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WO2007001010A1 - パーキンソン病の治療のための医薬 - Google Patents

パーキンソン病の治療のための医薬 Download PDF

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WO2007001010A1
WO2007001010A1 PCT/JP2006/312854 JP2006312854W WO2007001010A1 WO 2007001010 A1 WO2007001010 A1 WO 2007001010A1 JP 2006312854 W JP2006312854 W JP 2006312854W WO 2007001010 A1 WO2007001010 A1 WO 2007001010A1
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WO
WIPO (PCT)
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mediatophore
gene encoding
vector
disease
parkinson
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2006/312854
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English (en)
French (fr)
Inventor
Haruhiro Higashida
Shigeru Yokoyama
Taku Kin
Shoji Ohkuma
Nobuaki Shimizu
Hirokazu Hirai
Shinichi Muramatsu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kanazawa University NUC
Jichi Medical University
Original Assignee
Kanazawa University NUC
Jichi Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Kanazawa University NUC, Jichi Medical University filed Critical Kanazawa University NUC
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • the present invention relates to a medicament for the treatment of Parkinson's disease.
  • Parkinson's disease is a disease in which neurons in the substantia nigra below the central part of the brain cause degeneration and die. Since the midbrain substantia nigra produces dopamine, a neurotransmitter in the brain, in Parkinson's disease, there is a shortage of donomin in the brain, and the suppression of nerves in the suppressor system by donomin decreases, and the acetylcholine-promoting system Nerve nerves become dominant, and the action of the basal ganglia appears strongly, causing extrapyramidal symptoms such as limb tremors, muscle rigidity, peristalsis and postural disturbance.
  • Drug therapy for Parkinson's disease includes the ability to administer anticholinergic agents to suppress facilitating nerves in the early stages. L-Dopa, a minagonist and dopamine precursor, is administered. In some cases, amantadine or the like is administered as a drug having a dopamine release promoting action.
  • a gene that expresses tyrosine hydroxylase (TH) that converts L-tyrosin to L-dopa or aromatic amino acid decarboxylase (AADC) that converts L-dopa to dopamine A method has been proposed in which adeno-associated virus is introduced into the brain using an adeno-associated virus as a vector.
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • acetylcholine which is one of the neurotransmitters, in addition to the mechanism by which acetylcholine stored in vesicles is released, it is called 16,000 dal called mediatophore. Ton protein lipid pentamers have been reported to release (FEBS LETT ERS, 261, pp. 303-306, 1990; Life Science, 72, pp. 2029-2038, 2003). Previously, this mediatophore has been reported to be one of a group of APTases! / (J. Biochem, 112, pp. 212-219, 1992), but it is involved in the release of dopamine. There are no reports of this.
  • Non-Patent Document 1 FEBS LETTERS, 261, pp.303-306, 1990
  • Non-Patent Document 2 Life Science, 72, pp.2029-2038, 2003
  • Non-Patent Document 3 J. Biochem, 112, pp.212-219, 1992
  • An object of the present invention is to provide an effective therapeutic means for Parkinson's disease. More specifically, it is an object of the present invention to provide a drug for gene therapy that can effectively treat Parkinson's disease by promoting the release of donomin in the brain.
  • the present inventors have introduced a vector incorporating a gene encoding mediatophore into the brain to express the mediatophore in the brain.
  • the inventors have found that the amount of released dopamine is remarkably increased and that Parkinson's disease can be effectively treated by using this recombinant vector as a drug for gene therapy.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • a medicament for treating Parkinson's disease which comprises a vector incorporating a gene encoding a mediatophore and can express the mediatophore in the brain.
  • the present invention also provides a medicament for treating Parkinson's disease, which comprises a vector incorporating a gene encoding mediatophore and can promote the release of dominin in the brain.
  • the aforementioned pharmaceutical comprising a vector incorporating a gene encoding a mediatophore and a gene encoding an aromatic amino acid decarboxylase and a gene encoding Z or tyrosine hydroxylase.
  • the vector there is provided a medicament as described above, wherein one is an adeno-associated virus (AAV) vector.
  • a medicament comprising a combination of the above medicament with dopamine and / or L-dopa is also provided by the present invention.
  • a method for treating Parkinson's disease comprising administering to a patient a vector incorporating a gene encoding mediatophore and expressing the mediatophore in the brain.
  • a method for treating Parkinson's disease comprising administering to a patient a vector incorporating a gene encoding mediatophore to promote dopamine release in the brain.
  • a method for treating Parkinson's disease is provided to a patient with a vector that incorporates a gene encoding a mediatophore, a gene encoding an aromatic amino acid decarboxylase, and a gene encoding a Z or tyrosine hydroxylase enzyme.
  • a method comprising: administering and expressing mediatophore and aromatic amino acid decarboxylase and Z or tyrosine hydroxylase in the brain; and administering donomin and Z or L-dopa to the patient. Is done.
  • the present invention also provides the use of a gene encoding a mediatophore for the manufacture of the above medicament.
  • the medicament of the present invention has high effectiveness as a medicament for gene therapy of Parkinson's disease.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of measuring the amount of dopamine released into the striatum by administration of the medicament of the present invention.
  • the medicament of the present invention is a medicament for treating Parkinson's disease, comprising a vector incorporating a gene encoding mediatophore, and capable of expressing the mediatophore in the brain. ! /
  • the sequence of a gene encoding a mammalian mediatophore is known, and for example, the gene sequence encoding a rat-derived mediatophore has already been reported as Accession No. D10874 in the GenBank database. Therefore, the person skilled in the art It is possible to easily obtain a gene encoding a mammalian mediatophore.
  • cDNA encoding mediatophore can be easily obtained from the cerebrum of mammals according to the method specifically described in the examples of the present specification.
  • the medicine of the present invention can be applied as a medicine for mammals including humans In order to treat human Parkinson's disease, it is desirable to use a gene encoding a human-derived mediatophore.
  • the gene used for the medicament of the present invention may be any gene that can express a mediatophore that functions in the living body of a mammal.
  • Mediatophores include natural mediatophores derived from mammals, and modified mediatops containing several amino acid substitutions, insertions, and Z or deletions in the amino acid sequence of natural mediatophores. There may be.
  • a gene used in the medicament of the present invention a gene having any nucleic acid sequence encoding the above-mentioned natural type or modified mediatophore can be used.
  • the medicament of the present invention can be prepared using a vector so that the gene encoding mediatophore can be expressed in the brain.
  • a vector capable of directly introducing a gene into the brain in vivo can be used, and either a viral vector or a non-viral vector may be used. Of these, it is preferable to use a viral vector.
  • a viral vector an adeno-associated virus (AAV) vector, a lentivirus vector, a herpes virus vector and the like are available. Of these, an AAV vector is preferable.
  • AAV adeno-associated virus
  • a lentivirus vector a lentivirus vector
  • herpes virus vector a herpes virus vector and the like
  • an AAV vector is preferable.
  • a gene therapy drug for Parkinson's disease for example, a drug using an AAV vector has been developed (Avigen).
  • AAV betater is particularly preferably used for the medicine of the present invention because it can be expected to have relatively long gene expression with high safety.
  • Adeno-associated viruses include type 1 AAV virus (AAV 1), type 2 AAV virus (AAV2), type 3 AAV virus (AAV3), type 4 AAV virus (AAV4), and type 5 AAV virus (AAV5).
  • AAV3 is registered with Gene Bank (NC_001729) and described in the literature (Virology, 221, pp.208-217, 1996).
  • NC_001729 Gene Bank
  • Human Gene Therapy 13, pp. 345-354, 2002 can be referred to.
  • the method for producing the medicament of the present invention is not particularly limited.
  • a recombinant vector can be prepared according to the following method.
  • the mediatophore gene is inserted between the cytoguchi megalovirus (CMV) promoter region and the SV40 polyA region and incorporated into the plasmid along with inverted terminal repeat (ITR) sequences present at both ends of the type 3 AAV (AAV3) virus genome.
  • CMV cytoguchi megalovirus
  • ITR inverted terminal repeat
  • a vector plasmid is prepared by The above vector plasmids, knocking plasmids (plasmids for expressing AAV nonstructural protein Rep and cabsid protein VP), and helper plasmids (adenovirus-derived nucleotide sequences E2A, E4, and VA)
  • AAV vector containing the mediatophore gene can be prepared by transfecting three types of plasmids (including the region) into HE K293 cells derived from human kidney.
  • the drug of the present invention may incorporate a gene encoding tyrosine hydroxylase (TH) and Z or aromatic amino acid decarboxylase (AADC).
  • a vector incorporating a gene encoding mediatophore and a gene encoding tyrosine hydroxylase (TH) and Z or aromatic amino acid decarboxylase (AADC) are combined. It is also possible to use a medicine that can be combined with the inserted vector.
  • AAV vectors allow multiple types of vectors to infect a single cell, so AAV vectors containing mediatophore genes, AAB vectors containing tyrosine hydroxylase (TH), and Z or aromatic amino acids AAV vectors containing decarboxylase (AADC) can be simultaneously administered into the brain to simultaneously express these genes.
  • a vector incorporating a gene encoding a mediatophore and a gene encoding a neurotrophic factor such as DGNF
  • a mediatophore may be used as a medicament of the present invention. It is also possible to use a combination of a vector incorporating a gene coding for and a vector incorporating a neurotrophic factor.
  • Gene therapy for Parkinson's disease using an AAV vector includes, for example, neural progression Ayumi, 45, pp.92-103, 2001, or experimental medicine, 20, pp.1296-1300, 2002, etc., and these publications or references cited in these publications.
  • the mediatophore can be expressed in the cells by directly administering the medicament of the present invention to the striatal cells in the brain.
  • the expression of mediatophore in striatal cells promotes the release of dopamine, thereby improving the symptoms of Parkinson's disease.
  • the dosage of the medicament of the present invention is not particularly limited, but it is desirable to adjust the dosage so that the mediatophore is fully expressed in the striatum cells and the amount of released domino is increased.
  • Such a dose can be appropriately determined by conducting, for example, a model animal experiment specifically described in the examples of the present specification.
  • a pharmaceutical of the present invention comprising a gene encoding an aromatic amino acid decarboxylase (AADC) together with a gene encoding a mediatophore to a striatal cell
  • the mediatophore is sometimes used.
  • AADC aromatic amino acid decarboxylase
  • a donomin precursor is used.
  • Administration of certain L-dopa can enhance the release of donomin from striatal cells.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the obtained PCR product was incorporated into a plasmid (pCR2.1-TOPO; Invitrogen) by the TA cloning method and named pCRMP.
  • pCRMP plasmid
  • the nucleotide sequence of the PCR product was determined and compared with the sequence already reported as Accession No. D10874 in the GenBank database, there was one mismatch between the protein coding region and the 3 'untranslated region. (D1 0874 422th A is C, 566-569 TTTT is TTTTT), it was confirmed that the deduced amino acid sequence was completely matched.
  • CMV cytomegalovirus
  • IRES green fluorescent protein
  • pAAV-MP The nucleotide sequences of cytomegalovirus (CMV) promoter, ribosome internal recognition site (IRES), and green fluorescent protein (EGFP) are excised from the commercially available plasmid (pIRES2-EGFP, Clontech) with restriction enzyme Notl and adeno-associated.
  • the plasmid containing the viral (AAV) DNA sequence was inserted between the hairpin DNA sequences called inverted terminal repeats (ITR) of pAAV. Thereafter, the cDNA fragment of the mediatophore excised from the above pCRMP with the restriction enzyme EcoRI was inserted between the CMV promoter and the IRES sequence (pAAV-MP).
  • HEK293 cells 1.5 ⁇ 10 6 HEK293 cells were seeded in a 225 cm 2 flask and cultured in 10% FCS-DMEM / F12 medium at 5% CO 2 and 37 ° C.
  • Transfusion was performed by the calcium phosphate method. After mixing 3 types of plasmids (pAAV-RC, p Helper, pAAV MP, 25 ⁇ g each) with 0.3 ⁇ CaCl, 2 X HBS (80 mM NaCl,
  • the culture solution in the flask was replaced with a medium supplemented with DNA-calcium phosphate, and the medium was changed after culturing for several hours.
  • Recombinant virus (rAAV-MP) was collected. Remove 0.5M EDTA and remove cells TB It was suspended in S (100 mM Tris HC1, pH 8.0, 150 mM NaCl). Freeze-Z thawing was repeated three times using dry ice ethanol and 37 ° C water nose. After centrifuging at 10,000 Xg for 10 minutes, the supernatant was collected to remove coarse cell debris.
  • RAAV-MP was purified by ultracentrifugation with a density gradient of cesium chloride CsCl. A density gradient was created by superimposing 4 M and 2.2 M CsCl in an ultracentrifugation tube. The cell disruption solution containing rAAV-MP was overlaid, and then ultracentrifuged (25,000 rpm, 3 hours). Refractive index was measured, and fractions containing rAAV-MP with RI: 1.365-1.380 were collected. This fraction was layered again on the CsCl solution and ultracentrifuged (38,000 rpm, 2 hours) to obtain a fraction containing rAAV-MP.
  • mice were anesthetized with Nembutal (200 1 intraperitoneal administration per 30 g body weight) and fixed using a small animal fixation device.
  • body temperature controller the body temperature of the mouse was maintained at 37 ° C., the hair on the head was shaved, and then the skin was incised with nasal force applied to the back of the head.
  • a hole 2 to 3 mm in diameter was drilled using a microdrill on the skull, 2.0 mm outside the Bregma (depending on the age of the mouse) and 2.0 mm outside the midline.
  • the dura mater and the arachnoid under the bone were punctured with a needle.
  • Virus was filled in a flexfill microsyringe (manufactured by WPI, 10 ⁇ 1 volume), and the flexfil microsyringe was set in an ultra micropump 2 (manufactured by WPI) attached to a micromanipulator. A microsyringe needle tip was inserted about 2 mm from this hole. The virus was injected at a rate of 100 nl / min for 10 minutes for a total of 11 using a digital controller Micro4 (manufactured by WPI) dedicated to Ultra Micropump 2. The incised skin is sutured with an ophthalmic microneedle with sutures, the fixing device force is removed, and the mouse is removed until anesthesia awakens. Observation was made in a cage (in a safety cabinet) placed on a single pad. The mouse cage was then returned to the infected animal rack.
  • the measurement of dopamine was carried out by brain microphone dialysis using unanesthetized mice (body weight 26-30 g, male).
  • the surgical procedure was basically the same as in the case of AAV inoculation into the cerebellar subarachnoid space.
  • the mouse was anesthetized with Nembutal (15.5 mg intraperitoneally administered per 30 g body weight), and after anesthesia, the hair of the head was shaved and fixed to a small animal stereotaxic apparatus.
  • the body temperature was maintained at 37 ° C with a body temperature controller.
  • a midline incision was made in the scalp, and a hole with a diameter of 2-3 mm was drilled using a micro drill into the skull 0.4 mm caudal to Bregma and 2.0 mm outside the midline under a stereomicroscope.
  • the dura mater and arachnoid membrane under the skull were carefully dissected at the tip of the needle.
  • a micro screw was attached to the skull as an anchor.
  • the tip of the guide force-Yule fixed to the electrode holder of the stereotaxic device was inserted 0.4 mm tail side from Bregma, 2.0 mm outside the midline, and 1.7 mm deep from the brain surface. Thereafter, the guide force-Yule was fixed to the skull with dental cement. After confirming that the dental cement was completely solidified, a dummy force-yure was inserted into the guide force-yure and fixed with a cap nut. The mouse was removed from the fixation device and observed on a heating pad until it awakened from anesthesia. Mice were returned to their cages after waking up completely from anesthesia.
  • the experiment for measuring dopamine was performed under conditions of no anesthesia and no restraint after the mice had completely recovered the invasive power by surgery (about 5 to 7 days).
  • the mouse was fully adapted to a measuring box with a diameter of 40 cm and a height of 50 cm.
  • the cerebral striatum where the tip of the dialysis probe was located was perfused with dialysate using a syringe pump (flow rate, 1 ⁇ L / min).
  • the time course of the dopamine concentration in the dialysate collected from the striatum was analyzed using a high-performance liquid chromatograph.
  • An online analysis system with an electrochemical detector manufactured by Aicom Co., Ltd.
  • the retention time of donomin is about 8.5 minutes. It was.
  • the experiment was started after confirming that the peak of dopamine in the recovered solution was constant and stable.
  • NaH PO ⁇ 2 ⁇ O 15.6g was dissolved in ultrapure water to make 1L.
  • Na HPO-12H 0 35.8g was dissolved in ultrapure water to make 1L.
  • the dialysate is composed of NaCl (146 mM) KCl (2.7 mM) CaCl (1.2 mM) MgCl (1.0 mM)
  • a mouse that had been stained with the substantia nigra by connecting the forward and reverse mediatophore cDNA to a viral expression vector was used.
  • the amount of overflowing dopamine was measured by refluxing with the potassium salt of potassium salt at the concentration indicated on the striatum. The results are shown in FIG. It was shown that the amount of dopamine released was increased by medium-at-four.

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Abstract

 パーキンソン病の治療のための医薬であって、メディアトフォアをコードする遺伝子を組み込んだベクターを含み、脳内でメディアトフォアを発現させることができる医薬。

Description

明 細 書
パーキンソン病の治療のための医薬
技術分野
[0001] 本発明はパーキンソン病の治療のための医薬に関するものである。
背景技術
[0002] パーキンソン病は脳の中心部下方にある中脳黒質の部分の神経細胞が変性を起 こして死滅する疾患である。中脳黒質は脳内の神経伝達物質であるドーパミンを産 生していることから、パーキンソン病では脳内のドーノミンが不足し、ドーノミンによる 抑制系の神経の支配が低下してアセチルコリンによる促進系の神経が支配的になり 、大脳基底核の働きが強く現れて手足の振るえ、筋固縮、寡動'無動、姿勢障害など の錐体外路症状が生じる。パーキンソン病の薬物療法としては、初期においては促 進系神経を抑制するための抗コリン剤などの投与が行なわれる力 抗コリン剤での改 善が認められなくなった中期又は後期の段階では、ドーノ ミンァゴニストやドーパミン 前駆物質である L-ドーパ (L-Dopa)の投与が行なわれる。また、ドーパミン放出促進 作用のある薬物としてアマンタジンなどの投与が行なわれる場合もある。
[0003] パーキンソン病に対して遺伝子治療を行なう試みもなされている。例えば、 L-チロ シン力 L-ドーパへの変換を行なうチロシン水酸ィ匕酵素（TH)又は L-ドーパからドー パミンへの変換を行なう芳香族アミノ酸脱炭酸酵素 (AADC)などを発現する遺伝子を アデノ随伴ウィルスをベクターとして用いて脳内に導入する方法が提案されている。 また、神経保護療法的アプローチとして神経栄養因子である GDNF (glial cell line-de rived neurotrophic factor)などを脳内で発現させることによりパーキンソン病の病態 の進行を遅延させることができると期待されている (パーキンソン病の遺伝子治療に ついては、総説として、実験医学， 20(9), pp.1296-1300, 2002;神経進歩， 45(1), pp. 92-103, 2001などを参照のこと)。もっとも、ドーノミンの放出を促進させる目的での遺 伝子治療は従来全く試みられて!/、な 、。
[0004] 一方、神経伝達物質の一つであるアセチルコリンの放出について、小胞に蓄えられ たアセチルコリンが放出するメカニズム以外に、メディアトフオアと呼ばれる 16000ダル トンのタンパク脂質の 5量体により放出が制御されているとの報告がある（FEBS LETT ERS, 261, pp.303-306, 1990; Life Science, 72, pp.2029-2038, 2003)。従来、このメ ディアトフオアが APTaseの一群の要素の一つとなって!/、ることが報告されて 、るが（J. Biochem, 112, pp.212-219, 1992)、ドーパミンの放出に関与しているとの報告はな い。
非特許文献 1 : FEBS LETTERS, 261, pp.303-306, 1990
非特許文献 2 : Life Science, 72, pp.2029-2038, 2003
非特許文献 3 : J. Biochem, 112, pp.212-219, 1992
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の課題は、パーキンソン病の有効な治療手段を提供することにある。より具 体的には、脳内においてドーノミンの放出を促進することによりパーキンソン病を有 効に治療することができる遺伝子治療用の医薬を提供することが本発明の課題であ る。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、メディアトフオア をコードする遺伝子を組み込んだベクターを脳内に導入してメディアトフオアを脳内 で発現させることにより、ドーパミンの放出量が顕著に増加すること、及びこの組換え ベクターを遺伝子治療のための医薬として用いることによりパーキンソン病を有効に 治療できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
[0007] すなわち、本発明により、パーキンソン病の治療のための医薬であって、メディアト フォアをコードする遺伝子を組み込んだベクターを含み、脳内でメディアトフオアを発 現させることができる医薬が提供される。また、本発明により、パーキンソン病の治療 のための医薬であって、メディアトフオアをコードする遺伝子を組み込んだベクターを 含み、脳内のドーノ ミン放出を促進することができる医薬が提供される。本発明の好 ましい態様として、メディアトフオアをコードする遺伝子とともに芳香族アミノ酸脱炭酸 酵素をコードする遺伝子及び Z又はチロシン水酸ィヒ酵素をコードする遺伝子を組み 込んだベクターを含む上記の医薬が提供される。さらに好ましい態様により、ベクタ 一がアデノ随伴ウィルス (AAV)ベクターである上記の医薬が提供される。また、上記 の医薬とドーパミン及び/又は L-ドーパとの組み合わせを含む医薬も本発明により 提供される。
[0008] 別の観点からは、パーキンソン病の治療方法であって、メディアトフオアをコードす る遺伝子を組み込んだベクターを患者に投与し、脳内でメディアトフオアを発現させ る工程を含む方法、及びパーキンソン病の治療方法であって、メディアトフオアをコー ドする遺伝子を組み込んだベクターを患者に投与し、脳内でドーパミン放出を促進 する工程を含む方法が提供される。さらに、パーキンソン病の治療方法であって、メ ディアトフオアをコードする遺伝子と芳香族アミノ酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子及 び Z又はチロシン水酸ィヒ酵素をコードする遺伝子とを組み込んだベクターを患者に 投与し、脳内でメディアトフオアと芳香族アミノ酸脱炭酸酵素及び Z又はチロシン水 酸化酵素を発現させる工程、及び該患者にドーノ ミン及び Z又は L-ドーパを投与す る工程を含む方法が提供される。
さらに別の観点からは、上記の医薬の製造のためのメディアトフオアをコードする遺 伝子の使用も本発明により提供される。
発明の効果
[0009] 本発明の医薬は、パーキンソン病の遺伝子治療のための医薬として高い有効性を 有している。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]本発明の医薬の投与により線条体に放出されてくるドーパミン量を測定した結 果を示した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明の医薬は、パーキンソン病の治療のための医薬であって、メディアトフオアを コードする遺伝子を組み込んだベクターを含み、脳内でメディアトフオアを発現させる ことができることを特徴として！/、る。
哺乳類動物のメディアトフオアをコードする遺伝子の配列は公知であり、例えば、ラ ット由来のメディアトフオアをコードする遺伝子配列が GenBankデータベースに Acce ssion No. D10874として既に報告されている。従って、当業者はこの情報を基にして 哺乳類動物のメディアトフオアをコードする遺伝子を容易に入手することが可能であ る。また、本明細書の実施例に具体的に記載した方法に従って哺乳類動物の大脳 からメディアトフオアをコードする cDNAを容易に取得することができる。本発明の医薬 はヒトを含む哺乳類動物の医薬として適用することができる力 ヒトのパーキンソン病 の治療を行なうためには、ヒト由来のメディアトフオアをコードする遺伝子を用いること が望ましい。本発明の医薬に用いる遺伝子は、哺乳類動物の生体内において機能 するメディアトフオアを発現できるものであればよい。メディアトフオアとしては、哺乳類 動物由来の天然型メディアトフオアのほカゝ、天然型メディアトフオアのアミノ酸配列に 数個のアミノ酸の置換、挿入、及び Z又は欠失を含む改変メディアトフオアであっても よい。本発明の医薬に用いる遺伝子としては、上記の天然型又は改変メディアトフォ ァをコードする任意の核酸配列を有する遺伝子を用いることができる。
本発明の医薬は、ベクターを用いてメディアトフオアをコードする遺伝子を脳内にお V、て発現させることができるように調製することができる。ベクターとしてはイン ·ビボで 直接脳内に遺伝子を導入できるベクターを用いることができ、ウィルスベクター又は 非ウィルスベクターのいずれを用いてもよい。これらのうち、ウィルスベクターを用いる ことが好ましい。ウィルスベクターとしては、アデノ随伴ウィルス (AAV)ベクター、レン チウィルスベクター、ヘルぺスウィルスベクターなどが利用可能である力 これらのう ち、 AAVベクターが好ましい。例えば、パーキンソン病を対象とする遺伝子治療薬と して、例えば、 AAVベクターを利用した医薬が開発されている（Avigen社)。 AAVベタ ターは安全性が高ぐ比較的長期の遺伝子発現を期待できることから、本発明の医 薬には特に好ましく用いられる。アデノ随伴ウィルスとしては、 1型 AAVウィルス (AAV 1)、 2型 AAVウィルス (AAV2)、 3型 AAVウィルス (AAV3)、 4型 AAVウィルス (AAV4)、 又は 5型 AAVウィルス (AAV5)などが知られて!/ヽるが、 AAVベクターの製造には!、ず れを用いることも可能である。例えば、 AAV3の塩基配列は Gene Bankに登録されて おり（NC_001729)、文献にも記載されている（Virology, 221, pp.208- 217, 1996)。 AA Vベクターを利用した脳内への遺伝子導入については、 Human Gene Therapy, 13, p p.345-354, 2002などを参照することができる。総説として、神経進歩， 45, pp.92-103, 2001又は実験医学， 20, pp.1296-1300, 2002などを参照することができる。これらの 刊行物の開示及びこれらの刊行物に引用された文献の開示のすべてを参照により 本発明の開示に含める。
[0013] 本発明の医薬の製造方法は特に限定されないが、 AAVベクターを用いる場合には 、以下の方法に従って組換えベクターを調製することができる。以下、本発明の好ま しい態様として AAVベクターを用いる場合について具体的に説明するが、本発明の 範囲は AAVベクターを用いる場合に限定されることはない。メディアトフオア遺伝子を サイト口メガロウィルス (CMV)プロモーター領域と SV40の polyA領域の間に挿入して 3 型 AAV(AAV3)ウィルスゲノムの両端に存在する inverted terminal repeat (ITR)配列 とともにプラスミドに組み込むことによりベクタープラスミドを調製する。上記のベクター プラスミド、ノ ッケージングプラスミド (AAVの非構造蛋白質である Repとカブシド蛋白 である VPを発現するためのプラスミド）、及びへルパープラスミド (アデノウイルス由来 の塩基配列で E2A、 E4、及び VA領域を含む）の 3種類のプラスミドをヒト腎由来の HE K293細胞にトランスフエタトすることにより、メディアトフオア遺伝子を含む AAVベクタ 一を調製することができる。
[0014] 本発明の医薬には、チロシン水酸ィ匕酵素 (TH)及び Z又は芳香族アミノ酸脱炭酸 酵素 (AADC)をコードする遺伝子を組み込んでもよい。あるいは、本発明の医薬とし て、メディアトフオアをコードする遺伝子を組み込んだベクターと、チロシン水酸ィ匕酵 素 (TH)及び Z又は芳香族アミノ酸脱炭酸酵素 (AADC)をコードする遺伝子を組み 込んだベクターとの組み合わせ力もなる医薬を用いることもできる。 AAVベクターを用 いると複数の種類のベクターを一つの細胞に感染させることができるので、メディアト フォア遺伝子を含む AAVベクターと、チロシン水酸化酵素（TH)を含む AABベクター 及び Z又は芳香族アミノ酸脱炭酸酵素 (AADC)を含む AAVベクターを同時に脳内 に投与してこれらの遺伝子を同時に発現させることが可能である。さらに、本発明の 医薬としては、メディアトフオアをコードする遺伝子とともに神経栄養因子 (DGNFなど )をコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いてもよぐあるいは本発明の医薬と して、メディアトフオアをコードする遺伝子を組み込んだベクターと神経栄養因子を組 み込んだベクターとの組み合わせを用いてもょ 、。
[0015] AAVベクターを用いたパーキンソン病の遺伝子治療については、例えば、神経進 歩， 45, pp.92-103, 2001又は実験医学， 20, pp.1296-1300, 2002などに具体的に説 明されており、これらの刊行物又はこれらの刊行物に引用された文献を参照すること により、脳内の線条体細胞に本発明の医薬を直接投与して該細胞内でメディアトフォ ァを発現させることができる。メディアトフオアが線条体細胞内で発現することによって ドーパミンの放出が促進され、それによりパーキンソン病の症状の改善が達成できる 。本発明の医薬の投与量は特に限定されないが、メディアトフオアが線条体細胞で十 分に発現してドーノ ミン放出量が増加するように投与量を調節することが望ま 、。こ のような投与量は、例えば、本明細書の実施例に具体的に説明したモデル動物実験 を行なうことにより適宜決定することが可能である。メディアトフオアをコードする遺伝 子とともに芳香族アミノ酸脱炭酸酵素 (AADC)をコードする遺伝子を組み込んだベタ ターカゝらなる本発明の医薬を線条体細胞に投与する場合、ある 、はメディアトフオア をコードする遺伝子を組み込んだベクター力もなる本発明の医薬と芳香族アミノ酸脱 炭酸酵素 (AADC)をコードする遺伝子を組み込んだベクターとを線条体細胞に投与 する場合には、ドーノミンの前駆物質である L-ドーパを投与することによって、線条 体細胞からのドーノミンの放出を促進させることが可能である。
実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の 実施例に限定されることはない。
例 1
A.材料及び方法
(1)メディアトフオアの cDNAクローユング
Wister系ラット大脳より全細胞 RNA (total cellular RNA)を抽出し、ランダムプライマ 一 (p(dN) )を用いた逆転写酵素反応によって cDNAを合成した。次に、この cDNAを
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铸型にしてポリメラーゼ鎖反応 (PCR: polymerase chain reaction)を行い、メディアトフ オアの cDNAを増幅した。プライマーとして、下記の 2組のプライマーセットを連続して 用いた。
5'— GAATTCCGGAGAATCTTCTTTCG— 3'(MPS1)と 5'— TTCTGGAATGAGGAGGG GTGA-3'(MPAS1) 5し GCTCTCTCTCCCGTCGTCCT- 3'(MPS2)と 5し CCTATCCTGTGACTGGTGGT G-3'(MPAS2)
得られた PCR産物をプラスミド (pCR2.1- TOPO; Invitrogen社)に TAクロー-ング法 によって組込み、 pCRMPと命名した。 PCR産物の塩基配列を決定し、 GenBankデ ータベースに Accession No. D10874として既に報告されている配列と比較したとこ ろ、蛋白コーディング領域と 3'側非翻訳領域に 1か所ずつ不一致が認められたが（D1 0874の 422番目の Aが C 、 566-569の TTTTが TTTTT )、推定されるアミノ酸配列は 完全に一致することが確認された。
[0017] (2)アデノ随伴ウィルス (AAV)ベクターの作製
(a)ベクタープラスミドの作製
市販のプラスミド (pIRES2-EGFP、 Clontech社)から、サイトメガロウィルス (CMV)プロ モーター、リボゾーム内部認識部位 (IRES)、および緑色蛍光蛋白質 (EGFP)の各塩基 配列を制限酵素 Notlで切り出し、アデノ随伴ウィルス (AAV)の DNA配列を含むプラス ミド pAAVの inverted terminal repeats (ITR)と呼ばれるヘアピン DNA配列の間に挿入 した。その後、上記の pCRMPから制限酵素 EcoRIで切り出したメディアトフオアの cD NA断片を CMVプロモーターと IRES配列との間に組込んだ（pAAV-MP)。
[0018] (b)HEK 293細胞へのトランスフエクシヨン
<第 1日目 >
225cm2フラスコに 1.5 X 106の HEK293細胞をまき、 10% FCS- DMEM/F12培地を使 用して 5%CO 、 37°Cで培養した。
2
<第 3日目 >
リン酸カルシウム法でトランスフエクシヨンを行った。 3種類のプラスミド (pAAV-RC, p Helper, pAAV MP、各 25 μ g)と 0.3Μ CaClとを混合した後に、 2 X HBS (80 mM NaCl,
2
50 mM Hepes buffer, 1.5 mM Na HPO (pH7.10》を加え、 DNA-リン酸カルシウムを
2 4
作製した。フラスコ中の培養液を DNA-リン酸カルシウムを添加した培地と入れ換え、 数時間培養した後に培地を交換した。
<第 6日目 >
組換えウィルス (rAAV- MP)の回収を行った。 0.5M EDTAをカ卩えて細胞を剥がし TB S (100 mM Tris HC1, pH 8.0, 150 mM NaCl)に懸濁した。ドライアイスエタノールと 37 °Cのウォーターノ スを使用して凍結 Z融解を 3回繰り返した。 10,000 X gで 10分間遠 心した後、上清を回収して粗大な細胞破片を除去した。
[0019] (c)ウィルスの精製
塩ィ匕セシウム CsClの密度勾配による超遠心を行 、rAAV-MPを精製した。超遠心チ ユーブ内に 4 Mおよび 2.2 Mの CsClを重層し密度勾配を作製した。 rAAV-MPを含む 細胞破砕溶液を重層後、超遠心 (25,000 rpm、 3時間)を行った。屈折率を計測して RI :1.365-1.380の rAAV- MPを含む分画を回収した。この分画を再度 CsCl溶液上に重 層し、超遠心 (38,000rpm、 2時間)を行って rAAV- MPを含む分画を得た。
(d)ベクター力価の測定 （リアルタイム PCR)
精製した rAAV-MPの 10— 2-10— 6の希釈系列を作製した。 pIRES2- EGFP (Clontech社) を制限酵素 EcoRIで切断したフラグメントをスタンダードとした。プライマーとして下記 のプライマーセットを用い、 Applied Biosystems 7900HT Fastリアルタイム PCRシステ ム (Applied Biosystemsネエで疋逢した。
5し AAGGCTACGTCCAGGAGCGCA— 3'(EGFP qPCR 270 Forward)
5し AGGATGTTGCCGTCCTCCTTGA— 3'(EGFP qPCR 390 Reverse)
[0020] (3)マウス線条体への AAVの接種
マウスをネンブタール (体重 30gあたり 200 1腹腔内投与)にて麻酔し、小動物固定 装置を用いて固定した。体温コントローラ一にて、マウス体温を 37度に保持し、頭部 の毛を刈った後、鼻側力も後頭にかけて皮膚を切開した。実体顕微鏡下で Bregmaよ り 0.4 mm (マウスの週齢により異なる）尾側、正中線より 2.0 mm外側の頭蓋骨に、マイ クロドリルを用いて径 2〜3 mmの穴を開けた。骨の下の硬膜及びクモ膜は注射針にて 穴を開けた。 Virusをフレックスフィルマイクロシリンジ (WPI社製、 10 μ 1 volume)に充填 し、該フレックスフィルマイクロシリンジをマイクロマニピュレータに取り付けたウルトラ マイクロポンプ 2(WPI社製)にセットした。マイクロシリンジ針先をこの穴より約 2 mm刺 入した。ウィルスをウルトラマイクロポンプ 2専用デジタルコントローラー Micro4 (WPI 社製)を用いて、 100 nl/minの速度で 10分間、計 1 1注入した。切開した皮膚を縫合 糸付き眼科用微小針で縫合し、固定装置力 マウスをはずし、麻酔が覚醒するまでヒ 一ティングパッド上に置いたケージ (安全キャビネット内)で観察した。その後、マウスケ ージを感染動物用ラックに戻した。
[0021] (4)ドーパミンの測定
ドーパミンの測定は無麻酔.無拘束のマウス (体重 26〜30g、ォス)を用いて脳マイク 口ダイアリシス法により行った。
(a)ガイド力-ユーレの頭蓋骨への固定
手術方法は基本的に小脳クモ膜下腔への AAV接種の場合と同様に行った。マウス をネンブタール (体重 30g当り 15.5mg腹腔内投与)にて麻酔し、麻酔後頭部の毛を刈り 、小動物脳定位固定装置に固定した。手術中は体温コントローラ一にて体温を 37°C に保持した。頭皮を正中切開し、実体顕微鏡下で Bregmaより 0.4 mm尾側，正中線よ り 2.0 mm外側の頭蓋骨にマイクロドリルを用いて径 2-3 mmの穴を開けた。頭骨の下 の硬膜およびクモ膜を注射針先端にて注意深く切開した。頭蓋骨に微小ねじをアン カーとして取り付けた。脳定位固定装置の電極ホルダーに固定したガイド力-ユーレ の先端を Bregmaより 0.4 mm尾側、正中線より 2.0 mm外側、脳表面より深さ 1.7 mmの 位置に刺入した。その後、ガイド力-ユーレを歯科用セメントにて頭蓋に固定した。デ ンタルセメントが完全に固まったことを確認後、ガイド力-ユーレにダミー力-ユーレを 挿入してキャップナットにて固定した。固定装置からマウスをはずし、麻酔から覚醒す るまでヒーティングパッド上で観察した。マウスが完全に麻酔から覚醒後ケージに戻し た。
[0022] (b)月 マイクロダイアリシス
ドーパミンの測定実験は、マウスが手術による侵襲力も完全に回復した後（約 5〜7 日）に無麻酔'無拘束の条件で行った。実験当日、ガイド力-ユーレに取り付けたダミ 一力-ユーレをダイアリシスプローブ (株式会社エイコム製)で置換した後，マウスを直 径 40 cm,高さ 50 cmの測定箱に十分適応させた。その後、シリンジポンプを用いてダ ィアリシスプローブ先端が位置する大脳線条体を透析液で灌流した (流速， 1 μ L/mi n)。線条体から回収した透析液中のドーパミン濃度の経時変化を高速液体クロマトグ ラフィ一.電気化学検出器によるオンライン分析システム (株式会社エイコム製）によつ て分析した。以下に述べる分析条件においてドーノ ミンの保持時間は約 8.5分であつ た。実験は回収液中のドーパミンのピークが一定となり，安定したことを確認後開始し た。
[0023] 以下に使用した分析条件，高速液体クロマトグラフィー移動相の調製及び透析液 の組成を記す。
<分析条件 >
分析カラム EICOMPAK CA-50DS 2. lmm X 150mm (株式会社エイコム） プレカラム EICOM PREPAKSET-CA 3mm φ X 4mm (株式会社エイコム） 移動相
80% 0.1Mリン酸緩衝液 (Na") pH=6.0
20%メタノーノレ
500mg/L 1 -オクタンスルホン酸ソーダ (SOS)
50mg/L EDTA-2Na
流速 0.23 mL/min
分析温度 25°C
設定加電圧 +450mV vs Ag/AgCl
作用電極グラフアイト電極 WE-3G (株式会社エイコム）
[0024] <移動相の調製 >
a) 0.1Mリン酸 1ナトリウム溶液
NaH PO ·2Η O 15.6gを超純水に溶解して 1Lとした。
2 4 2
b) 0.1Mリン酸 2ナトリウム溶液
Na HPO - 12H 0 35.8gを超純水に溶解して 1Lとした。
2 4 2
c) a)液 1000 mL及び b)液 160mLを混合した（pH 6.0となった）。
d) c)液 800 mLと液クロ用メタノール 200 mLをそれぞれ計り混合した。
e) EDTE-2Naを lg秤量して 20 mLの超純水に溶解し（50 mg/mL)、冷蔵庫に保存し た。この溶液を d)液 1Lに対して lmL添カ卩した。
D オクタンスルホン酸ソーダ 500 mgは用時秤量して EDTEと共に d)液 1Lに添カ卩して 混合'溶解した。
<透析液組成 > 透析液は NaCl (146 mM) KCl (2.7 mM) CaCl (1.2 mM) MgCl (1.0 mM)の組成
2 2
のものを使用した。これを冷蔵庫に保存し，使用時は室温に戻しよく脱気して使用し た。
B.結果
正方向と逆方向のメデアトフオア cDNAをウィルス発現ベクターにつなぎ、黒質に感 染させたネズミを用いた。線条体を記してある濃度の塩ィ匕カリウムで環流し、あふれ 出てくるドーパミン量を測定した。結果を図 1に示した。メデアトフオアによりドーパミン 放出量が増加することが示された。

Claims

請求の範囲
[1] パーキンソン病の治療のための医薬であって、メディアトフオアをコードする遺伝子を 組み込んだベクターを含み、脳内でメディアトフオアを発現させることができる医薬。
[2] ベクターがアデノ随伴ウィルス (AAV)ベクターである請求項 1に記載の医薬。
[3] 線条体に投与するための請求項 1又は 2に記載の医薬。
[4] メディアトフオアをコードする遺伝子とともに芳香族アミノ酸脱炭酸酵素をコードする 遺伝子及び Z又はチロシン水酸化酵素をコードする遺伝子を組み込んだベクターを 含む請求項 1な 、し 3の!、ずれ力 1項に記載の医薬。
[5] メディアトフオアをコードする遺伝子とともに芳香族アミノ酸脱炭酸酵素をコードする 遺伝子をコードする遺伝子を組み込んだベクターを含む請求項 4に記載の医薬。
[6] 芳香族アミノ酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子及び Z又はチロシン水酸化酵素をコ ードする遺伝子を組み込んだベクターとともに投与する請求項 3に記載の医薬。
[7] パーキンソン病の治療のための医薬であって、メディアトフオアをコードする遺伝子を 組み込んだベクターを含み、脳内のドーノミン放出を促進することができる医薬。
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