérie Lactobacillus rhamnosus, sous forme vivante, en association avec du lactose, en particulier en association avec un milieu à base de lactose, pour la fabrication d'un médicament ou d'un complément alimentaire pour traiter un patient atteint de dermatite atopique, où ladite bactérie est capable de fermenter le lactose. Selon des modes de réalisation préférés, la bactérie utilisée provient de la souche Lactobacillus rhamnosus Lcr35, elle est utilisée comme probiotique, en association avec un prébiotique à base notamment de lactose, et d'éventuels métabolites résultant de la fermentation de la bactérie sur son milieu de culture, pour traiter la dermatite atopique chez des enfants.

Description

Utilisation d'un symbiotique pour le traitement de la dermatite atopique
Les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui produisent un bénéfice pour la santé de leur hôte. Cet effet bénéfique s'explique notamment par l'amélioration de l'équilibre de la flore intestinale (1). Les plus connus sont les lactobacilles et les bifidobactéries qui permettent, en se multipliant dans l'intestin, de réduire par simple compétition la population bactérienne potentiellement pathogène. Les prébiotiques sont quant à eux des substances qui ne peuvent être digérées par l'organisme et/ou qui ont des effets bénéfiques sur la personne qui les consomme en stimulant la croissance ou l'activité de certaines bactéries non pathogènes et naturellement présentes dans le côlon.; La durée de vie limitée et le faible taux de survie des probiotiques demeurent toutefois des obstacles majeurs à leur utilisation en thérapie. Il y a donc un besoin pour des prébiotiques appropriés, ainsi que des combinaisons optimisées de prébiotiques et de probiotiques (symbiotiques) permettant d'obtenir une amélioration significative de l'efficacité des probiotiques. Une telle combinaison présenterait bien entendu des avantages certains pour le traitement d'affections atopiques, et tout particulièrement de la dermatite atopique (DA).
A ce jour, il n'existe aucune donnée sur l'utilisation de prébiotiques ou de symbiotiques dans le traitement de la dermatite atopique.
La dermatite atopique est une dermatose dont la prévalence chez les enfants des pays occidentaux est située entre 10 et 25% (2, 3). Son évolution est chronique avec amélioration fréquente à l'adolescence. Les formes modérées et sévères, de par la chronicité des lésions prurigineuses, inesthétiques et nécessitant des soins locaux quotidiens, ont un retentissement psychologique important. Le traitement de fond repose sur l'application régulière d'émollients, associée à des règles hygiéno- diététiques. Les poussées nécessitent l'application de corticoïdes ou d'immunosuppresseurs sous forme topique. Cependant les rechutes sont courantes, la chronicité peut détériorer la qualité de vie tant du patient que de sa famille, et l'usage prolongé de traitement induit des effets secondaires.
La pathogénie de la dermatite atopique repose sur une dysrégulation de l'immunité à médiation cellulaire avec déséquilibre dans le rapport Th1/Th2, au profit d'une réponse de type Th2. L'augmentation constante de la prévalence de la dermatite atopique dans les pays occidentalisés serait corrélée à l'amélioration des conditions d'hygiène. Les enfants seraient ainsi moins exposés aux agents infectieux pendant leurs premiers mois ou années de vie et développeraient ainsi une réponse Th2 préférentielle (4-7). Il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement commercialisé permettant de corriger cette dysrégulation immunitaire. Les probiotiques sont des micro-organismes vivants, commensaux du tube digestif, qui peuvent avoir des propriétés antiallergiques en favorisant une réponse de type Th 1 (8, 9). Tous les probiotiques n'ont cependant pas les mêmes propriétés immunologiques. Dans un récent article réalisé avec des cellules dendritiques de souris, la bactérie Lactobacillus rhamnosus a montré de manière significative qu'elle induisait la production de cytokines favorisant la réponse Th1 [à savoir les interleukines IL-12, IL- 6, le facteur α de nécrose des tumeurs « TNF tumour necrosis factor α »] sans augmenter la production d'IL-10 (connue pour son rôle actif dans la réponse Th2) (10). Cette souche présente donc un grand intérêt dans le traitement de la dermatite atopique. II a été montré par ailleurs que L. rhamnosus GG était efficace dans la prévention de la dermatite atopique (11 et 12) et, à un degré moindre, dans le traitement des jeunes enfants (13-15). Ces études ont été réalisées avec de très jeunes enfants et l'efficacité du traitement pourrait être dû à une colonisation initiale de la microflore intestinale. Cependant, les effets immuno-modulateurs des probiotiques sont aussi observés chez les enfants et les adultes, et pourraient donc être efficaces sur ces groupes d'âge (16). A ce jour, une unique étude a évalué l'utilisation de probiotiques pendant 6 semaines seulement, chez des enfants âgés de 6 mois ou plus (17). Si cette étude permet de mettre en évidence que des probiotiques peuvent permettre de réduire l'inflammation intestinale consécutive à la dermatite atopique, l'efficacité à long terme de l'usage de probiotiques pour traiter la dermatite atopique n'est cependant pas traitée.
Il existe donc un important besoin pour une association symbiotique d'un prébiotique et d'un probiotique, permettant d'une part d'assurer un bon taux de survie du probiotique et d'autre part de traiter la dermatite atopique.
La présente invention montre l'efficacité du symbiotique (probiotique L rhamnosus et prébiotiques), dans la prévention et le traitement de la dermatite atopique, en particulier chez des enfants de plus de deux ans.
La présente invention concerne tout particulièrement l'utilisation de la souche Lactobacillus rhamnosus Lcr35 (probiotique) associée à du lactose (notamment en association avec un milieu à base de lactose), dans le traitement de la dermatite atopique. Par traitement de la dermatite atopique, on comprend traitement curatif et/ou préventif. L'invention met également en lumière l'importance du lactose dans le traitement de la dermatite atopique.
La souche Lactobacillus rhamnosus Lcr35 est une souche dérivée de l'espèce Lactobacillus rhamnosus (aussi nommée Lactobacillus casei subsp. rhamnosus), cette dernière étant déposée à l'ATCC sous le numéro ATCC 7469. La souche particulière Lactobacillus rhamnosus Lcr35 peut être obtenue selon le protocole défini dans l'exemple 1.
La présente invention concerne l'utilisation d'un produit comprenant une bactérie Lactobacillus rhamnosus en association avec du lactose dans le traitement de la dermatite atopique. De préférence, la bactérie Lactobacillus rhamnosus est dans un milieu à base de lactose. L'utilisation est de préférence pour la fabrication d'un médicament, d'un complément alimentaire, etc., pour traiter un patient atteint de dermatite atopique ou pour la prévention d'une telle affection. Le traitement ou la prévention, au sens de la présente invention, comprend la réduction du risque allergique et l'amélioration de l'état de santé du patient.
Le produit selon l'invention est donc une combinaison d'un probiotique (bactérie Lactobacillus rhamnosus) et d'un prébiotique (lactose, et plus spécifiquement milieu à base de lactose). Un tel produit peut donc être dénommé symbiotique. Le lactose est en effet connu pour son activité prébiotique ; il arrive dans l'intestin sous forme non transformée, il constitue alors un aliment pour certaines populations bactériennes de la flore intestinale, ce qui justifie son appellation de prébiotique.
Du fait de l'implication du lactose dans les allergies au lait, l'utilisation de ce dernier comme prébiotique par les présents inventeurs est particulièrement originale. De préférence, la bactérie considérée, entrant dans la composition du produit, est capable de fermenter le lactose.
En effet, les inventeurs ont constaté que le taux de survie du probiotique était très largement augmenté lorsque ledit probiotique était associé avec un élément nécessaire à sa croissance. Ainsi, dans un produit selon l'invention, sont présents le probiotique capable de fermenter le lactose ainsi que, notamment, du lactose, nécessaire à la survie du probiotique.
Selon un aspect particulièrement préféré de la présente invention, ladite bactérie est la bactérie Lactobacillus rhamnosus Lcr35. En effet, la souche L rhamnosus Lcr35 a la capacité de fermenter le lactose alors que la souche L. rhamnosus GG par exemple ne peut le faire. Un symbiotique tel que défini dans la présente invention peut bien entendu contenir au moins deux, voire plusieurs, probiotiques différents. Il peut s'agir d'une bactérie Lactobacillus rhamnosus avec une bactérie d'un autre genre, ou bien il peut s'agir d'au moins une ou plusieurs bactéries du genre Lactohacillus, d'espèces différentes. Le produit symbiotique tel que décrit comprend de préférence la bactérie vivante. Par vivante, il faut comprendre que l'intégrité de la cellule est conservée et que les processus cellulaires se produisent ou peuvent se produire si la bactérie est cultivée dans un milieu et des conditions adéquates. Toute bactérie vivante peut être de nouveau ensemencée sur un milieu de culture adéquat et se multiplier, dans des conditions adéquates. La présente invention comprend donc notamment l'utilisation de Lactobacillus rhamnosus Lcr35 sous forme lyophilisée ou sous forme congelée.
Un produit selon l'invention est considéré comme un symbiotique. En effet, la bactérie est un probiotique alors que le milieu à base notamment de lactose est un prébiotique. Par médicament ou préparation alimentaire ou complément alimentaire, etc., il faut entendre toute forme acceptable sur le plan pharmacologique, notamment sous forme de préparation pour nourrisson, de produit destinés aux enfants en bas âge, d'aliment diététique et de régime, d'aliment diététique de complémentation orale, de produit d'hygiène, de denrée alimentaire ou diététique à fins médicales particulières (ou spéciales), ou dispositif médical, ou toute autre forme adaptée bien connue de l'homme du métier. Le produit est de préférence sous une forme galénique adaptée à l'administration orale, par exemple sous forme de suspension buvable ou de gélule. Il peut également se présenter sous forme de poudre ou granule à ajouter aux aliments ou à une boisson, ou bien à sucer.
Par dermatite atopique, il faut entendre toutes les affections diagnostiquées comme étant des dermatites atopiques ou eczéma atopique, ainsi que les affections atopiques dont les symptômes sont essentiellement identiques et qui reçoivent par ailleurs des traitements identiques.
Le patient traité recevant le produit tel que décrit est de préférence un être humain, de préférence un enfant. Par enfant, on entend toute personne âgée de moins de 18 ans, de préférence moins de 15 ans ou moins de 12 ans. Le patient est de préférence un enfant de plus de 1 an, tout particulièrement un enfant âgé d'au moins deux ans.
Alternativement, le patient considéré peut être un ^nammifère autre que l'homme, par exemple un singe, un chien, un chat ou un lapin.
Une classe préférée de patients pour une utilisation selon la présente invention est les enfants ayant entre 2 et 12 ans. Une autre population de patients susceptibles de recevoir un produit selon la présente invention est constituée de sujets qui présentent des allergies au lactose, notamment des allergies au lait de vache. De préférence les allergies considérées sont des allergies bénignes ou modérées au lactose.
Par traitement de la dermatite atopique, on entend notamment toute action visant à supprimer ou à réduire les symptômes de la dermatite atopique, ainsi que toute action préventive tendant à empêcher, retarder ou ralentir leur apparition.
La durée du traitement est à définir en fonction de l'évolution de la dermatite atopique, elle est de préférence supérieure à 2 semaines. Elle peut être de 3 mois ou plus, notamment au moins 6 mois ou une année. Il peut s'avérer approprié de poursuivre le traitement sur plusieurs années, par exemple sur 2, 5 ou 8 années, en particulier dans le cas d'une application préventive.
De préférence, dans le traitement ou la prévention de la dermatite atopique, le produit selon l'invention est administré au moins une fois par semaine, de préférence au moins une fois par jour. Dans le cadre de la présente invention, une posologie préférée est de trois fois par jour. Le produit selon l'invention peut se présenter sous toute forme appropriée. Des formes appropriées sont bien connues de l'homme du métier. Elles doivent notamment permettre d'assurer la survie du probiotique. En effet, si le probiotique n'est pas vivant au moment de l'ingestion, les effets bénéfiques du symbiotique sont absents. Il est très important de tenir compte de trois facteurs essentiels qui sont l'atmosphère, l'humidité et la température. Les différents moyens de conservation des probiotiques sont bien connus de l'homme du métier.
De préférence, le produit est sous forme lyophilisée. En effet, cette forme assure non seulement une excellente conservation, mais elle permet également de préserver toute bactérie vivante faisant partie du produit selon l'invention. Il est important de déterminer le dénombrement du probiotique lors de l'obtention d'un produit lyophilisé selon l'invention.
La bactérie contenue dans le produit peut être le seul élément lyophilisé, mais de préférence, la bactérie est lyophilisée avec le produit contenant le milieu à base notamment de lactose. Le produit peut bien sûr comprendre des constituants additionnels, en sus de la bactérie et du milieu à base entre autres de lactose. De tels constituants sont ou bien ajoutés avant lyophilisation des autres composants, ou bien après (cas par exemple des excipients permettant la mise en forme galénique du produit). Le milieu à base de lactose est un milieu contenant au moins 5% en masse de lactose, de préférence au moins 20%.
Ledit milieu est de préférence stérile, avant ensemencement avec le probiotique. De préférence, un tel milieu est un milieu de culture (de fermentation) contenant donc d'autres substances. Le milieu est de préférence un milieu essentiellement constitué de lait, par exemple de lait écrémé.
Le milieu à base de lactose contient avantageusement également de l'amidon de pomme de terre. Il peut contenir également de la dextrine maltose. Tout autre composé ou excipient pharmacologiquement acceptable peut également entrer dans la composition d'un milieu à base de lactose comme défini.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le milieu à base de lactose correspond à un milieu de culture compatible avec la fermentation du lactose par la bactérie probiotique comprise dans le produit selon l'invention. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la bactérie est cultivée sur un milieu de culture, qui est éventuellement complémenté par la suite pour former un produit selon l'invention, c'est-à-dire un symbiotique (combinaison d'un probiotique et d'un prébiotique). Une telle situation est étayée par un exemple dans la partie expérimentale de la présente demande (voir exemple 1).
Il est particulièrement avantageux que le milieu à base de lactose soit issu du milieu de culture du probiotique. Ainsi, en vue de l'obtention du produit, il est inutile de changer le probiotique de milieu. Ceci évite un trop grand nombre d'étapes de centrifugation ; en effet, lors des centrifugations, les parois cellulaires des micro-organismes peuvent être endommagées, ce qui nuit à leur survie. Ainsi, en évitant de changer le probiotique de milieu et en réduisant ainsi le nombre de centrifugations, on assure un meilleur taux de survie au probiotique. De préférence, le probiotique utilisé n'est pas ensemencé ou cultivé sur du MRS. Du fait que le prébiotique correspond à un milieu de culture adapté pour le probiotique (bactérie), lorsque le produit selon l'invention est ingéré (et notamment quand il se présente sous forme lyophilisée et qu'il est remis en suspension avant l'ingestion), la bactérie se trouve immédiatement dans un milieu compatible avec sa survie. Un taux de survie augmenté des probiotiques serait ainsi obtenu. De préférence, la bactérie a été cultivée pendant au moins 4 heures, au moins 12h, de préférence entre 24 et 48 heures, voire plus, par exemple environ 72 heures, sur un milieu de culture à base notamment de lactose qui est ensuite éventuellement complémenté pour former le produit selon l'invention.
L'invention repose en effet sur les effets obtenus par le symbiotique, c'est-à-dire par le combinaison d'un probiotique (la bactérie de l'espèce Lactobacillus rhamnosus) et d'un prébiotique (le lactose, de préférence sous forme de milieu à base de lactose). Les effets obtenus sont encore plus avantageux quand la bactérie a été cultivée sur le milieu à base en autres de lactose. En effet, dans ces conditions, le milieu contient également des métabolites résultant de cette culture. Or certains de ces métabolites ont des propriétés antimicrobiennes particulièrement avantageuses (31). L'association de ces composés (probiotique, prébiotiques et métabolites) contribue à l'effet bénéfique sur la dermatite atopique.
Dans un produit selon la présente invention, le nombre de bactéries ou germes par gramme de produit est de préférence compris entre 1x108 et 1x1010. Avant une éventuelle lyophilisation du produit symbiotique selon l'invention, celui-ci est généralement sous forme liquide. Dans une telle situation, pour une utilisation dans le traitement de la dermatite atopique, le produit comprend de préférence une concentration dans le milieu égale ou supérieure à 1x108 UFC (unités formant colonie ou germes) par mL
Pour une application dans la prévention ou le traitement de la dermatite atopique, on administre au patient environ entre 1x108 et 1x1010 UFC de Lactobacillus rhamnosus par prise. Plusieurs prises peuvent être administrées par jour, par exemple sous forme de 3 prises quotidiennes. Les doses peuvent être ajustées, notamment en fonction de la corpulence du patient à traiter et de son éventuelle réaction au traitement. Comme mentionné dans les paragraphes précédents, une bactérie particulièrement préférée de l'espèce Lactobacillus rhamnosus Céquivalent à Lactobacillus casei subsp. rhamnosus) capable de fermenter le lactose est la souche Lcr35 qui peut être obtenue selon le protocole défini dans l'exemple 1. D'autres protocoles sont bien connus de l'homme du métier.
Dans le choix d'un probiotique pour obtenir un produit selon l'invention, il est essentiel de rechercher une bactérie qui n'ait aucun effet pathogène et qui soit de préférence connue comme ayant de bonnes propriétés en ce qui concerne son taux de survie. Un autre paramètre à prendre en compte est sa résistance aux procédés technologiques. Il peut également être avantageux que le probiotique en question possède des résistances à la plupart des antibiotiques classiques. A l'inverse, il est des situations où le probiotique est de préférence sensible à la majorité des antibiotiques connus. De plus, une souche pour utilisation selon la présente invention doit également présenter la capacité à coloniser la flore intestinale.1
La souche spécifique Lactobacillus rhamnosus Lcr35 est particulièrement préférée dans le cadre de la présente invention car elle présente les différents avantages mentionnés ci-dessus. Elle est de plus résistante à la streptomycine, à la tétracycline, à l'érythromycine, à l'acide nalidixique, à l'acide pipémidique, à l'acide fusidique, à la colistine, à la polymyxine, au sulfaméthoxazole et à la triméthoprime. Les caractères fermentaires de cette souche sont particulièrement avantageux. Alternativement, l'invention concerne également l'utilisation du lactose seul ou en combinaison avec un probiotique, dans le traitement ou la prévention de la dermatite atopique.
Légende des figures :
Figure 1 : génotypage de la souche Lactobacillus rhamnosus Lcr35. Figure 1A : séquence intergénique ADNr 16S-23S ; Figure 1B : ADN ribosomal 16S. Figure 2: représentation des régions séquencées de Lactobacillus rhamnosus Lcr35. Figures 3A et 3B : comparaison des profils métaboliques 50 API CH des souches Lactobacillus rhamnosus Lcr35 et Lactobacillus GG.
Exemple 1 : Obtention de la souche; Lactobacillus rhamnosus Lcr35 lyophilisée et conditionnement. Réactivation :
Les germes obtenus dans le commerce (Bacilor® des laboratoire Lyocentre) ou issus de la souchothèque des laboratoires Lyocentre, sont remis en activité en ensemençant avec 100 à 200 mg du produit lyophilisé 10mL de milieu au lait écrémé enrichi (glucose 15g/L, extrait de levure 5g/L). Ce tube est placé dans une étuve à 37°C pendant 72 heures.
1mL de la culture de ce premier tube est introduit dans un second tube contenant 10mL de milieu au lait enrichi stérile, ce tube est placé à l'étuve à 370C, pendant 72 heures. Cette opération est recommencée plusieurs fois de manière à obtenir une population la plus importante possible, supérieure à 1x109 germes par mL.
Préparation du pied de cuve :
1mL de cette souche réactivée est introduit dans un ballon contenant 18OmL de lait écrémé enrichi stérilisé puis cultivé à 370C pendant 72 heures, ce pied de cuve sert à ensemencer les ballons.
Milieu de culture : .. , '
Afin de pouvoir disposer d'une culture lyophilisée de Lactobacillus casei var. rhamnosus (aussi dénommée Lactobacillus rhamnosus) de titre adapté, celle-ci est élaborée simultanément selon 2 procédés de culture différents : - sur milieu simplifié - sur milieu enrichi 6 001979
a) constituants des milieux :
1. Milieu simplifié : lait écrémé en poudre 100g
Eau, qsp 1,000 L
2. Milieu enrichi: lait écrémé en poudre 16,650g
Glucose 4,450g
Sulfate de manganèse 0,028g Citrate de sodium 0,560g
Phosphate monopotassique 1,780g
Phosphate dipotassique 3,560g
Autolysat de levure de bière . 1 ,670g
Eau, qsp 1 ,000 L
b) Préparation et stérilisation des milieux : 1. Milieu simplifié :
formule : lait écrémé en poudre 100g
Eau, qsp 1.000 L
Méthode : Dans un contenant, mettre 200 litres d'eau et ajouter par petites fractions sous agitation lente les 28kg de lait écrémé en poudre. Après complète dispersion, ajuster à 280 L avec de l'eau. Ce lait est réparti en contenants correctement bouchés et stérilisés à l'autoclave pendant 30 minutes à 115°C.
2. Milieu enrichi :
Formule pour un contenant de 2000 litres lait écrémé en poudre 30,00kg
Glucose 8,00kg
Sulfate de manganèse 0,05kg Citrate de sodium 1 ,00kg
Phosphate monopotassique 3,20kg Phosphate dipotassique 6,40kg
- Autolysat de levure de bière. 3,00kg
Eau, qsp 1800,00 L
Méthode :
Dans un contenant, mettre 1000L d'eau, puis sous agitation rapide, ajouter le lait ; après complète dispersion ajouter le glucose, le sulfate de manganèse, le citrate de sodium, les phosphates mono et dipotassique, et enfin l'autolysat de levure de bière. Après dispersion complète, ajuster à 1800 litres par de l'eau. Ensuite, toujours sous agitation, stériliser ce milieu à 1150C pendant 30 minutes puis refroidir pour le ramener à 37°C.
Ensemencement et culture a) milieu simplifié : Introduire par contenant de 1 à 2 ml de préculture provenant du pied de cuve, sous une hotte à flux d'air laminaire vertical.
Ensuite ces contenants sont placés pendant 72 heures dans des étuves de bactériologie maintenues à 370C, plus ou moins 2°C.
b) milieu enrichi :
Introduire par contenant de 1800 litres, 2,4 litres de préculture provenant du pied de cuve. Maintenir grâce à un dispositif thermostaté approprié la température à 37°C pendant 48 heures sous agitation lente.
Préparation de la culture pour lyophilisation : a) milieu simplifié : constituants :
- culture de Lactobacillus casei var. rhamnosus 136, 8 L
- amidon de pomme de terre 35,0 kq
- lactose 15,0 kg
- suspension d'hydroxyde de.calcium q.s. pqύr neutralisation pH=7,0 Méthode de préparation :
Sous hotte à flux d'air laminaire, verser la culture obtenue dans une cuve de 200 litres, agiter fortement pour briser le caillé et ajouter sous agitation rapide l'amidon de pomme de terre et le lactose. Quand leur dispersion est totale, mesurer le pH qui doit être voisin de 3. Ensuite, avec de l'hydroxyde de calcium, neutraliser ce mélange jusqu'à pH=7,O ± 0,1.
b) milieu enrichi constituants :
- culture de Lactobacillus case/ var. rhamnosus 1800,0 L
- amidon de pomme de terre 6,6 kg
- lactose 3,3 kg
- dextrine maltose 6,0 kg - suspension d'hydroxyde de calcium q.s. pour neutralisation pH=7,0
Méthode de préparation :
La culture de Lactobacillus casei var. rhamnosus est centrifugée en continu dans une centrifugeuse pour éliminer totalement le surnageant. Le culot est récupéré sous hotte à flux d'air laminaire, il est mélangé sous agitation rapide avec les excipients de lyophilisation. Ensuite, à l'aide d'hydroxyde de calcium, neutraliser ce mélange jusqu'à pH=7,0 ± 0,1.
Lyophilisation Les préparations de culture de Lactobacillus casei var. rhamnosus pour lyophilisation sont réparties aseptiquement dans des plateaux en acier inoxydable.
Congeler rapidement à -400C, ensuite effectuer la sublimation à -220C. Quand le produit a dépassé le seuil de 00C, réaliser un étuvage à +370C.
Selon les préparations mises en œuvre, les quantités obtenues de produit sec lyophilisé sont environ les suivantes :
Figure imgf000012_0001
Broyage, mélange, conditionnement a) broyage
Dans une pièce à atmosphère déshumidifiée (H. R. inférieure à 50% et filtrée (filtration 99,999)), la culture lyophilisée de Lactobacillus casei var. rhamnosus est récupérée, broyée et tamisée sur calibreur de type oscillant équipé d'une grille de 60 MESH, un échantillon est prélevé pour dénombrement des lactobacilles. Le produit est conservé dans des containers hermétiquement clos. Après titrage des Lactobacillus case/ var. rhamnosus vivants, les produits sont homogénéisés afin d'obtenir une matière première de titre désiré.
b) mélange Afin d'obtenir des lots de culture lyophilisée de Lactobacillus casei var. rhamnosus de 200 à 225 kg dont le titre est compris entre 1x109 et 1x1010 germes par gramme, un mélange est effectué dans un mélangeur doux selon la méthode suivante :
-Q. S. de culture lyophilisée de Lactobacillus casei var. rhamnosus sur milieu simplifié. -Q. S. de culture lyophilisée de Lactobacillus casei var. rhamnosus sur milieu enrichi, de telle sorte que le poids du mélange final soit compris entre 200 et 225 kg d'une poudre dont le titre est compris entre 1x109 et 1x1010 germes par gramme.
c) conditionnement Après mélange, des échantillons sont prélevés pour contrôles. Le reste du mélange est conditionné en fonction de la demande en containers adaptés hermétiquement clos. Puis cette poudre est mise en forme galénique.
Exemple 2 : Etude de l'effet sur la dermatite atopique d'un produit à base de LCR35 Les objectifs de cette étude sont d'une part, l'étude de l'efficacité du Lactobacillus casei variété rhamnosus en association avec un prébiotique dans le traitement de la dermatite atopique modérée à sévère de l'enfant, d'autre part, l'évaluation des effets indésirables et la tolérance clinique de ce traitement.
Type d'étude :
Etude prospective contrôlée en double aveugle versus placebo. Etude de phase 2.
Connaissances actuelles 1) La dermatite atopique
La dermatite atopique est une dermatose fréquente (prévalence estimée entre 10 et 25% dans les pays occidentaux) (2, 3). Son évolution est chronique avec amélioration fréquente à l'adolescence. Les formes modérées et sévères, de par la chronicité des lésions prurigineuses, inesthétiques et nécessitant des soins locaux quotidiens, ont un retentissement psychologique important, peuvent altérer la relation parents / enfant et retentissent sur la qualité de vie de l'enfant et sa famille. 1o
Le traitement de fond repose sur l'application régulière d'émollients, associée à des règles hygiéno-diététiques. Les poussées nécessitent l'application de corticoïdes ou d'immunosuppresseurs sous forme topique.
La pathogénie de la derrήatite atopique repose sur une dysrégulation de l'immunité à médiation cellulaire avec déséquilibre du rapport Th1/Th2 au profit d'une réponse de type Th2. Il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement commercialisé permettant de corriger cette dysrégulation immunitaire.
2) Les probiotiques
Les probiotiques sont des microbes commensaux du tube digestif ayant potentiellement des propriétés anti-allergiques en favorisant une réponse de type Th 1
(8-9). Ils sont utilisés depuis près de 40 ans dans le traitement symptomatique d'appoint de la diarrhée de l'enfant et de l'adulte. Cependant tous les probiotiques n'ont apparemment pas les mêmes propriétés. Dans une étude sur les cellules dendritiques de souris le Lactobacillus casei apparaît comme le probiotique induisant à faible concentration la production majoritaire d'interleukines favorisant la réponse Th1 (IL12,
IL6, TNFαj sans augmenter la production d'ILIO (principale interleukine de la réponse
Th2) (10).
Les probiotiques ont déjà démontré leur efficacité en prévention primaire de la maladie atopique (11) et sur une courte série dans le traitement de la dermatite atopique du nourrisson (13). Ces études interviennent à un âge très précoce et l'efficacité de ce traitement est possiblement due à la colonisation initiale de la microflore intestinale.
Cependant les effets immunomodulateurs des probiotiques s'observent aussi chez le grand enfant et l'adulte: ils pourraient donc également être efficaces dans ces tranches d'âge (16). Enfin ces traitements s'avèrent particulièrement sûrs puisque seuls quelques rares cas d'endocardites et de septicémies ont été décrits chez des sujets gravement immunodéprimés.
L'utilisation notamment de la souche LCR35 comme source de L casei offre de multiples avantages.
- Cette souche est commercialisée depuis 1967 (sous le nom d'Antibiophilus® puis de Bacilor® visa 01/12/1959, AMM 29/03/1974) dans le traitement symptomatique d'appoint de la diarrhée. , -
- Sa tolérance est excellente. Aucun effet indésirable n'a été relevé en France ou à l'étranger.
- Il contient du Lactobacillus casei variété rhamnosus (aussi appelé Lactobacillus rhamnosus) qui semble être aujourd'hui un probiotique prometteur dans le traitement et la prévention des manifestations atopiques. Matériels et méthodes 1 ) Critères d'inclusion
L'étude a été réalisée sur une période de 17 mois. Les patients, des enfants âgés de 2 à 12 ans présentant une dermatite atopique modérée à sévère, ont été inclus dans cette étude après obtention du consentement écrit des parents et également des enfants en âge de comprendre. Le diagnostic de la dermatite atopique a été réalisé selon les critères standardisés (18). Seuls les patients présentant un SCORAD supérieur à 15 ont été inclus dans l'étude.
2) Critères de non inclusion
Les patients présentant une immunodépression connue (congénitale ou acquise) ainsi que ceux qui prenaient ou avaient pris un traitement pouvant induire une immunodépression générale (corticoïdes par voie générale ou médicament immunosuppresseur) dans les trois mois précédents, n'ont pas été inclus dans l'étude.
3) Conditions de réalisation du double aveugle
Les enfants ont été répartis par tirage au sort en 2 groupes.
Le premier a reçu le symbiotique (contenant du Lactobacillus casei variété rhamnosus sous la forme du Bacilor®) ; le second a reçu uniquement le prébiotique (sans Lactobacillus casei variété rhamnosus).
La randomisation a été réalisée avant le début de l'étude, selon la sévérité de la dermatite atopique (SCORAD < OU > 40) et selon la saison (hiver, printemps, été, automne).
Les sachets contenant les probiotiques (+prébiotiques + métabolites) ne peuvent être différenciés ni par le patient, ni par le médecin, des sachets ne contenant que le prébiotique.
4) Modalités d'administration
Le symbiotique comprenant le Lactobacillus casei variété rhamnosus est administré par voie orale sous forme de sachets de Bacilor® (produit par les laboratoires
Lyocentre, à Aurillac, France) à 1 ,5g. Chaque dose de 1,5g est conservée dans des sachets d'aluminium, étanches à l'air. Les doses de symbiotique contiennent environ
1 ,2x109 unités formant colonie (ou germes) de L rhamnosus Lcr35 + une préparation d'un prébiotique spécifique et des métabolites sécrétés par la bactérie. La préparation prébiotique est dérivée du milieu de fermentation de L rhamnosus
Lcr35, et contient du lait écrémé en poudre (en moyenne 0,344g- 33% de protéine bovine, 52% de lactose), de l'amidon de pomme de terre (en moyenne 0,759g) et du lactose (en moyenne 0,397g).
Les doses de préparation de symbiotiques et de prébiotiques ont été données sous forme de poudre pour suspension buvable, trois fois par jour, durant 3 mois. Il a été 5 demandé aux patients de dissoudre la préparation dans de l'eau ou tout autre liquide froid de leur convenance. Aucun des patients n'a modifié son régime alimentaire durant la période de l'étude.
Durant la période de l'étude, les traitements habituels des patients pour la dermatite atopique sont restés inchangés ; tous les patients appliquaient des émollients et o presque tous utilisaient des dermocorticoïdes ou des immunosuppresseurs locaux. Les traitements topiques étaient notés ainsi que toutes les autres prises médicamenteuses qu'elles soient régulières ou occasionnelles. La consommation de dermocorticoïdes et d'immunosuppresseurs locaux a été évaluée quantitativement par estimation en poids des tubes utilisés, à chaque visite. 5
5) Critères d'évaluation de l'efficacité du traitement
Ni le patient, ni ses parents, ni le dermatologue investigateur ne connaissaient le traitement administré au patient.
Des évaluations cliniques ont été réalisées avant le début du traitement, à un mois 0 (M1), à deux (M2) et trois mois (M3). Chaque patient a été examiné par le même dermatologue à chaque visite.
L'évolution de la symptomatologie et de l'efficacité du traitement sont quantifiées par un score global de gravité: le SCORAD (pour SCORing Atopic Dermatitis) développé le Εuropean Task Force for Atopic Dermatitis' (19). Ce score strictement clinique 5 constitue la référence dans l'évaluation des traitements de la dermatite atopique.
Le score dénommé SCORAD combine l'évaluation clinique de l'intensité et de l'étendue des symptômes avec un score subjectif lié au prurit et à l'insomnie indiqué par le patient, ses parents ou bien les deux, sur une échelle visuelle. Le SCROAD objectif se situe entre 0 et 83. Quand on ajoute le prurit et l'insomnie, le score peut 0 alors être compris entre 0 et 103.
Lors de la visite initiale, les patients sont classés ,dans un groupe modéré (SCORAD entre 16 et 39) ou sévère (SCORAD supérieur à 40). A chaque visite, le SCORAD objectif et le SCORAD total sont calculés. L'IGA (Investigator's Global Assessment ou Evaluation Globale de l'Investigateur, une échelle à 6 niveaux incluant les catégories 5 suivantes : 0, rien ; 1 , presque rien ; 2, léger ; 3, modéré ; 4, sévère ; 5, très sévère) a aussi été évalué à chaque visite. Le nombre de poussées et l'utilisation de Ib
dermocorticoïdes ou d'immunosuppresseurs locaux durant le mois précédent ont également été notés ainsi que les possibles effets secondaires. Lors de la dernière visite, l'opinion des patients et/ou celle des parents sur l'efficacité du traitement (aggravation, inchangé, amélioration) ainsi que sur la tolérance ont été notés. Enfin, les parents ont été joints 6-12 mois après la fin de l'étude pour déterminer s'ils ont observé une rechute de la maladie après l'arrêt du traitement.
6) Surveillance des effets secondaires
La surveillance est exclusivement clinique. Elle est mensuelle.
7) Analyse statistique
Le nombre de patients nécessaires, pour mettre en évidence une différence de scorad de 15 points entre les deux groupes, avec un écart-type de 16, un risque de première espèce (alpha) de 5%, une puissance de 80% et un pourcentage maximal de patients exclus au cours de l'essai clinique de 20%, a été donc de 22 personnes par groupes. Les différences potentielles liées au sexe, à d'autres maladies atopiques et à l'utilisation des traitements topiques entre les deux groupes ont été analysés à l'aide du test du χ2 (ou par le test exact de Fisher, selon le cas). Le taux de base (qui est le taux au départ de l'étude avant toute intervention) pour l'âge, les nombres de poussées par mois, l'utilisation de traitements topiques, le SCORAD (total) et le SCORAD objectif ont été comparés pour les deux groupes à l'aide du test t (ou du test de Kruskal-Wallis pour les données non-paramétriques).
A la fin de la période d'étude, les changements dans le SCORAD et dans le SCORAD objectif, par référence au taux de base, dans chaque groupe de traitement, ont été analysés à l'aide du test t de Student apparié; le SCORAD objectif et le SCORAD entre les deux groupes à M3 ont été comparés à l'aide du test t pour des échantillons indépendants. Cette analyse a également été effectuée dans le sous-groupe des patients présentant d'autres manifestations atopiques. Seuls ceux ayant achevé l'étude (résultat primaire et SCORAD disponible à M3) ont été inclus dans ces analyses. Cependant, les analyses ont été répétées sur la totalité de la population de l'étude, après avoir remplacé les SCORAD manquants à M3 par la moyenne des SCORAD dans chaque groupe de traitement, sur la base des données disponibles à M3. Les résultats des patients de chaque groupe ayant obtenu une baisse du SCORAD supérieure ou égale à 50%, ou supérieure ou égale à 90% par rapport au taux de base à M3, ont également été analysés à l'aide du test exact de Fisher. Les scores IGA ont été analysés de manière similaire en utilisant les tests de Wilcoxon et Mann-Whitney. Enfin, le nombre total de poussées et les quantités de traitements topiques utilisés durant la période de l'étude ont également été comparés entre les deux groupes et ce pour le mois précédant l'étude et pour le dernier mois de l'étude (test de Kruskal-Wallis et test de Friedman pour les échantillons appariés). Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel SPPS pour Windows.
Résultats :
Etude de la population :
Parmi les 48 patients inclus dans l'étude, neuf (groupe symbiotique, n=7; groupe prébiotique, n=2; P=O, 13) ont été exclus de l'étude. Les raisons de ces exclusions sont la non présentation des patients aux consultations prévues, (groupe symbiotique, n=5; groupe prébiotique, n=2) ou le retrait du consentement éclairé (groupe symbiotique, n=2). Trente-neuf patients (moyenne d'jâge 5,82 ans, moyenne de SCORAD =39,7) ont mené cette étude jusqu'à son terme. Les caractéristiques de la population de l'étude sont indiquées dans le tableau 1. Aucune différence statistique n'a été mise en évidence entre les deux groupes sur la base de l'âge, de la présence d'autres manifestations atopiques, du nombre de poussées mensuelles, de -l'utilisation de dermocorticoïdes ou d'immunosuppresseurs locaux et sur le SCORAD objectif et le SCORAD. Le taux de base pour le SCORAD objectif est de 29,1 (groupe symbiotique = 28,7 contre groupe prébiotique = 29,4), et la moyenne de référence du SCORAD est de 39,2 (groupe symbiotique = 39,1 contre groupe prébiotique = 39,3).
Effets cliniques
L'évolution du SCORAD objectif et du SCORAD dans les deux groupes est indiquée respectivement dans les tableaux 2 et 3. Dans le groupe symbiotique, le SCORAD moyen était de 39,1 avant le traitement (n=24) contre 20,7 après trois mois de traitement (n=17 ; P<0,0001 , sur la base de 17 observations complètes). Dans le groupe prébiotique, le SCORAD moyen était de 39,3 avant le traitement (n=24) contre 24,0 après trois mois (n=22 ; P<0,0001). La différence entre les deux groupes de traitement est nette mais faible d'un point de vue statistique tant au niveau du SCORAD objectif 'qu'au niveau du SCORAD après 3 mois de traitement (P=0,418 et P=0,535, respectivement). Ces résultats sont compatibles avec ceux obtenus dans les analyses réalisées en remplaçant les valeurs manquantes pour le SCORAD et le SCORAD objectif à M3. Comme la réponse au traitement était plus prononcée chez les patients allergiques comparés aux patients non allergiques dans la première étude réalisée chez des enfants de plus de un an (17), les inventeurs ont également analysé les résultats en tenant compte de la présence, ou non, d'autres manifestations atopiques. Vingt-cinq patients présentaient d'autres manifestations atopiques (13 dans le groupe prébiotique et 12 dans le groupe symbiotique). Au taux de base, le SCORAD était de 41 ,7 ± 11 ,4 dans le groupe prébiotique contre 49,6 ± 16,8 dans le groupe symbiotique (P=O, 181). Les deux groupes ont montré une baisse importante de leurs SCORAD après trois mois de traitement ; la différence observée entre les deux groupes n'atteint toutefois pas la significativité statistique. L'évolution des scores IGA est similaire à celle des SCORAD. Dans le groupe recevant des symbiotiques, le score IGA moyen était de 3,33 (intervalle de confiance :2,97-3,70) avant traitement (n=24) contre 2,41 (IC : 1 ,75-3,07) après trois mois de traitement (n=17 ; P=O, 002, sur la base de 17 observations complètes).
Dans le groupe recevant des prébiotiques, le score IGA moyen était de 3,42 (intervalle de confiance :3,20-3,63) avant traitement (n=24) contre 2,73 (IC : 2,31-3,14) après trois mois de traitement (n=22 ; P=0,006).
Utilisation de médicaments topiques :
Les traitements topiques utilisés par les patients ont été classés en trois groupes : les dermocorticoïdes (n=34) ; les pommades ayant comme principe actif un inhibiteur de la calcineurine (n=11) et les émollients (n=3). La pommade de tacrolimus 0,03% est le seul produit utilisé dans le groupe des inhibiteurs de la calcineurine. En comparant la consommation des tubes de pommade pendant toute la période de l'étude au sein de chacun des deux groupes (prébiotiques et symbiotiques), aucune différence statistique n'a été observée (P=0,966). Des résultats similaires ont été obtenus en comparant l'utilisation durant le dernier mois de l'étude (P=O, 919). Dans les deux groupes, l'utilisation de dermocorticoïdes ou de pommades ayant comme principe actif un inhibiteur de la calcineurine (tacrolimus) durant le mois précédant l'étude était plus élevée que durant le mois M3 (prébiotique, P=O, 005 ; symbiotique, P=O, 07).
Tolérance au traitement :
Le traitement a été bien toléré dans les deux groupes. Aucun effet secondaire sérieux
I n'a été observé ; seuls trois épisodes de douleurs abdominales modérées ont été notés_ deux dans le groupe recevant le symbiotique et un dans le groupe recevant le prébiotique. Tableau 1 : caractéristiques de la population sous étude (totale et dans chaque groupe)
Total Symbiotique Prébiotique Valeur p
Nombre de patients 48 (100.0) 24(100.0) 24(100.0)
Age [années, moyenne (plage)] 5.85(2-12) 5.38(2-11) 6.33(2-12) NS
Autres maladies atopiques 25 (52) 12(50) 13 (54) NS
Asthme 17 (68) 9(75) 8(62) NS
Rhinite allergique 19 (76) 8(67) 11 (85) NS
Conjonctivite allergique 11 (44) 5(42) 6(46) NS
Poussées [mois ; moyenne (plage)] 7.5 (0-30) 8.83 (0-30) 6.13(1-30) NS
Traitements
Dermocorticoïdes 34(71) 16(67) 18 (75)
Classe 2 29 (60) 15 (63) 14 (58) co
Classe 3 5(11) 1 (4) 4(17)
Tacrolimus 0,003% 11 (23) 6(25) 5(21)
Emollients seuls 3(6) 2(8) 1(4)
Utilisation mensuelte.[g; moyenne (plage)] 1.29(0-5) 1.25(0-4) 1.32(0-5) NS
Taux base SCORAD objectif [médiane (EIQ)] 29.0(19.9-37.4) 28.7(16.1-36.6) 29.0(21.6-37.7) NS
SCORAD au-dessus du taux de base [médiane 39.7 (27.6-46.2) 39.7(26.5-46.1) 39.2(30.6-48.1) NS
(EIQ)]
Les valeurs données sont n (%) sauf indication contraire.
SCORAD= SCORing Atopic Dermatitis ; EIQ = écart interquartile.
Tableau 2 : évolution du SCORAD objectif
SCORAD objectif Taux de base (n=24) 1 mois (n=20) 2 mois (n=17) 3 mois (n=17)
Groupe symbiotique Moyenne (95% IC) 29 (22.9-34.5) 26 (20.2-32.1) 19 (13.0-25.4) 16 (8.9-23.8) Médiane (EIQ) 29 (16.1-36.6) 28 (15.7-37.2) 22 (7.5-25.7) 8 (7.2-32.2) n = 24 /7 = 23 n = 22 n = 22
Groupe prébiotique Moyenne (95% IC) 29 (25.3-33.6) 25 (18.5-31.1) 21 (16.0-25.2) 20 (14.2-25.7) Médiane (EIQ) 29 (21.6-37.7) 19 (14.5-38.0) 19 (13.5-27.4) 17 (10.1-30.2)
SCORAD= SCORing Atopic Dermatitis ; EIQ = écart interquartile ; IC = intervalle de confiance
o
Tableau 3 : évolution du SCORAD
SCORAD Taux de base (n=24) 1 mois (n=20) 2 mois (n=17) 3 mois (n=17)
Groupe symbiotique. Moyenne (95% IC) 39 (31.9-46.4) 35 (28.5-42.5) 26 (18.1-34.0) 21 (11.7-29.8) Médiane (EIQ) 40 (26.5-46.1) 37 (23.2-48.6) 30 (11.5-35.5) 14 (8.0-39.5)
/7 = 24 /7 =23 n= 22 /7 = 22
Groupe prébiotique Moyenne (95% IC) 39 (34.7-43.9) 32 (24.6-39.2) 26 (20.8-31.6) 24 (17.3-30.7) Médiane (EIQ) 39 (30.6-48.1) 26 (19.0-46.5) 26 (18.4-32.5) 21 (13.4-36.4)
SCORAD= SCORing Atopic Dermatitis ; EIQ = écart interquartile ; IC = intervalle de confiance
Suivi :
Tous les enfants pour lesquels une amélioration de la dermatite atopique a été observée durant le traitement, sauf deux, ont subi une rechute de la maladie, ou tout au moins une détérioration de l'état de la peau dans les 2 à 4 mois après la fin du traitement (soit par le symbiotique soit par le prébiotique).
Discussion :
Une amélioration de la dermatite atopique à la fin de l'étude a été observée dans les deux groupes de patients (groupes recevant un prébiotique et groupe recevant un symbiotique), avec un niveau de satisfaction élevé. L'amélioration dans le groupe des patients recevant le symbiotique, d'un point de vue statistique, n'apparaît que peu supérieure au groupe de patients recevant le prébiotique.
Chaque souche bactérienne probiotique a des propriétés spécifiques et une capacité à proliférer et survivre dans le tube digestif. La souche L rhamnosus LCR35 utilisée dans la présente étude possède de nombreuses propriétés intéressantes. Elle présente 96% d'homologie avec L rhamnosus GG par comparaison des séquences 16S-23S. Cette séquence signature pour la souche L rhamnosus LCR35 est donnée dans la figure 1. De plus, la souche L. rhamnosus Lcr35 a la capacité de fermenter le lactose alors que la souche L. rhamnosus GG ne peut le faire. Enfin, des études précédentes ont démontré la capacité de L rhamnosus Lcr35 à effectuer une colonisation à long terme de la muqueuse intestinale après son administration par voie orale (20). L'évaluation de l'efficacité de symbiotiques dans le traitement de la dermatite atopique est intéressante car l'association à des prébiotiques adéquats peut améliorer le taux de survie de souches de probiotiques suite à l'ingestion (21).
Les inventeurs ont donc fait l'hypothèse que la combinaison prébiotiques-probiotiques pourrait donner de meilleurs résultats dans le traitement de la dermatite atopique par rapport à des probiotiques seuls. Des résultats récents montrent que le lactose et l'amidon de pomme de terre peuvent être considérés comme des prébiotiques (22, 23). Cependant, l'utilisation d'une préparation spécifique de prébiotique (comme décrite plus haut) repose sur sa capacité à améliorer la prolifération et la survie de la souche L. rhamnosus Lcr35 in vitro.
De manière intéressante, comme la préparation de prébiotique utilisée est le milieu de fermentation de L. rhamnosus Lcr35, le traitement symbiotique est composé du milieu de culture contenant les prébiotiques, du probiotique mais en plus des métabolites sécrétés par ce probiotique. Ces métabolites peuvent être définis comme des eubiotiques. La combinaison (probiotique, prébiotique, eubiotique) est présente dans le produit Bacilor® commercialisé par les laboratoires Lyocentre. Son efficacité dans le traitement symptomatique d'appoint de la diarrhée est reconnue et le produit est commercialisé pour cette indication thérapeutique. La durée de l'étude a été fixée à 3 mois afin de bénéficier d'une période suffisante pour évaluer les effets du traitement tout en limitant la probabilité d'une interférence avec une variation spontanée d'intensité de la maladie.
Le traitement de la dermatite atopique des enfants âgés de deux ans et plus par des symbiotiques [prébiotiques+ la souche de L rhamnosus Lcr35 (1,2x109 unités formant colonie, trois fois par jour)] a une efficacité supérieure au traitement composé uniquement de prébiotiques, bien que la différence soit peu prononcée. Ceci est démontré à la fois par l'évolution du SCORAD au cours de l'étude mais également par l'évaluation subjective des patients concernant l'efficacité du traitement. Bien que la sévérité et l'importance des lésions soient restées constantes, le traitement avec les symbiotiques semble avoir fait diminuer le nombre de poussées et l'utilisation de médicaments topiques. La différence statistique pour ces deux paramètres reste cependant faible.
En fait, il a bien été observé une diminution plus importante du SCORAD moyen dans le groupe symbiotique (20,5 contre 15,6), mais cette différence est dans les limites de la significativité d'un point de vue statistique.
A ce jour, aucune étude n'a évalué l'efficacité de symbiotiques et de prébiotiques dans le traitement de la dermatite atopique, ou dans toute autre maladie atopique. Cependant, il a récemment été démontré chez des patients en bonne santé que les prébiotiques et les probiotiques (versus placebo), pouvaient diminuer de manière significative la génération et l'accumulation de produits de fermentation potentiellement toxiques (24).
Ainsi, des prébiotiques en eux-mêmes peuvent avoir un impact important sur la flore intestinale et peuvent aussi induire des changements immunologiques. Bien que des études supplémentaires soient nécessaires, les données préliminaires suggèrent que la consommation de prébiotiques peut avoir une influence sur des paramètres liés à l'immunité à médiation cellulaire etdonc modifier, Ie rapport Th1/Th2 (25, 26). Ainsi, des prébiotiques spécifiques peuvent agir sur la flore intestinale pour induire une immunomodulation susceptible d'être bénéfique à la diminution des manifestations de la dermatite atopique. Bien que les présents résultats démontrent l'importance des prébiotiques (spécialement en combinaison avec des probiotiques pour former des symbiotiques), d'autres facteurs éventuels, autres que les traitements, ont toutefois été recherchés pour expliquer l'amélioration de l'état des patients.
L'effet des saisons peut être éliminé parce que l'inclusion des patients s'est déroulée tout au long de l'année, et la randomisation a été réalisée en tenant compte des saisons. Cependant, la fréquence des visites ainsi que l'inclusion dans un essai clinique avec l'espoir de voir sa maladie améliorée, a pu jouer un rôle psychologique favorable pour les patients comme pour leur famille.
L'absence de comparaison avec un réel placebo (les prébiotiques ne pouvant être considérés comme un placebo) ne permet pas de conclure définitivement ; cependant, quelque soit l'impact psychologique d'un placebo, il ne permet pas en général d'induire une amélioration du SCORAD de plus de 5 points (13, 17, 27-29). Or, dans la présente étude, les traitements avec le prébiotique et avec le symbiotique (et les métabolites) ont tous les deux permis d'obtenir une baisse du SCORAD de plus de 15 points (15,6 et 20,5 points respectivement). De plus, cette amélioration ne peut pas être liée à une augmentation de la consommation de dermocorticoïdes ou d'immunosuppresseurs locaux. Au contraire, l'utilisation de ces substances a très nettement baissé à la fin de la présente étude. Enfin, la rechute de la maladie observée dans les 2 à 4 mois après l'arrêt du traitement pour quasiment tous les patients, suggère aussi que l'amélioration n'était pas due à un hasard ou à une évolution spontanée de la dermatite atopique. Toutes ces données confirment l'efficacité des prébiotiques, et surtout des symbiotiques, dans le traitement de la dermatite atopique (DA).
Les présents résultats vont dans le même sens que l'amélioration clinique observée dans d'autres études qui ont évalué l'utilisation de probiotiques (mais non de symbiotiques) dans le traitement de la DA. Bien qu'un effet important ait été observé dans la première des études évaluant l'efficacité de probiotiques chez des enfants de moins de deux ans (13), l'amélioration observée dans la seconde étude, dans laquelle les enfants étaient âgés d'au moins un an, était nettement moins significative (17). La différence d'efficacité entre ces études (13 et17) pourrait s'expliquer par les critères d'inclusions (« très spécifiques ») des patients de l'étude (13) qui étaient : - des patients âgés de moins de deux ans, avec une allergie prouvée au lait de vache.
L'amélioration observée dans le SCORAD pour la présente étude avec à la fois des prébiotiques et des symbiotiques semble être supérieure à celle observée dans l'étude menée par Rosenfeldt (17). Cette différence pourrait s'expliquer par la différence dans la durée du traitement [6 semaines dans l'étude de Rosenfeldt (17) contre 3 mois dans ^
la présente étude]. Mais il est très probable que l'utilisation d'une association probjotiques/prébiotiques/métabolites joue également un rôle important dans la différence observée. L'étude de Rosenfeldt a en effet été réalisée avec uniquement un probiotique. Cependant, il est à noter que très peu de données sont disponibles concernant le rôle respectif des probiotiques, prébiotiques, symbiotiques et métabolites dans la modulation du système immunitaire. Une étude récente suggère que les probiotiques et les prébiotiques pourraient agir via des mécanismes différents (30). Deux études en double aveugle avec placebo ont été rapportées récemment, toutes les deux réalisées avec des probiotiques pour traiter des enfants atteints de DA et âgés de moins de 28 mois.
Dans la première, Lactobacillus GG, un mélange de quatre souches de probiotiques, et un placebo ont été donnés aux patients atteints de la DA suspectés d'être allergiques au lait de vache, pendant 4 semaines (14). Aucune différence n'a été montrée entre les groupes de traitement, immédiatement ou après 4 semaines de traitement, mais dans un sous-groupe [enfants sensibles à Plmmunoglobuline E (IgE)], le groupe Lactobacillus a montré une réduction statistiquement supérieure du .SCORAD par rapport au groupe placebo. Dans la seconde étude, L. fermentum et un placebo ont été administrés pendant 8 semaines (15). La réduction du SCORAD durant la période a été significative dans le groupe de probiotique mais non dans le groupe placebo.
Il faut noter que dans ces deux études, une réduction du SCORAD pour le groupe placebo a été observée (-20 et -10 points selon l'étude). L'observation plus précise des placebos utilisés pourrait apporter une explication à l'effet inhabituel du placebo dans le traitement de la DA. En effet, de la cellulose et de la maltodextrine ont été utilisés respectivement dans l'étude de Weston et al (15) et Viljanen et al (14). Les substances choisies pour le placebo sont toutes les deux des substances qui peuvent être considérées comme des prébiotiques. Ainsi, les résultats obtenus avec de tels 'placebos' dans ces études pourraient être similaires à ceux obtenus dans le groupe prébiotique de la présente étude. Ces résultats mettent aussi en lumière l'importance du choix d'un vrai placebo (et non un composé avec des propriétés prébiotiques) lors de la réalisation d'essais cliniques sur le DA avec des prébiotiques, probiotiques ou des symbiotiques. En conclusion, un composé symbiotique (L rhamnosus Lcr35 plus un prébiotique) est capable d'améliorer les manifestations de la dermatite atopique chez des enfants âgés de deux ans ou plus. L'importance de l'amélioration observée dans cette étude souligne l'intérêt des prébiotiques et des symbiotiques dans le traitement de la dermatite atopique.
Exemple 3 : Séquence signature de Lactobacillus rhamnosus Lcr35 L'identification a été réalisée par PCR puis séquençage du gène des ARN ribosomaux 16S et de la partie intergénique 16-23S. Le séquençage est un séquençage double brin (procédé LI-COR), suivi d'un alignement avec des séquences d'autres souches. Les résultats et la stratégie sont présentés dans les figures 1 et 2.
Résultats de l'analyse de la séquence de la partie 16S
Position : 16S
Longueur : 1320 paires de bases
Ambiguïté de lecture < 5%
Figure imgf000026_0001
Résultats de l'analyse de la séquence de la partie 16-23S
Position : 16-23S Longueur : 483 paires de bases Ambiguïté de lecture < 5%
Figure imgf000026_0002
La souche analysée appartient à la sous espèce Lactobacillus casei subsp rhamnosus. Le séquençage de la presque totalité du gène ribosomal 16S ne permet pas de différencier Lactobacillus casei subsp casei de Lactobacillus casei subsp rhamnosus aussi dénommé Lactobacillus rhamnosus.
La séquence signature de Lactobacillus casei subsp rhamnosus se situe dans la partie intergénique 16-23S. Exemple 4 : Comparatif entre le profil API de Lactobacillus rhamnosus Lcr35 et celui de Lactobacillus GG.
Les figures 3A et 3B présentent le profil métabolique API 50 CH des souches Lactobacillus rhamnosus LCR35 et Lactobacillus GG, pour des temps de 24 et 48 heures.
Le profil API 50 CH est une galerie " Recherche " permettant d'étudier le métabolisme de 49 sucres et adaptée à :
- l'identification des Bacillus avec le milieu API 50 CHB, en 48 heures environ,
- l'identification des Lactobacillus avec le milieu API 50 CHL, en 48 heures, - l'identification et le biotypage des entérobactéries avec le milieu API 50 CHE en 48 heures,
- toute autre application " recherche " d'étude du métabolisme des sucres. L'identification API (R) est bien connue de l'homme du métier.
II apparaît nettement que les deux souches Lactobacillus rhamnosus LCR35 et Lactobacillus GG n'ont pas exactement le même profil, notamment pour du lactose. Une différence de comportement in vitro vis-à-vis du métabolisme des sucres sous entend une différence de comportement in vivo.
Références :
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Claims

Revendications
1. Utilisation d'un produit comprenant une bactérie Lactobacillus rhamnosus, sous forme vivante, et de lactose, pour la fabrication d'un médicament ou d'un complément alimentaire pour traiter un patient atteint de dermatite atopique, où ladite bactérie est capable de fermenter le lactose.
2. Utilisation selon la revendication 1 , où le lactose est sous forme d'un milieu à base de lactose.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, où ladite bactérie est Lactobacillus rhamnosus Lcr35.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 , 2 et 3, où le produit est lyophilisé.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, où le. milieu à base de lactose contient de l'amidon de pomme de terre.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, où la bactérie a été cultivée précédemment sur ledit milieu pendant au moins 24 heures.
7. Utilisation selon la revendication 6, où la bactérie a été cultivée pendant au moins 48 heures sur ledit milieu.
8. Utilisation selon la revendication 6, où la bactérie a été cultivée pendant environ 72 heures sur ledit milieu.
9. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 où le patient est un être humain âgé de moins de 15 ans.
10. Utilisation selon la revendication 1 , 2 ou 9 où le patient est un être humain âgé de plus de deux ans.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 , 2, 9 et 10, où le patient présente une allergie au lactose.
12. -Utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, où le produit comprend une concentration de bactérie dans le milieu comprise entre 1x108 et 1x1010 unités formant colonies par ml_ ou par gramme de produit congelé ou sec.
13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, où le médicament ou le complément alimentaire comprend un nombre de bactéries égal ou supérieur à 1x108 germes par gramme.
14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, où le médicament ou le complément alimentaire comprend un nombre de bactéries compris entre à 1x108 et 1x1010 germes par gramme.
15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, où la durée de traitement est comprise entre 2 semaines et 1 an, de préférence entre 2 semaines et 6 mois.
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