WO2007006797A1

WO2007006797A1 - Utilisation de la 4-(3,4-dichloro-phenyl)-1,2,3,4-tetrahydro-naphtalen-1-ylamine pour le traitement du cancer

Info

Publication number: WO2007006797A1
Application number: PCT/EP2006/064155
Authority: WO
Inventors: Frédéric Revah; Fabrice Balavoine; Marius Tuijnder; Robert Amson; Adam Telerman
Original assignee: ANCERIS; Cerenis SA
Current assignee: ANCERIS; Abionyx Pharma SA
Priority date: 2005-07-12
Filing date: 2006-07-12
Publication date: 2007-01-18
Anticipated expiration: 2008-01-12
Also published as: KR20080031748A; MA29729B1; JP2009501193A; NO20080722L; WO2007006797A8; ZA200800500B; TNSN08010A1; CA2614696A1; CN101222917A; RU2008101268A; EP1904045A1; FR2888506A1; IL188685A0; AU2006268657A1

Abstract

Utilisation de la 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-1-ylamine ou de toute combinaison de ses énantiomères ou d'un de ses énantiomères pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement du cancer, ainsi qu'au traitement et à la prévention des métastases.

Description

UTILISATIONDE LA 4-(3,4-DICHLORO-PHENYL)-l,2,3,4-TETRAHYDRO- NAPHTALEN-1-YLAMINE POUR LE TRAITEMENT DU CANCER

La présente invention est relative à l'utilisation de la 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine ou de l'un de ses énantiomères ou de toute combinaison de ses énantiomères pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées au traitement du cancer, ainsi qu'au traitement et à la prévention des métastases. Le nombre annuel de nouveaux cas de cancers a considérablement augmenté au cours des vingt dernières années. Le traitement des cancers est donc de fait un véritable problème de santé publique. Quel que soit le type de cancer, un traitement par chimiothérapie est généralement préconisé, ne serait-ce qu'en traitement adjuvant. Il existe donc un besoin permanent de développer de nouvelles molécules pour la chimiothérapie.

Les inventeurs ont étudié la 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4- tétrahydro-naphtalèn-1-ylamine et ses énantiomères ou toute combinaison de ses énantiomères, et ont montré que ces composés possèdent une activité antiproliférative sur de nombreux types de cellules tumorales, et qu'ils peuvent être utilisés dans la prévention ou le traitement des cancers.

La présente invention concerne donc l'utilisation de la 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine ou d'un de ses énantiomères choisi parmi ((1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine, ( 1 S,4R) 4-(3 ,4-dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine, (1R,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine, et (1R,4R) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine) ou de toute combinaison de ses énantiomères, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement du cancer, ainsi qu'au traitement et à la prévention des métastases Par traitement du cancer ou des métastases, on entend selon la présente invention essentiellement la capacité pour un composé de détruire sélectivement les cellules tumorales sans atteindre sensiblement les cellules saines, étant entendu que cette sélectivité peut être variable en fonction de la condition du patient et du type de cancer traité.

Comme on le constatera dans les exemples ci-après, les composés selon la présente invention possèdent une remarquable capacité de destruction des cellules tumorales. Les résultats se sont révélés particulièrement impressionnants quant à la capacité de ces produits à affecter des cellules tumorales issues d'un grand nombre de type de cancers différents..

Selon la présente invention, ledit cancer ou lesdites métastases sont issues d'un cancer choisi dans le groupe constitué par le cancer de la prostate, les ostéosarcomes, le cancer du poumon, le cancer du poumon non à petites cellules, le cancer du sein, le cancer de l'endomètre ou le cancer du côlon, la leucémie chronique ou aiguë, les tumeurs solides de l'enfant, les lymphomes lymphocitaires, le cancer du pancréas, le cancer de la peau, le mélanome cutané ou intraoculaire, le cancer de la tête et du cou, le cancer de l'utérus, le cancer de l'ovaire, les tumeurs gynécologiques, la maladie de Hodgkin, le cancer des os, le cancer du rectum, le cancer de la région anale, le cancer de l'estomac, le cancer de l'œsophage, le cancer de l'intestin grêle, le cancer du système endocrinien, les sarcomes des parties molles, le cancer de l'urètre, le cancer du pénis, le cancer de la vessie, le cancer du rein, le cancer de l'uretère, les tumeurs malignes pédiatriques et les tumeurs du système nerveux central, en particulier les tumeurs cérébrales. De manière préférée, ledit cancer ou lesdites métastases sont issues d'un cancer du sein. D'une autre manière préférée, ledit cancer est une leucémie.

En outre, les inventeurs ont montré que la 4-(3,4-dichloro-phényl)- 1,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine ou l'un de ses énantiomères ou de toute combinaison de ses énantiomères, administré(e) en combinaison avec au moins un alcaloïde, préférentiellement un alcaloïde de vinca, par exemple la vincristine ou la vinblastine, présente une synergie de l'activité cytotoxique spécifique à rencontre des cellules tumorales.

Un autre aspect de l'invention concerne donc l'utilisation de la 4-(3,4- dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine ou de l'un de ses énantiomères ou de toute combinaison de ses énantiomères et d'au moins un alcaloïde pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement du cancer, ainsi qu'au traitement et à la prévention des métastases. De manière préférée, l'alcaloïde est un alcaloïde de vinca. De manière plus préférée, l'alcaloïde de vinca est choisi dans le groupe constitué par : la vinblastine, la vincristine, la vindésine, et la vinorelbine, de préférence la vincristine et/ou la vinblastine.

Par alcaloïde de vinca on entend désigner selon la présente invention les alcaloïdes de la pervenche, Vinca rosea, et leurs dérivés obtenus par modification chimique. Ils ont pour cible la tubuline du fuseau achromatique de la mitose dont ils inhibent la polymérisation. Cette tubuline constituant aussi les fibres nerveuses, les alcaloïdes de vinca ont une toxicité nerveuse, surtout sensitive, et induisent une tendance dépressive.

Un autre aspect de l'invention concerne des produits comprenant de la

4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine ou l'un de ses énantiomères ou toute combinaison de ses énantiomères et au moins un alcaloïde, en tant que produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie anti-cancéreuse.

De manière préférée, l'alcaloïde choisi est un alcaloïde de vinca. De manière plus préférée, l'alcaloïde de vinca est choisi dans le groupe constitué par : la vinblastine, la vincristine, la vindésine, et la vinorelbine, de préférence la vincristine et/ou la vinblastine.

Les compositions pharmaceutiques et/ou les produits de combinaison selon la présente invention peuvent être administrés par voie orale, intraveineuse, entérale, parentérale, intramusculaire, intranasale, sous-cutanée sublinguale ou topique. De façon générale, on préférera utiliser les voies orales ou par défaut injectables, notamment pour le traitement des tumeurs. De manière remarquable les inventeurs ont démontré que les produits de la présente invention peuvent être efficaces par voie orale, à la différence de nombreux produits anti-tumoraux aujourd'hui disponibles pour les patients (Goodman & Gilman's Pharmacological Basis of Therapeutics, Mc Graw HiIl Editor).

Les dosages journaliers devront tenir compte de l'état du malade mais également du cancer traité, de son stade et de sa progression.

Les exemples ci-dessous ne sont mentionnés qu'à titre illustratif et ne peuvent pas être considérés comme limitant l'enseignement de la présente description.

LEGENDE DES FIGURES

Figure 1 : Etude de l'effet synergique de combinaisons de cis 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et de vincristine sur l'inhibition de la prolifération de cellules de type leucémiques U937

Figure 2 : Etude de l'effet synergique de combinaisons de cis 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et de vinblastine sur l'inhibition de la prolifération de cellules de type leucémiques U937

Figure 3 : Etude de l'effet synergique de combinaisons de cis 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et de vincristine sur l'inhibition de la prolifération de cellules de cancer du sein de type MDA-MB231

Figure 4 : Etude de l'effet synergique de combinaisons de cis 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et de vinblastine sur l'inhibition de la prolifération de cellules de cancer du sein de type MDA-MB231 Figure 5 : Evolution au cours du traitement du volume médian des tumeurs implantées chez des souris SCID après une administration chronique de la Cis 4- (3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine par voie intrapéritonéale

Figure 6 : Evolution au cours du traitement du volume médian des tumeurs implantées chez des souris SCID après une administration chronique de la (1S,4S) 4-(3 ,4-dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine par voie intrapéritonéale

EXEMPLES :

Par « Cis 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine », on entend le mélange racémique des deux énantiomères (1S,4S) 4-(3,4- dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et (1R,4R) 4-(3,4- dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine.

Par «Trans 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine », on entend le mélange racémique des deux énantiomères (1S,4R) 4- (3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et (1R,4S) 4-(3,4- dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine.

Par « Cis/Trans 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine », on entend le mélange racémique des quatre susdits énantiomères.

EXEMPLES 1 à 3 :

Dans ces exemples les inventeurs démontrent de manière inattendue l'effet antitumoral de la 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine et de ses énantiomères ou de toute combinaison de ses énantiomères sur des lignées cellulaires tumorales d'origine diverses.

Exemple 1 : Détermination des CI₅₀ sur des cellules de type leucémiques U937

La méthode décrite ci-après a été appliquée pour déterminer les valeurs de CI₅₀ des composés suivants sur les cellules U937:

• Cis/Trans 4-(3 ,4-dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine

• Cis 4-(3 ,4-dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine • Trans 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine

• (IS, 4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine

• (IS, 4R) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine

• (IR, 4R) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine

• (IR, 4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine

Les valeurs des CI₅₀ sont résumées dans le tableau ci-dessous (Tableau 1)

Tableau 1

Ces résultats montrent que la 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4- tétrahydro-naphtalèn-1-ylamine, des combinaisons de ses énantiomères et tous ses énantiomères possèdent la propriété d'inhiber la prolifération des cellules de type leucémiques U937 et par conséquent une activité antitumorale. Les activités antitumorales de la 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine, des combinaisons de ses énantiomères et tous ses énantiomères sont équivalentes dans la mesure où les valeurs des CI50 obtenues sont toutes comprises entre 3 μM et 12 μM. En conséquence, toute combinaison des énantiomères de la 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine possède la propriété d'inhiber la prolifération des cellules de type leucémiques U937 et donc une activité antitumorale Exemple 2 : Détermination des CI₅₀ sur des cellules du cancer du sein MDA- MB231

La méthode décrite ci-après a été appliquée pour déterminer les valeurs de CI₅₀ des composés suivants sur les cellules MDA-MB231 :

• Cis 4-(3 ,4-dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine

• Trans 4-(3 ,4-dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine

Les valeurs des CI₅₀ sont résumées dans le tableau ci-dessous (Tableau 2)

Tableau 2

Ces résultats montrent que la 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4- tétrahydro-naphtalèn-1 -ylamine et des combinaisons de ses énantiomères possèdent la propriété d'inhiber la prolifération des cellules du cancer du sein de type MDA-MB231 et par conséquent une activité antitumorale. Les activités antitumorales de la 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine et des combinaisons de ses énantiomères sont équivalents dans la mesure où les valeurs des CI₅₀ obtenues sont toutes comprises entre 4 μM et 7 μM. En conséquence, tous les énantiomères de la 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4- tétrahydro-naphtalèn-1-ylamine et même toute combinaison de ces énantiomères possèdent la propriété d'inhiber la prolifération des cellules du cancer du sein de type MDA-MB231 et donc une activité antitumorale

Exemple 3 : Détermination des CI₅₀ de la (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)- 1,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine sur 30 lignées cellulaires tumorales

La méthode décrite ci-après a été appliquée pour déterminer les valeurs de CI₅₀ de la (lS,4S)-4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamin sur 30 lignées cellulaires dérivées de cancer du sein, du colon, du poumon, de l'ovaire, de la prostate, du pancréas, de la peau, du cerveau et du sang.

Le tableau 3 regroupe les valeurs de CI₅₀ de la (lS,4S)-4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine sur 30 lignées tumorales différentes issues de tumeurs hématologiques et solides très variées.

Dans cet exemple les inventeurs démontrent de manière inattendue que la (1 S-4S)-4-(3 ,4-dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine possède un large spectre d'action anti-tumorale et est capable d'inhiber la prolifération de cellules tumorales issues de l'ensemble des cancers testés

Tableau 3

EXEMPLES 4 à 9 :

Dans ces exemples les inventeurs démontrent de manière inattendue l'effet antitumoral synergique de la 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro- naphtalèn-1-ylamine et de ses énantiomères avec des alcaloides de Vinca.

Exemple 4 : Etude de l'effet synergique de combinaisons de cis 4-(3,4- dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et de vincristine sur l'inhibition de la prolifération de cellules de type leucémiques U937

La méthode décrite ci-après pour évaluer un effet synergique de combinaisons de deux produits sur l'inhibition de la prolifération de cellules de type leucémiques U937 a été appliquée avec les composés suivants:

• Cis 4-(3 ,4-dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine

• Vincristine

Les 6 concentrations finales choisies pour tester la cis 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine ont été 25, 13, 6,3, 3,1 et 1,6 micromolaire (μM). Les 6 concentrations finales choisies pour tester la vincristine ont été 4000, 1000, 250, 63, et 16 picomolaire (pM).

L'incubation des cellules U937 avec différentes combinaisons de concentrations de cis 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine et de vincristine révèle l'existence d'une synergie entre les effets antiprolifératifs de deux composés.

Les résultats sont présentés dans la figure 1.

L'activité antiproliférative (pourcentage d'inhibition de la prolifération de 73%) d'une combinaison de vincristine (250 pM) et de cis 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine (3.1 μM) est nettement supérieure à l'effet de l'agent seul le plus actif (21% d'inhibition pour la vincristine à 250 pM). De plus, l'effet antiprolifératif observé avec cette combinaison ne relève pas d'une simple additivité des effets séparés des deux produits compte tenu de la valeur positive (+49) calculée pour l'excédent par rapport à l'additivité « Bliss ». En conclusion il existe un effet synergique de cette combinaison de cis 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et de vincristine.

Exemple 5 : Etude de l'effet synergique de combinaisons de cis 4-(3,4- dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et de vinblastine sur l'inhibition de la prolifération de cellules de type leucémiques U937

La méthode décrite ci-après pour évaluer un effet synergique de combinaisons de deux produits sur l'inhibition de la prolifération de cellules de type leucémiques U937 a été appliquée avec les composés suivants: • Cis 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine • Vinblastine

Les 6 concentrations finales choisies pour tester la cis 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine ont été 25, 13, 6,3, 3,1 et 1,6 micromolaire (μM). Les 6 concentrations finales choisies pour tester la vinblastine ont été 4000, 1000, 250, 63, et 16 picomolaire (pM).

L'incubation des cellules U937 avec différentes combinaisons de concentrations de cis 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine et de vinblastine révèle l'existence d'une synergie entre les effets antiprolifératifs de deux composés. Les résultats sont présentés dans la figure 2.

L'activité antiproliférative (pourcentage d'inhibition de la prolifération de 54%) d'une combinaison de vinblastine (250 pM) et de cis 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine (3.1 μM) est nettement supérieure à l'effet de l'agent seul le plus actif (19% d'inhibition pour la vinblastine à 250 pM). De plus, l'effet antiprolifératif observé avec cette combinaison ne relève pas d'une simple additivité des effets séparés des deux produits compte tenu de la valeur positive (+31) calculée pour l'excédent par rapport à l'additivité « Bliss ». En conclusion il existe un effet synergique de cette combinaison de cis 4-(3,4- dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et de vinblastine. Exemple 6 : Etude de l'effet synergique de combinaisons de (1S,4S) 4-(3,4- dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et de vincristine sur l'inhibition de la prolifération de cellules de type leucémiques U937 La méthode décrite ci-après pour évaluer un effet synergique de combinaisons de deux produits sur l'inhibition de la prolifération de cellules de type leucémiques U937 a été appliquée avec les composés suivants:

• ( 1 S,4S) 4-(3 ,4-dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine

• Vincristine L'incubation des cellules U937 avec différentes combinaisons de concentrations de (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine et de vincristine révèle l'existence d'une synergie entre les effets antiprolifératifs de deux composés. L'effet antiprolifératif observé d'une combinaison de (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine (3.1 μM) et de vincristine ne relève pas d'une simple additivité des effets séparés des deux produits compte tenu de la valeur positive (+8) calculée pour l'excédent par rapport à l'additivité « Bliss ». En conclusion il existe un effet synergique de cette combinaison de (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4- tétrahydro-naphtalèn-1 -ylamine et de vincristine.

Exemple 7 : Etude de l'effet synergique de combinaisons de (1S,4S) 4-(3,4- dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et de vinblastine sur l'inhibition de la prolifération de cellules de type leucémiques U937

• Vinblastine L'incubation des cellules U937 avec différentes combinaisons de concentrations de (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine et de vinblastine révèle l'existence d'une synergie entre les effets antiprolifératifs de deux composés. L'effet antiprolifératif observé d'une combinaison de (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine (3.1 μM) et de vinblastine ne relève pas d'une simple additivité des effets séparés des deux produits compte tenu de la valeur positive (+5) calculée pour l'excédent par rapport à l'additivité « Bliss ». En conclusion il existe un effet synergique de cette combinaison de (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4- tétrahydro-naphtalèn-1-ylamine et de vinblastine.

Exemple 8 : Etude de l'effet synergique de combinaisons de cis 4-(3,4- dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et de vincristine sur l'inhibition de la prolifération de cellules du cancer du sein de type MDA- MB231

La méthode décrite ci-après pour évaluer un effet synergique de combinaisons de deux produits sur l'inhibition de la prolifération de cellules du cancer du sein de type MDA-MB231 a été appliquée avec les composés suivants: • Cis 4-(3 ,4-dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine • Vincristine

Les 6 concentrations finales choisies pour tester la cis 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine ont été 25, 13, 6,3, 3,1 et 1,6 micromolaire (μM). Les 6 concentrations finales choisies pour tester la vincristine ont été 4000, 1000, 250, 63, et 16 picomolaire (pM). L'incubation des cellules MDA-MB231 avec différentes combinaisons de concentrations de cis 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine et de vincristine révèle l'existence d'une synergie entre les effets antiprolifératifs de deux composés.

Les résultats sont présentés dans la figure 3. L'activité antiproliférative (pourcentage d'inhibition de la prolifération de 59%) d'une combinaison de vincristine (1000 pM) et de cis 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine (3.1 μM) est nettement supérieure à l'effet de l'agent seul le plus actif (25% d'inhibition pour la vincristine à 1000 pM). De plus, l'effet antiprolifératif observé avec cette combinaison ne relève pas d'une simple additivité des effets séparés des deux produits compte tenu de la valeur positive (+28) calculée pour l'excédent par rapport à l'additivité « Bliss ». En conclusion il existe un effet synergique de cette combinaison de cis 4-(3,4- dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et de vincristine.

Exemple 9 : Etude de l'effet synergique de combinaisons de cis 4-(3,4- dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et de vinblastine sur l'inhibition de la prolifération de cellules du cancer du sein de type MDA- MB231 La méthode décrite ci-après pour évaluer un effet synergique de combinaisons de deux produits sur l'inhibition de la prolifération de cellules de type leucémiques U937 a été appliquée avec les composés suivants:

• Cis 4-(3 ,4-dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine

• Vinblastine Les 6 concentrations finales choisies pour tester la cis 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine ont été 25, 13, 6,3, 3,1 et 1,6 micromolaire (μM). Les 6 concentrations finales choisies pour tester la vinblastine ont été 4000, 1000, 250, 63, et 16 picomolaire (pM).

L'incubation des cellules MDA-MB231 avec différentes combinaisons de concentrations de cis 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine et de vinblastine révèle l'existence d'une synergie entre les effets antiprolifératifs de deux composés.

Les résultats sont présentés dans la figure 4. L'activité antiproliférative (pourcentage d'inhibition de la prolifération de 61%) d'une combinaison de vinblastine (1000 pM) et de cis 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine (1,6 μM) est nettement supérieure à l'effet de l'agent seul le plus actif (33% d'inhibition pour la vinblastine à 1000 pM). De plus, l'effet antiprolifératif observé avec cette combinaison ne relève pas d'une simple additivité des effets séparés des deux produits compte tenu de la valeur positive (+27) calculée pour l'excédent par rapport à l'additivité « Bliss ». En conclusion il existe un effet synergique de cette combinaison de cis 4-(3,4- dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et de vinblastine. De même, l'activité antiproliférative (pourcentage d'inhibition de la prolifération de 87%) d'une combinaison de vinblastine (1000 pM) et de cis 4- (3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine (3.1 μM) est nettement supérieure à l'effet de l'agent seul le plus actif (33% d'inhibition pour la vinblastine à 1000 pM). De plus, l'effet antiprolifératif observé avec cette combinaison ne relève pas d'une simple additivité des effets séparés des deux produits compte tenu de la valeur positive (+47) calculée pour l'excédent par rapport à l'additivité « Bliss ». En conclusion il existe un effet synergique de cette combinaison de cis 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine et de vinblastine.

EXEMPLES 10 et 11:

Dans ces exemples les inventeurs démontrent de manière inattendue l'effet antitumoral de la 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine et de ses énantiomères administré chez l'animal portant une tumeur.

Exemple 10 : Etude de l'effet antitumoral chez la souris de la cis 4-(3,4- dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine après une administration chronique par voie intrapέritonέale

Dans cet exemple les inventeurs ont testé l'effet antitumoral chez la souris de la Cis 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine, en appliquant la méthode décrite ci-après. De manière à tester cet effet les inventeurs ont administré la Cis 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro- naphtalèn-1-ylamine à des souris auxquelles avaient été préalablement greffées des cellules tumorales. Ils ont comparé la croissance des tumeurs chez des animaux traités avec la Cis 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn- 1-ylamine avec celle de tumeurs chez des animaux contrôles non traités ou traités uniquement avec le véhicule de la substance test. De manière remarquable les inventeurs ont pu montrer que l'administration par voie intrapéritonéale de Cis 4- (3 ,4-dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine ralentissait significativement la croissance tumorale chez les souris ainsi traitées.

Les inventeurs ont analysé la taille moyenne des tumeurs dans des souris portant une tumeur sous cutanée et traitées avec la Cis 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et l'ont comparée à celle des souris « contrôle » portant ces tumeurs et traitées avec le véhicule de la substance test uniquement.

La figure 5 représente le volume moyen des tumeurs sous cutanées portées par des souris (en mm3) traitées par la Cis 4-(3,4-dichloro-phényl)- 1, 2,3, 4-tétrahydro-naphtalèn-l -ylamine en fonction du temps écoulé (en jours) depuis le premier jour de traitement (50 mg/kg par voie intrapéritonéale), comparé au volume moyen des tumeurs portées par des souris traitées par du véhicule.

Le volume des tumeurs des souris traitées avec le composé de l'invention est nettement inférieur à celui des souris non traitées, ce qui révèle un effet anti-tumoral manifeste de la Cis 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro- naphtalèn- 1 -ylamine.

Exemple 11 : Etude de l'effet antitumoral chez la souris de la (1S,4S) 4-(3,4- dichloro-phcnyl)-l,2,3,4-tctrahydro-naphtalcn-l -ylamine après une administration chronique par voie intrapéritonéale

Dans cet exemple les inventeurs ont testé l'effet antitumoral chez la souris de la (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine, en appliquant la méthode décrite ci-après. De manière à tester cet effet les inventeurs ont administré la (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4- tétrahydro-naphtalèn-1 -ylamine à des souris auxquelles avaient été préalablement greffées des cellules tumorales. Ils ont comparé la croissance des tumeurs chez des animaux traités avec la (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro- naphtalèn-1 -ylamine avec celle de tumeurs chez des animaux contrôles non traités ou traités uniquement avec le véhicule de la substance test. De manière remarquable les inventeurs ont pu montrer que l'administration par voie intrapéritonéale de (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine ralentissait significativement la croissance tumorale chez les souris ainsi traitées.

Les inventeurs ont analysé la taille moyenne des tumeurs dans des souris portant une tumeur sous cutanée et traitées avec la (1S,4S) 4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et l'ont comparée à celle des souris « contrôle » portant ces tumeurs et traitées avec le véhicule de la substance test uniquement.

La figure 6 représente le volume moyen des tumeurs sous cutanées portées par des souris (en mm3) traitées par la (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)- 1, 2,3, 4-tétrahydro-naphtalèn-l -ylamine en fonction du temps écoulé (en jours) depuis le premier jour de traitement (15 mg/kg deux fois par jour par voie intrapéritonéale), comparé au volume moyen des tumeurs portées par des souris traitées par du véhicule.

Le volume des tumeurs des souris traitées avec le composé de l'invention est nettement inférieur à celui des souris non traitées, ce qui révèle un effet anti-tumoral manifeste de la (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4- tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine. EXEMPLES 12 et 13:

Dans ces exemples les inventeurs démontrent de manière remarquable que la 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine et ses énantiomères possèdent les propriétés propres à leur utilisation thérapeutique par voie orale.

Exemple 12 : Etude des paramètres de pharmacocinέtique (demi-vie, biodisponibilitέ) de la (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro- naphtalèn-1-ylamine chez la souris Des études de pharmacocinétique ont été réalisées avec la (lS,4S)-4-

(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine chez le rongeur (souris CDl). Ce composé a été administré aux animaux par voie intraveineuse à la dose de 1 mg/kg et par voie orale aux doses 5, 10 et 20 mg/kg. Les taux circulants de (1 S,4S)-4-(3 ,4-dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 - ylamine dans le sang des souris ont été mesurés par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse, à différents temps compris entre 5 et 480 minutes après l'administration par voie intraveineuse et entre 15 et 1440 minutes après l'administration par voie orale. Ces mesures ont permis de montrer des doses circulantes significatives de (lS,4S)-4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4- tétrahydro-naphtalèn-1 -ylamine chez es animaux traités.

Les résultats des paramètres de pharmacocinétiques de la (1S,4S) 4- (3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine chez la souris sont rapportés dans les Tableau 4a et 4b ci-dessous.

Tableau 4a

Voie Sujet Dose Tl/2 Cl AUCaU AUCEVG d'administration (mg/kg) (min) (inL/inin/kg) (min*ng/mL) (min*ng/mL)

L V. Souris 1 161 35 25057 28302 Tableau 4b

Voie Sujet Dose Tmax Cmax Tl/2 AUCaU AUCEVG d'administration (mg/kg) (min) (ng/mL) (min) (min*ng/mL) (min*ng/mL) per os Souris 5 120 49 379 30070 32255 per os Souris 10 120 131 275 65769 67755 per os Souris 20 120 254 316 151002 157847

Avec :

• T 1/2 = élimination à la demi- vie

• AUCaIl = aire sous la courbe à partir de l'instant de l'administration (1=0) jusqu'au au temps de la dernière observation

• AUCESfF = zone sous la courbe à partir l'instant de l'administration (1=0) extrapolé à l'infini.

• Tmax = Temps de la concentration observée maximum

• Cmax = Concentration correspondant au Tmax

• Cl = Clairance totale

De plus, le rapport des aires sous la courbe (AUC) obtenues lors de l'administration par voie orale et par voie intraveineuse de (lS,4S)-4-(3,4- dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine permet de mesure un facteur de biodisponibilité, dont la valeur selon les concentrations est comprise entre 24 % et 30 %. Ces expériences démontrent que lorsque la (lS,4S)-4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine est administrée par voie orale, des doses importantes de ce composé sont retrouvées dans la circulation, avec un facteur de biodisponibilité significatif, ce qui démontre qu'il est donc bien adapté à un traitement par voie orale. Exemple 13 : Etude de l'effet antitumoral chez la souris de la (1S,4S) 4-(3,4- dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine après une administration chronique par voie orale

Dans cet exemple les inventeurs ont testé l'effet antitumoral chez la souris de la (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine. En appliquant la méthode décrite ci-après. De manière à tester cet effet les inventeurs ont administré la (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4- tétrahydro-naphtalèn-1-ylamine à des souris auxquelles avaient été préalablement greffées des cellules tumorales. Ils ont comparé la croissance des tumeurs chez des animaux traités avec la (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro- naphtalèn-1-ylamine avec celle de tumeurs chez des animaux contrôles non traités ou traités uniquement avec le véhicule de la substance test. De manière remarquable les inventeurs ont pu montrer que l'administration par voie orale de ( 1 S,4S) 4-(3 ,4-dichloro-phényl)- 1 ,2,3 ,4-tétrahydro-naphtalèn- 1 -ylamine ralentissait significativement la croissance tumorale chez les souris ainsi traitées.

Le tableau 5 rapporte les volumes médians (en mm³) des tumeurs sous cutanées portées par les souris SCID traitées par la (lS-4S)-4-(3,4-dichloro- phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine en fonction du temps écoulé (en jours) depuis le premier jour du traitement (administration de 80 mg/kg par jour et par voie orale) et les volumes médians des tumeurs portées par les souris traitée par du véhicule aux mêmes jours. Les jours Jl 5 et Jl 8 correspondent respectivement aux

jour après le premier jour de traitement.

Le tableau 5 ci-dessous présente les volumes médians des tumeurs implantées chez des souris SCID après une administration chronique de la (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine par voie orale Tableau 5

Le volume médian des tumeurs portées par les souris traitées avec le composé de l'invention est significativement inférieur (de près de la moitié) au volume médian des tumeurs portées par les souris traitées par du véhicule.

Par conséquent, la (lS,4S)-4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro- naphtalèn-1 -ylamine administrée par voie orale possède un effet anti-tumoral chez l'animal.

Exemple 14 : Etude de la pénétration cérébrale de la (1S,4S) 4-(3,4-dichloro- phcnyl)-l,2,3,4-tctrahydro-naphtalcn-l -ylamine chez la souris

L'activité des anti-tumoraux sur les tumeurs du système nerveux est souvent limitée par leur incapacité à traverser la barrière hématoencéphalique et donc à pénétrer dans le cerveau. Comme indiqué dans le Tableau 3, la (lS,4S)-4-(3,4-dichloro-phényl)-

1, 2,3, 4-tétrahydro-naphtalèn-l -ylamine est active in vitro sur des lignées tumorales dérivées de glioblastomes. De manière intéressante, les expérimentations rapportées ci-dessous démontrent que la (lS,4S)-4-(3,4- dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine possède une capacité à traverser la barrière hématoencéphalique de manière significative, ce qui représente un avantage important de ce composé pour le traitement des tumeurs cérébrales. La (lS,4S)-4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l- ylamine a été injectée par voie intraveineuse à un groupe de souris CDl, à raison de 1 mg/kg. Les niveaux de (lS,4S)-4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro- naphtalèn-1-ylamine dans le sang et le cerveau ont été analysés par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse.

Les résultats de cette étude chez la souris de la pénétration cérébrale de la (1S,4S) 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine sont rapportés dans le Tableau 6 ci-dessous.

Tableau 6

TEMPS (minutes) CERVEAU PLASMA RAPPORT

CONCENTRATION CONCENTRATION CERVEAU/PLASMA (ng/g cerveau) (ng/mL)

21 96 47 2

34 217 67 3

50 275 34 8

65 149 32 5

120 486 37 13

360 295 15 20

480 155 7 23

600 209 11 19

Ces expérimentations montrent que les concentrations de (lS,4S)-4-

(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro-naphtalèn-l-ylamine dans le cerveau sont plus importantes que dans le plasma et que le rapport de concentration de ce composé entre le cerveau et le sang augmente avec le temps (sur l'intervalle analysé) montrant ainsi la capacité d'accumulation cérébrale de ce composé.

Par conséquent, la (lS,4S)-4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro- naphtalèn-1-ylamine présente un intérêt majeur pour le traitement des tumeurs cérébrales. MATERIELS ET METHODES

I. Procédure pour déterminer une CI^n sur des cellules de type leucémiques U937 Le composé à tester est mis en solution dans du DMSO (100%) à la concentration 1.10^"2 M (solution mère) puis 8 échantillons de 8 concentrations différentes sont préparés par dilution successive avec le milieu complet de culture cellulaire (RPMI 1640 Cambrex + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 40μg/ml de Gentamycine). Pour chaque échantillon, le volume de dilution est ajusté de façon à obtenir une concentration égale à deux fois la concentration finale C_x choisie. A titre d'exemple, 1.10^ M, 5.10^"5 M, 2,5.10^"5 M, 1,3.10^"5 M, 6,3.10^"6 M, 3,1.10^"6 M, 1,6.10^"6 M et 7,8.10^"7 M est une gamme standard de 8 concentrations finales. Parallèlement, 8 échantillons contrôles sont préparés par dilution successive d'une solution de DMSO (100 %) avec le même milieu de culture cellulaire (RPMI1640 Cambrex + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 40μg/ml de Gentamycine), les volumes de dilution choisis étant strictement identiques à ceux utilisés pour la préparation des échantillons du composé à tester.

Dans une plaque de 96 puits blanche, non transparente (fluoronunc 96F Nunclon Delta), 100 μL d'une suspension de cellules U937 à la concentration de 2,5 10⁴ cellules/ml dans un milieu RPMI1640 Cambrex + 10% FBS + 1% L- Glutamine + 40μg/ml de Gentamycine sont déposés dans chaque puits soit 2500 cellules par puits. 100 μL d'un échantillon à la concentration 2 fois C_x sont ajoutés (un échantillon par puits) et le milieu est homogénéisé. Après 144h d'incubation à 37°C sous une atmosphère (CO₂ 5%, humidité 90-95%), la quantification de la viabilité des cellules en culture s'effectue par mesure des niveaux d'ATP à l'aide du test d'analyse luminescente CellTiter-Glo™ fourni par Promega Corporation en suivant les instructions du fournisseur. La luminescence dans chaque puits est mesurée en utilisant un compteur, VICTOR₂ 1420 (Wallac, PerkinElmer, Courtaboeuf, France). Pour chaque concentration finale C_x du composé à tester, le pourcentage d'inhibition de la prolifération cellulaire (%Inh. (C_x)) est obtenu en appliquant la formule suivante :

[Lum. (éch. Composé Cx) - Lum. (Blanc)]

% lnh.(Cx) = 100 x [ 1 ]

[Lum. (éch. Contrôle Cx) - Lum. (Blanc)] dans laquelle

• Lum. (éch. Composé C_x) = moyenne des mesures de luminescence de trois puits de l'échantillon à tester à la concentration finale C_x.

• Lum. (éch. Contrôle C_x) = moyenne des mesures de luminescence de trois puits de l'échantillon contrôle correspondant • Lum. (blanc) = moyenne des mesures de luminescence de huit puits comprenant uniquement 200 μL de milieu de culture cellulaire (RPMI 1640 Cambrex + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 40μg/ml de Gentamycine)

La CI₅₀ est la concentration du composé nécessaire pour obtenir une inhibition de 50 % de la prolifération cellulaire ; ces valeurs sont calculées avec le logiciel XLfit 3 (ID Business Solutions Ltd., UK) à partir de courbes semi- logarithmiques.

II. Procédure pour déterminer une CI^n sur des cellules du cancer du sein MDA-MB231

Le composé à tester est mis en solution dans du DMSO (100%) à la concentration 1.10^"2 M (solution mère) puis 8 échantillons de 8 concentrations différentes sont préparés par dilution successive avec le milieu complet de culture cellulaire (E-MEM Cambrex + 10% FBS, + 1% d'acides aminés non essentiels + 1% Napyruvate + 1% L-Glutamine + 40μg/ml de Gentamycine). Pour chaque échantillon, le volume de dilution est ajusté de façon à obtenir une concentration égale à deux fois la concentration finale C_x choisie. A titre d'exemple, 1.1 O^ M, 5.10^"5 M, 2,5.10^~5 M, 1,3.10^"5 M, 6,3.10^"6 M, 3,1.10^"6 M, l,6.10^~6 M et 7,8.10^~7 M est une gamme standard de 8 concentrations finales. Parallèlement, 8 échantillons contrôles sont préparés par dilution d'une solution de DMSO (100 %) avec même le milieu de culture cellulaire (E-MEM Cambrex + 10% FBS, + 1% d'acides aminés non essentiels + 1% Napyruvate + 1% L-Glutamine + 40μg/ml de Gentamycine), les volumes de dilution choisis étant strictement identiques à ceux utilisés pour la préparation des échantillons du composé à tester.

Dans une plaque de 96 puits blanche, non transparente (fluoronunc 96F Nunclon Delta), 100 μL d'une suspension de cellules MDA-MB231 à la concentration de 1.25 10⁴ cellules/ml dans un milieu E-MEM Cambrex + 10% FBS, + 1% d'acides aminés non essentiels + 1% Napyruvate + 1% L-Glutamine + 40μg/ml de Gentamycine sont déposés dans chaque puits soit 2500 cellules par puits. 100 μL d'un échantillon à la concentration 2 fois C_x sont ajoutés (un échantillon par puits) et le milieu est homogénéisé. Après 144h d'incubation à 37°C sous une atmosphère (CO₂ 5%, humidité 90-95%), la quantification de la viabilité des cellules en culture s'effectue par mesure des niveaux d'ATP à l'aide du test d'analyse luminescente CellTiter-Glo™ fourni par Promega Corporation en suivant les instructions du fournisseur. La luminescence dans chaque puits est mesurée utilisant un compteur, VICTOR₂ 1420 (Wallac, PerkinElmer, Courtaboeuf, France).

Pour chaque concentration finale C_x du composé à tester, le pourcentage d'inhibition de la prolifération cellulaire (%Inh. (C_x)) est obtenu en appliquant la formule suivante :

[Lum. (éch. Composé Cx) - Lum. (Blanc)]

% lnh.(Cx) = 100 x [ 1 ]

[Lum. (éch. Contrôle Cx) - Lum. (Blanc)] dans laquelle

• Lum. (éch. Composé C_x) = moyenne des mesures de luminescence de trois puits de l'échantillon à tester à la concentration finale C_x. • Lum. (éch. Contrôle C_x) = moyenne des mesures de luminescence de trois puits de l'échantillon contrôle correspondant

• Lum. (blanc) = moyenne des mesures de luminescence de huit puits comprenant uniquement 200 μL de milieu de culture cellulaire (E-MEM Cambrex + 10% FBS, + 1% d'acides aminés non essentiels + 1%

Napyruvate + 1% L-Glutamine + 40μg/ml de Gentamycine)

III. Méthode pour évaluer un effet synergique de combinaisons de deux produits A et B sur l'inhibition de la prolifération de cellules de type leucémiques U937

Chaque produit est mis en solution dans du DMSO (100%) à la concentration 1.10^"2 M (solution mère) puis, pour chaque produit, 6 échantillons de 6 concentrations différentes sont préparés par dilution successive avec le milieu complet de culture cellulaire (RPMI 1640 Cambrex + 10% FBS + 1% L- Glutamine + 40μg/ml de Gentamycine). Pour chaque échantillon, le volume de dilution est ajusté de façon à obtenir une concentration égale à quatre fois la concentration finale choisie.

Une suspension cellulaire à 2,5.10⁴ cellules/ml est préparée dans du milieu complet, et 36xl00μl de cette solution (soit 2500 cellules/puits) sont distribués dans 36 puits d'une plaque 96 puits, blanche et non transparente (fluoronunc 96F Nunclon Delta). Dans chaque puits contenant lOOμl de suspension cellulaire, sont ajoutés 50 μL d'un échantillon de produit A concentrée 4 fois et 50 μL d'un échantillon de produit B concentrée 4 fois pour obtenir un volume final de 200 μL. Chaque échantillon du produit A (6 concentrations Al, A2, A3, A4, A5, A6) est combiné avec chaque échantillon de produit B (6 concentrations Bl, B2, B3, B4, B5, B6). Les concentrations A6 et B6 correspondent à une concentration nulle de produit A et de produit B respectivement.

La combinaison A6/B6 correspond donc à un puits sans drogue ni DMSO, qui sert de référence de croissance cellulaire.

Le contenu des 36 puits peut être schématiquement représenté de la façon suivante :

Après 144h d'incubation à 37°C sous une atmosphère (CO₂ 5%, humidité 90-95%), la quantification de la viabilité des cellules en culture s'effectue par mesure des niveaux d'ATP à l'aide du test d'analyse luminescente CellTiter-Glo™ fourni par Promega Corporation en suivant les instructions du fournisseur. La luminescence dans chaque puits est mesurée en utilisant un compteur, VICTOR₂ 1420 (Wallac, PerkinElmer, Courtaboeuf, France).

Pour chaque combinaison An/Bm, le pourcentage d'inhibition de la prolifération cellulaire (%Inh. (An/Bm)) est obtenu en appliquant la formule suivante :

[Lum. M(An/Bm) - Lum.M(Blanc)]

% lnh.(An/Bm) = 100 x [ "l -

[Lum. M(A6/B6) - Lum. M(Blanc)] dans laquelle

• Lum.M (An/Bm) = moyenne des mesures de luminescence de deux puits comprenant la combinaison des échantillons An et Bm • Lum.M (A6/B6) = moyenne des mesures de luminescence de deux puits comprenant la combinaison des échantillons A6 et B6

• Lum. (blanc) = moyenne des mesures de luminescence de 6 puits comprenant uniquement 200 μL de milieu de culture cellulaire (RPMI 1640 Cambrex + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 40μg/ml de

Gentamycine)

Pour chaque combinaison An/Bm, l'excédent par rapport à l'agent seul le plus actif (E_aslpa (An/Bm)) est calculé en appliquant les formules suivantes :

• Si %lnh. (An/B6) > %lnh. (A6/Bm) alors E_as,_pa (An/Bm) = %lnh. (An/Bm)- %lnh. (An/B6)

• Si %lnh. (An/B6) < %lnh. (A6/Bm) alors E_as,_pa (An/Bm) = %lnh. (An/Bm)- %lnh. (A6/Bm)

Enfin pour différencier l'addition des effets de la synergie, le pourcentage d'inhibition pour chaque combinaison An/Bm est exprimé comme un excès par rapport à l'additivité « Bliss ». Le modèle « Bliss » prédit une réponse combinée C pour deux agents actifs ayant un effet donné A et B selon la formule : C = A + B - AB avec A et B exprimés en fraction entre 0 et 1.

FV. Méthode pour évaluer un effet synergique de deux produits sur l'inhibition de la prolifération de cellules du cancer du sein MDA-MB231

La méthode utilisée pour les cellules du cancer du sein MDA-MB231 est similaire à celle utilisée pour les cellules de type leucémiques U937 à l'exception de la concentration de la suspension cellulaire (1,25.10⁴ cellules/ml pour MDA-MB231 au lieu de 2,5.10⁴ cellules/ml pour U937). La composition du milieu complet est également modifiée : E-MEM Cambrex + 10% FBS, + 1% d'acides aminés non essentiels + 1% Napyruvate + 1% L-Glutamine + 40μg/ml de Gentamycine. V. Procédure pour déterminer une CI^n sur des lignées cellulaires issues de cancer de type différent

Les cellules ont été mises à incuber dans un volume final de 200 μl d'un milieu de culture supplémenté avec 10 % de sérum bovin foetal contenant le composé testé à 37°C sous atmosphère contenant 5 % de CO₂.

Les cellules tumorales ont été mises à incuber pendant 96 heures avec 10 concentrations finales du composé testé (gamme de 1 x 10^ à 4 x 10^"10 M). Chaque concentration finale a été testée en quadriplicate. Des cellules contrôles ont été traitées avec le véhicule du composé testé. A l'issue de la période de traitement, l'activité antiproliférative a été évaluée par un test colorimétrique utilisant le sel de tetrazolium MTS (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-5-(3- carboxymethoxy phenyl) - 2 - ( 4 - sulfophenyl)-2H- tetrazolium, Baltrop J.A. et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1991, 1:611-614).

A la fin du traitement des cellules, 40 μl d'une solution fraîchement filtrée à 0,22 μm de MTS (20 ml à 2 mg/ml, Réf Gl 111 , Promega, Charbonnières,

France) et de PMS (1 ml à 0,92 mg/ml, Réf P9625, Sigma) dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS, Réf 17-513F, Cambrex) ont été ajoutés dans chaque puits. Les plaques de culture ont été incubées pendant 2 heures à 37°C. L'absorbance de chaque puits a été mesurée à 490 nm en utilisant un compteur multimarqué, VICTOR₃™ 1420 (Wallac, PerkinElmer, Courtaboeuf,

France). Les valeurs d'absorbance correspondent à la moyenne de 4 mesures expérimentales

[Abs. Composé (Cx) ] % lnh.(Cx) = 100 x [ 1 ]

[Abs. Contrôle] dans laquelle • Abs. Composé (C_x) = moyenne des mesures d'absorbance des quatre puits de l'échantillon à tester à la concentration finale C_x.

• Abs. Contrôle = moyenne des mesures d'absorbance des quatre puits contrôle (absence de composé)

VI. Procédure pour déterminer l'effet antitumoral in vivo des produits testés Induction tumorale

Des cellules U937 viables dans un volume de 200 μl de milieu de culture RPMI sont injectées de manière sous cutanée dans le flanc droit d'une souris SCID. L'injection des cellules est réalisée 24 heures après l'irradiation complète du corps avec une source γ (1,8 Gy, Co⁶⁰, INRA BRETENIERE, Dijon,

France).

Plan du traitement Le traitement est initié quand les tumeurs ont atteint un volume moyen d'environ 50 mm³. Les souris sont réparties au hasard dans des groupes de 10 souris de façon à ce que la moyenne du volume tumoral de chaque groupe ne soit pas différente statistiquement des autres groupes (analyse de la variance).

Pour chaque dose de composé test, une quantité appropriée de produit est mis en suspension dans du Tween-20 (Ref P7949, Sigma). Les suspensions sont ensuite diluées dans de l'eau de façon à atteindre la concentration désirée du compose test et une concentration finale de Tween-20 de 1% (v/v). Les souris reçoivent des injections intrapéritonéales (IP) répétées du véhicule (Tween-20 1% (v/v) ou du composé du test à la dose et conformément au plan de traitement chois (1 fois par jour ou 2 fois par jour pendant 30 jours). Pour les traitements par voie orale les produits et le véhicule sont administrés par gavage.

Détermination du volume tumoral

La longueur et la largeur de la tumeur sont mesurées deux fois par semaine à l'aide d'un pied à coulisse et le volume de la tumeur est estimé par la formule : volume tumoral = (largeur² x longueur)/2.

Claims

REVENDICATIONS

1. Utilisation de la 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4-tétrahydro- naphtalèn-1-ylamine, ou de toute combinaison de ses énantiomères ou d'un de ses énantiomères pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement du cancer, ainsi qu'au traitement et à la prévention des métastases.

2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que la composition pharmaceutique contient en outre au moins un alcaloïde.

3. Utilisation selon la revendication 2 caractérisée en ce que l'alcaloïde est un alcaloïde de vinca.

4. Utilisation selon la revendication 3 caractérisée en ce que l'alcaloïde de vinca est choisi dans le groupe constitué par : la vinblastine, la vincristine, la vindésine, la vinorelbine, ou leurs mélanges, de préférence la vincristine et/ou la vinblastine.

5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit cancer est, ou lesdites métastases sont issues d'un cancer choisi dans le groupe constitué par le cancer de la prostate, les ostéosarcomes, le cancer du poumon, le cancer du poumon non à petites cellules, le cancer du sein, le cancer de l'endomètre ou le cancer du côlon, la leucémie chronique ou aiguë, les tumeurs solides de l'enfant, les lymphomes lymphocytaires, le cancer du pancréas, le cancer de la peau, le mélanome cutané ou intraoculaire, le cancer de la tête et du cou, le cancer de l'utérus, le cancer de l'ovaire, les tumeurs gynécologiques, la maladie de Hodgkin, le cancer des os, le cancer du rectum, le cancer de la région anale, le cancer de l'estomac, le cancer de l'œsophage, le cancer de l'intestin grêle, le cancer du système endocrinien, les sarcomes des parties molles, le cancer de l'urètre, le cancer du pénis, le cancer de la vessie, le cancer du rein, le cancer de l'uretère, les tumeurs malignes pédiatriques,et les tumeurs du système nerveux central.

6. Utilisation selon la revendication 5 caractérisée en ce que ledit cancer est le cancer du sein, ou lesdites métastases sont issues d'un cancer du sein.

7. Utilisation selon la revendication 5 caractérisée en ce que ledit cancer est une leucémie.

8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que la composition pharmaceutique est administrée par voie orale, intraveineuse, entérale, parentérale, intramusculaire, intranasale, sous-cutanée ou sublinguale.

9. Produit comprenant de la 4-(3,4-dichloro-phényl)-l,2,3,4- tétrahydro-naphtalèn-1-ylamine ou au moins un de ses énantiomères ou toute combinaison de ses énantiomères et au moins un alcaloïde, en tant que produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie anti-cancéreuse.

10. Produit selon la revendication 9 caractérisés en ce que l'alcaloïde est un alcaloïde de vinca.

11. Produit selon la revendication 10 caractérisés en ce que l'alcaloïde de vinca est choisi dans le groupe constitué par : la vinblastine, la vincristine, la vindésine, la vinorelbine, ou leurs mélanges, de préférence la vincristine et/ou la vinblastine.