WO2007018257A1

WO2007018257A1 - 大腸癌マーカー検出方法

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Publication number: WO2007018257A1
Application number: PCT/JP2006/315793
Authority: WO
Inventors: Shigeru Kanaoka
Original assignee: Hamamatsu Foundation for Science and Technology Promotion
Current assignee: Hamamatsu Foundation for Science and Technology Promotion
Priority date: 2005-08-10
Filing date: 2006-08-10
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2008-02-10
Also published as: JP4798514B2; EP1914318A4; EP1914318A1; JPWO2007018257A1; CN101233243A; US20090148840A1; CA2618650A1

Abstract

　ａ）糞便を採取し、凍結する工程、ｂ）凍結した糞便をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する工程、ｃ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する工程、ｄ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る工程、ｅ）得られたｃＤＮＡを増幅する工程、及びｆ）増幅されたｃＤＮＡを検出する工程を含む大腸癌及び大腸腺腫診断のための腫瘍マーカーの検出方法であって、上記腫瘍マーカーが、ＣＯＸ－２、ＳＮＡＩＬ及びＭＭＰ－７からなる群より選択される１以上の腫瘍マーカー（ただし、ＣＯＸ－２又はＭＭＰ－７のいずれかのみを除く）であることを特徴とする、腫瘍マーカーの検出方法。

Description

明細書

大腸癌マーカー検出方法

技術分野

[0001] 本発明は、大腸癌及び大腸腺腫診断のための COX— 2、 SNAIL及び MMP— 7 力もなる群より選択される 1以上の腫瘍マーカー（ただし、 COX— 2又は MMP— 7のいずれかのみを除く）の検出方法、及びこれらの腫瘍マーカーを含む大腸癌及び大腸腺腫診断用キットに関する。

背景技術

[0002] 大腸癌による死亡者力増加して!/、る。大腸癌による死亡者は、全ての癌による死亡者のうち男性においては第 4番目、女性においては第 2番目に多い癌である（199 9年度癌死統計)。また、 2015年の癌患者推計では、男女とも似に第一位になると推計されており、二次的な予防を含めた総合的な大腸癌対策が求められており、癌の集団検診は、最も効果的な方法の一つである。

[0003] 癌の集団検診 (mass screening)のためには、簡便かつ非侵襲性の検出方法であることが重要である。現在利用することができる唯一の非侵襲性の方法は、潜血の有無を調べる糞便検査、すなわち便潜血検査であり、大腸癌の集団検診の標準方法として広く用いられている。

[0004] しかし、便潜血検査は、糞便中にヘモグロビンが現れることが腫瘍に特異的なものではないことから、感度及び特異度が低く（感度 30〜90%、特異度 70〜98%)、そのため偽陰性や偽陽性が少な力ず存在するという欠点がある。

[0005] また、大腸癌の診断には、免疫学的便潜血法によるスクリーニングの後力又は同時に、全大腸内視鏡検査又は注腸検査と S状結腸内視鏡検査とが組み合わせて用いられており、多大な時間と労力が力かるという欠点がある。

[0006] 便潜血検査の代替法としては、糞便中の K ras、 p— 53、 APC遺伝子変異やマイクロサテライト不安定性を検出する等の DNAを用いた方法が報告されている (非特許文献 1〜4)。

[0007] これらの DNAを用いる方法は、非侵襲的で癌細胞の直接的変化を捉えることができる方法であり、特異度が高いという特徴を有し、将来性豊カな方法と考えられるが、従来技術である便潜血検査と比べると感度が低ぐまた、時間と労力もかなりかかるという欠点がある。

[0008] また、さらなる便潜血検査の代替法として、遺伝子発現をより直接的に検出するために、糞便中のタンパク質キナーゼ C (PKC)等の mRNAを検出する方法も開発されてヽる（非特許文献 5〜7)。

[0009] しかし、上記の RNAを用いる方法によっても、少量の糞便から簡便かつ効率的に R NAを抽出することができず、便潜血法を超える感度を得ることができな力つた。

[0010] PCR法を逆転写酵素反応 (RT)と組み合わせることによって、 RNAを定性的に、また定量的に検出する方法が知られている。この RT—PCR法は、微量分子を検出することができる感度の高さで、ノーザンプロット法に優り、また、手技の速さや容易さで i n situハイブリダィゼーシヨン法に優るものである。

[0011] しかし、 RNAは、 DNAに比べて不安定であり、かつ、全ての生物学的試料中に普遍的に存在し、極めて安定である RNA分解酵素 (RNase)による分解の危険性に常にさらされていることから、 RT— PCR法においても、 RNAの精製過程及び精製後にお!、ても、 RNaseが混入しな、ように厳密な管理が要求される。

[0012] したがって、糞便という生物学的に極めて粗製の試料から RNAを抽出する際には、 RNaseの影響を排除するために、予め細胞画分を分離する工程が必要とされていた。

[0013] したがって、極めて多量の微生物に由来する膨大な量の RNaseが存在する糞便中力も直接 RNAを検出することは、不可能であり、少なくとも微生物等に由来する外因性 RNase除去のために細胞画分の分離は、必須であると考えられてヽた。

[0014] 本発明者は、すでに、場合により凍結した生物学的試料を RNA分解酵素阻害剤の存在下に均質ィ匕することによって、大腸癌の診断に有用な腫瘍マーカーを糞便中から検出する方法を開発して、る (特許文献 1)。

[0015] 最近、便潜血法代替大腸癌スクリーニング法として、便の細胞画分の CD44バリアントの発現を調べる方法が開発されたが、その感度は約 68%にすぎず、便潜血法の感度 (約 75%)に及ばな、ものであった (非特許文献 8)。 [0016] 本発明者は、驚くべきことに、 COX— 2、 SNAIL及び MMP— 7からなる群より選択される 1以上の腫瘍マーカー（ただし、 COX- 2又は MMP— 7の!、ずれかのみを除く）を採用することによって、大腸癌及び大腸腺腫診断の感度、特異度及び臨床的有用度を改善することができることを発見し、本発明を完成させた。

特許文献 1： WO2004/083856A1

非特許文献 1 :シドランスキー等著（D. Sidransky, et al.)、サイエンス（Science)、第 2 56卷、 1992年 4月 3日、第 102頁〜第 105頁

非特許文献 2 :ドン等著（S.M.Dong, et al.)、ジャーナル'ォブ 'ザ ·ナショナル 'キャンサ^ ~ ·インスティテュート（Journal of the National Cancer Institute)、第 93卷、第 11号、 2001年 6月 11日、第 858頁〜第 865頁

非特許文献 3 :トラベルソ等著（G.Traverso, et al.)、ザ 'ニューイングランド 'ジャーナル 'ォブ 'メデイシン（The New England Journal of Medicine)、第 346卷、第 5号、 200 2年 1月 31日、第 311頁〜第 320頁

非特許文献 4 :トラベルソ等著（G.Traverso, et al.)、ザ'ランセット（The Lncet)、第 35 9卷、 2002年 2月 2日、第 403頁〜第 404頁）

非特許文献 5 :デビッドソン等著（L.A.Davidson, et al.)、カーシノジエネシス（Carcino genesis)、第 19卷、第 2号、 1998年、第 253頁〜第 257頁

非特許文献 6 :ァレキサンダー及びライハット等著（R.J.Alexander and R.F.Raicht)、ダイジエステイブ'デジ一ジス 'アンド'サイエンス（Digestive Diseases and Sciences)、第 43卷、第 12号、 1998年、第 2652頁〜第 2658頁

非特許文献 7 :ャマオ等著（T.Yamao et al.)、ガストロェンテロロジー（Gastroenterolo gy)、第 114卷、第 6号、 1998年、第 1198頁〜第 1205頁

非特許文献 8 :サイトウ著（Hiroshi Saito)、ジャパニーズ 'ジャーナル'ォブ 'キャンサ _ ·リサーチ（j_apanese Journal of Cancer Research)、第 87卷、第 10号、 1996年、第 1011頁〜 1024頁

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0017] したがって、本発明の目的は、大腸癌及び大腸腺腫診断のための COX— 2、 SN AIL及び MMP— 7からなる群より選択される 1以上の腫瘍マーカー（ただし、 COX 2又は MMP— 7の!、ずれかのみを除く）の検出方法、及びこれらの腫瘍マーカーを含む大腸癌及び大腸腺腫診断用キットを提供することにある。

より具体的には、本発明は、下記に関する。

1. 下記工程：

a)糞便を採取し、凍結する工程、

b)凍結した糞便を RNA分解酵素阻害剤の存在下で均質ィ匕し、懸濁物を調製するェ程、

c)得られた RN Aを抽出するための試料から、 RN Aを抽出する工程、

d)抽出された RNAを逆転写し、 cDNAを得る工程、

e)得られた cDNAを増幅する工程、及び

f)増幅された cDNAを検出する工程

を含む大腸癌及び大腸腺腫診断のための腫瘍マーカーの検出方法であって、上記腫瘍マーカーが、 COX— 2、 SNAIL及び MMP— 7からなる群より選択される 1 以上の腫瘍マーカー（ただし、 COX- 2又は MMP— 7の!、ずれかのみを除く）であることを特徴とする、

腫瘍マーカーの検出方法。

2.上記腫瘍マーカーが、 COX— 2と MMP— 7との組合せ、 COX— 2と SNAILと MMP— 7との組合せ、又は COX— 2と SNAILとの組合せである、上記 1記載の方法。

3.上記腫瘍マーカーが、 COX— 2と SNAILと MMP— 7との組合せであり、大腸癌が早期大腸癌である、大腸癌診断のための上記 1記載の方法。

4.下記手段：

a)糞便を採取し、凍結する手段、

b)凍結した糞便を RNA分解酵素阻害剤の存在下で均質ィ匕し、懸濁物を調製する手段、

c)得られた RNAを抽出するための試料から、 RNAを抽出する手段、

d)抽出された RNAを逆転写し、 cDNAを得る手段、 e)得られた cDNAを増幅する手段、及び

f)増幅された cDNAを検出する手段

を含む、大腸癌及び大腸腺腫診断のための腫瘍マーカーの検出キットであって、上記腫瘍マーカーが、 COX— 2、 SNAIL及び MMP— 7からなる群より選択される 1 以上の腫瘍マーカー（ただし、 COX- 2又は MMP— 7の!、ずれかのみを除く）であることを特徴とする、大腸癌及び大腸腺腫診断のための腫瘍マーカーの検出キット。

5.上記腫瘍マーカーが、 COX— 2と MMP— 7との組合せ、 COX— 2と SNAILと MMP— 7との組合せ、又は COX— 2と SNAILとの組合せである、上記 4記載の大腸癌及び大腸腺腫診断のための腫瘍マーカーの検出キット。

6.上記腫瘍マーカーが、 COX— 2と SNAILと MMP— 7との組合せであり、大腸癌が早期大腸癌である、上記 4記載の大腸癌及び大腸腺腫診断のための腫瘍マーカーの検出キット。

発明を実施するための最良の形態

[0019] 本発明の RNA分解酵素阻害剤としては、チォシアン酸グァ-ジン、アイソジェン（I sogene)、ウルトラスペック II (登録商標）（Ultraspec II)等が挙げられる。

[0020] 凍結方法は、任意の従来技術を用いることができ、好ましくは、液体窒素を用いる方法である。凍結温度は、保存温度は、ー1〜一 196°C、好ましくは、—20〜一 196

。C、好ましくは、—75〜— 196°C、より好ましくは、 110〜一 196°C、最も好ましくは一 196°Cである。

[0021] 凍結されたサンプルは、冷凍保存してもよい。保存温度は、 75〜― 196°C、好ましくは、 110〜一 196°C、より好ましくは— 196°Cである。保存期間は、 1日〜 10年

、好ましくは、 1日〜 3年、より好ましくは、 1日〜 1年である。

[0022] 本発明で用いられる腫瘍マーカーは、 COX— 2、 SNAIL及び MMP— 7からなる群より選択される 1以上の腫瘍マーカー（ただし、 COX- 2又は MMP— 7の!、ずれかのみを除く）である。

[0023] 好ましくは、上記腫瘍マーカーは、 COX—2と MMP— 7との組合せ、じ0 ー2と3

NAILと MMP— 7との組合せ、又は COX— 2と SNAILとの組合せである。

[0024] また、早期大腸癌及び大腸腺腫診断のためには、上記腫瘍マーカーは、 COX- 2 と SNAILと MMP— 7との組合せである。

[0025] COX—2は、ァラキドン酸をプロスタグランジン H2に変換する誘導酵素であり、 CO X— 2の発現が高まると、アポトーシスが阻害され、血管新生因子や浸潤時に必要とされる基質分解酵素が誘導される。 SNAILは、細胞間接着因子である E—力ドヘリンの負の転写調節因子であり、 SNAILの発現が高まると E—力ドヘリンの発現が低下し、細胞間の接着が低下し深部浸潤や転移に影響することが知られている。 MM P— 7は、マトリックスメタ口プロテアーゼの一種であり、癌の浸潤'転移に必要と考えられている。

[0026] 上記工程 d)〜f)は、 RT— PCR法と呼ばれるものであり、例えば、関谷剛男等編、 PCR法最前線、 1997年、共立出版、第 187頁〜第 196頁の記載にしたがって行うことができる。

[0027] 懸濁物力もの RNAの抽出は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、 RNea sy Mini Kit (QIAGEN)や RNA Extraction Kit (Pharmacia Biotech)のような市販のキットを用いることができる。

[0028] 本発明で逆転写とは、逆転写酵素（Reverse Transcriptase)を用いて RNAを相補的な DNA(cDNA)に転換することをいう。逆転写反応は、通常、バッファー、 MgCl

2 や KC1等の塩類、ジチオスレィトール（DTT)、プライマー、デォキシリボヌクレオチド類、 RNase阻害剤及び逆転写酵素を含む溶液を用いて行われる。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して試用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンノク質や界面活性剤等を添加することもできる。

[0029] 逆転写に続!、て行われる cDNAの増幅は、通常、 PCRが用いられる。 PCRの反応液は、通常、バッファー、 MgClや KC1等の塩類、プライマー、デォキシリボヌクレオ

2

チド類、及び耐熱性ポリメラーゼを含む。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して試用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質、ジメチルスルホキシドや界面活性剤等を添加することもできる。

[0030] cDNAの増幅は、 LAMP法（特許第 3313358号公報）や ICAN法（特開 2001—

136965)を用いることもできる。

[0031] 本発明でプライマーとは、 cDNA合成や核酸増幅の際の合成開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本鎖も使用することができる。プライマーが二本鎖である場合には、増幅反応に先立ち、一本鎖にすることが望ましい。プライマーは、公知の方法にしたがって合成することができ、また、生物から単離することもできる。

[0032] 逆転写反応に使用する逆転写酵素は、 RNAを cDNAに逆転写することができる酵素を意味する。逆転写酵素としては、 RAV (Rous associated virus)や AMV (Avian m yeloblastosis virus)等のレトロウイルス由来の逆転写酵素や、 MMLV (Moloney muri ne leukemia virus)等のマウスのレトロウイルス由来の逆転写酵素がある力これらに限定されるものではない。

[0033] PCRに用いる耐熱性ポリメラーゼとしては、 Taqポリメラーゼが挙げられる力これに限定されるものではない。

[0034] 増幅された DNAの検出方法としては、ァガロースゲルを用いる電気泳動を用いることができるが、これに限定されるものではない。

[0035] 本発明のキットには、本発明の方法を記載した指示書を含むこともできる。また、キットに含まれるものとして、逆転写酵素、 RNase阻害剤、 DNA合成酵素、各種デォキシヌクレオチド 3リン酸 (dNTPs)、各腫瘍マーカーに対する特異的プライマー、各腫瘍マーカーに対する陽性コントロール、 RNase ' DNaseを含まない蒸留水、蛍光' 目視検出用試薬などを挙げることができる。

実施例 1

[0036] 以下の実施例は、本発明を説明するものであるが、本発明を限定するものではない

[0037] 浜松医科大学第 1内科に精査 ·治療目的のために入院し、全大腸内視鏡によって大腸癌の存在が確認された患者、及び大腸に腫瘍又は炎症性変化のな、 (非大腸疾患）患者を対象とした。なお、すべての患者からインフォームドコンセントが得られている。

[0038] 糞便は、採便後可及的速やかに 5mlチューブに約 0. 5〜： Lgずつ分取し、液体窒素を用いて凍結させ、— 80°Cで保存した。また、比較対照のため、それぞれの試料にっ、て免疫学的便潜血検査法により便中のヒトヘモグロビン (Hb)を測定した。組織は、治療前に受けた内視鏡検査時に癌部と正常部の生検材料を液体窒素で凍結してから 80°Cで保存した。その後、ホモジナイザーとグァ-ジン塩とフエノールを用 V、てホモジナイズし、クロ口ホルムとエタノールで全 RNAを抽出した。

[0039] 得られた RNAの 1 μ gをリバ一スクリプト II (登録商標）（反応液量 20 μ 1、和光純薬）を用いて逆転写し cDN Αを得、その一部を Gene Taq (和光純薬）を用いて、ネステイド PCRによって増幅させた。得られた PCR増幅産物を、 4%ァガロースゲルを用いて電気泳動し、ェチジゥムブロマイドで染色した。

[0040] なお、用いたプライマーは、逆転写では、ランダムプライマーであり、 PCRでは、 C OX— 2、 SNAIL, MMP— 7ともに独自に設計したものを使用した。 PCRは、 3つの分子とも第 1ラウンドを 20サイクルで行い、第 2ラウンドでは COX— 2は 20サイクル、 S NAIL, MMP— 7の両者は 35サイクルで行った。

使用したプライマーを下記に示す。

< COX- 2>

フォワード 1： 5し CTGAAAACTCCAAACACAG- 3'

フォワード 2： 5 -GCACTACATACTTACCCACTTCAA-3'

リバース： 5し ATAGGAGAGGTTAGAGAAGGCT- 3'

< SNAIL >

フォワード、 1： 5 '-AGATGAGGACAGTGGGAAAGGCT-3

フォワード 2： 5'- CCTTCGTCCTTCTCCTCTACTTCA- 3'

リバース 1 ： 5し AGGTATGGAGAGGAAGAGGGAG- 3'

リパース 2 ： 5 '-GCACTGGTACTTCTTGACATCTGAG-3 '

< MMP- 7>

フォワード、 1： 5-ATGAGTGAGCTACAGTGGGAA-3 '

フォワード 2： 5 -TTAAACTCCCGCGTCATAGAA-3'

リバース 1 : 5— AAATGCAGGGGGATCTCTTTG— 3'

リバース 2 ： 5— TCGATCCACTGTAATATGCGG— 3 '

[0041] 結果

大腸癌 65例（早期癌 13例、進行癌 52例）と対照群 32例における糞便からの RT— PCI^ 5COX—2、 SNAIL及び MMP— 7の検出結果を比較対照として行った免疫学的便潜血検査の検出結果と比較した (表 1)。

C〇X- 2、 SNAIL及び MMP- 7アツセィと便潜血法との比較腫瘍マ一力一 COX-2 SNAIL MMP-7 COX-2又は SNAIL COX-2又は MMP-7 COX-2. SNAIL又は MMP-7 免疫学的便潜血法感度 87.7% (57/ 65) 49.2% (32/ 65) 65.6% (42/ 64) 87.7% (57 / 65) 90.8% (59 / 65) 90.8% (59 / 65) 73.0% (46/ 63)

95% CI 77.2- 94.5% 36.6- 61.9% 52.7-77.1% 77.2-94.5% 81.0-96.5% 81.0-96.5% 60.3-83.4%

P = 0.02 P = 0,02

特異度 00% (32/ 32) 100% (32/ 32) 100% (3 /31) 100% (32 / 32) 100% (31 /31) 100% (31 /31) 87.5% (28 / 32) 95% CI 91.1 - 100% 91. - 100% 90.8- 100% 91. - 100% 90.8 - 100% 90.8- 100% 71.0-96.5% 臨床的有用度 91.7% (89/97) 66.0% (64/ 97) 76.8% (73 / 95) 91.7% (89/97) 93.8% (90/ 96) 93.8% (90/ 96) 77.9% (74 / 95) 95% CI 84.4- 96.4% 55.7- 75.3% 67. - 84.9% 84.4-96.4% 86.9-97.7%* 86.9-97.7%* 68.2- 85.8%

P = 0.01 P = 0.01 P = 0.003 P = 0.003 腺腫 61.5% (8/13) 61.5% (8/13) 53.8% (7/ 13) 76.9% (10/13) 69.2% (9/13) 84.6% (11/13) 30.8% (4/ 3)

31.6-86.1% 31.6-86.1% 25.1-74.1% 46.2-95.0% 38.6-90.9% 54.6-98.1% 9.1-61.4%

P = 0.049

腺腫 0期癌 66.7% (10/15) 53.3% (8/15) 46.7% (7/ 15) 80.0% (12/15) 73.3% (11/15) 86.7% (13/15) 26.7% (4/15)

38.4-88.2% 26.6-78.7% 21.3-73.4% 51.9-95.7% 44.9-92.2% 59.5-98.3% 7.8-55.1%

P = 0.010 P = 0.028 P = 0.0032

腺腫 I期癌 73.1% (19/26) 50.0% (13/26) 50.0% (13/26) 80.8% (21/26) 76.9% (20/26) 84.6% (22/26) 36.0% (9/25)

52.2-88.4% 29.9-70.1% 29.9-70.1% 60.6-93.4% * 56.4-91.0% 65.1-95.6%* 18.0-57.5% P = 0.017 P = 0.0030 P:Q.007 P = 0.0010 腺腫 II期癌 83.6% (46/55) 47.3% (25/55) 64.8% (35/ 54) 87.3% (48/55) 87.3% (48/55) 90.9% (50/55) 60.4% (32/53)

71.2-92.2% 33.7-61.2% 50.6-77.3% 75.5-94.7%* 75.5-94.7% 80.0-97.0%* 46.0-73.5% P = 0.013 P = 0.0029 P = 0.0029 P = 0W049 腺腫と癌全体 83.3% (65/78) 48.7% (38/78) 63.6% (49/ 77) 85.9% (67/78) 87.2% (68/78) 89.7% (70/78) 65.8 (50/76)

73.1-90.8% 37.2-60.3% 51.9-74.3% 76.2-92.7% 77.7-93.7% 80.8-95.4%* 54.0-76.3% P = 0.020 P = 0.0063 P = 0.0032 P :0.00070 腺腫、癌全体と正常者の 88.2% (97/110) 70.9% (78/110) 80.6% (87/108) 90.0% (99/110) 90.8% (99/109) 92.7% (101/109) 72.2 (78/108) 臨床的有用度 80.6-93.6% * 61.5-79.2% 71.8-87.5% 82.8-94.9%* 83.8-95.5%* 86.0-96.8%* 62.8-80.4%

P = 0.0053 P = 0.0014 P = 0.00078 P = 0.00016

[0043] 大腸癌 65例における感度 (sensitivity)、特異度 (specificity)、臨床的有用度 (Accur acy;癌を癌、正常を正常と診断したことを意味する)は、 COX— 2では各々 87. 7% ( 57/65) , 100% (32/32) , 91. 7% (89,97)であり、 SNAILでは各々 49. 2% (32/65) , 100% (32/32) , 66. 0% (64,97)であり、 MMP— 7では各々 65. 6% (42/64) , 100% (31/31) , 76. 8% (73,95)であった。

[0044] 一方、比較対照として行った免疫学的便潜血検査では、感度 73. 0% (46/63)、特異度 87. 5% (28/32) ,臨床的有用度 77. 9% (74/95)であった。

[0045] SNAIL及び MMP— 7の!ヽずれか単独では、免疫学的便潜血検査と比べて感度、臨床的有用度において低い値であつたが、 COX— 2は感度、特異度、臨床的有用度の、ずれのパラメーターにお、ても免疫学的便潜血検査より高!、値を得た。しかし、表 1でも示したように統計学的に有意な差はなぐ COX— 2のいずれのパラメータ一の 95%信頼区間（95%CI)も、 COX— 2と免疫学的便潜血検査の間で重複していた。

[0046] ところが、 COX— 2が陰性であった例中 2例で MMP— 7が陽性であることから CO X— 2と MMP— 7の二つのマーカーの組合せにつ!ヽて検討すると、 COX- 2または MMP— 7のー方が陽性でぁる群（COX—2又はMMP— 7)では、感度が 90. 8% ( 59/65) ,臨床的有用度が 93. 8% (90Z96)であった。この結果、 COX— 2又は ΜΜΡ— 7群の感度、臨床的有用度は免疫学的便潜血検査に比し統計学的に有意差を認めた。また臨床的有用度においては 95%信頼区間が、 86. 9% - 97. 7%となり免疫学的便潜血検査の 95%信頼区間である 68. 2% -85. 8%と重複を認めなくなつた。同様に、 COX— 2、 SNAIL又は ΜΜΡ— 7のいずれかが陽性である群（C OX— 2、 SNAIL又は MMP— 7)と免疫学的便潜血検査群との間でも、感度に明らかな有意差があることを示した。さらに、臨床的有用度においても、 COX—2、 COX ー2又はSNAIL、 COX— 2又は MMP— 7、及び、 COX— 2、 SNAIL又は MMP— 7について、免疫学的便潜血検査に比べて統計学的に有意な差があることを示した

[0047] 次に、癌を臨床病期 0期から IV期に分類し、各症例を腺腫、腺腫から 0期の癌、腺腫から I期の癌 (腺腫、 0期及び I期の癌）、腺腫から II期の癌 (腺腫及び 0期〜 II期の癌）、腺腫から癌全体 (腺腫及び癌を含めた大腸腫瘍 (advanced neoplasia) )の 4つの群に分けて、各群ごとに感度の検討を行った。

[0048] その結果、 COX- 2単独であっても、腺腫から I期の癌、腺腫から II期の癌、腺腫から癌全体では感度が各々 73. 1%、 83. 6%、 83. 3%であり、免疫学的便潜血検査は同一の各群で 36. 0%、 60. 4%、 65. 8%であった。また、臨床的有用度が 88. 2 % (97Z110)、その 95%信頼区間は 80. 6%— 93. 6%であるのに対し、免疫学的便潜血検査の臨床的有用度は 72. 2% (78Z108)であり、その 95%信頼区間 62. 8% -80. 4%であった。

[0049] すなわち、 COX— 2単独であっても、腺腫から I期の癌、腺腫から II期の癌、腺腫から癌全体の各群で、免疫学的便潜血検査の感度と臨床的有用度を上回り、統計学的に有意差を認め、また、統計的に両者の 95%信頼区間は重複しないことを示した

[0050] また、 COX— 2が陰性の腺腫 5例のうち 1例で MMP— 7が陽性、腺腫 5例のうち 2 例が SNAIL陽性であることから、 COX— 2又は MMP— 7、 COX— 2又は SNAILと COX—2、 SNAIL, MMP— 7のいずれかを陽性とした場合についても検討した。

[0051] その結果、腺腫のみで、 COX— 2又は SNAILの感度が 76. 9% (10/13, 95% 信頼区間 46. 2% - 95. 0%)、 COX—2、 SNAIL, MMP— 7のいずれかを陽性した場合の感度が 84. 6% (11/13, 95%信頼区間 54. 6%— 98. 1%)と免疫学的便潜血検査の感度である 30. 8% (4/13, 95%信頼区間 9. 1%— 61. 4%)を共に大幅に上回った。また、腺腫から 0期、腺腫から I期、腺腫から II期の癌、及び腺腫と癌全体においても COX— 2又は SNAIL、 COX— 2又は MMP— 7、そして COX 2、 SNAIL, MMP— 7のいずれか陽性群で免疫学的便潜血検査と比し統計的に有意な差を認めた。さらに COX— 2又は MMP— 7において腺腫力 II期の癌で、 C OX— 2又は SNAILでは腺腫から I期で、そして COX— 2、 SNAIL, MMP— 7のいずれか陽性群では腺腫から 0期において 95%信頼区間で重複しない有意に高い感度を得ることができた。

[0052] つまり COX— 2、 SNAIL, MMP— 7の組合せは、内視鏡や手術などで根治可能である比較的早期の大腸腫瘍のスクリーニングに優れ、しかも特異度の高い非常に有用な検査法である。

産業上の利用可能性

本発明の方法は、特異度、感度及び臨床的有用性の高い新規大腸癌の非侵襲的スクリーニング方法として従来の便鮮血法の代替となりうるものであり、臨床的に極めて有用なものである。

Claims

請求の範囲

[1] 下記工程：

a)糞便を採取し、凍結する工程、

d)抽出された RNAを逆転写し、 cDNAを得る工程、

e)得られた cDNAを増幅する工程、及び

f)増幅された cDNAを検出する工程

腫瘍マーカーの検出方法。

[2] 上記腫瘍マーカーが、 COX—2と MMP— 7との組合せ、 COX—2と SNAILと M

MP— 7との組合せ、又は COX— 2と SNAILとの組合せである、請求項 1記載の方法。

[3] 上記腫瘍マーカーが、 COX— 2と SNAILと MMP— 7との組合せであり、大腸癌が早期大腸癌である、請求項 1記載の方法。

[4] 下記手段：

a)糞便を採取し、凍結する手段、

d)抽出された RNAを逆転写し、 cDNAを得る手段、

e)得られた cDNAを増幅する手段、及び

f)増幅された cDNAを検出する手段

[5] 上記腫瘍マーカーが、 COX—2と MMP— 7との組合せ、 COX—2と SNAILと M

MP— 7との組合せ、又は COX— 2と SNAILとの組合せである、請求項 4記載の大腸癌及び大腸腺腫診断のための腫瘍マーカーの検出キット。

[6] 上記腫瘍マーカーが、 COX— 2と SNAILと MMP— 7との組合せであり、大腸癌が早期大腸癌である、請求項 4記載の大腸癌及び大腸腺腫診断のための腫瘍マーカ一の検出キット。