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WO2007014992A2 - Anticorps diriges contre le recepteur du ldl - Google Patents

Anticorps diriges contre le recepteur du ldl Download PDF

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WO2007014992A2
WO2007014992A2 PCT/FR2006/001807 FR2006001807W WO2007014992A2 WO 2007014992 A2 WO2007014992 A2 WO 2007014992A2 FR 2006001807 W FR2006001807 W FR 2006001807W WO 2007014992 A2 WO2007014992 A2 WO 2007014992A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
ldl
antibody
antibody according
cells
Prior art date
Application number
PCT/FR2006/001807
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English (en)
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WO2007014992A3 (fr
Inventor
Christian Behrens
Christine Gaucher
Jean-François Prost
Jamila Najib
Original Assignee
Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Groupement D'interet Public
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Groupement D'interet Public filed Critical Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Groupement D'interet Public
Priority to AU2006274752A priority Critical patent/AU2006274752A1/en
Priority to EP06794207A priority patent/EP1937722A2/fr
Priority to CA002618050A priority patent/CA2618050A1/fr
Priority to JP2008524539A priority patent/JP2009502189A/ja
Publication of WO2007014992A2 publication Critical patent/WO2007014992A2/fr
Publication of WO2007014992A3 publication Critical patent/WO2007014992A3/fr

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody directed against the LDL (Low Density Lipoprotein) human receptor, binding to the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO - 1) of the peptide sequence of the human LDL receptor, its use as a medicament, a pharmaceutical composition containing this antibody and its use in immunohistochemical analysis of cancer tissues, healthy or cirrhosis, or in Western blot analyzes, ELISA test or quantifying in vivo.
  • LDL Low Density Lipoprotein
  • Cholesterol is " a lipid made by the liver, intestine and adrenal glands, but it is also provided by the diet.It is involved in the manufacture of sex hormones, corticosteroids such as natural cortisone and components of bile .
  • LDL Low Density Lipoprotein
  • LDL-R LDL receptor
  • Cholesterolemia refers to the level of cholesterol in the blood. Hypocholesterolemia is a sign of cholesterol deficiency in the blood, while hypercholesterolemia is a sign of excess cholesterol in the blood.
  • hypercholesterolemia can as a result of a lack of binding between LDL and LDL-R, or a lack of internalization of LDL, which may result from a familial structural alteration of LDL-R in these patients (Beisiegel et al. , nineteen eighty one).
  • LDL-R LDL receptor expression level
  • LDL-R could serve as a viral receptor.
  • LDL-R is involved in many mechanisms of importance in the cellular life, as well as in many pathologies.
  • LDL-R The study of LDL-R therefore remains a major challenge, both to understand its tissue expression profile in the pathologies in which it intervenes, and to develop and study new therapeutic tools for the treatment of these conditions. pathologies.
  • the invention relates to a monoclonal antibody directed against the human LDL receptor (Low Density Lipoprotein).
  • a first subject of the invention relates to a monoclonal antibody directed against the human LDL (Low Density Lipoprotein) receptor, binding to the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1) of the peptide sequence of the receptor human LDL.
  • LDL Low Density Lipoprotein
  • the human LDL receptor is a transmembrane protein of 839 amino acids which comprises three regions: the extracellular region “( '1-7' 6" 8 "J, the transmembrane region (768-790) and the cytoplasmic region (790-839)
  • the extracellular region is divided into two subregions: the LDL binding region (1-322) and the subregion outside the LDL binding zone (322-768).
  • the antibody according to the invention was produced to specifically bind to the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1) of the peptide sequence of LDL-R. This peptide is located in the LDL binding zone. This peptide was chosen because it has good accessibility to the antibody according to the invention, due to its location in the LDL binding zone, and to its conformation. three-dimensional. In addition, it has the characteristic of being immunogenic, because of its amino acid composition.
  • this peptide has been chosen as a target of the antibodies according to the invention in order to produce an antibody specific for human LDL-R and thus having a good affinity for LDL-R.
  • this peptide has 85% homology with murine LDL-R which allows the production of antibodies that cross-react in humans and mice, hence the possibility of implementing both . (including toxicity) tests in mice and use in humans.
  • the peptide to which the antibody binds may also be a peptide included in the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1) of LDL-R. More particularly, the term "peptide” means any molecule formed by the sequence of at least 2 amino acids, preferably from 5 to 35 amino acids / and possibly more than 35 amino acids.
  • the terms “monoclonal antibody” or “monoclonal antibody composition” refer to a preparation of antibody molecules having identical and unique specificity.
  • antibody whole antibody as well as any polypeptide, peptide or protein comprising at least a domain or fragment of immunoglobulin, and '' that any antibody derivative.
  • An immunoglobulin molecule is composed of 4 polypeptides: 2 identical heavy (H, Heavy) chains of 50 kDa each and 2 identical light (L, Light) chains of 25 kDa each.
  • the light chain is composed of 2 domains, a variable domain V and a constant domain C, folded independently of each other in space. They are called VL and CL.
  • the heavy chain also comprises a V domain denoted VH and 3 or 4 C domains denoted from CH1 to CH4. Each domain comprises about 110 amino acids and is structurally comparable.
  • the 2 heavy chains are linked by disulfide bridges and each heavy chain is linked to a light chain by a disulfide bridge as well.
  • variable parts The region that determines the specificity of the antibody for the antigen is carried by the variable parts, whereas the constant parts can interact with the Fc receptors of the effector cells or molecules as complement to mediate different functional properties.
  • immunoglobulin domain is understood to mean any of the V L, CL, V H, CH 1, CH 2, CH 3 and CH 4 domains.
  • the antibody according to the invention may advantageously contain one or more of these domains, all the combinations between the aforementioned domains are part of the invention.
  • fragment of immunoglobulin one of the fragments selected from • fragment Fab, Fab ', F (ab') 2, Fc, • • a scFv or CDR (complementarity determining region).
  • Fab fragment Frametic Antigen Binding
  • Fc fragment fragment crystallizable
  • an F (ab ') 2 fragment is generated, where the two Fab fragments remain bound by two disulfide bridges, and the Fc fragment is cleaved into several peptides.
  • the F (ab ') 2 fragment is formed of two Fab' fragments, linked by disulfide bonds intercatenaries to form an F (ab ') 2.
  • variable regions of the heavy and light chains it is found that the sequence variability is not distributed equally. Indeed, • ⁇ variable regions consist of a share of very few variables named regions “framework” or “framework” (EN) to the number 4 (FR 1 to FR4) and the other regions in which the variability is extreme: these are the "hypervariable” regions, or CDRs, of which there are 3 (CDR1 to CDR3).
  • a Single Chain Fragment Variable is a fragment consisting only of the variable domains VH and VL of a monoclonal antibody, and whose structure is stabilized by a short flexible peptide arm placed between the two domains (Billiald et al., 1995). .
  • Such fragments can be produced by . bacteria. These molecules retain the ability to specifically recognize an antigen. Small in size (29 kDa), they are poorly immunogenic and better tolerated than whole antibodies.
  • the antibody according to the invention may advantageously contain one or more of these fragments, any combina-isons between les fragments "- mentioned above are part of the invention In a particular aspect of the invention, the.
  • the antibody according to the invention contains at least one immunoglobulin domain and at least one immunoglobulin fragment, for example an Fc fragment and one or more variable or hypervariable regions.
  • antibody, which antibody may comprise one or more mutations, substitutions, deletions and / or additions of one or more amino acid residues.
  • the antibody according to the invention which has the particularity of binding to the peptide corresponding to amino acids 280- 307 (SEQ ID NO: 1) of the human LDL receptor, as well as the characteristics presented below. advantageously allows the recruitment of effector cells.
  • an "effector cell” is a cell that causes the destruction of cells on which - the antibody is bound
  • Target cells More particularly, the effector cells express on their surface a receptor for the Fc fragment of the antibodies.
  • "recruitment” is understood to mean the faculty possessed by the antibody according to the invention for fixing cells capable of causing the destruction of the target cells. The destruction may be lysis, that is, destruction of the target cells with release of their contents.
  • target peptide The peptide on which the antibody according to the invention (“target peptide") binds is located in the LDL binding region (natural ligand of LDL-R).
  • the antibody according to the invention allows the recruitment of cells capable of causing the destruction of "" cells "" on which the antibody according to the invention is bound, that is to say of cells expressing on their surface LDL-R
  • binding is meant the binding of the antibody to the target peptide, as well as the attachment of cells capable of causing the destruction of the target cells.
  • Antibodies according to the invention binds to the target cell by their variable fragment and binds to the effector cells by their constant fragment. This dependent relationship between antibodies • target cells and effector cells Provogue lysis of target cells by ADCC mechanism • (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity).
  • the target cells according to the invention are tumor cells.
  • the antibody according to the invention allows the destruction of cancer cells ("target cells”). Indeed, the recruitment of the effector cells causes destruction of the cells on which the antibody according to the invention is linked.
  • targets cells cancer cells
  • studies have shown that there is a correlation between the increase in the level of expression of LDL-R by cells and certain cancers. Indeed, patients with certain cancers have hypocholesterolemia. This hypocholesterolemia is the consequence of overuse of cholesterol by cancer cells. For survival, the latter induce an increase in the level of expression of the LDL receptor (LDL-R) in tumor bodies (Henrick ⁇ son et al.
  • .- may -c-iter - in particular-cancer of the prostate, breast, liver, pancreas, ovaries, colon, lung, stomach and leukemias.
  • Cancer cells overexpressing LDL-R will therefore be preferred targets of the antibody according to the invention which, by recruitment of cells capable of destroying the cells to which the antibody is bound, will cause the destruction of these cancer cells.
  • the subject of the invention is therefore a monoclonal antibody directed against the human LDL receptor (Low Density Lipoprotein), binding to the peptide corresponding to the amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1) of the peptide sequence of the human LDL receptor.
  • LDL receptor Low Density Lipoprotein
  • At least one CDR (Complementarity Determination Region) region of each of the light chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70% identity with a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and at least one CDR region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70% identity with a sequence chosen from sequences SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7.
  • the CDR regions concerned are the CDR CDR1 and / or CDR2 and / or CDR3 regions.
  • the identity with each of the sequences mentioned above is at least 70%, preferably at least 80%, 90%, 95%, 99% and even more preferably 100% identity.
  • the percentage identity is calculated by aligning the two sequences to be compared and by counting the number of positions with identical amino acid, this number being "divided by the" number of a-amino-Eides total of -block. In any case, these sequence differences in no way affect the affinity of the monoclonal antibody for its target or its ability to recruit effector immune cells.
  • each CDR region of each of the light chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70% identity with the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: • 3, SEQ ID NO: 4 respectively, and that each CDR region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70% identity with the sequences SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 respectively.
  • the CDR1 region of each of the light chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 2
  • the CDR2 region of each of the light chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 3
  • the CDR3 region of each of the light chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 4
  • the CDR1 region of each of the heavy chains of has a peptide sequence having at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 2
  • the CDR2 region of each of the light chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 3
  • the CDR3 region of each of the light chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 4
  • the CDR1 region of each of the heavy chains of has
  • the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 5
  • the CDR2 region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least less than 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 6
  • the CDR3 region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 7.
  • variable region of each of the light chains of the antibody according to the invention is encoded by a nucleic acid sequence having at least 70% identity with the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 8
  • variable region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention is coded by an acid sequence nucleic acid having at least 70% identity with the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 9.
  • identity with each of the sequences mentioned above is at least 70%, preferably at least 80%, and even more preferably 95% or 99% identity.
  • the percent identity is calculated by aligning the 2 sequences to be compared and counting the number of positions having an identical nucleotide, this number being divided by the total number of nucleotides of the sequence.
  • the degeneracy of the genetic code can be at the origin of the fact that the same amino acid can be encoded by several triplets of different nucleotides. In any case, these sequence differences do not affect 'nothing affinity of the monoclonal antibody for its target nor its ability to recruit immune effector cells.
  • variable region of each of the light chains of the antibody according to the invention is encoded by the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 8, and the variable region of each of its heavy chains is coded by the sequence of nucleic acid SEQ ID Ng: ⁇ 9 ⁇ ⁇ .
  • variable region of each of the light chains of the antibody according to the invention has at least 70% identity with the amino acid sequence SEQ ID NO -.
  • variable region of each of its heavy chains has at least 70% identity with the amino acid sequence SEQ ID NO: 11.
  • identity with each of the sequences mentioned above is at least 70%, and preferably at least 80%, and even more preferably 95% or 99% identity. The identity percentage is calculated by aligning the 2 sequences to be compared and counting the number of positions having an identical amino acid, this number being divided by the total number of amino acids of the sequence.
  • variable region of each of the light chains of the antibody according to the invention has the peptide sequence SEQ ID NO: 10 and the variable region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention has the peptide sequence SEQ ID NO: 11.
  • the peptide sequence SEQ ID NO: 10 is the peptide sequence deduced from the nucleotide sequence SEQ ID NO: 8 and the peptide sequence SEQ ID NO: 11 is the sequence deduced from the nucleotide sequence SEQ ID NO: 9.
  • the antibody according to the invention also includes any modified antibody corresponding to the characteristics of the invention, in which one or more amino acids have been added, substituted or deleted. Such an addition, substitution or deletion may be located at any position in the molecule. In the case where several amino acids have been added, substituted or deleted, any combination of addition, substitution or deletion may be considered. Such alterations • - -LA- - • sequence - ⁇ d.es • variable regions of the antibody according to the invention can be performed in order to increase the number of residues likely to come into contact with the pepbide target.
  • an antibody according to the invention may be, that is to say, consist of an F (ab ') 2 fragment, an Fab' fragment, an Fab fragment, a CDR region or any modified version of any one of of these fragments or region.
  • the antibody according to the invention is a murine antibody.
  • this murine monoclonal antibody is an IgGlkappa.
  • Such an antibody can be produced by immunizing an animal, particularly a mouse, with the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1), or with any other human LDL-R peptide located in the LDL binding region.
  • Antibody production methods are known to those skilled in the art.
  • the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1) of the LDL-R sequence can be injected intraperitoneally to Balb / C mice in the presence of Freund's adjuvant. Several immunization reminders are performed in the presence of incomplete Freund's adjuvant. The monitoring of the immune response of the mice is carried out on blood samples by ELISA against the peptide SEQ ID NO: 1.
  • Hybridomas are obtained from the fusion of the spleen cells of the mice immunized with mouse myeloma cells in the presence of PEG (polyethylene glycol). The cells are then cultured and then tested in ELISA for their response against the p-peptide SEQ ID NO: 1.
  • the antibody according to the invention is a chimeric, humanized or human antibody.
  • the antibody according to the invention is chimeric.
  • chimeric antibody is meant an antibody whose variable regions of the light and heavy chains belong to a species different from the constant regions of the light and heavy chains.
  • the antibody according to the invention also has murine variable regions and constant regions belonging to a non-species. murine.
  • all families and species of non-murine mammals are likely to be used, and in particular humans, monkeys, murids (except mice), suids, cattle, equines, felids , canids, for example, and birds.
  • the constant regions of each of the light chains and of each of the heavy chains of the antibody according to the invention are human constant regions.
  • the constant region of each of the light chains of the antibody according to the invention is of type K. Any allotype is suitable for carrying out the invention, for example Km (I), Km (I, 2), Km (I, 2, 3) or Km (3).
  • the constant region of each of the light chains of the antibody according to the invention is of type ⁇ .
  • the region constant of each of the heavy chains of the antibody is of type y.
  • the constant region of each chain - heavy • antibody may be of L hSi type, ⁇ 2 type, ⁇ 3 type these three types of constant regions having the feature of binding the human complement, or even type ⁇ 4.
  • Antibodies possessing a constant region of each of the ⁇ heavy chains belong to the IgG class.
  • Immunoglobulins of the type • G- (IgG) are heterodimers consisting of 2 heavy chains and 2 light chains, linked together by bridges disulfide.
  • Each chain consists, in the N-terminal position, of a region or variable domain (encoded by the rearranged VJ genes for the light chain and VDJ for the heavy chain) specific for the antigen against which the antibody is directed, and in the C-terminal position of a constant region consisting of a single CL domain for the light chain or 3 domains (CH1, CH2 and CH3) for the heavy chain.
  • the combination of the variable domains and the CH 1 and CL domains of the heavy and light chains forms the Fab portions, which are connected to the Fc region by a very flexible hinge region allowing each Fab to bind to its antigenic target while the Fc region, mediator of the effector properties of the antibody remains accessible to effector molecules such as FcDR receptors and CIq.
  • the Fc region consists of two globular domains and CD 2 CD 3, is glycosylated at the CD domain 2 with the presence, on each of two channels, a JW-biantennary glycan linked to Asn 297.
  • the constant region of each of the heavy chains of the antibody is of the ⁇ 1 type, since such an antibody shows an ability to generate ADCC activity " (Antibody-Dependent Cellular
  • any allotype is suitable for carrying out the invention, for example Glm (3), GIm (1, 2, 17), GIm (I, 17) or GIm (I, 3).
  • Chimeric antibodies '' according to the invention can be constructed using standard techniques of recombinant DNA the well known to the art, especially by using construction techniques chimeric antibodies
  • An expression vector is a nucleic acid molecule in which the murine nucleic acid sequence encoding the variable domain of each of the heavy or light chains of the antibody and / or the nucleic acid sequence, preferably human , coding for the constant region of each of the heavy or light chains of the antibody were inserted, in order to introduce and maintain them in a host cell. It allows the expression of these fragments of foreign nucleic acid in the host cell as it Pos' sede the "sequences" essential (promoter, polyadenylation sequence, selection gene) in this expression.
  • the vector may be for example a plasmid, an adenovirus, a retrovirus or a bacteriophage
  • the host cell may be any mammalian cell, for example SP2 / 0, YB2 / 0, IR983F, Namalwa human myeloma, PERC6, CHO lines, especially CHO-K, CHO-LeclO, CHO-LECL, Lecl3 CHO, CHO Pro-5, CHO dhfr-, WII-2, Jurkat, Vero, Molt-4, C0S- '7, 293-HEK , - BHK, K6H6, NSO, SP2 / ⁇ -Ag14 and P3X63Ag8.653.
  • sequences Synthetic signaling and appropriate restriction sites can be fused to variable regions during PCR amplification reactions.
  • the variable regions are then combined with the constant regions of an antibody, preferably a human IgG1.
  • the genes thus constructed are cloned under the control of a promoter (e.g. the RSV promoter) and upstream of a polyadenylation site, using two separate vectors (a 1 in each chain).
  • the vectors are also provided with selection genes known to those skilled in the art, such as, for example, the dhfr gene or the neomycin resistance gene.
  • the chimeric antibodies according to the invention can be produced by cotransfection in a host cell of the light chain expression vector and the fast chain expression vector using a method well known to those skilled in the art. (eg, calcium phosphate co-precipitation, electroporation, microinjection, etc.).
  • the cells can be put in a selective medium, for example in RPMI medium (Invitrogen, ref 21875-034) containing 5% dialysis serum (Invitrogen, ref 10603-017), 500 ⁇ g / ml of -6418 (Invitrogen, ref-10131-0-27-) and 25-n-methotrexate (Sigma, M8407).
  • the supernatants of the resistant transfection wells are screened for the presence of chimeric immunoglobulin (Ig) by ELISA-specific assay. human Ig sequences.
  • the transfectants producing the most antibodies are amplified and their supernatants redosed by ELISA in order to estimate their productivity and to select the 3 best producers for limiting dilution cloning (40 cells / plate).
  • humanized antibody an antibody which contains CDR regions derived from a antibodies of non-human origin, the other parts of the antibody molecule being derived from one (or more) human antibodies.
  • Such antibodies can be prepared according to CDR grafting methods well known to those skilled in the art (US Patent Publication Nos. 5,225,539, US 6,180,370; Jones et al., Nature 321 (6069): 522-5. (1986); Verhoeyen et al., Bioessays 8 (2): 74-8 (1988); Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988); Queen C. et al., Proc Natl Acad Sci USA 86 (24): 10029-33 (1989); Lewis AP and Crowe J.
  • variable domains to be grafted for the production of humanized antibodies are important in order to reduce the immunogenicity of the antibody without altering its affinity for its target.
  • sequence of the variable domain of a murine antibody is compared to a database of sequences of known human variable regions and the nearest human variable sequence 'of murine sequence is -LA- retained as -I 1 R region of the humanized antibody [Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988); Queen C. et al., Proc Natl Acad Sci USA 86 (24): 10029-33 (1989); Sims et al., J. Immunol.,
  • Another method for selecting human FR regions is the comparison of the sequence of each subregion of the murine FR sequence (FR1, FR2, FR3 and FR4) with a library of known human FR sequences, in order to choose, for each region FR, the human FR sequence closest to the murine sequence [US Patent Publication 2003/0040606; Singer et al., J Immunol 150 (7): 2844-57 (1993); Sato K. et al Mol Immunol 31 (5): 371-81 (1994); Leung SO et al., Mol Immunol 32 (17-18): 1413-27 (1995)].
  • Another method uses a particular FR region derived from a consensus sequence of all human antibodies of a particular heavy or light chain subgroup [Sato K. et al Mol Immunol 31 (5) -.371-81
  • CDR transplantation is supplemented by the mutation of certain key residues located in human FRs in order to maintain a good affinity of the humanized antibody for its target [Holmes MA and Foote J, Immunol 158 (5)). 2192-201 (1997)].
  • humanized antibodies according to the invention are preferred for use in in vitro diagnostic methods, or in vivo prophylactic and / or therapeutic treatment.
  • the antibody according to the invention thus chimerised or humanized has the advantage of being better tolerated by the human body, and at least as effective as the murine antibody.
  • the antibody thus chimerized or humanized is 2 times more cytotoxic than the corresponding murine antibody. Even more 'advantageous antibody and chimerized ⁇ ⁇ u ".humanisé 10 times, even 100 times- .or or- of -manière-geniefchae- more --de- -100 times more cytotoxic than the murine antibody corresponding.
  • human antibody is intended to mean an antibody in which each region is derived from a human antibody. These antibodies can be derived from transgenic mice bearing human antibody genes, or from human cells [Jakobovits et al., Curr Opin Biotechnol. Oct ; 6 (5): 561-6 (1995); Lonberg N. and D. Huszar. Internai Review of- Immunology 13: 65-93
  • the antibody according to the invention is coupled to a toxin.
  • the toxin is, for example, diphtheria toxin or ricin.
  • the binding between the antibody according to the invention and the toxin is sufficiently strong to prevent the systemic release of the toxin and also sufficiently labile, so that the toxin is released into the target cells.
  • the antibody is coupled to a radioisotope.
  • the presence of the radioisotope greatly increases the cytotoxicity.
  • Two isotopes are mainly used: iodine 131
  • Iodine 131 has the advantage of making it possible to perform imaging, but requires compliance with radiation protection measures.
  • tumoricidal effects over a distance of 5 mm.
  • ADCC Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity
  • the antibody according to the invention can be modified so as to induce ADCC, for example by being chimerised or humanized.
  • the antibody according to the invention allows the - recruitment of effector immune cells.
  • the antibody according to the invention allows the destruction of cancer cells. Indeed, . the recruitment of the effector cells by the antibody according to the invention causes destruction of the cells to which the antibody is bound (target cell). Cancer cells overexpressing LDL-R will therefore be preferred targets of the antibody according to the invention. Thus, the lysed cells will be near-specific cancer cells, the healthy cells do not over-expire or little LDL-R and thus being preserved.
  • a preferred antibody according to the invention is the antibody 5E5, capable of being produced by the hybridoma H5E5 (deposited under the number 1-3488 to the CNCM, National Collection of Culture of Microorganisms, 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15).
  • the variable region of each of the light chains of the monoclonal antibody produced by the hybridoma H5E5 is encoded by the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 8
  • the variable region of each of the heavy chains of the monoclonal antibody produced. by the hybridoma H5E5 is encoded by the nucleic acid sequence SEQ ID NO: -9.
  • a particular object of the invention relates to a monoclonal antibody binding to LDL-R and allowing the recruitment of effector cells.
  • This antibody is 5E5, or a chimeric, humanized or human antibody having the variable portions of the 5E5 antibody.
  • the antibody is produced in mouse SP2 / O-AG14 (ATCC CRL-1581).
  • Another object of the invention relates to a line stable cell producing an antibody according to the invention as described above.
  • the stable cell line according to the invention is chosen from the group consisting of: SP2 / 0, YB2 / 0 (YB2 / 3HL.P2.G11.16Ag.2O cell, deposited at the American Type Culture Collection under the number ATCC CRL-1662), SP2 / 0-AG14 (ATCC CRL-1581), IR983F, Namalwa human myeloma, PERC6, CHO lineages, including CHO-KI, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CH0- Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2 / O-Ag14 and P3X63Ag8.653.
  • SP2 / 0, YB2 / 0 deposited at the American Type Culture Collection under the number ATCC CRL-1662
  • SP2 / 0-AG14 ATCC CRL-1581
  • Another subject of the invention relates to the HERCE hybridoma deposited under CNCM registration number 1-3488 at the CNCM.
  • Another subject of the invention relates to a DNA fragment of sequence SEQ ID NO: 9 coding for the variable region of the heavy chain of an antibody according to the invention.
  • This DNA fragment can be used for the production of a polypeptide binding to the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO: I) 7 polypeptide may be -a anticorps.-
  • Another object of the invention refers to a sequence of DNA fragment SEQ ID NO: 8 encoding the light chain variable region uiy antibody of the invention.
  • this DNA fragment may be used for the manufacture of a peptide-binding polypeptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1), which polypeptide may be an antibody.
  • Another subject of the invention relates to an expression vector comprising at least one DNA fragment chosen from fragments of sequence SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 8.
  • Another subject of the invention is the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1) of the peptide sequence of the human LDL receptor.
  • Another subject of the invention is the use of an antibody according to the invention for activating Fc ⁇ RIII receptors in vitro or in vivo. immune effector cells.
  • the antibodies of the invention can be used for their ability to activate by their Fc region the Fc ⁇ RIIIA receptor.
  • This is of considerable interest because this receptor is expressed on the surface of cells called "effector cells”: the binding of the Fc region of the antibody to its receptor carried by the effector cell causes the activation of Fc ⁇ RIIIA and the destruction of target cells.
  • the effector cells are, for example, NK (Natural Killer) cells, macrophages, neutrophils, CD8 lymphocytes, T ⁇ lymphocytes, NKT cells, eosinophils, basophils or mast cells.
  • Another particular object of the invention is an antibody as described above for its use as a medicament.
  • the antibody used binds to the human LDL receptor, and allows the recruitment of effector cells.
  • this cytotoxic antibody can bind to all or part of the extracellular region of the LDL receptor, that is to say that it is capable of binding to the LDL binding region (corresponding to amino acids 1 322) or to the region outside the LDL binding zone (corresponding to the acids Amines 322-768 of LDL-R).
  • the antibody according to the invention binding to the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1) of the peptide sequence of the LDL receptor, is an embodiment. particular object of this invention.
  • an object of the invention is the use of an antibody as described above for the manufacture of a medicament.
  • this cytotoxic antibody can bind to all or part of the extracellular region of the LDL receptor, that is to say that it is capable of binding to the LDL binding region (corresponding to amino acids 1 to 322) or to the region outside the LDL binding zone (corresponding to amino acids 322-768 of LDL-R).
  • the antibody according to the invention which binds to the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO - 1) of the peptide sequence of the human LDL receptor, is a particular embodiment of this object. of the invention.
  • Another object of the invention is the use of an antibody as described above, ie having the ability to bind all or part of the extracellular region of the human LDL receptor. and advantageously to the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1) of the human LDL receptor sequence for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.
  • the antibody according to the invention targets LDL-R specifically.
  • the antibody according to the invention by binding to this receptor, will generate a lysis reaction of the cancerous target cells, in particular by ADCC against the target cancer cells and allow lysis of the latter.
  • the lysed cells will be in a quasi-specific manner cancer cells, healthy cells not over-expressing little or no LDL-R and thus being preserved.
  • the cancers treated with the antibody according to the invention are cancers for which the LDL receptor is overexpressed on the surface of the cancer cells, and this relative to the corresponding healthy cells.
  • the treated cancer is cancer of the prostate, breast, liver, pancreas, stomach, ovaries, colon, lung or leukemias, for which there is an increase in density of LDL receptors on the membrane surface of cancer cells.
  • Target cells cancerous, can be lysed by the cells. Effectors recruited during the ADCC reaction, healthy cells being preserved since they do not over-express LDL-R.
  • the antibody -according to the invention is used "for" preparing tiii '• drug -destiné --au- treatment- -of.
  • cancers including - acute myeloid leukemia, acute monocytic leukemias, myelomonocytic leukemias, chronic myeloid leukemia in blast crisis, lymphocytic leukemias, chronic lymphoid leukemias, solid tumors such as cervical squamous cell cancer, Endometrial adenocarcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, choriocarcinoma, brain tumors.
  • Another subject of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an antibody according to the invention as described above and an excipient and / or a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • This pharmaceutical composition is intended to target cancer cells, including those overexpressing LDL-R. As these cancer cells express on their surface a quantity of LDL receptors greater than the quantity of receptors expressed by the healthy cells, the drug thus prepared will be preferentially bound by the cancer cells.
  • the excipient may be any solution, such as saline, physiological, isotonic, buffered, etc., as well as any suspension, gel, powder, etc., compatible with a pharmaceutical use and known to those skilled in the art.
  • the compositions according to the invention may also contain one or more agents or vehicles chosen from dispersants, solubilizers, stabilizers, surfactants, preservatives, etc.
  • the compositions according to the invention may comprise other agents or active principles.
  • compositions can be administered in different ways and in different forms. Administration may be by any route -réalirri "" classical 'for' 'what' kind '• of --therapeutique approach-as - especially - par- - systemic attention-, especially by intravenous injection, intradermal, intra- -Tumoral, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, etc. For example, intra-tumor injection or injection into an area close to the tumor or irrigating the tumor.
  • the doses may vary according to the number of administrations, the association with other active ingredients, stage , evolution of the pathology, etc.
  • Another object of the invention is the use of the antibody according to the invention in immunohistochemical analyzes of cancerous, healthy or cirrhosis tissues, or in Western blot analyzes, in ELISA or in vivo quantification test.
  • the 5E5 antibody is particularly suitable for use in Western Blot, as it specifically recognizes a 160 kDa band and a 120 kDa band corresponding to the glycosylated and non-glycosylated forms of human LDL-R, respectively.
  • the 5E5 antibody therefore has an advantage as a diagnostic tool for pathologies involving LDL-R, and more particularly cancers.
  • Figure 1 Screening of the expression level of LDL-R in cancer lines (results expressed in arbitrary fluorescence units).
  • FIG. 1 Binding of LDL-DiI on HepG2 cells (results expressed as percentage of fluorescent cells).
  • Figure 3 Screening of breast cancer cell lines for LDL-R expression (results expressed as percentage of fluorescent cells).
  • Figure 4 -Liaison anti-LDL-R 5E5 antibodies on A549 cells (results, expressed as a percentage of fluorescent cells).
  • Anti-LDL-R 5E5 antibodies are produced by the H5E5 hybridoma and are directed against the peptide corresponding to amino acids 280- 307 of the LDL receptor sequence (SEQ ID NO: D)
  • FIG. 5 Binding of anti-LDL-R 5E5 antibodies on MDA-MB-231 cells (results expressed as percentage of fluorescent cells).
  • FIG. 6A Cross-reactivity of anti-LDL-R 5E5 antibodies on C2C12, CHO-K1 and YB2 / 0 cells (results expressed as percentage of fluorescent cells).
  • Figure 6B Cross-reactivity of anti-LDL-R 5E5 antibodies on C2C12, CHO-K1 and YB2 / 0 cells (results expressed as average fluorescence).
  • Figure 7 Competition of anti-LDL-R 5E5 antibodies with LDL, on A549 cells (results expressed as average fluorescence).
  • Figure 8 Kinetics of internalization of anti-LDL-R 5E5 antibodies with LDL, on A549 cells (results expressed as percentage of internalization).
  • Example 1 Production, selection and characterization of seven monoclonal antibodies directed against the peptide corresponding to the sequence of 7 amino acids 280-307 of the sequence of the human LDL receptor (SEQ ID NO: 1) Choice of the appropriate peptide sequence
  • the peptide fragment corresponding to the sequence SEQ ID NO: 1 (corresponding to amino acids 280-307 of the human LDL receptor sequence) located in the LDL binding region was synthesized.
  • the sequence SEQ ID NO: 1 chosen was modified (replacement of cysteines by serines) in order to avoid the formation of disulfide bridges in the event of oxidation of the thiol group of cysteines (SEQ ID NO: 17).
  • the peptide was synthesized by the solid phase synthesis method on an ABI 433 A model automatic synthesizer (Applied Biosystems Inc., California, USA), using a Boc / Bzl strategy on a 0.5 mmol MBHA resin.
  • the molecular weight was determined using a spectrometer mass electrospray ion.
  • the spectrum of the electrospray was obtained using an API apparatus (Perkin-Elmer Sciex) on a mass spectrometer • by électrdsp 'ray' quadrupole ion simp ⁇ eT '' equipped with a spray ⁇ d --- ions - (Elea-fe-attended • rospray of one- nebulizer) (Sciex, Toronto, Canada).
  • the monoclonal antibodies directed against the peptide corresponding to the sequence SEQ ID NO: 1 are produced by immunizing male BALB / c mice by intraperitoneal injection of the peptide corresponding to SEQ ID NO: 17, the peptide being previously emulsified with an equal volume. .the complete adjuvant of Freund.
  • HAT medium selective medium
  • hybridoma belongs to the class of IgG, of subclass 1.
  • the antibodies produced by the hybridoma H5E5 were tested by an ELISA test, for the secretion of a monoclonal antibody of desired specificity, namely against the peptide corresponding to SEQ ID NO: 1.
  • the antibodies - monoclonal have - summer- -isorials- ⁇ ⁇ by precipitation with 27% ammonium sulfate and then purified by affinity chromatography on protein A gel (HiTrap Protein A columns HP, Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden) .
  • the unbound proteins were removed by washing with buffered saline (PBS: 50 mmol / L phosphate, pH 7.2, NaCl 150 mmol / L). .
  • the elution of monoclonal IgG immunoglobulins specific for the antibody directed against the peptide corresponding to the sequence SEQ ID NO: was accomplished using 0.2 M glycine at pH2.8.
  • the purified antibodies were dialysed immediately.
  • Anti-LDL-R 5E5" Anti-LDL-R 5E5
  • Anti-LDL-R 5E5 antibodies were tested in Western Blot.
  • Total protein extracts of MDA-MB-231 cells were subjected to denaturing electrophoresis on SDS-PAGE gel (10%) and then transferred to a nitrocellulose membrane and reacted with Anti-LDL-R 5E5 antibodies.
  • Immunoreactive proteins were visualized with a monoclonal anti-IgG antibody conjugated to peroxidase (Chemicon). The development of the reaction was carried out by chemiluminescence (Amersham, Biosciences). •
  • the 5E5 antibody is IgG1, kappa.
  • LDL-R expression HepG2, HeLa, MCF-7, Jurkat, Ramos, HuH7 and Hek293 by the study of labeled LDL binding ( Figures 1 and 2).
  • the LDL were prepared by ultracentrifugation, dialyzed in PBS buffer, pH 7.4 and validated by SDS-PAGE under denaturing conditions, then labeled with fluorochrome 1,1'-dioctadecyl-3, 3, 3 ', 3'-tetramethyl-indocarbocyanide
  • the LDL-DiI were incubated on cells at final concentrations of 0, 10 and 100 ⁇ g / ml for 3 hours at 40 ° C. After washing with PBS, the binding was analyzed by FACS cytofluorometry.
  • FSC Fluorescence-Activated CeIl Sorting
  • the LDL-DiI were incubated on the cells at final concentrations of 6.25, 12.5, 25, 50 and 100 ⁇ g / ml for 3 hours at 40 ° C. After washing with PBS, the binding was analyzed. by cytofluorometry (FACS) and the results were expressed as a percentage of fluorescent cells.
  • each line was tested for its level of expression of LDL-R (Figure 3): the MCF7-ras and the MDA-MB-435 have a LDL-R expression level equivalent to half that HepG2.
  • MDA-MB-231 represents a homogeneous population that expresses high-level LDL-R.
  • Example 3 In vitro functional tests of monoclonal antibodies directed against the peptide corresponding to the sequence SEQ ID NO; 1 selected in Example 1
  • the functionality of the monoclonal antibodies directed against the peptide corresponding to the sequence SEQ ID NO: 1 was evaluated by studying the binding of antibodies to LDL-R at the cellular level (A549 cells and MDA-MB-231 cells).
  • the study of the cross-reactivity of the LDL-R antibodies of C2C12 cells (mouse), GHO-Kl (hamster), YB2 / 0 (rat) the study of the competition between these antibodies and the LDLs on LDL - A459 cell R, the study of their internalisation kinetics as well as the study of the proapoptotic character of the antibodies.
  • Anti-LDL-R 5E5 antibodies to LDL-R was evaluated by quantification of labeling of A549 cells cultured in the presence of LPDS (Lipoprotein Deficient Serum) for 24 hours, by flow cytometry.
  • LPDS Lipoprotein Deficient Serum
  • Anti-LDL-R 5E5 antibodies recognize the LDL-R of A549 cells in a dose-dependent manner.
  • Anti-LDL-R 5E5 antibodies to the LDL-R of MDA-MB-231 cells was evaluated according to the same protocol described for the study of the binding of Anti-LDL-R 5E5 antibodies to the LDL-R of cells.
  • A549 by quantification of MDA-MB-231 cells cultured in the presence of LPDS for 24h, by flow cytometry (FACS).
  • FACS flow cytometry
  • Anti-LDL-R 5E5 antibodies were incubated at final concentrations of 1, 3, 10, 30, 100 ⁇ g / ml for 3 hours at 4 ° C.
  • Anti-LDL-R 5E5 antibodies recognize LDL-R in MDA-MB-231 cells
  • the cross-reactivity of the anti-LDL-R antibodies has been tested in mice (C2C12 cells), in rats (YB2 / 0 cells) and in hamster (CHO-K1 cells).
  • Anti-LDL-R 5E5 antibodies were incubated at a final concentration of 30 mcg / ml for 3 hours at 4 0 C. on C2C12 cells, CHO-Kl and. YB2 / 0 previously grown under LPDS conditions for 24 hours.
  • Commercial antibodies 1C6 (anti-SREBP2, IgG1) and C7 ' (anti-LDL-R, IgG2b) served as negative and positive control antibodies respectively. Revelation of binding was performed using anti-IgG-PE. The results were expressed as percentage of fluorescent cells (FIG. 6A) and fluorescence average (FIG. 6B).
  • the antibodies / LDL-Dil bound but not internalized were unhooked by dextran sulfate and quantified by fluorimetry.
  • the A549 cells were then lysed with sodium hydroxide (0.1 N) and then the amount of internalized antibodies was quantified by fluorimetry.
  • the percentage of internalization was calculated according to the following formula: fluorescence of the internalized antibodies / (fluorescence of the internalized antibodies + fluorescence of the bound but not internalized antibodies).
  • the internalization kinetics of Anti - LDL - R 5E5 antibodies is intermediate between that of LDL (fastest kinetics with 60% internalization at 4h) and that of Cl which internalizes a little more slowly (Figure 8).
  • LDL the kinetics of internalization of the antibodies is biphasic with one. internalisation. Quick - .. to. during the first 4-6 hours. After 6h of incubation, the three antibodies tested show the same rate of 1 internalisation with a tray internalization of about 60% to 24h.
  • A549 cells in the presence and absence of Anti-LDL-R 5E5 antibodies was studied by a double labeling FITC-annexin V (which binds to the phosphatidylserine of apoptotic cells in the early phase) and iodide of propidium (PI, which only marks necrotic cells whose plasma membrane is damaged) by c 'ytométrie flow (FACS).
  • FITC-annexin V which binds to the phosphatidylserine of apoptotic cells in the early phase
  • PI iodide of propidium
  • FACS c 'ytométrie flow
  • Anti-LDL-R 5B5 Commercial antibodies 1C6 (anti-SREBP2, IgG1) and C7 (anti-LDL-R, IgG2b) prepared and incubated under the same conditions as Anti-LDL-R 5B5 were used as reference. A negative control, cells without antibody, and a positive control, cells incubated with camptothecin, were run in parallel.
  • Anti-LDL-R 5E5 antibodies do not show a strongly pro-apoptotic effect on A549 cells after 16 hours of incubation.
  • the animal model chosen is a xenograft model of human tumor tissue on nude mice.
  • the xenograft of tumor cells is implanted subcutaneously.
  • LDL-R LDL-R expression level
  • the expression of LDL-R on these human cancer cell lines has been demonstrated by studying the binding of labeled LDL on this cell line.
  • the LDL-DiI were incubated on the cells at final concentrations of 6.25, 12.5, 25, 50 and 100 ⁇ g / ml for 3 hours at 40 ° C. After washing with PBS, the binding was analyzed by cytofluorometry (FACS) and the results were expressed as a percentage of fluorescent cells.
  • MCF7-ras and MDA-MB-435 have an LDL-R expression level equivalent to half that of HepG2.
  • MDA-MB-231 represents a homogeneous population that expresses LDL-R at a high level. In view of these results, our choice on the lineage to be implanted was focused on the MDA-MB-231.
  • the rate of appearance of the tumor as a function of the number of implanted cells in nude mice was studied.
  • the study concerns the implantation of 0.5.10 6 7 10 6 , 2.10 6 and 5.10 6 cells.
  • LDL competition with Anti-LDL-R5E5 antibody was investigated by assaying the binding of DiI-labeled LDL at 12.5 ⁇ g / ml in competition with Anti-LDL-R5E5 antibody at increasing concentrations (6 , 25, 12.5, 25, 50, - and 80 ⁇ g / ml) on MDA-MB-231 cells for 3 h at 4 ° C.
  • Antibody binding to LDL-R was then analyzed by FACS and the results expressed as percent of fluorescent cells.
  • the chosen approach is to inject the cell line and antibody simultaneously (Winn's test). This approach makes it possible to evaluate the ability of the antibody to prevent the formation of the tumor.
  • the first group comprises 5 nude mice implanted with 10 s MDA-MB-231 cells taken up in 200 ⁇ l of a control antibody, of the same isotype as the anti-LDL-R 5E5 antibody (IgGi) which does not recognize LDL-R, without subsequent treatment of cell implantation.
  • a control antibody of the same isotype as the anti-LDL-R 5E5 antibody (IgGi) which does not recognize LDL-R, without subsequent treatment of cell implantation.
  • the second group comprises 5 nude mice implanted with 10 s MDA-MB-231 cells taken up in 200 ⁇ l of Anti-LDL-R 5E5 antibody, without successive treatment at the implantation of the cells.
  • a "modified" approach of the Winn test consisting of treating nude mice after simultaneous implantation of MDA-MB-231 cells and Anti-LDL-R 5E5 antibody with Anti-LDL-R 5E5 antibody, twice a week during the 4 weeks of the study (third group) was set up.
  • the third group consisted of 5 nude mice implanted with 10 6 cell MDA-MB-231 times in 200 .mu.l of antibody Anti-LDL-R 5E5, treated intra- peri 'tonéale per 500 .mu.g of antibody Anti-LDL-R SES 2 times a week (the first treatment with ' 500 - ⁇ g- taking place 3-4 h after cell implantation).
  • mice are monitored daily with measurement of weight gain and size .. 'tumor 3 times a week. At the end of the 4 weeks of the protocol, the mice are sacrificed and the liver, heart, kidneys and spleen are recovered and frozen at -80 ° C. for each of the 5 mice of each group. Moreover, the sera of the mice are also recovered and frozen.
  • Example 5 Therapeutic feasibility study
  • the purpose of the therapeutic feasibility study was to demonstrate an over-expression of LDL-R in n cancerous tissue compared to healthy tissue, in different types of cancer.
  • WB Western Blot
  • the immunohistochemical study was performed on microarray tissue slides of normal human tissue, comprising 108 spots corresponding to 54 different normal human tissues fixed in 10% formalin.
  • the C7 antibody and the anti-LDL-R 5E5 antibody were diluted 1/10 (10 ⁇ g / ml).
  • the antigenic reactivation was carried out in the microwave, 3 times 5 minutes at 750 Watts in 10mM citrate buffer, pH 6.
  • Example 6 Amplification and sequencing of the variable regions of anti-LDL-R 5E5 antibodies
  • a first reverse transcription step was first performed using a primer located in the 5 'region of the murine CK OR Gl constant regions.
  • a poly-dC sequence was then added in 3 'cDNAs synthesized before - de- achieve amplification -VK-- regions- and - VH in • using a 5' primer recognizing the sequence poly- dC and a 3 'primer, localized in murine CK OR Gl constant regions 5' of the reverse transcription primer.
  • a second "semi-nested" PCR was carried out on the VH PCR product using a 3 'primer located 5' of the 3 'primer of the first PCR.
  • the primers used for these different steps are as follows:
  • Murine G1 specific antisense primer 5'-CTGGACAGGGATCCAGAGTTCCA -3 ', (SEQ ID NO: 13)
  • the VK and VH sequences of the 5E5 antibody were cloned into the plasmid pCR4-TOPO (TOPO-TA-cloning kit for sequencing, Invitrogen, Cat.No. 45-0030).
  • the plasmid 's' is 'plus' "at" minimum 3 colony-G -recombinantes were purified and insert--iei ⁇ r- sequence using universal primers M13 rev and united.
  • the nucleotide sequence of the VK region of the murine antibody 5E5 is indicated under the sequence SEQ ID NO: 8 and the deduced peptide sequence is the sequence SEQ ID NO: 10.
  • the VK gene belongs to the V ⁇ 4 subgroup ( V ⁇ 4 / 5, Almagro JC et al. Immunogenetics 1998, 47: 355-3.63).
  • the CDR1, CDR2 and CDR3 sequences of the VK region of the murine antibody 5E5, defined according to Kabat [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991)] are indicated under the following sequences: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively
  • the nucleotide sequence of the VH region of 5E5 is the sequence SEQ ID NO: 9 and the deduced peptide sequence is the sequence SEQ ID NO: 11.
  • the VH gene belongs to the VH1 subgroup (Honjo T. and Matsuda F. in " Immunoglobulin genes. "Honjo T. and Alt FW eds, Academy Press, London, 1996, pp. 45-171).
  • the CDR1, CDR2 and CDR3 sequences of the VH region of murine antibody 5E5, defined according to Kabat [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991)] are indicated under the following sequences: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, respectively.

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Abstract

La présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur des LDL, son utilisation comme médicament, une composition pharmaceutique contenant cet anticorps, ainsi que son utilisation dans les analyses immunohistochimiques de tissus cancéreux, sains ou cirrhoses, en western blot, en ELISA ou en test de quantification in vivo.

Description

Anticorps dirigés contre le récepteur du LDL
La présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein) , se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO -. 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL, son utilisation comme médicament, une composition pharmaceutique contenant cet anticorps, ainsi que son' utilisation dans les analyses immunohistochimiques de tissus cancéreux, sains ou cirrhoses, ou dans les analyses en Western Blot, en ELISA ou en test de quantification in vivo.
Le cholestérol est "un lipide fabriqué par le foie, l'intestin et les glandes corticosurrénales, mais il est aussi apporté par l'alimentation. Il intervient dans la fabrication des hormones sexuelles, des corticostéroïdes comme la cortisone naturelle et des composants de la bile.
Insoluble dans le sang, le cholestérol y est transporté par des lipoprotéines, notamment les LDL (Low Density Lipoprotein) .
Le cholestérol va ainsi pénétrer dans la cellule grâce à une protéine cellulaire de .surface capable de reconnaître les LDL : le récepteur du LDL (LDL-R) . Le complexe LDL/LDL-R est alors internalisé par endocytose, et les LDL vont être digérées' par les lysosomes, libérant le cholestérol que la cellule va utiliser.
La cholestérolémie désigne le taux de cholestérol dans le sang. Une hypocholestérolémie traduit une insuffisance de cholestérol dans le sang, alors qu'une hypercholestérolémie traduit un excès de cholestérol dans le sang.
Il a été montré qu'une hypercholestérolémie peut résulter d'un défaut de liaison entre les LDL et le LDL-R, .ou encore d'un défaut d' internalisation des LDL, qui peuvent provenir d'une altération structurelle familiale du LDL-R chez ces patients (Beisiegel et al., 1981).
Par ailleurs, des études ont montré que des patients atteints de certains cancers présentent une hypocholestérolémie . Cette hypocholestérolémie est la conséquence d'une sur-utilisation du cholestérol par les cellules cancéreuses. Pour leur survie, ces dernières induisent une augmentation du niveau d'expression du récepteur des LDL (LDL-R) au sein des organes tumoraux (Henricksson et al., 1989) . Il existe ainsi une corrélation entre l'augmentation du niveau d'expression du LDL-R par les cellules et certains cancers . On peut citer' notamment le cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas, des ovaires, du colon, du poumon, de l'estomac et les leucémies .
De plus, il est à présent connu que l'endocytose du virus de l'hépatite C est médiée par les LDL-R. Ainsi, le LDL-R pourrait servir de récepteur viral.
Ainsi, " il apparaît que le LDL-R est impliqué dans de nombreux mécanismes d' importance dans la vie cellulaire, ainsi que dans de nombreuses pathologies.
L'étude du LDL-R reste donc un enjeu majeur, tant- pour comprendre son profil d'expression tissulaire dans les pathologies dans lesquelles il intervient, que pour la mise au point et l'étude de nouveaux outils thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
C'est pour répondre à ce besoin que le Demandeur a cherché à mettre au point un nouvel outil présentant une sensibilité et une spécificité pour le LDL-R le rendant particulièrement adapté à l'étude de l'expression du LDL-R, notamment dans les analyses immunohistochimiques de tissus sains, tumoraux ou cirrhoses, en Western Blot, en ELISA, ou en tests de... quantification in vivo ou encore pour la fabrication de nouveaux outils thérapeutiques, notamment pour leur mise en œuvre dans le traitement contre le cancer.
Description détaillée de l'invention
L'invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein) .
Un premier objet de l'invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein) , se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL.
Le récepteur humain des LDL (LDL-R) est une protéine transmembranaire de 839 acides aminés qui comprend trois régions : la région extra-cellulaire" ('1-7'6"8"J , la région transmembranaire (768-790) et la région cytoplasmique (790-839) . La région extracellulaire est divisée en deux sous-régions : celle de liaison des LDL (1-322) et la sous-région en dehors de la zone de liaison des LDL (322-768) .
L'anticorps selon l'invention a été produit de manière à se lier de manière spécifique au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du LDL-R. Ce peptide est situé dans la zone de liaison .des LDL. Ce peptide a été choisi car il présente une bonne accessibilité à l'anticorps selon l'invention, due à sa situation dans la zone de liaison des LDL, et à sa conformation tridimensionnelle. De plus, il présente la caractéristique d'être immunogène, de par sa composition en acides aminés.
Ainsi, ce peptide a été choisi comme cible des anticorps selon l'invention en vue de produire un anticorps spécifique du LDL-R humain et présentant donc une bonne affinité pour le LDL-R. De plus, ce peptide présente 85% d'homologie avec le LDL-R murin ce qui permet la production d'anticorps qui cross- réagissent chez l'homme et la souris, d'où la possibilité de mettre en œuvre à la fois des. tests (de toxicité notamment) chez la souris et une utilisation chez l ' homme .
D'autres avantages concernant le choix de ce peptide particulier ressortiront à la lecture de la suite de la description.
Aux fins de l'invention, le peptide auquel se lie l'anticorps peut aussi correspondre à un peptide compris dans le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) du LDL-R. Plus particulièrement, on entend par ,« peptide » toute molécule formée par l'enchaînement d'au moins 2 acides aminés, préfèrentiellement de 5 à 35 acides aminés/ et possiblement plus de 35 acides aminés.
Aux fins de l'invention, les expressions « anticorps monoclonal » ou « composition d'anticorps monoclonal » se réfèrent à une préparation de molécules d'anticorps possédant une spécificité identique et unique. De plus, on entend par « anticorps » tout anticorps entier, ainsi que tout polypeptide, peptide ou protéine, comprenant au moins un domaine ou fragment d' immunoglobuline, ainsi ''que tout dérivé d'anticorps. Une molécul'e d' immunoglobuline est composée de 4 polypeptides : 2 chaînes lourdes (H, Heavy) identiques de 50 kDa chacune et 2 chaînes légères (L, Light) identiques de 25 kDa chacune. La chaîne légère est composée de 2 domaines, un domaine variable V et un domaine constant C, repliés indépendamment l'un de l'autre dans l'espace. On les appelle VL et CL. La chaîne lourde comporte également un domaine V noté VH et 3 ou 4 domaines C noté de CHl à CH4. Chaque domaine comprend environ 110 acides aminés et est structuré de manière comparable. Les 2 chaînes lourdes sont liées par des ponts disulfures et chaque chaîne lourde est liée à une chaîne légère par un pont disulfure également .
La région qui détermine la spécificité de l'anticorps pour l'antigène est portée par les parties variables, alors que les parties constantes peuvent interagir avec les récepteurs Fc des cellules effectrices ou des molécules comme le complément pour médier différentes propriétés fonctionnelles.
Ainsi, on entend par « domaine d' immunoglobuline » l'un quelconque des domaines VL, CL, VH , CHl, CH2 , CH3, CH4. L'anticorps selon l'invention pouvant avantageusement contenir un ou plusieurs de ces domaines, toutes les combinaisons entre les domaines précédemment cités font partie de l'invention. On entend par « fragment d' immunoglobuline » un des fragments choisis parmi le • fragment Fàb, ' Fab' , F(ab')2, Fc, • un scFv ou un • CDR (Complémentarity Determining Région) .
La digestion enzymatique des immunoglobulines par la papaïne génère 2 fragments identiques, qu'on appelle « fragment Fab » (Fragment Antigen Binding) , et -'un fragment Fc (fragment cristallisable) . Le fragment Fc est • le support des fonctions effectrices des immunoglobulines .
Par digestion à la pepsine, un fragment F(ab')2 est généré, où 'les deux fragments Fab restent liés par deux ponts disulfure, et le fragment Fc est scindé en plusieurs peptides. Le fragment F(ab')2 est formé de deux fragments Fab' , liés par des ponts disulfure intercaténaires pour former un F(ab')2.
Quant aux régions variables des chaînes lourdes et légères, on constate que la variabilité de séquence n'est pas distribuée de manière égale. En effet, les • régions variables^ sont constituées d'une part de régions très peu variables nommées « charpente » ou « framework » (FR) au nombre de 4 (FR 1 à FR4) et d'autre part de régions dans lesquelles la variabilité est extrême : il s'agit des régions « hypervariables », ou CDR, au nombre de 3 (CDRl à CDR3) .
Un scFv (Single Chain Fragment Variable) est un fragment constitué uniquement des domaines variables VH et VL d'un anticorps monoclonal, et dont la structure est stabilisée par un court bras peptidique flexible placé entre les deux domaines (Billiald et al., 1995). De tels fragments peuvent être produits par. des bactéries. Ces molécules conservent la capacité à reconnaître de façon spécifique un antigène. De petite taille (29 kDa) , ils sont peu immunogéniques et mieux tolérées que les anticorps entiers .
Ainsi, l'anticorps selon l'invention pouvant avantageusement contenir un ou plusieurs de ces fragments, toutes les combina-isons entre les- fragments" - précédemment cités font partie de l'invention. Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps selon l'invention contient au moins un domaine d' immunoglobuline : et au moins un fragment ' d' immunoglobuline, par exemple un fragment Fc et une ou plusieurs régions variables ou hypervariables. Enfin, on entend par « dérivé d'anticorps » tout anticorps, cet anticorps pouvant comprendre une ou plusieurs mutations, substitutions, délétions et/ou additions d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés. Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps selon l ' invention, qui possède la particularité de se lier au peptide correspondant aux acides aminés 280- 307 (SEQ ID NO : 1) du récepteur humain des LDL, ainsi que les caractéristiques présentées ci-après., permet de manière avantageuse le recrutement de cellules effectrices. A cet égard, une « cellule effectrice » est une cellule qui provoque la destruction des cellules sur lesquelles - l'anticorps est lié
(« cellules cibles ») . Plus particulièrement, les cellules effectrices expriment à leur surface un récepteur du fragment Fc des anticorps. De plus, on entend par « recrutement » la faculté que possède l'anticorps selon l'invention à fixer des cellules capables de provoquer la destruction des cellules- cibles. La destruction peut être une lyse, c'est-à- dire une destruction des cellules-cibles avec libération de leur contenu. Le peptide sur lequel se lie l'anticorps selon l'invention (« peptide-cible ») , est situé dans la région de liaison des LDL (ligand naturel du LDL-R) .
Par cette liaison, l'anticorps selon l'invention permet le recrutement de cellules capables de provoquer la destruction de"" cellules" "sur lesquelles l' anticorps selon l '-invention- est lié, e-'est-à-dire de cellules exprimant à leur surface le LDL-R
(« cellules-cibles ») .
On entend par « liaison » la fixation de l'anticorps sur le peptide-cible, ainsi que la fixation des cellules capables de provoquer la destruction des cellules-cibles .
Les cellules effectrices peuvent être des cellules NK
(Natural Killer) . Elles peuvent aussi être des macrophages,- des neutrophiles, ,1e lymphocyte T4 , le lymphocyte T8 ou l ' éosinophile. Ces cellules possèdent à leur surface des récepteurs du fragment Fc des anticorps selon l'invention. Les anticorps selon l'invention se lient à la cellule-cible par leur fragment variable et se lient aux cellules effectrices par leur fragment constant. Cette relation dépendante des anticorps • entre les cellules cibles et les cellules effectrices provogue la lyse des cellules cibles par un mécanisme de type ADCC • (Antibody Dépendent Cellular Cytotoxicity) .
De manière avantageuse, les cellules cibles selon l'invention sont des cellules tumorales. De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention permet la destruction des cellules cancéreuses (« cellules cible ») . En effet, le recrutement des cellules effectrices engendre une destruction des cellules sur lesquelles l'anticorps selon l'invention est lié. Or, des études ont montré qu'il existe une corrélation entre l'augmentation du niveau d'expression du LDL-R par les cellules et certains cancers. En effet, des patients atteints de certains cancers présentent une hypocholestérolémie. Cette hypocholestérolémie est la conséquence d'une surutilisation du cholestérol par les cellules cancéreuses. Pour leur survie, ces dernières induisent une augmentation du niveau d'expression du récepteur des LDL (LDL-R) au sein des organes tumoraux ' (Henrickεson et al.', 19-89-) .- On peut -c-iter -notamment—le cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas, des ovaires, du colon, du poumon, de l'estomac et les leucémies. Les cellules cancéreuses sur-exprimant le LDL-R seront donc des cibles préférées de l'anticorps selon l'invention qui, par recrutement de cellules capables de détruire les cellules sur lesquelles l'anticorps est lié, provoquera la destruction de ces cellules cancéreuses .
L'invention a donc pour objet, un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein) , se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidigue du récepteur humain des LDL.
De manière avantageuse, au moins une région CDR (Complémentarity Determining Région) de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d' identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, et au moins une région CDR de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d' identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7.
Les régions CDR concernées sont les régions CDR CDRl et/ou CDR2 et/ou CDR3.
De manière particulièrement avantageuse, l'identité avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70%, de manière préférée- d'au moins 80%, 90%, 95%, 99% et de manière encore plus préférentielle de 100% d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé en alignant les 2 séquences à comparer et en comptant le nombre de positions possédant un acide aminé identique, ce nombre étant" divisé par le 'nombre d'-a-eides aminés total de la -séquence. En • tout état- -de-- cause, ces différences de séquences n'affectent . en rien l'affinité de l'anticorps monoclonal pour sa cible, ni sa capacité à recruter des cellules immunitaires effectrices. '.
De manière particulièrement avantageuse, chaque région CDR de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO :• 3, SEQ ID NO : 4 respectivement, et en ce que chaque région CDR de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec les séquences SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 respectivement. Ainsi, la région CDRl de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d' identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, la région CDR2 de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3, la région CDR3 de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence - peptidique ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 4 , et la région CDRl de chacune des chaînes lourdes de. l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d' identité avec la séquence SEQ ID NO : 5, la région CDR2 de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6, la région CDR3 de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d' identité avec la séquence SEQ ID NO : 7. ' ' '
De- maniè-re particulièrement- -avantageuse-,- - •1-'-identité' • avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70%, de manière préférée d'au moins 80%, 90%, 95%, 99% et de manière encore plus préférentielle de 100% d'identité.
Avantageusement, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence d'acide nucléique possédant au moins 70% ' d'identité avec .la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et- la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence d'acide nucléique possédant au moins 70% d'identité avec la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 9. De manière particulièrement avantageuse, l'identité avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70%, de manière préférée d/ au moins 80%, et de manière encore plus préférentielle de 95% ou 99% d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé en alignant les 2 séquences à comparer et en comptant le nombre de positions possédant un nucléotide identique, ce nombre étant divisé par le nombre de nucléotides total de la séquence. La dégénérescence, du code génétique peut être à l'origine du fait qu'un même acide aminé puisse être codé par plusieurs triplets de nucléotides différents. En tout état de cause, ces différences de séquences n'affectent en' rien l'affinité de l'anticorps monoclonal pour sa cible, ni sa capacité à recruter des cellules immunitaires effectrices.
Préfèrentiellement, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et la région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ' ID NG- : ~9~.~
De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède au moins 70% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID NO -. 10 et la 'région variable de chacune de ses chaînes lourdes possède au moins 70% d' identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 11. De manière particulièrement avantageuse, l'identité avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70%, et de manière préférée d'au moins 80%, et de manière encore plus préférentielle de 95% ou 99% d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé en alignant les 2 séquences à comparer et en comptant le nombre de positions possédant un acide aminé identique, ce nombre étant divisé par le nombre - d'acides aminés total de la séquence.
Préférentiellement, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède la séquence peptidique SEQ ID NO : 10 et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède la séquence peptidique SEQ ID NO : 11. La séquence peptidique SEQ ID NO : 10 est la séquence peptidique déduite de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8 et la séquence peptidique SEQ ID NO : 11 est la séquence déduite de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 9.
L'anticorps selon l'invention s'entend aussi de tout anticorps modifié répondant aux caractéristiques de l'invention, dans lequel un ou plusieurs acides aminés ont été ajouté (s), substitué(s) ou délété(s). Un tel ajout, substitution ou délétion peut être localisé à n'importe quelle position dans la molécule. Dans le cas où plusieurs acides aminés ont été ajoutés, substitués ou délétés, toute combinaison d'ajout, de substitution ou de délétion peut être considérée. De telles altérations de •- -la- -• séquence -~d.es • régions variables de l'anticorps selon l'invention peuvent être effectuées dans le but d'augmenter le nombre de résidus susceptibles d'entrer en contact avec le pepbide cible.
Avantageusement, un anticorps selon l'invention peut être, c'est-à-dire consister en un fragment F(ab')2, un fragment Fab' , un fragment Fab, une région CDR ou toute version modifiée de l'un quelconque de ces fragments ou région.
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est un anticorps murin. De manière avantageuse, cet anticorps monoclonal murin est une IgGlkappa. Un tel anticorps peut être produit par immunisation d'un animal, en particulier d'une souris, avec le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) , ou avec tout autre peptide du LDL-R humain situé dans la région de liaison aux LDL. Les méthodes de production d'anticorps sont connues de l'homme du métier. Selon un mode particulier de production des anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) du LDL-R, le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence du LDL-R peut être injecté par voie intra péritonéale à des souris Balb/C en présence d'adjuvant de Freund. Plusieurs rappels d' immunisation sont effectués en présence d'adjuvant incomplet de Freund. Le suivi de la réponse immunitaire des souris est réalisé sur des prélèvements sanguins par ELISA contre le peptide SEQ ID NO : 1. Des hybridomes sont obtenus à partir de la fusion des cellules spléniques des souris immunisées avec des cellules de myélomes de souris en présence de PEG (polyéthylèneglycol) . Les cellules sont ensuite cultivées puis testées en ELISA pour leur réponse .contre- le-p-eptide SEQ ID NO - : 1.
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est un anticorps chimérique, humanisé ou humain.
De manière préférentielle, .; l'anticorps selon l'invention est chimérique.
On entend par « anticorps chimérique » un anticorps dont les régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à une espèce différente des régions- constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes. Ainsi, l'anticorps selon l'invention possède en outre des régions variables murines et des régions constantes appartenant à une espèce non- murine . A cet égard, toutes les familles et espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d' être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les muridés (sauf la souris) , les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés, par exemple, ainsi que les oiseaux. De manière encore préférée, les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention sont des régions constantes humaines. Ce mode de réalisation préféré de l'invention permet de diminuer l ' immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration thérapeutique chez l'homme. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type K. Tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Km(I), Km(I, 2), Km(I, 2, 3) ou Km (3). Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type λ. Dans un aspect particulier de l'invention, et notamment lorsque les régions constantes de chacune des chaînes' légères 'et de chacune des chaînes lourdes ' de- l'anticorps selon- i' invention- -—sont des régions- humaines , la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type y. Selon cette variante, la région constante de chacune des chaînes -•lourdes de l'anticorps peut être de type γl, de type γ2 , de type γ3 , ces trois types de régions constantes présentant la particularité de fixer le complément humain, ou encore de type γ4. Les anticorps possédant une région constante de chacune des chaînes lourdes de type γ appartiennent à la .classe des IgG. Les immunoglobulines de type • G- (IgG), sont des hétérodimères constitués de 2 chaînes lourdes et de 2 chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour la chaîne légère et V-D-J pour ' la chaîne lourde) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines (CHl, CH2 et CH3) pour la chaîne lourde. L'association des domaines variables et des domaines CH1 et CL des chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui sont connectées à la région Fc par une région charnière très flexible permettant à chaque Fab de se fixer à sa cible antigénique tandis que la région Fc, médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps reste accessible aux molécules effectrices telles que les récepteurs FcDR et le CIq. La région Fc, constituée des 2 domaines globulaires CD2 et CD3, est glycosylée au niveau du domaine CD2 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un JW-glycanne biantenné, lié à l'Asn 297.
De manière préférée, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type γl , car un tel anticorps montre une capacité .à engendrer une activité ADCC " (Antibody-Dependënt Cellular
- Gytot-oxicity) chez le plus - grand nombre- d'individus • • (humains) . A cet égard, tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Glm(3), GIm (1, 2, 17), GIm(I, 17) ou GIm(I, 3).
Les anticorps chimériques '' selon l'invention peuvent être construits en utilisant les techniques standard de l'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier, et plus particulièrement en utilisant les techniques de construction des anticorps chimériques
- décrites par exemple dans Mprrison et al., Proc . Natl . Acad. Sci. U. S.A., 81 : 6851-55 (1984), où la technologie de l'ADN recombinant est utilisée pour remplacer la région constante d'une chaîne lourde et/ou la région constante d'une chaîne légère d'un anticorps provenant d'un mammifère non-humain avec les régions correspondantes d'une immunoglobuline humaine. De tels anticorps et leur mode de préparation ont également été décrits dans la publication brevet EP 173 494, dans le document Neuberger, M. S. et al., Nature 1985 Mar 21-27 ; 314 (6008) : 268-70. , ainsi que dans le document EP 125 023 par exemple. Des méthodes pour générer des anticorps chimériques sont largement disponibles pour l'homme du métier. Par exemple, les chaînes lourdes, et légères de l'anticorps peuvent être exprimées séparément en utilisant un vecteur pour chaque chaîne, ou bien être intégrées dans un seul vecteur .
Un vecteur d'expression est une molécule d'acide nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique murine codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes ou légères de l'anticorps et/ou la séquence d'acide nucléique, de préférence humaine, codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes ou légères de l'anticorps ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car il pôs'sëde des "séquences" indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. Le vecteur peut être par exemple un plasmide, un adénovirus, un rétrovirus ou un bactériophage, et la cellule hôte peut être toute -' cellule de mammifère, par exemple SP2/0, YB2/0, IR983F, le myélôme humain Namalwa, PERC6 , les lignées CHO, notamment CHO-K-I, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO- Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, WiI-2, Jurkat, Vero, Molt-4, C0S-'7, 293-HEK,- BHK, K6H6 , NSO, SP2/θ-Ag 14 et P3X63Ag8.653.
Pour la construction de vecteurs d'expression des anticorps chimériques selon l'invention, des séquences signal synthétiques et des sites de restriction appropriés peuvent être fusionnés aux régions variables au cours des réactions d'amplification par PCR. Les régions variables sont ensuite combinées avec les régions constantes d'un anticorps, de manière préférentielle une IgGl humaine. Les gènes ainsi construits sont clones sous le contrôle d'un promoteur (par exemple le promoteur RSV) et en amont d'un site de polyadénylation, en utilisant deux vecteurs séparés (un1 pour chaque chaîne) . Les vecteurs sont également munis de gènes de sélection connus de l'homme du métier, tels que par exemple le gène dhfr ou le gène de résistance à la néomycine.
Les anticorps chimériques selon l'invention peuvent être produits par co-transfection dans une cellule hôte du vecteur d'expression de la chaîne légère et du vecteur d'expression de la chaîne .lourde en utilisant une méthode bien connue de l'homme du métier (par exemple , la co-précipitation au phosphate de calcium, l' électroporation, la micro-injection, etc.). A l'issue de la transfection, les cellules peuvent être mises en milieu sélectif, par exemple en milieu RPMI (Invitrogen, ref 21875-034) contenant 5% de sérum dialyse (Invitrogen, réf. 10603-017), 500 μg/ml de -6418 (Invitrogen, réf.- 10131—0-27-) -- et 25- -nM- -de methotrexate (Sigma, réf. M8407) . Les surnageants des puits de transfection résistants sont criblés- pour la présence d' immunoglobuline (Ig) chimérique par dosage ELISA spécifique des. séquences Ig humaines. Les transfectants produisant le plus d'anticorps sont amplifiés et leur surnageant redosé par ELISA afin d'estimer leur productivité et de sélectionner les 3 meilleurs producteurs pour le clonage par dilution limite (40 cellules / plaque) .
Par anticorps humanisé, on entend désigner un anticorps qui contient des régions CDRs dérivées d'un anticorps d'origine non humaine, les autres parties de la molécule d'anticorps étant dérivées d'un (ou de plusieurs) anticorps humains. De tels anticorps peuvent être préparés selon des méthodes de greffe de CDR (« CDR-grafting ») bien connues de l'homme ,,du métier [publications brevet US 5,225,539, US 6,180,370 ; Jones et al., Nature 321(6069): 522-5. (1986) ; Verhoeyen et al., Bioessays 8(2): 74-8 (1988) ; Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988) ; Queen C. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 86 (24) : 10029-33 (1989) ; Lewis A. P. and Crowe J. S-, Gène 101(2) :297- 302 (1991) ; Daugherty BL et al., Nucleic Acids Res 19(9):2471-6 (1991) ; Carter et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 89 :4285 (1992) ; Singer et al., J Immunol
150 (7): 2844-57 (1993) ; ' Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993')]. Le choix des domaines variables humains à greffer pour la production d'anticorps humanisés est important afin de réduire 1' immunogénicité de l'anticorps sans altérer son affinité pour sa cible. Dans une méthode de production d'un anticorps humanisé, la séquence du domaine variable d'un anticorps murin est comparée à une banque de séquences de régions variables humaines connues et 'la séquence variable humaine la plus proche' de -la- séquence murine est retenue comme -région Ij1R- de- l'anticorps humanisé [Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988) ; Queen C. et al., Proc Natl Acad Sci USA 86 (24) : 10029-33 (1989) ; Sims et al., J. Immunol.,
151 :2296 (1993) ] . Une autre méthode de sélection des régions FR humaines est la comparaison de la séquence de chaque sous-région de la séquence FR murine (FRl, FR2 , FR3 et FR4) avec une banque de séquences FR humaines connues, afin de choisir, pour chaque région FR, la séquence FR humaine la plus proche de la séquence murine [publication brevet US 2003/0040606 ; Singer et al., J Immunol 150 (7): 2844-57 (1993) ; Sato K. et al Mol Immunol 31(5):371-81 (1994) ; Leung S. O. et al., Mol Immunol 32 (17-18) : 1413-27 (1995) ]. Une autre méthode utilise une région FR particulière dérivée d'une séquence consensus de tous les anticorps humains d'un sous-groupe particulier de chaîne lourde ou légère [Sato K._ et al Mol Immunol 31(5) -.371-81
(1994) ] . La greffe de CDR est complétée dans la majorité des cas par la mutation de certains résidus clés localisés dans les FR humains afin de conserver une bonne affinité de l'anticorps humanisé pour sa cible [Holmes M.A. and Foote J. , J Immunol 158 (5) .-2192-201 (1997)].
Les anticorps humanisés selon l'invention sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes de diagnostic in vitro, ou de traitement prophylactique et/ou thérapeutique in vivo.
L'anticorps selon l'invention ainsi chimérisé ou humanisé présente l'avantage d'être mieux toléré par l'organisme humain, et au moins aussi efficace que l'anticorps murin. De manière particulièrement avantageuse, l'anticorps ainsi chimérisé ou humanisé est 2 fois plus cytotoxique que l'anticorps murin correspondant. De manière encore plus ' avantageuse, l'anticorps ainsi chimérisé ~σu ".humanisé est 10 fois, .ou encore 100 fois- ou- de -manière-préférée- plus --de- -100 fois plus cytotoxique que l'anticorps murin correspondant .
Par anticorps humain,/ on entend désigner un anticorps dont chaque région est dérivée d'un anticorps humain. Ces anticorps peuvent être dérivés de souris transgéniques portant des gènes d'anticorps humains, ou de cellules humaines [Jakobovits et al., Curr Opin Biotechnol. Oct ; 6 (5) : 561-6 (1995) ; Lonberg N. and D. Huszar. Internai Review of- Immunology 13 : 65-93
(1995) ; Tomizuka K. et al., Proc . Natl . Acad, Sci . USA 97(2): 722-727 (2000)]. De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention est couplé à une toxine. La toxine est, par exemple, la toxine diphtérique ou la ricine. La liaison entre l'anticorps selon l'invention et la toxine est suffisamment forte pour éviter la libération systémigue de la toxine et aussi suffisamment labile, afin que la toxine soit libérée dans les cellules cibles .
Dans un autre aspect de l'invention, l'anticorps est couplé à un radio-isotope . La présence du radio- isotope accroît considérablement la cytotoxicité . Deux isotopes sont essentiellement utilisés : l'iode 131
(émetteur bêta et gamma) , dont la demi-vie est relativement longue (8 jours) et qui exerce un effet tumoricide sur environ 1 mm autour de la cellule tumorale ayant fixé l'anticorps selon l'invention. L'iode 131 présente l'avantage de rendre possible la réalisation d'une imagerie, mais nécessite le respect des mesures de radio-protection. L'yttrium 90
(émetteur bêta), dont la demi-vie est plus brève (2,5 jours) , exerce des effets tumoricides sur une distance de 5 mm.
De- manière - avantageuse-,- --1--anticorps • selon-- l' invention permet le recrutement de cellules immunitaires effectrices. Un tel anticorps, de par sa bonne spécificité et sa bonne sensibilité, est un outil pouvant servir à médier des réactions d'ADCC (Anfcibody Dépendent Cellular Cytotoxicity) . En effet, l'anticorps selon l'invention peut être modifié de manière à induire l'ADCC, par exemple en étant chimérisé ou humanisé. L'anticorps selon l'invention permet le - recrutement de cellules immunitaires effectrices.
De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention permet la destruction des cellules cancéreuses. En effet, . le recrutement des cellules effectrices par l'anticorps selon l'invention engendre une destruction des cellules sur lesquelles l'anticorps est lié (cellule cible) . Les cellules cancéreuses surexprimant le LDL-R seront donc des cibles préférées de l'anticorps selon l'invention. Ainsi, les cellules lysées seront de manière quasi-spécifiques les cellules cancéreuses, les cellules saines ne sur- expriπvant pas ou peu le LDL-R et étant ainsi préservées .
Un anticorps préféré selon l'invention est l'anticorps 5E5, susceptible d'être produit par l'hybridome H5E5 (déposé sous le numéro 1-3488 à La CNCM, Collection Nationale de Culture des Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) . La région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome H5E5 est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et la région variable de , chacune des chaînes lourdes de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome H5E5 est codée par la séquence d' acide nucléique SEQ ID NO : -9.
Un objet particulier de l'invention concerne un anticorps monoclonal se liant au LDL-R et permettant le recrutement de cellules effectrices. Cet anticorps est le 5E5, ou .feout anticorps chimérique, humanisé ou humain possédant les parties variables de l'anticorps 5E5.
Dans un certain mode de réalisation, l'anticorps est produit dans- la lignée SP2/0-AG14 de souris (ATCC CRL- 1581) .
Un autre objet de l'invention se rapporte à une lignée cellulaire stable produisant un anticorps selon l'invention tel que décrit précédemment.
De manière avantageuse, la lignée cellulaire stable selon l'invention est choisie parmi ., le groupe consistant en : SP2/0, YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G11.16Ag.2O, déposée à l' American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662) , SP2/0-AG14 (ATCC CRL-1581) , IR983F, le myélome humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-I, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CH0-Lecl3 , CHO Pro-5, CHO dhfr- , Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.
Un autre objet de l'invention se rapporte à l'hybridome H5E5 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3488 à la CNCM.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 9 codant pour la région variable de la chaîne lourde d'un anticorps selon l'invention. Ce fragment d'ADN peut être utilisé pour la fabrication d'un polypeptide se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307' (SEQ ID NO : I)7 ce polypeptide pouvant être -un anticorps.-
Un autre objet de l'invention' se rapporte a un fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 8 codant pour la région variable de la chaîne légère d'uiy anticorps selon l'invention. De même, ce fragment d'ADN peut être utilisé pour la fabrication d'un polypeptide se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280- 307 (SEQ ID NO : 1), ce polypeptide pouvant être un anticorps.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un vecteur d'expression comprenant au moins un fragment d'ADN choisi parmi les fragments de séquence SEQ ID NO : 9 ou SEQ 'ID NO : 8.
Un autre objet de l'invention est le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL..
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps selon l'invention, pour activer in vitro ou in vivo les récepteurs FcγRIII de . cellules immunitaires effectrices. En effet, les .anticorps de l'invention peuvent être utilisés pour leur capacité à activer par leur région Fc le récepteur FcγRIIIA. Ceci représente un intérêt considérable, car ce récepteur est exprimé à la surface de cellules appelées « cellules effectrices » : la liaison de la région Fc de l'anticorps à son récepteur porté par la cellule effectrice provoque l'activation du FcγRIIIA et la destruction des cellules cibles. Les cellules effectrices sont par exemple des cellules NK (Natural Killer) , des macrophages, des neutrophiles, les lymphocytes CD8, les lymphocytes Tγδ, les cellules NKT, ' les ' éosinophiles, lés basophiles ou les mastocytes . " '
Un autre objet particulier de l'invention est un anticorps tel que décrit précédemment pour son utilisation comme médicament.
Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps utilisé se lie au récepteur humain des LDL, et permet le recrutement de cellules effectrices. Avantageusement, cet anticorps cytotoxique peut se lier à tout ou partie de la région extracellulaire du récepteur des LDL, c'est-à-dire, qu'il est capable de se lier à la région de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 1 à 322) ou à la région en dehors de la zone de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 322-768 du LDL-R). A cet égard, l'anticorps selon l'invention, se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur des LDL, est un mode de réalisation. particulier de cet objet de 1' invention.
Plus particulièrement, un objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps tel que décrit précédemment pour la fabrication d'un médicament. Avantageusement, cet anticorps cytotoxique peut se lier à tout ou partie de la région extracellulaire du récepteur des LDL, c'est-à-dire qu'il est capable de se lier à la région de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 1 à 322) ou à la région en dehors de la zone de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 322-768 du LDL-R). A cet égard, l'anticorps selon l'invention, se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO -. 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL, est un mode de réalisation particulier de cet objet de 1' invention.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps, tel .que décrit précédemment, c' est-â-dir.e possédant la capacité de se lier à tout ou partie de la région extracellulaire du récepteur humain des LDL et avantageusement au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de .-la séquence du récepteur humain des LDL, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer. En effet, l'anticorps selon l'invention cible le LDL-R de manière spécifique. A cet égard, l'anticorps selon l'invention,- en se liant à ce récepteur, va engendrer une réaction de lyse des cellules cibles cancéreuses, notamment par ADCC contre les cellules cibles cancéreuses et permettre la lyse de ces dernières. Ainsi, les cellules lysées seront de manière quasi- spécifiques les cellules cancéreuses, les cellules saines ne sur-exprimant pas ou peu le LDL-R et étant ainsi préservées.
De manière avantageuse, les cancers traités au moyen de l'anticorps selon l'invention sont les cancers pour lesquels le récepteur des LDL est sur-exprimé à la surface des cellules cancéreuses, et ce par rapport aux cellules saines correspondantes.
De manière particulièrement avantageuse, le cancer traité est le cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas, de l'estomac, des ovaires, du colon, du poumon ou des leucémies, pour lesquels on observe une augmentation de la densité de récepteurs au LDL sur la surface membranaire des cellules cancéreuses . Les cellules cibles, cancéreuses, pourront être lysées par les cellules . effectrices recrutées lors de la réaction d'ADCC, les cellules saines étant préservées puisqu' elles, ne sur-expriment pas le LDL-R.
De manière particulièrement avantageuse, l'anticorps -selon l'invention est utilisé "pour" la préparation d'tïiî ' •médicament -destiné --au- traitement- -des. cancers-- -incluant - la leucémie myéloïde aiguë, les leucémies monocytaires aiguës, les leucémies myélomonocytiques, la leucémie myéloïde chronique en crise blastique, les leucémies lympho|.des, les leucémies lymphoïdes chroniques, les tumeurs solides telles que le cancer épidermoïde cervical, 1 ' adénocarcinome endométrial, le carcinome gastrique, le carcinome hépatocellulaire, le choriocarcinome, les tumeurs du cerveau.
Un autre objet de l ' invention .concerne une composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon l'invention tel que décrit ci-dessus et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiguement acceptables. Cette composition pharmaceutique a pour vocation de cibler les cellules cancéreuses, notamment celles surexprimant le LDL-R. Ces cellules cancéreuses exprimant à leur surface une quantité de récepteurs au LDL supérieure à la quantité de récepteurs exprimés par les cellules saines, le médicament ainsi préparé sera préférentiellement lié par les cellules cancéreuses .
L'excipient peut être toute solution, telle qu'une solution saline, physiologique, isotonique, tamponnée, etc., ainsi que toute suspension, gel, poudre, etc., compatible avec un usage pharmaceutique et connu de l'homme du métier. Les compositions selon l'invention peuvent en outre contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, surfactants, conservateurs, etc. D'autre part, les compositions selon l'invention peuvent comprendre d'autres agents ou principes actifs.'
Par ailleurs, les compositions peuvent être administrées de différentes manières et sous différentes formes. L'administration peut être -réalisée par toute voie ""classique 'pour' 'ce' type " •d' approche -—thérapeutique, -comme - notamment - par- - voie- systémique, en particulier par injection intraveineuse, intradermique, intra-tumorale, sous- cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire, intra- artérielle, etc. On peut citer par> exemple l'injection intra-tumorale ou l'injection dans une zone proche de la tumeur ou irriguant la tumeur.
• Les doses peuvent varier en fonction du nombre d'administrations, de l'association à d'autres principes actifs, du stade, d'évolution de la pathologie, etc.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation de l'anticorps selon l'invention dans les analyses immunohistochimiques de tissus cancéreux, sains ou cirrhoses, ou dans les analyses en Western Blot, en ELISA ou en test de quantification in vivo. L'anticorps 5E5 est particulièrement approprié pour son utilisation en Western Blot, car il reconnaît de manière spécifique une bande de 160 kDa et une bande de 120 kDa correspondant aux formes glycosylées et non glycosylées respectivement du LDL-R humain. L'anticorps 5E5 présente donc un avantage en tant qu'outil de diagnostique des pathologies impliquant le LDL-R, et plus particulièrement les cancers.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas l'étendue de l'invention.
Légendes de figures
Figure 1 : Criblage du niveau d'expression du LDL-R dans des lignées cancéreuses (résultats exprimés en unités arbitraires de fluorescence) .
Figure 2 : Liaison des LDL-DiI sur des cellules HepG2 (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes) .
Figure 3 : Criblage des lignées cellulaires du cancer du sein pour l'expression du LDL-R (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes) .
Figure 4 : -Liaison des anticorps anti-LDL-R 5E5 sur des cellules A549 (résultats , exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes) . Les anticorps anti-LDL-R 5E5 sont produits par l'hybridome H5E5 et sont dirigés contre le peptide correspondant aux acides aminés 280- 307 de la séquence du récepteur des LDL (SEQ ID NO: D •
Figure 5 : Liaison des anticorps anti-LDL-R 5E5 sur des cellules MDA-MB-231 (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes) .
Figure 6A : Cross-réactivité des anticorps anti-LDL-R 5E5 sur des cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0 (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes) .
Figure 6B : Cross-réactivité des anticorps anti-LDL-R 5E5 sur des cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0 (résultats exprimés en moyenne de fluorescence) .
Figure 7 : Compétition des anticorps anti-LDL-R 5E5 avec les LDL, sur des cellules A549 (résultats exprimés en moyenne de fluorescence) .
Figure 8 : Cinétique d' internalisation des anticorps anti-LDL-R 5E5 avec les LDL, sur des cellules A549 (résultats exprimés en pourcentage d' internalisation) .
-Figure ...9- : Caractér'isàt-ïαn de l'anticorps- 5E5 en- Western Blot
Exemples
Exemple 1 : Production, sélection et caractérisation d7 anticorps monoclonaux diriges contre le peptide correspondant à la séquence d7 acides aminés 280-307 de la séquence du récepteur humain des LDL (SEQ ID NO : 1) Choix de la séquence peptidique appropriée Le fragment peptidique correspondant à la séquence SEQ ID NO : 1 (correspondant aux acides aminés 280-307 de la séquence du récepteur humain des LDL) situé dans la région de liaison aux LDL a été synthétisé. La séquence SEQ ID NO : 1 choisie a été modifiée (remplacement des cystéines par des serines) afin d'éviter la formation de ponts disulfures en cas d'oxydation du groupement thiol des cystéines (SEQ ID NO : 17) .
Synthèse peptidique
Le peptide a été synthétisé par la méthode de synthèse en phase solide sur un synthétiseur automatique modèle ABI 433 A (Applied Biosystems Inc., Californie, USA), en utilisant une stratégie Boc/Bzl sur une résine MBHA 0 , 5 mmol .
Spectrométrie de masse
La masse moléculaire a été déterminée en utilisant un spectromètre de ' masse à électrospray d'ions. Le spectre de l ' électrospray a été obtenu en utilisant un appareil API (Perkin-Elmer-Sciex) sur un spectromètre • de masse par électrdsp'ray' d'ions à quadripôle simpïeT' ' équipé avec un spray~d---ions —(élee-fe-rospray assisté • d' un- nébuliseur) (Sciex, Toronto, Canada) .
Production d'anticorps monoclonaux
> Les anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à la séquence SEQ ID NO : 1 sont produits en immunisant des souris mâles BALB/c par injection intrapéritonéale du peptide correspondant à la SEQ ID NO : 17, le peptide étant préalablement émulsifié avec un volume égal .d'adjuvant complet de Freund.
Trois injections ont ensuite été effectuées toutes les deux semaines en présence d'adjuvant incomplet de Freund. Quatre jours après la dernière injection, les rates des animaux sont prélevées, puis les cellules sont isolées et fusionnées avec des cellules de myélome de souris Sp 2/0-Agl4 en présence d'agent de fusion tel que le polyéthylène glycol . Les cellules fusionnées sont ensuite incubées dans, un milieu sélectif (milieu HAT) qui inhibe la croissance de cellules malignes non fusionnées.
Afin de s'assurer du caractère monoclonal des hybridomes, des sous-clonages par dilution limite ont été réalisés. A l'issue de ces sous-clonages , un hybridome dénommé « H5E5 », producteur d'anticorps dirigés contre le peptide correspondant à la SEQ ID NO : 1 a été sélectionné.. Cet hybridome appartient à la classe des IgG, de sous classe 1.
Les anticorps produits par l' hybridome H5E5 ont été testés par un test ELISA, pour la sécrétion d'un anticorps monoclonal de spécificité recherchée, à savoir contre le peptide correspondant à la SEQ ID NO : 1.
Les ascites ont été obtenus à partir de souris BALB/c mâles ayant reçu au préalable une injection de pristane et auxquelles 2.106 cellules d' hybridome H5E5 ont été injectées. *
Les ---anticorps - monoclonaux ont - été— -isolés- ~par~ précipitation avec 27% de sulfate d'ammonium puis purifiés par chromâtographie d'affinité sur gel de protéine A (colonnes HiTrap Protein A HP, Amersham Bioscience, Uppsala, Suède) . Les protéines non retenues ont- été éliminées par lavage avec une solution saline tamponnée (PBS : Phosphate 50 mmol/L, pH 7,2, NaCl 150 mmol/L) . . L'élution des Immunoglobulines IgG monoclonales spécifiques de l'anticorps -dirigé contre le peptide correspondant à la séquence SEQ ID NO : l a été accomplie en utilisant de la glycine à 0,2 M à pH2 , 8. Les anticorps purifiés ont été dialyses immédiatement contre 10 mmol/L de PBS, concentrés par lyophilisation, puis conservés par aliquots de 0.5 à 1 mg +/- BSA 1% à -200C. Ces anticorps seront dénommés ci-après « Anti-LDL-R 5E5 ».
Analyse en Western Blot
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été testés en Western Blot . Des extraits de protéines totales de cellules MDA-MB-231 ont été soumis à une électrophorèse dénaturante sur gel SDS-PAGE (10%) puis transférés sur une membrane de nitrocellulose et mis à réagir avec les anticorps Anti-LDL-R 5E5. Les protéines immunoréactives ont été visualisées avec un anticorps monoclonal anti-IgG conjugué à la peroxidase (Chemicon) . Le développement de la réaction a été effectué par - chemiluminescence (Amersham, Biosciences) . •
L'analyse en Western Blot montre que l'anticorps anti- LDL-R 5E5.reconnaît une bande de 160 kDa et une bande de 120 kDa correspondant aux formes glycosylées et non glycosylées respectivement du LDL-R humain (Figure 9) .
Isotypage
L' isotypage des hybridomes a été effectué par "ELISA
• avec- Te • kit- SBA- - --S-loπotyping System/ΗRP •
(SouthernBiotech) et avec l'Isostrip Mouse Monoclonal
Antibody Isotyping Test (Roche-référence 1493027) .
L'anticorps 5E5 est une IgGl, kappa.
Exemple 2 : Criblage du niveau d'expression du LDL-R dans des lignées cancéreuses
Les lignées - cellulaires cancére.uses suivantes ont été criblées pour l'expression du LDL-R : HepG2 , HeLa, MCF-7, Jurkat, Ramos, HuH7 et Hek293 par l'étude de la liaison de LDL marquées (Figures 1 et 2) . Pour cela, les LDL (densité = 1.03-1.053 g/ml) ont été préparées par ultracentrifugation, dialysées dans un tampon PBS, pH 7.4 et validées par SDS-PAGE en conditions dénaturantes, puis marquées par le fluorochrome 1,1'- dioctadecyl-3 , 3 , 3 ' , 3 ' -tetramethyl-indocarbocyanide
(DiI) . Les LDL-DiI ont été incubées sur des cellules à des concentrations finales de 0, 10 et 100 μg/ml pendant 3 heures à 40C. Après lavage au PBS, la liaison a été analysée par cytofluorométrie au FACS
(Fluorescence-Activated CeIl Sorting) c'est-à-dire que la fluorescence de chaque cellule à l'intérieur d'une population donnée est individuellement mesurée par cytométrie en flux sur un appareil Facscalibur (Becton Dickinson) . Les paramètres mesurés sont le FSC
(Forward Scatter) , SSC (Side Scatter) et la fluorescence émise à la longueur d'onde de 530 nm après excitation avec' un laser Argon à 48B nm. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 1) .
'Les résultats présentés sur la figure 1 montrent que les cellules HepG2 et les cellules HeLa expriment le plus fortement le LDL-R.
De plus, .plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein sont disponibles : MCF7-ras, MDA-MB-435 et MDA- ""HB'-231". L'"expression du 'LDL-R" sûr ces "lignées cellulaires cancéreuses humaines a été mise en évidence par l'étude de la liaison de LDL marquées sur cette lignée cellulaire. Pour cela, les LDL (d=1.03- 1.053) ont été préparées par ultracentrifugation, dialysées dans un tampon PBS, pH 7,4 et validées par SDS-PAGE en conditions dénaturantes, puis marquées par le fluorochrome 1,1'- dioctadecyl-3 , 3 , 3 ' , 3 ' - tetramethyl-indocarbocyanide (DiI) . Les LDL-DiI ont été incubées sur les cellules- à des concentrations finales de 6,25, 12,5, 25, 50 et 100 μg/ml pendant 3 heures à 4 0C. Après lavage au PBS, la liaison a été analysée par cytofluorométrie (FACS) et les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes .
Ainsi, chaque lignée a été testée pour son niveau d'expression du LDL-R (figure 3) : les MCF7-ras ainsi que les MDA-MB-435 ont un niveau d'expression du LDL-R équivalent à la moitié de celui des HepG2. Les MDA-MB- 231 représentent une population homogène qui exprime le LDL-R à haut niveau.
Exemple 3 ; Tests fonctionnels in vitro des anticorps monoclonaux dirigés contre le pβptide correspondant à la séquence SEQ ID NO ; 1 sélectionnés à l' Exemple 1
La fonctionnalité des anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à la séquence SEQ ID NO : 1 a été évaluée par l'étude de la liaison des anticorps au LDL-R au niveau cellulaire (cellules A549 et cellules . MDA-MB-231) , l'étude de la cross- réactivité des anticorps au LDL-R de cellules C2C12 (souris), GHO-Kl (hamster), YB2/0 (rat), l'étude de la compétition entre ces anticorps et les LDL sur le LDL- R de cellules A459, l'étude de leur cinétique d' internalisation ainsi que l'étude du caractère pro- apoptotique des anticorps.
Etude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R de cellules A549
La liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R a été évaluée par quantification du marquage de cellules A549 cultivées en présence de LPDS (lipoprotein Déficient Sérum) pendant 24h, par cytométrie en flux
(FACS) . Pour réaliser ce test, les anticorps Anti-LDL- R 5E5 ont été incubés à des concentrations finales de
(1, 3, 10, 30, 100 μg/ml) pendant 3 heures à 4°C. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2 , IgGl, ATCC-LGC Promochem CRL-2224) et C7 (anti-LDL-R, IgG2b, ATCC CRL-1691) , préparés et incubés dans les mêmes conditions que les Anti-LDL-R 5E5, ont servis d'anticorps contrôles, négatif et positif respectivement. La révélation de la liaison a été effectuée en utilisant un anticorps secondaire anti- IgG-PE. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 4).
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 reconnaissent le LDL-R des cellules A549 de manière dose-dépendante.
Etude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R de cellules MDA-MB-231
La liaison des anticorps Anti -LDL-R 5E5 au LDL-R des cellules MDA-MB-231 a été évaluée selon le même protocole décrit pour l'étude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R de cellules A549, par quantification du marquage de cellules MDA-MB-231 cultivées en présence de LPDS pendant 24h, par cytométrie en flux (FACS) . Pour réaliser ce test, les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été incubés à des concentrations finales de 1, 3, 10, 30, 100 μg/ml pendant 3 heures à 4°C. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl) et Cl (anti-LDL-R, IgG2b) , prépares et" incubés dans les mêmes conditions que les- Anti-LDL-R 5E5 , ont servis d'anticorps contrôles, négatif et positif respectivement. La révélation de la liaison a été effectuée en utilisant un anti-IgG-PE. Les résultats ont / été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 5) .
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 reconnaissent le LDL-R des cellules MDA-MB-231
Etude de la cross-réactivité .des anticorps Anti-LDL-R
5E5 au LDL-R de cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0
La cross-réactivité des anticorps anti LDL-R a été testée chez la souris (cellules C2C12) , chez le rat (cellules YB2/0) et chez le hamster (cellules CHO-Kl) . Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été incubés à une concentration finale de 30 μg/ml pendant 3 heures à 40C sur des cellules C2C12, CHO-Kl et,. YB2/0 préalablement cultivées en conditions de LPDS pendant 24h. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2 , IgGl) et C7 ' (anti-LDL-R, . IgG2b) ont servis d'anticorps contrôles négatif et positif respectivement. La révélation de la liaison a été effectuée en utilisant un anti-IgG-PE. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 6A) et en moyenne de fluorescence (Figure 6B) .
Etude de la compétition des anticorps Anti-LDL-R 5E5 avec les LDL sur des cellules A549
La compétition des LDL avec les anticorps Anti-LDL-R 5E5 a été étudiée en testant la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 , à 30 μg/ml, en compétition avec des LDL non marquées à des concentrations croissantes (1, 4 et 16 fois la concentration des anticorps, exprimée en nM) sur des cellules A549 pendant 3 h à '40C. La révélation de la liaison a été efféctué'e en utilisant un. anti-LgG-PE.' -La* -li-aiVôή des" anticorps -au LDL-R -a été ensuite analysée par FACS et les résultats exprimés en moyenne de fluorescence (Figure 7) . Ce test de compétition des anticorps avec les LDL a permis . de mettre en évidence que la liaison de l'anticorps 5E5 au LDL-R des cellules A549 n'est pas diminuée par l'addition de LDL à des concentrations physiologiques dans le milieu. Cela signifie que les anticorps 5E5 ne se lient pas au même site que les LDL.
Cinétique d' internalisation des anticorps Anti-LDL-R 5E5 La cinétique d' internalisation de l'anticorps Anti- LDL-R 5E5 a été étudiée sur 24 heures lors de l'incubation à 370C de l'anticorps (30 μg/ml) marqué à la rhodamine (NHS-rhodamine, Pierce, réf 46102) sur des cellules A549. Les cinétiques d' internalisation de l'anticorps contrôle C7 (30 μg/ml) marqué à la rhodamine et des LDL-DiI (30 μg/ml) ont été étudiées en parallèle. Après 2h, 4h, 6h et 24h d'incubation, les anticorps/LDL-Dil liés mais non internalisés ont été décrochés par du sulfate de dextran et quantifiés par fluorimétrie . Les cellules A549 ont ensuite été lysées par de la soude (0.1 N) puis la quantité d'anticorps internalisés a été quantifiée par fluorimétrie . Le pourcentage d' internalisation a été calculé selon la formule suivante : fluorescence des anticorps internalisés/ (fluorescence des anticorps internalisés + fluorescence des anticorps liés mais non internalisés) .
La cinétique d' internalisation des anticorps Anti-LDL- R 5E5 est intermédiaire entre celle des LDL (cinétique la plus rapide avec 60% d' internalisation à 4h) et celle du Cl qui s ' internalise un peu plus lentement (Figure 8) . Comme pour les LDL, la cinétique d' internalisation des- anticorps est- biphàsique avec une . internalisation .' rapide-..au. cours-- des- 4 - à--1-6- premières heures. Après 6h d'incubation, les 3 anticorps testés montrent le même taux d1 internalisation avec un plateau d' internalisation d'environ 60% à 24h.
Etude du caractère pro-apoptotique des anticorps Anti- LDL-R 5E5
La croissance des cellules A549 en présence et en l'absence d'-anticorps Anti-LDL-R 5E5 a été étudiée par un double marquage FITC-annexine V (qui se lie à la phosphatidylsérine des cellules apoptotiques en phase précoce) et iodure de propidium (PI, qui ne marque que les cellules nécrotiques dont la membrane plasmique est lésée) par c'ytométrie en flux (FACS) . Pour réaliser ce test, les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été . incubés à une concentration finale de 30 μg/ml pendant 16 heures (durée d'un test d'ADCC) à 370C. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2 , IgGl) et C7 (anti-LDL-R, IgG2b) , préparés et incubés dans les mêmes conditions que les Anti-LDL-R 5B5, ont servis de référence. Un contrôle négatif, cellules sans .anticorps, et un contrôle positif, cellules incubées' avec de la camptothécine, ont été effectués parallèlement .
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ne présentent pas d'effet fortement pro-apoptotique sur les cellules A549 après 16h d'incubation.
Exemple 4 : Etudes in vivo
Le modèle animal choisi est un modèle de xénogreffe de tissu tumoral humain sur des souris nude . La xénogreffe de cellules tumorales est implantée en sous-cutanée .
Choix de la lignée cellulaire cancéreuse humaine pour la xénogrëffe
• Criblage- • -des"- lignées — cel-l-ulaires - - - pour - l'expression du LDL-R
Plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein sont disponibles : MCF7-ras, MDA-MB-435 et MDA-MB-231 et le choix de la lignée à implanter dépend pour no'tre étude du niveau d'expression du LDL-R. L'expression du LDL-R sur ces lignées cellulaires cancéreuses humaines a été mise en évidence par l'étude de la liaison de LDL marquées sur cette lignée cellulaire. Pour cela, les • LDL (d=l.03-1.053 g/ml) ont été préparées par ultracentrifugation, dialysées dans un tampon PBS, pH 7,4 et validées par SDS-PAGE en conditions dénaturantes, puis marquées par le fluorochrome 1,1'- dioctadecyl-3 , 3 , 3 ' , 3 ' -tetramethyl-indocarbocyanide (DiI) . Les LDL-DiI ont été incubées sur les cellules à des concentrations finales de 6,25, 12,5, 25, 50 et 100 μg/ml pendant 3 heures à 4 0C. Après lavage au PBS, la liaison a été analysée par cytofluorométrie (FACS) et les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes .
Ainsi, chaque lignée a été testée pour son niveau d'expression du LDL-R (Figures 2 et 3) . : les MCF7-ras ainsi que les MDA-MB-435 ont un niveau d'expression du LDL-R équivalent à la moitié de celui des HepG2. Les MDA-MB-231 représentent une population homogène qui exprime le LDL-R à haut niveau. Au vu de ces résultats, notre choix sur la lignée à implanter s'est porté sur les MDA-MB-231.
• Détermination du nombre de cellules à implanter pour la xénogreffe
La vitesse d'apparition de la tumeur en fonction du nombre de cellules implantées chez des souris nude a été étudiée. L'étude porte sur l'implantation de 0,5.106 7 106, 2.106 et 5.106 cellules.
• Etude de la compétition de l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 avec les LDL sur des cellules MDA-MB-231
La compétition des LDL avec l'anticorps Anti-LDL-R 5É5 a été étudiée en testant la liaison des LDL marquées au DiI, à 12.5 μg/ml en compétition avec l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 à des concentrations croissantes (6,25, 12,5, 25, 50,-'et 80 μg/ml) sur des cellules MDA-MB-231 pendant 3 h à 4°C. La liaison des anticorps au LDL-R a été ensuite analysée par FACS et les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes..
Protocole in vivo
Pour le traitement des souris avec l'anticorps Anti- LDL-R 5E5 , l'approche choisie consiste à injecter la lignée cellulaire et l'anticorps simultanément (Test de Winn) . Cette approche permet d'évaluer la capacité de l'anticorps à empêcher la formation de la tumeur.
Le premier groupe, groupe Contrôle, comprend 5 souris nude implantées avec 10s cellules MDA-MB-231 reprises dans 200μl d'un anticorps contrôle, de même isotype que l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 (IgGi) qui ne reconnaît pas le LDL-R, sans traitement successif à l'implantation des cellules.
Le deuxième groupe comprend 5 souris nude implantées avec 10s cellules MDA-MB-231 reprises dans 200μl " d'anticorps Anti-LDL-R 5E5 , sans traitement successif a l'implantation des cellules.
Par ailleurs, une approche « modifiée » du test de Winn consistant à traiter les souris nude après implantation simultanée des cellules MDA-MB-231 et de l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 avec l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 , deux fois par semaine au cours des 4 semaines de l'étude (troisième groupe) a été mise en place. Le troisième groupe comprend 5 souris nude implantées avec 106 cellules MDA-MB-231 reprises dans 200μl d'anticorps Anti-LDL-R 5E5, traitées en intra- péri'tonéale par 500 μg d'anticorps Anti-LDL-R SES, 2 fois par semaine (le premier trai-tement par' 500 -μg- ayant eu- lieu 3 à 4 h après l'implantation des cellules) .
Les souris sont contrôlées tous les jours avec mesure de la prise de poids et de la taille de..' la tumeur 3 fois par semaine. A la fin des 4 semaines de protocole, les souris sont sacrifiées et le foie, le coeur, les reins et la rate sont récupérés et congelés à - 8O0C pour chacune des 5 souris de chaque groupe. Par ailleurs, les sêrums des souris sont aussi récupérés et congelés . Exemple 5 : Etude de faisabilité thérapeutique
L'étude de la faisabilité thérapeutique a eu pour but de mettre en évidence une sur-exprèssion du LDL-R dans le tissun cancéreux par rapport au tissu sain, dans différents types de cancers. Pour cela une analyse en Western Blot (WB) de carcinomes hépatocellulaires a été réalisée.
Une analyse en Western Blot a été réalisée à partir de tissus issus de patients atteints de carcinome hépatocellulaire (CHC) survenu sur une cirrhose provoquée par l'alcool (3 patients) ou sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virus de l'hépatite C (15 patients). Deux prélèvements de tissu ont été fournis pour chaque patient: (i) un échantillon prélevé dans une zone non-tumorale mais cirrhosée et (ii) un échantillon prélevé dans du tissu tumoral, issu du même patient (avec un minimum de 70% d' hépatocytes tumoraux) .
Des analyses de type Western Blot, en utilisant un anticorps anti-LDL-R polyclonal de lapin (Research Diagnostics. Inc).,...ont été réalisées- -sur ces tissus... Une bande à 160 kDa, qui correspond a la forme mature du LDL-R, a été observée à la fois sur les tissus cirrhoses et sur les tissus cancéreux. En plus de cette bande, une bande à 120 kDa, correspondant à la forme immature du LDL-R (non glycosylée) , est présente . '
La quantification de la bande correspondant au LDL-R mature, normalisée par rapport à l'actine, a permis de mettre en évidence :
- Une sur-expression du LDL-R dans le tissu sain des 3 patients atteints de CHC survenu sur une cirrhose provoquée par l'alcool et dans le tissu sain de 2 patients sur les 15 atteints de CHC survenu sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virus de l'hépatite C.
Une sur-expression du LDL-R . dans le tissu cancéreux chez 7 patients sur les 15 patients atteints de CHC survenu sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virusr de l'hépatite C (niveau de sur-expression chez ces patients est entre 2 et 14 fois) .
Six patients atteints de CHC survenu sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virus de l'hépatite C n'ont pas présenté de' différentiel d'expression du LDL-R.
Exemple 6 : étude de la spécificité de l' anticorps
L'étude immunohistochimique a été réalisée sur des lames de tissue micro-array de tissus humains normaux, comportant 108 spots correspondants à 54 tissus humains normaux différents fixés en formol à 10%. L'anticorps C7 et l'anticorps anti-LDL-R 5E5 ont ont été dilués au 1/10 (lOμg/ml) . La réactivation antigénique a été réalisée au micro-ondes, 3 fois 5 minutes à 750 Watts dans un tampon citrate 1OmM, pH 6.
Il a" "été observé une absence" de' marquage ' "dans le - système hématopoïëtique (amygdale-, rate et • gangïdon lymphoïde) , le tissu musculaire (cœur et muscle strié squelettique) , le revêtement cutané et le tissu mammaire, quel que soit l'anticorps utilisé. Le système nerveux central (cortex cérébral, cervelet, noyaux gris centraux, hippocampe et moelle épinière) , les glandes surrénales (cortex et médullaire) , le foie et la vésicule biliaire ont été marqués par les 2 anticorps .
• Ces résultats sont en accord avec la littérature sur la distribution tissulaire ' du LDL-R puisque les surrénales, le foie, le système nerveux central, les testicules et les reins ont été décrits comme dès tissus exprimant fortement le LDL-R. LDL-R •
Exemple 6 : Amplification et séquençage des régions variables des anticorps anti-LDL-R 5E5
1.Amplification des régions VH et VK
L'ARN total de l'hybridome murin 5E5 , produisant une immunoglobuline de type' IgGl, K, a été extrait (kit Nucleospin RNA Macherey-Nagel réf. 740609.250). Les domaines variables des chaînes légère (VK) et lourde
(VH) de l'anticorps 5E5 ont été amplifiées par la technique de 5'RACE (Rapid Amplification of £DNA Ends)
(kit 5'RACE, Invitrogen réf., 18374.041) en s'ancrant dans la région constante Kappa (CK) murine, pour la chaîne légère Kappa, ou Gl murine, pour la chaîne lourde.
Brièvement, une première étape de transcription inverse a été tout d'abord réalisée en utilisant une amorce localisée dans la région 5' des régions constantes CK OU Gl murines. Une séquence poly-dC a été ensuite ajoutée en 3' dès ADNc synthétisés avant - de- réaliser l'amplification des régions- -VK-- et -' VH à • l'aide d'une amorce 5' reconnaissant la séquence poly- dC et d'une amorce 3', localisée dans les régions constantes CK OU Gl murines en 5 ' de l ' amorce de transcription inverse. Afin d'améliorer la spécificité de l'amplification une deuxième PCR « semi-nested » a été réalisée sur le produit de PCR VH en utilisant une amorce 3' située en 5' de l'amorce 3' de la première PCR.
Les amorces utilisées pour ces différents étapes sont les suivantes :
1) amorces de transcription inverse a. Amorce antisens spécifique Kappa murin
5'- ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC -3' (SEQ ID NO : 12) b. Amorce antisens spécifique Gl murin 5'- CTGGACAGGGATCCAGAGTTCCA -3' ,(SEQ ID NO : 13)
2) amorces de PCR 5'RACE a. Amorce antisens spécifique Kappa murin 5'- TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3' (SEQ ID NO : 14) b. Amorces antisens spécifiques Gl murin Amorce première PCR :
5'- TGTCACTGGCTCAGGGAAATAGCCCTTGAC -3' (SEQ ID NO :
15)
Amorce PCR « semi-nested » :
5'-CACCATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAGATCCA - 3' (SEQ ID NO :
16)
2. Détermination de la séquence des régions VH et VK
Après amplification les séquences VK et VH de l'anticorps 5E5 ont été clonées dans le plasmide pCR4- TOPO (TOPO-TA-cloning kit for sequencing, Invitrogen, réf. 45-0030) . Les plasmidë's' is'sus " 'd'au " minimum 3 colonie-G -recombinantes ont été purifiés et -ieiαr- insert- séquence à l'aide des amorces universelles M13 uni et rev.
La .séquence nucléotidique de,/ la région VK de l'anticorps murin 5E5 est indiquée sous la séquence SEQ ID NO : 8 et la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 10. Le gène VK appartient au sous-groupe Vκ4 (Vκ4/5, Almagro JC et al Immunogenetics 1998, 47 : 355-3.63) . Les séquences des CDRl, CDR2 et CDR3 de la région VK de l'anticorps murin 5E5, définies selon Kabat [Kabat et al., "Séquences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991) ] sont indiquées sous les séquences suivantes : SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4, respectivement
La séquence nucléotidique de la région VH de 5E5 est la séquence SEQ ID NO : 9 et la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 11. Le gène VH appartient au sous-groupe VHl (Honjo T. and Matsuda F. in « Immunoglobulin gènes ». Honjo T. and Alt F.W. eds, académie Press, London, 1996, ppl45-171) . Les séquences des CDRl, CDR2 et CDR3 de la région VH de l'anticorps murin 5E5 , définies selon Kabat [Kabat et al., "Séquences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991)] sont indiquées sous les séquences suivantes : SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7, respectivement.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein) , se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL.
2. Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins une région CDR (Complémentarity Detennining Région) de chacune de ses chaînes légères possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d' identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, et en ce qu' au moins une région CDR de chacune de ses chaînes lourdes possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7.
3. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractéri-sé en ce- que chaque' région' CDR de chacune de ses chaînes légères possède une - séquence- peptidique ayant au moins 70% d' identité avec les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4 respectivement, et en ce que chaque région CDR de chacune de ses chaînes lourdes possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec les séquences SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 respectivement.
4. Anticorps- selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la région variable de chacune de ses chaînes légères est codée, par une séquence d'acide nucléique possédant au moins 70% d'identité avec la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8,- et en ce que la région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par une séquence d' acide nucléique possédant au moins 70% d'identité avec la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 9.
5. Anticorps selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite région variable de chacune de ses chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et en ce que ladite région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 9.
6. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment F(ab')2, d'un fragment Fab' , d'un fragment Fab, d'une région CDR ou toute version modifiée de l'un quelconque de ces fragments ou région.
7. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est murin.
8. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à '' 6 , 'caractérisé en ce ' qu'il est" chimérique/" humanisé ou humain.
9. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est couplé à une toxine. ' :••'
10. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il permet le recrutement de cellules immunitaires effectrices .-
11. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il permet la destruction des cellules cancéreuses.
12. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est produit dans la lignée cellulaire SP2/0-AG14 de souris .
13. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être produit par l'hybridomé H5E5 déposé' sous le numéro 1-3488 à la CNCM.
14. Lignée cellulaire stable produisant un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
15. Lignée cellulaire stable selon la revendication 14 choisie parmi le groupe consistant en : YB2/0, SP2/0- AG14, IR983F,- le myélome humain Namalwa, PERC6 , les lignées CHO, notamment CHO-K-I, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6 , NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.
IS. Hybridome~ H5Ξ5 - déposé sous "le numéro d'enregistrement CNCM 1-3488 à- la--Collection- Nationale-' de Cultures de Microorganismes (CNCM) .
17. Fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 9 codant pour la région/ variable de la chaîne lourde d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.
18. Fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 8 codant pour la région variable de la chaîne légère d'un anticorps selon l'une des revendications 1 à 13.
19. Vecteur d'expression comprenant au moins un fragment d'ADN choisi parmi les fragments de séquence SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 8.
20. Peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL.
21. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 , pour activer in vitro les récepteurs FcγRIII de cellules immunitaires effectrices.
22. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour la fabrication d'un médicament .
23. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 22 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer.
24. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 22 ou 23, caractérisée en ce que les cancers traités sont les cancers pour lesquels le récepteur des LDL est sur-e3cprimé ""à" "la ' 'Surface" des
- ce-11u-le-s- cancéreuses.- - - - - - - - - • . - -
25. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 22 à 24, caractérisée en ce' que ledit cancer est le cancer de la prostate, du pancréas-, du foie, du sein, de l'estomac, des ovaires, du colon, du
•poumon ou des leucémies.
26. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 22 à 24 pour, la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers incluant la leucémie myéloide aiguë, les leucémies monocytaires aiguës, les leucémies myélomonocytiques, la leucémie myeloïde chronique en crise blastigue, les leucêmieâ lymplioïdes, les leucémies lymphoïdes chroniques, les tumeurs solides telles que le cancer êpidermoïde cervical, l ' adênocarcinome endométrial, le carcinome gastrique, ._ le carcinome hépatocellulaire, le choriocarcinome, les tumeurs du cerveau.
27. Composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 et un excipient et/ou un ' véhicule pharmaceutiquement acceptables .
28. Utilisation de l'anticorps selon l'une des revendications 1 à 13 dans les analyses immunohistochimiques de tissus cancéreux, sains ou cirrhoses, en Western Blot, en ELISA ou en test de quantification in vivo.
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