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WO2007018169A1 - Ｒｎａ中のイノシン化部位の検出方法 - Google Patents

Ｒｎａ中のイノシン化部位の検出方法 Download PDF

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Publication number
WO2007018169A1
WO2007018169A1 PCT/JP2006/315581 JP2006315581W WO2007018169A1 WO 2007018169 A1 WO2007018169 A1 WO 2007018169A1 JP 2006315581 W JP2006315581 W JP 2006315581W WO 2007018169 A1 WO2007018169 A1 WO 2007018169A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
inosine
rna
site
cdna
chemically modified
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2006/315581
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tsutomu Suzuki
Masayuki Sakurai
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC filed Critical University of Tokyo NUC
Publication of WO2007018169A1 publication Critical patent/WO2007018169A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting an inosine site in RNA. More specifically, the present invention relates to a method for detecting an inosine site by chemically modifying the inosine site in RNA.
  • RNA editing causes a change from A to I and changes the amino acid sequence by changing the codons on the mRNA.
  • Double-stranded RNA adenosine deaminase acting on RNA (ADAR) is an enzyme that specifically recognizes the double-stranded part of RNA and converts adenosine residues into inosine.
  • ADAR Double-stranded RNA adenosine deaminase acting on RNA
  • the glutamate receptor subunit GluR-B mRNA is a substrate of ADAR2, adenosine in exon 11 is edited to inosine, and the amino acid sequence changes from glutamine to arginine.
  • ADAR2 knockout mice do not undergo this editing and therefore cannot control the calcium permeability of glutamate receptors, causing epilepsy symptoms and premature death.
  • ADAR is known to show a wide range of substrate recognition ability for double-stranded RNA.
  • the editing is in sight.
  • ADAR2 is known to be able to induce variable splicing by editing the intron position of its mRNA from A to I, and to feedback control the expression level of ADAR2.
  • RNA editing may be related to the acquisition of complex neural circuitry in the brain.
  • Diseases resulting from abnormal RNA editing have also been reported.
  • GluR2 glutamate receptor subunit protein
  • RNA amplified as cDNA
  • I forms a base pair with C
  • mRNA is also reverse transcribed.
  • G is incorporated into the I-corresponding site in the cDNA after PCR amplification. Therefore, the editing site is a mixture of G or A / G on the cDNA, despite its basic strength on the genome.
  • the present invention can be easily distinguished from noise and SNP, can be analyzed using RNA alone as an analysis sample, can be analyzed even with a small amount of sample, and the background is kept low. It is possible to detect the presence of inosine with high sensitivity, and to provide a method for detecting an inosine site in RNA.
  • the present inventors have chemically modified the inosine site by treating RNA with a compound having an ⁇ , j8-unsaturated bond and an electron-withdrawing group. As a result, it was found that an inosine site in RNA can be detected, and the present invention has been completed.
  • RNA has an ⁇ , ⁇ unsaturated bond and an electron-withdrawing group.
  • a method for detecting an inosine site comprising the step of chemically modifying the inosine site by treatment with a compound.
  • the method of the present invention further comprises a step of synthesizing cDNA by subjecting the chemically modified RNA to a reverse transcription reaction, and a step of detecting an inosine site based on the synthesized cDNA. including.
  • the detection of the inosine site is the detection of the presence or absence of an inosine site, the quantification of the amount of inosine, and the identification of the region or inosine site containing Z or inosine.
  • the compound having an ex, j8-unsaturated bond and an electron-withdrawing group is
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom, a alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a phenol group, or a phenyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R Either 1 or R 2 may combine with E to form a ring
  • R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a full group, or an alkoxyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the electron withdrawing group is CN, NO, SO H, CONH, COCH, COOCH,
  • COOC H COCH, COC H, or COC H.
  • the chemically-modified RNA is subjected to a reverse transcription reaction to synthesize cDNA, and then a cDNA amplification reaction is performed.
  • the inosinization site is detected by comparing a cDNA synthesized by subjecting RNA that has not been chemically modified to reverse transcription to a cDNA that has been chemically modified and synthesized by RNA.
  • the RNA is chemically modified by treating the RNA with an oc, ⁇ -unsaturated bond and an electron-withdrawing group, followed by chemical modification of the inosynthetic site, and then subjecting the chemically modified RNA to mass spectrometry. Detected inosine.
  • chemically modified inosine is detected by detecting the length of cDNA derived from the chemically modified RNA.
  • RNA is treated with a compound having an a, ⁇ unsaturated bond and an electron-withdrawing group. Then, after chemically modifying the inosinization site, the chemically modified inosine is detected by determining the base sequence of the chemically modified RNA or cDNA derived therefrom.
  • chemically modified inosine is detected by detecting cDNA derived from chemically modified RNA using a probe containing a sequence only upstream of the inosine synthesizing site of RNA.
  • the chemically modified inosine is detected by selectively extracting cDNA derived from chemically modified RNA and analyzing the sequence of the cDNA that has been stopped at the inosinization site.
  • an inosine moiety modifying agent in RNA comprising a compound having a,
  • a reagent kit for performing the above-described method of the present invention comprising the above-described modifying agent of the present invention.
  • the method for detecting an inosine site includes a step of chemically modifying an inosine site by treating RNA with a compound having an ⁇ , ⁇ -unsaturated bond and an electron-withdrawing group.
  • the type of RNA is not particularly limited and may be any of mRNA, rRNA, tRNA or non-coding (nc) RNA! /.
  • the method of the present invention it is possible to prove the presence of inosine in cDNA by detecting inosine-specific modification / inhibition of reverse transcription elongation, and it is also easy to distinguish between noise and SNP. is there. Furthermore, genomes are not required as analysis samples, and analysis can be performed with RNA alone, so even a small amount of valuable samples can be analyzed. For this reason, it is possible to identify an inosine site even if the gene structure such as a splice site or the coding region on the genome is unknown. In these respects, the method of the present invention is superior to the conventional matched-tissu method.
  • the knock ground can be kept very low, and there is an advantage that the presence of inosine can be detected and proved with high sensitivity.
  • detection in the method of the present invention is performed by a microarray. This makes it possible to comprehensively identify inosine sites in RNA in vivo.
  • the method of the present invention targets all RNA species and uses the inosine-specific chemical modification (Yoshida, M., et al.), which has been reported in the past, in that it uses the inhibition of reverse transcription strand elongation by inosine-specific chemical modification. Furuichi, Y "Ukita, T” and Kaziro, Y. (1967). The effect of cyan oetnylation on codon recognition of yeast tRNA containing inosine. Biochim Biophys Acta 149, 308-310).
  • RNA inosine-specific chemical modification
  • a reagent a, j8-unsaturated electron withdrawing group compound can be used.
  • the reaction mechanism basically proceeds by a mechanism called Michael addition (Fig. 3A).
  • the ⁇ -position carbon atom is positively charged due to the electron-withdrawing group of the modified reagent.
  • This carbon atom undergoes addition modification to inosine by electrophilic addition to the 1st nitrogen atom, which is the active amine of inosine.
  • the modifying reagent it is also possible to isolate an RNA molecule containing inosine specifically for the added functional group.
  • Examples of the compound having an a, ⁇ unsaturated bond and an electron-withdrawing group include:
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom, a alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a phenol group, or a phenyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R Either 1 or R 2 may combine with E to form a ring
  • R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a full group, or an alkoxyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • reverse transcription can be performed on RNA that has been chemically modified specifically for inosine.
  • C cytidine
  • reverse transcriptase reverse transcriptase
  • the reverse transcription reaction can be performed by a conventional method using a primer, chemically modified RNA ( ⁇ type), four kinds of dNTPs, reverse transcriptase and the like. That is, the reverse transcription reaction can be performed by mixing the above reagents in an appropriate reaction solution (for example, a buffer solution containing an appropriate salt) and incubating at a predetermined temperature for a fixed time.
  • an appropriate reaction solution for example, a buffer solution containing an appropriate salt
  • RNA is subjected to a reverse transcription reaction to synthesize cDNA and then a cDNA amplification reaction is performed.
  • reverse transcription and amplification can be performed by a series of operations using the RT-PCR method.
  • it can also be performed by transcription amplification using reverse cDNA-cRNA as a cage.
  • RNA is chemically modified, and RNA is subjected to the reverse transcription reaction to synthesize cDNA, which can be used for the control in the following detection step.
  • the presence or absence of chemical modification by inosine may be detected by mass spectrometry, or the reverse transcribed strand that is inhibited from elongation is detected and compared with the presence or absence of inosine chemical modification.
  • the inosine site in RNA may be detected.
  • the detection target information includes its length, base sequence, or amount.
  • the inosine site is chemically modified by treating RNA with a compound having an ⁇ , ⁇ unsaturated bond and an electron-withdrawing group, and then chemically modified.
  • chemically modified inosine sites can be detected.
  • the chemically modified RNA can be used as a sample! /, but preferably the chemically modified RNA is degraded to nucleosides with RNase and phosphatase. After that.
  • the RNase used here is not particularly limited as long as it can be decomposed to nucleoside.
  • NucleasePl can be used.
  • the phosphatase is not particularly limited, and the species of origin such as nocteria is not limited.
  • Bacterial Alkaline Phospatase derived from E. coli can be used.
  • RNA is treated with acrylonitrile as a modifier for the inosine site, and then degraded to nucleosides.
  • a nucleotide sample derived from non-chemically modified RNA and reduce the inosine peak (mZz 269) or the appearance of the cyanoethylated inosine peak (mZz 322) in liquid chromatography Z mass spectrometry (LCZMS)
  • LCZMS liquid chromatography Z mass spectrometry
  • the region containing inosine may be identified by using the chemically modified RNA as a sample.
  • the chemically modified RNA is fragmented with an appropriate RNase.
  • the RNase used here is not particularly limited as long as RNA can be fragmented to a length of several bases to about 100 bases, such as G-specific RNase T1.
  • RNA is treated with acrylonitrile as a modifier of the inosine site, and then decomposed into RNA fragments. Compare this sample with an RNA fragmentation sample derived from non-chemically modified RNA and reduce the peak of the fragment containing inosine or the peak of the fragment containing cyanoethylated inosine (LC) in liquid chromatography Z mass spectrometry (LCZMS).
  • LCZMS liquid chromatography Z mass spectrometry
  • chemical modification stops the reverse transcription strand specifically at the inosine site, and the 3 ′ end force of the primer used for reverse transcription is extended. It is possible to detect the inosinylated site from the degree or the like. According to this method, it is possible to detect the presence or absence of an inosine site, to quantify the amount of inosine, and to identify a region containing Z or inosine or an inosine sputum site.
  • a compound having an ⁇ , ⁇ unsaturated bond and an electron-withdrawing group by determining the base sequence of chemically modified RNA or cDNA derived therefrom. Can detect chemically modified inosine. In the presence of chemically modified inosine as described above, the reverse transcription reaction stops before the site of inosine and a short cDNA is generated. By determining the base sequence of this cDNA, it is possible to detect the inosine site where the extension of the cDNA has stopped. That is, according to this method, it is possible to detect the presence or absence of an inosine site, to quantify the amount of inosine, and to identify a region or inosine site containing Z or inosine.
  • cDNA derived from chemically modified RNA is detected by hybridization using a probe containing a sequence only upstream of the inosinization site of RNA.
  • inosine chemically modified by a compound having an a, j8-unsaturated bond and an electron-withdrawing group can be detected.
  • the reverse transcription product will stop at the site of elongation reactivity S inosine and complement the upstream sequence of the mRNA.
  • a short cDNA is generated that lacks.
  • cDNA derived from non-chemically modified RNA when used, cDNA derived from chemically modified RNA containing inosine does not react with probes containing sequences only upstream of the inosine site of RNA.
  • the cDNA reacted with the probe can be detected.
  • the site of inosine can be detected by the presence or absence of a signal.
  • This method may be performed in combination with a microarray.
  • the whole region force of the mRNA is also extended using a random primer.
  • This reverse transcription product stops at the site of elongation reaction inosinization and produces a short cDNA lacking a sequence complementary to the upstream sequence of mRNA.
  • cDNA derived from non-chemically modified RNA when used, cDNA derived from chemically modified RNA containing inosine does not react with probes containing sequences only upstream of the inosine site of RNA. Signals reacted with the probe can be detected from cDNA derived from. Thus, the inosine wrinkle site can be detected by the presence or absence of the signal or the decrease.
  • This cDNA may be amplified in some cases.
  • the probe it is possible to use a tiling array that covers the entire genome or a complementary sequence for a transcription product, or a primer set for quantitative PCR.
  • a, j8-unsaturated bond and electron-withdrawing property are obtained by detecting only the cDNA whose elongation is stopped at the inosine site, using chemically modified RNA as a saddle type. Inosine chemically modified by a compound having a group can be detected. For example, after chemical modification of mRNA, the random region is used to extend the whole region force of mRNA. At the beginning of this extension reaction, a reaction solution containing dNTPs is used. In reverse transcripts, the elongation reaction stops at the inosinization site, and a short cDNA is generated lacking a sequence complementary to the upstream sequence of mRNA.
  • the reverse transcript extension reaction proceeds smoothly and a long cDNA is generated. Then, in the middle of the extension reaction, replace dNTP with Didiox (dd) NTP, or add an excessive amount of ddNTP to dNTP. By this operation, ddNTP is incorporated into the 3 ′ end of the reverse transcript that was extended outside the inosine site, and the extension was stopped. In the resulting cDNA, the 3 'end of the cDNA stopped at the inosine site has a 3'-OH group. The 3' end of the cDNA extended outside the inosine site becomes a 3'-H group.
  • dd Didiox
  • a ddNTP derivative is used during the extension reaction. As a result, this derivative is present only in cDNA with a 3'-H group at the 3 'end. Subsequently, by using a carrier that specifically binds to this derivative, it is possible to remove the extended cDNA other than the inosine site from the cDNA population. Next, the cDNA stopped at the inosinization site remaining in the system is converted into double-stranded DNA. Second, the adapter DNA or RNA is ligated to the 3 'end of the cDNA using ligase.
  • the adapter was not ligated to the extended cDNA other than the inosine site having 3'-H group at the 3 'end, and as a result, at the inosinization site having 3'-OH group at the 3' end.
  • the adapter is only ligated to the stopped cDNA.
  • Double-stranded the cDNA using primers complementary to the adapter sequence.
  • the cDNA extended at a site other than the inosine site with 3'-H group at the 3 'end does not have a poly dN sequence added to the cDNA, and as a result, an inosine with a 3'-OH group at the 3' end.
  • Poly dN sequences are added only to cDNAs that are stopped at the anchor site.
  • the cDNA is then double-stranded using primers complementary to the poly dN sequence.
  • the double-stranded cDNA is amplified and the sequence thereof is analyzed.
  • this double-stranded cDNA can be controlled by adding a restriction enzyme recognition sequence to the 5 'end of the random primer during reverse transcription and the 5' end of the primer during double-stranded DNA synthesis.
  • Protruding ends can be created by degradation with a restriction enzyme.
  • a protruding end can be created at the end in a double-stranded DNA amplification step using PCR.
  • the sequence analysis can be carried out by incorporating double-stranded DNA with protruding ends into a cloning vector such as a plasmid.
  • a plurality of sequence analyzes can be performed at a time by linking double-stranded DNAs having protruding ends and incorporating them into a force-cloning vector.
  • An inosine site exists immediately upstream of the RNA corresponding to the finally detected sequence.
  • the present invention relates to a modifying agent that modifies inosine in RNA, and also to a reagent kit for detecting an inosine moiety containing the modifying agent.
  • the modifying agent that modifies inosine in RNA contains a compound having an a, j8-unsaturated bond and an electron-withdrawing group. Since “ ⁇ ,) 8-compound having an unsaturated bond and an electron-withdrawing group” is the same as the compound that can be used in the above method, the description thereof is omitted.
  • a reagent kit for detecting the inosine bud site can be designed according to the detection method.
  • Rnase or phosphatase can be combined in addition to the inosine modifying agent.
  • a reverse transcriptase for generating a reverse transcript or a buffer for reverse transcription as necessary may be combined. it can.
  • a set of reagents for base sequence determination can be combined with the inosine modifier.
  • a set of reagents for determining the base sequence for example, polymerase, dNTP, ddNTP, reaction buffer and the like can be mentioned as examples.
  • a probe based on the upstream sequence of RNA to be detected, a hybridization buffer, a washing solution, and the like can be combined in addition to the inosine modifier.
  • the probe set may be provided fixed to the microarray.
  • RNA fraction to be analyzed 10 ⁇ g is dissolved in 30 ⁇ 1 of CE buffer (41% ethanol, 1.1 M TE A-acetic acid (pH 8.6)), and then 15.2 M acrylonitrile (Tokyo Kasei) 4 1
  • CE buffer 41% ethanol, 1.1 M TE A-acetic acid (pH 8.6)
  • Tokyo Kasei 15.2 M acrylonitrile
  • CE- acrylonitrile
  • Example 2 Inosin that was specifically cyanoylated was confirmed by liquid chromatography / mass spectrometry (LC / MS method).
  • LC / MS method liquid chromatography / mass spectrometry
  • the inosine peak (m / z 269) observed with CE- decreased with the reaction time of cyanobacteria, but was not detected with CE- instead.
  • the peak of cyanoethylated pseudouridine (CE- ⁇ ) (m / z 298) also increased with the time of cyanoethylation, but the reaction rate was slow (Fig. 4B, C, D, F). About 60% of unreacted pseudouridine (m / z 245) was detected. Since no change was detected for other bases, this cyanoethyl reaction is inosine-specific.
  • Example 3 Detection of inosine by the primer extension method
  • Inosine-specific chemical modification reaction was performed on mouse brain total RNA according to the reaction procedure described in Example 1. 25 g of RNA after the reaction and 0.4 pmol of DNA primer labeled with 32 P at the 5 ′ end were dissolved in 51, incubated at 65 ° C. for 3 minutes, and then cooled to room temperature.
  • the DNA primer used here was designed downstream of the Q / R A-to-I RNA editing site in mouse glutamate receptor B mRNA (99% of A has been edited into inosine).
  • the nucleotide sequence is 5′-GATCTTGGCGAAATATCGCA TC-3 ′ (SEQ ID NO: 1).
  • Samples cooled to room temperature were ddATP, 0.5 mM DTT, 3 mM MgCl, 175 mM KCl, 50 mM Tris—HCl (pH 8) at the same concentration as 150 M dGTP, dCTP, dT TP.
  • Example 4 Detection of inosine by direct sequencing (Inosine Chemical Erasing method; ICE method)
  • Inosine-specific chemical modification reaction was performed on mouse brain total RNA according to the reaction procedure described in Example 1.
  • a forward primer and a reverse primer were designed to amplify 250 nt of the region centering on five A-to-I RNA editing sites in mouse serotonin receptor 2c (5HT2cR) mRNA.
  • the base sequence of the DNA primer used here is a forward primer; 5′-ATGGAGAAGAAACTGCACAATG-3 ′ (SEQ ID NO: 2), a reverse primer; 5-ATGATGGCCTTAGTCCGCGAAT-3 ′ (SEQ ID NO: 3). Both primers were mixed with 2.5 pmol each and mouse brain total RNA after reaction.
  • the total RNA amounts obtained here are respectively CE- (control without acrylonitrile) condition; 10 ng, CE + 15 min condition; 50 ng, CE + 30 min; 50 ng.
  • the mixed sample was subjected to RT-PCR using a Superscript III One-Step RT-PCR system with Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen) at a scale of 12.5 ⁇ 1. Reaction was reverse transcription; 55 ° C for 30 minutes, heat denaturation; after 94 ° C for 2 minutes, 38 cycles of 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 30 seconds were performed.
  • the reaction solution 51 was treated with ExoSAP-IT (Usb) to purify the mold.
  • the reverse transcribed strand extended from the reverse primer incorporates C into the inosine site and reaches the forward primer complementary site.
  • cyanobyl when cyanobyl is applied, the reverse transcription chain extension to the inosine-containing mRNA stops before the inosine site, does not reach the forward primer complementary site, and is not amplified by subsequent PCR.
  • Example 5 Detection of inosine by microarray (ICE-microarray method)
  • Microarray analysis was performed using human brain total RNA (CE ⁇ ) and (CE + 15min) prepared in Example 1. Oligo dT primer with T7 promoter sequence [T7 (dT) c
  • the reverse transcription reaction using DNA primer was requested from Hitachi Soft's DNA Chip Laboratory, and the company's AceGene Human Olig Chip 30K IChip version was used.
  • the company uses Amino Allyl Message Amp aRNA kit (Ambion) for reverse transcription to cDNA synthesis and aminoallyl-labeled aRNA (amplified RNA) transcription amplification.
  • the principle of this method is as follows.
  • the setting is made when a primer for reverse transcription is located downstream (3 ') of the inosine site and a probe on the array is designed upstream (5') of the inosine site.
  • the reverse transcribed strand extended from the reverse primer incorporates C into the inosine site and extends.
  • Example 6 Detection of inosine by real-time PCR
  • the reverse transcription reaction was performed using the random primer with the mouse brain total RNA (CE ⁇ ) and (CE + 15min) prepared in Example 1 as a saddle type.
  • CE- 500 ng of RNA, N9 random primer (5 and AGCAGAGGATTGACGACTACAGNNNNNNN NN-3 ') (SEQ ID NO: 4) with adapter sequence and reaction solution containing 250 ⁇ g and dNTP (20 ⁇ l final concentration 2 ⁇ )
  • a reaction solution 131 containing 1 was prepared.
  • a reaction solution containing 500 ng of RNA and 250 g of random primer and a reaction solution containing dNTP (final concentration 500 ⁇ on a 20 ⁇ 1 scale) 13 ⁇ 1 was prepared.
  • the reaction solution was heat denatured at 65 ° C for 2 minutes, and 0.1 M DTT 1 1, 40 U / ⁇ 1 RNaseOUT (Invitrogen 1 ⁇ ⁇ , 5x First strand buffer (Invitrogen, 250 mM Tris-HCl ( pH 8.3), 375 mM KC1, 15 mM MgCl) 4 ⁇ 1, 200 U / ⁇ 1 SuperScriptlll RT (
  • Invitrogen 1 1 was added and incubated at 25 ° C for 5 minutes, followed by an extension reaction at 50 ° C for 30 minutes. After the reaction, the enzyme was inactivated by incubation at 70 ° C for 15 minutes. To this reaction solution, 2 ⁇ l of IN NaOH was added and heated at 70 ° C for 10 minutes to degrade RNA, and then IN HC1 2 1, 1M Tris-HCl (pH 7.6) was added and neutralized.
  • 1st strand cDNA was purified using S-300 HR column (GE Healthcare) and QIA quick nucleotide removal kit (QIA GEN) in this order.
  • a reaction solution 201 containing dCTP, 400 U / ⁇ 1 terminal deoxynucleotidyl transferase (Roche) 1 ⁇ 1 was prepared. The reaction was carried out at 37 ° C for 15 minutes and incubated at 65 ° C for 10 minutes to inactivate the enzyme.
  • PCR was performed using 2 ⁇ 1 of the cDNA solution after the above reaction.
  • Primer complementary to dC-tail (5 and AGCAGAGGATTGACGACTACAGGGGGGGGGGGGGGHN-3,) (SEQ ID NO: 5) 2.5 pmol for amplification.
  • Primer (5'-AGCAGAGGATTGACGACTACAG-3,) (SEQ ID NO: 6) 2.5 pmol, 1 mM MgSO, 200 ⁇ M dNTPs, 1 U KOD-Plus (Toyo
  • lx KOD-Plus reaction buffer containing 50 ⁇ 1 was prepared. First, 94 ° C for 2 minutes 15 seconds, 50 ° C for 2 minutes, 68 ° C for 2 minutes, dsDNA synthesis, 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 90 seconds This cycle was performed 16 to 24 cycles. After confirming this amplified product by electrophoretic movement, the stage 1 or 2 cycles before the amplification reached the plateau was determined as the optimal cycle. The PCR product in this cycle was purified using the QIA quick PCR purification kit.
  • PCR was performed using 1 ⁇ 1 of the PCR reaction solution from the first round.
  • Primer for amplification (5'-AGCAGAGGATTGACGACTAC AG-3,) (SEQ ID NO: 7) 3 pmol, 1 mM MgSO, 200 ⁇ ⁇ dNTPs, 1U KOD- Plus (Toyobo ), 50 ⁇ 1 of reaction solution containing lx KOD-Plus reaction buffer was prepared.
  • the reaction was performed by heat denaturation at 94 ° C for 2 minutes, followed by 4 to 12 cycles of 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 90 seconds. After confirming this amplification product by electrophoresis, the stage before the cycle at which amplification reached a plateau was determined as the optimal cycle.
  • the PCR product in this cycle was purified using the QIA quick PCR purification kit.
  • the reaction was analyzed using SYBR Premix Ex Taq (Takara) and LightCycler 480 (Roche). The amplification was performed on a 20 ⁇ 1 scale using 4 pmol each of the forward primer and reverse primer of each primer set and 5 ng of the amplified and purified PCR product dsDNA.
  • Each primer sequence used is as follows.
  • MGluRBQRr-1050 (CAGTCACACTGACATTCATTCC) (SEQ ID NO: 8)
  • MGluRBQRf-1000 (ATGCTGTCCCTTACGTGAGTC) (SEQ ID NO: 9)
  • MGluRBQRr-750 GCATTCTTTGCCACCTTCATTC (SEQ ID NO: 10)
  • MGluRBQRr-300 CCGTAGTCCTCACAAACACAG
  • SEQ ID NO: 18 MGluRBQRf-250 (TGTGGACTTATATGAGGAGTGC)
  • SEQ ID NO: 19 MGluRBQRr-200 (GAGCCAGAGTCTAATGTTCCAT)
  • SEQ ID NO: 20 MGluRBQRf-150 (GAGGATCTGTCTAAGCAAACAG)
  • SEQ ID NO: 21) MGluRBQRr-100 GTCCTGTGTAGGATCGTGTGATGTGGGTGTC
  • SEQ ID NO: 23 MGluRBQRr-25 (GATCTTGGCGAAATATCGCATC)
  • SEQ ID NO: 24 MGluRBQRf + 25 (GTTTTCCTTGGGTGCCTTTATG)
  • SEQ ID NO: 25 MGluRBQRr + 5 (CATAAAGGCACCCAAGGAAAAC)
  • SEQ ID NO: 26 MGluRBQRTGATGARATAT +60 (TCACTACTTTGTGTTTC
  • M5HT2cRr-400 (TTTCTTCTTTCGACGTGGCTTC) (SEQ ID NO: 48)
  • M5HT2cRr-200 (CAACGGGATGAAGAATGCCAC) (SEQ ID NO: 52)
  • M5HT2cRf + 25 (TATCGCTGGACCGGTATGTAG) (SEQ ID NO: 57)
  • M5HT2cRr + l (CATACCGGTCCAGCGATATG) (SEQ ID NO: 58)
  • M5HT2cRf + 50 (TTTTCAACTGCGTCCATCATGC) (SEQ ID NO: 59)
  • M5HT2cRr + 150 (TGACAAGTAGTCCCACCAGC) (SEQ ID NO: 62)
  • M5HT2cRf + 200 (TCTTAATGTCCCTAGCCATTGC) (SEQ ID NO: 63)
  • M5HT2cRf + 300 (CCAGCACTTTCAATAGTCGTG) (SEQ ID NO: 65)
  • M5HT2cRr + 350 (CCACCATCGGAGGAATTAAAAG) (SEQ ID NO: 66)
  • M5HT2cRf + 400 (GTCCAGTAGCAGCTATAGTAAC) (SEQ ID NO: 67)
  • M5HT2cRr + 450 (CCAGGTTCACCATTATTGCTTC) (SEQ ID NO: 68)
  • M5HT2cRf + 500 (CCCAATTCTCAGTTTGAAACTGG) (SEQ ID NO: 69)
  • M5HT2cRr + 1000 (TTCTTCTTTGAAGGCCCCTAAC) (SEQ ID NO: 70)
  • M5HT2cRf + 1050 (TCTTCGTCCGCTTAGAATAGTG) (SEQ ID NO: 71)
  • T for the forward primer and "r" for the reverse primer are shown after the gene name.
  • the amplification region including the length of the primer was approximately 50 bp.
  • reverse transcription reaction is performed using a random primer with an adapter sequence added to the 5 'end using RNA as a saddle.
  • RNA untreated (CE-) RNA
  • 1st strand cDNA is generated equally over the entire region of RNA.
  • CE + chemically modified
  • the extension of cDNA stops just before the inosine site, so the amount of complementary cDNA just upstream of the inosin site is the same as the stopped cDNA amount. descend.
  • terminal deocynucleotidyl transferase (Roche) was used to attach a poly dC chain to the end of the cDNA, and this cDNA was doubled with a primer complementary to the adapter sequence and an oligo dG primer with the adapter sequence added. Perform chaining and PCR amplification. For the final product, the amount of cDNA in each region of RNA is compared between CE- and CE + using a tiling array probe or a primer set for real-time PCR that mimics a tiling array.
  • the signal intensity ratio of CE + / CE- decreases in the region containing the inosynthetic site or immediately upstream (5 'side), reflecting the amount of 1st strand cDNA in the CE + RNA stopped. Conceivable. In other words, when the signal intensity of CE + decreases compared to the signal intensity of CE-, it can be said that inosine exists near the quantified region!
  • mouse glutamate receptor B mRNA and the amount of cDNA in each region were comparatively quantified with CE- and CE + (Figs. 10 and 11).
  • the intensity ratio of CE + / CE- was taken, and a log with 2 as the base was calculated. Furthermore, correction was performed by subtracting the average of log values on the same mRNA from the log value in each region. The log value is shown on the vertical axis and the position of each region is shown on the horizontal axis. The graph also shows the values when the first PCR product was in a saddle shape and when the second PCR product was in a saddle shape.
  • inosine sites At present, most of the inosine sites, said to be more than 12000, have not been identified. Given that inosine is abundant in brain mRNA, it is thought to be associated with abnormalities in mental disorders (schizophrenia, panic syndrome, bipolar disorder, autism, etc.). If inosin fistula sites clearly associated with these diseases can be identified by the method of the present invention, very important knowledge can be obtained in elucidating the onset mechanism of the disease and considering a therapeutic method. In addition, it is possible to estimate the risk of developing lifestyle-related diseases and various diseases such as SNP by analyzing the fluctuations of the inosin cocoon site for each individual.
  • FIG. 1 shows detection of inosine by the matched-tissue method.
  • FIG. 2 shows the identification of inosine ⁇ site by inosine-specific cleavage (Morse, D. P., and Bass, BL (1997). Detection of inosine in messenger RNA by inosine-specin c cleavage. (Quoted from Biochemistry 36, 8429-8434).
  • FIG. 3 shows an inosine-specific chemical modification reagent.
  • FIG. 4 shows the detection of inosine after the cyanoethyl ester reaction by mass spectrometry.
  • FIG. 5 shows inosine detection by the primer extension method.
  • Figure 6 shows the principle of the ICE method.
  • FIG. 7 shows the detection of inosine by the ICE method.
  • FIG. 8 shows inosine detection by microarray.
  • FIG. 9 shows the detection results of mRNA containing inosine by microarray.
  • FIG. 10 shows the reverse transcription reaction using a random primer and the detection of inosine using a tiling array.
  • the gray area indicates the probe complementary area on the tiling array, and the amount of cDNA containing this area is measured by each probe.
  • the hatched triangle indicates the amount of probe that disappears due to chemical modification of inosine.
  • FIG. 11 shows the quantitative results of real-time PCR of cDNA after reverse transcription reaction with random primers. After reverse transcription using random primers, poly dC chain is added to cDNA, cDNA is double-stranded, mouse glutamate receptor B and serotonin receptor -2C in the product of the first PCR and second PCR Compared.

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Abstract

　本発明の目的は、ノイズやSNPとの判別が容易であり、解析サンプルとしてRNAのみで解析を行うことが可能であり、少量のサンプルでも解析可能であり、さらにバックグラウンドを低く抑えることが可能であり、イノシンの存在を高感度に検出することが可能である、ＲＮＡ中のイノシン化部位を検出する方法を提供することである。本発明によれば、ＲＮＡをα，β－不飽和結合と電子吸引性基とを有する化合物で処理することによってイノシン化部位を化学修飾する工程を含む、イノシン化部位の検出方法が提供される。

Description

明 細 書
RNA中のイノシンィ匕部位の検出方法
技術分野
[0001] 本発明は、 RNA中のイノシンィ匕部位の検出方法に関する。より詳細には、本発明 は、 RNA中のイノシンィ匕部位をィ匕学修飾することによって、該イノシン化部位を検出 する方法に関する。
背景技術
[0002] 脱ァミノ化（デアミネーシヨン）による修飾は、 RNAエディティングと呼ばれて 、る。 RN Aエディティングにより、 Aから Iへの変化が生じ、 mRNA上のコドンが変化することでァ ミノ酸配列の変化を引き起こす。二本鎖 RNAアデノシンデアミネース（ADAR； adenosi ne deaminase acting on RNA)は RNAの二本鎖部分を特異的に認識してアデノシン 残基をイノシンに変換する酵素である。哺乳動物には、 ADAR1、 ADAR2、 ADAR3の 3 種類のファミリーが存在する。グルタミン酸受容体のサブユニット GluR-Bの mRNAは、 ADAR2の基質であり、ェキソン 11番中のアデノシンがイノシンへとエディティングされ 、アミノ酸配列がグルタミンからアルギニンへと変化する。 ADAR2のノックアウトマウス はこのエディティングが生じな 、ため、グルタミン酸受容体のカルシウム透過性をコン トロールできず、てんかん症状を起こし、早期に死に至ることが知られている。 ADAR は二本鎖 RNAに対し幅広い基質認識能を示すことが知られ、 GluR-B以外にも、セロ ト-ンレセプター（5- HT2c)、カリウムチャンネル（Kvl.l)などで Aから Iへのエディティ ングが見つかつている。また、興味深いことに ADAR2は自身の mRNAのイントロン部 位を Aから Iにエディティングすることで、可変的スプライシングを誘導し、 ADAR2の発 現量をフィードバック制御して 、ることが知られて 、る。
[0003] ADARが高発現している脳 mRNAには 17000塩基に一度の頻度でイノシンが含ま れているとの見積もりがあり、ヒト mRNAには未知のエディティング部位が多量に存在 することが予測されていた。最近、バイオインフォマティクス的手法を用いた解析によ り、ヒト mRNAの UTRにおける Alu因子の反復配列に Aから Iへのエディティング候補部 位が大量に報告された。実験的に実証された例はこのうちのまだわずかであるが、 1 600遺伝子の 12000箇所以上の部位にイノシンが存在するという見積もりは、 Aから I へのエディティングが遺伝子のグロ一ノ レな発現制御に大きな役割を果たしているこ とを示唆している。 Alu因子を持っているのは霊長類だけであり、 ADARは脳で高発現 して ヽることを考え合わせると、 Aから Iへのエディティングによるトランスクリプトームの 複雑性増加は、高度に進化した脳の神経回路の複雑性の獲得と関連している可能 性がある。また、 RNAエディティング異常に起因する疾患も報告されている。悪性ダリ ォーマ (Malignant glioma)や筋萎縮性側索硬ィ匕症（Amyotrophic lateral sclerosis)で はグルタミン酸受容体のサブユニットタンパク質（GluR2)の Aから Iへのエディティング が顕著に減少している。このように、 mRNA中のイノシンは RNAに質的な変化を与える ものであり、高次生命現象と深く関わって 、る可能性が高 、。
[0004] Aから Iへの RNAエディティング部位（=1の存在部位）の検出法としてこれまで最も 一般的である手法が matched-tissue法である（図 1)。この方法は同一個体の同一組 織由来の RNA (cDNAとして増幅）とゲノムで相当する領域の配列を比較する方法で ある。 Iは Cと塩基対を形成するため、 mRNA力も逆転写 ' PCR増幅後の cDNA中の I相 当部位には Gが取り込まれる。よってエディティング部位ではゲノム上の塩基力 であ るにも関わらず、 cDNA上では Gもしくは A/Gの混在となっている。しかしこの方法では PCRの非特異増幅 ·ゲノム混入 ·シークェンスエラ一'ノイズ'対立遺伝子間の SNP (A1 lele SNP) 為遺伝子 ·遺伝子コピー'スプライスノ リアント等を原因とする偽シグナル による Gの混在と、 目的とするイノシン由来の Gの混在を判別することが難しい。また、 ェキソン境界領域や偽遺伝子の存在する領域の場合、 RNAに対応するゲノム領域を 判別することが困難であるためこの方法自体用いることができな 、。さらにこの方法で 特定されたイノシンィ匕部位は配列上 Gとして検出されるため、厳密にはイノシンの存 在を証明してはいない。また、同一個体由来のゲノムと RNAの両方を準備する必要 があるため、解析可能なサンプルも制限されてしまうと 、う難点も持つ。
[0005] また、これまでに分子生物学分野におけるイノシンの化学修飾法としては 2例の報 告がある。 1つは生体内 RNA中のイノシンィ匕部位同定を目的としたイノシン特異的切 断法で &)る (Morse, D. P. (2004). Iaentincation of substrates for adenosine deaminas es that act on RNA. Methods Mol Biol 265, 199-218 ;Morse, D. P., and Bass, B. L. (1997). Detection of inosine in messenger RNA by inosine- specific cleavage. Bioche mistry 36, 8429- 8434 ;及び Morse, D. P., and Bass, B. L. (1999). Long RNA hairpin s that contain inosine are present in Caenorhabditis elegans poly(A) + RNA. Proc Na tl Acad Sci U S A 96, 6048-6053) (図 2)。この手法は以下の 3ステップからなる。
[0006] (1)化学修飾試薬としてダリオキサールを用いて、 RNA鎖中のグアノシン (G)とイノシ ン (I)の塩基修飾を行う。 Gの場合、ダリオキサールは 1位及び N'2位に付カ卩して cis-ジ オールとなり、さらにホウ酸と化合物（図中 G*)される。一方イノシンの場合、 2位のアミ ノ基が存在しないためダリオキサールは 1位にのみ付加する。さらに付加した構造は 不安定であるため、容易に逆反応を起こして元のイノシンに戻る。
(2)ダリオキサール/ホウ酸処理後の RNAを Gとイノシンに特異的な RNase Tlにより切 断する。このとき Gが G*へと修飾されているために G部位では切断は起らない。一方 イノシンは修飾を受けて 、な ヽ（元に戻って 、る）ためイノシンィ匕部位での切断が起る 。結果としてイノシンィ匕部位特異的な切断が可能となる。
(3)切断後の RNA中の G*から付力卩物を取り除き、イノシンを含む側の RNAフラグメント にアンカー配列を取り付けてこの部位力も逆転写 · PCRを行 、、その配列を解析する
[0007] この方法で Morseらは数例の mRNA中のイノシン化部位を同定して!/、るが（Morse, D. P., and Bass, B. L. (1999). Long RNA hairpins that contain inosine are present in Caenorhabditis elegans poly(A) + RNA. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 6048-6053)、 その後の報告はな 、。この解析法の成功の鍵はダリオキサール/ホウ酸処理による G の RNase Tl非感受性修飾処理である。 RNAを構成する塩基の 1/4を占める Gを全て 修飾するのは困難であり、未修飾の Gが残存することは避けられない。さらに数千〜 数万塩基力 なる一本の mRNA中にイノシンは 0〜30塩基程度しか存在しな 、ほど微 量であり、未修飾の G部位の切断によるバックグラウンドが目的のイノシン化部位にお ける切断の検出を非常に困難なものにしている。そのため仮に候補部位が得られた 場合でも、 matched tissue法による確認が必要である。
[0008] また、イノシン特異的化学修飾は Yoshidaらにより報告されて!、る (Yoshida, M., Fur uichi, Y., Ukita, Τ·, ana aziro, Y. (1967). The effect of cyanoethylation on codon r ecognition of yeast tRNA containing inosine. Biochim Biophys Acta 149, 308-310)。 この解析法では酵母の転位 RNA (transfer RNA; tRNA)のアンチコドン部位（遺伝喑 号を規定する mRNA上のコドンと対号する）に存在するイノシンの機能解明を目的とし 、イノシンの 1位をアクリロニトリルを用いてシァノエチル化してコドン一アンチコドン対 形成を阻害してその効果を解析している。また反応効率は低いものの、シユードゥリ ジン (口)もシァノエチル化され (Yoshida, M., and Ukita, T. (1968). Modification of nu cleosides and nucleotides. 8. The reaction rates of pseudouridine residues with acryl onitrile and its relation to the secondary structure of transfer ribonucleic acid. Bioc him Biophys Acta 157, 466- 475)、 MengehJorgensenらはシァノエチル化によるシュ 一ドウリジンの分子量の変化を質量分析法により解析し、 tRNA上の位置を特定する 手法を報告している（MengehJorgensen, J., and Kirpekar, F. (2002). Detection of ps eudouridine and other modifications in tRNA by cyanoethylation and MALDI mass s pectrometry. Nucleic Acids Res 30, el35)。これらの手法は比較的豊富に存在する t RNAを解析対象とし、アンチコドンの不活性ィ匕の与える影響もしくはシァノエチルイ匕 による質量の変化を解析するものである。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明は、ノイズや SNPとの判別が容易であり、解析サンプルとして RNAのみで解 析を行うことが可能であり、少量のサンプルでも解析可能であり、さらにバックグラウン ドを低く抑えることが可能であり、イノシンの存在を高感度に検出することが可能であ る、 RNA中のイノシンィ匕部位を検出する方法を提供することを解決すべき課題とした 課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 RNAを α , j8—不 飽和結合と電子吸引性基とを有する化合物で処理することによってイノシンィ匕部位を 化学修飾することによって、 RNA中のイノシンィ匕部位を検出できることを見出し、本 発明を完成するに至った。
[0011] 即ち、本発明によれば、 RNAを α , β 不飽和結合と電子吸引性基とを有する化 合物で処理することによってイノシンィ匕部位をィ匕学修飾する工程を含む、イノシンィ匕 部位の検出方法が提供される。
[0012] 好ましくは、本発明の方法は、さらに、化学修飾された RNAを逆転写反応に供して cDNAを合成する工程、及び合成された cDNAに基づ 、てイノシンィ匕部位を検出す る工程を含む。
好ましくは、イノシンィ匕部位の検出は、イノシン化部位の有無の検出、イノシンの量 の定量、及び Z又はイノシンを含む領域又はイノシンィ匕部位の同定である。
[0013] 好ましくは、 ex , j8—不飽和結合と電子吸引性基とを有する化合物は、
式： C d^ I^^ C d^ E
(式中、 R1及び R2はそれぞれ独立に水素原子、炭素数 1から 6のアルキル基、フエ- ル基、又は炭素数 1から 6のアルコキシル基を有するフエ-ル基を示し、また R1及び R 2の何れか一方は Eと結合して環を形成してもよい。 R3は、水素原子、炭素数 1から 6 のアルキル基、フ -ル基、炭素数 1から 6のアルコキシル基を有するフ -ル基、又 は電子吸引性基を示す。 Eは電子吸引性基を示す。 )
で表される化合物である。
好ましくは、電子吸引性基は、 CN、 NO、 SO H、 CONH、 COCH、 COOCH、
2 3 2 3 3
COOC H、 COCH、 COC H、又は COC Hである。
2 5 3 2 5 6 5
[0014] 好ましくは、化学修飾された RNAを逆転写反応に供して cDNAを合成した後に、 c DNAの増幅反応を行う。
好ましくは、対照として化学修飾されていない RNAを逆転写反応に供して合成され た cDNAと化学修飾された RNA力 合成された cDNAとを比較することにより、イノシ ン化部位を検出する。
好ましくは、 RNAを oc , β 不飽和結合と電子吸引性基とを有する化合物で処理 することによってイノシン化部位をィ匕学修飾した後に、化学修飾された RNAを質量 分析に供することによって化学修飾されたイノシンを検出する。
好ましくは、化学修飾された RNAに由来する cDNAの長さを検出することによって 、化学修飾されたイノシンを検出する。
[0015] 好ましくは、 RNAを a , β 不飽和結合と電子吸引性基とを有する化合物で処理 することによってイノシン化部位をィ匕学修飾した後に、化学修飾された RNA又はそ れに由来する cDNAの塩基配列を決定することによって、化学修飾されたイノシンを 検出する。
好ましくは、化学修飾された RNAに由来する cDNAを、 RNAのイノシン化部位の 上流のみの配列を含むプローブを用いて検出することによって、化学修飾されたイノ シンを検出する。
好ましくは、化学修飾された RNAに由来する cDNAを、イノシン化部位で停止した cDNAを選択的に抽出してその配列を解析することによって、化学修飾されたイノシ ンを検出する。
[0016] 本発明の別の側面によれば、 a , |8—不飽和結合と電子吸引性基とを有する化合 物を含む、 RNA中のイノシンィ匕部位修飾剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の修飾剤を含む、上記した本 発明の方法を行うための試薬キットが提供される。
発明を実施するための最良の形態
[0017] 以下、本発明の実施の形態についてさらに詳細に説明する。
本発明によるイノシンィ匕部位の検出方法は、 RNAを α , β—不飽和結合と電子吸 引性基とを有する化合物で処理することによってイノシンィ匕部位をィ匕学修飾する工程 を含むことを特徴とする。本発明において RNAの種類は特に限定されず、 mRNA、 rRNA、 tRNA又はノンコーディング（nc) RNAの何れでもよ!/、。
[0018] 本発明の方法では、イノシン特異的な修飾 ·逆転写伸長阻害を検出することにより 、 cDNA中のイノシンの存在を証明することが可能であり、ノイズや SNPとの判別も容 易である。さらに解析サンプルとしてゲノムは必要なく RNAのみで解析が行えるため、 少量の貴重なサンプルでも解析可能である。この理由によりスプライス部位などの遺 伝子構造や、ゲノム上のコード領域が不明な場合でもイノシン化部位を特定すること が可能である。これらの点において、本発明の方法は、従来の matched-tissu法より 優れている。また、本発明の方法ではイノシン特異的な修飾を施すため、ノ ックグラ ゥンドを非常に低く抑えることが可能であり、イノシンの存在を高感度に検出'証明す ることができる利点を持つ。さらに本発明の方法における検出をマイクロアレイで行う ことにより、生体内 RNA中のイノシンィ匕部位を網羅的に特定することができる。さらに、 本発明の方法は、全 RNA種を対象とし、イノシン特異的な化学修飾による逆転写鎖 の伸長阻害を利用するという点において、従来報告されているイノシン特異的化学 修飾（Yoshida, M., Furuichi, Y" Ukita, T" and Kaziro, Y. (1967). The effect of cyan oetnylation on codon recognition of yeast tRNA containing inosine. Biochim Biophys Acta 149, 308- 310)とは区別されるものである。
[0019] 以下、本発明の方法を具体的に説明する。
[0020] ( 1)イノシン特異的化学修飾
本発明による方法では先ず、イノシン特異的な化学修飾を RNAに施す。試薬とし ては a , j8—不飽和 電子求引性基ィ匕合物を用いることができる。
[0021] 反応機構は基本的には Michael付加と呼ばれる機構 (図 3A)で進む。まず、修飾試 薬の電子求引性基の影響で β位の炭素原子が正電荷を帯びる。この炭素原子が、 イノシンの活性ァミンである 1位の窒素原子に求電子付加することにより、イノシンへ の付加修飾が進む。修飾試薬の選択によっては、付加官能基特異的にイノシンを含 む RNA分子を単離することも可能である。修飾試薬により適切な溶媒を選択して、反 応を行うことができる。以下に記載の実施例ではアクリロニトリル (CH =CHCN)を使用
2
している。アクリロニトリルの場合、同様にシユードウリジンも反応することが知られてい る力 これは反応時間を短縮することでほぼイノシン特異的な反応条件とすることが 可能である。
[0022] a , β 不飽和結合と電子吸引性基とを有する化合物としては、例えば、
式： C d^ I^^ C d^ E
(式中、 R1及び R2はそれぞれ独立に水素原子、炭素数 1から 6のアルキル基、フエ- ル基、又は炭素数 1から 6のアルコキシル基を有するフエ-ル基を示し、また R1及び R 2の何れか一方は Eと結合して環を形成してもよい。 R3は、水素原子、炭素数 1から 6 のアルキル基、フ -ル基、炭素数 1から 6のアルコキシル基を有するフ -ル基、又 は電子吸引性基を示す。 Eは電子吸引性基を示す。 )
で表される化合物を挙げることができる。上記化合物中の官能基の例、並びに上記 化合物の具体例は、図 3B及び図 3Cにそれぞれ示す。 [0023] 上記化合物の具体例としては、 CH =CHCN、 C H CH = CHCN、 CH CH = C
2 6 5 3
HCOCH、 CH CH = CHCOC H、 CH CH = C (CH ) COCH、 (CH3) C = CH
3 3 6 5 3 3 3 2
COCH、 CH CH = C (CH ) COC H、 CH =C (CH ) COC H、 CH =C (CH C
3 3 3 6 5 2 3 6 5 2 2
H ) COC H、 CH =CHCOOCH、 CH =C (CH ) COOCH、 CH OC H CH =
3 6 5 2 3 2 3 3 3 6 5
CHCOOCH CH、 CH OC H CH = CHCOOCH、 CH =COOCH CH、 CH
2 3 3 6 5 3 2 2 3 2
= COOCH、 CH =CONH、 CH =C (OCOCH ) CN、及び
3 2 2 2 3
[0024] [化 1]
Figure imgf000010_0001
[0025] などを挙げることができる。
[0026] (2)逆転写反応 (必要に応じて増幅）
本発明の方法では、イノシン特異的に化学修飾を施した RNAに対して逆転写反応 を行うことができる。化学修飾をしていない場合、逆転写酵素によりイノシンィ匕部位に 対してシチジン (C)が取り込まれる。一方、化学修飾をほどこした場合、この化学修飾 により Cの取り込みが阻害されて逆転写鎖の伸長はその手前で停止する。
[0027] 逆転写反応は、プライマー、化学修飾を施した RNA (铸型）、 4種の dNTP、逆転 写酵素などを用いて常法により行うことができる。即ち、逆転写反応は、上記の試薬 を適当な反応液 (例えば、適当な塩を含む緩衝液）中で混合して、所定の温度で一 定時間インキュベートすることにより行うことができる。
[0028] 本発明にお ヽては、化学修飾された RNAを逆転写反応に供して cDNAを合成し た後に、 cDNAの増幅反応を行うことが好ましい。この場合、逆転写反応と増幅反応 は、 RT—PCR法により一連の操作により行うことができる。あるいは逆転写後の cDN Aを铸型とした転写増幅により行うことも可能である。
[0029] また、逆転写反応では、化学修飾されて 、な 、RNAを逆転写反応に供して cDNA を合成し、これを以下の検出工程にぉ 、て対照用として用いることもできる。
[0030] (3)検出
検出においては、質量分析によりイノシンによる化学修飾の有無を検出してもよい し、あるいは、伸長阻害された逆転写鎖を検出し、イノシンィ匕学修飾の有無で比較す ることにより RNA中のイノシンィ匕部位を検出してもよい。この際、検出対象情報として は、その長さ、塩基配列、又は量などが挙げられる。
[0031] 検出の第一の態様としては、 RNAを α , β 不飽和結合と電子吸引性基とを有す る化合物で処理することによってイノシンィ匕部位をィ匕学修飾した後に、化学修飾され た RNAを質量分析に供することによって化学修飾されたイノシンィ匕部位を検出する ことができる。質量分析を行う場合、イノシンの有無及び総量を解析するには、化学 修飾後の RNAをサンプルとしてもよ!/、が、好ましくは化学修飾された RNAを RNaseとフ ォスファタ一ゼでヌクレオシドまで分解した後に行う。ここで用いる RNaseはヌクレオシ ドまで分解可能ならば特に限定はなぐ例えば、 NucleasePlなどを用いることができる 。フォスファターゼも特に限定はなぐノ クテリアなどの由来する生物種も限定はない 。例えば、大腸菌由来の Bacterial Alkaline Phospataseなどを用いることができる。
[0032] 例えば、アクリロニトリルをイノシン化部位の修飾剤として用いて RNAを処理し、その 後ヌクレオシドまで分解する。このサンプルを非化学修飾 RNA由来のヌクレオチドサ ンプルと比較して、液体クロマトグラフィー Z質量分析法 (LCZMS)におけるイノシ ンのピーク（mZz 269)の減少またはシァノエチル化イノシンのピーク（mZz 322 )の出現またはその増加によりイノシンィ匕部位の検出を行うことができる。
[0033] また、イノシンを含む領域の同定には、化学修飾後の RNAをサンプルとしても良い 力 好ましくは化学修飾された RNAを適当な RNaseにより断片化した後に行う。ここで 用いる RNaseは RNAを数塩基から 100塩基程度の長さに断片化可能ならば特に限定 はなぐ例えば G特異的 RNase T1などを用いることができる。
[0034] 例えば、アクリロニトリルをイノシン化部位の修飾剤として用いて RNAを処理し、その 後 RNA断片に分解する。このサンプルを非化学修飾 RNA由来の RNA断片化サンプ ルと比較して、液体クロマトグラフィー Z質量分析法 (LCZMS)におけるイノシンを含 む断片のピークの減少またはシァノエチル化イノシンを含む断片のピーク (イノシン一 箇所当たり 53の分子量増カロ）の出現またはその増加によりイノシンを含む領域の同 定を行うことができる。
[0035] この方法によれば、イノシンィ匕部位の有無の検出、イノシンの量の定量、及び Z又 はイノシンを含む領域の同定が可能である。 [0036] 検出の第二の態様としては、化学修飾された RNAの逆転写産物である cDNAある いはその増幅産物の長さを検出することによって α , β 不飽和結合と電子吸引性 基とを有する化合物によって化学修飾されたイノシンを検出することができる。 cDNA の長さは電気泳動など当業者に公知の常法により検出することができる。上述したよ うに化学修飾 (例えば、シァノエチルイ匕など）により逆転写鎖の伸長をイノシンィ匕部位 特異的に停止させ、逆転写に用いたプライマーの 3 '末端力 伸長した長さを電気泳 動の移動度等からイノシン化部位を検出することが可能である。この方法によれば、 イノシン化部位の有無の検出、イノシンの量の定量、及び Z又はイノシンを含む領域 又はイノシンィ匕部位の同定が可能である。
[0037] また、検出の第三の態様としては、化学修飾された RNA又はそれに由来する cDN Aの塩基配列を決定することによって α , β 不飽和結合と電子吸引性基とを有す る化合物によって化学修飾されたイノシンを検出することができる。上述のように化学 修飾されたイノシンが存在すると、逆転写反応はイノシン化部位の手前で停止し、短 い cDNAが生成される。この cDNAの塩基配列を決定することにより、 cDNAの伸長が 停止したイノシンィ匕部位を検出することができる。すなわち、この方法によれば、イノ シンィ匕部位の有無の検出、イノシンの量の定量、及び Z又はイノシンを含む領域又 はイノシンィ匕部位の同定が可能である。
[0038] さらに、検出の第四の態様としては、化学修飾された RNAに由来する cDNAを、 R NAのイノシン化部位の上流のみの配列を含むプローブを用いてハイブリダィゼーシ ヨンにより検出することによって、 a , j8—不飽和結合と電子吸引性基とを有する化合 物によって化学修飾されたイノシンを検出することができる。例えば、 mRNAをィ匕学修 飾した後にポリ Tのプライマーを用いて 3'末端力も伸長させると、逆転写産物には伸 長反応力 Sイノシンィ匕部位で停止し、 mRNAの上流配列に相補する配列を欠 、た短 ヽ cDNAが生成される。対照として、非化学修飾 RNAに由来する cDNAを用いると、イノ シンを含む化学修飾 RNAに由来する cDNAでは、 RNAのイノシン化部位の上流のみ の配列を含むプローブと反応しないが、非化学修飾 RNAに由来する cDNAでは該プ ローブと反応したシグナルを検出することができる。このようにシグナルの有無もしく は減少により、イノシンィ匕部位を検出することができる。また、プローブのデザインによ つては、イノシンィ匕部位を含む領域さらには位置を同定することも可能である。この方 法は、マイクロアレイと組み合わせて行ってもよい。もう一つの例として、 mRNAを化学 修飾した後にランダムプライマーを用いて mRNAの全領域力も伸長させる。この逆転 写産物では伸長反応力イノシン化部位で停止し、 mRNAの上流配列に相補する配 列を欠いた短い cDNAが生成される。対照として、非化学修飾 RNAに由来する cDN Aを用いると、イノシンを含む化学修飾 RNAに由来する cDNAでは、 RNAのイノシン化 部位の上流のみの配列を含むプローブと反応しないが、非化学修飾 RNAに由来す る cDNAでは該プローブと反応したシグナルを検出することができる。このようにシグ ナルの有無もしくは減少により、イノシンィ匕部位を検出することができる。この cDNAを 場合によっては増幅してもよい。また該プローブとしては、全ゲノム、もしくは転写産 物に対する相補配列を網羅したタイリングアレイや、定量 PCR用のプライマーセットを 用いることが可能である。
上記のように、この方法によれば、イノシンィ匕部位の有無の検出、イノシンの量の定 量、及び Z又はイノシンを含む領域の同定が可能である。
[0039] 検出の第五の態様としては、化学修飾された RNAを铸型とし、イノシンィ匕部位で伸 長が停止した cDNAのみを検出することによって、 a , j8—不飽和結合と電子吸引 性基とを有する化合物によって化学修飾されたイノシンを検出することができる。 例 えば、 mRNAを化学修飾した後にランダムプライマーを用いて mRNAの全領域力も伸 長させる。この伸長反応初期には dNTPを含む反応溶液を用いる。逆転写産物では 伸長反応がイノシン化部位で停止し、 mRNAの上流配列に相補する配列を欠 、た 短い cDNAが生成される。一方、イノシンィ匕部位以外では逆転写産物の伸長反応は 滞りなく進み、長い cDNAが生成される。続いて伸長反応の途中で dNTPをダイデォキ シ (dd)NTPに置換、もしくは dNTPに対して過剰量の ddNTPを添加する。この操作によ り、イノシンィ匕部位以外で伸長した逆転写産物の 3'末端には ddNTPが取り込まれるた め、その伸長が停止する。その結果生成される cDNAにおいて、イノシンィ匕部位で停 止した cDNAの 3'末端は 3'-OH基を持つ力 イノシン化部位以外で伸長した cDNAの 3 '末端は 3'- H基となる。
[0040] こうして得られた cDNAの集団から、イノシン化部位で停止した 3'末端に 3'-OH基を もつ cDNAのみを選別する。
[0041] その方法の例としては、第一に、伸長反応の途中で ddNTP派生体を用いる。この結 果、 3'末端に 3'-H基をもつ cDNAのみにこの派生体が存在する。続いてこの派生体 に特異的に結合する担体を用いることで、 cDNAの集団から、イノシンィ匕部位以外で 伸長した cDNAを除去することができる。次 、で系に残ったイノシン化部位で停止した cDNAを、二本鎖 DNA化する。第二に、 cDNAの 3'末端に、アダプター DNAもしくは RN Aをリガーゼにより連結する。この際に 3'末端に 3'-H基を持つイノシンィ匕部位以外で 伸長した cDNAにはアダプターが連結されな 、ために、結果として 3'末端に 3'-OH基 をもつイノシン化部位で停止した cDNAにのみアダプターが連結される。続!、てこの アダプター配列に相補的なプライマーを用いて、この cDNAを二本鎖化する。第三に 、 cDNAの 3'末端に、 Terminal deocynucleotidyl transferase活性をもつ酵素を用いる ことで、ポリ dA, dT, dC又は dG配列 (ポリ dN)のいずれかを付加する。この際に 3'末端 に 3'-H基を持つイノシンィ匕部位以外で伸長した cDNAにはポリ dN配列が付加されな V、ために、結果として 3'末端に 3'-OH基をもつイノシンィ匕部位で停止した cDNAにの みポリ dN配列が付加される。続、てこのポリ dN配列に相補的なプライマーを用いて、 この cDNAを二本鎖化する。
[0042] このようにして二本鎖化された cDNAを、場合によっては増幅し、その配列を解析す る。例えば、逆転写時のランダムプライマーの 5'末端側と、二本鎖 DNA合成時のブラ イマ一の 5'末端側に制限酵素認識配列を付加しておくことで、この二本鎖 cDNAを制 限酵素により分解して突出末端を作成することができる。もしくは PCRを用いた二本 鎖 DNA増幅段階で末端に突出末端を作成することができる。このようにして末端を突 出末端にした二本鎖 DNAをプラスミド等のクローユングベクターに組み込むことで、そ の配列解析を行うことができる。この際に効率ィ匕のため、突出末端を持つ二本鎖 DN A同士を連結させて力 クローユングベクターに組み込む方法により、複数の配列解 析を一度に行うことが可能である。最終的に検出された配列に相当する RNAのすぐ 上流側にイノシンィ匕部位が存在する。
[0043] 上記のように、この方法によれば、イノシン化部位の有無の検出、イノシンの量の定 量、及び Z又はイノシンを含む領域の同定が可能である。 [0044] 本発明は、 RNA中のイノシンを修飾する修飾剤、さらにはこれを含むイノシン化部 位検出用試薬キットに関する。
[0045] RNA中のイノシンを修飾する修飾剤は、 a , j8—不飽和結合と電子吸引性基とを 有する化合物を含有する。「《, )8—不飽和結合と電子吸引性基とを有する化合物」 については上記方法に使用し得る化合物と同様であることからその説明を省略する。
[0046] イノシンィ匕部位の検出用試薬キットは、検出手法に応じて、設計することができる。
たとえば、上記第一の検出手法のための試薬キットの場合には、上記イノシン修飾剤 に加えて、 Rnaseやフォスファターゼを組合せることできる。また、第二の検出手法の ための試薬キットとしては、上記イノシン修飾剤に加えて逆転写産物を生成するため の逆転写酵素や必要に応じて逆転写反応用緩衝液などを組合せることができる。第 三の検出手法のための試薬キットの場合には、上記イノシン修飾剤にカ卩えて、塩基 配列決定用の試薬一式を組み合わせることができる。塩基配列決定用の試薬一式と しては、例えば、ポリメラーゼ、 dNTP、 ddNTP、反応用緩衝液などを一例としてあげる ことができる。第四の検出手法のための試薬としては、上記イノシン修飾剤にカ卩えて 、検出したい RNAの上流配列に基づくプローブ（プローブセット）と、ハイブリダィゼー シヨン用の緩衝液、洗浄液などを組み合わせるができる。プローブセットについては、 マイクロアレイに固定ィ匕して提供してもよい。
[0047] 以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する力 本発明は実施例によつ て限定されるものではない。
実施例
[0048] 実施例 1：イノシン特異的化学修飾（1-シァノエチル化)反応
解析対象とする RNA画分 10 μ gを 30 μ 1の CEバッファー（41%エタノール， 1.1M TE A-酢酸（pH8.6》に溶解させた後、 15.2Mのアクリロニトリル (東京化成） 4 1を加え遮 光で 70°C 15分又は 30分反応させた。またコントロール (CE-)としてアクリロニトリルを 非添加条件でインキュベートしたサンプルも用意した。反応後のサンプルを氷上で急 冷し、 RNeasy MinElute Cleanup kit (QIAGEN)により精製した。さらに溶出液中の RN Aをエタノール沈殿 · 70%エタノールでリンスした後、凍結乾燥させた。
[0049] 実施例 2 : 特異的にシァノエチルイ匕されたイノシンを液体クロマトグラフィー/質量分析法（LC/ MS法)により確認した。サンプルには酵母カゝら抽出した total RNAを使用し、基本的に 実施例 1に記載した方法に従い反応した。ただし反応時間を 70°C 0分、 15分、 30分、 又は 60分とし、反応後の RNAは RNeasy MinElute Cleanup kitを使用せずそのままェ タノール沈殿 · 70%エタノールでリンスした後、凍結乾燥させた。続いて乾燥後の RN Aを、 Sakurai, M., Ontsuki, T., buzuki, T., and Watanabe, K. (2005). Unusual usage of wobble modifications in mitochondrial tRNAs of the nematode Ascaris suum. FEB S Lett 579, 2767— 2772に従って Nuclease PIと bacterial alkaline phosphataseを用い てヌクレオシドまで分解後、 LC/MS解析を行った。
[0050] その結果、 CE- (£yano£thyl化，図 4A)で観察されたイノシンのピーク (m/z 269)が シァノエチルイ匕の反応時間にともない減少し、代わりに CE-では検出されな力つたシ ァノエチル化イノシン (CE-I)(m/z 322)のピークが観察された (図 4B、 C、 D、 E)。また、 シァノエチル化シユードウリジン (CE-Ψ)のピーク（m/z 298)もシァノエチル化時間に 伴い増加していったがその反応速度は遅く (図 4B、 C、 D、 F)、 60分反応後も 6割程度 の未反応シユードウリジン (m/z 245)が検出された。これ以外の塩基については変化 が検出されな力つたことから、このシァノエチルイ匕反応はイノシン特異的であるといえ る。
[0051] 実施例 3 :プライマーエクステンション法によるイノシンの検出
実施例 1に記載された反応手順によりマウス脳 total RNAに対してイノシン特異的 化学修飾反応を行った。反応後の RNA25 gと、 5'末端を32 P標識した DNAプライマ 一 0.4pmolを 5 1に溶解し、 65°C3分インキュベート後、室温まで冷やした。ここで用 いた DNAプライマーはマウスグルタミン酸レセプター B mRNAにおける Q /R A-to-I RNAエディティング部位（Aの 99%がイノシンへとエディティングを受けている)に対し て下流に設計したものであり、その塩基配列は、 5'-GATCTTGGCGAAATATCGCA TC-3' (配列番号 1)である。室温まで冷却したサンプルを 150 M dGTP, dCTP, dT TPと同濃度の ddATP, 0.5mM DTT, 3mM MgCl , 175mM KCl, 50mM Tris— HCl (pH8
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.3), 100U Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen)を含む 10 μ 1溶揿中で 50 °C60分インキュベートした。 [0052] 反応後 2xLoading solution (7M urea, 0.05 %bromophenol blue, 0.05%xylene cyan ol, lx TBE)を 10 μ 1, 100%formamideを 20 μ 1加え、 95°C 5分ボイルした後、 10 1を 泳動に使用した。泳動は 15%polyacrylamide, 7M urea, ΙχΤΒΕのゲルで行った。
[0053] 未処理 (CE-)の total RNAの場合、イノシンィ匕部位に対して逆転写鎖に Cがとりこま れ、滞りなく伸長が進んだ [確認のため最初の U登場部位で ddATP (ダイデォキシ ATP )により伸長を止めている]。一方、シァノエチルイ匕した場合 (CE+)、図 5に示したように シァノエチルイノシン (CE-I)の 1—シァノエチル基により Cの取り込みが阻害されるた め、逆転写鎖の伸長はイノシンの一塩基手前で停止した。この結果から、シァノエチ ルイ匕により逆転写鎖の伸長をイノシン化部位特異的に停止させ、その伸長した長さ によりイノシンィ匕部位を同定することが可能であるといえる。
[0054] 実施例 4：ダイレクトシークェンシングによるイノシンの検出 (Inosine Chemical Erasing 法； ICE法）
実施例 1に記載された反応手順によりマウス脳 total RNAに対してイノシン特異的 化学修飾反応を行った。一方、マウスセロトニンレセプター 2c (5HT2cR) mRNAにお ける 5箇所の A-to-I RNAエディティング部位を中心とした領域 250ntを増幅するよう なフォワードプライマーとリバースプライマーを設計した。ここで用いた DNAプライマー の塩基配列は、フォワードプライマー; 5'- ATGGAGAAGAAACTGCACAATG- 3' (配 列番号 2) ,リバースプライマー； 5 -ATGATGGCCTTAGTCCGCGAAT-3' (配列番 号 3)である。両方のプライマーをそれぞれ 2.5pmolと、反応後のマウス脳 total RNAを 混合した。ここでカ卩えた total RNA量は、それぞれ、 CE- (アクリロニトリル無しの条件で のコントロール)条件； 10ng, CE+ 15min条件； 50ng, CE+ 30min; 50ngである。混合し たサンプルを 12.5 μ 1のスケールで Superscript III One-Step RT-PCR system with P latinum Taq DNA polymerase (Invitrogen)により RT- PCRを行った。反応は逆転写； 5 5°C30分，熱変性； 94°C2分後、 94°C15秒， 60°C30秒， 68°C30秒を 38サイクル行った。 反応溶液 5 1を ExoSAP- IT (Usb)により処理して铸型を精製した。続いて Big Dye Te rminator vl.lし ycle sequencing kit (Applied BiosystemsJを用 ヽ飞ン ~~クエンス反 J j を行い、 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems)により解析した。また、 比較のためゲノムに対するプライマーを設計し、 genomic PCRを行い同様にシークェ ンシングした。
[0055] この手法の原理は次のようである。まず未処理 (CE-)の total RNAの場合、リバース プライマーから伸長した逆転写鎖はイノシン化部位に対して Cをとりこみ、フォワード プライマー相補部位まで到達する。この 1st strand cDNAの PCR増幅産物センス鎖の イノシン相当部位にはイノシンを反映した Gが存在する (図 6A)。し力しシァノエチルイ匕 を施すとイノシンを含む mRNAに対する逆転写鎖の伸長はイノシンィ匕部位の手前で 止まり、フォワードプライマー相補部位まで到達せず、その後の PCRで増幅されない 。よってイノシンが部分的に混在している場合は PCR産物センス鎖の相当部位からィ ノシンを反映した Gは消失する (図 6B)。また、完全にイノシンへの置換が起きている 場合は、 PCRによる増幅全体が見られなくなる (図 6C)。
[0056] 実施例において（図 7)、マウス脳セロトニンレセプター 2c mRNAのゲノム配列と cD NA CE-配列を比較すると、 5箇所の A-to-I RNAエディティング部位において Iを反 映した Gが混在して!/、る。しかしこの混在して!/、る Gのピークはシァノエチル化反応の 進行に伴い特異的に消失し、 A単独のピークとなった。よって CE-と CE+の配列を比 較することにより、微量 RNA中のイノシンを検出することが可能である。この化学修飾 によりイノシン由来の Gを特異的に消失させる手法を、 Inosine Chemical Erasing( ICE 法)と称する。
[0057] 実施例 5：マイクロアレイによるイノシンの検出（ICE-マイクロアレイ法）
実施例 1で調整した Human brain total RNA (CE- )と (CE+ 15min)を用いてマイクロ アレイ解析を行った。 T7プロモーター配列を付カ卩したオリゴ dTプライマー [T7(dT) c
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DNA primer (Ambion) ]を用いた逆転写反応から先は日立ソフト 'DNAチップ研究所 に依頼し、同社の AceGene Human Olig Chip 30K IChip versionを用いて行った。同 社では逆転写から cDNA合成、アミノアリルラベル aRNA (amplified RNA)転写増幅に ついては Amino Allyl MessageAmp aRNA kit (Ambion)を使用している。
[0058] この手法の原理は以下の通りである。設定はイノシンィ匕部位の下流 (3')側に逆転写 用のプライマーが位置し、イノシンィ匕部位の上流 (5')側にアレイ上のプローブが設計 されている場合である。まず未処理 (CE-)の total RNAの場合、リバースプライマーか ら伸長した逆転写鎖はイノシンィ匕部位に対して Cをとりこみ伸長する。その後二本鎖 c DNAィ匕 · Τ7 RNA polymeraseによる aRNAの転写増幅'標識を経てアレイ上のプロ一 ブとハイブリダィズさせ、このアレイ上の aRNAの標識強度 (シグナル強度）を定量する (図 8A)。一方 CE+の場合、イノシンを含む mRNAに対する逆転写鎖の伸長はイノシン 化部位の手前で停止するため、短い逆転写鎖が合成される。合成された逆転写鎖の 長さはそのまま転写増幅を経て aRNAの長さに反映される (図 8B)。よってイノシン特異 的に停止した逆転写鎖に起因する短い aRNAは、アレイ上のプローブとの相補領域 を含まず、プローブとハイブリダィズできない。結果的にプローブ上の aRNAのシグナ ル強度は、イノシンィ匕部位の手前で逆転写鎖が停止した量を反映して減少すると考 えられる。すなわち、 CE-のシグナル強度と比較して、 CE+のシグナル強度が減少し た場合、そのアレイ上のプローブと逆転写プライマーの間の領域にイノシンが存在す るといえる。
[0059] 実施例においては上記アレイ上のプローブ設計位置の制約から、 日立ソフトの Ace Geneを用いた。プローブ設計位置と、本発明者らが ICE法により確認した A-to-I RN Aエディティング部位の情報から、アレイ上のプローブ位置と mRNA末端との間にイノ シンィ匕部位が存在する mRNA 68種を抽出した（図 9, X印一黒線)。この 68種とァレ ィ上の全遺伝子（図 9,口印-灰色線）について、 CE+の CE—に対するシグナル強度 比 [Log2(CE+/CE-)，グラフ中では横軸において負の方向に進むほど CE+のシグナ ルが減少したことを意味する]を解析したところ、 RNAエディティングを受ける mRNA 6 8種の分布が負の方向に偏り、その平均値は- 0.42とアレイ全遺伝子の平均値- 0.12 に対して優位なシグナル減少が得られた。よって本手法により mRNA中のイノシンの 存在が検出可能であることが示された。
[0060] 実施例 6：リアルタイム PCRによるイノシンの検出
実施例 1で調整した Mouse brain total RNA (CE-)と (CE+ 15min)を铸型としてランダ ムプライマーを用いて逆転写反応を行った。 CE-では RNA 500 ng,アダプター配列 を付カロした N9ランダムプライマー (5し AGCAGAGGATTGACGACTACAGNNNNNNN NN-3') (配列番号 4) 250 μ gを含む反応溶液と dNTP (20 1スケールで終濃度 2 μ Μ)を含む反応溶液 13 1を調製した。 CE+では RNA 500 ng,ランダムプライマー 25 0 gを含む反応溶液と dNTP (20 μ 1スケールで終濃度 500 μ Μ)を含む反応溶液 13 μ 1を調製した。反応溶液を 65°Cで 2分熱変性させた後、この溶液に 0.1 M DTT 1 1, 40 U/ ^ 1 RNaseOUT(Invitrogen 1 μ \, 5x First strand buffer (Invitrogen, 250 mM T ris-HCl (pH 8.3), 375 mM KC1, 15 mM MgCl )を 4 μ 1, 200 U/ μ 1 SuperScriptlll RT (
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Invitrogen) 1 1を加え 25°Cで 5分インキュベートした後、 50°Cで 30分伸長反応を行い 、反応後 70°C 15分インキュベートして酵素を失活させた。この反応溶液に IN NaOH を 2 μ 1カ卩えて 70°Cで 10分温めて RNAを分解した後、 IN HC1 2 1, 1M Tris- HCl (pH 7.6》 1 1カ卩えて中和した。
[0061] 続いて S- 300 HR column (GE Healthcare), QIA quick nucleotide removal kit (QIA GEN)をこの順に用いて、 1st strand cDNAを精製した。
[0062] 次に cDNAの 3'末端にポリ dC鎖を付カ卩した。得られた 1st strand cDNAを 11 μ 1に調 製し、 95°Cで 2分ボイルして急冷した後、ここに 5x TdT buffer (1 M potassium cacodyl ate, 125 mM Tris— HCl, 1.25 mg/ml BSA (pH 6.6》 4 1, 10 mM CoCl 2 ^ 1, 400 ^ M
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dCTP, 400 U/ μ 1 terminal deoxynucleotidyl transferase (Roche) 1 μ 1を含む反応溶 液 20 1を調整した。反応は 37°C 15分行い、 65°C 10分インキュベートして酵素を失 活させた。
[0063] 次に、得られた cDNA溶液を铸型として、 1回目の PCR増幅を行った。 PCRは上記 反応後の cDNA溶液 2 μ 1を使用して 5'末端にアダプター配列をもつ dC-tailに相補的 なプライマー (5し AGCAGAGGATTGACGACTACAGGGGGGGGGGGGGGHN- 3， ) (配列番号 5) 2.5 pmolと増幅用のプライマー (5'- AGCAGAGGATTGACGACTACAG -3，）（配列番号 6) 2.5pmolを、 1 mM MgSO , 200 ^ M dNTPs, 1 U KOD- Plus (Toyo
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bo), lx KOD- Plus reaction bufferを含む反応溶液 50 μ 1を調製した。反応は、まず 9 4°C 2分 15秒， 50°C 2分， 68°C 2分インキュベートして dsDNAを合成後， 94°C 15秒， 6 0°C 30秒， 68°C 90秒のサイクルを 16から 24サイクル行った。この増幅産物を電気泳 動で確認後、増幅がプラトーに達する 1,2サイクル前の段階を至適サイクルとした。こ のサイクルにおける PCR産物を QIA quick PCR purification kitを用いて精製した。
[0064] さらに上記 PCR産物を铸型として 2回目の PCR増幅を行った。 PCRは 1回目の PCR 反応溶液 1 μ 1を使用して、増幅用のプライマー (5'- AGCAGAGGATTGACGACTAC AG- 3，）（配列番号 7) 3 pmol, 1 mM MgSO , 200 μ Μ dNTPs, 1U KOD- Plus (Toyobo ), lx KOD-Plus reaction bufferを含む反応溶液 50 μ 1を調製した。反応は、まず 94°C 2分の熱変性後、 94°C 15秒， 60°C 30秒， 68°C 90秒のサイクルを 4から 12サイクル行 つた。この増幅産物を電気泳動で確認後、増幅がプラトーに達する 1,2サイクル前の 段階を至適サイクルとした。このサイクルにおける PCR産物を QIA quick PCR purificat ion kitを用いて精製した。
[0065] 最後に、 CE-と CE+のそれぞれの場合において、 1回目と 2回目の PCR産物を铸型と して、リアルタイム PCRによる cDNAの定量解析を行った。解析対象には、マウスのグ ルタミン酸レセプター B mRNAとセロト-ンレセプター 2c mRNAの全領域に対して間 隔を 50塩基ずつ空けて増幅長がおよそ 50塩基対になるように設計されたプライマー を用いて各領域における cDNA量を定量した。
[0066] 反応は SYBR Premix Ex Taq (Takara)を使用し、 LightCycler 480 (Roche)を用いて 解析した。各プライマーセットのフォワードプライマー，リバースプライマーそれぞれ 4 pmolと増幅'精製した PCR産物 dsDNA 5 ngを用いて 20 μ 1スケールで行った。反応 条件としては、 Denature;95°C 10秒， PCR(45サイクル)； 95°C 3秒 4.8°C/秒， 57°C 10 秒 2.5°C/秒， 72°C 6秒 4.8°C/秒 acquisition=single, Melting; 95°C 3秒 4.8°C/秒， 6 5°C 15秒 2.5°C/秒， 95°C acquisition=20point/°C, Cooling; 37°C 30分 2.0°C/秒の プロトコルで行った。使用した各プライマー配列は以下の通りである。
MGluRBQRr-1050 (CAGTCACACTGACATTCATTCC) (配列番号 8)
MGluRBQRf-1000 (ATGCTGTCCCTTACGTGAGTC) (配列番号 9)
MGluRBQRr-750 (GCATTCTTTGCCACCTTCATTC) (配列番号 10)
MGluRBQRf-700 (TGTTACAAGTCAAGGGCCGAG) (配列番号 11)
MGluRBQRr-550 (CAATTTGTCCAACAGGCCTTG) (配列番号 12)
MGluRBQRf-500 (TAACCTCGCAGTACTAAAACTG) (配列番号 13)
MGluRBQRr-450 (AATGAGGATCCTTTAGGTGTGG) (配列番号 14)
MGluRBQRf-400 (AACCTGGATTCCAAAGGCTAC) (配列番号 15)
MGluRBQRr-400 (ATGGTGTCGCAAGGCTTCCT) (配列番号 16)
MGluRBQRf-350 (CTGGAGTCCACAATGAATGAG) (配列番号 17)
MGluRBQRr-300 (CCGTAGTCCTCACAAACACAG) (配列番号 18) MGluRBQRf-250 (TGTGGACTTATATGAGGAGTGC) (配列番号 19) MGluRBQRr-200 (GAGCCAGAGTCTAATGTTCCAT) (配列番号 20) MGluRBQRf-150 (GAGGATCTGTCTAAGCAAACAG) (配列番号 21) MGluRBQRr-100 (TAGCCGTGTAGGAGGAGATG) (配列番号 22) MGluRBQRf-50 (AGGTGTGTGGTGGTTCTTTAC) (配列番号 23) MGluRBQRr-25 (GATCTTGGCGAAATATCGCATC) (配列番号 24) MGluRBQRf+25 (GTTTTCCTTGGGTGCCTTTATG) (配列番号 25) MGluRBQRr+5 (CATAAAGGCACCCAAGGAAAAC) (配列番号 26) MGluRBQRf+55 (AGTGAATCAACTAATGAATTTGGGA) (配列番号 27) MGluRBQRr+60 (TCACTACTTTGTGTTTCTCTTCC) (配列番号 28) MGluRBQRf+110 (AGTGGCACACTGAGGAATTTG) (配列番号 29) MGluRBQRr+150 (CCCAATGTAGGCAAACACAATG) (配列番号 30) MGluRBQRf+200 (TCCTTTAGCCTATGAGATCTGG) (配列番号 31) MGluRBQRr+250 (CATGATAGAGATTCCAAGGCTC) (配列番号 32) MGluRBQRf+300 (AGAGGTGATTGACTTCTCGAAG) (配列番号 33) MGluRBQRr+350 (TTCCCATATACAAGTTCTCCAAC) (配列番号 34) MGluRBQRf+400 (TGCAGACACCAAAATTTGGAATG) (配列番号 35) MGluRBQRr+450 (TGGCAATTTCTGCAGCTAAGTC) (配列番号 36) MGluRBQRf+500 (TGAAGGGAATGAGCGTTATGAG) (配列番号 37) MGluRBQRr+1000 (GGGCCGAAGTATACTTAATTGTC) (配列番号 38) MGluRBQRf+1050 (GAAAAGAATACCCTGGAGCAC) (配列番号 39) MGluRBQRr+1500 (CATAGACGCCTCTTGAAAACTG) (配列番号 40) MGluRBQRf+1550 (TTTCGCAGTCACCAATGCTTTC) (配列番号 41) M5HT2cRr-1550 (TACCACTATGTTTGGGGACAGA) (配列番号 42) M5HT2cRf-1500 (TGTTGTGTCGGTATTTTGCTGC) (配列番号 43) M5HT2cRr-1050 (CTGACCACATTAGAGGGATTGA) (配列番号 44) M5HT2cRf-1000 (GCAGGTAGAGAATTTAGAGCTG) (配列番号 45) M5HT2cRr-500 (GCACCACATGATCAGAAACACA) (配列番号 46) M5HT2cRf-450 (CTTCCAAAGTCCTTGGCATTG) (配列番号 47)
M5HT2cRr-400 (TTTCTTCTTTCGACGTGGCTTC) (配列番号 48)
M5HT2cRf-350 (AGAACGCTCCCAACCCCAAT) (配列番号 49)
M5HT2cRr-300 (TGATATTACGCAGTTCCTCCTC) (配列番号 50)
M5HT2cRf-250 (CGTCAAACCCTGATGTTACTTC) (配列番号 51)
M5HT2cRr-200 (CAACGGGATGAAGAATGCCAC) (配列番号 52)
M5HT2cRf-150 (GACCCGAACTTCGTTCTCATC) (配列番号 53)
M5HT2cRr-100 (CTCCTATTGATATTGCCCAAACG) (配列番号 54)
M5HT2cRf-50 (GGACTAAGGCCATCATGAAGAT) (配列番号 55)
M5HT2cRr-25 (GAATTGAACCGGCTATGCTCAA) (配列番号 56)
M5HT2cRf+25 (TATCGCTGGACCGGTATGTAG) (配列番号 57)
M5HT2cRr+l (CATACCGGTCCAGCGATATG) (配列番号 58)
M5HT2cRf+50 (TTTTCAACTGCGTCCATCATGC) (配列番号 59)
M5HT2cRr+50 (TGGACGCAGTTGAAAATAGCAC) (配列番号 60)
M5HT2cRf+100 (TTTGTGCCCCGTCTGGATTTC) (配列番号 61)
M5HT2cRr+150 (TGACAAGTAGTCCCACCAGC) (配列番号 62)
M5HT2cRf+200 (TCTTAATGTCCCTAGCCATTGC) (配列番号 63)
M5HT2cRr+250 (AGAATGTTGCCCCCTATTGTC) (配列番号 64)
M5HT2cRf+300 (CCAGCACTTTCAATAGTCGTG) (配列番号 65)
M5HT2cRr+350 (CCACCATCGGAGGAATTAAAAG) (配列番号 66)
M5HT2cRf+400 (GTCCAGTAGCAGCTATAGTAAC) (配列番号 67)
M5HT2cRr+450 (CCAGGTTCACCATTATTGCTTC) (配列番号 68)
M5HT2cRf+500 (CCCAATTCTCAGTTTGAAACTGG) (配列番号 69)
M5HT2cRr+1000 (TTCTTCTTTGAAGGCCCCTAAC) (配列番号 70)
M5HT2cRf+1050 (TCTTCGTCCGCTTAGAATAGTG) (配列番号 71)
フォワードプライマーには T,リバースプライマーには" r"をプライマー名の遺伝子 名の後に示した。 Iの存在する、 GluR-Bの Q to R部位、 5HT2cRの最も上流のエディ ティング部位をそれぞれ +1位として、 mRNA上の増幅領域を設定し、プライマー名の 末尾に示した。負の方向に向かうほど mRNAの 3'末端に近い。プライマーの長さを含 めた増幅領域はおよそ 50bpとした。
[0068] この手法の原理は以下の通りである。
まず RNAを铸型として、 5'末端にアダプター配列を付加したランダムプライマーを用 いて逆転写反応を行う。この際、未処理 (CE-)の RNAの場合、 1st strand cDNAは RN Aの全領域に対して均等に生成される。一方、化学修飾処理を施した (CE+)場合、ィ ノシンィ匕部位の手前で cDNAの伸長が停止するため、イノシンィ匕部位のすぐ上流側 に相補的な cDNA量は、停止した cDNA量と同じだけ低下する。続いて Terminal deoc ynucleotidyl transferase (Roche)を用いて cDNAの末端にポリ dC鎖を付カ卩し、この cDN Aを、アダプター配列に相補的なプライマーと、アダプター配列を付加したオリゴ dG プライマーにより二本鎖化と PCRによる増幅を行う。最終的に得られた産物につ 、て 、タイリングアレイプローブもしくはタイリングアレイを模倣したリアルタイム PCR用のプ ライマーセットにより、 RNAの各領域における cDNA量を CE-と CE+で比較する。その 結果、 CE+の RNAにおける 1st strand cDNAが停止した量を反映して、イノシン化部 位を含む領域もしくはすぐ上流 (5'側)の領域で CE+/CE-のシグナル強度比が減少す ると考えられる。すなわち、 CE-のシグナル強度と比較して、 CE+のシグナル強度が 減少した場合、その定量した領域の近傍にイノシンが存在すると!/ヽえる。
[0069] 実施例において、マウスのグルタミン酸レセプター B mRNA及び各領域における cD NA量を CE-と CE+で比較定量した（図 10、図 11)。
[0070] リアルタイム PCRで得られたシグナル強度において、 CE+/CE-の強度比をとり、そ の 2を底とするログを算出した。さらに同一 mRNA上におけるログ値の平均を、各領域 におけるログ値から引いて補正を行った。このログ値を縦軸に、横軸に各領域の位置 を示した。また、グラフには 1回目の PCR産物を铸型とした場合と、 2回目の PCR産物 を铸型とした場合の値を示した。
[0071] グルタミン酸レセプター Bにおいては、 -400-450と、 -500#-550領域の間に R to G 部位として知られる 40%程のイノシンィ匕部位と、 +1位に Q to R部位として知られるほぼ 100%のイノシンィ匕部位が存在する。グラフでは、 R to G部位の最も近い上流領域の- 400#450領域及び、 +1位を含む +25#-25領域において、シグナル強度比の減少のピ ークが得られた。また、この減少度合いは、 5'上流に行くにしたがって小さくなつてい つた。また、その減少の大きさは、それぞれのイノシン化部位の効率に比例して、 R to G部位 (40%)では- 1程度、 Q to R部位 (100%)では- 2.8程度まで低下した。
[0072] 一方、セロトニンレセプター 2Cにおいては、 +1, +3, +7, +8, +13位に、 10から 80%の イノシン化部位が存在する。グラフでは、これらの部位を含む +25#-25領域において シグナル強度比の減少のピークが得られた。これらの結果から、この手法により、シグ ナル強度比が著しく減少する領域内もしくはその 3'末端近傍にイノシンィ匕部位の存 在を検出可能であることが示された。本技術はタイリングアレイに応用可能である。 産業上の利用可能性
[0073] 12000箇所以上とも言われるイノシン化部位は、現状では、その大部分が同定され ていない。イノシンは脳の mRNAに大量に存在することを考えると、精神疾患 (統合 失調症、パニック症候群、双極性障害、自閉症など)の異常と関連があると考えられ る。これらの疾患と明確に関連するイノシンィ匕部位を本発明の方法によって同定する ことができれば、疾患の発症機構の解明や治療法を考える上で非常に重要な知見を 得ることができる。また、個体ごとにイノシンィ匕部位の変動解析を行うことで、 SNPのよ うに生活習慣病や様々な疾患の発症リスクを見積もることが可能になる。
図面の簡単な説明
[0074] [図 1]図 1は、 matched-tissue法によるイノシンの検出を示す。
[図 2]図 2は、イノシン特異的切断法によるイノシンィ匕部位の同定を示す (Morse, D. P ., and Bass, B. L. (1997). Detection of inosine in messenger RNA by inosine- specin c cleavage. Biochemistry 36, 8429- 8434より引用）。
[図 3]図 3は、イノシン特異的化学修飾試薬を示す。
[図 4]図 4は、質量分析法によるシァノエチルイ匕反応後のイノシンの検出を示す。
[図 5]図 5は、プライマーエクステンション法によるイノシンの検出を示す。
[図 6]図 6は、 ICE法の原理を示す。
[図 7]図 7は、 ICE法によるイノシンの検出を示す。
[図 8]図 8は、マイクロアレイによるイノシンの検出を示す。
[図 9]図 9は、マイクロアレイによるイノシンを含む mRNAの検出結果を示す。 [図 10]図 10は、ランダムプライマーによる逆転写反応とタイリングアレイによるイノシン の検出を示す。灰色の領域はタイリングアレイ上のプローブ相補領域を示し、この領 域を含む cDNAの量が各プローブにより測定される。斜線の三角形はイノシンの化学 修飾により消失するプローブ量を示している。
[図 11]図 11は、ランダムプライマーによる逆転写反応後の cDNAのリアルタイム PCR による定量結果を示す。ランダムプライマーを用いて逆転写後、 cDNAにポリ dC鎖を 付加、 cDNAを二本鎖化後、 1回目の PCRと 2回目の PCRによる産物中のマウスグルタ ミン酸レセプター Bとセロト-ンレセプタ -2Cを比較した。

Claims

請求の範囲
[1] RNAを oc , β 不飽和結合と電子吸引性基とを有する化合物で処理することによつ てイノシンィ匕部位をィ匕学修飾する工程を含む、イノシンィ匕部位の検出方法。
[2] さらに、化学修飾された RNAを逆転写反応に供して cDNAを合成する工程、及び合 成された cDNAに基づ 、てイノシンィ匕部位を検出する工程を含む、請求項 1に記載 の方法。
[3] イノシン化部位の検出力 イノシン化部位の有無の検出、イノシンの量の定量、及び Z又はイノシンを含む領域又はイノシンィ匕部位の同定である、請求項 1又は 2に記載 の方法。
[4] a , |8—不飽和結合と電子吸引性基とを有する化合物が、
式： cd^ i^^cd^ E
(式中、 R1及び R2はそれぞれ独立に水素原子、炭素数 1から 6のアルキル基、フエ- ル基、又は炭素数 1から 6のアルコキシル基を有するフエ-ル基を示し、また R1及び R 2の何れか一方は Eと結合して環を形成してもよい。 R3は、水素原子、炭素数 1から 6 のアルキル基、フ -ル基、炭素数 1から 6のアルコキシル基を有するフ -ル基、又 は電子吸引性基を示す。 Eは電子吸引性基を示す。 )
で表される化合物である、請求項 1から 3の何れかに記載の方法。
[5] 電子吸引性基が、 CN、 NO、 SO H、 CONH、 COCH、 COOCH、 COOC H、
2 3 2 3 3 2 5
COCH、 COC H、又は COC Hである、請求項 4に記載の方法。
3 2 5 6 5
[6] 化学修飾された RNAを逆転写反応に供して cDNAを合成した後に、 cDNAの増幅 反応を行う、請求項 1から 5の何れかに記載の方法。
[7] 対照として化学修飾されて ヽな 、RNAを逆転写反応に供して合成された cDNAと 化学修飾された RNAから合成された cDNAとを比較することにより、イノシンィ匕部位を 検出する、請求項 2から 6の何れかに記載の方法。
[8] RNAを oc , β 不飽和結合と電子吸引性基とを有する化合物で処理することによつ てイノシンィ匕部位をィ匕学修飾した後に、化学修飾された RNAを質量分析に供するこ とによって化学修飾されたイノシンを検出する、請求項 1、 3、 4または 5の何れかに記 載の方法。
[9] 化学修飾された RNAに由来する cDNAの長さを検出することによって、化学修飾さ れたイノシンを検出する、請求項 2から 7の何れかに記載の方法。
[10] RNAを a , β 不飽和結合と電子吸引性基とを有する化合物で処理することによつ てイノシンィ匕部位をィ匕学修飾した後に、化学修飾された RNA又はそれに由来する c
DNAの塩基配列を決定することによって、化学修飾されたイノシンを検出する、請求 項 1から 7の何れかに記載の方法。
[11] 化学修飾された RNAに由来する cDNAを、 RNAのイノシン化部位の上流のみの配 列を含むプローブを用いて検出することによって、化学修飾されたイノシンを検出す る、請求項 2から 7の何れかに記載の方法。
[12] 化学修飾された RNAに由来する cDNAを、イノシンィ匕部位で停止した cDNAを選択 的に抽出してその配列を解析することによって、化学修飾されたイノシンを検出する、 請求項 2から 6の何れかに記載の方法。
[13] a , β 不飽和結合と電子吸引性基とを有する化合物を含む、 RNA中のイノシンィ匕 部位修飾剤。
[14] 請求項 13記載の修飾剤を含む、請求項 1から 12の何れかに記載の方法を行うため の試薬キット。
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