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WO2007066809A1 - タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体が導入された細胞及びその製造法 - Google Patents

タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体が導入された細胞及びその製造法 Download PDF

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Publication number
WO2007066809A1
WO2007066809A1 PCT/JP2006/324786 JP2006324786W WO2007066809A1 WO 2007066809 A1 WO2007066809 A1 WO 2007066809A1 JP 2006324786 W JP2006324786 W JP 2006324786W WO 2007066809 A1 WO2007066809 A1 WO 2007066809A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
cells
synuclein
polymer
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2006/324786
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takashi Nonaka
Sayuri Watanabe
Masami Masuda
Masato Hasegawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
Original Assignee
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research filed Critical Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
Priority to US12/086,124 priority Critical patent/US9802992B2/en
Priority to JP2007549210A priority patent/JP5665258B2/ja
Priority to EP06834541A priority patent/EP1964918B8/en
Publication of WO2007066809A1 publication Critical patent/WO2007066809A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • a coalesced tank is a coalesced tank
  • This book is a combination of cells, and cells relate to the cells into which the cells are introduced, the method of the above cells, and the drug for therapeutic drugs using the cells.
  • Characteristic pathological structures appear in transcellular cells such as Atixon's disease.
  • This physical structure is called an epigenetic in Aty's disease and a bibody in Kysson's disease.
  • the physical structure of the gap is also a structure consisting of Microemulsions are used for transepidermalization, while quies are used for bi-organs.
  • quinine In xon disease, in particular, the gene encoding quinine has been found as the causative gene in a familial pedigree. Since there is a correlation between the position of these structures and the position of nerve cells, it is considered that the abnormal structure appearing in the cells causes cell damage, which eventually leads to the death of nerve cells and the onset of the disease. It is. However, this rhythm must not be experimentally proven.
  • soluble polymers are polymerized to form insoluble agglomerates, the process of polymerization and the extent to which it extends. It has been accepted that the polymerized tanks that are capable of undergoing the growth process are accepted by Ja e JT LansbyPTJ Ce 73 055 1058 1993). It is considered that this method also applies to the aggregation and reaction of proteins that accumulate in cells, and in fact, experimental results supporting this have been obtained in vitro. However, a method of introducing it into the cell at a polymerization rate that gives damage to the cell has not yet been developed, and it is extremely difficult to actually perform it in a living cell or an experimental product. Was Of Ming
  • the target of the tank combination is to provide the method of cells and cells into which the combination has been introduced.
  • Tactile cells are cells into which the cells have been introduced.
  • ta for example, at least one selected from the group consisting of uta, aidota, qui, pogot, and 0D otaku can be exemplified. Moreover, it is preferable that the above-mentioned nerve cell guar. Clearly, it can be used as a degenerative disease.
  • Detached cells which are the progenitors of the tacrosome, which is characterized by introducing the macrophages into the neuronal cells.
  • the and / or the tacks are introduced into the neuronal cells, and the plus and the plus, which contain the genes that express the proteins, are combined with the takt polymer and the plus and negative proteins.
  • the cell tank It provides a method for neurologically affected cells, which is characterized by accumulating the body.
  • a skong of a substance that suppresses a tactile compound characterized by bringing a substance into contact with a cell.
  • a degenerative therapeutic drug which is characterized in that a substance is brought into contact with the cell.
  • Staining kit for deteriorating drug that is a substance that suppresses the presence of cells, including cells.
  • Fig. 8 is a diagram showing the introduction of qui, a polymerized quine complex into nerve SH 5.
  • Figure 3 shows the results of immunostaining with an PSe 9 body that specifically recognizes quies and observation with a microscopic microscope.
  • FIG. 4 is a diagram showing that T F cells were triple-colored with 29 an PSe bodies, T P 3, and Ravi S, and observed with the microscope.
  • Figure 5 shows the TFS and bi-body DLB) rat pieces subjected to double color with an PSe 29 and chitin, respectively, and observed under the microscope.
  • Figure 6 is a diagram showing that cells formed and were recognized in cells in which Quinplus N was introduced.
  • Figure 8 shows the result of ossy en.
  • Good to carry out Ming Below is a detailed description of the present invention. This is an explanation to explain Ming, which is given below, and it is not the intention to set Ming only in this state. As long as it does not deviate from that, it can be implemented in various forms.
  • the cells In order to create a model that can efficiently transfer cells into the brain while giving large damage to cells, and can easily analyze in the brain, the cells will be aggregated into cells, including cells, and I tried to introduce the coalescence.
  • the nerve SH 5 Using the nerve SH 5, started to build a cell device in which quies accumulate in cells. Then, it was found that the tank can physically introduce the above-mentioned protein into the cell as a method of introducing the aggregate into the cell. It was observed that the introduced tacks were oxidised and accumulated in the lysate, and the tans were found to have some of the characteristics found in patients in the cells into which the tissate was introduced.
  • Tank composites are adherent-soluble structures that appear in denatured transcellular and guar cells.
  • a tank that is a coalesced body is a coalesced body that includes a tac structure (with a structure or polymer).
  • Coalescence means the combination of proteins, and also includes the combination of molecules.
  • Qui is the cytoplasm in the cytoplasm, which is regarded as the trait of xo disease, and is considered to be the cause of quill cells.
  • neurosis Is a species of microprotein, and is called neurosis, which is represented by Athi disease, and accumulates in a large amount in nerve cells as neurogenesis.
  • Athi disease Athi disease
  • tau Athi disease
  • Toptpit's disease Similar to atixo, accumulation of neurons appears in Toptpit's disease including Chit's disease.
  • the proteins accumulated in Toptopit's disease are the ones thought to exert cellularity.
  • Poxta exists as an insoluble and soluble form of pontaku in sickle disease, but the nuclear localization of the gutta chain is a factor that contributes to cells.
  • S0D is a substance thought to exert cellularity, and is known to be accumulated in Bi bodies in atrophic dystrophy. And S0 itself is considered to have new effects.
  • Aty's disease an id tactic substance accumulates in cells. Are considered to be mutually effective although they are weak.
  • Athi disease Since the gene coincides with the p-id, it is considered to be involved in the etiology of Athi disease.
  • tank material may also accumulate in cells. As a result, the day is included as a tag to be introduced into cells.
  • the protein is a protein found to accumulate in Quite-Year disease, and is known to accumulate in nerve cells or outside. It is thought that the normal protein is converted into the pathogenic prior protein by changing the high protein structure and increasing the protein structure, which is responsible for the nerve cells.
  • the protein used in the present invention is not limited to the above-mentioned proteins, but may be a mutant of the above-mentioned proteins.
  • the variant means a protein in which several ( ⁇ 0, preferably ⁇ 5) anoic acids in the amino acid sequence of the above-mentioned amino acid have different substitution additions, and Even if it accumulates outside as a coalesced body.
  • quine variants include 30P53 and E46, which are quies found from familial Kinso family analysis. 30P is a quino (
  • N-deficient quine or quine deficient in 5 to 7 repetitive sequences, etc.
  • Quinn for example Of the quino series of quino shown in 2, the ones lacking the 131-140th amino acids can be exemplified.
  • the returned quill is the ano sequence of the quies represented by array 2 and has all or some of the 0 to 5 2 to 26 32 to 37 43 to 48 58 to 63 columns deleted. is there. 3 ⁇ Tak is
  • the protein quality of the gene that carries the protein is used for the purpose of obtaining the gene report from the ccesson number shown in, and based on the report, it can be obtained by the normal gene engineering method.
  • You can Such a gene is a DN consisting of the base sequence shown in the above-mentioned item or a fragment thereof, and is subjected to a publicly known method such as idyzation, plaque-disease, or sutherbet.
  • the cDN library can be obtained from the genomic library. For these methods, o ec a C o ng Labo ao y an a 2nded Cod p ng Ha bo P ess 1989)) can be referred to.
  • the gene for the above-mentioned protein can also be produced by a conventional chemical synthesis method or biochemical synthesis method.
  • the excised N-piece of the gene can be inserted into an appropriate expression vector to obtain a vector containing a gene encoding the protein.
  • the tank or its variant can be isolated from a neurological disorder or the like, or can be obtained by a genetic engineering method, for example, a method using a natural mutation of K nke apped dup ex.
  • kit for mutation for example,
  • Taku quality includes the above-mentioned squid quill, tau, OD, gutta, and varieties thereof.
  • the amino acids of these proteins and the gene sequences that carry these proteins are shown.
  • the gene that encodes the protein is a protein that accumulates in the cell under the conditions that are equivalent to the base sequence shown in the above sequence number and the sequence complementary to the base sequence. Contains N.
  • Examples of stringent conditions for the ID are S ⁇ , 0 1 ⁇ 0.5 S S 42. C to 68. The case of C is mentioned.
  • the polymerizing protein can be obtained by constructing the following vector expression vector and introducing it mainly. Or, if the texture is on the market, you can buy it. It is not particularly limited as long as it can express the gene of interest for introducing the vector, and examples thereof include a colon, Eschech aCo), a host cell such as Bactus S bs) and a success sequence.
  • yeasts such as accha o ycesCe ev s ae and mammary vesicles of, etc. are produced.
  • the gene of Ming is self-sustaining at the same time as the promoter and transcription. It is preferable that it is a composition containing a row.
  • examples of the actor include pcDN3, p172PEL, PE, etc. Any type of colony can be used as long as it can be expressed in the colon. For example, p-type, ac-type, PL-type
  • expression vectors include Ep350.
  • ga pumper ga 0 butter, etc.
  • pc N 3 etc. are preferable as the expression vector.
  • Kuta is mainly introduced to produce recombinants, which serve as the target gene expression.
  • the host is not particularly limited as long as it can express the gene of interest, and examples thereof include colon Eschech aCo), Chissus Bac sSub s, and other Saccha o yc. ce ev s., etc., and mammary vesicles of H.
  • the main kuta methods include, for example, kutpo, posom, spruce, and thium.
  • a tank of a structure or the like can be obtained by cultivating the transformant and collecting it from the composite. Means the deviation of the above ,,, or cells.
  • the method of placing the recombinant in the ground is carried out according to the usual method used for the host.
  • the main land for transformants whether it is a land that can contribute to microorganisms, contains nitrogen or inorganic matter, and can efficiently feed the transformants, whether it is a natural land or a synthetic land, can be used.
  • Examples of such materials include coal, water-based conversion such as gas, lactose, sucrose, and dep, and organic acids such as Pupio, Tano, and Puno.
  • inorganic acid such as ammonium, ammonium, ammonium, aluminum, and ammonium
  • organic acids such as ammonium, peptides, kisses, and inorganic salts are used.
  • antibiotics such as tetracycline may be added to the soil during feeding.
  • antibiotics such as cane and pen may be added to the soil during feeding.
  • the cells are crushed to extract the protein.
  • the nutrient solution is added to the cell. Use as-is, remove cells by centrifugation.
  • the tachygenesis system is a system that uses the cell effluent to synthesize a protein in a test tube or other device.
  • the tax system includes D A as a template and A as a component. The discharge is
  • kits include, for example, PU E TE (Post Genome Research Institute) P TE (Yobo) and TNT ys em (P).
  • the protein obtained by synthesizing S as in S can be purified by selecting chromatography etc. as described above. 4
  • the tactics of the tactics are the same as those of the tactics, including the structures obtained as described above, and the tactics of the tactics, which are the tactics of the tactics, are introduced into the cells.
  • cells in which a polymer of these proteins has been accumulated are not particularly limited, it is preferably an animal, and more preferably a nerve cell guar.
  • nerve 2 The cells include HS 5 (L de s ade a 981 B an es 224 69 82) and NH 3T3 guar LN 93, but are not limited to these.
  • the tac can use the appropriate input reagent within the coagulation.
  • Examples of internal medicines include fuku ha o.
  • the above-mentioned tag may be subjected to sound wave treatment as necessary due to fragments and the like when introducing the aggregate into cells.
  • the accumulation of the polymer of the tank is accumulated in both cells depending on the kind of the tank. , Quies accumulate in cells, but quays accumulate in both cells and outside.
  • the introduced polymerization is accumulated and accumulated, and the introduced cells exhibit some of the characteristic features found in patients.
  • a gene that encodes a protein that is thought to be required for elongation is introduced into cells to be overexpressed, and a tac-combining gene is introduced into cells. be able to. This allows the accumulated polymer and the overexpressed tag to interact with each other to accumulate the tank complex.
  • the polymerizing tag may be introduced into the cell together with the polymer, or either of them may be introduced first. .
  • the cells produced by this method are much more similar to the ones that actually accumulate, and it is more preferable because they are observed to aggregate and accumulate a protein with a similar quality.
  • the method of expressing the protein that is considered to be necessary for the reaction for the formation of cells into cells is, for example, to prepare a gene in which the gene encoding the protein is inserted into an appropriate cell, and to connect the cell to a nerve cell. Or guar and adapt these cells. It's about time.
  • the positive transformant can be prepared according to the method described in 3 above.
  • the cells are induced. This is because, after a certain period of time in the above cells, a clear morphology was observed in comparison with the introduction of the tag complex into the cell (6b), and also in the cells. . Thus, it can be used as a clear and neurological deficit.
  • the assay includes, but is not limited to, a hydrogen (L H) assay method. This assay is based on the method of quantifying how much LDH originally present leaks out at the time of cell death, and the higher the cellular LH property, the stronger the occurrence. 6.Scribing method and kit
  • the present invention is characterized in that () is brought into contact with cells into which the above-mentioned tag has been introduced, using a light screen. This makes it possible to scoop substances that suppress the action of tacopolymers, and also to scrub neurologic agents.
  • ⁇ neurodegene ao '' refers to a disease in which nerve cells die due to death such as traumatic infection or bacterial staining, but the main symptoms are eye disease and exercise damage. Son's disease, etc. In addition to these diseases, Ningtin, Toppitpit, muscular dystrophy, B-body type, polymorphism, Quite Toya, an ausS syndrome group ,, ball, tone , Dentate disease, FTDP 7, progressive, corticobasal disease, and Pck disease.
  • the cells () into which the above-mentioned tank complex has been introduced are present in the same reaction system.
  • a cytoplasm to the cell organ, mixing the cytoplasm with the cytoplasm, It includes things such as quality.
  • neural xons In a preferred embodiment, it is preferable to use neural xons, bibody morphisms, and many cells into which quies have been introduced as a construct.
  • the qualitative contact of the neurons with the quality of the cells, the qualities of the cells with which the quality of the cells is contacted, and the correlated index value properties were compared and compared. It can be used to inhibit substances that inhibit insulin, or substances that reduce or eliminate symptoms of xo disease.
  • index value properties that have the relevant correlation.
  • the target of the drug is the therapeutic drug
  • the candidate drug is the nerve into which the cells have been introduced. I prefer to use cells. Also nerve
  • kit the es ann auss e symptom group, and the cells into which the protein has been introduced.
  • FTDP progressive, corticobasal, Pck's disease
  • tau it is preferable to use tau.
  • Examples of the quality include pep, tak, non-compound synthetic compound (molecule), fermentation product, cell effluent, on cell, plant effluent, (, mouse, rat, pig, cormorant, sheep, sal, sheep). Etc.), plasma, etc., and these compounds may be new compounds or compounds.
  • These candidate substances may form salts, and as the candidate substance, salts with physiologically acceptable substances (such as inorganic acids and organic acids) (for example, metal acids) are used.
  • the cells are induced by the structure or the cells and the cells accumulate the cells, it can be confirmed that the cells relaxed or disappeared when a certain candidate was administered. With the results obtained, it is possible to select the substance used as a neurotherapeutic.
  • Ossypen which is a kind of polio compound.
  • Oss e is a compound contained in Aoshima, and is also a compound used as food.
  • Oss en suppresses quin at nV o
  • quiesce the quiesce add the rabbi of the reaction, and measure the frequency.
  • tapaks which are rich in p-structures and bind to them, emit light, and the taps of the taps are used to determine that combination.
  • it possesses a wealth of manufacturing features, and o. Quies are suppressed by n. It is less frequent than en.
  • oss e n suppresses quies in squid. Therefore, ossypen, which is a species of Pono, has an effect of suppressing cells. It can be provided in the form of a modified kit, which is a substance that suppresses the conjugation of denatured drug.
  • the kit of Akira contains cells, but in addition, it may also contain a labeling substance, cell output (such as LDH), and a quinone. Quality means, radioisotopes, fluorescent compounds and photocompounds.
  • the Ming kit contains the reagents listed above and other reagents for performing the assay, for example,
  • kit of Akira can also contain various substances for test compounds, various instruments, various instruments, various instruments (such as pedopefive), and washing experiments (a statement).
  • H 5 is 37 using D 12 land containing 10.
  • the cells were left overnight and then replaced once with Phospha ebu e edSane (PB) with 1 op. This cell was mixed with 2 Tg of sonicated quill 5 L of drug in 200 ops37.
  • PB Phospha ebu e edSane
  • Binacui was diluted to 30 mm T s H pH 75), 0.2 NaN to give 9, and oss e n, which is the seed of the vine, was added to the final 200.
  • the reaction was carried out at 37 C, 200 p.
  • a quie (or a mutant type) was inserted into a SH5 cell that has been traversed with pcDN 3 plus, such as a quiche, and the cell in one inked state was used. After removing the soil, the 0.25 top solution of 05 was added, and the mixture was kept at 37C for 0 hours. 0.5 of PBS was added thereto, and the cells were peeled off with a Petti and collected.
  • the ultrasonic wave is processed together with the sink and the T on X 00 containing 100, and the same (.
  • 290000 9 20, 4C It was made to be T-soluble, and a sampler was added for electrical use. Ultrasound is carried out in a tray containing 100 s (a) of T, then 37. It was kept warm at 30 ° C. After warming (290000 920, at 4), the resulting a-solubility was prepared and similarly prepared into a DSPE suspension. , 100 SD sampler was added and sonicated to make electricity.
  • N was deleted. It was able to be introduced into Fukun cells in the same manner as full-length Quin, such as quii and Qui lacking repeat sequences at 5 to 7 sites.
  • the quine present in the bi-corporeal body seen in Fig. 1 also undergoes cell volume and / or insolubilization and nitration. It is true that the quill that has accumulated in the area will be recovered as an insoluble fraction. Qui in the cells were found to have a biochemically similar quality in the patients. Query cell chemical
  • T F s was observed (3) was considered to consist of crystals.
  • Rabin S which is a species of element that specifically binds to rich ta in p-structure.
  • the F S cells are PSe 9 bodies, T P 3, and Rabin.
  • T F and bi-body DLB rat pieces were double-colored with an PSe 9 and chitin, respectively, and observed by dot and the microscopy.
  • the results are summarized in Figure 5.
  • LDH cells were evaluated. This is based on a method of quantifying the leakage of native LD during cell death. Therefore, the higher the cellular LDH property, the higher the strength.
  • Oss en is a compound contained in Aoena and is a compound used as food. So, we first examined whether 9 quishes suppress quies at nV o.
  • ossype which is a species of Pono, has an effect of suppressing the cells induced by TFS cells.
  • a tac-conjugated tac is provided with the cells into which the tacrosome has been introduced and a method for its production. It can be used as a system that has the characteristic features of the structure found in the brain of an actual person, and is useful for elucidating the development of Atyxo disease. Also, it is extremely useful for analysis of the mechanism common to Akira and Aido. In addition, it is not only the structure of the nerves that are

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Abstract

本発明は、タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体が導入された細胞とその製造法を提供することを目的とし、タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体が導入された細胞、及びその製造法、および前記細胞に候補物質を接触させることを特徴とする、線維性構造を有するタンパク質の細胞内蓄積を抑制する物質のスクリーニング方法に関する。

Description

明 細 書 タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体が
導入された細胞及びその製造法 技術分野
' 本発明は、タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体が導 入された細胞、上記細胞の製^方法、及ぴ当該細胞を用いた変性疾患治療薬のスク リ一二ング方法等に関する。 背景技術
ァルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患患者脳の神経細胞内に は、特徴的な病理構造物が出現する。 この病理構造物は、.アルツハイマー病では神 経原線維変化と呼ばれ、パーキンソン病ではレビー小体と呼ばれている。いずれの 病理構造物も、種々のタンパク質からなる線維性の沈着構造物である。神経原線維 変化の主要構成成分として微小管結合タンパク質の一つであるタウが、レビー小体 の主要構成成分として シヌクレインがそれぞれ同定されている。特にパーキンゾ ン病では、 aシヌクレインをコードする遺伝子が家族性疾患家系の遺伝学的解析か ら原因遺伝子の一つとして見出されている。これらの 常構造物の出現部位と神経 細胞の脱落部位との間に相関が見られることから、細胞内に出現する異常構造物が 細胞障害となり、最終的に神経細胞が死に至り発症につながるというメ力二ズムが 考えられている。 し力 しながら、 このメカニズムは実験的に証明されてはいなレ、。 このように、タウや αシヌクレインの細胞内蓄積は神経変性疾患の発症と密接に 関連していることが考えられており、この仮説を実証するためにこれらのタンパク 質が細胞内に蓄積した細胞モデル、あるいは実験動物モデノレの開発が世界中で精力 的に行われている。 しかしながら現在のところ、実際の患者脳に見出される構造物 の特徴を有するモデル又はこれに類似するモデルに関する報告は数少ない。
一般的に可溶性のタンパク質が重合し、不溶性の凝集塊や線維を形成する分子反 応は、重合核の形成過程とその重合核を中心に線維が伸びる伸長過程とに分けるこ とができ、凝集核形成過程がその律速段階とされる重合核形成依存性タンパク質重 合モデルが受け入れられている（Jarrett JT & Lansbury PT Jr, Cell 73： 1055-1058, 1993)。 この考え方は細胞内に蓄積するタンパク質の凝集、 線維形 反応にもあて はまると考えられ、 実際に試験管内ではこれを支持する実験結果も得られている。 しかしながら、細胞にダメージを与えることなく、重合核を効率的に細胞内に導入 する方法は未だに開発されておらず、 生きた細胞内、 あるいは実験動物において、 実際に行うことは極めて困難であった。 発明の開示.
本発明は、タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体が導 入された細胞及び当該細胞の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 c シヌクレインな どの線維状構造物を神経細胞内に導入すると、当該導入された細胞は神経変性疾患 のモデル細胞となり得ること.を見出し、 本発明を完成するに至った。 ' すなわち、 本発明は以下の通りである。
( 1 )タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体が導入され た細胞。 '
■ 本発明において.、 タンパク質としては、例えばタウタンパク質、 アミロイドタ ンパク質、 ひシヌクレイン、 ポリグルタミン、 S0D1及 プリオンタンパク質並び にこれらの変異体からなる群から達択される少なくとも一種を例示することがで きる。 また、 上記細胞は神経細胞又はグリア細胞であることが好ましい。本発明の 細胞は、 変性疾患のモデル細胞として使用することが可能である。
( 2 )タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体を神経細胞 又はグリア細胞に導入することを特徴とする、 変性疾患のモデル細胞の製造方法。 さらに、本発明は、 タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合 体と、当該タンパク質をコ一ドする遺伝子を含むブラスミ ドとを神経細胞又はグリ ァ細胞に導入し、編己重合核となりうるタンパク質又は重合体と、プラスミ ドの発 現により生じるタンパク質とを相互作用させることにより、細胞内にタンパク質重 合体を蓄積させるこ.とを特徴とする、神経変性疾患のモデル細胞の製造方法を提供 する。
( 3 )上記細胞に候補物質を接触させることを特徴とする、タンパ'ク質重合体の細 胞内蓄積を抑制する物貧のスクリーニング方法。
( 4 )上記細胞に候補物質を接触させることを特徴とする、変性疾患治療薬のスク リーユング方法。 -
■ ( 5 ) 上記細胞を含む、 タンパク質重合体の細胞内蓄積を抑制する物質又は変性疾 患治療薬のスクリーニング用キット。 図面の簡単な説明
図 1は、 aシヌクレイン線維、重合核となりうる αシヌクレイン重合体を神経 芽細胞 SH- SY5Y内に導入したことを示すィムノブ口ッ卜の図である。
. 図 2は、 αシヌクレイン線維、重合核となりうる α、ンヌクレイン重合体を細胞 に導入するとともに可溶性 c .シヌクレインを発現させたときのひシヌクレインの 蓄積を示す図である。： .
図 3は、 リン酸化 αシヌクレインを特異的に認識する anti_PSerl29抗体によ る免疫染色を行い、共雋点レーザー顕微鏡による観察を行った結果を示す図である。
図 4は、 WT+F a S細胞を、 anti- PSerl29抗体、 TO- PRO- 3、 およぴチオフラビン Sにより三重染色し、 共焦点レーザー顕微鏡にて観察したことを示す図である。
図 5は、 WT+F a S細胞およびレビー小体型痴呆症 （DLB) 患者脳のビブラトー ム切片を、 それぞれ anti-PSer 129抗体およびュビキチン抗体による二重染色を行 い、 共焦点レーザー顕微鏡で観察したことを示す図である。
図 6は、 αシヌクレインプラスミ ド DNAおよび線維を導入した細胞において細 胞の形態変化及び細胞死が認められたことを示す図である。
図 7は、 Gossypetinが in vitroで aシヌクレインの線維化を抑制することを 示す図である。
図 8は、 Gossypetinの細胞死抑制効果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態 以下、本発明を詳細に説明する。 以下の実施の形態は、'本発明を説明するための 例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、 そ の要旨を逸脱しない限り、 さまざまな形態で実施をすることができ'る。
なお、本明細書において引用した文献、 および公開公報、特許公報その他の特許 文献は、 参照として本明細書に組み込むものとする。 また、 本明細書は、 2005年 12 月 6 日に出願された本願優先権主張の基礎となる-日本国特許出願 （特願 2005- 352480号） の明細書に記載の内容を包含する。 本発明は、タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体を細胞 内に導入することにより、当該構造物が細胞に蓄積された細胞及びその製造法に関 する。
1 ·. 概要
本発明者は、細胞に大きなダメージを与えることなく、効率的に重合核を細胞に 導入し、脳内における線維化を簡易に解析できるモデノレを作製するため、細胞内に 線維状のタンパク質をはじめとする、タンパク質重合体の重合核となりうるタ パ ク質又はその重合体を,導入することを試みた。
本発明者は、神経芽細胞 SH-SY5Yを用いて、 CLシヌクレインが細胞內に蓄積する 細胞モデノレの構築に着手した。そして、 タンパク質又ばその重合体を細胞内に導入 する方法として、前記タンパク質を物理的に細胞に導入することができることを見 いだした。導入されたタンパク質又はその重合体は、 リン酸ィ匕され、 蓄積されるこ とが観察され、 また、 タンパク質又はその重合体が導入された細胞では、患者脳に みられる一部の病的特徴が見られた。
さらに、本発明者は、重合体形成のための伸長反応に必要と考えられるタンパク 質をコードするプラスミドを、遺伝子工学的に細胞内に導入し、前記タンパク質を 過剰発現させるとともに、タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はそ の重合体を細胞に導入することにより、重合核となるタンパク質又は重合されたタ ンパク質と、プラスミドの発現により生成されるタンパク質とを相互作用させ、細 胞内にタンパク質重合体を蓄積させることに成功した。この方法で作製された細胞 では、実際の患者脳に蓄積するタンパク質と極めて類似した性質のタンパク質が細 胞内に凝集し、蓄積されることが観察された。 さらに導入された細胞が細胞死に至 ることも観察された。 本発明の方法は従来にはない極めて独創的な'方法である。 本発明において、細胞内に出現したタンパク質の重合体は、抗リン酸化シヌクレ インおよびュビキチン抗体で染色され、患者脳に見られるレビー小体と極めて類似 していることが示された。また蓄積モデル細胞に出現する異常重合体に含まれる α シヌクレインは、レビー小体を構成するひシヌクレインと同様に界面活性剤などで も可溶化されず、細胞内で不溶 していることも明らかとなった。 さらに本発明者 は、上記方法で製造された αシヌクレインを蓄積した細胞は最終的に細胞死に至る という驚ぐべき新知見を見出した （実施例参照） 。 以上のように、細胞内への線維 化タンパク質をはじめとするタンパク質の重合体の蓄積に関し、本発明者が構築し た新しい細^モデルは、実際の患者脳に見られるレビー小体と同様の性質の重合体 が出現するモデルであり、蓄積された重合体をともなう神経細胞死誘導機構の解明 や、蓄積を抑制する薬剤の探索など治療薬の開発に応用されると考えられる。マウ スなどの実験動物を用レ、たモデル系の開発も重要であるが、本究明におレ、て開発さ れた培養細胞を用いた系のほうが、 より安価で簡便に利用でき、力つ短時間で大量 の試料をスクリーニン,グすることが可能である。
2, タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質文はその重合体
「タンパク質重合体」 とは、 変性疾患患者脳の神経細胞、 グリア細胞内又は細胞 外に出現する沈着性又は蓄積性の不溶性のタンパク質構造物をいう。 「タンパク質 重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体」には、線維性のタンパク質 構造物又はその重合核が含まれる （以下 「線維性構造物または重合核」 という） 。 「重合体」 とは、 タンパク質がいくつか重合したものを意味し、線維のほか、 分子 が幾つ力重合したオリゴマーも含まれる。 「重合核」 とは、 可溶性のタンパク質が 重合して不溶性の凝集塊や線維を形成する分子反応における出発物質を意味する。 例えば、線維性構造物を細胞に導入するために破砕したものなどが含まれる。線維 性構造物または重合核は、種々のタンパク質からなり、不溶化して細胞内に沈着又 は蓄積する。線維性構造物は、神経変性疾患の多くで病理学的特徴の一つとして挙 げられ、その形成過程が発症と密接に関連していると考えられて-いる。 この線維性 構造物の病理像は、パーキンソン病ではレビー小体とよばれ、アルツハイマー病で は神 原線維変化とよばれている。そして、 レビー小体の主要構成成分として αシ ヌクレインが、神 ¾ ^線維変化の主要構成成分としてタウタンパク質が、それぞれ 同定されている。
αシヌクレインとは、パーキンソン病の病因物質として同定された細胞質中への 蓄積物質であり、 αシヌクレインの凝集が細胞死の要因と考えられている。
タウとは、微小管結合タンパク質の一種であり、アルツハイマー病に代表される タゥォパチ一とよばれる疾患群において、神経原線維変化として神経細胞内に大量 に蓄積する。 タウォパチ一においても、パーキンソン病で見られるレビー小体と同 様に、 種々の異常構造物 （神経原線維変化） が細胞内に認められるが、 それらの主 要構成成分がタウである。 レビー小体における αシヌクレインと同檫に、 タウも異 常構造物内で線維化しており、 界面活性剤に不溶性を示す。
アルツハイマー病やパーキンソン病と同様に神経細胞内に蓄積物が出現する他 の変性疾患としては、ハンチントン病をはじめとする卜1リプレツトリピート病が挙 げられる。. トリプレツトリピート病において蓄積されるタンパク質は、細胞毒性を 発揮すると考えられ いるポリグルタミンである。'ポリグルタミンは、ハンチン卜 ン病において、不溶ィ匕した核内凝集体又は可溶状態のポリグルタミン鎖含有タンパ ク質片として存在する力 ポリグルタミン鎖の核内局在が細胞死の必須要因となつ ている。
また、神経細胞内に蓄積物が出現する他の変性疾患としては、筋萎縮性側索硬化 症が挙げられ、 この疾患においては、 Cu/Zn superoxide dismutase (S0D1) が蓄積 される。 S0D1は、 細胞毒性を発揮すると考えられているタンパク質であり、 筋萎 縮性側索硬化症において、 レビー小 封入体に蓄積されることが知られている。 そして、 S0D1の凝集物そのものが、 新たな細胞障害効果を有すると考えられてい る。
一方、細胞外に蓄積するタンパク質としては、 アルツハイマー病における、 アミ ロイド 3タンパク質 (Α ]3 )と呼ばれるタンパク質が知られている。 A j3は、 タウと弱 いながらも相互作用をしているものと考えられている。一部のアルツハイマー病の 原因遺伝子が ]3アミロイド前駆体と一致することから、 A i3の蓄積は、 ァルツハイ マー病の発症原因に関与するものと考えられている。 さらに、 A i3タンパク質は細 胞内にも蓄積される:^がある。 従って、 細胞内に導入するタンパク質として、 A i3も含まれる。 .
プリオンタンパク質は、狂牛病やクロイツフェル卜 ·ヤコブ病で異常蓄積が認め られるタンパク質であり、神経細胞内又は外におレ、て線維化して蓄積することが知 られている。プリオンタンパク質の高次構造が変化して、ベータシート構造が增加 することにより、 正常プリオンタンパク質が病原性プリオンタンパク質に転換し、 神経細胞死の原因となると考えられている。 .
以上のタンパク質はいずれも細胞内又は細胞外に蓄積しその発症と関連してレ、 ると考えられており、何らかの共通のメカニズムにより細胞内で蓄積し細胞毒性を 発揮する可能性がある。従って、本発明の細胞は、 上記神経変性疾患のモデルとし て使用することが可能である。
また、本発明で用いられるタンパク質は、上記タンパク質に限られず、 上記ダン パク質の変異体でもよい。 「衮異体」 とは、 上記タンパク質のアミノ酸配列におい て、 1個スは数個 （例えば 1〜 1 0個、 好ましくは 1〜 5個） のアミノ酸に欠失、 置換又は付加等の変異が生じたタンパク質を意味し、細胞内又は外におレ、てタンパ ク質重合体として蓄積しうるものであればょレ、。例えば、 αシヌクレインの変異体 と,しては、家族性パーキンソン病家系解析から見出された変異型 αシヌクレインで ある Α30Ρ、 Α53Τ、 Ε46Κがある。 Α30Ρは、 αシヌクレインのアミノ酸配列 （配列番 号 2 ) .において第 30番目のァラニン （Ala) がプロリン （Pro) に置換した変異型 であり、 A53Tは、 αシヌクレインのァミノ酸配列 （配列番号 2 ) におレヽて第 53番 目のァラニン （Ala) がスレオニン （Thr) に置換した変異型であり、 E46Kは、 ひ シヌクレインのアミノ酸配列 （配列番号 2 ) において第 46番目のグノレタミン酸 (Glu) が.リシン （Lys) に置換した変異型である。
また、 N末端や C末端側が欠損した断片化 c シヌクレイン、 あるいは、 5〜7箇所 存在する繰り返し配列が欠損した αシヌクレインなども、本発明におレ、て細胞内に 導入するために使用することができる。断片化 αシヌクレインは、例えば配列番号 2に示す Lシヌクレインのァミノ酸配列のうち、. 131〜140番目のァミノ酸を欠失 させたものを例示することができる。
繰返し配列欠損 αシヌクレインは、配列番号 2.で表されるひシヌ 'クレインのァミ ノ酸配列のうち、 10〜15、 21〜26、 32〜37、 43〜48、 58〜63番目のアミノ酸残基 のいずれか又は全部を欠損させたものである。
3 . タンパク質又はその重合体の作製
( 1 ) タンパク質をコードする遺伝子の取得 . ' 本発明で用いられるタンパク質は、表 1に示す Accession番号から遺伝子又はァ ミフ酸配列情報を得、その情報をもとに通常の遺伝子工学的手法により入手するこ とができる。 このような遺伝子は、表 1に記載の配列番号で示される塩基配列から なる DNA又ほその断片をプローブとして、 コロニーハイブリダィゼーシヨン、プラ ークハイブリダィゼーション、サザンプロット等の公知のハイブリダィゼーション 法により、 ヒ トの cDNAライブラリ一及びゲノムライブラリ一から得ることができ る。 これらの方法【こつレヽて ίま、 「Molecular Cloning.、 A 'Laboratory Manual 2nd ed.」 (Cold Spring Harbor Press (1989) )を参照することができる。
また、上記タンパク,質をコードする遺伝子は、通常の化学合成法または生化学的 合成法を用いて製造することもできる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に いられている DNA合成装置を用いた核酸合成法、あるいは、铸型となる塩基配列 を単離又は合成した後に、 PCR法文はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法 を用いることができる。その後、上記のようにして得られた核酸を制限酵素等で切 断する。 このように切出した当該遺伝子の DNA断片を、適当な発現ベクターに挿入 し、 タンパク質をコードする遺伝子を含む発現用ベクターを得ることができる。 タンパク質やその変異体は、神経変性疾患の病巣部分等から単離することもでき るし、 公知の遺伝子工学的手法、 例えば、 Kunkel法や Gapped duplex法等の部位 特異的突然変異誘発法を利用した公知手法により取得することもできる。部位特異 的突然変異誘発のための変異導入用キットとして、 例えば
QuikChange™Site- Directed Mutagenesis Kit (ストラタジーン社製）、 GeneTailor™ Site-Directed Mutagenesis System (インビトロジェン社製）、 TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutaii- K、 Mutan-Sujjer Express Km等：タカ ラバイオネ ± ) 等を用いることが可能である。
タンパク質は、 上記したとおり αシヌクレイン、 タウ、 S0D1、 ポリグルタミン、 A /3、 及びプリオン並びにこれらの変異体が含まれる。 これらのタンパク質のアミ ノ酸配列、 及びこれらのタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を表 1に示す。 表 1
Figure imgf000010_0001
'タンパク質をコードする遺伝子は、上記した配列番号に示される塩基配列のほ力 \ 当該塩基配列に相補的な配列に対してス トリンジェントな条件下でハイプリダイ ズし、かつ細胞内への沈着又は蓄積するタンパク質をコードする DNAを含む。上記 ハイブリダィゼーシヨンにおいてストリンジェン卜な条件としては、 たとえば、 1 X SSC〜2 X SSC、 0. 1 %〜0. 5 % SDS及び 42 °C〜68 °Cの条件が挙げられる。
( 2 ) 発現ベクターの構築及び形質転換
本発明において、重合核となりうるタンパク質は、以下に示すとおり発現べクタ 一を構築してこれを宿主に導入し、培養することにより得ることができる。 あるい は、 タンパク質が市販されている場合は、 購入してもよい。 発現ベクターを導入するための宿主は、目的とする遺伝子を発現できるものであ れば特に限定されず、例えば、宿主として大腸菌 （Escherichia coli)、 バチルス · ズブチリス（Bacillus subtilis) 等の細菌、 サツカロミセス .セレ'ピシェ
(Saccharomyces cerevisiae) 等の酵母、 COS細胞、 CH0細胞等の哺乳類細胞などが 挙げられる。大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、本 明の遺伝子が宿主中 で自立複製可能であると同時に、プロモーター、転写終結配列を含む構成であるこ とが好ましレ、。 発現ベクターとしては、 例えば pcDNA3、 pRK172、 pET、 pGEX等が挙 げられる。プロモーターとし Tは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればい ずれを用いてもよい。 例えば、 trpプロモーター、 lac プロモーター、 PLプロモー ター、 PRプロモーターなどの大腸菌やファ"ジ等に由来するプロモーターが用い られる。酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えば YEpl3、YCP50 等が挙げられる。 プロモーターとしては、 例えば gall プロモーター、 gallOプロ モーター等が拳げられる。哺乳類細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターと して、 例えば pcDNA3等が好ましい。 ' 上記発現べクターを,宿主に導入し形質転換体を作製し、目的遺伝子の発現に供す る。 このとき、宿主は、 目的とする遺 子を発現できるものであれば特に限定され ず、.例えば、大腸菌 （Escherichia coli)、バチルス.ズブチリス（Bacillus subtilis) ' '等の細菌、 サッカロミセス .セレピシェ（Saccharomyces cerevisiae) 等の酵母、 COS細胞、 CH0細胞等の哺乳類細胞などが挙げられる。 主への組換えベクターの 導入方法としては、例えばエレクトロポレーシヨン法、 リボソーム法、 スフエロプ ラスト法、 酢酸リチウム法等が挙げられる。
( 3 ) タンパク質又はその重合体の採取及び精製
線維性構造物などのタンパク質又はその重合体は、前記形質転換体を培養し、そ の培養物から採取することにより得ることができる。 「培養物」 とは、 培養上清、 培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するもので ある。
形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従つ て行われる。 大腸菌や酵母菌等を宿主とする形質転換体を培養する培地としては、微生物が資 化し得る炭素源、 窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行う ことができる培地であれば、 天然培地、 合成培地のいずれを用いて'もよい。 ■ 炭素源としては、 グルコース、 フラクトース、 スクロース、 デンプン等の炭水化 物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノール等のアルコール類 が用いられる。 -
' 窒素源としては、 アンモニア、塩化アンモニヴム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アン モニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニゥム塩、'ぺプ トン、 肉エキス、 コーンスティープリカ一等が用いられる。
無機物どしては、 リン酸第一力リウム、. リシ酸第二力リウム、 リン酸マグネシゥ ム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリゥム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭 酸カルシウム等が用いられる。
培養は、通 、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、例えば 37°Cで 6
〜24時間行う ό ρΗの調整は、.無機又は有機酸、 アルカリ溶液等を用いて行う。 ： 培養中は必要に応じてアンピシリンゃテトラサイクリン等の抗生物質を培地に 添加してもよレヽ。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換し ' た微生物を培養する場合は、必要に応じてィンデュ一サーを培地に添加してもよい。 例えば、 Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する ときにはイソプロピル - /3 -D "チォガラクトシド （IPTG) 等を培地に添カ卩してもよ い。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用 されている RPMI-1640培地、 DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加し た培地等が用いられる。
培養は、 通常、 5%C02存在下、 37°Cで 1〜30日行う。 培養中は必要に応じてカナ マイシン、 ぺニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、 タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を 破砕することによりタンパク質を抽出する。 また、線維性構造物をはじめとするタ ンパク質又はその重合体が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をその まま使用する力 \遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。 その後、 タンパク質 の単離精製に用いられる一般的な生ィ匕学的方法、例えば硫酸アンモニゥム沈殿、ゲ ノレクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティーク口アト グラフィ一等を単独で文は適: ¾且み合わせて用いることにより、前記培養物中から タンパク質を単離精製することができる。
精製されたタンパク質の線維化をはじめとするタンパク質の重合化は.、 例えば、 上記タンパク質を含む溶液を振とうすることにより行うことができる。重合ィヒによ り得られた構造物を、超遠心分離等により回収したのち、適当量の緩衝液に懸濁し て、 細胞導入用のタンパク寳又はその重合体とする。 ' また、本発明においては、生細胞を全く使用することなく無細胞タンパク質合成 系を採用して産生したタンパク質を使用することが可能である。 無細胞タンパク 質合成系とほ、 細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタンパク質を合 成する系である。 無細胞タンパグ質合成系には、 DNAを铸型として11^を合 成する無細胞転写系も含まれる。 上記細胞抽出液は、 真核細胞由来又は原核細 胞由来の抽出液、 例えば、 小麦胚芽、 ゥサギ網状赤血球、 マウス L-細胞、 HeLa 細胞、 CH0細胞、 出芽酵母、 大腸菌などの Λ出液を使用することができる。
さらに本発明において、 無細胞タンパク質合成は、 市販のキットを用いて行: うこともできる。 そのようなキッ小としては、例えば PURESYSTEM (ボストゲノム 研究所)、 PROTEI0S™ (東洋紡)、 TNT™ System (プロメガ） などが挙げられる。 上記のように無細胞タンパク質合成によって得られるタンパク質は、 前述の ように適宜クロマトグラフィー等を選択して、 精製することができる。
4 .タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体の細胞内への 導入
本発明においては、上記のようにして得られた線維性構造物をはじめとする、 タ ンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体を細胞内に導入す ることにより、これらのタンパク質の重合体が蓄積された細胞を得ることができる。 導入するための細胞は、特に限定されるものではないが、動物細胞であることが好 ましく、 中でも神経細胞又はグリア細胞であることが好ましい。 例えば、神経芽細 胞である SH-SY5Y細胞. (し. Odelstad et al;、 1981、 Brain Res.、 224： 69-82) や NIH/3T3細胞及びグリア様細胞である OLN-93細胞等が挙げられるが、 これらに限 定されるものではなレ、。 、 .
タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体の細胞内への 導入は、適当な導入試薬を用いて行うことができる。細胞内への導入用試薬として は、例えばリボフエタトァミンや Chariotなどが挙げられる。 なお、前記タンパク 質又はその重合体を細胞内に導入するに際し、断片化等のために必要に応じて超音 波処理を行ってもよレ、。
なお、タンパク質の重合体が蓄積される部位が細胞内力細胞外か両方に蓄積され るのかに関しては、各タンパク質重合体の種類による。 例えば、 αシヌクレインは 細胞内に蓄積するが、 A j3、 プリオンタンパク質は細胞内、 外腔のどちらにも蓄積 する。
本発明においては、上記のように重合核を導入することにより、導入された重合 核はリン酸ィ匕されて蓄積し、前記重合核が導入された細胞は患者脳にみられる一部 の病的特徴を示す。 ' '
また、本発明においては、伸長反応に必要と考えられるタンパク質をコードする 遺伝子を細胞に導入して過剰発現させるとともに、,タンパク質重合体の重合核とな' りうるタンパク質又はその重合体を細胞に導入することができる。 これにより、導 入された重合核と、過剰発現させたタンパク質とを相互作用させることにより、細 胞内にタンパク質重合体を蓄積させることができる。但し、重合核となりうるタン パク質をコードする遺伝子の細胞内への導入は、重合核となりうるタンパク質又は その重合体とともに細胞内に導入しても、 どちらを先に導入してもよく、導入の先 後又は時期に限定されるものではない。
この方法で作製した細胞は、実際の患者脳に蓄積するタンパク質と極めて類似し た性質のタンパク質が細胞内で凝集して蓄積し、その後細胞死に至ることが観察さ れるため、 より患者脳に近い細胞モデルとして好ましい。 この重合体形成のための 伸長反応に必要と考えられるタンパク質を細胞内に発現させる方法は、例えば前記 タンパク質をコードする遺伝子を適当なベクターに挿入した組換えベクターを作 製し、 当該組換えベクターを神経細胞ゃグリア細胞等に導入し、 これらの細胞を適 当時間培養すればょレヽ b組換えプラスミ ド及ぴ形質転換体の作製は、前記 3 . に記 載の方法に準じて行うことができる。
タンパク質が細胞に導入され、不溶化していることは、上記タンパク質を認識す る抗体を用いたィムノブロット法により解析できる。 また、 タンパク質が細胞内に 蓄積されたことは、 共焦点レーザー及び免疫染色により確認することができる。 なお、患者脳に見られるレビー小体には、 リン酸ィ匕ひシヌクレインだけでなくュ ビキチンも含まれることが知られている力 S、本発明に含まれる αシヌクレイン蓄積 モデル細胞に出現する鉀^内構造物は、 レビー小体と形や大きさだけでなく、 リン 酸ィ匕ひシヌクレインの線維から構成され、ュビキチン化されているという性質まで 類似している。 これを確認するには、例えば、上記細胞およびレビー小体型痴呆症 (DLB) 患者脳のビブラトーム切片を、それぞれ抗 aシヌクレイン抗体およびュビキ チン抗体で二重染色を行い、 共焦点レーザー顕微鏡で観察する方法が挙げられる。 これにより、上記タンパク質重合体がレビー小体と同様にュビキチン化されている ことが示される。
5 . タンパク質重合体蓄積モデル細胞
本発明のタンパク質,重合体が蓄積したモデル細胞は、細胞死を誘導する。 このこ
'とは、上記細胞を一定期間培養すると、 タンパク質重合体が細胞内に導入されてい ない細胞と比べて明らかな形態変化が認められ （図 6-b) 、 さらに、 細胞数の減少 も見られることから明らかである。 従って、本発明の細胞は、神経変性疾患のモデ ノレ細胞として使用することができる。
本発明のタンパク質重合体蓄積モデル細胞にぉレ、て細胞死が誘導されたことの 確認は、例えば細胞死ァッセィを用いることができる。細胞死ァッセィ法としては、 特に限定されるものではなく、 例えば乳酸脱水素酵素 （LDH) 漏出アツセィ法が挙 げられる。 このアツセィ法は、本来細胞内に存在する LDH力 S、細胞死の際にどれだ け細胞外に漏出するかを定量する方法に基づいており、細胞外の LDH活性が高けれ ば高いほど強レ、細胞死が起きていることになる。
6 . スクリーニング方法及びキット 本発明のスクリ一二ング方法は、上記タンパク質重合体が導入された細胞に候補 物質 （被験物質） を^させることを特徴とするものである。 これにより、 タ パ ク質童合体の細胞内蓄積を抑制する物質をスク.リー ングすることが可能となり、 また、 神経変性疾患治療薬をスクリーユングすることも可能となる。
神経変性疾患とは、外傷や細菌感染などの明らかな原因がな 、のに神経細胞が死 んでレ、く神経変性（neurodegeneration) という現象がみられる病気を意咔し、痴呆 を主とするァルツハイマー病、運動障害を主な症状とするパーキンソン病などが挙 げられる。 これらの疾患の他に、 ハンチントン病、 小リプレットリピート病、 筋萎 縮性側索硬化症、 レビー小体型痴呆症、 多系統萎縮症、 クロイツフェルト-ヤコ 、 病、 Gerstraann- Straussler症候群、狂牛病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症、 歯状核赤血淡蒼球ルイ体萎縮症、 FTDP- 17、 進行性上性麻痺、 皮質基底核変性症、 Pick病などが挙げちれる。
「接触」 とは、 上記タンパク質重合体が導入された細胞と候補物質 （被験物質） とを同一の反応系又は培養系に存在させることを意味し、例えば、細胞培養容器に 候補物質を添加すること、細胞と候補物質とを混合する'こと、細胞を候補物質の存 在下で培養することなどが含まれる。
本発明の好ましい 様において、神経変性疾患がパーキンソン病、 レビー小体型. 痴呆症及ぴ多系^萎縮症の場合は、線維性構造物として αシヌクレインを導入した 細胞を用いることが好ましい。 この場合、 αシヌクレインが蓄積した神経細胞に候 補物質を接触させ、 tilt己候補物質を接触させた細胞において標的とする疾患と相関 関係を有する指標値又は性質について、 対照と比較し、 この比較結果に基づいて、 aシヌクレインの細胞内蓄積を抑制する物質、あるいはパーキンソン病の症状を軽 減または消滅させる物質をスクリーニングすることができる。標的とする疾患と相 関関係を有する指標値又は性質としては以下のものが挙げられる。これらの指標値 又は性質は、 1つのみを採用してもよく、 .2種類以上を組み合わせてもよレ、。
パーキンソン病： αシヌクレインの蓄積の有無、 レビー小体の出現の有無、抗ュ ビキチン抗体による反応性の有無、 神経細胞の変性の有無など
アルツハイマー病： A ]3又はタウの蓄積の有無、 神経原線維変化の有無、 抗ュビ キチン抗体による反応性の有無、 神経細胞の変性の有無など ク口イツフェルト .ヤコブ病：プリオンの蓄積の有無；神経細胞の変性の有無な ど
ハンチントン病：ハンチンチンの蓄積の有無、 神経細胞の変性め有無など 神経変性疾患がアルツハイマー病の場合、すなわちスクリ一ユングの目的対象物 質がアルツハイマー病治療薬の場合は、候補物質のスクリ-ーユングには、細胞とし 'て Α ]3又は—タウが導入された神経細胞を用いることが好ましい。 また、 神経変性疾 患がク口イツフエノレト-ヤコブ病、 Gerstraann-Straussler症候群及び狂牛病の場合 は、プリオンタンパク質力 S導入された細胞を用いることが好まレレ、。神経変性疾患 がハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症及び歯状核赤血淡蒼球ルイ 体萎縮症の場合は、ポリグルタミンが導入された神経細胞を用いることが好ましレ、。 神経変性疾患が筋萎縮性側索 化症の場合は、 S0D1が導入された神経細胞を用い る.ことが好ましい。神経変性疾患が FTDP-17、進行性上性麻痺、皮質基底核変性症、 Pick病の場合は、 タウを用いることが好ましい。
候補物質としては、例えば、 ぺプチド、 タンパク質、 非べプチド性化合物、 合成 化合物 （高分子又は低分子化合物） 、 発酵生産物、 細胞抽出液、細胞培養上清、 植 物抽出液、 哺乳動物 (例えば、 マウス、 ラット、 ブタ、 ゥシ、 ヒッジ、 サル、 ヒト など） の TO抽出液、血漿などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であって ょいし、公知の化合物であってもよい。 これら候補物質は塩を形成していてもよ く、 候補物質の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例えば、 無機^有機酸な ど）.や塩基 （例えば、 金属酸など） などとの塩が用いられる。
線維性構造物あるいはタンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はそ の重合体が細胞内に蓄積された細胞は、細胞死が誘導されるため、ある候補物質を 投与した場合に、細胞死が緩和もしくは消失したことが確認できる結果が得られれ ば、 用いた候補物質を、 神経変性疾患治療薬として選択することが可能である。 例えば、 上記候補物質の一つとして、 ポリフエノール化合物の一種である Gossypetinが挙げられる。 Gossypetinはァオイ科シロバナヮタに含まれるフラポ ノールであり、 食品添加剤として利用されているポリフエノール化合物でもある。 例えば、 Gossypetinが in vitroで c シヌクレインの線維化を抑制するかどうかを 検討するには、 c シヌクレインを Gossypetinの存在下で線維化を行い、 反応後の 溶液に、 チオフラビン Sを添加して蛍光強度を測定すればよレ、。 チオフラビン S は、 シー卜構造に富むタンパク質重合体の重合核どなりうるタン ク質又はその 重合体に結合して蛍光を発する試薬であり、タンパク質重合体の重合核となりうる タンパク質又はその重合体や線維の有無の判定に利用されている。一方、 αシヌク レイン線維は βシート構造に富む構造を有しており、 Gossypetinにより. αシヌク レイン線維化が抑制されれば、 Gossypetin未添加のものよりも蛍光強度が減少す る。 . ' この方法により、 Gossypetinはインビトロで αシヌクレインの線維化を抑制す ることが示される。 このため、 ポリフエノールの一種である Gossypetinには、 細 胞死を抑制する効果があるといえる。 本発明の細胞は、タンパク質重合体の細胞内蓄積を抑制する物質又は変性疾患治 療薬のスクリーニング用キットの形態で提供することができる。本発明のキットは 上記細胞を含むが、 その他に、 標識物質、 細胞死検出用試薬 （例えば LDH等）、 リン 酸化ひシヌクレイン抗体などを含めることができる。標識物質とは、酵素、放射性 同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等を意味する。 本発明のキットは、 上記の' 構成要素のほか、本発明の方法を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標 識,物の場合は、 酵素基質 （発色性基質等)、 酵素基質溶解液、 酵素反応停止液など を含めることができる。 さらに、 本発明のキットには、 被験化合物用希釈液、 各種 バッファー、 滅菌水、各種細胞培養容器、 各種反応容器 （エツペンドルフチューブ 等）、 洗浄剤、 実験操作マニュアル （説明書） 等を含めることもできる。 実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、本発明はこれら実 施例に限定されるものではない。
1 . 方法
aシヌクレイン線維の調製 aシヌクレイン遺伝子を組み込んだ PRK172べクターは、 文献 (Jakes R，
Spi l lant ini MG, & Goedert M. FEBS Lett. 1994， 345： 27-32) に記載のものを使 用し/こ。 これを大腸菌（BL21DE3株）にトランスフォームした。 トランスフォームした大腸 菌を 500 mLの 50 μ g/mLのアンピシリンを含む LB培地中で 37°C6時間振とう培養 'したのち、 0. 2 m isopropyl 1- thio- D- galactos ideを添加してさらに 2時閘 培養した。 菌体を回収し.、 液体窒素で急速凍結した。 室温で解凍したのち、 菌体に 5 mL (D Buffer A (50 raM Tri s- HC1 buffer, pH7. 5/ 1 mM ethylene glycole bi s ( β -aminoethyl ether) -tetraacet ic acid (EGTA) /1 mM di thiothrei tol)を加え て懸濁したのち超音波処理を行い、 菌体を破砕した。
菌体破砕物を遠心分離 (26， 600 g、 15分、 4°C)したのち、 上清を回収し、 5分間 の熱処理を行った。 さらに遠心分離 (26, 600 g、 15分、 4°C)により不溶ィ匕したタン パク質を除去したのち、 上清を、 予め Buffer Aで ¥ 化した Qセファロースカラ ム （2 mL) に添カ卩した。 6 mLの 0. 1 M NaClを含む Buff er Aでカラムを洗浄した のち、 カラムに吸着したタンパク質を、 6 mLの 0. 5 M NaClを含む Buf f er Aで溶 出した。 この溶出液に,硫酸アンモニゥムを加えて 50%飽和とし、 αシヌクレインタ ンパク質を沈殿させた。
遠心分離 （39, 100 g、 20分、 4°C) により沈殿した eシヌクレインを回収し、 1 mL の 50 mM Tri s-HCl buffer, pH 7. 5 (Buffer B) に溶解した。 さらにこの溶液は 1 L の Buffer Bに対して透析した。 透析した試料はタンパク質定量したのち、 線維化 に用いた。 5〜10 mg/raLの αシヌクレイン溶液を 37°Cで 4日間振とうし、 線維化さ せた。超遠心分離 （113， 000 g、 20分、室温） で線維を回収したのち、適当量の Buffer Bに懸濁し、 超音波処理を行った。 これをタンパク質定量したのち、 細胞導入用の aシヌクレイン線維、 重合核となりうる αシヌクレイン重合体とした。 シヌクレイン蓄積細胞モデルの作製
神経芽細胞 SH-SY5Yは、 10%仔牛血清を含む DMEM/F12培地を用いて 37°C、 5% C02 の条件下、 インキュベータ中で培養を行った。 30〜50°/。 コンフルェントとなるように SH- SY5Y細胞を 6 ゥエルプレート上で培 養し、 培地中に、 1 / gの野生型 αシヌクレイン遺伝子を組み込んだ pcDNA3ベタ タ一 （pcDNA3- a syn) と 3 /z Lの FuGENE6 (口ッシュ）を 100 しの opt i- EM (ラィ フテックオリエンタル） に混合した液を加え、そのままー晚静置し、プラスミド由 来の可溶性 αシヌクレインを発現させた。また、野生型 αシヌクレインプラスミ ド のほかに、家族性パーキンソン病家系の解析より発見された変異型 αシヌクレイン (Α30Ρ、 Α53Τ、 Ε46Κ)、 . Ν末端や C末端の一部が欠損した断片化 cシヌクレイン、 .5 〜7箇所存在する繰り返し配列を欠損した αシヌグレインをコードする PCDNA3ベ クタ一を用いた。 なお、 プラスミ ド DNAのトランスフエクシヨンは、 FuGENE6だけ でなくリポフエクトァミン試薬 （インビトロジェン)やリボフエタトァミン 2000 (インビトロジェン） などでも同様に行うことができた。
細胞をー晚静置したのち、 Phosphate buffered sal ine (PBS) で一回洗浄し、 1 mL の opt i-ΜΕΜで培地交換した。 この細胞に、 2 /i gの超音波処理した c シヌクレイン 線維と 5 Lのリボフェクトアミン試薬を 200 Lの opt i- MEMに混合したものを加 えて 37°Cで 3時間静置した。 .その後、 通常の DMEM/F12培地に交換し、 さらにイン キュベータ中で培養を続けた。必要に応じて、野生型 αシヌクレイン線維の代わり に、 変異型 αシヌクレイン （Α30Ρ、 Α53Τ、 Ε46Κ)、 Ν末端や C末端側が欠損した断 片化 αシヌクレイン、 5〜7箇所存在する繰り返し配列を欠損した c シヌクレイン などの線維を用いた。 これらのシヌクレインの線維化方法は、野生型 αシヌクレイ ンの場合と同じである。 in vitroにおける cシヌクレイン線維化の抑制
精製リコンビナント αシヌクレインを 30 tnM Tris-HCl (pH 7. 5)、 0. 2 % NaN3に て希釈し 2 mg/raLとし、ポリフエノールの一種である Gossypet inを最終濃度 200 μ Μになるように添加、 37 °C、 200 rpmで振とうさせ線維化反応を行った。
線維化反応後の試料 10 しに、 300 mLの 5 /z Mチオフラビン S (Sigma- Aldrich) 溶 液 [0. 2 %チオフラビン S、 20 mM MOPS (pH 6. 8) ]を加え室温で 30分インキュべ —卜した。蛍光強度は日立 F4000蛍光スぺクトロフォトメーター (励起波長 440 nra、 蛍光波長 520 nm)を用いて測定した。 aシヌクレイン蓄精細胞モデルの評価法
(1)界面活性剤を用いて段階的に抽出したタンパグ質のィムノブロットによる解 近
野生型 αシヌクレインなどの pcDNA3プラスミ ドをトランスフヱクトした
SH-SY5Y細胞に、 aシヌクレイン線維 （野生型あるいは変異型など） をリポフェク トァミンにより導入し、 1日間インキュベーションした状態の細胞を使用した。 ゥ エルの培地を除去したのち、 0. .5 raLの 0. 25% トリプシン溶液を加え、 37°Cで 10 分間保温した。 そこに 0. 5 mLの!3 BSを加え、 ピベッティングで細胞をはがし回収 した。 遠心分離 （1, 800 g、 5分、 4°C) により細胞を回収し、 さらに l mLの PBS を加えて洗浄し.、 同条件の遠心分離により細胞を回収した。
細胞は、 100 しの破砕バッファー（50 niM Tris- HC1, pH 7. 5/0. 15 M NaCl/5 raM ethylene diamine tetra acetic acid/5 mM EGTA/プロテアーゼ阻害剤カクテノレ） に懸濁したのち超音波処理を行った。細胞破砕液は超遠心分離 (290， 000 g、 20分、 4°C)を行い、 上清のトリス可溶性画分を回収した。 トリス可溶性画分は、 BCA Protein assay kit . (PIERCE) を用いてタンパク質定量を行ったのち、 Sodium . dodecylsulphate (SDS) ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （SDS- PAGE) 用サンプ 'ルバッファーを加えて SDS-PAGE用の試料とした。
一方、 沈殿画分は、 lOO /z Lの 1 % Triton Χ-100 (ΤΧ) を含む破碎バッファーと 共に超音波処理を行い、 同じ条件 （290, 000 g、 20分、 4°C) で超遠心分離を行つ た。 得られた上清を TX可溶性画分とし、 SDSサンプルバッファーを加えて電気泳 動用の試料とした。 TX処理の沈殿画分は、 lOO ^ Lの 1 %サルコシル （Sar) を含 む破碎バッファー中で超音波処理を行い、 次いで 37°Cで 30分保温した。 保温のの ち超遠心分離 (290, 000 g、 20分、 4°C) を行い、 得られた上清を Sar可溶性画分 とし、 同様に SDS- PAGE用のサンプルに調製した。 沈殿画分は、 100 /z Lの SDSサン プルバッファーを加えて超音波処理し、 電気泳動用の試料とした。
得られたすべての画分について 13. 5 % ゲルを用いたトリス · トリシン SDS- PAGE を行った。電気泳動後、ゲルをポリビニリデンジフルオリ ド （PVDF) 膜に転写した のち、 3%ゼラチン溶液でブロッキングを行い、 1， 000倍希釈した抗 αシヌクレイ ン抗体 (anti- a syn) あるいは抗リン酸化 αシヌクレイシ抗体 （anti- PSerl29) と 室温でー晚反応させた。 反応後の PVDF膜は、 Tris- buffered saline (TBS) で洗浄 したのち、 500倍希釈したピオチン化マウス Ig Gと室温で 1時間反応させた。 反 応後、 TBSにて膜を洗浄したのち、 ィムノスター試薬 （和光純薬工業） で処理し、 エックス線フィルム （富士フィルム） に感光させてバンドを検出した。
' (2) 共焦点レーザー顕微鏡観察
SH-SY5Y細胞はカバ一ガラスの上で培養を行つた。 定法に従い pcDNAS- a synを 発現させてー晚保温したのち、 シヌクレイン線維を導入した。 導入して数日間 （1 〜2日間） インキュベーションを行ったのち、 1 mLの 4%パラホルムアルデヒドを 加えて細胞を固定した。 固定した細胞は、 0. 2 % TXで処理したのち、 5 %牛血清 アルブミン /PBS溶液でブロッキングを行い、 anti-PSerl29 (1， 000倍希釈） と 37°C で 1時間反応させた。
次に 0. 05 % Tween 20を含む TBS (TBS-T) で細胞を洗浄したのち、 FITC標識し た抗マウス二次抗体と 37°Cで 1時間反応させた。 同様に TBS-Tで洗浄したのち、 細胞を TOTPRO - 3 (2, 000倍希釈） と反応させて核染色を行った。 また一部の細胞に ついては、 0. 05%チオフラビン S .と室温で 5分間反応させた。 これらをスライドガ ラス上で封入した後、 共焦点レーザー顕微鏡 (Zeiss) で解析した。 (3) 細胞死アツセィ.
細胞死アツセィは、 pcDNA3- a synベクターおよび αシヌクレイン線維を導入し、 線維化阻害剤の存在下あるいは非存在下で 3日間ィンキュベー卜した細胞を用い た。 線維化阻害剤としては、 ポリフエノールの一種である Gossypetin (20 μ Μ) を 用いた。
3日間インキュベートしたのち、 培養中の細胞の培地を一部回収した。 残りの培 地を除去した細胞は、上述したトリス可溶性画分の調製と同じ方法で処理し、 トリ ス可溶性画分を調製した。 回収した培地とトリス可溶性画分を用いて、 CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit (Promega) による細胞死アツセィ 行 つた。 方法は、 Kitに添付の説明書に従った。 2 . 結果
aシヌクレイン重合体の細胞内への導入 '
本項では、 aシヌクレイン重合体 (線維）を神経芽細胞 SH- SY5Y内に導入できるか どうかについて検討した。超音波処理し c シヌクレイン線維 （F a S) (2 ^) お よび線維ィヒしていない可溶性 aシヌクレイン （2 ju g) を、それぞれリポフエクトァ ミン試薬と共に SH- SY5Y細胞に添加し、ー晚反応させたのちに細胞を回収し、ィム ノブ口ットで解析した。 ■ .
その結果を図 1に示した。図 1 (a) はリン酸化に関係なく αシヌクレインを認識 する抗体 (anti- a syn) を用いて、 図 1 (b) .はリン酸ィ匕 αシヌクレインのみを特異 的に認識する抗体 (anti - PSerl29) を用いてィムノブロットした結果をそれぞれ示 している。可溶性 c シヌクレインをリボフェクトアミン処理して細胞に添加しても 全くバンドは検出されなかったのに対し （図 1、 「可溶性」 の 「十」 のレーン） 、 aシヌクレイン線維をリボフ.エタトアミン存在下で細胞に添加した場合 ( 「F « S」 の 「十」 のレーン）は、 どちらの抗体でもバンドが検出された。 この結果は、 αシ ヌクレイン線維、あるいは重合核となりうる αシヌクレイン重合体はリボフェクト ァミンの作用により細,胞内に導入され、かつリン酸化されることを示している。ま' た αシヌクレイン.線維は細胞内に導入できた力 可溶性ひシヌクレインは導入され なかった。 さらに、家族性パーキンソン病家系解析から見出された変異型 αシヌク レイン （Α30Ρ、 Α53Τ、 Ε46Κ)、 Ν末端や C末端側が欠損した断片化 aシヌクレイン、 5〜7箇所存在する繰り返し配列を欠損した aシヌクレインなどの線維も、 全長の 野生型 αシヌクレイン線維と同様にリボフヱクトァミン試薬で細胞内に導入でき フ aシヌクレイン蓄積モデル細胞の作製
本項では、 ひシヌクレイン重合体 (線維） を導入する方法を利用して、 予め可溶 性 αシヌクレインを発現させておいた細胞に線維を導入すると、細胞内で αシヌク レインの蓄積が起こるかどうかを検討した。 αシヌクレイン線維のみを導入した細 胞 （F ct S)、 αシヌクレイン遺伝子を組み込んだ pcDNA3ベクター （pcDNA3- a syn) をトランスフヱグトした細胞（WT)、 pcDNA3- a synをトヲンスフエタトしたのち a シヌクレイン線維を導入した細胞 （WT+F a S) の三種類の細胞を調製し、 これらか ら細胞内の a.シヌクレインの抽出を試みた。調製した細胞はトリプシン処理したの ち、 PBSで洗浄し、 破砕バッファーに懸濁し超音波処理を行った。 破碎液は方法の 項に示したように、 界面活性剤である Triron X- 100およびサルコシルを用いて順 次タンパク質の可溶化を行った。 得られた各画分は、 anti- a synおよび anti- PS.erl29抗体を用いたィムノブ口ッ卜で解析した。その結果を図 2に示した。 線維のみを導入した F a S細胞では、 界面活性剤に不溶な画分 （ppt画分） に多 くの anti- a syn抗体陽性のバンドが出現し、.その一部はリン酸化されていること が分かった。 すなわち、 この結果から、 シヌクレイン線維が細胞内に導入されそ の一部がリン酸化を受けること、および導入された線維、重合核となりうる αシヌ クレイン重合体は、その間、細胞内でもその性質を維持し除去あるいは可溶ィ匕され ないことが明らかとなった。 pcDNA3- a synを発現させた細胞 （WT) では、 ほとん どの シヌクレインは可溶性画分 （TS画分） に回収された。 このことは、 細胞内 で αシヌクレインが大量に生合成されても、通常の状態では可溶性のまま存在して おり、 容易に線維化及び/又は不溶化しないことを示しており、 また、 そのほとん どはリン酸ィ匕されていないことも判明した。 '
一方、 αシヌクレインプラスミ ド DNAおよび線維を導入した WT+F ct S細胞では、 いずれの画分にも anti- a syn抗体陽性のバンドが出現した。.特に ppt画分におい てバンドが顕著に観察され、同様にリン酸化シヌクレインも ppt画分に多く検出さ れていた。 すなわち、 WT+F a S細胞では、 αシヌクレインが細胞内で不溶化 ·蓄積 しているため、その多く力 ppt画分に回収されたと考えられる。また訂 +F a S細胞 の ppt画分のリン酸化 αシヌクレイン量は、 線維のみを導入した F a S細胞のリン 酸ィ匕 aシヌクレイン量と比べて大幅に増加していることが分かる。 この結果は、プ ラスミド由来の可溶性 aシヌクレイン力、導入された aシヌクレイン線維依存的に (言い換えれば、導入された線維を核として）細胞内で蓄積することを示している。 患者脳に見られるレビー小体に存在する cシヌクレインも、 細胞内で蓄積及び/ 又は不溶化し、力 リン酸ィ匕などの翻訳後修飾を受けている。患者脳に蓄積した a シヌクレインも界面活性剤に不溶性な画分に回収されるという事実より、今回開発 したモデル細胞における蓄積 cシヌクレインは、患者脳における蓄積 αシヌクレイ ンと生化学的に類似した性質を持つことが明らかとなった。 aシヌクレイン蓄積 ¾3胞の免疫組織化学的観察
αシヌクレインプラスミ ド DNAおよび線維を導入した WT+F a S細胞内の蓄積 αシ ヌクレインは、患者脳におけるレビー小体に存在する蓄積 αシヌクレインと生ィ匕学 的に類似した性質を有したことから、本項では、次に細胞内の蓄積シヌクレインを 免疫組織化学的に観察して、 レビ一小体と形態学的に比較した。 未処理 （none；)、 αシヌクレインプラスミ ドのみ発現させた WT.細胞、 線維のみ導入した F a S細胞、 プラスミドおよび線維を導入した WT+F a S細胞の 4種類の細胞を、リン酸化 αシヌ クレインのみを特異的に認識する anti- PSerl29抗体による免疫染色を行い、 共焦 点レーザー顕微鏡による観察を行つた。
その結果、 図 3に示したように、 WTおよび F ct S細胞ではリン酸化シヌクレイン を含む細胞はそれほど多く存在しないのに対し、 WT+F a S細胞では、 anti - PSerl'29 抗体陽性細胞がさらに増カ卩した。 これらの陽性細胞の細胞質には、 この抗体で強く 染色される、 直径約 10〜15 nraの丸い構造物が存在していた （図中、 白矢印で示し た)。 この形態ば、 患 脳に見られるレビー小体と'大きさに関しても類似していた (図 5参照） 。 . aシヌクレイン蓄積モデル細胞内に出現する構造物の性質
本 I頁では、 WT+F a S細胞で観察された丸レ、構造物 （図 3 ) ί aシヌクレイン線 維からなるかどうカ こついて検討した。 ここでは、 /3シート構造に富む線維性タン パク質と特異的に結合する蛍光色素の一種であるチオフラビン Sによる染色を試 みた。 WT+F a S細胞を anti-PSerl29抗体、 T0-PR0- 3、 およびチオフラビン Sと三 重染色し、 共焦点レーザ一顕微鏡にて観察した。
図 4に示したように、リン酸ィ匕 αシヌクレイン抗体で染色された丸い構造物のい くつかは、 チオフラビン Sによっても染色されることが判明した （図中、 白矢印で 示した） 。 以上の結果と図 2より、 WT+F c S細胞内に出現した丸レ、構造物は、 リン 酸ィ匕 OLシヌクレインが線維化および不溶ィ匕して形成されたものであることが考え られた。
患者脳に見られるレビー小体には、リン酸ィ匕 αシヌクレインだけでなくュビキチ ンも含まれることが知られている。 そこで、 WT+F a S細胞内における構造物がレビ 一小体と同様にュビキチン化されているかどうかにつレ、て調べた。
WT+F a S細胞およびレビー小体型痴呆症 (DLB) 患者脳のビブラトーム.切片を、 それぞれ anti-PSerl29抗体およびュビキチン抗体による二重染色を行レ、、 共焦点 レーザー顕微鏡で観察した。 結果を図 5にまとめた。
DLB患者脳のビブラトーム切片の染色象より、 リン酸化 aシヌクレイン抗体で認 識されるレビー小体はほとんどュビキチン陽(4を示すことが観察された（図中、 白 矢印で示した）。 ひシヌクレインプラスミ ぉよぴ線維を導入した WT+F a S細胞で は、 リン酸化 αシヌクレイン抗体陽性を示す細胞内構造物は、患者脳のレビー小体 と同様にュビキチン抗体でも染色されることが明らかとなった（図中、 白矢印で示 した） 。 .
以上の結果より、今回開発した シヌクレイン蓄積モデル細胞に出現する細胞内 構造物は、 レビー小体と形や大きさだけでなく、 リン酸化 (Xシヌクレインの線維か ら構成され、ュビキチン化されているという性質まで類似していることが判明した。 シヌクレイン蓄積モデル細胞に誘導される細胞死 '
αシヌクレインプラスミ ド DNAおよび線維を導入した細胞を 3日間培養すると、 未処理の細胞 （図 6 (a) ) と比べて明らかな形態変化が認められる （図 6 (b) ) 。 形 態変化に加えて細胞数の減少も見られることから、 本項では、 WT+F a S処理細胞に おけるこの変化が細胞死と関連して 、るかどうかにつレ、て検討した。
未処理の細胞 (none；)、 αシヌクレイン線維のみ導入した細胞 （F a S)、 c シヌク レインプラスミ ド DNAおよぴ線維を導入した WT+F c S細胞の三種類の細胞について、 細胞死のアツセィを行った。 それぞれ 3日間培養を行ったのち乳酸脱水素酵素 (LDH) 漏出アツセィによって細胞死を評価した。 このアツセィは、本来細胞内に存 在する LDHが、細胞死の際にどれだけ細胞外に漏出するかを定量する方法に基づい ており、細胞外の LDH活性が高ければ高いほど強い細胞死が起きているということ になる。
細胞死のアツセィの結果を図 6 (c) に示した。 この図から明らかなように、 未処 理および αシズクレイン線維のみを導入した細胞では細胞死は 10%程度であった のに対し、 αシヌクレインプラスミ ド DNAおよび線維を導入した WT+F a S細胞では 約 30%の細胞死が認められた。 このように訂 +F a S細胞において、 αシヌクレイン 蓄積がとも う細胞死が誘導されることが明らかとなった。. aシヌクレイン蓄積モデル細胞に誘導される細胞死の抑制
図 6で観察された WT+F a S細胞死ァッセィ系を利用して、その細胞死を抑制する 薬剤の探索はパーキンソン病などの神経変性疾患に対する治療薬開発につながる と考えられる。
Gossypetinはァオイ科シロバナヮタに含まれるフラボノールであり、 食品添カ卩 剤として利用されているポリフエノール化合物である。 そこで、本発明者は、 まず Gossypetinが in vitroで αシヌクレインの線維化を抑制するかどうかを検討した。
2 mg/mL (D aシヌクレインを 20 μ Μ Gossypetinの存在下で、 37°Cで振とうして、 線維化を行った。反応後の溶液に、チオフラビン Sを添加し、蛍光強度を測定した。 ' チオフラビン Sは、 シート構造に富むタンパク質重合体の重合核となりうるタン パク質又はその重合体に結合して、蛍光を発する試薬であり、タンパク質重合体の 重合核となりうるタンパク質又はその重合体や線維の有無の判定に利用されてい る。 αシヌクレイン線維は βシート構造に富む構造を有しており、 Gossypetin力 αシヌクレイン線維化を抑制する場合、未添加のものよりも蛍光強度が減少するは ずである。
その結果、 Gossypetinnを添加した場合は、 未添加の場合に比べて、 蛍光強度が 顕著に減少することが観察された （図 7 ) 。
以上より、 Gossypetinが in vitroで αシヌクレインの線維化を抑制することが見 出された。 in vitroでの aシヌクレイン線維化の顕著な抑制が確認できたので、 次いで、 Gossypetinが訂 +F ct S細胞で誘導される細胞死を抑制できるかどうかについて調 ベた。 ■ . 、
cシヌクレインプラスミ.ドおよび線維を導入した SH- SY5Y細胞に、 20 // M Gossypetinを添加し、 3日間インキュベートしたのち細胞死のアツセィを行った。 結果を図 8に示す。図 8に示ように、ポリフエノールイヒ合物を添加しない場合で は約 50%の細胞死が起きていたが、 Gossypetinを添加した場合では顕著な細胞死の 抑制が認められた。この結果より、ポリフエノールの一種である' Gossypetinには、 WT+Fひ S細胞に誘導される糸田胞死を抑制する効果があることが示された。
以上のことから、本発明の方法により、. cシヌクレイン蓄積による細胞死を抑制 する化合物又は天然物のスクリーニングが容易に行えることが判明した。スクリー ニングで探索された化合物は、新たなターゲットのパーキンソン病あるいは神経変 性疾患治療薬となり得るものであり、本発明の方法は極めて有用なスクリーニング 法であるといえる。 .： 産業上の利用可能性
本発明により、タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体 が導入された細胞、 またその製造方法が提供される。 本発明の細胞は、実際の神経 変性疾患患者の脳に見出される構造物の特徴を有するモデル系として利用するこ とが可能であり、アルツハイマー病やパーキンソン病の発症を解明するために有用 である。 また、本発明の細胞は、種々の神経変性疾患やアミロイドーシスに共通の 発症メカニズムなどの解析に極めて有用である。 さらに、本発明の細胞は、神経変 性疾患の発症機構だけでなく、タウタンパク質やひシヌクレイン等の細胞内蓄積を 抑制する化合物のスクリーニングなどにも容易に応用でき、新しい作用機序を有す る治療薬の開発につながることが期待できる。

Claims

請 求 の 範 囲
I. タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体が導入され た細胞。 ' .
2. タンパク質が、タウタンパク質、 ]3アミロイドタンパク質、 αシヌクレイン、 ポリグルタミン、 S0D1及びプリオンタンパク質並びにこれらの変異体からなる ' 群から選 される少なくとも一種である請求項 1記載の細胞。
3 . タンパク質がリン酸化ざれたものである請求項 1又は 2記載の細胞。 ■
4 . 神経細胞又はグリァ細胞である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の細胞。
5 . 神経変性疾患のモデル細胞である請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の細胞。
6 . タンパク ¾重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体を神経細胞 又はグリア細胞に導入することを特徴とする、神経変性疾患のモデル細胞の製造 方法。
7 . タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体と、 当該タ ンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドとを神経細胞又はグリア細胞に 導入し、前記重合核となりうるタンパク質又は重合体と、プラスミドの発現によ り生じるタンパク質,とを相互作用させることにより、細胞内にタンパク質重合体 を蓄積させることを特徴とする、 神経変性疾患のモデル細胞の製造方法。 '
8. タンパク質力 S、タウタンパク質、 3アミロイドタンパク質、 ひシヌクレイン、 ポリグルタミン、 S0D1及びプリオンタンパク質並びにこれらの変異体からなる 群から選択される少なくとも一種である請求項 6又は 7記載の方法。
9 . タンパク質がリン酸化されたものである請求項 6又は 7記載の方法。
1 0 . 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の細胞に候補物質を接触させることを 特徴とする、タンパク質重合体の細胞内蓄積を抑制する物質のスクリーニング方 法。 .
I I . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の細胞に候補物質を接触させることを 特徴とする、 変性疾患治療薬のスクリーニング方法。
1 2 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の細胞を含む、 タンパク質重合体の細胞 内蓄積を抑制する物質又は変性疾患治療薬のスクリーニング用キット。
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