WO2007068173A1

WO2007068173A1 - Carrier for making immobilized enzyme or immobilized cells and method of using the same

Info

Publication number: WO2007068173A1
Application number: PCT/CN2006/002512
Authority: WO
Inventors: Caike Jin; Jun Wang
Original assignee: Bioright Worldwide Co Ltd
Current assignee: Bioright Worldwide Co Ltd
Priority date: 2005-12-16
Filing date: 2006-09-25
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2008-06-16
Also published as: EP1970443A1; EP1970443A4; US8486676B2; EP1970443B1; CN1982445B; JP2009519019A; CN1982445A; JP5027152B2; US20100028971A1

Description

用于制备固定化酶或固定化细胞的载体以及使用该载体的固定化方法技术领域

本发明涉及涉及固定化酶 /固定化细胞技术领域，特别是采用合成有机材料作为载体的固定化酶 /固定化细胞技术。背景技术

随着生物技术的发展，酶或含酶的细胞常常以固定化的形态应用于工业和其它领域，因为固定化酶 /固定化细胞易于与产品分离并可回收重复使用，也往往比游离酶更为稳定。酶或细胞的固定化方法很多，如物理吸附、亲和联结、共价交联、凝絮包埋等等。

固定化酶 /固定化细胞通常以比活力（单位重量的固定化酶 /固定化细胞的活性）的高低来评估固定化技术的水平。比活力的高低与固定化方法有关，也与单位重量的固定化酶 /固定化细胞的表面积（比表面积）有关。一般而言比表面积越大，比活性也就越高。因此，各种固定化方法都致力于提高酶颗粒的比表面积。目前，提高颗粒比表面积的方法一般是采用多孔、小颗粒的载体，用预制的含毛细孔的小颗粒载体来吸附或结合细胞或酶分子。

然而，现有技术在提高固定化酶 /固定化细胞的比表面积方面存在很大的局限。现有的有机或无机载体因为多用硬质材料做成，其多孔性一般只体现在颗粒表面，因为如果内部孔隙过多则载体脆而易裂。因此，比表面积大且不易破碎的固定化载体一直是本领域科学家努力的目标。发明内容

针对现有技术中各种载体的比表面积不足够大，一种载体往往只适用于某种或某几种酶的固定，且大多不适用于细胞的固定化，并且载体大多价格昂贵等问题，本发明的目的是找到一种比表面积大且不易破碎的既适用于固定化酶又适用于固定化细胞的合适的固定化载体。本发明还要解决的技术问题是如何有效地将所述的载体用于固定化酶或表达酶的细胞。

为了提高固定化酶 /固定化细胞的比活力，本发明以开孔的多孔有机泡沬材料为载体。该载体的内部也具有开放的孔，即所述的孔不是封闭的，在该载体的内部具有至少两个互为连通的孔。利用这样的载体可以使所形成的固定化产品也具有开孔的三维网格结构，反应液可以贯穿流动在固定相的内部。这一方面显著提高了产品的比表面积，一方面也消除了传统粒状产品表里反应速率之差异。同时，与现有的颗粒状或片状的产品不同，本发明所述的固定化酶 /细胞可视需要制成大小任意的颗粒、块状、片状及其它形态的结构而基本不影响其比表面积。

本发明所述的载体为开孔的吸水性的有机多孔泡沬材料。载体的开孔特性便于固定化时酶液进入载体内部，便于酶反应时底物充分有效地与载体上的酶分子接触反应，以及便于酶反应后产物的传质。本发明载体的吸水特性使得酶蛋白或细胞等亲水性组分可以均匀地分布、良好地附着并固定于载体的多孔表面。多孔材料的吸水性越强，其表现出来的水自然湿润速率就越大。本发明人发现有机多孔材料在水中自然湿润的快慢与其是否适用于作为固定化载体有相关性；水自然湿润速率高于

0.2mm/s、优选高于 0.4 mm/s的材料适用于作为固定化载体，水自然湿润速率低于 0.2 mm/s的材料则不适用于作为固定化载体。大部分常见的合成材料（如各种聚氨酯海绵）的水自然湿润速率低，本发明优选的载体包括 PVA海绵、木浆海绵、三聚氰胺海绵等。

本发明还提供一种用于固定化酶或固定化细胞的制备方法，其包括如下步骤：

( i ) 釆用开孔的多孔有机泡沬材料作为固定载体；和

( ii ) 利用凝絮交联技术将所述酶或细胞固定在所述的载体上。与现有技术比较，本发明具备诸多优势。其一，采用开孔的多孔有机泡沬材料作为固定酶或细胞的载体，可大幅度地提高固定化酶和固定化细胞的比表面积，从而显著提高固定化酶 /固定化细胞的比活力。其二，本发明所涉及的方法在应用酶学领域具有广泛的适用性，理论上适用于几乎所有类型的酶和细胞的固定化。其三，本发明所使用的载体为通用惰性材料，价格低廉，因而降低了制造成本。其四，本发明所述的载体柔韧，即使在剧烈搅拌下也不易破碎。其五，本发明可以在不改变比表面积的同时根据需要制备各种外形、尺寸的大体积整体产品，尤其适合于大工业生产。附图的简要说明

图 1显示的是卷轴状固定化细胞柱体的制备过程。图中 a为内芯， b 为固定化细胞圆柱， c为橡胶带， d为接口装置， e为硅胶管， f为聚氨酯保温材料。具体实施方式

如上文所述，本发明的载体是一种开孔的多孔有机泡沬材料，该载体具有至少为 0.2mm/s的水自然湿润速率。该自然湿润速率是如下测定的- 将待测的干燥的有机多孔材料切割成边长为 5cm 的立方体，轻轻置于水深为 20cm的蒸熘水面并立即开始计时。该测试在整块受试材料完全被湿润或在测试开始后 10分钟时结束。在此条件下，有机多孔材料被润湿的部分（包括沈入水中的部分）垂直于水面的高度（毫米）与其被润湿所花费的时间（秒）的比值被定义为该材料的水自然湿润速率。

本发明人认为，可能在聚合物的主链或支链上具有亲水性基团例如羟基、氨基、氰基等的那些多孔有机泡沬材料是比较合适的载体。在目前市场上可购得的一些开孔的多孔有机泡沬材料中，经测定聚乙烯醇海绵、木浆海绵和三聚氰胺海绵是较为合适的载体材料。这些材料制成的载体可以各种形状，例如颗粒状、条带状、片状、柱状或块状。

本发明的另一方面提供了将酶或细胞固定化于本发明载体上的方法。在进行酶或细胞的固定化之前，可以事先将本发明所述的载体切割成薄片状或颗粒状，并用水或缓冲液将酶液或细胞悬液配成适当浓度。本发明固定方法的一个具体的实施方案可按如下步骤完成： a) 将酶液或细胞悬液加入载体中，挤压载体使液体在载体中分布均匀并除去载体中未被吸附的液体； b) 将适量蛋白凝絮剂溶液加入吸附有酶液的载体中，挤压数次使酶或细胞凝絮沈积于载体的孔壁上,挤压除去未被吸附的液体； c)将适量交联剂溶液加入载体中，交联固定凝絮的蛋白或细胞，然后挤压除去交联剂溶液； d) 视需要重复步骤 a至 c数次，以增加酶或细胞在载体上的载量。最后以清水洗涤载体数次，干燥。本发明固定方法的另一个可替代的实施方案如下： a')向待固定的酶或细胞液中加入一定量的作为交联剂使用的多元醛化合物制备醛化的酶或细胞液； b' ) 向切割好的载体加入上述醛化的酶或细胞液，挤压载体使液体均勾分布其中； C ) 向载体中加入一定量的蛋白絮凝剂，反复混合挤压载体，再挤压除去载体中的液体； d' )视需要重复步骤 a'至 c '数次，以增加酶或细胞在载体上的载量。最后以清水洗涤载体数次，干燥。

在酶或细胞的固定化过程中，载体的挤压操作可以手工进行，也可以用专门的器械或机器完成；上述缓冲液的 pH值应兼顾酶的最佳活性及保证酶蛋白与凝絮剂分子的表面电荷相反；一般而言，所用酶蛋白浓度为 0.3-30% ( W/V) 或细胞浓度为 1-50% ( V/V) , 凝絮剂的浓度为 0.01%-30% ( V/V) ，交联剂的浓度为 0.01%-30% ( V/V) 。凝絮剂一般为阳离子大分子，如壳聚糖、聚乙烯亚胺（PEI) 、羧甲基聚乙烯亚胺 (CMPEI)等；交联剂一般为多元醛化合物（如戊二醛、双醛淀粉、双醛葡聚糖等）。不同的絮凝剂或交联剂可单独使用，也可混合使用。为了节约酶的用量并提高酶的活力回收，可在酶液中添加非酶蛋白，如血清蛋白、卵清单白、乳清蛋白、奶酪蛋白等。此外，根据不同产品的具体需要，在酶或细胞的固定化过程中可以添加其它成分或增加有关步骤以改善产品的性能，如活性、稳定性、通透性、特异性及外观特征等。

本发明所制备的颗粒状固定化酶 /固定化细胞可用于悬浮搅拌反应，也可用于填充式反应柱；本发明所制备的片状产品可卷绕成为圆柱形卷轴结构，直接构成反应柱。这种卷轴结构的产品可以作为模块上下堆积安装在生化反应器内，也可直接包裹后单独或相互拼接组合而成直径和长度可以调节的柱子用于工业生产。

本发明所制备的片状产品在卷绕的过程中，依借卷绕动作本身所产生的张力和持续外加的压轴挤压力导致多孔材料适当被压縮。因而此一卷绕的过程既是圆柱状结构的形成过程，也是压缩多孔材料的过程。根据应用需要，通过改变压轴的作用压力可以改变卷轴结构的松紧程度；通过改变卷绕的圈数或卷绕材料的厚度可以控制卷轴结构的直径；通过改变卷绕材料的宽度或直接对卷轴结构进行裁切可以控制卷轴圆柱体的高度。

本发明所述的圆柱形卷轴结构的柱状面可以用适当的包裹材料密封固定，以防止卷绕结构松脱。在产品用于填充反应柱套时，如果固定化酶产品本身不具备吸水膨胀的特性，此包裹材料应具备吸水膨胀的特性，如干的 PVA海绵及木浆海绵，以便于在反应床充水后消除模块的柱面与柱子的壳体内壁之间可能存在的间隙，该间隙也可用颗粒材料填实。圆柱形卷轴结构在无柱套的条件下单独或相互拼接而直接构成实体柱子应用时，其包裹材料应具防水和保温特性，如聚氨酯泡沬塑料，以减少能耗。另一方面，如果圆柱形卷轴结构在灌流应用的过程中会发生收缩而体积变小，则要求作为床壁的包裹材料具有持续的收缩抱紧功能，如橡胶或含橡胶的材料，以免柱子在运行的过程中会逐渐形成床壁间隙。

圆柱形卷轴结构直接或拼接应用时，柱体的两端应配有用于连接柱体和管路的接口装置。该接口装置可以具有液体过滤功能，并能有效地将液体向柱体输入和输出。圆柱形卷轴结构拼接应用时，为防止液体自模块之间的连接处渗出，模块之间应有防止液体渗漏的密封胶带。

以下用具体的实例对本发明作进一步的说明。

实施例 1. 有机多孔材料的水自然湿润速率

将干燥的有机多孔材料切割成边长为 5cm 的立方体，轻轻置于水深为 20cm 的蒸馏水面并立即开始计时。测试在 10分钟或整块受试材料完全被湿润后结束。在此条件下，有机多孔材料被润湿的部分 (包括沈入水中的部分)垂直于水面的高度（毫米）与其被润湿所花费的时间 (秒）的比值被定义为该材料的水自然湿润速率。本实施例测试了大量有机多孔材料，部分结果列于下表 1。

表 1

润湿能否均比重

名称型号来源速率匀固定

(g/cm³)

(mm/s) 细胞聚酯海绵 ST33 深圳联达海绵厂 0.0501 <0.01 否聚氨酯海绵 DL68 深圳联达海绵厂 0.0314 <0.01 否聚氨酯海绵 L338 深圳联达海绵厂 0.0213 <0.01 否聚氨酯海绵 A230 深圳联达海绵厂 0.0186 <0.01 否聚氨酯海绵 - 美国 Stepan公司 0.0250 <0.01 否聚氨酯海绵 - 新加坡益展工业有限公司 0.0365 <0.01 否涤纶纤维丝 - 深圳联达海绵厂 0.0351 0.044 否

PVA海绵 - 深圳俊鸿实业有限公司 0.1 191 0.483 能木浆海绵 - 香港 3M公司 0.0830 1.75 能三聚氰胺海绵 - 珠海天虹特殊海绵厂 0.0080 12.50 能实施例 2. 表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒的制备 1 根据 pGEMT-Easy(Promega)的序列设计 PCR引物，具体为：上游引物 RBS-Ndel:

5 '-CATATGTATATCTCCTTCTTGTGTGAAATTG-3，；

下游引物 RBS-AlwNI:

5'-CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTC-3'

以 pGEMT-Easy(Promega) 为模板，用上述引物进行 PCR，扩增得到一 755bp产物。 PCR条件为： 50 ng pGEMT-Easy(Promega) , 0.4 μΜ RBS-Ndel, 0.4 μΜ RBS- AlwNI, 50 μΜ dATP, 50 μΜ dTTP, 50 μΜ dCTP, 50 μΜ dGTP, 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KC1, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0.1% Triton X-100， 2.5 U Pfu DNA聚合酶 (Promega),用无菌水调反应体积至 50 μί。 PCR扩增反应程序为： 94。C， 5分钟； 94 °C， 1分钟， 50 °C， 1分钟， 72 °C， 4分钟，循环 35次； 72 °C, 10分钟。该 PCR产物 (755bp)在 5'端含有 Ndel酶切位点和核蛋白体结合位点及在 3'端含有 AlwNI酶切位点。用 0.8%琼脂糖电泳提纯， Ndel和 AlwNI酶切后，与经 Ndel和 AlwNI酶切的 pRSETA(Invitrogen) 连接，得 pRSET-lac。用 AlwNI和 EcoRI酶切 pRSET-lac和 pRSET-kan (中国专利申请公布号: CN1680558A), 用 0.8%琼脂糖电泳提纯各 DNA片段并连接，得 pRSET-lac-kan 。

按照中国专利申请公开号: CN1702172所公开的制备葡萄糖异构酶突变体的方法，以 pGEMT-MGI-4为模板，分别以 T1和 87LR、 87LF 和 217GR、 217GF和 260AR、 260AF和 T2 为引物对 (均见表 2)，进行 PCR合成，得到编码含有 F87L、 W139F, R182A、 F187S、 V217G、 D260A 和 T299Q共七个点突变的葡萄糖异构酶突变体的基因 MGI4-35。用 Ndel 和 EcoRI 酶切 MGI4-35后，与经 Ndel和 EcoRI 酶切的 pRSET-lac-kan 连接，得到 pRSET-lac-MGI4-35-kan。所得载体 pRSET-lac-MGI4-35-kan 的完整序列列于序列表中的序列 1。

表 2

引物对

87LR: 5'AAAAACTCCAGTGCTGCTTCTACCCTTGCTTTC 3，

87LF: 5 ' GAAGC AGC ACTGGAGTTTTTTGATAAGATAA 3，

217GR: 5'GCATAGTCGCCAGCCATGTGCAAAAATCTT 3'

217GF: 5'ACATGGCTGGCGACTATGCAAAGGAAATCG 3'

260AR: 5'AAATATTTCGCAAGGTCGTATTTTCTCAAG 3'

260AF: 5'ACGACCTTGCGAAATATTTCAAAGTAAATA 3'

T2: 5'ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTATTCTGCAAACAAATAC 3 '

然后将 pRSET-lac-MGI4-35-kan转化大肠杆菌 BL21 (DE3 ) pLysS。按 1%比例接种至 70L LB液体培养基 (含 50 mg/L卡那霉素)中， 37 C培养该含葡萄糖异构酶突变体 MGI4-35的大肠杆菌 36小时。离心得湿菌体 670g，并悬浮于一倍菌体重量的纯水中。

将干燥的 PVA海绵（购自浙江省宁海县好帮手日用品有限公司）切成约 15mm³ 的颗粒，取 PVA海绵颗粒 6g置尼龙纱网袋中，再将网袋置塑料袋中，加菌液 40ml于海绵颗粒中，反复挤压混合至少 3分钟使菌液在颗粒上分布均匀；加 0.5% (w/v) pH 7.0的 PEI (购于 Sigma Chemicals, St. Luis, USA)溶液 40ml, 反复挤压混合至少 3分钟；加 0.5% (v/v) 的戊二醛 (购于广东汕头市西陇化工厂）溶液 40ml，反复挤压混合至少 5 分钟,然后将网袋从塑料袋取出，挤压除去液体，以水挤压洗涤 3次， .除去未被吸附的液体后，流动空气干燥 5-10小时，得表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒 l lg。基本参照文献 ( Disc e et al.， 1951, J. Biol. Chem, 192:583-587； Nakamura, 1968， Agr. Biol. Chem.32:701-706 ) 所报道的酶活力测定方法，测定本实施例制得的固定化细胞的比活力。具体为，精密称取 0.5-2mg 按上述方法制备的表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒，加 36%(w/v)葡萄糖溶液（含 0.25 mM 氯化钴， 5 mM氯化镁， 20mM 磷酸盐， pH6.5 ) lml, 75°C振摇反应 10分钟，置冰浴终止反应。在此条件下每分钟催化 1 微摩尔的葡萄糖转化为果糖所需的酶量被定义为一个葡萄糖异构酶活力单位。经测定实施例 2制得的固定化细胞的比活力为 2,540 U/g o

实施例 3. 表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒的制备 2 按实施例 2制备菌液 40ml,加 0.25mM 氯化钴溶液 6ml,混匀。将木浆海绵（香港 3M公司）洗净，除去可能含有的表面活性剂，将海绵切成约 15mm³ 的颗粒，干燥后取海绵颗粒 4g置尼龙纱网袋中，再将网袋置塑料袋中，加含氯化钴的菌液 46ml于海绵颗粒中，反复挤压混合至少 3分钟使菌液在颗粒上分布均匀；加 2.5%的 PEI溶液 (pH7.0)10ml, 反复挤压混合至少 3分钟；加 2.5%的戊二醛溶液 10ml，反复挤压混合至少 5 分钟,然后将网袋从塑料袋取出，挤压除去液体，以水挤压洗涤 3 次，除去未被吸附的液体后，流动空气干燥 5-10 小时，得表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒 9g。

葡萄糖异构酶的活力测定方法参照实施例 2。结果，实施例 3制得的固定化细胞的比活力为 4,442 U/g

实施例 4. 表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒的制备 3 按实施例 2制备菌液。开孔的三聚氰胺海绵来自珠海天虹特种海绵厂,开孔率 >95%。将三聚氰胺海绵切成约 15mm³ 的颗粒，干燥后取海绵颗粒 2.67g置尼龙纱网袋中，再将网袋置塑料袋中，加菌液 80ml于海绵颗粒中反复混合至少 3分钟使菌液在颗粒上分布均匀；加 0.5%的 PEI溶液 (pH7.0)160ml, 反复挤压混合至少 3 分钟，挤压除去未被吸附的液体；力 Π 0.5%的戊二醛溶液 160ml，反复挤压混合至少 3分钟,然后将网袋从塑料袋取出，挤压除去液体，以水挤压洗涤 3次，除去未被吸附的液体后，流动空气干燥 5-10小时，得表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒 13g。

葡萄糖异构酶的活力测定方法参照实施例 2。结果，实施例 4制得的固定化细胞的比活力为 5,544 U/g。

实施例 5. 表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒的制备 4 按实施例 2制备菌体细胞，将细胞悬浮于 5倍菌体重量的纯水中。将三聚氰胺海绵切成约 15mm³ 的颗粒，取海绵颗粒 10g置尼龙纱网袋中，按以下顺序操作： a) 将海绵颗粒浸泡于 1000ml菌液中至少 3 分钟后取出，挤压海绵除去未被吸附的液体； b) 加 0.1%的 PEI 溶液 (pH7.0) 100ml, 反复挤压混合至少 3分钟，挤压除去未被吸附的液体； c) 加 0.1%的戊二醛溶液 100ml，反复挤压混合，静置 3分钟后，挤压除去未被吸附的液体； d) 重复步骤 &至0 5次，然后以水挤压洗涤 3次，挤压除去未被吸附液体后，流动空气干燥 5-10 小时，得表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒 56g。

葡萄糖异构酶的活力测定方法参照实施例 2。结果，实施例 5制得的固定化细胞的比活力为 6,150 U/g。

实施例 6.表达戊二酰 7-氨基头孢烷酸酰化酶固定化大肠杆菌细胞颗粒的制备 1

pT7-kan-ACY的构建:根据已知的假单孢菌 SE83戊二酰 -7-氨基头抱霉烷酸酰化酶 DNA序列 (Matsuda, A. et al., 1987, J. Bacteriol. 169, 5821-5826) , 设计 PCR上游引物 Ndel-ACY:

5，-CATATGAACGCTCCCGTCCCCGTCCC-3，，和 PCR下游引物 Bglll-ACY: 5'-AGATCTTCAGATGGTGAAGCGGGCAC-3'。

以假单孢菌 SE83 DNA为模板，用上述引物进行 PCR, 扩增得到一 l,676bp产物。 PCR条件为： 50 ng假单孢菌 SE83 DNA， 0.4 μΜ Ndel-ACY, 0.4 μΜ Bglll-ACY, 50 μΜ dATP, 50 μΜ dTTP, 50 μΜ dCTP, 50 μΜ dGTP, 20 mM Tris-HCl (pH 8.8 ) , 10 mM KC1， 10 mM (NH₄)₂SO₄， 2 mM MgSO₄， 0.1% Triton X-100, 2.5 U Pfu DNA 聚合酶 (Promega) ，用无菌水调反应体积至 50 L。

PCR扩增反应程序为： 95°C， 5分钟； 94°C， 1分钟， 50°C， 1分钟， 72°C， 3分钟，循环 35次； 72°C， 10分钟。该 PCR产物（l,676bp) 在 5'和 3'端分别含有 Ndel和 Bglll酶切位点。 PCR产物经 0.8%琼脂糖电泳提纯， Ndel和 Bglll酶切后，与经 Ndel和 Bglll酶切的 pRSET-kan 连接，得 pT7-kan-ACY，具体序列示于序列表中的序列 2。将 pT7-kan-ACY转化感受态大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS (Novagen) ，得菌株 BL-T7K-ACY。

以含卡那霉素 (50mg/L)的 20L LB液体培养基，在 37Ό培养大肠杆菌 BL-T7K-ACY24小时，离心收集菌体，得湿菌体细胞 235g，将细胞悬浮于 5倍菌体重量的纯水中。

将三聚氰胺海绵切成约 15mm³ 的颗粒，取海绵颗粒 10g置尼龙纱网袋中，按以下顺序操作： a) 将海绵颗粒浸泡于 1000ml菌液中至少 3 分钟后取出，挤压海绵除去未被吸附的液体； b) 加 0.1%的 PEI 溶液 (pH7.0) 100ml, 反复挤压混合至少 3分钟，挤压除去未被吸附的的液体； c) 加 0.1%的戊二醛溶液 100ml，反复挤压混合，静置 5分钟后，挤压除去未被吸附的的液体； 5次重复步骤&至 (；，以水挤压洗涤后，挤压除去未被吸附的液体后，流动空气干燥 5-10小时，得表达 GL-7-ACA酰化酶固定化大肠杆菌细胞颗粒 50g。

检测基本按 Binder, R. et al, (1994, Appl. Environ. Microbiol. 60, 1805-1809)所述的方法，来测定固定化表达 GL-7-ACA酰化酶大肠杆菌细胞的比活力。具体为，取 18g制备的固定化 GL-7-ACA酰化酶细胞颗粒悬浮于 600 ml 75mM戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸溶液（含 25mM磷酸钠， pH8.0) 中（戊二酰 -7-氨基头抱霉烷的制备方法参见 Shibuya, Y. et al.,(1981, Agric. Biol. Chem. 45, 1561-1567), 在 37 °C下搅拌反应 (搅拌速度为 450转每分钟)，并用 5N氢氧化钠维持 pH在 8.0。反应开始后在不同时间 (0， 10， 20分钟)抽取 60 μΐ:样本，与 30 10%三氯醋酸混匀以终止反应。离心（10,000g， 3分钟），取 10 上清液混合 990 HPLC 流动相 (50mM磷酸钾， pH7; 5%乙腈)。用 HPLC检测酶反应。 HPLC 条件如下： HPLC 色谱柱： Diamonsil™C18， 250x4.6mm (迪马公司，北京)；柱温度： 30°C ; 流速： lmL每分钟；检测： 260nm。一单位戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶活性定义为在上述条件每分钟转化一微摩尔戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸至 7-氨基头孢霉烷酸的酶量。经测定，实施例 6制得的固定化细胞在初始 10分钟内的比活力为 140.8 U/g。

实施例 7.表达腺苷蛋氨酸合成酶固定化大肠杆菌细胞颗粒的制备根据 GENBANK NC— 000909设计引物 SAM-F和 SAM-R。

SAM-F为 5，AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATACA

TATGAGAAACATAATTGTAA 3，；

SAM-R 为 5， ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTAGAATGTAGTTACTT TTCCTTCA 3，。利用引物对 SAM-F和 SAM-R从 Methanococcus jannaschii JAL-1 ATCC 43067(购自 ATCC, USA) 中扩增 S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因。扩增条件为： 20mM Tris-HCl (PH8.8), 10mM KCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 0.1% Triton X-100, 50uM dATP, 50uM dTTP, 50uM dCTP, 50uM dGTP, 400nM SAM-F, 400uM SAM-R, 4.5U Taq DNA聚合酶（购自 Promega, USA)，再用无菌水把反应体积调至 50 μ1。 PCR 扩增反应程序为： 95°C 3分钟， 40圈循环 (95°C 50秒、 50°C 30秒和 72°C 1 分钟。：)，最后 72°C 10分钟。将扩增的产物 (长约 1.3KB)克隆至载体 pRSET-lac-kan，将连接产物转化大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS并于 LB (含 50 mg/L卡那霉素)平板培养过夜，挑出单个克隆。

按 1%接种量在 50L LB液体培养基 (含 50 mg/L卡那霉素) 37°C培养上述表达 M. jannaschii S-腺苷甲硫氨酸合成酶的大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 40小时后，离心得湿菌体 480g, 将菌体悬浮在于 5倍菌体重量的纯水中。

将三聚氰胺海绵切成约 15mm³ 的颗粒，取海绵颗粒 10g置尼龙纱网袋中，以下按顺序操作： a) 将海绵颗粒浸泡于 1000ml菌液中 3分钟后取出，挤压海绵除去未被吸附的液体； b) 加 0.1%的 PEI 溶液 (pH7.0)100ml, 反复挤压混合至少 3分钟，挤压除去未被吸附的液体； c) 加 0.1%的戊二醛溶液 100ml,反复挤压混合，静置 5分钟后，挤压除去未被吸附的液体； d) 重复步骤 a至 c 3次，以水挤压洗涤后， 70°C热水处理 30分钟，挤压除去未被吸附的液体后，流动空气干燥 5-10小时，得表达腺苷蛋氨酸合成酶固定化大肠杆菌细胞颗粒 50 g。

酶活力之测定参照 George D. Markham et al,(1980, Journal of Biological Chemistry, 255, 9082-9092)所述的方法。具体为，在 500 μΐ 反应液（2mM ATP, 8mM L-甲硫氨酸， 20 mM MgCl₂, lOOmM KC1, lOOmM Tris-Cl pH8.3 ) 中，加入 15mg固定化细胞，在 58°C下震荡反应反应 20分钟后，加入 300 μΐ 之 10%三氯醋酸终止反应，离心除去沉淀，收集上清用 HPLC 测定其中之 SAM含量。 HPLC测定参照 US Patent No. US6881837 (色谱柱： C18, 4.6mm x 250mm, Beckman Coulter, USA; 缓冲液： 0.02M 柠檬酸， 0.01M 磷酸二氢钠；流动相： a.含有 0.4% SDS 的缓冲液； b乙腈， a与 b的比例为 56: 44；流速： 1.5 ml/分钟; 检测波长： 260nm) 。经测定，实施例 7制备的固定化细胞的比活力为 0.6U/g。

实施例 8. 固定化 D-氨基酸氧化酶颗粒的制备

按下列方法制备 BL-HS-GHA [含有重组 D-氨基酸氧化酶 GHA 的 E. coli BL21 ( DE3 ) pLysS]菌体。

BL-HS-GHA的来源：

根据已知的 Thermoanaerobacterium saccharolyticum glucose isomerase DNA序列（GenBank L09699), 设计 PCR引物，具体为：

上游引物：

5， - AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATAC ATATG AATAAATATTTTGAGA

下游引物：

5'-ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTATTCTGCAAACAAATAC 以 Thermoanaerobacterium saccharolyticum (购自 ATCC, USA) DNA 为模板，用上述引物进行 PCR，扩增得到一 l,376bp产物。 PCR条件为： 50 ng T. saccharolyticum DNA, 0.4 μΜ GI-Ndel, 0.4 μΜ GI-EcoRI, 50 μΜ dATP, 50 μΜ dTTP, 50 μΜ dCTP, 50 μΜ dGTP， 20 mM Tris-HCl (pH 8.8)， 10 mM KCl， 10 mM (NH₄)₂S0₄, 2 mM MgSO₄ , 0.1% Triton X- 100， 2.5 U Platinum Taq High Fidelity DNA聚合酶 (Invitrogen)，用无菌水调反应体积至 5() L。 PCR扩增反应程序为： 95 °C， 5分钟； 94 °C， 1分钟， 50 °C, 1分钟， 72 °C， 3分钟，循环 35次； 72 °C， 10分钟。 PCR产物经 0.8%琼脂糖电泳提纯，利用 TA克隆方法，与 pGEMT-Easy(Promega) 连接，得 pGEMT-Easy-GI。用 Ndel和 EcoRI酶切 pGEMT-Easy-GI，经 0.8%琼脂糖电泳提纯，与经 Ndel和 EcoRI酶切的 pRSET-lac-kan连接，得 pRSET-lac-GI-kan。根据已知 hok/sok基因片段序列 (GenBank X05813) 设计 10条引物 (见表 3)。PCR基因构造根据 Kikuchi, M. et al, 1999, Gene 236:159-167所述，唯具体步骤有变更。 PCR条件为： 20 ng 各个引物， 50 μΜ dATP, 50 μΜ dTTP, 50 μΜ dCTP, 50 μΜ dGTP, 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl， 10 mM (NH₄)₂SO₄， 2 mM MgSO₄， 0.1% Triton X-100， 2.5U Pfu DNA聚合酶 (Promega),用无菌水调反应体积至 50 μί。 PCR扩增反应程序为: 95 °C， 4分钟; 94 °C, 1.5分钟， 50 °C, 1.5分钟， 72。C， 5分钟，循环 30次； 72 °C， 10分钟。取 PCR扩增反应混合物 5 作模板，引物 1和 10，依上述条件再次 PCR扩增，得一 PCR 产物长 580 bp, 在其 5'和 3'端分别含有 Ascl及 EcoRI酶切位点。 PCR 产物经 0.8%琼脂糖电泳提纯， Ascl及 EcoRI酶切后，与经 Ascl及 EcoRI 酶切的 pRSET-lac-GI-kan连接，得 pRSET-lac-GI-hok/sok-kan。序号引物序列

5 ' -ttggcgcgccttaagatatcaacaaactccgggaggcagc

1

gtgatgcggcaacaatcacacggatttcccgtgaa-3'

5 '-catatacctgcacgctgaccacactcactttccctgaaaa

2

taatccgctcattcagaccgttcacgggaaatccgtgtga-3'

5， -ggtcagcgtgcaggtatatgggctatgatgtgcccggcgc

3

ttgaggctttctgcctcatgacgtgaaggtggtttgttgc-3'

5 ' - cgtggtggttaatgaaaattaacttactacggggctatct

4

tctttctgccacacaacacggcaacaaaccaccttcacgt-3'

5'-aattttcattaaccaccacgaggcatccctatgtctagtc

5

cacatcaggatagcctcttaccgcgctttgcgcaaggaga-3'

5 ' -tgagacacacgatcaacacacaccagacaagggaacttcg

6

tggtagtttcatggccttcttctccttgcgcaaagcgcgg-3'

5 ' -tgtgttgatcgtgtgtctcacactgttgatattcacttat

7

ctgacacgaaaatcgctgtgcgagattcgttacagagacg-3'

5 ' -cgcctccaggttgctacttaccggattcgtaagccatgaa

8

agccgccacctccctgtgtccgtctctgtaacgaatctcg-3' 5'-taagtagcaacctggaggcgggcgcaggcccgccttttca

9

ggactgatgctggtctgactactgaagcgcctttataaag- 3 '

5 ' -cggaattcacaacatcagcaaggagaaaggggctaccggc

10

gaaccagcagcccctttataaaggcgcttcagt-3'

用 Ndel和 Bglll酶切质粒 pRSET-kan-DAOGHA (中国专利申请公开号: CN1680558A),得一 l,074bp基因片段（内含 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA 基因），经 0.8%琼脂糖电泳提纯，与经 Ndel 和 Bglll 酶切的 pRSET-lac-GI-hok/sok-kan得到的长片断连接，得 pHS-GHA (见序列表中的序列 3)。将 pHS-GHA 转化感受态大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS (Novagen) ，得菌株 BL-HS-GHA,

制备 BL-HS-GHA [含有重组 D-氨基酸氧化酶 GHA的 E. coli BL21 (DE3 ) pLysS]菌体的方法

从卡那霉素（50 g/mL ) LB 琼脂平板上挑取单菌落大肠杆菌 BL-HS-GHA, 接种到 2x5 mL含卡那霉素（50 g/mL) 的液体 LB培养基，在 37°C培养 8小时（摇床转速为 250转每分钟），再接种至 2x50 mL种子培养基含卡那霉素（ 100 g/mL)和氯霉素（40 g/mL)，在 30°C 培养 16小时（摇床转速为 400转每分钟）。

玉米浆 1之制备：

将 300 g玉米浆（购自华北制药康欣有限公司）溶于 300 mL蒸馏水，搅拌后离心（5,000 g， 8分钟），上清液即为玉米浆 1。沉淀物留用。

玉米桨 2之制备：

将上述沉淀物再溶于 600 mL蒸熘水，搅拌后离心（5,000 g， 8分钟），上清液即为玉米桨 2。

50 mL种子培养基中各成分重量如下：

玉米浆 1 4 mL

玉米浆 2 4 mL

酵母浸膏 0.2 g

硫酸铵 0.075 g

磷酸氢二钠 0.25 g 磷酸二氢钾 0.04 g

氯化钠 0.075 g

将各成分溶于 50 mL蒸熘水，以 10 N氢氧化钠调 pH值至 7.15, 高温消毒。

种子过夜发酵后，将全部 100 mL 之种子接种至 2 L 发酵罐 (BIOENGINEERING, Benchtop Fermentor, KLF2000 )含卡那霉素（50 g/mL) 。

2L发酵培养基中各成分重量如下：

玉米浆 1 160 mL

玉米浆 2 160 mL

酵母浸膏 8 g

硫酸铵 3 g

磷酸氢二钠 10 g

磷酸二氢钾 l g

氯化钠 3 g

将各成分溶于 1.9 L蒸馏水，以 IO N氢氧化钠调 pH值至 7.15，于 2 L发酵罐（BIOENGINEERING, Benchtop Fermentor, KLF2000) 高温消毒。

将 12.5 g葡萄糖溶于 50 mL蒸馏水，高温消毒；将 1.25 g硫酸镁溶于 50 mL蒸馏水，高温消毒。

发酵前把已消毒的葡萄糖和硫酸镁放进 2 L发酵罐。

补料之制备：

将 250 mL玉米浆 1和 250 mL玉米浆 2混合，以 10 N氢氧化钠调 pH值至.7.25，高温消毒。

将 2.25 g硫酸铵， 7.56 g磷酸氢二钠， 1.2 g磷酸二氢钾， 2.25 g氯化钠溶于 60 mL蒸馏水，高温消毒。

将 15 g酵母浸膏溶于 100 mL蒸馏水，高温消毒。

将 70 g葡萄糖溶于 140 mL蒸馏水，高温消毒。

将 30 mL甘油混合 10 mL蒸熘水，高温消毒。

将 20 g硫酸镁溶于 30 mL蒸馏水，高温消毒。将所有溶液混合，加入卡那霉素至浓度为 50 g/mL，加入 2 mL消泡剂。

在 35°C生长，在初始的 6小时， pH值由 6.9 自然上升至 7.2，开始补料（50 mL/小时）。在平衡条件下（以 5 N氢氧化钾将 pH值维持在 7.2，溶氧水平 pO2不大于 0.5%) ，继续生长 26小时。

在发酵罐发酵后，细菌在 4°C经离心机分离 (5,000g， 8分钟)，弃上清液，得沉淀 198g，将沉淀重悬于 600mL 磷酸钠缓冲液 (50mM， pH7.5)。用珠磨法裂解细菌，以 50mL每分钟之速度把细菌重悬液送进珠磨机 (DYNO-MILL TYP KDL， 0.2mm直径玻璃珠， WA Bachofen)内，最后再以 800mL 磷酸钠缓冲液 (50mM， pH7.5)把细菌残留冲洗出来。将细菌裂解液在 55 °C水浴中浸泡 30分钟，以高速离心（10，000g， 30 分钟)，取上清液，即为粗纯之重组 D-氨基酸氧化酶 GHA。 D-氨基酸氧化酶的纯化基本按 Alonso, J., Barredo, J.L., Diez, B.， Mellado, E.， Salto, F.， Garcia, J.L., Cortes, E. (1998, Microbiology 144:1095-1101) 所述。提取之粗纯重组 D-氨基酸氧化酶 GHA，加入甘油至最终浓度为 10%，用 5N氢氧化钠调 pH值至 8，离心 (13,000g， 30分钟)，取上清液。按产品供货商所述制备法制备 DEAE-纤维素离子交换树脂 (Sigma， D-0909)。按每 lmL粗纯酶混合 0.5mL DEAE-纤维素离子交换树脂，在 4 °C搅拌 5小时（100转每分钟），用滤斗 (Buchner filter funnel, 120mm PI)将酶液滤去。以 3倍 DEAE-纤维素离子交换树脂体积之 40mM磷酸二氢钠缓冲液 (含 10%甘油)冲洗 DEAE-纤维素离子交换树脂，再用 2倍 DEAE- 纤维素离子交换树脂体积之 400mM磷酸二氢钠缓冲液将重组 D-氨基酸氧化酶 GHA洗脱出来。按每 1L洗脱之重组 D-氨基酸氧化酶 GHA，加入 262g硫酸铵，在室温搅拌 15分钟 (100转每分钟）。离心（13,000g， 15 分钟)，弃上清液，保留沉淀物。将沉淀物溶于 20mM磷酸二氢钠缓冲液 (pH7.5)后以 Millipore YM30滤膜超滤除去剩余硫酸铵，将酶液浓缩至 25mg/ml。用 SDS-PAGE检测蛋白质的纯度。取酶液 25mg/ml的 D- 氨基酸氧化酶溶液 25ml，加牛血清白蛋白（卵清蛋白） 3.75g，加水 112.5ml, 搅拌均匀，得稀释酶液。

取三聚氰胺海绵切成约 15mm³ 的颗粒，取海绵颗粒 5g置尼龙纱网袋中，按以下顺序操作： a) 加稀释酶液 50ml于海绵颗粒中充分挤压混合均匀； b) 加 0.05%的 PEI溶液 (pH7.0)400ml，反复挤压混合至少 5分钟，挤压除去未被吸附的液体； c) 加 0.05%的戊二醛溶液 400ml, 反复挤压混合，静置 5分钟后,挤压除去未被吸附的液体； d) 重复步骤 a 至 c 3次，然后以水挤压洗涤 3次，挤压除去未被吸附液体后，流动空气干燥 5-10小时,得表达 D-氨基酸氧化酶固定化大肠杆菌颗粒 30g。

D-氨基酸氧化酶的活力测定基本参照文献 Isogai, T.， Ono, H.， Ishitani, Y.， Kojo, H.， Ueda, Y.， Kohsaka, M. (1990, J Biochem [Tokyo]. 108, 1063-1069) 所述，具体步骤略有变更。具体为，取表达 D-氨基酸氧化酶固定化大肠杆菌颗粒 5克悬浮在 75 mM头孢菌素 C钠盐水溶液中，加氧在 22°C振荡反应 60分钟。反应开始后在不同时间（0、 15、 30分钟）抽取 100 μΐ反应液与 10 μΐ 3% 过氧化氢混匀，再加入 50 μΐ 10% 三氯醋酸，混匀以终止反应。将终止反应液离心（10,000 g, 3 分钟），取 10 μΐ上清液和 990 μΐ HPLC流动相混合，上 HPLC柱检测。 HPLC 色谱柱： Diamonsil ^TM C18, 250 x 4.6 mm (迪马公司，北京）；流动相： 50 mM K₂HP0₄/KH₂PO₄ ( H 7.0), 5% 乙腈；柱温度： 30。C; 流速： 1 ml/min_; 检测： 260 nm UV。一单位酶活性定义为在上述条件每分钟转化一微摩尔头孢菌素 C为戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸的酶量。经测定，实施例 8制备的固定化酶在初始 15分钟内酶比活力为 156 U/g。

实施例 9. 表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞片带的制备按实施例 2制备菌体细胞，将细胞悬浮于 5倍体积的纯水中。将三聚氰胺海绵切割成 0.5x 10x 120cm的片带 (4.8g)。以下按顺序操作： a) 将海绵片带浸入细胞悬液中，挤压海绵使菌液在海绵中均匀分布，将海绵通过对滚轴挤压除去海绵上未被吸附的菌液，调节两挤压轴的间隙使海绵上所粘附的菌液约为 200g; B)向海绵加入 500ml 0.1% PEI (pH7.0)溶液，挤压海绵使 PEI分布均勾，海绵再次通过对滚轴以除去未被吸附的液体； c) 向海绵加入 500ml 0.1%戊二醛溶液，挤压使戊二醛分布均匀并除去未被吸附的液体,静置 5分钟。 d) 重复步骤 a至 c 5 次，每次重复步骤 a时，调节两对滚轴间的间隙使海绵再次携带的菌液量约为 100g，然后以水挤压洗涤 1 次，挤压除去未被吸附的液体后，流动空气干燥 5-10小时,得表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞片带 24g。从所制备的表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞片带上剪取少量样品参照实施例 2的方法测定活力，测定酶比活力为 6,608 U/g。

实施例 10. 表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞卷轴状圆柱的制备

将实施例 9制得的固定化细胞片带之一部分 (3.5g)在一圆柱形实体内芯（附图 1， a)上卷绕成直径 1.8cm、高 9.6cm的圆柱（附图 1， b)。卷绕前将海绵片带的两末端削切成斜面，使卷绕的始末两端与内芯或外壁不形成间隙。其柱面以宽约 4cm的橡胶带缠绕（附图 1 , c) 。两个接口装置（附图 1， d) 被橡胶带缠绕固定于柱体的两端。两端涂以密封用的玻璃胶，接上硅胶管（附图 1 , e) 后，整个柱体用聚氨酯保温材料（附图 1， f) 封裹。

向上述固定化细胞柱通入 75 °C的 50%(w/v)的葡萄糖浆（含 2.5mM 磷酸盐、 0.5mM MgCl₂， 0.05mM CoCl₂, ρΗ6.5 )，初始流速为 1.62ml/min, 流出物的果糖含量为总糖量的 51.6%; 144 小时后流速为 1.63 ml/min时, 流出物的果糖含量为总糖量的 45.6%。

按本发明制备的圆柱形卷轴结构的产品用于填充柱子时，其装卸过程比颗粒状的固定化酶简单高效，这一优势在大规模生产时尤其显得突出。卷轴结构的无柱套应用对节约固定成本投资也是显而易见的。而且，由卷轴结构单独构成的反应柱子可以随意并联或串联，或由卷轴结构拼接而成的反应柱子的长度和数目可以随意调节，使得生产规模可以很方便地根据需要扩大或缩小。其次，反应柱子在使用过程中，柱子内的酶分子会逐渐失去活力，越靠近底物进口端位置的酶分子失活越快，因而柱子在使用一段时间之后，其两端的活力会有显著的差异。本发明可以很方便地用新的高活力的反应柱置换失活严重端的反应柱。如此可有效调节整个柱子的使用寿命和生产效率。这一点，现有的颗粒状固定化酶产品就无法做到。

实施例 11 固定化葡萄糖异构酶网格片带的制备

按实施例 2制备菌体细胞，将细胞悬浮于 3倍体积的纯水中,以高压匀质机 (Niro Soavi S.P.A., Type SlOOlL 2K) 破碎细胞，破碎液经 80°C热处理 5分钟，离心，上清液经 10000分子量超滤膜超滤浓缩至蛋白浓度为 15mg/ml，得粗纯之葡萄糖异构酶液。

取上述粗纯之葡萄糖异构酶液 650ml，加 1%戊二醛溶液 65ml，缓慢搅拌 30分钟，得醛化葡萄糖异构酶液。

将三聚氰氨海绵切割成 0.5x50x 125cm ( 3.25g) 的片带状。以下按顺序操作： a) 向海绵片带加入 130ml上述醛化葡萄糖异构酶液，挤压海绵片带使液体在海绵中均勾分布； b) 向海绵片带加入 130ml 0.25% PEI溶液，反复混合挤压海绵，使其中的酶液与 PEI均匀分布并充分反应，混合挤压至海绵中挤出的液体完全澄清后，再挤压除去海绵中的液体； c) 重复步骤 a) 至 b) 4次，最后以水挤压洗涤 2次，挤压除去未被吸附的液体后，流动空气干燥 5-10 小时,得葡萄糖异构酶网格片带 21.6g，比活力为 6,330 U/g。葡萄糖异构酶的活力测定方法参照实施例 2中所提及的方法。

本专利申请中引用的各种文献的全部公开内容，无论是专利文献还是非专利文献，全部以引用方式并入本文。另外，本发明不受上述具体实施例描述的限制。本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变，这些改变也在本发明的范围之内。

Claims

权利要求书

1. 一种用于制备固定化酶或固定化细胞的载体，其特征为开孔的多孔有机泡沬材料。

2. 根据权利要求 1所述的载体，其具有至少为 0.2mm/s的水自然湿润速率。

3. 根据权利要求 2所述的载体，该种载体是选自聚乙烯醇海绵、木浆海绵和三聚氰胺海绵中的至少一种海绵。

4. 根据权利要求 3所述的载体，其为颗粒状、条带状、片状、柱状或块状。

5. 一种用于固定化酶或固定化细胞的制备方法，其特征包括如下步骤：

a) 采用开孔的多孔有机泡沬材料作为固定载体；和

b) 利用凝絮交联技术将所述酶或细胞固定在所述的载体上。

6. 根据权利要求 5 所述的方法，其中所述载体具有至少为 0.2mm/s 的水自然湿润速率。

7. 根据权利要求 6所述的方法，其中所述载体是选自聚乙烯醇海绵、木浆海绵和三聚氰胺海绵中至少一种海绵。

8. 根据权利要求 7所述的方法，其中所述载体为颗粒状、条带状、片状、柱状或块状。

9. 权利要求 8所述的方法，其中，所述载体为片状载体，该载体可卷绕成为圆柱形的卷轴结构而直接构成反应柱。

10. 根据权利要求 5所述的方法，其中所述的凝絮交联技术如下完成- 用蛋白絮凝剂和多元醛化合物将酶蛋白或细胞交联凝絮沈积于载体的孔壁上。

11. 根据权利要求 10 的方法，其中所述的蛋白絮凝剂为壳聚糖、聚乙烯亚胺（PEI) 或羧甲基聚乙烯亚胺。

12. 根据权利要求 10的方法，其中所述的多元醛化合物为戊二醛。

13. 权利要求 5 所述的方法，其中所述的酶选自葡萄糖异构酶、 D- 氨基酸氧化酶、戊二酰 7-氨基头孢垸酸酰化酶或腺苷蛋氨酸合成酶。

14. 权利要求 5所述的方法，其中所述的细胞表达至少一种选自葡萄糖异构酶、 D-氨基酸氧化酶、戊二酰 7-氨基头孢垸酸酰化酶或腺苷蛋氨酸合成酶的酶。

15. 权利要求 14所述的方法，所述的细胞为大肠杆菌。