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WO2007015470A1 - 酵母宿主、形質転換体および異種タンパク質の製造方法 - Google Patents

酵母宿主、形質転換体および異種タンパク質の製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2007015470A1
WO2007015470A1 PCT/JP2006/315173 JP2006315173W WO2007015470A1 WO 2007015470 A1 WO2007015470 A1 WO 2007015470A1 JP 2006315173 W JP2006315173 W JP 2006315173W WO 2007015470 A1 WO2007015470 A1 WO 2007015470A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
genes
gene
protease
group
host
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2006/315173
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English (en)
French (fr)
Inventor
Alimjan Idiris
Hideki Tohda
Yuko Hama
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AGC Inc
Original Assignee
Asahi Glass Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asahi Glass Co Ltd filed Critical Asahi Glass Co Ltd
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Priority to CA002617832A priority patent/CA2617832A1/en
Priority to EP06782051A priority patent/EP1930428B1/en
Priority to JP2007529263A priority patent/JP5131457B2/ja
Publication of WO2007015470A1 publication Critical patent/WO2007015470A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US12/025,138 priority patent/US8329448B2/en
Priority to US13/666,116 priority patent/US20130122547A1/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to an improved host in which a chromosomal portion of a eukaryotic microorganism is modified for the purpose of improving the production efficiency of a heterologous protein by a transformant of the eukaryotic microorganism host, a method for constructing the host, the host And a method for producing a protein using the transformant. More specifically, as the eukaryotic cell microorganism, Schizosaccharomyces pombe (hereinafter referred to as S. pombe! Called fission yeast is used.
  • S. pombe Schizosaccharomyces pombe
  • E.coli Escherichia coli
  • animal cells as hosts.
  • proteins derived from various organisms are targeted for production, and many are already industrially produced and used for pharmaceuticals and the like.
  • yeast which is a eukaryotic cell, has high commonality with animals and plants in terms of transcription, translation, etc.
  • Baker's yeast sacharomvces cerevisiae, hereinafter referred to as “h S. Cerevisiae”
  • h S. Cerevisiae is widely used as a host.
  • S. pombe in particular, is separated from other yeasts at an early stage in the evolutionary process, and as a result of having achieved another evolution, it is not surprising that it grows by means of division rather than budding, It is known to have properties close to animal cells. Therefore, by using S. pombe as a host for expressing a heterologous protein, it is expected that a gene product closer to the natural body can be obtained as in the case of animal cells.
  • a heterologous protein production system using eukaryotic microorganisms such as yeast can be easily implemented using known microbiological methods and recombinant DNA technology, and has high production capacity. Large-capacity culture has already been carried out and has been rapidly utilized for actual production. In actual production, the per cell obtained in the laboratory is high! Production efficiency is maintained even after scale-up.
  • Patent Document 1 Patent 2776085
  • Patent Document 2 JP 07-163373 A
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 10-215867
  • Patent Document 4 JP-A-10-234375
  • Patent Document 5 JP-A-11-192094
  • Patent Document 6 JP 2000-136199 A
  • Patent Document 7 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-262284
  • Patent Document 8 International Publication No. 96/023890 Pamphlet
  • Patent Document 9 International Publication No. 02/101038 Pamphlet
  • Patent Document 10 International Publication No. 04/090117 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Yeast Magazine 23-83-99, 2006
  • the production efficiency of heterologous proteins can be improved by using an improved host in which part or all of the genomic portion of the host that is unnecessary or harmful to heterologous protein production is deleted or inactive. Will improve. However, if the production efficiency of heterologous proteins varies depending on the type or combination of chromosome parts (especially gene parts) that have been deleted or inactive, the target should be modified in order to achieve higher production efficiency. Further examination of the chromosomal portion is necessary.
  • the inventors of the present invention have produced heterologous protein production by deleting or inactivating one or more selected protease-related genes in the S. pombe host. It has been found that the efficiency can be greatly improved. That is, the present invention includes the following.
  • [0011] A method for constructing an improved host composed of Schizosaccharomvces pombe for expressing a foreign gene introduced by a gene recombination method. Gene group), genes encoding aminopeptidases (aminopeptidase gene group), genes encoding carboxypeptidase (carboxypeptidase gene group), and genes encoding dipeptidase (dipeptidase gene group) Powerful group power A method for constructing a Schizosaccharomyces bomb host characterized by deleting or inactivating one or more selected genes as a target.
  • 2.Target genes are psp3 (SPAC1006.01), sxa2 (SPAC1296.03c), ⁇ (SPAC22G The construction method according to claim 1, which is one or more genes selected from the group consisting of 7.01c) and ppp52 (SPBC18A7.01).
  • Two or more types of genes are selected from the group of one or more genes selected for meta-protease gene group strength and two or more types of genes selected for serine protease gene group strength. How to build.
  • SPAC23H4.09 cdb4
  • ppp22 SPBC14C8.03
  • ppp53 ppp53
  • SPAC4A8.04 isp6
  • ppp 16 SPBC1711.12
  • psp3 SPAC1006.01
  • sxa2 SPAC1296.03c
  • Two or more kinds of genes are selected from the group consisting of one or more genes selected for meta-protease gene group power and two or more genes selected for serine protease gene group power. The host.
  • a method for producing a heterologous protein comprising culturing the transformant according to 11 or 12 above to produce and collect a heterologous protein.
  • a heterogeneity characterized by culturing the transformant according to item 12 above, producing a heterologous protein, secreting the heterologous protein into a culture solution, and collecting the heterologous protein from the culture solution.
  • a method for producing a protein A method for producing a protein.
  • heterologous protein is human growth hormone (hGH).
  • protease-related genes which are considered to be involved in the degradation of heterologous proteins of fission yeast S. pombe, are deleted or inactive (hereinafter collectively referred to as destruction).
  • destruction A gene-disrupted strain constructed as a host As a result, the production efficiency of the heterologous protein of the transformant was improved.
  • protease-related gene-disrupted strains can be widely used for the production of heterologous proteins that may be affected by proteases.
  • FIG. 1 is a graph showing the relative growth rate of S. pombe protease-related gene-disrupted strains.
  • FIG. 2 is a vector structure diagram showing the structure of a multi-expression cassette vector for r-hGH secretion expression.
  • FIG. 3 (A) is an SDS-PAGE observation diagram showing a time-dependent analysis of the amount of r-hGH secreted by transformant ARC001 (hGH). (B) is an SDS-PAGE observation diagram showing time-dependent analysis of the amount of r-hGH secreted when a protease inhibitor is added to the culture medium of transformant ARC001 (hGH) and cultured.
  • FIG. 4 SDS-PAGE observation diagram showing the results of time-dependent analysis of the amount of r-hGH secretion in strains in which the protease gene was disrupted and strains in which ARC001 was transformed with the hGH expression vector.
  • FIG. 5 is a graph showing the relative growth rate of S. pombe protease-related gene multiple disruption strains.
  • FIG. 6 is an SDS-PAGE observation diagram showing time-dependent changes in the amount of secreted hGH produced by S. pombe protease-related gene multiple disruption strains.
  • FIG. 7 is an SDS-PAGE observation diagram showing the change over time in the amount of secreted hGH produced by 6- and 7-fold disrupted S. pombe protease-related genes.
  • the improved host is S. pombe.
  • the host means S.pombe unless otherwise specified.
  • the protease-related gene includes a gene that is presumed to be a protease-related gene, such as its DNA sequence (in addition, the polypeptide encoded by the gene, the structure of the protein, and its amino acid sequence strength). Including those presumed to be protease-related genes).
  • genomic parts that are unnecessary or harmful to the production of the heterologous protein in the culture environment of the transformant.
  • This genomic part may be a gene or a non-gene part. In particular, there are many such unwanted or harmful genes in the genome.
  • some genes of the protease-related genes are likely to be an inhibitory factor for the production of heterologous proteins. Since the heterologous protein is a product that is essentially unnecessary for the host, the transformant tends to degrade the produced heterologous protein with a protease. Therefore, degradation of heterologous protein is considered to be one of the factors that reduce the production efficiency of heterologous protein.
  • some proteases have an adverse effect on the host, such as inert or non-hazardous, which is not necessary or harmful to the host.
  • the present invention has found that the production efficiency of heterologous proteins can be improved by selectively destroying genes that produce unnecessary or harmful proteases.
  • a genomic part unnecessary or harmful to the production of a heterologous protein there are four groups of protease-related genes, serine protease gene group, aminopeptidase gene group, carboxypeptidase gene group and dipeptidase gene group.
  • the yeast host improved in the present invention is obtained by deleting or inactivating one or more genes from which the above four groups of protease-related genes are also selected. The part may be further deleted or inactivated.
  • protease-related genes are selected as target genes selected from psp3 (SPAC1006.01) and sxa2 (SPAC1296. 03c), ⁇ (SPAC22G7.01c) and ppp52 (SPBC18A7.01) are preferably selected from one or more genes for which group power is also selected.
  • Psp3 (SPAC1006.01) and sxa2 (SPAC1296.03c) are genes of the serine protease gene group.
  • Ppp51 (SPAC22G7.01c) and ppp52 (SPBC18A7.01) are genes encoding proteins presumed to be aminopeptidases (genes of the aminopeptidase gene group), and these are also meta-proteases described below. It is also a kind of gene (protease gene containing metal ions).
  • protease-related genes may be insufficient for versatility (ie, increased productivity of a wide variety of heterologous proteins).
  • various proteases of living organisms often have overlapping functions. Deletion of only one protease-related gene or inactivity can increase productivity to some extent. Dramatically increase productivity. There is nothing to do.
  • a genomic moiety that is unnecessary or harmful to the production of a heterologous protein a meta-oral protease gene group, a serine protease gene group, a cystine protease gene group, and an aspartic protease gene group are included.
  • Select two or more types from the group of protease-related genes delete these two or more genes as targets of these two or more selected genes, and remove the inactive genes to transform the heterologous mutant of the transformant. Succeeded in improving quality production efficiency.
  • the yeast host improved in the present invention is obtained by deleting or inactivating two or more genes selected from the above four groups of protease-related genes, and a part of genes other than these genes. Has been further removed or inactivated! /
  • the two or more types of genes that are selected and deleted or inactivated by selecting the group 4 protease-related gene group forces may be two or more types of genes selected within one gene group. Two or more genes selected from different gene group forces may be used. In the latter case, it may be a total of 3 or more genes including 2 or more genes selected from one group and 1 or more genes selected from the other group. In addition, two or more genes selected from the group 4 protease-related genes and a gene selected from a group other than the group 4 protease-related genes (the genes are other than the protease-related genes). Or may be deleted or inactive.
  • Means for deleting or inactivating a protease-related gene as a target can be performed by a known method.
  • the portion that deletes or inactivates the protease-related gene may be an ORF portion or an expression regulatory sequence portion.
  • a particularly preferred method is deletion or inactivation by PCR-mediated homologous recombination (Yeast 14: 943-951, 1998), which replaces the ORF part of the target gene with a marker gene. . In the examples described below, this PCR-mediated homologous recombination method was used, but is not limited thereto.
  • Deletion or inactivation of a protease-related gene may delete the entire gene, or may delete a part of the gene and inactivate the gene.
  • the inactivation of a protease-related gene is not limited to deleting a part of a gene, but also means a case where a protease-related gene is modified without deletion.
  • protease-related genes can be inactivated by inserting other genes or DNA into the sequence of protease-related genes. In either case, the protease-related gene should be inactive by coding an inactive protein, or by making the protease-related gene incapable of transcription or translation. If a cell has two or more types of protease-related genes, a small number of them can be deleted as long as the intracellular activity of the protease encoded by the gene is sufficiently reduced. The gene may remain.
  • the gene in the protease-related gene group in the present invention includes a gene encoding a metaprotease (metaprotease gene group), a gene encoding a serine protease (serine protease gene group), a cysteine protease.
  • These genes are at least two genes selected for both the gene coding for (cystine protease gene group) and the gene coding for aspartic protease (aspartic protease gene group).
  • it is preferable that at least two kinds of genes are selected, in particular, the meta-protease gene group and the serine protease gene group.
  • a combination of at least one gene in these two gene groups and at least one gene selected from the group consisting of cysteine proteinase gene group and aspartic protease gene group is also preferable.
  • Examples of each gene include the following An example is given (see Table 1 below).
  • Meta-oral protease gene group c db4 (SPAC23H4.09), mas2 (SPBC18E5.12c), pgpl (S PCC1259.10), ppp20 (SPAC4F10.02), ppp22 (SPBC14C8.03), ppp51 (SPAC22G7.01c), ppp52 (SPBC18A7.01), ppp53 (SPAP14E8.04).
  • Serine protease gene group isp6 (SPAC4A8.04), pppl6 (SPBC1711.12), psp3 (SPA C1006.01), sxa2 (SPAC1296.03c).
  • Cysteine protease gene group ppp80 (SPAC19B12.08), pcal (SPCC1840.04), cut tl (SPCC5E4.04), gpi8 (SPCCllE10.02c).
  • Aspartic protease gene group sxal (SPAC26A3.01), ypsl (SPCC1795.09), ppp81 (SPAC25B8.17) 0
  • the protease-related genes targeted for deletion or inactivation are genes selected from the meta-oral protease gene group and the serine protease gene group, and two or more genes selected from these two groups. Or a combination of one or more genes selected from these two groups and one or more genes selected from other groups, and the former is particularly preferable. More preferably, it is preferably a total of 3 or more genes including one or more genes selected from the meta-protease gene group strength and two or more genes selected from the serine protease gene group strength. Furthermore, when targeting 4 or more genes, 50% or more of them are genes of the serine protease gene group, and at least one other (more preferably at least 2) is a metaprotea. It is preferred that it is a gene in the gene group. Of the four groups, the genes of the cystine protease gene group are preferred as the other genes.
  • the genes of the meta-oral protease gene group are cdb4 (SPAC23H4.09), pgpl (SPCC1259.10), ppp20 (SPAC4F10.02), ppp22 (SPBC14C8.03), ppp52 (SPBCl 8A7.01), ppp53 (SPAP14E8.04), of which cdb4 (SPAC23H4.09), ppp22 (SPB C14C8.03), and ppp53 (SPAP14E8.04) are more preferred! / ⁇ .
  • Preferred genes of the serine protease gene group as a target are isp6 (SPAC4A8.04), p ppl6 (SPBC1711.12), psp3 (SPAC1006.01), and sxa2 (SPAC1296.03c).
  • the other gene group is preferably ppp80 (SPAC 19B 12.08). More specific target gene combinations include one or more genes selected from the group consisting of cdb4 (SPAC23H4.09), ppp22 (SPBC14 C8.03) and ppp53 (SPAP14E8.04), and isp6 (SPAC4A8.04). ), pppl6 (SPBC1711.12), psp3 (SPAC1006.01), and sxa2 (SPAC1296.0 3c) force A combination of two or more genes selected in combination of three or more genes is preferable.
  • ppp53 ppp53
  • SPAC23H4.09 cdb4
  • isp6 SPAC4A8.04
  • psp3 SPAC1006.0 1
  • SPAC1006.01 at least three of psp3 (SPAC1006.01), is p6 (SPAC4A8.04), and ppp53 (SPAP14E8.04) are preferable (see Table 3 below).
  • spp53 ppp53
  • isp6 SPAC4A8.04
  • psp3 SPAC1006.01
  • pppl6 SPBC1711.12
  • SPBC14C8.03 ppp22
  • the upper limit of the number of types of genes to be disrupted is not particularly limited as long as the object of the present invention can be achieved. However, if too many kinds of genes are destroyed, the growth rate is too low.
  • the relative growth rate of the gene-disrupted host in the present invention (growth rate compared to the S. pombe strain before gene disruption) is preferably 0.6 or more, and particularly preferably 0.8 or more.
  • growth rate compared to the S. pombe strain before gene disruption is preferably 0.6 or more, and particularly preferably 0.8 or more.
  • even a gene has a small effect on the decrease in the growth rate even if it is disrupted, it can be considered that some genes have little effect on improving the expression efficiency of foreign genes due to their disruption. Such a gene has little significance for destruction in the present invention. For these reasons, it is usually estimated that the upper limit of the number of genes to be destroyed is 20 or less, and preferably 10 or less.
  • the present invention introduces a gene encoding a protein that the host does not originally have (ie, a foreign protein) (hereinafter referred to as a foreign gene) into the improved host by a genetic recombination method. And a method for producing the heterologous protein, wherein the transformant is cultured to produce and collect the heterologous protein.
  • the heterologous protein produced using the improved host of the present invention is limited. However, proteins produced by animals and plants that are multicellular organisms are preferred. In particular, proteins produced by mammals (including humans) are preferred. Illustrative examples include human growth hormone. Such a protein is highly active when produced using a prokaryotic microbial host such as E. coli, and the protein is often not obtained, and when animal cells such as CHO cells are used as the host. Is usually low in production efficiency. When the genetically modified eukaryotic microorganism in the present invention is used as a host, these problems are considered to be solved.
  • various gene expression methods using yeast as a host include various expression systems for expressing a heterologous protein more stably and efficiently.
  • expression vectors, secretion signal gene-introduced expression vectors, and the like have been developed, and these can be widely applied.
  • an expression system using S As an expression system using S.
  • JP 2776085 JP 07-163373, JP 10-215867, JP 10-234375, JP 11-192094, JP 2000-136199, JP 2000-262284, WO96 / 02 3890 and the like are known, and these expression systems can be widely used in the method for producing a heterologous protein of the present invention.
  • the culture contains YES medium [supplemented koji yeast extract, 0.5% Bactoyeast extract (Becton, Dickinson and Company), 3% glucose and SP supplement (Qbiogene)], YPD medium [l% Bactoyeast extract ⁇ 2% Bacto peptone (Becton, manufactured by Dickinson and Company) and 2% glucose, SDC-Ura and SDC-Ura-Lue medium (synthetic dextrose complete medium lacking both uracil or uracil and leucine, Qbiogene Incubation)
  • Thread-replaceable DNA was obtained by the method of Sambrook et al. (Sambrook J et al. 1989. Molecular Cloning.
  • ⁇ and ⁇ flanking sequences for each 200-300 bp target ORF were amplified from the chromosomal DNA of S.pombe parent strain ARC001 by two rounds of PCR using an appropriate intergenic adapter pair.
  • the intergene adapter pair was designed such that the ⁇ and ⁇ ends were fused.
  • the ura4 gene cassette is sandwiched between the two prepared fusion PCR products and ligated, and a vector for destroying the protease gene (hereinafter referred to as gene disruption vector). ) was produced.
  • gene disruption vector a vector for destroying the protease gene
  • the transformed bacteria were cultured in a minimal medium, and a non-uracil-requiring strain that formed colonies on the minimal medium (MMA + Leu plate) was obtained. This strain was subjected to Koguchi-one PCR and DNA sequencing to confirm that the protease gene was destroyed.
  • Table 1 S. Dombe putative proteases selected for gene disruption.
  • the cell growth rate of the S. pombe strain in which the protease gene obtained by the above method was disrupted was measured.
  • a growth curve of the S. pombe strain was obtained using a neuro-auto recorder (Advantech Toyo Co., Ltd., TN-1506).
  • the cells were cultured with shaking at 32 ° C. in 5 ml of YES medium in an L-shaped test tube. Cell turbidity was measured every 5 minutes at an absorbance of 660 nm. 5
  • Each maximum specific growth rate ( ⁇ ) of two protease-disrupted strains was measured. Measured with ARC001 stock max
  • a multi-cassette vector for secreting and expressing r-hGH was prepared, and a transformant ARC001 (hGH) producing r-hGH was constructed.
  • the restriction enzymes A11II and Bam HI the restriction enzymes A11II and Bam HI, the fusion vector pXL4 (Isoai et al., 2002 Biotechnol Bioeng 80: 22-32-) et al.
  • pombe strain from which the protease gene obtained by the above method was deleted, and transformed. After culturing in SDC-Leu-Ura medium for 2-3 days, a leucine non-requiring strain was obtained, transferred again to YPD medium (24-well plate) and incubated at 32 ° C with shaking, r -hGH secretion confirmed
  • Fig. 2 shows the structure of a multi-expression cassette vector constructed to secrete and express r-hGH.
  • a 594 bp S. pombe high-biased codon-type hGH structural gene with A11II and BamHI cleavage sites at the end was placed downstream of the P3 secretion signal sequence, and then the multicloning site (MCS) of the integrated expression vector pXL4 Inserted into.
  • MCS multicloning site
  • FIG. 3A shows a time course analysis of r-hGH secretion by the transformant ARC001 (hGH).
  • Lane M is a molecular weight marker (unit: kilodalton); Lane hGH is 1 ⁇ g of human purified natural hGH; Lanes 24-144 are cultured for 24 to 144 hours of transformant ARC001 (h GH) 0.5 ml of the supernatant was TCA precipitated and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-P AGE). Both were stained and detected with Kumashi Brilliant Blue (CBB).
  • CBB Kumashi Brilliant Blue
  • a portion of the culture supernatant was stored at -20 ° C as a positive control at this point.
  • Other cells were added with a series of protease inhibitors separately to each well, and then further cultured with shaking at 32 ° C for 2 days.
  • Ten types of protease inhibitors contained in the protease inhibitor set were separately added to each well.
  • the negative control well did not contain any inhibitor.
  • 0.5 ml of YPD culture supernatant was collected at 72 and 96 hours of culture time and concentrated by TCA (10% w / v) precipitation and analyzed by SDS-PAGE. .
  • Figure 3B shows the effect of adding various protease inhibitors to the culture medium of transformant ARC001 (hGH) (change in r-hGH secretion over time) by SDS-PAGE (CBB staining). The results are shown.
  • Lane M is a molecular weight marker (unit: kilodalton); lane hGH is 0.5 ⁇ g of natural hGH; lane C is cultured in YPD medium for 24 hours.
  • Lane-PI is a control sample of the culture supernatant that was stored at -20 ° C just prior to the addition of the enzyme inhibitor; Lane-PI is a control sample of the culture supernatant that was not supplemented with any protease inhibitors; 3 to 12 are culture supernatant samples supplemented with 10 kinds of protease inhibitors described in the figure.
  • proteases sxa2, psp3 , Isp6 and ppp7 are serine proteases, and cdb4, ppp22, ppp51, ppp52 and ppp60 belong to the meta-oral protease family. Therefore, it was suggested that in addition to the expected serine protease, several meta-oral proteases are also involved in the extracellular proteolysis of secreted r-hGH! /.
  • S. pombe in which sxa2, psp3, ppp51 and ppp52 indicated by arrows were disrupted expressed more r-hGH than those in which other protease genes were disrupted.
  • S. pombe disrupted by sx a2, psp3, ppp51 and ppp52 expresses a larger amount of r-hGH than that disrupted pppl6 (see the examples in WO02 / 101038).
  • Non-Patent Document 1 13 selected from among 52 types of protease-related gene single disruption strains prepared by single disruption of S. pombe protease-related genes were selected as shown in Table 2.
  • Table 2 Was a protease-related gene that is a candidate for multiple disruption.
  • the ORF (open reading frame) of the protease-related genes listed in Table 2 was disrupted by PCR-mediated homologous recombination method using the ura4 gene cassette as a selection marker (Non-patent Document 1). That is, the ⁇ and 3 'flanking sequences for each 200-300 bp target ORF were amplified from the chromosomal DNA of S. pombe parent strain ARC001 by two rounds of PCR using appropriate intergenic adapter pairs. The intergenic adapter pair was designed so that the ⁇ and ⁇ ends were fused respectively.
  • a ura4 gene cassette was sandwiched between two prepared fusion PCR products to create a gene disruption vector for disrupting protease-related genes.
  • S. pombe strain ARC010 was transformed with the gene disruption vector.
  • the transformed bacteria were cultured in a minimal medium, and a non-uracil-requiring strain that formed colonies on the minimal medium (MMA + Leu plate) was obtained.
  • This strain was subjected to colony PCR and DNA sequencing to confirm that the protease-related gene was destroyed.
  • protease-related gene-disrupted strain confirmed as described above was cultured on MMA + Leu + Ura + FOA medium to obtain a uracil-requiring strain that forms a colony. Acquired The process of destroying a new protease-related gene again in the strain was repeated, and the protease-related gene multiple disruption strains shown in Table 3 were produced.
  • the cell growth rate of the S. pombe strain in which the protease-related gene obtained by the above method was disrupted was measured.
  • a nano off-recorder manufactured by Advantech Toyo, TN-1506
  • a growth curve of S. pombe strain was obtained.
  • the cells were cultured in a L-shaped test tube with shaking in 5 ml of YES medium at 32 ° C. Cell turbidity was measured every 5 minutes at an absorbance of 660 nm.
  • Each maximum specific growth rate ( ⁇ ) of 17 protease multiple disruption strains was measured.
  • ARC max maximum specific growth rate
  • Figure 5 shows the relative maximum specific growth rate of strains in which protease-related genes are disrupted.
  • Each measured value (0.30 ⁇ 0.02 / h) of ARC001 strain (shown as AO) is the standard value and each max
  • protease-related genes affect the cell growth rate.
  • the relative growth rate of the 6-fold and 7-fold disrupted strains decreased by about 10-20%, and the extent of the decrease was strong mainly when the two protease-related genes ppp22 and ppp20 were destroyed. It was also found out. These two genes had almost no effect on cell proliferation in the single disruption state, and therefore, the combined effect of multiple destruction of protease-related genes was considered.
  • the overall decrease in growth rate remains at a low level of about 10 to 20%, so the impact on actual substance production is expected to be small.
  • Example 2 Non-Patent Document 1
  • hGH human growth hormone
  • hGH transformant A producing hGH
  • This paper described the construction of RC001 (hGH), the method of detecting hGH secreted from the transformant ARC001 (hGH), and the effectiveness of the protein as a secreted heterologous production model.
  • hGH was also used as a model for secreted heterologous proteins to evaluate the effectiveness of protease multidisruption strains.
  • FIG. 6 is an SDS-PAGE observation diagram showing the change over time in the amount of secreted hGH produced by the S. pombe protease-related gene multiple disruption strain.
  • the time-dependent change of secreted production hGH is analyzed by SDS-PAGE (Kumasi-brilliant blue staining). After 0.5 ml of culture supernatant of each strain at each culture point was TCA precipitated, it was analyzed by SDS-PAGE.
  • the upper part of each lane shows strain name abbreviations (details are shown in Table 3 above), and the lower part also shows the flow of deletion of protease-related genes.
  • Lane AO nond: non-disrupted strain
  • the secretory production of hGH drastically decreased to the peak at 48 hours in the protease non-destructive strain A0, and in contrast, in the multi-disrupted strain, it continued to increase up to the 72h or 96h time point. Break It was also confirmed that it expanded as the level of destruction increased. This phenomenon was found to be more pronounced in the multiple disruption strains in Group A than in Group B. The hGH levels in the five-fold and six-fold disruption strains A5 and A6 were found to remain at a high level until 120 hours. . This is a force that clearly showed that the degradation rate of hGH was more effectively suppressed by the multiple disruption of more protease-related genes. did. This means that in the process of multiple protease destruction, it is important to select the best one by trying more destruction combinations, and it became clear that the technique used this time was effective. .
  • FIG. 7 is an SDS-PAGE observation diagram showing the change over time in the amount of secreted hGH produced by the 6- and 7-fold disrupted S. pombe protease-related genes.
  • TCA Trisomal Composition
  • FIG. 7 shows the change over time in the amount of secreted hGH produced by the 6- and 7-fold disrupted S. pombe protease-related genes.
  • the strain name abbreviations (details are shown in Table 3) are shown in the upper part of each lane.
  • Lane AO represents the protease non-destructive strain ARC001.

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Abstract

　酵母を宿主とした形質転換体における異種タンパク質の生産効率を向上させる。 　シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces　pombe）のプロテアーゼ関連遺伝子群（特にメタロプロテアーゼ遺伝子群とセリンプロテアーゼ遺伝子群）から選ばれる１種以上の遺伝子を削除または不活性化する、外来遺伝子を発現させるための宿主の構築方法、上記遺伝子を削除または不活性化した宿主、その宿主に外来遺伝子を導入してなる形質転換体、および、その形質転換体を用いた異種タンパク質の製造方法。 　プロテアーゼ関連遺伝子としては、psp3（SPAC1006.01）、sxa2（SPAC1296.03c）、ppp51（SPAC22G7.01c）およびppp52（SPBC18A7.01）からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子、または、メタロプロテアーゼ遺伝子群およびセリンプロテアーゼ遺伝子群からなる群から選ばれる２種以上の遺伝子であることが好ましい。特に、psp3（SPAC1006.01）、isp6(SPAC4A8.04)、ppp53(SPAP14E8.04)の少なくとも３種が好ましく、さらにその３種にppp16(SPBC1711.12)を加えた４種、さらにそれにppp22(SPBC14C8.03)を加えた５種、の遺伝子削除または不活性化した宿主が好ましい。

Description

明 細 書
酵母宿主、形質転換体および異種タンパク質の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、真核細胞微生物宿主の形質転換体による異種タンパク質の生産効率を 向上させることを目的として真核細胞微生物の染色体部分を改変した改良宿主、該 宿主の構築方法、該宿主の形質転換体、および該形質転換体を用いたタンパク質 の製造方法に関する。さらに詳しくは、該真核細胞微生物としては、分裂酵母と呼ば れるシゾサッカロミセス ·ボンべ (Schizosaccharomvces pombe,以下 S.pombeと！、う)を 用いるものである。
背景技術
[0002] 組換え DNA技術を用いた異種タンパク質の生産は大腸菌 (Escherichia coli、以下 E.coliと 、う）をはじめとした様々な微生物や動物細胞を宿主として行われて 、る。ま た様々な生物由来のタンパク質 (本明細書では、ポリペプチドを含む意味で使用する )が生産対象とされ、既に多くのものが工業的に生産され、医薬品等に用いられてい る。
[0003] 異種タンパク質生産のための種々の宿主が開発されてきた中で、真核細胞である 酵母は、転写、翻訳などの点で動植物と共通性が高く動植物のタンパク質発現が良 タナ ると考 られ、パン酵母 (saccharomvces cerevisiae,以 "h S . cerevisiaeと ヽつ ) などが宿主として広く使用されている。
酵母のうちでも、特に S.pombeは、進化過程で他の酵母とは早い時期に分かれ、別 の進化をとげた結果、出芽ではなく分裂という手段で増殖することからもわ力るように 、動物細胞に近い性質を持つことが知られている。このため異種タンパク質を発現す る宿主として S.pombeを用いることによって、動物細胞の場合と同様の、より天然体に 近 ヽ遺伝子産物が得られることが期待される。
[0004] S.pombeを用いた遺伝子発現に関する研究は遅れていた力 最近 S.pombeで働く 強力なプロモーターの発見がなされたため、 S.pombeを宿主として発現系の開発が急 速に進み、さらにより安定な効率の良い発現システムを開発するために発現ベクター に種々の改良が加えられている（特許文献 1〜8等)。その結果、現在 S.pombeを宿主 とした発現系としては高い生産能力を示すに至った。
[0005] 酵母などの真核細胞微生物を用いた異種タンパク質生産系は、既に知られている 微生物学の方法と組換え DNA技術を用いて容易に実施でき、かつ高!、生産能力を 示すため、既に大容量の培養も実施されて実生産に急速に利用されてきている。実 生産にあたり、実験室で得られた菌体あたりの高!、生産効率はスケールアップ後も維 持される。
[0006] 実生産の場合にしばしば求められる、より低コストの生産法を考えた場合、菌体の 増殖効率そのものの向上、目的異種タンパク質の分解の抑制、真核細胞微生物特 有の修飾の効率的実施、栄養源の利用効率の向上、などの異種タンパク質の生産 効率を向上させる方策が必要と考えられている。たとえば、生育のために培地に添カロ した炭素源から目的とする異種タンパク質への変換効率を高めることができれば、菌 体増殖ひいては異種タンパク質の生産効率が格段に上昇することが期待される。な ぜなら、菌体自身の生育や目的異種タンパク質の生産に不要である代謝系（たとえ ばエタノール発酵系）に培地中の炭素源が消費 (例えばエタノール生産に使用）され ることにより、目的異種タンパク質の生産のための炭素源の利用効率が低下している と考えられるからである。
[0007] このため、異種タンパク質生産に不要または有害な宿主ゲノムの一部または全部を 削除または不活性ィ匕した宿主を用いることにより、異種タンパク質の生産効率を向上 させる試みが行なわれている（特許文献 9、 10)。
[0008] なお、本発明者らは、本出願の第 1の優先権主張日以後（第 2の優先権主張日以 前）に第 1の優先権主張日の出願に記載の発明に関連する文献発表を行った (非特 許文献 1)。
特許文献 1 :特許 2776085
特許文献 2：特開平 07-163373
特許文献 3：特開平 10-215867
特許文献 4：特開平 10-234375
特許文献 5：特開平 11-192094 特許文献 6：特開平 2000-136199
特許文献 7：特開平 2000-262284
特許文献 8 :国際公開 96/023890号パンフレット
特許文献 9：国際公開 02/101038号パンフレット
特許文献 10 :国際公開 04/090117号パンフレット
非特許文献 1： Yeast誌第 23卷 83-99頁、 2006年
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 上記特許文献に記載のように、異種タンパク質生産に不要または有害な宿主のゲ ノム部分の一部または全部を削除または不活性ィ匕した改良宿主を用いることにより、 異種タンパク質の生産効率が向上する。しかし、削除または不活性ィ匕した染色体部 分 (特に遺伝子部分)の種類又は組み合せに応じて異種タンパク質の生産効率が変 化することにより、より高い生産効率を達成するためには改変対象とする染色体部分 の更なる検討が必要である。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは以上の点を鑑み検討を行った結果、 S.pombe宿主の選択された 1種 以上のプロテアーゼ関連遺伝子を削除または不活性ィ匕することにより、異種タンパク 質の生産効率を大幅に向上させうることを見出した。すなわち、本発明は以下よりな る。
[0011] 1.遺伝子組換え法により導入した外来遺伝子を発現させるためのシゾサッカロミセ ス ·ボンべ (Schizosaccharomvces pombe)からなる改良宿主を構築する方法にぉ ヽ て、セリンプロテアーゼをコードする遺伝子 (セリンプロテアーゼ遺伝子群）、アミノぺ プチダーゼをコードする遺伝子 (アミノぺプチダーゼ遺伝子群）、カルボキシぺプチダ ーゼをコードする遺伝子 (カルボキシぺプチダーゼ遺伝子群）およびジぺプチダーゼ をコードする遺伝子 (ジぺプチダーゼ遺伝子群)力 なる群力 選ばれる 1種以上の 遺伝子を標的として当該 1種以上の遺伝子を削除または不活性ィ匕することを特徴と するシゾサッカロミセス ·ボンべ宿主の構築方法。
2.標的遺伝子が、 psp3 (SPAC1006.01) , sxa2 (SPAC1296.03c) , ρρρδΐ (SPAC22G 7.01c)および ppp52 (SPBC18A7.01)からなる群から選ばれる 1種以上の遺伝子であ る、請求項 1に記載の構築方法。
3.遺伝子組換え法により導入した外来遺伝子を発現させるためのシゾサッカロミセ ス ·ボンべ (Schizosaccharomvces pombe)からなる改良宿主を構築する方法にぉ ヽ て、メタ口プロテアーゼをコードする遺伝子 (メタ口プロテアーゼ遺伝子群）、セリンプロ テアーゼをコードする遺伝子 (セリンプロテアーゼ遺伝子群）、システィンプロテア一 ゼをコードする遺伝子 (システィンプロテアーゼ遺伝子群）およびァスパラギン酸プロ テアーゼをコードする遺伝子 (ァスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群)力もなる群から 選ばれる 2種以上の遺伝子を標的として当該 2種以上の遺伝子を削除または不活性 化する、シゾサッカロミセス ·ボンべ宿主の構築方法。
4. 2種以上の遺伝子が、メタ口プロテアーゼ遺伝子群力 選ばれる 1種以上の遺伝 子とセリンプロテアーゼ遺伝子群力 選ばれる 2種以上の遺伝子の合計 3種以上の 遺伝子である、前項 3に記載の構築方法。
5. 2種以上の遺伝子が、 cdb4(SPAC23H4.09)、 ppp22(SPBC14C8.03)および ppp53( SPAP14E8.04)からなる群から選ばれる 1種以上の遺伝子と、 isp6(SPAC4A8.04)、 ppp 16(SPBC1711.12)、 psp3(SPAC1006.01)および sxa2(SPAC1296.03c)からなる群から選 ばれる 2種以上の遺伝子の合計 3種以上の遺伝子である、前項 3または 4に記載の 構築方法。
6.前記遺伝子の ORF (オープンリーディングフレーム）部分をマーカー遺伝子に 置換して当該遺伝子を削除または不活性ィ匕する、前項 1〜5のいずれかに記載の構 築方法。
7.遺伝子組換え法により導入した外来遺伝子を発現させるためのシゾサッカロミセ ス ·ボンべ (Schizosaccharomvces pombe)からなる改良宿主であって、 psp3 (SPAC10 06.01)、 sxa2 (SPAC1296.03c)、 ρρρδΐ (SPAC22G7.01c)および ppp52 (SPBC18A7.01
)からなる群力も選ばれる 1種以上の遺伝子が削除または不活性ィ匕されている、シゾ サッカロミセス ·ボンべ宿主。
8.遺伝子組換え法により導入した外来遺伝子を発現させるためのシゾサッカロミセ ス ·ボンべ（Schizosaccharomvces Dombe)からなる改良宿主であって、メタ口プロテア ーゼをコードする遺伝子 (メタ口プロテアーゼ遺伝子群）、セリンプロテアーゼをコード する遺伝子 (セリンプロテアーゼ遺伝子群）、システィンプロテアーゼをコードする遺 伝子 (システィンプロテアーゼ遺伝子群）およびァスパラギン酸プロテアーゼをコード する遺伝子 (ァスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群)からなる群から選ばれる 2種以 上の遺伝子が削除または不活性ィ匕されている、シゾサッカロミセス 'ボンべ宿主。
9. 2種以上の遺伝子が、メタ口プロテアーゼ遺伝子群力 選ばれる 1種以上の遺伝 子とセリンプロテアーゼ遺伝子群力 選ばれる 2種以上の遺伝子の合計 3種以上の 遺伝子である、前項 8に記載の宿主。
10. 2種以上の遺伝子が、 cdb4(SPAC23H4.09)、 ppp22(SPBC14C8.03)および ppp5 3(SPAP14E8.04)からなる群から選ばれる 1種以上の遺伝子と、 isp6(SPAC4A8.04)、 pp pl6(SPBC1711.12)、 psp3(SPAC1006.01)および sxa2(SPAC1296.03c)からなる群から 選ばれる 2種以上の遺伝子の合計 3種以上の遺伝子である、前項 8または 9に記載 の宿主。
11.前項 7〜： LOのいずれか〖こ記載の宿主に、異種タンパク質をコードする遺伝子 を導入してなる形質転換体。
12.異種タンパク質をコードする遺伝子とともに分泌シグナル遺伝子を導入してな る、前項 11に記載の形質転換体。
13.前項 11または 12に記載の形質転換体を培養して異種タンパク質を生産し採 取することを特徴とする異種タンパク質の製造方法。
14.前項 12に記載の形質転換体を培養し、異種タンパク質を生産し該異種タンパ ク質を培養液に分泌させ、該培養液力ゝら該異種タンパク質を採取することを特徴とす る異種タンパク質の製造方法。
15.異種タンパク質がヒト成長ホルモン (hGH)である、請求項 13または 14の製造 方法。
発明の効果
本発明にお 、て、分裂酵母 S.pombeの異種タンパク質の分解に関与すると考えら れる、 1種または複数種類のプロテアーゼ関連遺伝子を削除または不活性ィ匕 (以下、 両者を破壊と総称することがある）して構築された遺伝子破壊株を宿主として用いる ことにより、形質転換体の異種タンパク質の生産効率が向上することがわ力つた。この ようなプロテアーゼ関連遺伝子破壊株は、プロテアーゼの影響を受けるおそれのある 異種タンパク質の生産に広く用いることができる。
図面の簡単な説明
[0013] [図 l]S.pombeプロテアーゼ関連遺伝子破壊株の相対的増殖速度を示すグラフ。
[図 2]r-hGH分泌発現ためのマルチ発現カセットベクターの構造を示すベクター構造 図。
[図 3] (A)は、形質転換体 ARC001 (hGH)による r-hGH分泌量の経時変化分析を示 す、 SDS— PAGE観察図。（B)は、プロテアーゼ阻害剤を形質転換体 ARC001 (hG H)の培養培地に添加して培養した場合の r-hGH分泌量の経時変化分析を示す、 S DS— PAGE観察図。
[図 4]プロテアーゼ遺伝子が破壊された株ならびに ARC001を hGH発現ベクターで形 質転換した株の r-hGH分泌量の経時変化分析の結果を示す、 SDS-PAGE観察図。
[図 5]S.pombeプロテアーゼ関連遺伝子多重破壊株の相対増殖速度を示すグラフ。
[図 6]S.pombeプロテアーゼ関連遺伝子多重破壊株による hGH分泌生産量の経時変 化を示す SDS-PAGE観察図。
[図 7]S.pombeプロテアーゼ関連遺伝子 6重および 7重破壊株による hGH分泌生産量 の経時変化を示す SDS-PAGE観察図。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明にお 、て、改良された宿主は、 S.pombeである。以下の説明にお 、て宿主と は特に言及しない限り S.pombeをいう。なお、本発明においてプロテアーゼ関連遺伝 子とは、その DNA配列カゝらプロテアーゼ関連遺伝子と推定される遺伝子を含む（さら に、その遺伝子がコードするポリペプチドな 、しタンパク質の構造やそのアミノ酸配列 力もプロテアーゼ関連遺伝子と推定されるものを含む)。
[0015] 形質転換体を培養して異種タンパク質を生産させる場合、形質転換体の培養環境 下にお 、て異種タンパク質の生産に不要または有害なゲノム部分が存在する。この ゲノム部分は遺伝子である場合も、非遺伝子部分である場合もある。特に、このような 不要または有害な遺伝子はゲノムに多数存在すると考えられる。 [0016] プロテアーゼ関連遺伝子群の遺伝子のあるものは、異種タンパク質の生産に対し 阻害要因となりやすいと一般的には推定される。異種タンパク質は本来宿主にとって 不要な生産物であることより、形質転換体は生産した異種タンパク質をプロテアーゼ により分解する傾向がある。そのため、異種タンパク質の分解は異種タンパク質の生 産効率を低下させる要因の一つと考えられる。しかし、全てのプロテアーゼが宿主に とって不要又は Z及び有害ではなぐ不活性ィヒ等が逆の影響をもつものも存在する
。そこで、本発明では不要又は有害なプロテアーゼを生産する遺伝子を選択的に破 壊することにより異種タンパク質の生産効率を向上できることを見出した。
本発明においては、異種タンパク質の生産に不要または有害なゲノム部分として、 セリンプロテアーゼ遺伝子群、アミノぺプチダーゼ遺伝子群、カルボキシぺプチダー ゼ遺伝子群およびジぺプチダーゼ遺伝子群の 4群のプロテアーゼ関連遺伝子群か ら選ばれる 1種以上のプロテアーゼ関連遺伝子を標的として当該 1種以上の遺伝子 を削除または不活性ィ匕して形質転換体の異種タンパク質の生産効率を向上させるこ とに成功した。本発明において改良された酵母宿主は、上記 4群のプロテアーゼ関 連遺伝子群力も選ばれる 1種以上の遺伝子が削除または不活性ィ匕してなるものであ り、さらにこの遺伝子以外の遺伝子の一部がさらに削除または不活性ィ匕されていても よい。
上記 4群のプロテアーゼ関連遺伝子群力 選ばれる標的遺伝子としては、該 S.pom beにおいてプロテアーゼまたはプロテアーゼと推定されるタンパク質をコードする遺 伝子である、 psp3 (SPAC1006.01)、 sxa2 (SPAC1296.03c)、 ρρρδΐ (SPAC22G7.01c) および ppp52 (SPBC18A7.01)からなる群力も選ばれる 1種以上の遺伝子が好ましい。 なお、 psp3 (SPAC1006.01)および sxa2 (SPAC1296.03c)はセリンプロテアーゼ遺伝子 群の遺伝子である。また、 ppp51 (SPAC22G7.01c)および ppp52 (SPBC18A7.01)はァ ミノべプチダーゼと推定されるタンパク質をコードする遺伝子 (アミノぺプチダーゼ遺 伝子群の遺伝子)であり、これらはまた下記メタ口プロテアーゼ遺伝子 (金属イオンを 含むプロテアーゼの遺伝子）の 1種でもある。
[0017] しかるに、プロテアーゼ関連遺伝子の 1種のみを削除または不活性ィ匕することによ つては必ずしも充分に前記目的を達成することが困難であることが少なくない。単独 のプロテアーゼ関連遺伝子の削除または不活性ィ匕は汎用性 (すなわち、多種多様な 異種タンパク質の生産性向上）には不十分であることがある。また一般に生物が持つ 各種プロテアーゼは機能が重複していることが多ぐプロテアーゼ関連遺伝子 1種の みの削除または不活性ィ匕によって生産性がある程度向上することはある力 劇的に 生産性が向上することは皆無である。このため本発明では、プロテアーゼの種類とし て少なくとも 2種、望ましくは 3種以上、の遺伝子を削除または不活性ィ匕することが好 まし 、。選択された 2種以上のプロテアーゼ関連遺伝子を削除または不活性ィ匕する ことにより、異種タンパク質の生産効率が劇的に向上する。
[0018] 従って、さらに、本発明においては、異種タンパク質の生産に不要または有害なゲ ノム部分として、メタ口プロテアーゼ遺伝子群、セリンプロテアーゼ遺伝子群、システィ ンプロテアーゼ遺伝子群およびァスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群の 4群のプロテ ァーゼ関連遺伝子群から 2種以上を選択し、これらの選ばれた 2種以上の遺伝子を 標的として当該 2種以上の遺伝子を削除または不活性ィ匕して形質転換体の異種タン ノ^質の生産効率を向上させることに成功した。この発明において改良された酵母 宿主は、上記 4群のプロテアーゼ関連遺伝子群力 選ばれる 2種以上の遺伝子が削 除または不活性ィ匕してなるものであり、さらにこの遺伝子以外の遺伝子の一部がさら に削除または不活性化されて！/、てもよ 、。
以下、上記 4群のプロテアーゼ関連遺伝子群力 選ばれる 2種以上の遺伝子を削 除または不活性ィ匕する本発明の構築方法、および同 2種以上の遺伝子を削除また は不活性化された本発明の宿主について説明する。前記 1種以上の遺伝子の削除 または不活性ィ匕の場合もこれと同様に実施できる。
[0019] 前記 4群のプロテアーゼ関連遺伝子群力も選択されて削除または不活性ィ匕される 2 種以上の遺伝子としては、 1つの遺伝子群内で選択された 2種以上の遺伝子であつ てもよく、異なる遺伝子群力 選ばれた 2種以上の遺伝子であってもよい。後者の場 合、 1つの群内から選択された 2種以上の遺伝子と他の群から選択された 1種以上の 遺伝子との合計 3種以上の遺伝子であってもよい。さらに、前記 4群のプロテアーゼ 関連遺伝子群から選択された 2種以上の遺伝子と、前記 4群のプロテアーゼ関連遺 伝子群以外から選ばれた遺伝子 (その遺伝子はプロテアーゼ関連遺伝子以外であ つてもよい）とが組み合されて、削除または不活性ィ匕が行われていてもよい。
[0020] プロテアーゼ関連遺伝子を標的にしてその削除または不活性ィ匕を行う手段は、公 知の方法で行うことができる。また、プロテアーゼ関連遺伝子の削除または不活性ィ匕 を行う部分は ORF部分であってもよぐ発現調節配列部分であってもよい。特に好ま L ヽ方法は、標的遺伝子の ORF部分をマーカー遺伝子に置換する PCR媒介相同組 換え法 (Yeast誌第 14卷 943-951頁、 1998年）による削除または不活性ィ匕の方法であ る。後述の実施例では、この PCR媒介相同組換え法を使用したがこれに限定されるも のではない。
[0021] プロテアーゼ関連遺伝子の削除または不活性ィ匕は遺伝子の全体を削除してもよく 、遺伝子の一部を削除して遺伝子を不活性ィ匕してもよい。また、プロテアーゼ関連遺 伝子の不活性ィ匕は、遺伝子の一部を削除することに限られず、プロテアーゼ関連遺 伝子を削除なしに改変する場合も意味する。さらに、プロテアーゼ関連遺伝子の配 列の中に他の遺伝子や DNAを挿入してプロテアーゼ関連遺伝子を不活性化するこ ともできる。いずれの場合も、プロテアーゼ関連遺伝子を活性のないタンパク質をコ ードするものとしたり、プロテアーゼ関連遺伝子が転写や翻訳できないものにしたりし て、不活性なものとする。なお、 1つの細胞がある 1種類のプロテアーゼ関連遺伝子 を 2個以上有する場合には、その全てを削除してもよぐその遺伝子がコードするプロ テアーゼの細胞内活性が充分に低下する限り少数の遺伝子は残存してもよい。
[0022] 本発明におけるプロテアーゼ関連遺伝子群内の遺伝子は、メタ口プロテア一ゼをコ ードする遺伝子 (メタ口プロテアーゼ遺伝子群）、セリンプロテアーゼをコードする遺伝 子 (セリンプロテアーゼ遺伝子群）、システィンプロテアーゼをコードする遺伝子 (シス ティンプロテアーゼ遺伝子群）およびァスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝 子 (ァスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群)力もなる群力も選択された少なくとも 2種 の遺伝子である。そのうちでも、特にメタ口プロテアーゼ遺伝子群およびセリンプロテ ァーゼ遺伝子群力 なる群力 選択される少なくとも 2種の遺伝子であることが好まし い。また、これら 2つの遺伝子群内の少なくとも 1種の遺伝子とシスティンプロテア一 ゼ遺伝子群およびァスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群内からなる群力 選択され る少なくとも 1種の遺伝子との組合せも好ましい。各遺伝子としては、例えば以下の遺 伝子が例示される (後記表 1参照)。
メタ口プロテアーゼ遺伝子群： cdb4(SPAC23H4.09)、 mas2(SPBC18E5.12c)、 pgpl(S PCC1259.10)、 ppp20(SPAC4F10.02)、 ppp22(SPBC14C8.03)、 ppp51(SPAC22G7.01c )、 ppp52(SPBC18A7.01)、 ppp53(SPAP14E8.04)。
セリンプロテアーゼ遺伝子群： isp6(SPAC4A8.04)、 pppl6(SPBC1711.12)、 psp3(SPA C1006.01)、 sxa2(SPAC1296.03c)。
システィンプロテアーゼ遺伝子群： ppp80(SPAC19B12.08)、 pcal(SPCC1840.04)、 cu tl(SPCC5E4.04)、 gpi8(SPCCllE10.02c)。
ァスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群： sxal(SPAC26A3.01)、 ypsl(SPCC1795.09)、 ppp81(SPAC25B8.17)0
本発明において削除または不活性ィ匕の標的となるプロテアーゼ関連遺伝子として は、メタ口プロテアーゼ遺伝子群およびセリンプロテアーゼ遺伝子群力 選ばれる遺 伝子であり、これら 2つの群から選ばれる 2種以上の遺伝子、または、これら 2つの群 から選ばれる 1種以上の遺伝子と他の群から選ばれる 1種以上の遺伝子の組合せ、 であることが好ましぐ特に前者が好ましい。さらに好ましくは、メタ口プロテアーゼ遺 伝子群力 選ばれる 1種以上の遺伝子とセリンプロテアーゼ遺伝子群力 選ばれる 2 種以上の遺伝子の合計 3種以上の遺伝子であることが好ま 、。さらに 4種以上の遺 伝子を標的にする場合は、種類数にしてその 50%以上がセリンプロテアーゼ遺伝子 群の遺伝子であり、他の少なくとも 1種 (より好ましくは少なくとも 2種）はメタ口プロテア ーゼ遺伝子群の遺伝子であることが好まし 、。前記 4群の内他の遺伝子としてはシス ティンプロテアーゼ遺伝子群の遺伝子が好まし 、。
標的として好まし 、メタ口プロテアーゼ遺伝子群の遺伝子は、 cdb4(SPAC23H4.09) 、 pgpl(SPCC1259.10)、 ppp20(SPAC4F10.02)、 ppp22(SPBC14C8.03)、 ppp52(SPBCl 8A7.01)、 ppp53(SPAP14E8.04)であり、そのうちでも cdb4(SPAC23H4.09)、 ppp22(SPB C14C8.03)、 ppp53(SPAP14E8.04)がより好まし!/ヽ。
標的として好ましいセリンプロテアーゼ遺伝子群の遺伝子は、 isp6(SPAC4A8.04)、 p ppl6(SPBC1711.12)、 psp3(SPAC1006.01)、 sxa2(SPAC1296.03c)である。
他の遺伝子群の遺伝子としては、 ppp80(SPAC 19B 12.08)が好ましい。 より具体的な標的遺伝子の組合せとしては、 cdb4(SPAC23H4.09)、 ppp22(SPBC14 C8.03)および ppp53(SPAP14E8.04)からなる群から選ばれる 1種以上の遺伝子と、 isp6 (SPAC4A8.04), pppl6(SPBC1711.12)、 psp3(SPAC1006.01)および sxa2(SPAC1296.0 3c)力 なる群力 選ばれる 2種以上の遺伝子の合計 3種以上の遺伝子の組合せが 好ましい。より好ましくは、 ppp53(SPAP14E8.04)および cdb4(SPAC23H4.09)からなる 群から選ばれる少なくとも 1種の遺伝子および isp6(SPAC4A8.04)と psp3(SPAC1006.0 1)とを含む合計 3種以上の遺伝子の組合せである。例えば、 psp3 (SPAC1006.01)、 is p6(SPAC4A8.04)、 ppp53(SPAP14E8.04)の少なくとも 3種が好ましい（後記表 3参照）。 さらに好ましくは、 ppp53(SPAP14E8.04)、 isp6(SPAC4A8.04)、 psp3(SPAC1006.01) および pppl6(SPBC1711.12)を含む 4種以上の遺伝子の組合せであり、さらには ppp5 3(SPAP14E8.04)、 isp6(SPAC4A8.04)、 psp3(SPAC1006.01)、 pppl6(SPBC1711.12)お よび ppp22(SPBC14C8.03)を含む 5種以上の遺伝子の組合せが好ましい。さらに 6種 以上の遺伝子を標的とする場合は、これら 5種の遺伝子にさらに sxa2(SPAC1296.03c )を組合せることが好ま Uヽ (後記表 3参照)。
破壊する遺伝子の種類の数の上限は、本発明の目的が達せられる限り特に限定さ れない。しかし、あまりに多種類の遺伝子を破壊すると増殖速度が低下しすぎるなど の好ましくな 、影響が生じやす 、。本発明における遺伝子破壊宿主の相対増殖速 度 (遺伝子を破壊する前の S.pombe菌株に比較した増殖速度）は 0. 6以上が好ましく 、特に 0. 8以上が好ましい。また、破壊されても増殖速度低下に影響が少ない遺伝 子であっても、それが破壊されたことにより外来遺伝子の発現効率向上の効果が少 な 、遺伝子もあると考えられる。このような遺伝子は本発明にお 、て破壊する意義が 少ない。このような理由により、通常、破壊される遺伝子の種類の数の上限は 20種類 以下が適当であると推定され、 10種類以下が好ましい。
[0024] また本発明は、この改良された宿主に、その宿主が本来有しないタンパク質 (すな わち、異種タンパク質)をコードする遺伝子 (以下、外来遺伝子という）を遺伝子組換 え法により導入してなる宿主 (すなわち、形質転換体)、および、当該形質転換体を 培養してその異種タンパク質を生産し採取する、異種タンパク質の製造方法である。
[0025] 本発明の改良された宿主を使って生産する異種タンパク質としては、限定されるも のではないが、多細胞生物である動物や植物が生産するタンパク質が好ましい。特 に哺乳動物（ヒトを含む）の生産するタンパク質が好ましい。例示的には、ヒト成長ホ ルモンが挙げられる。このようなタンパク質は E.coliなどの原核細胞微生物宿主を用 V、て製造した場合活性の高 、タンパク質が得られな 、場合が多ぐまた CHO細胞な どの動物細胞を宿主として用いた場合には、通常生産効率が低い。本発明における 遺伝子改変した真核細胞微生物を宿主とする場合はこれらの問題が解決されると考 えられる。
[0026] 本発明の改良された宿主を使った遺伝子組換え技術としては、酵母を宿主として 用いた遺伝子組換え法に関しては、異種タンパク質をより安定に効率よく発現させる ために種々の発現システム、特に発現ベクター、分泌シグナル遺伝子導入発現べク ター等が開発されており、これらを広く応用可能である。例えば、 S.pombeを宿主とし た発現システムとしては、特許 2776085、特開平 07-163373、特開平 10-215867、特開 平 10-234375、特開平 11-192094、特開 2000-136199、特開 2000-262284、 WO96/02 3890等が知られており、本発明の異種タンパク質を製造する方法には広くこれら発現 システムが利用できる。
[0027] 以下に本発明を具体的な実施例によりさらに詳細に説明する。以下の実施例は、 プロテアーゼ関連遺伝子をマーカー遺伝子に置換してプロテアーゼ関連遺伝子を 削除した S.pombeの例であり、以下この遺伝子削除を破壊ともいう。
以下において、パーセント（％)は、断らない限りいずれも質量％を表わす。 実施例 1
[0028] < S.pombe菌株の形質転換及び培養条件 >
全ての S.pombe菌株は ARC001 (h— leul- 32)および ARC010 (h— leul- 32ura4- D18)由 来のものを用いた。形質転換は、酢酸リチウム形質転換方法 (Okazaki K et al. 19 90. Nucleic Acids Res 18: 6485- 6489.)を用いて行なった。形質転換混合物を M MA (ァガー添加最小培地、 Qbiogene社製）または MMA+Leu (ロイシン添加） ヘプレ 一ティングし、 32°Cにて 3〜4日間インキュベートした。培養物を YES培地 [サプリメント 添カ卩酵母抽出物、 0.5%Bactoyeast extract (Becton、 Dickinson and Company社製) 、 3%グルコース及び SPサプリメント（Qbiogene社製）を含有]、 YPD培地 [l%Bactoyeast extract ^ 2%Bacto peptone (Becton、 Dickinson and Company社製)及び 2% グル コース]、 SDC- Uraおよび SDC- Ura- Lue培地（ゥラシル又はゥラシル及びロイシンの両 方を欠乏する合成デキストロース完全培地、 Qbiogene社製）にて培養した。
[0029] <組換え DNAの作製 >
糸且換え DNAは Sambrookらの方法（Sambrook J et al. 1989. Molecular Cloning.
A Laboratory Manual. 2nded. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor)を用 ヽて作製した。制限酵素及び DNA修飾酵素はタカラバイオ社製 、 TOYOBO (東洋紡績)社製、二ツボンジーン社製またはロシュダイァグノスティックス 社製のものを使用した。 PCR増幅による遺伝子破壊断片は、 KOD Dash DNAポリメ ラーゼ (TOYOBO社製)を使用して調製した。全ての酵素は製造元のプロトコールに 従 、使用した。プラスミドは Escherichiacoli strain DH5 (TOYOBO社製）を使用して 調製した。 DNAシーケンシングは DNA sequencerABI Prism 3100 genetic analyz er (アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行なった。酵母ゲノム DNAは DNeasy g enomic DNA purification kit (キアゲン社製）を用いて調製した。
[0030] くプロテアーゼ遺伝子を削除した S.pombe株の構築 >
染色体の配列データ（Wood et al., 2002, http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_ pombe/)及び S.pombe Gene DB (http://www.genedb.org/genedb/pombe/)にお ける記述により、 62個の遺伝子を S.pombe推定プロテアーゼ（S.pombe putative prot eases, ppp)としてリスト化した。表 1に S.pombeの既知および推定プロテアーゼのリスト を示す。リストイ匕されたプロテアーゼ遺伝子の ORF (オープンリーディングフレーム）を 、 ura4遺伝子カセットを選択マーカーとして用いる PCR媒介相同組換え法 (Bahler J et al. 1998. Yeast 14: 943- 951.)により破壊した。すなわち、 200〜300bpの各 標的 ORFに対する^および^のフランキング配列を、適切な遺伝子間アダプターぺ ァを用いた 2回の PCRにより S.pombe親株 ARC001の染色体 DNAから増幅した。該遺 伝子間アダプターペアは^及び^末端が各々融合するように設計した。さらなる融 合伸長 PCRを行うことにより、 ura4遺伝子カセットを二つの調製された融合 PCR産物 の間に挟んで連結させて、プロテアーゼ遺伝子を破壊するためのベクター（以下、遺 伝子破壊ベクターと 、う）を作製した。 [0031] 上記遺伝子破壊ベクターを用いて S.pombe菌株 ARC010を形質転換した。形質転 換した菌を最小培地で培養し、最小培地 (MMA+Leuプレート）でコロニーを形成する ゥラシル非要求性の株を取得した。この菌株について、コ口-一 PCR及び DNA塩基 配列決定を行い、プロテアーゼ遺伝子が破壊されて 、ることを確認した。
[0032] [表 1]
Table 1.— S. Dombe putative proteases selected for gene disruption.
Figure imgf000016_0001
[0033] <細胞増殖速度の測定 >
上記方法で得られたプロテアーゼ遺伝子が破壊された S.pombe菌株の細胞増殖速 度を測定した。ノ ィオフオトレコーダー（アドバンテック東洋社製、 TN- 1506)を用いて S.pombe株の増殖曲線を得た。細胞は、 L字型試験管において 5mlの YES培地中で 3 2°Cにて振とう培養した。 660nmの吸光度において細胞の濁度を 5分毎に測定した。 5 2個のプロテアーゼ破壊株の各最大比増殖速度（ μ )を測定した。 ARC001株で測 max
定された 値 (0.26- 0.30/時間）を基準として、これらの相対 値を算出した。図 max max
1に、プロテアーゼ遺伝子が破壊された株の相対的な最大比増殖速度を示す。
[0034] その結果、図 1に示すように、いくつかのプロテアーゼ遺伝子は細胞増殖率に影響 を与えることが判明した。例えば、 9個のプロテアーゼ遺伝子（qcr2、 octl、 ppp23、 pp p37、 ppp72、 ppp73、 ppp79及び ppp81)の破壊により、コントロールである ARC001と比 較して の減少が相対的に 20%以上もの幅で減少した。また、 3個のミトコンドリア max
シグナルプロセッシングプロテアーゼ（qcr2、 ppp72及び ppp73)の破壊により、 40%以 上もの減少が観察された。このことは、これらすベてのプロテアーゼ遺伝子が S.pomb eの細胞呼吸作用にお 、て非常に重要であること、及び該遺伝子の破壊はタンパク 質発現には望ましくないことを示している。このような細胞増殖率の減少は、効果的な タンパク質生産において重大な障害であると考えられる。一方、 cdb4、 pppll、 pppl7 、 ppp51、 ppp54、 ppp57、 ppp60及び ppp63を破壊した場合、 20%より大幅に μ が増 max カロした。このような細胞増殖率の増加は、タンパク質生産の障害にはならないと考え られる。
実施例 2
[0035] <r-hGHを産生する形質転換体 ARC001 (hGH)の構築 >
r-hGHを分泌発現するためのマルチカセットベクターを作製し、 r-hGHを産生する 形質転換体 ARC001 (hGH)を構築した。高発現する S.pombe遺伝子である adh、 tpi及 び gdp 1の ORF配列により、 S.pombeでの翻訳に好まし!/、（高バイアス）コドン表を用 ヽ 、 594bpの hGH- ORFを人工的に合成した（Gene. Art社製）。制限酵素 A11II及び Bam HIを用いて融合ベクター pXL4 (Isoai et al., 2002 Biotechnol Bioeng 80: 22-32 -)力ら、合成 hGH遺伝子を下流の P3分泌シグナル (WO96/023890参照）と共にフレ ームに融合させた。そして、文献（Ikeda et al.， 2004 J. Biosci Bioeng98: 366-3 73)の方法で、図 2に示したタンデムな 8個の hGH発現カセット（hCMV-プロモーター/ P3-シグナル/ hGH- ORF/ターミネータ一）力 構成される、マルチカセット発現べクタ 一 pTL2P3hGHhb (M5) -8XLを構築した。該マルチカセット発現ベクターおいて、タン デムな 8個の hGH発現カセットを、上記方法により得られたプロテアーゼ遺伝子を削 除した S.pombe株の leul遺伝子座に挿入し、形質転換した。 SDC- Leu-Ura培地にて 2 〜3日間培養することによりロイシン非要求性の株を取得し、再び YPD培地 (24ゥエル プレート）に移し 32°Cにて振とうしながらインキュベートした後、 r-hGH分泌を確認した
[0036] 図 2に r-hGHを分泌発現するための構築されたマルチ発現カセットベクターの構造 を示す。末端に A11II 及び BamHI切断サイトを有する、 594 bpの S.pombe高バイアス コドン型 hGH構造遺伝子を、 P3分泌シグナル配列の下流に配置した後、組込型発現 ベクター pXL4のマルチクローユングサイト（MCS)に挿入した。マルチ発現カセットべ クタ一を構築するため、得られたベクター pTL2P3hGHhb(M5)-lXLにおいて、 Spel及 び Nhel切断サイトを分泌発現カセット [hCMVp- P3- hGHhb- terminator]の 2つの末端 に配置し、タンデムな 8コピーの発現カセットからなる 8XL発現ベクター pTL2P3hGHh b(M5)-8XLを構築した。宿主株である ARC001の leul遺伝子座にマルチ発現カセット を leul遺伝子に挿入するため、当該コンストラクトにおける二個の遺伝子間 leul+遺伝 子配列を用いた。
[0037] <形質転換体 ARC001 (hGH)より分泌された r- hGHの検出 >
上記方法により得られた形質転換体 ARC001 (hGH)における r-hGHの分泌及び分 解を確認した。該形質転換体をガラス管又は 24ゥエルプレート中の YPD培地に 32°C にて振とうしながら培養した後、様々な培養時間において 0.5〜1.0mlの培養培地を 回収した。その後、培養上清を TCA (終濃度 10%トリクロ口酢酸)で沈殿させた後に一 連の SDS-PAGE分析を行なった。標準的な SDS-PAGEは、還元性条件下で 18%ポリ アクリルアミドゲル (テフコネ土製)を用いて行なった。ゲルを CBB染色して hGH検出した 。ヒト下垂体由来の天然 hGH (バイオジェネシス社製）をコントロールとして用いた。 4 つのクローンのうち 1つの陽性クローンを選択し、 -80°Cにて 25%グリセロールで保存し た。
[0038] 図 3Aは、形質転換体 ARC001 (hGH)による r-hGH分泌量の経時変化分析を示す。
レーン Mは分子量マーカー（単位：キロダルトン）である；レーン hGHは 1 μ gのヒト由来 精製天然 hGHである；レーン 24〜144は 24〜144時間培養した形質転換体 ARC001 (h GH)の培養上清 0.5mlを TCA沈殿させて SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-P AGE)を行なったものである。いずれもクマシ一ブリリアントブルー（CBB)によって染 色し、検出した。
[0039] SDS-PAGEによる r-hGH分泌の経時的変化分析の結果、図 3Aに示すように培養 培地中の分泌された r-hGHの見かけ上の量は、 48時間より長く培養することにより劇 的に減少した。このことは、培養培地中に分泌された r-hGHのタンパク質分解が起き ている可能性を示唆する。
[0040] <プロテアーゼ阻害剤を用いた hGH分解性細胞外プロテアーゼのスクリーニング > 上記方法により得られた形質転換体の培養培地に各種プロテアーゼ阻害剤を添カロ して、 r- hGH分解性の細胞外プロテアーゼのスクリーニングを行なった。 r- hGH産生 S .pombe株 ARC001[pTL2P3hGHhp(M5)- 8XL]を、 20mlの YPD培地で 32°Cにて 24時間 2次培養した。そして、 24時間培養した細胞を含む培地を新しい 24ゥエルプレートに 移し（1.0ml/ゥエル）、一連のプロテアーゼ阻害剤を用いて細胞外のプロテアーゼ活 性をスクリーニングした。培養上清の一部をこの時点で- 20°Cにて陽性コントロールと して保存した。その他の細胞は、一連のプロテアーゼ阻害剤を各ゥエルに別々に添 加した後、さらに 32°Cにて 2日間振とう培養した。プロテアーゼ阻害剤セット（ロシュダ ィァグノスティックス社製）に含まれる 10種のプロテアーゼ阻害剤をそれぞれ規定量 各ゥエルに別々に添カ卩した。ネガティブコントロールのゥエルには阻害剤を全く添カロし なかった。各ゥエルにつ!、て 0.5mlの YPD培養上清を培養時間 72及び 96時間にお!/ヽ て回収し、 TCA(10%w/v)沈殿により濃縮した後、 SDS-PAGEにより分析した。
[0041] 図 3Bは様々なプロテアーゼ阻害剤を、形質転換体 ARC001 (hGH)の培養培地に 添加した際の影響 (r-hGH分泌量の経時変化）を、 SDS-PAGE (CBB染色)で検出し た結果を示す。レーン Mは分子量マーカー（単位：キロダルトン）である；レーン hGHは 0.5 μ gの天然 hGHである；レーン Cは、 YPD培地で 24時間培養し、様々なプロテア一 ゼ阻害剤を添加する直前に- 20°Cで保存した培養上清のコントロールサンプルであ る；レーン- PIはプロテアーゼインヒビターを全く添カ卩しなかった培養上清のコントロー ルサンプルである；レーン 3〜12は図中に記載した 10種のプロテアーゼ阻害剤を添カロ した培養上清サンプルである。
[0042] その結果、図 3Bに示すように阻害剤キモスタチンを培養培地に添加すると、分泌さ れた r-hGHの 22 kDaの主なフラグメントが増加することがわかった。アンチパインの 添カ卩によっても、 r-hGH分解に対するわずかな阻害効果が観察された。アンチパイン はパパイン様システィンプロテアーゼ (例えば、パパイン）、および、トリプシンおよび プラスミンなどのいくつかのセリンプロテアーゼを阻害する。キモスタチンは、キモスタ チン様特異性 (例えば、キモトリブシン、キマーゼおよびカテブシン G)並びにいくつ かのカテブシン B、 Hおよび Lなどのシスティンプロテアーゼとともに、主にセリンプロテ ァーゼを阻害する。このことから、いくつかの未知のキモスタチン感受性セリン一（お よび Zまたはわずかなシスティン一）型プロテアーゼが培養培地中に（または細胞表 面上に）分泌され、これにより培養過程にお!ヽてタンパク質分解が誘導されて ヽる可 能性が示された。
[0043] <形質転換体 ARC001 (hGH)の r- hGH分泌レベルの分析 >
上記方法で得られた形質転換体 ARC001 (hGH)における r-hGHの分泌レベルの経 時変化を分析した。プロテアーゼ遺伝子が破壊された株および ARC001を hGH発現 ベクターで形質転換した株について 0.5mlの YPD培養上清を培養時間 72及び 96時間 において回収し、該培養上清を TCAにより濃縮し、 SDS-PAGEにより解析した。 SDS- PAGEは、還元条件下にて 18%のポリアクリルアミドゲルで行い、クマシ一ブリリアントブ ルー G-250で染色した。各株をその削除したプロテアーゼ遺伝子名により示す:分子 量マーカーとして Bench Mark prestained protein ladder (インビトロジェン社製)を 用いた。図 4に、その結果を示す。
[0044] その結果、図 4に示すように、各形質転換体 ARC001 (hGH)間で r-hGH分泌量の差 が観察された。ここで、 r-hGHの分解は 12個の形質転換体 ARC001 (hGH) (プロテア ーゼ遺伝子 sxa2、 psp3、 isp6、 cdb4、 ppp22、 ppp51、 ppp52、 ppp60及び ppp79を破壊 した S.pombe株の形質転換体）で減少した。これらのプロテアーゼのうち、 sxa2、 psp3 、 isp6及び ppp7はセリンプロテアーゼであり、 cdb4、 ppp22、 ppp51、 ppp52及び ppp60 はメタ口プロテアーゼファミリーに属している。したがって、予想されるセリンプロテア ーゼに加え、いくつかのメタ口プロテアーゼも分泌 r-hGHの細胞外タンパク質分解に 関与して!/、ることが示唆された。
[0045] 図 4に示すように、矢印で示した sxa2、 psp3、 ppp51および ppp52を破壊した S.pombe は、他のプロテアーゼ遺伝子を破壊したものよりも多量の r-hGHを発現した。また、 sx a2、 psp3、 ppp51および ppp52破壊した S.pombeは、 pppl6を破壊したもの（WO02/101 038の実施例参照）よりも多量の r-hGHを発現して 、る。
実施例 3
[0046] くプロテアーゼ関連遺伝子を多重に破壊した S.pombe株の構築 >
実施例 2 (非特許文献 1)における記述により、 S.pombeプロテアーゼ関連遺伝子 の単独破壊によって作製された 52種類のプロテアーゼ関連遺伝子単独破壊株の中 カゝら選抜された、表 2に示す 13個を、多重破壊候補のプロテアーゼ関連遺伝子とし た。表 2にリストイ匕されたプロテアーゼ関連遺伝子の ORF (オープンリーディングフレ ーム）を、 ura4遺伝子カセットを選択マーカーとして用いる PCR媒介相同組換え法 (非 特許文献 1)により破壊した。すなわち、 200〜300bpの各標的 ORFに対する^および 3'のフランキング配列を、適切な遺伝子間アダプターペアを用いた 2回の PCRにより S .pombe親株 ARC001の染色体 DNAから増幅した。該遺伝子間アダプターペアは^及 び^末端が各々融合するように設計した。
さらなる融合伸長 PCRを行うことにより、 ura4遺伝子カセットを二つの調製された融 合 PCR産物の間に挟んで連結させて、プロテアーゼ関連遺伝子を破壊するための遺 伝子破壊ベクターを作製した。
[0047] 上記遺伝子破壊ベクターを用いて S.pombe菌株 ARC010を形質転換した。形質転 換した菌を最小培地で培養し、最小培地 (MMA+Leuプレート)でコロニーを形成する ゥラシル非要求性の株を取得した。この菌株について、コロニー PCR及び DNA塩基 配列決定を行 ヽ、プロテアーゼ関連遺伝子が破壊されて ヽることを確認した。
[0048] 上記によって確認されたプロテアーゼ関連遺伝子破壊菌株を MMA+Leu+Ura+FO A培地上で培養し、コロニーを形成するゥラシル要求性の株を取得した。取得された 菌株に再び新たなプロテアーゼ関連遺伝子の破壊を行う工程を繰り返し、表 3に示 すプロテアーゼ関連遺伝子多重破壊株を作製した。
[表 2] 多重破壊候補に選ばれたプロテアーゼ （一部推定） 遺伝子のリスト
Gene nam Systematic na Protease f
No. Descriptions
e me amily
1 Cdb4 SPAC23H4.09 Metal lopept idase M24X
2 isp6 SPAC4A8.04 Subt i lase-type proteinase S8A
3 mas2 SPBC18E5.12c Mitochondrial processing pept M16B idase a
4 pgpl SPCC1259.10 Endopeptidase M22
5 PPPlS SPBC17I1.12 Dipept idyl pept idase S9C
6 ppp20 SPAC4F10.02 Aspar ty 1 aminopept idase M18
7 PPP22 SPBC14C8.03 Methionine metal lopeptidase M24A
8 卿 5ゾ SPAC22GT.01c Aminopept idase 24B
9 ppp52 SPBC18A7.01 Aminopept idase M24B
10 ppp53 SPAP14E8.04 Zinc metal lopept idase M48B
11 ppp80 SPAC19B12.08 Peptidase C54
12 psp3 SPAC1006.01 Subt ilase-type pept idase S8A
13 sxa2 SPAC1296.03c Serine carboxypept idase S10 [表 3]
作製された S. pombeプロテアーゼ関連遺伝子多重破壊株リスト
Groups Disrupted protease genes in each strain Strain name
A1 psp3 GF241
A2 psp3- isp6 MGF242
A3 psp3- isp6- ppp53 MGF265
A4-1 psp3- isp6- PPP53- cdb4 MGF279
A4-2 psp3- isp6- 卿 53- pppl6 MGF281
A4-3 psp3- isp6 ppp53- pppSl MGF280
A A5 psp3- isp6- ppp53- ρρρΐβ- PPP22 MGF311
A6 psp3- isp6- ppp53- 講 16- 腳 22- - sxa2 MGF323
A7-1 psp3- isp6- 卿 53 - PPP16- 卿 22- MGF339
A7- 2 psp3- isp6- ,53- ρρρΐβ- ppp22- - sxa2- ppp20 MGF340
A7-3 psp3- isp6- 卿 53 - ,16- ,22- - sxa2- ppp80 MGF341
A8 psp3- isp6- ppp53- ρρρΐβ- ppp22- - sxa2- ppp80- MGF433
PPP20
B3 psp3- isp6 cdb4 GF264
B4- 1 psp3- isp6- cdb4- sxa2 MGF276
B B4-2 psp3- isp6- cdb4- mas2 GF277
B4-3 psp3- isp6- cdb4- pppSl MGF278
B5 psp3- lsp6- cdb4- sxa2- ppp52 GF317
<細胞増殖速度の測定 >
上記方法で得られたプロテアーゼ関連遺伝子が破壊された S.pombe菌株の細胞増 殖速度を測定した。ノ ィオフオトレコーダー（アドバンテック東洋社製、 TN- 1506)を用 いて S.pombe株の増殖曲線を得た。細胞は、 L字型試験管において 5mlの YES培地 中で 32°Cにて振とう培養した。 660nmの吸光度において細胞の濁度を 5分毎に測定 した。 17個のプロテアーゼ多重破壊株の各最大比増殖速度（ μ )を測定した。 ARC max
001株で測定された μ 値 (0.26-0.30/時間）を基準として、これらの相対 μ 値を算 max max 出した。
図 5に、プロテアーゼ関連遺伝子が破壊された株の相対的な最大比増殖速度を示 す。 ARC001株 (AOと示されている）の 測定値（0.30±0.02/h)を標準値として、各 max
菌株の 測定値からそれぞれの相対 値を算出した。グラフの縦軸は相対
max max max 値を、横軸は菌株名略称 (前記表 3にその詳細を示した)を示す。
[0052] その結果、いくつかのプロテアーゼ関連遺伝子は細胞増殖率に影響を与えること が判明した。また、 6重及び 7重破壊株の相対増殖速度が 10〜20%程減少したことが 判った上、その減少幅は主に ppp22と ppp20の 2つのプロテアーゼ関連遺伝子を破壊 した時点で大き力つたことも判明された。この 2つの遺伝子は、単独破壊状態では細 胞増殖にほとんど影響を示して 、な 、ことから、プロテアーゼ関連遺伝子の多重破 壊による複合的な影響が考えられた。だが、増殖速度の低下レベルは全体的に 1〜 2割程度の低い水準にとどまつていることから、実際の物質生産時に与える影響は小 さいと予測される。実際に、相対増殖速度の減少が細胞最大増殖密度にどれぐらい 影響を与えるかどうかを調べるために、相対増殖速度が一番低く落ちた多重破壊株 A8 (MGF433)を対象にして、 YES培地で 4日間培養した後の最終細胞密度を確認し てみた。その結果、 8重破壊株 A8の OD (660nm)最大測定値が野生株 ARC001に比 ベて逆に 10%以上も上昇していることが判明された。その主な原因としては、多重破 壊株はその増殖速度が落ちた分、栄養をゆっくり有効に使え、無駄なエタノール発 酵も抑えられたため、細胞分裂がより長い時間続いたことが考えられる。よって、この ような細胞増殖率の増加は、タンパク質生産の障害にはならないと考えられる。
実施例 4
[0053] < hGH生産によるプロテアーゼ多重破壊株の有効性評価 >
実施例 2 (非特許文献 1)では、ヒト成長ホルモン (以下 hGHと記載する）を用いた プロテアーゼ単独破壊株の有効性評価手法すなわち hGHを生産する形質転換体 A RC001 (hGH)の構築ならびに形質転換体 ARC001 (hGH)より分泌された hGHの検出 による手法、ならびにそのタンパク質の分泌型異種生産モデルとしての有効性を記 載した。本実施例 4においても、 hGHを同じく分泌型異種タンパク質のモデルとして 採用し、プロテアーゼ多重破壊株の有効性評価を行った。その実験では、各株によ る hGHの分泌生産能力から、プロテアーゼ関連遺伝子の多重破壊の生産物分解に 与える抑制効果を調べた。 hGHをプロテアーゼ多重破壊株で発現させるために、実 施例 2 (非特許文献 1)に記載の染色体組込型 hGH構成分泌発現ベクター pTL2P3h GHhb(M5)- 8XLを用いて、酢酸リチウム法によって各株の形質転換を行った。 6個の 形質転換体の中から、 hGHを一番安定的に分泌生産できるクローン 1個を選び、分 泌量を経時的に測定した。さらに実験の再現性を確認するために、異なるクローンも 同様に用いた。
特に両グループの多重破壊株の中でも主な株に絞って、 hGH量の経時変化を SDS -PAGEによって詳しく調べた。その結果を図 6に示す。
図 6は、 S.pombeプロテアーゼ関連遺伝子多重破壊株による hGH分泌生産量の経 時変化を示す SDS-PAGE観察図である。分泌生産された hGHの経時変化を SDS-PA GEによって解析した結果 (クマシ一ブリリアントブルー染色）を示す。各株の各培養時 点での培養上清 0.5mlを TCA沈澱した後、 SDS-PAGEで分析した。各レーン上段に 菌株名略称 (前記表 3にその詳細を示した)を示すとともに、下段にはプロテアーゼ 関連遺伝子の削除の流れも示した。レーン AO (nond: non-disrupted strain)はプロ テアーゼ非破壊株 ARC001を表す。
SDS-PAGE分析結果から、プロテアーゼ関連遺伝子の多重破壊によって hGHの分 泌生産量が著しく増加されたことが確認できる。その解析結果力 みると、 hGH生産 量力 24h時点では各株間でほとんど同じぐ 48hから差が出始め、その差が遺伝子多 重破壊のレベルアップによって大きくなつていくことがはっきり判明できる。それは、 h GHの基礎発現量は各株間には殆ど同じぐ 72h以降力 発生した発現量での差は主 に hGHの分解量での違いによるものであることを意味する。因みに、 hGHの分泌生産 量は、プロテアーゼ非破壊株 A0では 48hr時点での最大値をピークに激減して 、くに 比べて、多重破壊株では 72h又は 96h時点まで増加しつづけ、この増加幅が多重破 壊レベルの上昇に伴って拡大して 、ることも確認された。このような現象はグループ B よりもグループ Aでの多重破壊株でもっと著しぐ 5重、 6重破壊株 A5と A6での hGH量 は 120h時点まで高い水準に保たれていることが判った。これは、より多くのプロテア一 ゼ関連遺伝子の多重破壊によって hGHの分解速度が一層有効的に抑制されたこと をはっきり示した力 プロテアーゼ多重破壊対象の違う組合せによってその効果も違 うことも同時に示唆した。これは、プロテアーゼ多重破壊過程では、より多くの破壊組 合せを試すことによって、一番良いものを選抜することの重要性を意味し、今回とつた 手法が有効であったことも明らかになった。
[0055] 上述の hGH発現実験による実証過程では、グループ Aの 5重破壊株以降はほとん ど効果に差が確認できなかったので、グループ Aのプロテアーゼ 7重破壊株 3種類の 実証は、別途培養時間を 216hまで延長して行った。その SDS-PAGE結果を図 7に示 す。
図 7は、 S.pombeプロテアーゼ関連遺伝子 6重および 7重破壊株による hGH分泌生 産量の経時変化を示す SDS-PAGE観察図である。各株の各培養時点での培養上清 0.5mlを TCA沈澱した後、 SDS- PAGE (クマシ一ブリリアントブルー染色）で分析した。 各レーン上段に菌株名略称 (前記表 3にその詳細を示した）を示す。レーン AOはプロ テアーゼ非破壊株 ARC001を表す。
その結果から、 7重破壊株は 6重破壊株とほとんど同じ効果を示し、 216h時点まで h GH分泌生産量経時変化にほとんど違いが無いことが確認された。今回の実証実験 方法を用いた際には、 5重破壊以降の有効性での差異を確認するのは難しぐ違い の検出には限界が見られた。これは、プロテアーゼに更に弱い異種タンパク質をモ デルした実証実験によって解決できる可能性があると考えられる。
産業上の利用可能性
[0056] 本発明にお 、て、分裂酵母 S.pombeの異種タンパク質の分解に関与すると考えら れる 1種以上のプロテアーゼ関連遺伝子を削除または不活性ィ匕した細胞を宿主とし て用いることにより、形質転換体の異種タンパク質の生産効率が向上することがわか つた。このようなプロテアーゼ関連遺伝子破壊株は、プロテアーゼの影響を受けやす Vヽ異種タンパク質の生産に広く用いることができる。 なお、 2005年 8月 3曰〖こ出願された曰本特許出願 2005— 225638号及び 2006 年 6月 8日に出願された日本特許出願 2006— 160347号の明細書、特許請求の範 囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入 れるものである。

Claims

請求の範囲
[1] 遺伝子組換え法により導入した外来遺伝子を発現させるためのシゾサッカロミセス · ボンべ (Schizosaccharomvces pombe)からなる改良宿主を構築する方法にぉ 、て、 セリンプロテアーゼをコードする遺伝子 (セリンプロテアーゼ遺伝子群）、アミノぺプチ ダーゼをコードする遺伝子 (アミノぺプチダーゼ遺伝子群）、カルボキシぺプチダー ゼをコードする遺伝子 (カルボキシぺプチダーゼ遺伝子群）およびジぺプチダーゼを コードする遺伝子 (ジぺプチダーゼ遺伝子群)力 なる群力 選ばれる 1種以上の遺 伝子を標的として当該 1種以上の遺伝子を削除または不活性ィ匕することを特徴とする シゾサッカロミセス ·ボンべ宿主の構築方法。
[2] 標的遺伝子が、 psp3 (SPAC1006.01)、 sxa2 (SPAC1296.03c)、 ρρρδΐ (SPAC22G7.0 lc)および ppp52 (SPBC18A7.01)からなる群から選ばれる 1種以上の遺伝子である、 請求項 1に記載の構築方法。
[3] 遺伝子組換え法により導入した外来遺伝子を発現させるためのシゾサッカロミセス · ボンべ (Schizosaccharomvces pombe)からなる改良宿主を構築する方法にぉ 、て、 メタ口プロテアーゼをコードする遺伝子 (メタ口プロテアーゼ遺伝子群）、セリンプロテ ァーゼをコードする遺伝子 (セリンプロテアーゼ遺伝子群）、システィンプロテアーゼ をコードする遺伝子 (システィンプロテアーゼ遺伝子群）およびァスパラギン酸プロテ ァーゼをコードする遺伝子 (ァスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群)力もなる群力も選 ばれる 2種以上の遺伝子を標的として当該 2種以上の遺伝子を削除または不活性ィ匕 する、シゾサッカロミセス 'ボンべ宿主の構築方法。
[4] 2種以上の遺伝子が、メタ口プロテアーゼ遺伝子群力も選ばれる 1種以上の遺伝子 とセリンプロテアーゼ遺伝子群力 選ばれる 2種以上の遺伝子の合計 3種以上の遺 伝子である、請求項 3に記載の構築方法。
[5] 2種以上の遺伝子が、 cdb4(SPAC23H4.09)、 ppp22(SPBC14C8.03)および ppp53(SP
AP14E8.04)からなる群から選ばれる 1種以上の遺伝子と、 isp6(SPAC4A8.04)、 pppl6(
SPBC1711.12), psp3(SPAC1006.01)および sxa2(SPAC1296.03c)からなる群から選ば れる 2種以上の遺伝子の合計 3種以上の遺伝子である、請求項 3または 4に記載の 構築方法。
[6] 前記遺伝子の ORF (オープンリーディングフレーム)部分をマーカー遺伝子に置換 して当該遺伝子を削除または不活性ィ匕する、請求項 1〜 5の 、ずれかに記載の構築 方法。
[7] 遺伝子組換え法により導入した外来遺伝子を発現させるためのシゾサッカロミセス · ボンべ (Schizosaccharomvces pombe)からなる改良宿主であって、 psp3 (SPAC1006. 01)、 sxa2 (SPAC1296.03c)、 ρρρδΐ (SPAC22G7.01c)および ppp52 (SPBC18A7.01)か らなる群力も選ばれる 1種以上の遺伝子が削除または不活性ィ匕されている、シゾサッ カロミセス ·ボンべ宿主。
[8] 遺伝子組換え法により導入した外来遺伝子を発現させるためのシゾサッカロミセス · ボンべ (Schizosaccharomvces pombe)からなる改良宿主であって、メタ口プロテア一 ゼをコードする遺伝子 (メタ口プロテアーゼ遺伝子群）、セリンプロテアーゼをコードす る遺伝子 (セリンプロテアーゼ遺伝子群）、システィンプロテアーゼをコードする遺伝 子 (システィンプロテアーゼ遺伝子群）およびァスパラギン酸プロテアーゼをコードす る遺伝子 (ァスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群)力 なる群力 選ばれる 2種以上の 遺伝子が削除または不活性ィ匕されている、シゾサッカロミセス 'ボンべ宿主。
[9] 2種以上の遺伝子が、メタ口プロテアーゼ遺伝子群力も選ばれる 1種以上の遺伝子 とセリンプロテアーゼ遺伝子群力 選ばれる 2種以上の遺伝子の合計 3種以上の遺 伝子である、請求項 8に記載の宿主。
[10] 2種以上の遺伝子が、 cdb4(SPAC23H4.09)、 ppp22(SPBC14C8.03)および ppp53(SP AP14E8.04)からなる群から選ばれる 1種以上の遺伝子と、 isp6(SPAC4A8.04)、 pppl6( SPBC1711.12), psp3(SPAC1006.01)および sxa2(SPAC1296.03c)からなる群から選ば れる 2種以上の遺伝子の合計 3種以上の遺伝子である、請求項 8または 9に記載の 宿主。
[11] 請求項 7〜： L0のいずれかに記載の宿主に、異種タンパク質をコードする遺伝子を 導入してなる形質転換体。
[12] 異種タンパク質をコードする遺伝子とともに分泌シグナル遺伝子を導入してなる、請 求項 11に記載の形質転換体。
[13] 請求項 11または 12に記載の形質転換体を培養して異種タンパク質を生産し採取 することを特徴とする異種タンパク質の製造方法。
[14] 請求項 12に記載の形質転換体を培養し、異種タンパク質を生産し該異種タンパク 質を培養液に分泌させ、該培養液力ゝら該異種タンパク質を採取することを特徴とする 異種タンパク質の製造方法。
[15] 異種タンパク質がヒト成長ホルモン (hGH)である、請求項 13または 14の製造方法。
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