WO2007013613A1

WO2007013613A1 - フコイダン又はフコイダン加水分解生成物と免疫賦活素材とを含む組成物

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Publication number: WO2007013613A1
Application number: PCT/JP2006/315026
Authority: WO
Inventors: Yuji Nonaka; Takeshi Yasumoto; Hideo Naoki; Toshihide Kusumoto
Original assignee: Suntory Ltd; Tropical Technology Center Ltd
Current assignee: Suntory Ltd; Tropical Technology Center Ltd
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2006-07-28
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2008-01-29
Also published as: EP1920774A1; KR20080034973A; CA2617219A1; TW200803872A; AU2006273151A1; JPWO2007013613A1; EP1920774A4; CN101282732A

Abstract

　乳酸菌などの免疫賦活素材の活性を増強させる素材を提供すること。そのような素材を提供することにより、免疫賦活素材の使用量を低減させることが可能となる。また、そのような素材を提供することにより、強力な免疫賦活活性と好ましい発酵特性を有する乳酸菌の選抜にかかる時間を短縮させることも可能となる。これら目的のため、フコイダンを酸加水分解することにより得られる生成物またはオリゴ糖を免疫賦活素材と組み合わせて用いる。このような組み合わせにより、それらの免疫機能調節作用または免疫賦活活性を相乗的に増強する。

Description

明細書

フコィダン又はフコィダン加水分解生成物と免疫賦活素材とを含む組成物

技術分野

[0001] 本発明は、フコィダン又はフコィダン加水分解生成物と免疫賦活素材とを含み、免疫力の増強、免疫機能の調節などを目的とした飲食品、医薬品、健康食品、機能性食品、化粧品等に利用可能な組成物に関する。

背景技術

[0002] 免疫陚活素材

近年、健康食品分野においては、免疫賦活作用を有する素材が注目されており、それらを含む健康食品が多く開発されている。これらは、加齢やストレス、疾患などにより低下した免疫力の回復等の目的に用いられる。そのような素材には、例えば、乳酸菌 (乳酸球菌、乳酸桿菌）、酵母、真菌類のような微生物;シィタケ、マイタケ、霊芝、ァガリタスなどのキノコ類;海藻類;漢方薬等が含まれる。

[0003] 乳酸菌

上記免疫賦活素材の中でも、乳酸菌は、その免疫賦活作用が注目されており、一部の乳酸菌に関して、 NK (ナチュラルキラー)活性を増強する作用や ThlZTh2バランスを改善する作用等が報告されている。また、乳酸菌は、従来から飲食用に供されており、安全性が高いことも知られている。従って、乳酸菌は、免疫力の低下を回復する手段として望まし、と考えられる。

[0004] 乳酸菌の免疫賦活作用の効果を高めるには、飲食品中の乳酸菌の含量を増やせばよい。しかし、乳酸菌を多量に飲料などに添加すると沈殿を生じるという問題があつた。このような理由から、これまで乳酸菌を用いた飲食品としては、漬物のような固体のものや、沈殿が気にならない飲食品（たとえばヨーグルトや乳飲料）がほとんどだつた。また、たとえばヨーグルトのように、発酵により乳酸菌を増やす場合でも、乳酸菌の数が一定量に達すればそれ以上は増えないため、飲食品中の乳酸菌含量を増やすのには限界があった。しかも、発酵食品を作る以上、機能だけでなぐ発酵の度合い、発酵後の香味、発酵後の乳酸菌の数、なども考慮する必要があった。従って、乳酸菌を用いて機能性飲食品、特に免疫機能調節を目的とした機能性発酵飲食品を開発するためには、発酵特性に優れ、かつ免疫機能調節作用にも優れた乳酸菌を用いることが必須である。しかし、乳酸菌の発酵特性と免疫機能調節作用には全く相関が無い。したがってこのような乳酸菌を探索するのは容易なことではない。

[0005] 近年では乳酸菌などの免疫賦活素材の活性を高めるためのいくつかの方法が報告されている。たとえば、 3〜8種の乳酸菌や酵母を混合培養することで免疫賦活作用が増強するという報告や (特許文献 1)、乳酸菌とキノコを併用することで免疫賦活作用を増強させる方法 (特許文献 2)などの報告がある。

[0006] フコィダンおよびフコィダン加水分解牛.成物

フコィダンは藻類に含まれる硫酸化多糖であり、抗血液凝固作用、脂血清澄作用（血液中のコレステロールや過酸ィ匕脂質を除去する作用）、抗腫瘍作用、癌転移抑制作用、抗エイズウイルス感染作用等の様々な活性を有することが報告されている。中でも、生体の免疫機能を正常化する作用が注目されており、免疫機能調節作用を有する医薬品や健康食品の素材として有用であると考えられている。しかし、フコィダンは分子量が極めて大きい硫酸ィ匕多糖であり、そのまま飲食品や医薬品等として用いる際には、吸収性、抗原性、均一性、抗凝血活性等に関する問題がある。

[0007] これらの問題を解決するために、フコィダン力低分子化合物を得るための試みがいくつかなされている。例えばこれまでに、化学合成によるフコース含有オリゴ糖が報告されているが (非特許文献 1、 2および 3)、これらは有機合成反応により調製されているため食品などに使用するのは好ましくな力つた。

[0008] 一方、フコィダンを加水分解してフコィダンを低分子化する方法も報告されている。

例えば、特許文献 3には、フコィダンを酸加水分解する方法が開示されており、得られた低分子フコィダンは、 5 X 10³以下の分子量分布を有していたことが記載されている。また、特許文献 4には、酸を外部力も添加することなくフコィダンを加水分解してオリゴ糖を得る方法が記載されている。また、特許文献 5のように酵素によりフコィダンを加水分解する方法も報告されて！ヽる。

特許文献 1：特開 2005 - 68092 特許文献 2：特開 2004 - 51504

特許文献 3 :特開平 7— 215990

特許文献 4：特開 2002— 226496

特許文献 5：特開 2000 - 236889

非特許文献 1 : Carbohydrate research 4, 189-195 (1967)

非特許文献 2 : Carbohydrate research 37, 75-79 (1974)

非特許文献 3 : Carbohydrate research 41, 308-312 (1975)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] し力しながら、特許文献 1および 2の方法では、 V、ずれも不溶性素材同士を組み合わせる方法であって、沈殿を防ぐことには至っていない。また、乳酸菌以外の免疫賦活素材の活性を効果的に高めるような素材については、これまで検討がなされていない。

[0010] そこで、免疫賦活素材や乳酸菌の活性を相乗的に高める水溶性素材があれば、より強い効能を持った免疫機能調節剤や飲食品が開発できるだけでなぐ活性を維持したまま免疫賦活素材や乳酸菌の使用量を減らすこともできるため、結果として免疫賦活素材や乳酸菌の含有食品の開発範囲が広げることができる。更には良好な発酵特性と免疫機能調節作用を兼ね備えた乳酸菌を探索する負担も軽減される。また、食品や医薬品における用途を考慮すると、その物質は安全性が高くかつ簡便に製造できるものであることが必要とされる。

[0011] したがって本発明の目的は、免疫賦活素材を組み合わせることによりそれらの免疫機能調節作用を増強することができる物質を提供することである。

[0012] なお、ここでいう免疫機能調節作用とは、例えばキシロオリゴ糖のように腸内細菌叢を改善して間接的に免疫機能を整えるものではなぐいくつかのフコィダンで示されているように直接的に免疫担当細胞を活性ィ匕するものを指す。

[0013] 本発明のさらなる目的は、効果量を的確に飲食品または医薬組成物に添加することができる組成物を提供することである。

課題を解決するための手段 [0014] 本発明者は、フコィダン又はフコィダンの酸加水分解生成物、好ましくはオリゴ糖を任意の乳酸菌や免疫賦活素材と組み合わせることでそれらの免疫機能調節または免疫賦活活性が相乗的に増強することを見出し、本発明の完成に至った。本発明においては、フコィダン由来のそれらオリゴ糖をフコィダンオリゴ糖とも称する。

[0015] すなわち本発明は、

(1)フコィダン又はフコィダン加水分解生成物と免疫賦活素材とを含む組成物；

(2)加水分解生成物が、フコィダンを 0. 1〜6. ONの酸で、 25〜100°C、 0. 25〜2 . 5時間加水分解して得られるものである、（1)に記載の組成物；

(3)加水分解生成物が、フコィダンを 0. 5〜4. ONの酸で、 30〜90°C、 0. 5〜2. 0 時間加水分解して得られるものである、 (2)に記載の組成物；

(4)加水分解が塩酸又は硫酸で行なわれる、 (1)〜（3)のいずれか 1つ記載の組成物；

(5)加水分解生成物がオリゴ糖である、 (1)〜 (4)のいずれか 1つに記載の組成物；

(6)オリゴ糖が、フコース、硫酸化フコース、ァセチル化フコース、及びグルクロン酸力なる群力選択される少なくとも一種の糖で構成される二糖から五糖までのオリゴ糖である、（5)に記載の組成物；

(7)オリゴ糖として、下記構造式 (1)、 (11)、（III)、 (IV)ゝ (V)ゝ (VI)、（VII)、（VIII)、 (IX )、（X)および (XI)で示される化合物力選択される少なくとも一種を含む、（6)に記載の組成物；

[0016] [化 1]

[0017] (分子量 340)

[0018] [化 2]

[0019] (分子量 486) [0020] [化 3]

[0021] (分子量 390) [0022] [化 4]

[0023] (分子量 420) [0024] [化 5]

[0025] (分子量 566)

[0026] [ィ匕 6]

[0027] (分子量 712) [0028] [化 7]

[0029] (分子量 754) [0030] [化 8]

[0031] (分子量 808)

[0032] [化 9]

[0033] (分子量 850)

[0034] [化 10]

[0035] (分子量 858)

[0036] [化 11]

[0037] (分子量 900)

(8)免疫賦活素材が、乳酸菌 (乳酸球菌および乳酸桿菌)、酵母、真菌類のような微生物；シィタケ、マイタケ、霊芝、ァガリタスなどのキノコ類; CpGモチーフを含む免疫原性オリゴデォキシヌクレオチド（CpG— ODN)、 PolyI : Cのような核酸由来物質；リポ多糖 (LPS)、 β—グルカン;海藻類;漢方薬; ΜΜ46癌抗原のような癌ワクチン;コンカナパリン A(ConA)；クレスチン（登録商標）、 OK— 432 (ピシバニール、登録商標）、レンチナン (登録商標）のような BRM (生物学的応答修飾剤)から選択される少なくとも一種である、 (1)〜（7)のいずれか 1つに記載の組成物；

(9)免疫賦活素材が乳酸菌である、 (8)に記載の組成物；

(10) (1)〜（9)の、ずれか 1つに記載の組成物を含む免疫機能調節剤；

(11) (1)〜（9)のいずれか 1つに記載の組成物を添加した飲食品；

(12) (1)〜（9)のいずれか 1つに記載の組成物を含有し、免疫機能調節作用を有する旨の表示を付した飲食品；

(13) (1)〜（9)のいずれか 1つに記載の組成物を含む医薬組成物；および

(14) (1)〜（9)のいずれか 1つに記載の組成物を含む化粧品

に関する。

発明の効果

[0038] 本発明のフコィダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材との組み合わせは、それらを単独で用いた場合と比較して、相乗的に増強された免疫機能調節または免疫賦活作用を有する。従って、これまでの免疫賦活素材を用いた飲食品や医薬品よりも効果が高い製品を開発することが可能となる。また、その高い効果のため、免疫賦活素材の飲食品、医薬品、化粧品への添加量を減らすことも可能となる。

[0039] これらの利点は、免疫賦活素材として乳酸菌を用いる際に特に重要となる。例えば、水溶性の低い乳酸菌においては、その添加量を削減できれば、その沈殿を防止できる。また、免疫賦活活性と好ましい発酵特性を兼ね備えた乳酸菌を選抜する過程も省略できる。結果として、乳酸菌含有製品の開発を有利に進めることができる。

[0040] また、本発明の組成物の構成要件であるフコィダン又はその加水分解生成物は、食品素材力分離されたものであるため穏やかな作用を有し、極めて安全性が高、

[0041] 従って、本発明組成物は非常に有用であり、その応用範囲は飲食品のみならず、医薬品およびィ匕粧品にも適用可能である。

[0042] また、オリゴ糖として、上記構造式 (I)、 (II)、 (III)、 (IV)、 (V)、 (VI)、 (VII)、 (VIII)、

(IX)、（X)および (XI)で示される化合物カゝら選択される少なくとも一種を含むものを用いることにより、簡便かつ正確に品質管理できる。また、これらフコィダン由来オリゴ糖は低分子で扱いやすくまた簡便に製造でき、安全性も高いため、これらオリゴ糖を免疫賦活素材と組み合わせた組成物は、飲食品や医薬品等、様々な用途に用いることができる。

図面の簡単な説明

[0043] [図 1]図 1は、沖縛モズク力熱水抽出により得られるフコィダンの糖組成分析を示す HPLCチャートである。

[図 2A]図 2Aは、フコィダンを加水分解する際に用!ヽる酸濃度が免疫賦活活性に及ぼす影響を示す。

[図 2B]図 2Bは、フコィダンを加水分解する際に用いる酸濃度が免疫賦活活性に及ぼす影響を示す。

[図 3A]図 3Aは、フコィダンを加水分解する際に反応させる温度が免疫賦活活性に及ぼす影響を示す。

[図 3B]図 3Bは、フコィダンを加水分解する際に反応させる温度が免疫賦活活性に及ぼす影響を示す。

[図 4]図 4は、フコィダンを加水分解する際に反応させる時間が免疫賦活活性に及ぼす影響を示す。

[図 5]図 5は、式（I)で表される分子量 340のフコィダンオリゴ糖の MSスペクトルを示す。

[図 6]図 6は、式（II)で表される分子量 486のフコィダンオリゴ糖の MSスペクトルを示す。

[図 7]図 7は、式（I)で表される分子量 340のフコィダンオリゴ糖の¹ H— NMR^ぺクトルを示す。

[図 8]図 8は、式（I)で表される分子量 340のフコィダンオリゴ糖の¹³ C— NMRスぺタトルを示す。 [図 9]図 9は、式（II)で表される分子量 486のフコィダンオリゴ糖の¹ H—NMR^ぺクトルを示す。

[図 10]図 10は、式（II)で表される分子量 486のフコィダンオリゴ糖の¹³ C— NMRスぺタトルを示す。

[図 11]図 11は、式（III)で表される分子量 390のフコィダンオリゴ糖の¹ H— NMRスぺタトルを示す。

[図 12]図 12は、式（III)で表される分子量 390のフコィダンオリゴ糖の¹³ C—NMRスぺタトルを示す。

[図 13]図 13は、式 (V)で表される分子量 566のフコィダンオリゴ糖の¹ H— NMRスぺタトルを示す。

[図 14]図 14は、式 (V)で表される分子量 566のフコィダンオリゴ糖の¹³ C— NMRスぺタトルを示す。

[図 15]図 15は、式 (VI)で表される分子量 712のフコィダンオリゴ糖の¹ H - NMRスぺタトルを示す。

[図 16]図 16は、式 (VI)で表される分子量 712のフコィダンオリゴ糖の¹³ C— NMRスぺクトノレを示す。

[図 17]図 17は、式 (VII)で表される分子量 754のフコィダンオリゴ糖の¹ H - NMRスぺクトノレを示す。

[図 18]図 18は、式 (VII)で表される分子量 754のフコィダンオリゴ糖の¹³ C—NMRスぺクトノレを示す。

[図 19]図 19は、式 (VIII)で表される分子量 808のフコィダンオリゴ糖の¹ H— NMRスぺクトノレを示す。

[図 20]図 20は、式 (VIII)で表される分子量 808のフコィダンオリゴ糖の¹³ C— NMRスぺクトノレを示す。

[図 21]図 21は、式（IX)で表される分子量 850のフコィダンオリゴ糖の¹ H— NMRスぺタトルを示す。

[図 22]図 22は、式（IX)で表される分子量 850のフコィダンオリゴ糖の¹³ C— NMRスぺクトノレを示す„ [図 23]図 23は、式 (VII)で表される分子量 754のフコィダンオリゴ糖を再生した後の¹ H— NMRスペクトルを示す。

[図 24]図 24は、式 (VII)で表される分子量 754のフコィダンオリゴ糖を再生した後の T OF— MSスペクトルを示す。

[図 25]図 25は、式 (VII)で表される分子量 754のフコィダンオリゴ糖を再生した後の E SI MSZMSスペクトルを示す。

[図 26]図 26は、式 (IV)で表される分子量 420のフコィダンオリゴ糖の FAB— MSスぺクトノレを示す。

[図 27]図 27は、式（IV)で表される分子量 420のフコィダンオリゴ糖の MSZMSスぺタトルを示す。

[図 28]図 28は、式（X)で表される分子量 858および式（XI)で表される分子量 900のフコィダンオリゴ糖の FAB- MSスペクトルを示す。

[図 29]図 29は、式（X)で表される分子量 858のフコィダンオリゴ糖の FAB- MSZM Sスペクトルを示す。

[図 30]図 30は、式（XI)で表される分子量 900のフコィダンオリゴ糖の FAB-MSZM Sスペクトルを示す。

[図 31]図 31は、沖縛モズクを加水分解後、 ABEEで蛍光標識ィ匕した ESI— MSのチヤートを示す。

[図 32A]図 32Aは、式 (I)で表されるフコィダンオリゴ糖と乳酸菌の併用が相乗的に脾細胞の IFN— y誘導効果を高めることを示す。

[図 32B]図 32Bは、式 (II)で表されるフコィダンオリゴ糖と乳酸菌の併用が相乗的に脾細胞の IFN— y誘導効果を高めることを示す。

[図 33]図 33は、フコィダンオリゴ糖混合物と乳酸菌の併用が相乗的に脾細胞の IFN Ύ誘導効果を高めることを示す。

[図 34]図 34は、フコィダンオリゴ糖と乳酸菌の併用が相乗的に榭状細胞の IL 12誘導効果を高めることを示す。

[図 35]図 35は、フコィダンオリゴ糖と乳酸菌の併用が相乗的に榭状細胞の IL 10誘導効果を高めることを示す。 [図 36]図 36は、フコィダンオリゴ糖と乳酸菌の併用が相乗的に CTL活性を高めることを示す。

[図 37]図 37は、活性の殆どない乳酸菌とフコィダン加水分解生成物とによる IL— 12 産生の相乗的増強を示す。

[図 38]図 38は、乳酸菌以外の免疫賦活剤とフコィダン加水分解生成物とによる、 IF Ν- γ産生の相乗的増強を示す。

[図 39]図 39は、乳酸菌とフコィダン加水分解生成物が相乗的に ΝΚ活性を増強することを in vivoで証明する。

[図 40]図 40は、フコィダンと乳酸菌の併用が相乗的に脾細胞の IFN— γ誘導効果を高めることを示す。

発明を実施するための最良の形態

[0044] 免痔陚活素材

免疫賦活素材とは、動物の免疫応答力を増強する作用を有する素材のことをいう。免疫強化素材ともよばれる。本発明で用いる免疫賦活素材は、特に限定されないが、乳酸菌 (乳酸球菌、乳酸桿菌）、酵母、真菌類のような微生物;シィタケ、マイタケ、霊芝、ァガリタスなどのキノコ類; CpGモチーフを含む免疫原性オリゴデォキシヌクレォチド (CpG— ODN)、 PolyI : Cのような核酸由来物質;リポ多糖 (LPS)；海藻類;漠方薬；癌ワクチン（例えば、 MM46癌抗原）；コンカナパリン A (ConA)；クレスチン（登録商標）、 OK— 432 (ピシバニール、登録商標）、レンチナン (登録商標）のような BR M (生物学的応答修飾剤)等の公知の免疫賦活剤が含まれる。

[0045] CpG— ODNとは、非メチル化シトシンーグァニンジヌクレオチド（CpG)を含む（短 V、）オリゴデォキシヌクレオチド（ODN)であり、そのような CpGモチーフを含有する C pG— ODNは、抗原提示細胞を直接活性ィ匕することができる。その結果、 CpG— O DNによる NK細胞等の活性ィ匕は、 Thl型応答の誘発および細胞障害性 T細胞の発生を促進する（特表 2004— 519453)。

[0046] Polyl： Cとは、イノシン酸とシチジル酸とからなるポリヌクレオチドコポリマーのことであり、ポリイノシンポリシチジン酸ともよばれる。霊長類においては、インターフェロンの体液中濃度を高める作用を有することが一般に知られている。 [0047] リポ多糖は、自然免疫系を誘導する引き金となる物質として知られている。

[0048] MM46とは、乳癌または腫瘍の一種である。 MM46癌に対する抗原等の癌ヮクチンは、癌細胞を攻撃する免疫機能を賦活化するため、癌の予防や治療に用いられる

[0049] ConAとは、タチナタマメ（Jack bean)の種子由来のレクチンである。種々の免疫賦活作用を有することが知られている。

[0050] BRMとは、癌治療において宿主の免疫機能等を増強、調節することによって腫瘍と宿主の相互関係を修飾し、治療効果を導き出す薬剤や治療法のことである。そのような薬剤には、 OK— 432やクレスチン (登録商標）、レンチナン (登録商標)等が含まれる。 OK— 432とは、主成分としてストレプトコックス 'ピオゲネス (A群 3型） Su株ぺニシリン処理凍結乾燥粉末、乾燥菌体を含有する、抗悪性腫瘍剤'リンパ管腫治療剤である。クレスチンとは、主成分として力ワラタケの菌糸体より得られた、たん白質と結合した多糖類を含有する、癌の治療に用いられる薬剤である。レンチナンとは、シィタケ力得られた j8—1, 3—グルカンである。

[0051] .

本発明で用いる乳酸菌は特定の株に限定されるものではないが、好ましくは、 Lact obadllus属であり、その中でも植物素材を発酵できる植物性乳酸菌が好ましい。さらにタナ ¾しくは、 Lactobacillus plantarumま 7こは Lactobacillus pentosusである。本発明にお、てフコィダン又はその加水分解生成物と組み合わせて用いる場合には、乳酸菌は、生きていてもよいし、死んでいてもよい。

[0052] フコィダン

本発明の組成物のための原料として用いられるフコィダンは、どのような構造のものでもよぐまたいずれの藻類力も取得してもよい。藻類の例には、クロガシラ目（Sphac elariales)、ナガマツモ目（Chordariales)、カャモノリ目（Scytosiphonales)、ウイキヨゥモ目 (Dictyosiphonaies)、ムテモ目 (し utlenalesノ、ケャリモ目 (Sporochnalesノ、ア^ングサ目（Dictyotales)、コンブ目（Laminariales)、ヒバマタ目（Fucales)を含む褐藻綱 Ph aeophyceaeの海藻が含まれる。好ましくはモズク、より好ましくは沖縛モズク由来のフコィダンを用いる。 [0053] フコィダンの抽出方法

フコィダンを藻類力抽出する方法は種々検討されており、広く知られている（例えば、特開平 10— 245334に記載されているような水を用いる方法、特開平 10— 195 106に記載されてヽるような酸を用いる方法、特開 2002— 262788に記載されてヽるようなアルカリ水性溶媒を用いる方法等である)。本発明にお！/、て原料として用いるフコィダンはこれら公知の方法により取得することができる。本発明においては、例えば、以下の方法により取得したものを用いる。

[0054] 即ち、藻類 (例えば沖縛モズク）に蒸留水 5〜10倍量をカ卩え、 50〜100°Cで数分〜5時間、好ましくは 60〜90°Cで 0. 5〜2. 0時間、さらに好ましくは 80〜90°Cで約 1時間抽出する。このようにして得られた藻類抽出物を冷却、吸引濾過、脱塩および乾燥することにより、容易に水に溶解するフコィダン画分を得ることができる。このようにして得られたフコィダン画分は、さらに精製することなく次の工程に用いてもよいし、更に精製して力も用いてもよい。

[0055] フコィダンは、好ましくは上記のように藻類力も抽出したものを用いるが、藻類に含まれた状態で用いてもょヽ。フコィダンまたはそれを含む藻類を次の加水分解工程に付すことによってフコィダン加水分解生成物が得られる。

[0056] フコィダン加水/解牛.成物

フコィダン加水分解生成物とは、硫酸ィ匕多糖であるフコィダンを加水分解することにより得られうる単糖および多糖類を包含する糖誘導体、並びにそれらの混合物のことをいう。フコィダン加水分解生成物は、好ましくは多糖類であり、より好ましくは 2〜1 0個の単糖からなるオリゴ糖、さらにより好ましくは 2〜5個の単糖からなるオリゴ糖である。本発明においては、フコィダンを加水分解して得られる上記のようなオリゴ糖をフコィダンオリゴ糖とも称する。オリゴ糖を構成する単糖は、好ましくはフコース、硫酸化フコース、ァセチル化フコース、および Zまたはグルクロン酸である。特に好ましいオリゴ糖は、上記式 (I)〜 (XI)の化合物である。

[0057] フコィダン加水分解生成物は以下の様にして製造される。

[0058] フコィダン加水分解生成物の製造

(1)フコィダンの加水分解本発明の構成要件であるフコィダン加水分解生成物は、特許文献 3〜5に記載されて、るように、フコィダンを酸や酵素を用いる方法により加水分解することにより得られる。酸加水分解を行なう場合には、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸等の無機酸を用いてもよいし、酢酸、クェン酸、シユウ酸、コハク酸、ギ酸、プロピオン酸等の有機酸を用いてもよい。好ましい酸は、塩酸および硫酸である。好ましくは、以下の様な酸加水分解条件を用いる。

[0059] 即ち、上記のようにして藻類力得られたフコィダンを含む画分またはフコィダンを、酸、好ましくは塩酸を用い、 0. 1〜6. ON、好ましくは 0. 5〜4. ON、さらに好ましくは 0. 5〜2. ONの HC1を含む、 25〜100。C、好ましくは 30〜90。C、さらに好ましくは 50〜80°Cの水性溶媒中で、 0. 1〜3時間、好ましくは 0. 25-2. 5時間、さらに好ましくは 0. 5〜2. 0時間加水分解を行なう。得られた反応物を塩基、例えば約 1Nの N aOHで中和した後、電気透析もしくはゲル濾過等の適切な手段で脱塩し、乾燥 (例えば、凍結乾燥)することにより、フコィダンオリゴ糖混合物を含有する加水分解生成物を得ることができる。

[0060] このようにして得られた加水分解生成物は、このままフコィダン加水分解生成物として用いてもょ、が、さらに精製してその活性を高めることができる。

[0061] (2)加 7k分解牛成物の精製: よびオリゴ糖の単離

フコィダン加水分解生成物の精製は、クロマトグラフィー、再結晶、透析、アルコール沈殿等の方法を単独で、または組み合わせて用いることができる。例えば、以下の操作に従って精製を行なう。

[0062] 先ず、オリゴ糖混合物を含有するフコィダン加水分解生成物を陰イオン交換榭脂を用いたクロマトグラフィーに付して、吸着されずに通過する、硫酸基を含まないオリゴ糖を含有する画分（中性 ·酸性糖画分)と、酸性溶出液により溶出する、硫酸基を多く含むオリゴ糖を含有する画分 (硫酸化糖画分)とを分離する。

[0063] 本発明におヽては、このようにして得られた各画分をフコィダン加水分解生成物として用いることが好適である力以下の様にして、さらに精製してオリゴ糖を単離して用いてもよい。

[0064] 中性 ·酸性糖画分をさらにゲル濾過に付すことにより、式 (I)で表される二糖と式 (II) で表される三糖を得ることができる。

[0065] 一方、硫酸ィ匕糖画分をクロマトグラフィーに付すことにより、硫酸ィ匕オリゴ糖 (III)、 (I V)、（V)、（VI)、（VII)、（VIII)、（IX)、（X)、または (XI)各成分を単離することができる。

[0066] 各オリゴ糖は、精製、構造解析をより容易にするために適宜標識化または誘導体化してもよい。例えば、オリゴ糖は、 4—ァミノ安息香酸ェチル (ABEE)のような試薬で蛍光標識ィ匕することができ、これによりオリゴ糖の検出が容易となる。標識化された各オリゴ糖を分離した後にその標識ィ匕部分を除去することにより、純粋なオリゴ糖を取得することができる。

[0067] フコイダンはその加 7k分解牛成物免疫陚活素材のみ合わせ

本発明は、上記のようにして得られるフコィダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材との組み合わせを含む組成物である。このような組み合わせにより、フコィダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材の免疫機能調節作用および Zまたは免疫賦活作用が相乗的に増強される。

[0068] 当該組成物においては、フコィダン加水分解生成物として単一のフコィダンオリゴ糖を免疫賦活素材 (例えば乳酸菌）と組み合わせて用いてもよい。また、フコイダンォリゴ糖を複数、例えば三種類またはそれ以上用いて、免疫賦活素材と組み合わせてちょい。

[0069] 乳酸菌を本発明の組み合わせにおいて用いる場合には、それは生きていてもよいし、死んでいてもよい。これに対して、キシロオリゴ糖の様なプレバイオテイクスとして知られているオリゴ糖は、主に乳酸菌の増殖を促すことにより免疫機能調節作用を増強するものである。本発明の加水分解生成物は、死菌による免疫機能調節作用をも増強できる点で、従来のプレバイオテイクスとして用いられて、るオリゴ糖よりも優れている。

[0070] 用いられるフコィダン又はその加水分解生成物の免疫賦活素材に対する好ま U、比率は、重量で 1： 1〜： LOOOO : 1、より好ましくは 250 : 1〜1000： 1である。

[0071] また、本発明には、フコィダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材とを組み合わせて用いることによりそれらの免疫機能調節および Zまたは免疫賦活作用を相乗的に増強する方法も含まれる。

[0072] 本発明の組み合わせを、例えば飲食品、医薬品およびィ匕粧品等に用いて、これらに免疫機能調節作用を付与することができる。

[0073] 免鐘翻

本明細書における免疫機能調節作用とは、生体において低下している免疫反応を高める、および Zまたは亢進している免疫反応を抑制する作用のことをいう。従って、その作用には、免疫賦活作用および免疫抑制作用が含まれる。

[0074] 本明細書における免疫機能調節作用は、当該技術分野で知られて、る方法で測定することができる。それは、例えば、免疫機能調節作用を有するサイト力インを誘導する作用を指標として測定することができる。この目的に用いられるサイト力インには、インターフェロン— γ、インターロイキン— 10、 12等が含まれる。また、免疫機能調節作用は、免疫応答に関与する榭状細胞の成熟化や、細胞障害性 Τ細胞 (CTL)の活性を指標として測定することもできる。

[0075] 本発明の免疫機能調節剤は健康増進のために用いることができるが、腫瘍、癌の転移、ウィルス性疾患 (例えば、カゼ、エイズ、ウィルス性肝炎）、アレルギー性疾患（例えば、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー、喘息）、自己免疫疾患 (例えば、リウマチ様関節炎）、炎症性疾患、糖尿病のような疾患または状態に有効である。

[0076] フコイダンはその加 7k分解牛成物免疫陚活素材含む食品添加物：よび飲

απ

本発明のフコィダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材との組み合わせを飲食品に用いる場合には、それを含み免疫機能調節作用を有する食品添加物および飲食品として、並びにそれを添加した免疫機能調節作用を有する健康食品として実施することが好適である。これらは、公知の甘味料、酸味料、ビタミン等の各種成分と混合してユーザーの嗜好に合う製品とすることができる。飲食品は、例えば、錠剤、力プセル剤、清涼飲料、茶飲料、ドリンク剤、ヨーグルトや乳酸菌飲料等の乳製品、調味料、加工食品、デザート類、菓子 (例えば、ガム、キャンディ、ゼリー)等の形態で提供することが可能である。本発明の飲食品には、免疫機能調節作用を有する旨の表示を容器や説明書に付した機能性食品 (特定保健用食品や条件付き特定保健用食品が含まれる)も含まれる。表示場所は容器またはそれに添付した指示書などが挙げられる力これらに限られない。容器には、瓶、缶、ペットボトル、プラスチックボトル、紙パック等が含まれるが、それらに限定されない。また、表示の方法には、印刷、刻印、シール等が含まれる力それらに限定されない。また、飲食品は、ペットの餌として加工したペットフードや動物飼料等でもよ!/、。

[0077] フコィダン又はその加水分解牛.成物免疫陚活素材の組み合わせを含む医蓉組本発明の組成物を医薬品として用いる場合には、例えば、免疫機能調節剤、免疫賦活剤、抗アレルギー剤および免疫抑制剤として用いることができる。したがって、 1 つの態様において、本発明はフコィダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材とを含む、免疫機能調節作用、免疫賦活作用、抗アレルギー作用および Ζまたは免疫抑制作用を有する医薬組成物である。

[0078] 医薬組成物は、主薬に希釈剤、担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用する公知の補助剤を用いて製剤化することができる。剤型としては、錠剤、カブセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、座剤、クリーム剤、軟膏剤、ェマルジヨン、ハツプ剤、注射剤等を挙げることができ、特に限定されるものではない。本医薬品の投与経路としては、例えば、経口投与、直腸投与、経腸投与等を挙げることができる力特に限定されるものではない。

[0079] フコィダン又はその加水分解牛.成物免疫陚活素材の組み合わせを含す粧品

本発明の組み合わせを用いることにより、免疫機能調節作用を有する化粧品を製造することができる。

[0080] 本発明の組み合わせを含む化粧品は、例えば、顔用、皮膚用、頭髪用のクリーム、ローション、ゲル、ムース、シャンプー、リンス等である。

[0081] 他の成分の併用

本発明の組み合わせを含む組成物は、飲食品、医薬組成物およびィ匕粧品において、それ自体単独で使用してもよいが、他の免疫機能調節作用または免疫賦活作用を有する食品素材または物質と併用することも好適である。そのような食品素材または物質としては、乳酸菌、キノコ類、フコィダン等が挙げられる。

[0082] 本発明の飲食品または組成物には、これら活性成分以外に、具体的な態様に応じて、一般的な成分、例えば、担体、希釈剤、賦形剤または添加剤等の成分を配合することができる。ここで希釈剤、担体、賦形剤としては、フコィダン又はその加水分解物および免疫賦活素材の生理活性を妨げないものであれば特に制限されず、例えばシュクロース、グルコース、果糖、マルトース、トレハロース、乳糖、澱粉、水飴、異性化液糖などの糖類、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール類、ソルビトール、マン-トール、エリスリトール、ラタチトール、キシリトール、マルチトール、還元パラチノース、還元澱粉分解物等の糖アルコール類、トリァセチン等の溶剤、アラビアガム、カラギナン、キサンタンガム、グァーガム、ジエランガム、ぺクチン等の多糖類、または水を挙げることができる。また添加剤としては、キレート剤等の助剤、香料、香辛料抽出物、防腐剤などを挙げることができる。希釈剤、担体、添加剤等を本発明の効果を損なわない限り配合することができる。

[0083] 飲食品、医薬組成物およびィ匕粧品におけるフコィダン又はその加水分解物および免疫賦活素材の配合量は、選択する他の配合成分との関係等により適宜選択されるものであり、特に限定されるものではない。し力しながら、通常、フコィダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材の合計量は、飲料または食品中、医薬組成物中に添加する場合、個体の体重 60kgに対して 0.01g〜10gZ日、好ましくは 0.05g〜lgZ 日、特に好ましくは 0.05g〜0.5gZ日である。化粧品中には、 0.01〜20重量％、好ましくは 0.05〜 15重量％用!、られる。

[0084] 本発明のフコィダン又はその加水分解生成物およびオリゴ糖は、抽出精製品や合成製品を単独で飲食品、医薬組成物または化粧品に用いることもできる。

[0085] なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなぐ請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

[実施例]

以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されなヽことは言うまでもなヽ。 [0086] 以下の実施例においては、特に明記しない限り、 ECA— 600型核磁気共鳴装置（日本電子株式会社)を用いて NMR分析を行なった。測定溶媒として重水 (D O)を

2 用いた。構成糖の結合様式は、 2D-NMRを用いて行なった。

実施例 1

[0087] フコィダン画分の調製

沖縛モズク藻体 lOOgに蒸留水を 1000mlカ卩え、 100°Cで 1時間抽出した。得られた抽出物を冷却後、吸引濾過、電気透析 (脱塩)をして凍結乾燥し、フコィダン画分を 2g得た。このフコィダンを 2N H SOを含む 100°Cの水溶液で 1時間加水分解し

2 4

、得られた水溶液を 2N NaOHを用いて中和し、 ABEEで蛍光標識ィ匕することで単糖分析サンプルを調製した。その構成糖の組成は SFuc (硫酸ィ匕フコース）： GlcA( グルクロン酸）： Fuc (フコース）： Xyl (キシロース） =49. 3 :4. 9 : 12. 1 : 1であることを確認した（図 1)。

カラム： Cosmosil C18 AR— Π (4. 6mm X 250mm)

移動相： 10%ァセトニトリル含有 0. 2Mホウ酸カリウム緩衝液

流速： 1. OmlZ分

温度： 45°C

検出：蛍光検出器 (株式会社島津製作所)、 Ex_: 305nm、 Em: 360nm

実施例 2

[0088] フコィダン加水分解の観 ^^ 衞乍 fflの沏 I定

下記の各種条件でフコィダン加水分解生成物を得て、それらと乳酸菌との組み合わせを用いて免疫機能調節作用を検討した。

[0089] 力 ΠτΚ分解の酴濃が ,疫機 ffi活件に及ぼす影響

実施例 1で得られたフコィダンを 0. 1、 0. 2、 0. 3、 0. 4、 0. 5、 1. 0、 2. 0、 4. 0、 5. 0、 6. 0Nの HC1(80。C)で 1時間カロ水分解し、その後それぞれに 0. 1、 0. 2、 0. 3、 0. 4、 0. 5、 1. 0、 2. 0、 4. 0、 5. 0、 6. 0Nの NaOHを添加することで中和した後、電気透析による脱塩、凍結乾燥を経て、フコィダン加水分解生成物を得た。これを 100 μ gZmlの濃度で C57BLZ6マウス（8週齢、雄、日本チャールズリバ一株式会社)から分離した脾細胞（5 X 10⁶cells/ml)に添加した。 30分後に 0. 1 μ g/ml の乳酸菌（Lactobacillus pentosus:FERM ABP— 10028)を添加し、 24時間培養し、培養上清を回収し、 IFN- yの産生量を ELISAキット（OptEIA、 BD Pharmin gen)を用いて測定した（図 2A)。また、フコィダン加水分解生成物単独の効果も検討するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作も行った（白の棒グラフ)。比較対照として、何も添カ卩していないもの（白の棒グラフ中の" none")、乳酸菌のみを添カロしたもの（黒の棒グラフ中の" none")を用いた。その結果、加水分解して得た生成物を乳酸菌と併用すると、それら単独で得られる結果と比較して IFN— y産生が相乗的に増強された。この相乗的効果は、 0.5〜4.0Nの HC1で加水分解して得られた生成物において認められた。

[0090] また、加水分解前のフコィダンだけを用いて上記の実験を行な、、他のサンプルと効果を比較した（図 2B)。その結果、 0. 5〜4.0Nの HC1で加水分解して得た加水分解生成物（図 2B、白い棒グラフ）は加水分解前のフコィダン（図 2B"フコィダン"）と同程度の活性し力示さないが、乳酸菌を加えることにより（図 2B、黒い棒グラフ）、フコィダンで得られたもの以上の活性を示すことが明らカゝとなった。

[0091] ] がぼす醫響

フコィダンを 25、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100。Cの 1Nの HC1で 1時間カロ水分解し、その後 1Nの NaOHを添加することで中和した後、電気透析による脱塩、凍結乾燥を経て、フコィダン加水分解生成物を得た。これを 100 gZmlの濃度で C5 7BLZ6マウス（8週齢、雄、日本チャールズリバ一株式会社)力分離した脾細胞（5 X 10°cells/ml)に添カ卩した。 30分後 0. 1 μ g/mlの乳酸菌 (Lactobacillus pentosus ； FERM ABP- 10028)を添加し、 24時間培養し、培養上清を回収し、 IFN— γの産生量を ELISAキット（OptEIA、 BD Pharmingen)を用いて測定した（図 3A)。また、フコィダン加水分解生成物単独の効果も検討するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作も行った（白い棒グラフ)。比較対照として、何も添加していないもの（白 V、棒グラフの none)、乳酸菌のみを添カ卩したもの（黒、棒グラフの none)を用いた。その結果、 HC1で加水分解して得たフコィダン加水分解生成物を乳酸菌と併用することで、それら単独で得られる結果と比較して相乗的に増強された IFN— γ産生が認められた。この相乗的効果は、 25〜100°Cで加水分解して得られた全ての生成物において認められた力特に、 30〜90°C (好ましくは 50〜80°C)で加水分解した場合に優れていた。

[0092] また、加水分解前のフコィダンだけを用いて上記の実験を行な、、その効果を本願発明のものと比較した。その結果、 50〜100°Cの HC1で加水分解して得た生成物は、乳酸菌と組み合わせて用いると、加水分解前のフコィダンと同程度以上の活性を示すことが明らかとなった（図 3B)。

[0093] がぼす響

フコィダンを INの HC1 (80°C)で 30、 60、 120分間加水分解し、その後 1Nの NaO Hを添加することで中和した後、電気透析による脱塩、凍結乾燥を経て、フコィダン加水分解生成物を得た。これを 100 gZmlの濃度で C57BLZ6マウス（8週齢、雄、日本チャールズリバ一株式会社)から分離した脾細胞（5 X 10⁶cells/ml)に添加した。 30分後 0. 1 g/mlの乳酸菌（Lactobacillus pentosus: FERM ABP— 10028 )を添加し、 24時間培養し、培養上清を回収し、 IFN- yの産生量を ELISAキット（ OptEIA、 BD Pharmingen)を用いて測定した（図 4)。また、フコィダン加水分解生成物単独の効果も検討するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作も行った。なお、比較対照として、何も添カ卩していないもの、乳酸菌のみを添カ卩したものを用いた。その結果、 30〜120分間加水分解して得られた全ての生成物は、乳酸菌と併用することで、それら単独で得られる結果と比較して IFN— y産生が相乗的に増強された。

[0094] したがって、フコィダン加水分解生成物は、乳酸菌と組み合わせて用いることにより、相乗的に増強した免疫機能調節または免疫賦活作用を有することが明らかとなつた。

実施例 3

[0095] 製したフコィダン加水分解の^^ 衞乍 ffl

フコィダン l_gに 2NHC1を 100ml加えて 80°Cで 1時間酸カ卩水分解を行ない、次いで INNaOHで中和した。得られた反応液をゲル濾過（バイオゲル P— 6 (Bio—Rad ) )に供して脱塩し、凍結乾燥を行なうことによりフコィダンオリゴ糖混合物を含む画分を得た (オリゴ糖画分)。得られたフコィダンオリゴ糖混合物は、蟻酸で活性化した陰イオン交換榭脂 (東ソ一株式会社)を用いるクロマトグラフィーに供した。その結果、ォリゴ糖画分は、水で溶出することで得られた硫酸基を含まなヽオリゴ糖を含有する画分 (Fr. B)と、 2NHC1で溶出することで得られた硫酸基を多く含むオリゴ糖を含有する画分 (硫酸化糖画分）に分離された。硫酸ィ匕糖画分をゲル濾過 (バイオゲル P— 6) に供し、分子量 500未満の Fr. Aと 500以上の Fr. Cに分けた。以上のように精製を行ったフコィダン加水分解生成物の各画分をそれぞれ 100 g/mlの濃度で、 C57B LZ6マウス (8週齢、雄、日本チャールズリバ一株式会社)から分離した脾細胞（5 X 10⁶cells/ml)に添カ卩した。 30分後 0. 1 μ gZmlの乳酸菌 (Lactobacillus pentosus: FERM ABP- 10028)を添加し、 24時間培養し、培養上清を回収し、 IFN— γの産生量を ELISAキット（OptEIA、 BD Pharmingen)を用いて測定した（表 1)。その結果、フコィダンに関は、濃度が低い時に活性を示した力その濃度を高くすると活性が消失した。一方、加水分解生成物 (オリゴ糖各分、 Fr. A〜C、硫酸化糖各分 )の全てにおいて、濃度依存的に免疫賦活能が高まり、かつフコィダンの活性よりも強かった。特に、オリゴ糖を精製することによって活性が強まることも分力つた。比較対照として用いた単糖 (フコース、硫酸ィ匕フコース)ゃプレバイオテイクスとして広く使われているキシロオリゴ糖にもこのような作用が無力つた。

[表 1]

+0.1 ^ g/m l乳酸菌

3 1 0 30 1 00

( jt g/ml )

フコィダン 9.8 10.2 5.2 n.d.

フコース 1 .2 1.9 - 2.9

硫酸化フコース 1 .3 0.5 - n.d.

オリゴ糖画分 n.d n.d. 5.5 9.6

Fr.A 1 0.5 1 7.2 21 .2 15.8

Fr.B 4.6 6.7 1 1 .0 21 .2

Fr.C 5.0 1 1 .5 19.3 21 .0

硫酸化糖画分 0.0 19.8 一 21 .3

キシロオリゴ糖 n.d. n.d. - n.d.

0 0.1 μ g/ml

乳酸菌 n.d. n.d. 実施例 4 [0097] フコィダンオリゴ糖の製造

a)フコィダンの加水分解およびオリゴ糖混合物の分離

実施例 1で得られたフコィダン画分 lgに 2NHC1を 100ml加えて 50〜100°Cで 1時間酸加水分解を行ない、次いで INNaOHで中和した。得られた反応液をゲル濾過 (バイオゲル P— 6 (Bio— Rad) )に付して脱塩し、凍結乾燥を行なうことによりフコイダンオリゴ糖混合物を 895mg得た。得られたフコィダンオリゴ糖混合物は、蟻酸で活性化した陰イオン交換榭脂 (東ソ一株式会社)を用いるクロマトグラフィーに付した。結果として、オリゴ糖混合物は、水で溶出することで得られた硫酸基を含まないオリゴ糖を含有する画分（中性'酸性糖画分） 280mgと、 2N HC1で溶出することで得られた硫酸基を多く含むオリゴ糖を含有する画分 (硫酸化糖画分) 425mgに分離された。

[0098] b)化合物（I)および (II)の単離

a)で得られた中性 ·酸性糖画分 lOOmgをゲル濾過（バイオゲル P— 4 (Bio— Rad) 、溶出溶媒: 0. 2Mホウ酸カリウム (K B O )水溶液）に付すことにより、当該画分から

2 4 7

分子量 340の二糖と分子量 486の三糖が分離された (化合物 I、 II：図 5、 6)。これらの分子量は、 FAB— MSにより求めた (ィ匕合物（I) [M -H]" : 339. 2、化合物（II) [M— H]— : 485. 0)。これらの化合物 5mgに、水 lml、 ABEE (4—ァミノ安息香酸ェチル） 1.6g、 NaBH CN (水素化シァノほう素ナトリウム） 350mg、メタノール 3.5ml、酢酸 4

3

10 1を加え、 65°C、 4時間撹拌した。反応液をクロ口ホルムと水で分配することにより蛍光標識化された上記二糖および三糖を約 7〜9mg取得した。これら標識化オリゴ糖について測定した¹ H— NMRおよび¹³ C— NMRのチャートを図 7〜10に示し、それらを解析した結果を表 2、 3に示した。これらの結果より、得られた分子量 340の二糖は式（I)で表される at—D— GlcA—(l→2)—L—Fucであり、分子量 486の三糖は式（II)で表される a - D - GlcA- ( 1→2) - a— L— Fuc— ( l→3)— L— Fucであることが分力つた。

[0099] [表 2] 表 2 ： ϋί光標識した化合物（I) についての¹ H— NMRおよび C一 NMR解析結果

[0100] [表 3]

表 3 ：蛍光標識した化合物（II) についての¹ H— NMRおよび¹³ C— NMR解析結果

[0101] c)化合物 (III)〜 (XI)の製诰次に、硫酸化糖画分をゲル濾過 (バイオゲル P— 6 (Bio— Rad) )に付すことにより脱塩した。得られた硫酸ィ匕糖画分 lOOmgに、水 lml、 ABEE (4—ァミノ安息香酸ェチル） 1. 6g、 NaBH CN (水素化シァノほう素ナトリウム） 350mg、メタノール 3. 5ml

3

、酢酸 410 1を加え、 65°C、 4時間撹拌した。得られた生成物を真空で乾燥させ、水とクロ口ホルムに分配し、水層を逆相カラムで（担体： Lichroprep RP— 8 (25—4 0 m) (Merck)、 φ 10 X 220mm ;溶媒条件： 5%CH CNZO. 1%TFA ( 100ml)

3

、 8%CH CN/0. l%TFA (100ml)、 15%CH CN/0. l%TFA (100ml)、 20

3 3

%CH CN/0. l%TFA (100ml) )処理することにより蛍光標識ィ匕されたオリゴ糖の

3

混合物を得た。得られた蛍光標識化合物を HPLC (カラム： cosmosil 5C18— AR —Π、 10. O X 250mm ;溶媒条件： 12. 5%CH CN/0. 1%TFA (5分）、 12. 5

3

- 27. 5%CH CN/0. 1%TFA (50分）；流速： 3mlZ分）でァセトニトリル： 0. 1%

3

TFA水溶液を 5〜30%の濃度勾配で溶出して、分子量力 39、 715、 861、 903、 9 57、 999であり硫酸基を有する 6つの標識ィ匕フコィダンオリゴ糖を混合物力分離した (分子量は、 ESI— MSにより決定した)。得られた標識ィ匕オリゴ糖について NMR スペクトルを測定し、その結果を解析した。標識ィ匕オリゴ糖の¹ H— NMRおよび¹³ C— NMRのチャートを図 11〜22に示し、それらを解析した結果を表 4〜 7に示す。これら結果力ら、分子量 539、 715、 861、 903、 957、 999のィ匕合物は、それぞれ、ィ匕合物 (111)、 (V)ゝ (VI)、（VII)、（VIII)、（IX)の標識体であることが明らかとなった。

[0102] 確認のため、各オリゴ糖上に結合して、た ABEEを除去し、再生したオリゴ糖の純品を得た。即ち、これら分離した各標識ィ匕オリゴ糖 10mg (100 1)に、過酸化水素、酢酸を各 10 1加えて一昼夜放置した後、乾固した。こうして得られた再生オリゴ糖のうち、分子量 903の化合物から得られたものを¹ H— NMR (図 23)、 TOF— MS (装 ¾\ oyager D -STR (Applied Biosystems)、 Ion mode: negative ^ Mode of operation： reflector ^ Accelerating voltage： 20kV、 Matrix： 2,5-dihydroxybenzoic acid) (|¾|24) 、 ESI— MSZMS (図 25)で解析したところ、その結果は、確かに式 (VII)の構造を示していた。

[0103] また、上記方法で分離できなかった分子量 420、 858、 900の化合物（それぞれ (I V)、（X)、（XI) )に関しては、反応混合物を FAB— MSZMS (装置： HX110A/HX11 0A(JEOL)、 Ion mode : MS, MS/MS(negative)、 Xe atom beam : 5kV Ion source accele rating potential : 10kV Collision energy : 2keV Matrix : Glycerol)、および ESI— MS MSで分析することによりその存在を確認した。図 26に（IV)の FAB— MSチャートを、図 27に MSZMSチャートを示した。また図 28に（X)および（XI)の FAB— MSチヤートを、図 29 30にそれぞれの MS/MSチャートを示した。

[0104] これらの結果より、分子量 390の二糖は化学式（III)で表される α L Fuc— 4 O— SO—— (1→3) L Fuc、分子量 420の二糖は化学式（IV)で表される α— D

3

GlcA— (1→2) L Fuc、分子量 566の三糖は化学式 (V)で表される α— L Fuc -4-O - SO—― (1→3) - [ a— D— GlcA— (l→2) ]— L— Fuc、分子量 71

3

2の四糖は化学式 (VI)で表される a -L-Fuc-4-O - SO 1→3)— [ a—D

3

-GlcA- (1→2) ] - a— L— Fuc— (1→3)— L— Fuc、そして分子量 754の四糖は化学式 (VII)で表される a -L-Fuc -4-O - SO 1→3)— [ a D— GlcA

3

- (1→2) ] - a— L— Fuc— 4— O ァセチルー（1→3)— L— Fuc、分子量 808の 5糖は化学式 (VIII)で表される [ α— D— GlcA— (1→2) a L Fuc—（1→3) ] - [ a -D-GlcA- (1→2) ] - a— L— Fuc— (l→3)— L— Fuc、分子量 850の 5 糖は化学式（IX)で表される [ α— D— GlcA— (1→2) a L Fuc—（1→3) ]— [ a -D-GlcA- (1→2) ]—4— 0 ァセチノレー a—L— Fuc—（1→3)—L— Fuc 、分子量 858の 5糖は化学式（X)で表される α— L Fuc— 4 O— SO——（1→3)

3

a L— Fuc— (1→3) a D— GlcA— (1→2) a L— Fuc— (1→3) — L— Fuc、分子量 900の 5糖は化学式（XI)で表される a—L— Fuc— 4— 0— SO

3 (1→3) a L— Fuc— (1→3)— [ a D— GlcA— (1→2) a L— Fuc — 4— O ァセチル一 (1→3)—L— Fucであることが分かった。

[0105] [表 4] ¾4. ^光標識した化台物 (III) についての¹ H NMRおよぴ ^{1 :I}C一 NMR解析結果

[0106] [表 5]

表 5. '光標識した化合物 (V) についての¹ H NMRおよび¹³ C— NMR解析結果

[0107] [表 6] 表 6. ΐϊί光標識した化合物（VI) についての¹ Η— NMRおよび ¹³C— NMR解析結果

7]

表 7. ¾光標識した化合物 (VII) についての 'H - NMRおよび¹³ C NMR解析結果

実施例 5

ォキナヮモズク藻体 lOOgに 2NHC11000mlを入れ、 1時間、 50 100°Cで酸加水分解を行った。得られた抽出物を冷却後、吸引濾過、電気透析 (脱塩)を行ない凍結乾燥しフコィダン画分を 2g得た。得られたフコィダン画分を ABEEで蛍光標識ィ匕したものを ESI— MS(4000Q TRAP LC/MS/MSシステム（Applied Biosyst ems J分析条件 Polarity： Negative ion mode； Declustering Potential：― 5 Ov; Collision energy:— lOeV; Temperature :550°C)で分析した結果、図 31で示されるチャートが得られ、式 (I)〜(XI)に示されるフコィダンオリゴ糖の存在が確認できた。

実施例 6 [oi io] フコィダンオリゴ糖化合物乳酸菌の組み合わせによるネ目乗効果

マウス！!縣田にする IFN— m im

実施例 3と同様に調製した脾細胞 5 X 10⁶cells/mlに分子量 340のフコィダンオリゴ糖 (化合物（I) )を 100 gZmlになるように wellに添加した。比較対照としてフコースと硫酸化フコース (それぞれ MW164、 244)、キシロオリゴ糖 (XOS)を等量用いた。 30分後に、乳酸菌（Lactobacillus pentosus： FERM ABP-10028) (死菌）を 0. 1 μ gZmlずつ各 wellに添カ卩した。 24時間培養後、培養上清を回収し IFN— yの産生量を ELISAキット（OptEIA、 BD Pharmingen)を用いて測定した（図 32A)。また、糖単独による効果を確認するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作を行なつた o

[0111] また、化合物 (II)に関しても、化合物 (I)と同様に実験を行った。用いられたィ匕合物

(Π)の量は、 well中、 10、 100及び 300 gZmlであった（図 32B)。

[0112] 化合物 (I)に関しては、それを乳酸菌と併用すると著しく強い IFN— γ誘導能が得られた（図 32Α)。この作用は、化合物 (I)と乳酸菌をそれぞれ単独で用いて得られた結果（図 32Α中、左力も 2番目および右力も 5番目）から予測できない程強ぐ両者を組み合わせて用いることにより相乗的効果が生じることを裏付けている。また、化合物 (II)に関しても、同様に乳酸菌との相乗効果が認められた (図 32Β)。構成成分のフコースや硫酸ィ匕フコースにはこのような活性が無ぐプレバイオテイクスとして広く使われているキシロオリゴ糖にもこのような作用が無力つた。従って、本発明のフコィダンオリゴ糖は、乳酸菌と併用することで相乗的に脾細胞を活性化させ、生体の免疫機能の調節において非常に有用であることが明ら力となった。

[0113] また、同様に調製した脾細胞に、化合物 (I)〜 (VII)の化合物を任意に 3種類均等に混合したものを 50 μ gZmlの濃度で添加し、 30分後に乳酸菌 (Lactobacillus pent osus ;FERM ABP- 10028) (死菌）を 0. 1 gZmlずつ各 wellに添カ卩した。 24時間培養後、培養上清を回収し IFN— yの産生量を測定した（図 33)。図に示すとおり、 (V)、 (VI)および (VII)の混合物、 (I)、 (V)および (VI)の混合物、および (I)、 (V)および (VII)の混合物を用いると、高い IFN— γ産生量が観測された。したがって、化合物 (I)〜 (XI)が混在してヽてヽる場合でも乳酸菌と併用することで免疫機能調節活性が上昇することがわ力つた。

実施例 7

[0114] フコィダンオリゴ糖による、マウス由榭状細胞に針する TL 10、 ί2謙作用、および CTL活件谐強作用

BALBZcマウス (8週齢、雄、日本 SLC株式会社)の大腿骨力骨髄細胞を分離し、 l X 10⁶cells/mlになるように、 10%FBS、 20ng/ml GM— CSF (Peprotec )、 20ng/ml IL— 3 (Peprotec)を含む RPMI 1640培地中に懸濁し、 24wellプレートで培養した。培養開始 3、 5日目に培地交換を行ない、付着性の未成熟榭状細胞を得た。得られた榭状細胞に、化合物 (1)、（11)、（111)、（V)、（VI)、および (VII)をそれぞれ 50 gZmlの濃度で前処理した。前処理 30分後に、乳酸菌（Lactobacillus pentosus iFERM ABP- 10028) (死菌）を 0. 1 gZmlずつ各 wellに添カ卩した。 2 日間培養後、培養上清と細胞を回収した。また、糖ィ匕合物単独による効果も確認するため、乳酸菌を添加しな、で上記と同様の操作を行なった。

[0115] 回収した培養上清は ELISAキットを用いて IL— 12と IL— 10を測定した。結果をそれぞれ図 34、 35に示した。化合物（I)は、それを乳酸菌と併用することで相乗的に IL —12を誘導した（図 34)。また、化合物 (11)、（III)および (V)は乳酸菌と併用することで IL— 10を誘導することも分力つた（図 35)。これらのことにより、本発明で見つかつたフコィダンオリゴ糖には生体の免疫機能を正にも負にも調節する (低下した免疫を活性化し、または過剰な免疫反応を抑制する)機能があることが分力つた。キシロオリゴ糖には、このような作用は認められなかった。

[0116] さらに、回収した細胞をカウントし、 1 X 10⁵cellsZmlに調製後、 1mlの細胞懸濁液中にマイトマイシン C (50 gZml)を処理し、 37°Cで 30分間反応させた。反応終了後、 PBSの洗浄によりマイトマイシン Cを除去し、常法により調製した C57BL/6マウスの脾細胞（5 X 10⁶cells/ml)を lml添加し、 4日間混合培養した。培養後細胞を回収し、 C57BLZ6マウスのァロ抗原を持つ P— 815細胞（SOOOcellsZlOO /z l)をターゲットにし、 E :T比 40 : 1および 80 : 1の割合で 4時間反応させ、殺傷された P— 8 15の数をフローサイトメトリーでカウントすることにより CTL活性を求めた（図 36)。化合物 (1)、（111)、（V)、（VI)、（VII)は乳酸菌と併用することで CTL活性が増強されることも分かった。

[0117] 実施例 7の結果も、本発明のフコィダン加水分解生成物を乳酸菌と組み合わせることにより、相乗的に増強した免疫機能調節または免疫賦活作用が得られることを示している。

実施例 8

[0118] 免疫機能調節活件ほん有さない ¾,酸^^の併用による TL 12 の相乗 ^^龟

BALBZcマウス（8週齢、雄、日本 SLC株式会社）に 4. 05%チォグリコレート培地 (Difco)を腹腔内投与し、 4日後 10mlの PBSを用いて腹腔内に浸潤した細胞を回収した。その後 1 X 10⁶cells/mlに調製後、 24wellプレートで培養した。培養開始 3 時間後、培地交換により浮遊細胞を除去し、マクロファージを得た。各 wellに化合物 (I)および実施例 3記載のオリゴ糖画分を 100 gZmlの濃度で添加し、 30分後、免疫機能調節活性の強!、乳酸菌 (Lactobacillus pentosus DS84C株；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに 2004年 5月 26日付けで受領された FE RM ABP-10028)、または免疫機能調節活性をほとんど有さない乳酸菌（市販の Lactobacillus pentosus (以下乳酸菌 A) ) (市販の Lactobacillus plantarum (以下乳酸菌 B) ) 0. 1 μ gZmlの濃度で添加し、 24時間培養した。その後培養上清を回収し、 I L— 12の産生量を測定した（図 37)。比較のため、これら 3種類の株をそれぞれ単独で用いて上記と同様の操作を行なった。乳酸菌 Aも乳酸菌 Bも、それ自身だけでは検出できる程度の IL— 12誘導活性を示さな力つたが、これらの株をィ匕合物 (I)やオリゴ糖画分と併用することで顕著に増大した IL— 12誘導活性が得られた。したがって本発明で得られるフコダン加水分解生成物は、免疫機能調節活性のなヽ乳酸菌と併用した場合でも、相乗的に強、免疫機能調節作用を発揮することが明らかとなつた。

実施例 9

[0119] 乳酸菌以外の物皙のネ目乗効果

C57BLZ6マウス（8週齢、雄、日本チャールズリバ一株式会社)力脾細胞を分離し、 5 X 10⁶cells/mlになるように調製し、 24wellプレートで培養した。実施例 3の Fr .C画分をそれぞれ 30 /z gZmlになるように各 wellに添加した。 30分後に、免疫賦活作用または免疫機能調節作用のある物質として、 Polyl： C (SIGMA)を 5 μ g/ml、 L PS (SIGMA)を 2ng/ml、 CpG— ODN (5， - TCC ATG ACGTTCCTG ATGCT - 3' integrated DNA Technologies, Inc.から入手）を 3 g/ml、 MM46癌抗原（MM46乳癌細胞を HANK' S液（ナカライテスタ）中でホモジナイズし、そこから抽出された蛋白質:帝京大学医真菌研究センターにより提供された)を 50ng prote in/ml, ConA (和光純薬）を 0.25 /ζ ₈Ζπι1、それぞれ wellに添カ卩した。 24時間培養後、培養上清を回収し IFN— yの産生量を ELISAキット（OptEIA、 BD Pharmin gen)を用いて測定した（図 38)。比較のため、 Fr. Cを用いないで上記と同様の操作を行なった。各免疫機能調節物質は今回実験で用いた濃度にぉ、てほとんど IFN- γを誘導しな力つた。し力しながら、それらを Fr. C、つまり、フコィダン加水分解生成物 (オリゴ糖)と併用することで強い IFN— γ誘導能が得られた。したがって、フコイダン加水分解生成物およびそれから得られるオリゴ糖は、それを乳酸菌と併用した場合だけでなぐ他の免疫賦活素材と併用した場合でも相乗的にそれらの免疫賦活または免疫機能調節作用が高まることが明らかとなった。

実施例 10

ΝΚ活性増強効果 (In vivo)

C57BLZ6マウス（8週齢、雄、日本チャールズリバ一株式会社)を 4群に分けそれぞれフコィダン加水分解生成物単独（実施例 3記載の硫酸化糖画分 500mg/kg、図 39の「フコィダンオリゴ糖」）、乳酸菌単独（0.2mg/kg)、フフコィダン加水分解生成物 +乳酸菌（図 39の「乳酸菌 +フコィダンオリゴ糖」）をそれぞれ飲水中に混ぜ、自由摂取させた。コントロール群には水道水を摂取させた。摂取開始 1週間後、マウス力脾細胞を定法にしたがって分離し、 Yac-1細胞（5000cellsZl00 μ 1)をターゲットにして ΝΚ活性を測定した。 ΝΚ活性は Ε :Τ比 20:1、 40: 1の割合で 4時間反応させ、殺傷された Yac-1の数をフローサイトメトリーでカウントすることにより算出した（図 39)。フコィダンカゝら得られたフコィダンオリゴ糖を摂取することで NK活性が増強した。さらにフコィダンオリゴ糖と乳酸菌を併用することでより NK活性が高くなつた。したがって、フコィダン加水分解生成物と乳酸菌の組み合わせを摂取することで免疫機能が活性ィ匕することが in vivoでも確認できた。

実施例 11

[0121] フコィダン I,酴のみわせによるネ目

マウス肫細胞に針する TFN— V謙導作用

実施例 3と同様に調製した脾細胞 5 X 10⁶cellsZmlにフコィダン A (株式会社サゥスプロダクト）、フコィダン B (株式会社沖縛発酵ィ匕学)、フコィダン C (実施例 1で調製したもの）のそれぞれを、 1、 10、 100 gZmlとなるよう〖こ well〖こ添加した。フコイダン添加 30分後に乳酸菌（Lactobacillus pentosus ; FERM ABP— 10028) (死菌）を 0.1 gZmlずつ各 wellに添カ卩した。 24時間培養後、培養上清を回収し、 IFN— yの産生量を ELISAキット（OptEIA、 BD Pharmingen)を用いて測定した (図 40) 。また、フコィダン単独による効果を確認するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作を行った。

[0122] 3種のフコィダン各々を単独で用いた場合には、 IFN— y誘導能が認められた。さらに、その活性は、それらを乳酸菌と併用することで予想以上に強くなつた。したがつて、フコィダンは、乳酸菌と併用することで相乗的に脾細胞を活性化させ、生体の免疫機能の調節において非常に有用であることが明らかとなった。

Claims

請求の範囲

[1] フコィダン又はフコィダン加水分解生成物と免疫賦活素材とを含む組成物。

[2] 前記加水分解生成物が、フコィダンを 0. 1〜6. ONの酸で、 25〜100°C、 0. 25〜2

. 5時間加水分解して得られるものである、請求項 1に記載の組成物。

[3] 前記加水分解生成物が、フコィダンを 0. 5〜4. ONの酸で、 30〜90°C、 0. 5〜2. 0 時間加水分解して得られるものである、請求項 2に記載の組成物。

[4] 前記加水分解が塩酸又は硫酸で行なわれる、請求項 1〜3のいずれ力 1項に記載の組成物。

[5] 前記加水分解生成物がオリゴ糖である、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の組成物。

[6] 前記オリゴ糖力フコース、硫酸ィ匕フコース、ァセチルイ匕フコース、及びグルクロン酸力なる群力選択される少なくとも一種の糖で構成される二糖から五糖までのオリゴ糖である、請求項 5に記載の組成物。

[7] 前記オリゴ糖として、下記構造式 (I)、 (II)、 (III)、 (IV)、 (V)、 (VI)、 (VII)、 (VIII)、 (I

X)、（X)および (XI)で示される化合物から選択される少なくと

も一種を含む、請求項 6に記載の組成物。

[化 1]

[化 3]

[化 10]

[8] 前記免疫賦活素材が、乳酸菌、酵母、真菌類のような微生物;シィタケ、マイタケ、霊芝、ァガリタスなどのキノコ類; CpGモチーフを含む免疫原性オリゴデォキシヌクレオチド（CpG— ODN)、 PolyI : Cのような核酸由来物質；リポ多糖 (LPS)、 β—グルカン；海藻類；漢方薬； ΜΜ46癌抗原のような癌ワクチン；コンカナパリン A (ConA)； B RM (生物学的応答修飾剤)力も選択される少なくとも一種である、請求項 1〜7の、ずれ力 1項に記載の組成物。

[9] 前記免疫賦活素材が乳酸菌である、請求項 8に記載の組成物。

[10] 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の組成物を含む免疫機能調節剤。

[11] 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の組成物を添加した飲食品。

[12] 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の組成物を含む医薬組成物。

[13] 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の組成物を含む化粧品。