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WO2007060715A1 - インターロイキン－６（ｉｌ－６）シグナル伝達阻害剤スクリーニング方法 - Google Patents

インターロイキン－６（ｉｌ－６）シグナル伝達阻害剤スクリーニング方法 Download PDF

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WO2007060715A1
WO2007060715A1 PCT/JP2005/021485 JP2005021485W WO2007060715A1 WO 2007060715 A1 WO2007060715 A1 WO 2007060715A1 JP 2005021485 W JP2005021485 W JP 2005021485W WO 2007060715 A1 WO2007060715 A1 WO 2007060715A1
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WO
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compound
cells
screening
hydrogen
chemical
Prior art date
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PCT/JP2005/021485
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English (en)
French (fr)
Inventor
Toshio Kitamura
Toshiyuki Kawashima
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC filed Critical University of Tokyo NUC
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Priority to US12/085,324 priority patent/US20090280483A1/en
Priority to JP2007546317A priority patent/JP4882076B2/ja
Publication of WO2007060715A1 publication Critical patent/WO2007060715A1/ja
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    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a compound that inhibits the activity of a component of interleukin-6 (IL-6) signal transduction system, and an IL— identified by the Stallung method. 6 relates to a compound that inhibits the activity of a component of a signal transduction system.
  • IL-6 interleukin-6
  • Interleukin 6 was first discovered as a site force-in that induces terminal differentiation of B cells into antibody-producing cells. Various cells including T cells, B cells, macrophages, and fibroblasts It is known to be produced and secreted by species. When IL 6 binds the receptor IL- 6R a present on the cell membrane, IL- 6R a causes dimer I spoon of to what gpl30 as well as gp 130 and meeting if a cell transmembrane protein.
  • JAK1 and JAK2 belonging to the 3 ⁇ 4JAK (Janus kinase) family are constitutively associated with the intracellular domain of gpl30, and JAKs that associate with gpl30 by the dimerization of gpl30 are close to each other. JAK is thought to be activated by phosphorylating tyrosine residues with each other. Activated ⁇ JAK further activates these molecules by phosphorylating tyrosine residues in the intracellular region of gpl30 and various signal molecules.
  • a member of the STAT (signal transducer and activator of transcription) family has a SH2 (src homology 2) domain that recognizes a phosphorylated tyrosine residue, and the tyrosine residue is phosphorylated by that domain. It binds to ligated gpl30 and undergoes phosphorylation of tyrosine residues by JAK. STAT-phosphorylated STAT is released from gpl30, and then the released STAT SH2 domain binds to the phosphorylated tyrosine residues of other STATs, indicating that STAT homodimer or heterodimer. Form.
  • the dimerized STAT moves into the nucleus and, together with other gene regulatory proteins, binds to the response elements of various genes to promote transcription of the target gene. Also, like STAT phosphorylation, She and Shp are also known to undergo phosphorylation on gp130. Downstream of these molecules are PI3K and Akt-mediated pathways as well as RasZMAPK pathways. It affects various aspects of cell survival and differentiation (Non-Patent Documents 14).
  • IL 6 signaling molecules are active in many pathologies such as multiple myeloma, Castleman tumor, rheumatoid arthritis, etc.
  • Inhibitors that inhibit the activity of IL-6 signaling components are expected to be therapeutic agents for these diseases.
  • STAT3 is active in many cancer cells, and its activity is known to be involved in cell transformation, so STAT3 inhibitors are broad spectrum anticancer agents. It can be considered.
  • constitutively active mutations in JAK2 cause many myeloproliferative disease (MPD) cases (Non-Patent Documents 5-8).
  • Non-Patent Literature l Nakajima K, Yamanaka Y, Nakae K, et al. A centr al role for Stat 3 in IL— 6— induced regulation of growth and diffe rentiation in Ml leukemia cells.
  • Non-Patent Document 2 Kawashima, T., Hirose, ⁇ ., Satoh, ⁇ ., Kaneko, A., Ikeda, ⁇ ., Kaziro, ⁇ ., Nosaka, ⁇ ., And Kitamura, ⁇ . (2000).
  • MgcRacGAP is involved in the control of growth and dif ferentiation of hematopoietic cells. Blood 96, 2116— 2124.
  • Non-Patent Document 3 Kawashima, T., Murata, ⁇ ., Akira, S., Tonozuka, ⁇ ., Minoshima, ⁇ ., Feng, S., Kumagai, ⁇ ., Tsuruga, ⁇ ., Ikeda, ⁇ ., Asano, S., et al. (2001).
  • STAT5 induces mac rophage differentiation of Ml leukemia cells through activation of IL— 6 production mediated by NF— kappaB p65. J. Immunol. 16 7, 3652- 3660.
  • Non-Patent Document 4 Tonozuka Y et al. Blood 104 (12) 3550-7 (2004)
  • Non-Patent Document 5 James C, Ugo V, Le Couedic JP, Staerk J, Delhom meau F, Lacout C, Garcon L, Raslova H, Berger R, Bennaceu r— Griscelli A, Villeval JL, Constantine scu SN, Casadevall N, Va inchenker W.
  • a unique clonal JAK2 mutation leading to constitut ive signaling causes polycythaemia vera. Nature. 2005; 434: 1144
  • Non-Patent Document 6 Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, Teo SS, Tied t R, Passweg JR, Tichelli A, Cazzola M, Skoda RC.A gain— of—function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders. NE ngl J Med 2005; 352: 1779-1790.
  • Non-Patent Document 7 Levine RL, Wadleigh M, Cools J, Ebert BL, Wernig
  • Non-Patent Document 8 Zhao R, Xing S, Li Z, Fu X, Li Q, Krantz SB, Z hao 7.Identification of an acquired JAK2 mutation in polycythe mia vera. J Biol Chem. 2005; 280: 22788-22792.
  • Non-Patent Document 9 Rosania GR, Merlie J Jr, Gray N, Chang YT, Schultz PG, Heald R. A eye lin— dependent Kinase inhibitor inducing cancer cell differentiation: biochemical identification using Xenopus egg extracts. Proc Natl Acad Sci US A. 1999; 96: 4797— 4802.
  • Non-Patent Document 10 Murata K, Kumagai H, Kawashima T, Tamitsu K, Irie M, Nakajima H, Suzu S, Shibuya M, Kamihira S, Nosaka
  • Non-patent literature ll Winter— Vann AM, Baron RA, Wong W, dela Cruz J, York JD, Gooden DM, Bergo MO, Young SG, Toone EJ, Casey PJ.A small ⁇ molecule inhibitor of isoprenylcysteine carboxyl me thyltransf erase with antitumor activity in cancer cells.Proc N atl Acad Sci US A. 2005; 102: 4336— 41.
  • Non-Patent Document 12 Shimizu S et al. Blood 72 (5) 1826— 1828 (1988)
  • Non-Patent Document 13 Burger R et al. Hematol J. 2 (1) 42- 53 (2001) Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to provide a method for screening a compound that inhibits the activity of a component of the IL-6 signal transduction system.
  • the method of the present invention comprises:
  • step (b) For the compound selected in step (a), biochemically further selects a compound that inhibits the activation of any of the components of the IL-6 signal transduction system by biochemical means. Screening step.
  • the cells that are killed by IL-6 stimulation used in the positive screening step are preferably derived from mice or humans, more preferably clones derived from M1 cells derived from mice. Or a cell created by genetic engineering.
  • the target molecule of a compound that inhibits the activity of a component of the IL-6 signal transduction system is preferably mediated by Ras, a component of a pathway mediated by STAT3. It is a component of the pathway or a component of the pathway through PI3K and Akt.
  • the biochemical means of the biochemical screening step is preferably a Western blot method, a kinase assay, a transcription activity assay assay, a surface plasmon resonance method, an immunoprecipitation method, a cell staining method, a gene It is performed using any method selected from the group consisting of gene expression analysis by chip, Northern blotting, and RT-PCR, or a combination thereof.
  • a cell that proliferates by stimulation with IL-6 from a compound selected in the positive screening step is used.
  • the method further includes a negative screening step of selecting a compound that suppresses IL 6-dependent proliferation.
  • the cells that proliferate upon stimulation with IL-6 used in the negative screening step are preferably human-derived, and more preferably IL-6-dependent neoplastic cell lines.
  • Another object of the present invention is to provide a compound obtained by the screening method of the present invention, which inhibits activation of a component of the IL-6 signal transmission system.
  • IL-6 signal transduction can be achieved by a method of screening for a compound that inhibits the activity of a component of the IL-6 signal transduction system.
  • the present inventors came up with the present invention by identifying compounds that inhibit the activity of system components.
  • the present invention comprises (a) a positive screening step using cells that die by stimulation with IL-6, and selecting a compound that suppresses the death of the cells when stimulated with IL-6, ):
  • the biochemical means further selects a compound that inhibits activation of any of the components of the IL-6 signal transmission system.
  • the present invention provides a method for screening a compound that inhibits the activity of a component of the IL-6 signal transduction system including a screening step. Higher screening accuracy Therefore, between the positive screening step (a) and the biochemical screening step (b), cells that proliferate upon stimulation with IL-6 from the compound selected in step (a) are used. It may further include a negative screening step of selecting a compound that suppresses IL 6-dependent proliferation of the cell.
  • the method of screening for a compound that inhibits the activity of an IL-6 signal transduction system component invented by the inventors of the present invention is carried out during the positive screening step. This is done by identifying a compound that inhibits the death of IL-6-stimulated cells that die by stimulation. In this positive screening process, cells proliferate only when a compound that inhibits the activation of the IL-6 signal transduction system is added, so there is a possibility that a false positive due to the cytotoxicity of the compound will occur. Very few. In fact, less than 0.142% of compounds passed the positive screening process performed as a no-lot.
  • a compound that inhibits the activity of a constituent factor of the IL-6 signal transduction system can be more reliably selected by using a biochemical means such as a Western plot. Then, examine which part of the IL-6 signal transduction system (site force-in, receptor, kinase, transcription factor, etc.) inhibits the activity selected by the positive screening process. Is possible.
  • IL 6 signal transduction system means that secretory protein IL 6 binds to receptor IL 6R a, and activated intracellular JAKs phosphorylate other proteins. This is a signal cascade that starts with this. As shown in FIG. 1, a route via STAT, a route via Ras, a route via PI3K and Akt, and the like are known.
  • the “constituent factor of IL-6 signal transduction system” of the present invention includes any one of the molecules shown in FIG. 1 or a group of molecules having a plurality of molecular forces. Preferably, it is a component of a pathway through STAT3, a component of a pathway through Ras, or a component of a pathway through PI 3K and Akt.
  • “Inhibiting the activity of a constituent factor” is not particularly limited, and phosphorylation 'dephosphorylation of a constituent factor, kinase' phosphatase activity, inhibition of binding to other factors, And all aspects that inhibit the normal function (biological function) of the constituent factors, such as inhibition of nuclear translocation. “Inhibition” includes not only complete inhibition, but also partial inhibition of activation of a constituent factor and reduction of activation.
  • cells that die by stimulation with IL-6 are used, and a compound that suppresses the death of the cells when stimulated with IL-6 is selected.
  • the cell that is killed by the stimulation of IL-6 to be used is derived from a mouse or a human.
  • the cell that is killed by the stimulation of IL 6 to be used is a clone derived from a mouse-derived Ml cell or a genetically engineered cell. .
  • the "cell killed by IL 6 stimulation” refers to a cell that is completely killed by adding IL 6 to the culture medium in the process of cell culture. Those skilled in the art can easily understand and understand such cells, and can easily create known cell forces by genetic engineering by selection and modification from known cultured cells. . Although not necessarily limited, it is preferably derived from mouse or human. More preferably, a clone derived from an Ml cell derived from a mouse (Ml clone) or a genetically engineered cell It is.
  • the Ml clone refers to a clone obtained by selecting a clone that can be easily killed by adding IL-6 from a known mouse leukemia cell Ml cell (ATCC number TI B-192 etc.). This Ml clone can be selected based on the indication that the IL-6 concentration in the culture medium is killed under the condition of 10 ngZm 1, preferably 7.5 ngZml, more preferably 5 ngZml.
  • “gene engineered cells” refer to transcription factors such as STAT3, c Jun, ATF-2 or Elk-1, which are transcribed by transcription factors existing downstream of the IL-6 signal transduction system.
  • the suicide gene may be a gene that produces a cytotoxic substance such as HSV-tk, or a gene that induces apoptosis such as p53.
  • Such a method of creating a construct incorporating a target gene downstream of a specific promoter sequence and expressing it transiently or inserting it into a genome and expressing it constitutively is known in the art. It is well known.
  • “suppressing cell death” is not limited, but it is 10% or more, preferably 30% or more, and more preferably among cells cultured! / More than 50%, more preferably more than 90% survive.
  • Cell viability can be measured by using ordinary knowledge in the art, such as a method using FACS (described in Examples) and a method of staining with trypan blue.
  • the compound is cultured at a density of 20 / z M, preferably 5 M, more preferably 1.25 / ⁇ , more preferably 0 in a medium in which cells that die by stimulation with IL 6 are cultured.
  • a concentration of 3 ⁇ ⁇ and then adding IL-6 at a concentration of 5 ngZml, preferably lOngZml, more preferably 20 ngZml, and selecting the compound in which the cells survive, the compound library can — Screening for compounds that inhibit the activity of components that constitute the 6 signal transduction system.
  • the compound selected by the positive screening process of the present invention is a compound having no cytotoxicity and a function of inhibiting the activity of a component of the IL 6 signal transduction system. You can say that. This is because a compound that inhibits the activity of a constituent factor of the IL-6 signal transmission system is expected to be used in a pharmaceutical composition as an anticancer agent or the like, and these characteristics are desirable.
  • the biochemical screening step of the present invention is a compound that inhibits the activation of any of the components of the IL 6 signal transduction system by biochemical means for the compound selected in the above screening step or the like. Select further.
  • the biochemical means includes Western plot method, kinase assay, transcription activity assay assay, surface plasmon resonance method, immunoprecipitation method, cell staining method.
  • the gene expression analysis using a gene chip, the Northern plot method, and the RT-PCR method are performed using any one method selected from the group or a combination thereof.
  • biochemical means refers to means including immunological means and physical means that can be used in biochemical research.
  • Immunological means means means using an antibody such as Western plot method, immunoprecipitation method, cell staining method and the like. For example, in the Western plot method, it is possible to determine the phosphoric acid state of a constituent factor of the IL-6 signal transduction system or the increase or decrease of the tank mass in the nucleus.
  • Physical means refers to means for measuring biochemically important parameters, such as their binding strength, by using physical properties of proteins and compounds such as surface plasmon resonance. Say.
  • Surface plasmon resonance is a means by which the kinetics of binding between proteins and compounds can be examined. Specifically, the binding interaction is detected by detecting the reflected light emitted from the boundary between the aqueous solution of the compound and the surface of the biosensor coated with the immobilized protein or the like. The concentration of the aqueous solution of the compound varies depending on whether it interacts with proteins, etc., and the degree of interaction between compound proteins is measured by measuring this slight decrease rate (resonance signal). be able to. Specifically, the BIA core system (BIACORE) method is generally used, and this allows interaction between the target compound and protein. And the dissociation constant (Kd).
  • BIA core system BIACORE
  • biochemical means is not limited to these methods, and includes methods for measuring the activity of known intracellular signal molecules, such as kinase assay, transcription activity assay assay, and the like. .
  • the kinase assay is an assay performed to measure the influence of a substance that regulates the function of a specific kinase. That is, the degree of inhibition by a protein compound having kinase activity can be determined.
  • Kinase assembly can be performed by adding the target compound, protein having kinase activity, kinase substrate and ATP in an appropriate buffer, and identifying the amount of ATP remaining after a certain period of kinase reaction. .
  • ATP can be detected by any method as long as it is quantitative.
  • luciferin is subjected to the action of the enzyme luciferase and ATP is used to measure the amount of luminescence when it is converted to oxidized luciferin.
  • the effect of the compound of interest on kinase activity can be quantified using fluorescent dyes, luminescent dyes or radioactive isotopes, for example, using [ ⁇ — 32 P] ATP to bind the substrate. It is also possible to measure the amount of ⁇ - 32 ⁇ ⁇ ⁇ using a scintillation counter.
  • the transcription activity measurement assay is an assay that analyzes the regulation of the transcription level of a gene, or is an assay that measures the activity of a transcription factor that activates a target gene and its upstream components. . Specifically, luciferase acetylase or CAT (chloramphe-cholacetyl transferase) acetylase is known. These methods are
  • a plasmid incorporating a luciferase gene or CAT gene as a reporter was created downstream of the transcriptional regulatory region of the target gene.
  • the enzyme activity of cells into which the plasmid has been introduced is measured.
  • the specific luciferase procedure is illustrated in the examples.
  • the screening method of the present invention uses a cell that proliferates by stimulation with IL-6 from a compound selected in the positive screening step between the positive screening step and the biochemical screening step. 6 Further includes a negative screening step to select compounds that inhibit dependent growth.
  • the cells that proliferate upon stimulation with IL-6 used in the negative screening step are preferably human.
  • the negative screening step of the present invention is preferred U.
  • the cell that proliferates upon stimulation with IL-6 used in the negative screening step is an IL-6-dependent neoplastic cell line. .
  • Cells proliferating upon stimulation with IL 6 are not limited, but in the cell culture process, 5 ngZml, preferably 3 ngZml, more preferably lng Zml IL6 is added to the culture medium. By doing so, proliferate cells!
  • the human Rennelt T cell lymphoma cell line KT-3 cells (Non-patent document 12) (Source: Norihiro Nishimoto, Osaka University graduate School of Life Sciences, Department of Immunoregulation) or the human myeloma cell line INA — 6 cells (Non-patent Document 13) (obtained by Martin Gramatzki, MD, Director, Division of Stem Cell and Immunotherapy 2nd Medical Department, University of Kiel Schittenhelmstr. 1224105 Kiel Germ any).
  • IL-6 is added at a concentration of 1-20 ngZml, preferably 2-10 ngZml, more preferably 5 ngZml, in the medium in which cells proliferating upon stimulation with IL6 are cultured.
  • the compound is then added at a concentration of 0.1-50 M, preferably 1-25 M, more preferably 2-10 M.
  • a compound that inhibits the activity of the component of the IL-6 signal transduction system is selected from the compounds selected by positive screening. Can be ninged.
  • “Suppresses IL 6-dependent proliferation of cells” is compared to cell proliferation in control experiments.
  • the percentage force of proliferating cells is at least 50% or less, preferably 25% or less, more preferably 10% or less, and more preferably 1% or less.
  • the proliferation rate of the cells can be measured by a method using FACS (described in Examples), a method for measuring uptake of promoxuridine (BrdU), or the like.
  • the cells that proliferate upon stimulation with IL-6 are derived from humans. This is a compound that inhibits the activity of components of the IL 6 signaling system in human cells selected by the positive screening process when the positive screening process is performed in non-human cells. Is important to determine.
  • the present invention provides a compound that inhibits activation of a component of the IL-6 signal transduction system identified by the above screening method.
  • a compound that inhibits the activity of a component of the IL-6 signal transduction system is represented by the following formula (1):
  • R 1 is hydrogen, (C—C) alkyl, or halogen; and R 2 is hydrogen, (C—C) alkyl, hydroxy group or (C—C) alkoxy group
  • R 1 is hydrogen, (C—C) alkyl, or halogen
  • R 2 is hydrogen, (C—C) alkyl, hydroxy group or (C—C) alkoxy group
  • R 1 is hydrogen or (C—C) anolequinol]
  • Equation (4)
  • R 3 are the same or different, hydrogen or halogen, respectively;
  • R 4 is hydrogen or halogen
  • R 1 is hydrogen or halogen
  • R 2 , R 3 and R 4 are the same or different and each represents hydrogen, (C—C) alkyl, hydroxy.
  • Equation (6) [0058] [6]
  • R 3 are the same or different, hydrogen or halogen, respectively;
  • R 4 , R 5 , and R 6 are the same or different, hydrogen or halogen, respectively].
  • R is a methyl group and R is a methoxy group.
  • R 1 is chlorine and R 2 is hydrogen.
  • R is chlorine and is also a methoxy group
  • R 1 is an n-octyl group.
  • R 2 and R 3 are fluorine and R 4 is chlorine.
  • R 1 is chlorine
  • R 2 is a methoxy group.
  • R 2 and R 3 are fluorine, and R 4 , R 5 , and R 6 are also fluorine.
  • FIG. 1 shows the IL 6 signaling system.
  • FIG. 2 shows that compound No. 1, 2, 4, 7, 10, 13, 14 and 16 force inhibits IL-6-dependent proliferation of KT-3 Itoda cysts.
  • the inhibitory activity of KT3 cell proliferation by each compound in the negative screening step was measured by FACS.
  • the cells plotted in the area surrounded by the black line frame are the proliferating cells, and the percentage in the whole is shown by%.
  • IL 6 was 5 ngZml
  • Compound No. 4 was 2 ⁇
  • other compounds were 10 ⁇ .
  • FIG. 3 shows that compound Nos. 13 and 16 inhibit IL-6-induced tyrosin phosphorylation in STAT3 in Ml cells.
  • compound No. 1, 2, 7, 10, 13, 14 or 16 was treated with 10 M, and 30 minutes later, it was treated with lOngZml IL-6, The results of examining the inhibition of STAT3 phosphorylation 1 hour after treatment by Western plot using Ml cells are shown. Obvious inhibition of STAT3 phosphorylation was observed with Compound Nos. 13 and 16.
  • FIG. 4 shows that compounds Nos. 2, 13, and 16 inhibit the IL-6-induced transcriptional activity of STAT3.
  • 1 hour after treatment with 20 / z M compound No. 2, 13, or 16 treatment with lOngZml IL-6 and 16 hours after treatment. 17 hours after treatment with the compound, the inhibition of STAT3 phosphorylation was examined by Western plot using 293T cells.
  • Compound No. 13 A clear inhibition of STAT3 phosphorylation was observed not only in No. 16 but also in No. 2.
  • FIG. 5 shows the results of examining the inhibition of STAT3 transcriptional activity by compound No. 2, 13, or 16 by luciferase assay using 293T cells in the biochemical screening process.
  • the experimental setup is the same as in Fig. 4. Inhibition of IL 6-induced transcriptional activity of STAT3 was observed in compounds No. 2, 13, and 16.
  • FIG. 6 shows that Compound No. 2 inhibits IL 6-induced tyrosine phosphorylation of STAT3 but not ERK1Z2 phosphate.
  • IL 6 is lOngZml
  • Compound No. 2 is 5 ⁇
  • D is DMSO.
  • FIG. 7 shows that compounds No. 13 and 16 inhibit tyrosine phosphorylation induced by IL-6 in STAT3.
  • STAT3 phosphate inhibitory effects of compounds No. 13 and 16 were examined over time.
  • IL-6 is 10 ng / ml
  • compound is 10 ⁇
  • D is DMSO.
  • FIG. 8 shows that tyrosine phosphorylation of various proteins and phosphorylation of ERK1Z2 were induced after treatment with Compound No. 4 in Ml cells. Treatment with 2 M of Compound No. 4 for 14 hours.
  • FIG. 9 shows that phosphorylation of MEK, p38MAPK, JNK and Akt was not induced by compound No. 4 in Ml cells. Treated with 2 M of Compound No. 4 for 14 hours.
  • Mouse leukemia cells Ml cells were isolated by 200 limiting clones in RPMI medium supplemented with 10% urinary fetal serum (FCS). Continued, the speed of growth in the lever, 20 clones Isolated. Add mouse IL 6 to RPMI medium supplemented with 10% urinary fetal serum (FCS) at 5 ngZml and evaluate with FACS 72 hours later. Most likely to die! /, Cells (viability less than 1% ) was selected.
  • FCS urinary fetal serum
  • Mouse leukemia cells Ml cells were added to 10% urinary fetal serum (FCS) using 384 well plates and 2000 wells in 50 ⁇ l of RPMI medium, and Blank and 12700 kinds of compounds were imMDMSO solutions. 2 ⁇ 1 (final concentration 2 ⁇ ) was added, and mouse IL-6 was added at a final concentration of lOngZml. After culturing for 72 hours, 51 times of WST-8 kit solution (LIFE SCIENCE REAGENTS SERIES-3) for cell number measurement was added. After culturing for 2 hours, the absorbance was measured at OD450 nm to calculate the number of viable cells. This primary high-throughput screening led to 74 positive compounds.
  • FCS urinary fetal serum
  • the number of viable cells after addition at a final concentration of 10 ng / ml of mouse IL-6, as in the primary screening, at the final concentration of 20Z5Z1. was evaluated.
  • a sample supplemented with each compound and not supplemented with mouse IL 6 was similarly prepared, and the number of viable cells was measured after 72 hours of culture. Thereby, the cytotoxicity of each compound was evaluated.
  • 18 compounds were found to inhibit IL-6-induced cell death at concentrations that were non-cytotoxic, making them the primary screening positive.
  • Negative screening was performed on 18 compounds (No. 1-18) that were predicted to inhibit the activity of the components of the IL-6 signaling system by primary screening.
  • the human tumor cell line KT-3 cells which are known to proliferate upon stimulation with IL 6, were used.
  • KT-3 cells were grown to a sufficient amount, and 10% urinary fetal serum (FCS) supplemented with human IL-6 (5 ng Zml) was added to RPMI medium with 1 x 10 5 cells Zwell. 6 to the well plate! ⁇ After incubation for 3 hours, dimethyl sulfoxide (DMSO) and 18 compounds (No. 1 -18) were added at a final concentration of 10 ⁇ M (2 ⁇ for No. 4 only) and cultured for 48 hours.
  • FCS urinary fetal serum
  • human IL-6 5 ng Zml
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • 18 compounds No. 1 -18
  • the human tumor cell line 3-3 cells subjected to the above treatment were suspended in RPMI medium supplemented with 10% FCS so as to be about 1 ⁇ 10 6 cells / 100 1.
  • FSC and SSC dot plots were obtained from the cells using F ACS Calibur (Becton Dickinson).
  • Figure 2 shows an example of the results. Those in the area surrounded by black lines are proliferating cells. Cells with no added compound or solvent (control) and cells that had only DMSO, the solvent for the compound, showed 57% and 55% cell growth, respectively. On the other hand, suppression of cell proliferation was observed in the compounds No. 1, 2, 4, 7, 10, 13, 14 and 16.
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • FCS 10% ushi fetal serum
  • the Ml cells were then lysed with lysis buffer (0.5% Triton X—100, 50 mM Tris—HC1, (pH 7.5), 0.1 lmMEDTA, 150 mM NaCU 200 ⁇ M NaVO, 50 mM NaF, ImM dithiothreitol ( DTT) ⁇
  • PMSF phenol methylsulfur fluoride
  • the sample thus obtained was subjected to sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SD S-PAGE).
  • SD S-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
  • the gel after the above electrophoresis is placed on the transfer membrane of PVDF membrane soaked in methanol or the like for 10-20 seconds and then immersed in transfer buffer (25 mM tris, 192 mM glycine, 10% methanol, 0.1% SDS).
  • transfer buffer 25 mM tris, 192 mM glycine, 10% methanol, 0.1% SDS
  • the transfer membrane is blocked with buffer (5% BSA, 1% BSA, 0.1% NaN)
  • Anti-STAT3 polyclonal antibody C20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA
  • anti-phosphorylated STAT3 monoclonal antibody B-7, Santa Cruz Biotechnology
  • the plate was replaced with PBST and washed three times with shaking for 5 minutes each.
  • HRPO-labeled anti-rabbit or mouse IgG antibody was diluted at a dilution ratio of 1: 5000, the membrane was immersed and shaken for 30 minutes. Thereafter, the plate was replaced with PBST and washed while shaking, and was performed 3 times for 5 minutes each.
  • D MEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FCS ushi fetal serum
  • DMSO Norefoxide
  • GFAP glial fibrillar acidic protein
  • an internal control vector 0.1 g in which the promoter of the EF1 gene is linked to the luciferase gene using Lipofectamine Plus Reagent (Life Technologies, Bethesda, MD) according to the manufacturer's instructions.
  • each compound added was equally divided into non-stimulated cells and given cells, and human IL-6 was added to the stimulated cells at a final concentration of lOngZml. After 16 hours, a cell extract was prepared from each cell, and the specific activity of firefly luciferase relative to Renilla luciferase was measured using a Dual lucif erase reporter system (Promega, Madison, Wis.).
  • Compound No. 4 had a steroidal skeleton. It is known that a compound having such a compound has an activity to suppress cell death nonspecifically.
  • ERK is a kinase known to be involved in cell proliferation and cell survival. Therefore, in the positive screening, Compound No. 4 suppressed the cell death of the Ml clone by non-specifically activating ERK, and was a component of the IL 6 signal transduction system that is the object of the present invention. It is considered to be an example of a rare knock ground in this screening method, which is not the case with compounds that specifically inhibit the activity of ⁇ .
  • the biochemical screening process in this example mainly analyzes STAT3 in the IL 6 signaling system, and it is clear that at least compounds Nos. 2, 13, and 16 affect STAT3 phosphate. It became power. Since other compounds have also been selected from the positive and negative screening steps, the IL 6 signaling pathway, including the pathway through STAT3, the pathway through Ras, and the pathway through PI3K and Akt, is also included. It is thought to inhibit the activity of the constituent elements.
  • the present invention provides a method for screening for a compound that inhibits the activity of a component of the IL 6 signaling system, and a compound that actually inhibits the activity of the component of the IL 6 signaling system is obtained. It was. By screening other compound libraries using the method of the present invention, it is possible to identify compounds that inhibit the activity of additional components of the IL-6 signal transduction system. In addition, the compound thus identified is expected to be a therapeutic agent for diseases related to IL-6 signaling such as cancer.

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Abstract

　本発明は、ＩＬ－６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって：（ａ）ＩＬ－６の刺激により死滅する細胞を用い、ＩＬ－６で刺激したときに当該細胞の死滅を抑制する化合物を選択する、ポジティブスクリーニング工程、次いで；（ｂ）工程（ａ）で選択された化合物について、生化学的手段により、ＩＬ－６シグナル伝達系のいずれかの構成因子の活性化を阻害する化合物をさらに選択する、生化学的スクリーニング工程、を含む、前記方法を提供する。本発明はさらに、当該方法により同定されたＩＬ－６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物もまた提供する。

Description

明 細 書
インターロイキン— 6 (IL_ 6)シグナル伝達阻害剤スクリーニング方法 技術分野
[0001] 本発明は、インターロイキン一 6 (IL— 6)シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻 害する化合物をスクリ一ユングする方法、並びに当該スタリ一ユング方法によって同 定された IL— 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する化合物に関する。 背景技術
[0002] インターロイキン 6 (IL— 6)は、初め B細胞の抗体産生細胞への最終分化を誘導 するサイト力インとして発見され、 T細胞、 B細胞、マクロファージ、繊維芽細胞など種 々の細胞種で産生、分泌されることが知られている。 IL 6が細胞膜上に存在する受 容体 IL— 6R aと結合すると、 IL— 6R aは、細胞膜貫通タンパク質である gp 130と会 合するとともに gpl30どうしの二量体ィ匕を引き起こす。 gpl30の細胞内領域に ¾JA K (Janus kinase)ファミリ一に属する JAK1、 JAK2などの因子が構成的に会合して おり、 gpl30どうしの二量体ィ匕により gpl30に会合する JAKどうしも近接し、 JAKは互 いにチロシン残基をリン酸ィ匕することにより活性ィ匕すると考えられている。活性化され ^JAKは、さらに gpl30の細胞内領域のチロシン残基、および様々なシグナル分子 をリン酸ィ匕することにより、これらの分子を活性化する。
[0003」 STAT、signal transducer and activator of transcription)ファ リーのメ ンバ一は、リン酸化チロシン残基を認識する SH2 (src homology 2)ドメインを有し ており、そのドメインによりチロシン残基がリン酸ィ匕された gpl30に結合し、 JAKにより チロシン残基のリン酸化を受ける。リン酸ィ匕された STATは、 gpl30から遊離し、その 後遊離した STATの SH2ドメインが他の STATのリン酸化チロシン残基に結合する こと〖こより、 STATホモ二量体またはへテロ二量体を形成する。二量体ィ匕した STAT は、核内に移動して、他の遺伝子調節タンパク質とともに種々の遺伝子の応答配列 に結合して、標的遺伝子の転写を促進する。また、 STATのリン酸化と同様に、 She および Shpもまた gp 130上でリン酸ィ匕を受けることが知られている。これらの分子の 下流には、 PI3Kおよび Aktを介する経路、並びに RasZMAPKの経路があり、細 胞の生存、分化等に様々な局面に影響を及ぼす (非特許文献 1 4)。
[0004] これまでに、 IL 6のシグナル伝達系の分子は、多発性骨髄腫、キャスルマン腫瘍 、慢性関節リウマチなど多くの病態において、活性ィ匕されていることが知られているこ とから、 IL— 6のシグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する阻害薬は、これら の疾患の治療薬となると期待される。特に、 STAT3は多くの癌細胞で活性ィ匕されて おり、またその活性ィ匕が細胞のトランスフォーメーションに関与していることが知られて いることから、 STAT3の阻害剤はスペクトラムの広い抗癌剤となりうると考えられる。さ らに、 JAK2の恒常的活性型変異が多くの骨髄増殖性疾患 (MPD)症例の原因にな つて 、ることも報告されて 、る（非特許文献 5 - 8)。
[0005] これらのことから、 IL 6のシグナル伝達を阻害する化合物を効率よくスクリーニン グする方法は、癌をはじめとする様々な疾患に対する薬剤の開発につながりうるもの である。
[0006] 従来、 IL 6シグナル阻害薬に限らず、低分子化合物ライブラリーのスクリーニング は多くの場合、例えば細胞増殖の抑制する化合物の選択などのようなネガティブスク リー-ングに頼って 、た (非特許文献 9 11)
したがって、ネガティブスクリーニングのみに依存せずに、効率よく IL— 6シグナル 伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方法が希求され ている。
非特許文献 l : Nakajima K, Yamanaka Y, Nakae K, et al. A centr al role for Stat 3 in IL— 6— induced regulation of growth and diffe rentiation in Ml leukemia cells. EMBO J. 1996 5 : 3651— 3658. 非特許文献 2 :Kawashima, T. , Hirose, Κ. , Satoh, Τ. , Kaneko, A. , Ikeda, Υ. , Kaziro, Υ. , Nosaka, Τ. , and Kitamura, Τ. (2000) . MgcRacGAP is involved in the control of growth and dif ferentiation of hematopoietic cells. Blood 96, 2116— 2124.
非特許文献 3 :Kawashima, T. , Murata, Κ. , Akira, S. , Tonozuka , Υ. , Minoshima, Υ. , Feng, S. , Kumagai, Η. , Tsuruga, Η . , Ikeda, Υ. , Asano, S. , et al. (2001) . STAT5 induces mac rophage differentiation of Ml leukemia cells through activation of IL— 6 production mediated by NF— kappaB p65. J. Immunol. 16 7, 3652- 3660.
非特許文献 4 :Tonozuka Y et al. Blood 104 (12) 3550— 7 (2004) 非特許文献 5 :James C, Ugo V, Le Couedic JP, Staerk J, Delhom meau F, Lacout C, Garcon L, Raslova H, Berger R, Bennaceu r— Griscelli A, Villeval JL, Constantine scu SN, Casadevall N, Va inchenker W. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitut ive signalling causes polycythaemia vera. Nature. 2005 ;434 : 1144
- 1148.
非特許文献 6 :Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, Teo SS, Tied t R, Passweg JR, Tichelli A, Cazzola M, Skoda RC. A gain— o f— function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders. N E ngl J Med. 2005 ; 352 : 1779 - 1790.
非特許文献 7 : Levine RL, Wadleigh M, Cools J, Ebert BL, Wernig
G, Huntly BJ, Boggon TJ, Wlodarska I, Clark JJ, Moore S, Adelsperger J, Koo S, Lee JC, Gabriel S, Mercher T, D ' Andre a A, Frohling S, Dohner K, Marynen P, Vandenberghe P, Mes a RA, Tefferi A, Griffin JD, Eck MJ, Sellers WR, Meyerson M , Golub TR, Lee SJ, Gilliland DG. Cancer Cell. 2005 ; 7 : 387- 3 97.
非特許文献 8 : Zhao R, Xing S, Li Z, Fu X, Li Q, Krantz SB, Z hao 7 . Identification of an acquired JAK2 mutation in polycythe mia vera. J Biol Chem. 2005 ; 280 : 22788— 22792.
非特許文献 9 :Rosania GR, Merlie J Jr, Gray N, Chang YT, Schul tz PG, Heald R. A eye lin— dependent Kinase inhibitor inducing c ancer cell differentiation： biochemical identification using Xenopus egg extracts. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 ; 96 : 4797— 4802. 非特許文献 10 : Murata K, Kumagai H, Kawashima T, Tamitsu K, Irie M, Nakajima H, Suzu S, Shibuya M, Kamihira S, Nosaka
T, Asano S, and Kitamura T. Selective cytotoxic mechanism o f GTP— 14564, a novel tyrosine kinase inhibitor in leukemia cells expressing a constitutively active Fms— like tyrosine kinase 3 LT3) . J. Biol. Chem. 2003 ; 278 : 32892— 32898.
非特許文献 ll :Winter— Vann AM, Baron RA, Wong W, dela Cruz J, York JD, Gooden DM, Bergo MO, Young SG, Toone EJ, C asey PJ. A small― molecule inhibitor of isoprenylcysteine carboxyl me thyltransf erase with antitumor activity in cancer cells. Proc N atl Acad Sci U S A. 2005 ; 102 :4336— 41.
非特許文献 12 : Shimizu S et al. Blood 72 (5) 1826— 1828 (1988) 非特許文献 13 : Burger R et al. Hematol J. 2 (1) 42— 53 (2001) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、 IL— 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する化合物をスクリ 一二ングする方法を提供することを目的とする。
[0008] 本発明の方法は、
(a) IL— 6の刺激により死滅する細胞を用い、 IL 6で刺激したときに当該細胞の 死滅を抑制する化合物を選択する、ポジティブスクリーニング工程、次いで
(b)工程 (a)で選択されたィ匕合物について、生化学的手段により、 IL— 6シグナル 伝達系のいずれかの構成因子の活性化を阻害する化合物をさらに選択する、生化 学的スクリーニング工程、を含む。
[0009] 本発明の方法において、ポジティブスクリーニング工程で使用する IL— 6の刺激に より死滅する細胞は、好ましくはマウスまたはヒト由来であり、さらに好ましくはマウス由 来の M 1細胞に由来するクローンまたは遺伝子工学的に作成された細胞である。
[0010] 本発明の方法において、 IL— 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する 化合物の標的分子は、好ましくは STAT3を介する経路の構成因子、 Rasを介する 経路の構成因子または PI3Kおよび Aktを介する経路の構成因子である。
[0011] 本発明の方法において、生化学的スクリーニング工程の生化学的手段は、好ましく はウェスタンブロット法、キナーゼアツセィ、転写活性測定アツセィ、表面プラズモン 共鳴法、免疫沈降法、細胞染色法、ジーンチップによる遺伝子発現解析、ノーザン ブロット法、および RT—PCR法力もなる群より選択されるいずれかの手法、あるいは これらの組み合わせを用いて行われる。
[0012] さらに本発明の方法において、ポジティブスクリーニング工程と生化学的スクリー- ング工程の間に、ポジティブスクリーニング工程で選択された化合物から、 IL— 6の 刺激により増殖する細胞を用い、当該細胞の IL 6依存的増殖を抑制する化合物を 選択する、ネガティブスクリーニング工程をさらに含む。
[0013] 本発明の方法において、ネガティブスクリーニング工程で使用する IL— 6の刺激に より増殖する細胞は、好ましくはヒト由来であり、さらに好ましくは IL— 6依存性腫瘍性 細胞株である。
[0014] 本発明はまた、本発明のスクリーニング方法によって得られた、 IL— 6シグナル伝 達系の構成因子の活性化を阻害する化合物を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0015] 本発明者らは、上記問題の解決のために鋭意研究に努めた結果、 IL—6シグナル 伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する化合物をスクリーニングする方法により、 IL 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する化合物を同定するに至り、本発 明を想到した。
[0016] I. IL 6シグナル伝逹系の構成因子の活性化を阻害する化合物をスクリーニン グする
本発明は、 (a) :IL— 6の刺激により死滅する細胞を用い、 IL— 6で刺激したときに 当該細胞の死滅を抑制する化合物を選択する、ポジティブスクリーニング工程、次い で、（b)：工程 (a)で選択されたィ匕合物について、生化学的手段により、 IL— 6シグナ ル伝達系のいずれかの構成因子の活性化を阻害する化合物をさらに選択する、生 化学的スクリーニング工程、を含む IL— 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻 害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。さらにスクリーニングの精度を高 めるために、ポジティブスクリーニング工程 (a)と生化学的スクリーニング工程 (b)の 間に、工程 (a)で選択されたィ匕合物から、 IL— 6の刺激により増殖する細胞を用い、 当該細胞の IL 6依存的増殖を抑制する化合物を選択する、ネガティブスクリーニン グ工程をさらに含んでもよい。
[0017] 具体的には、本発明者らが発明した IL— 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を 阻害する化合物をスクリーニングする方法は、ポジティブスクリーニング工程にぉ 、て は、 IL 6の刺激により死滅する細胞の、 IL 6の刺激による死滅を阻害する化合物 を同定することにより行われる。このポジティブスクリーニング工程は、 IL— 6シグナル 伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物を添加した場合に限り細胞が増殖し てくるので、化合物の細胞毒性よる偽性陽性が発生する可能性はきわめて少な 、。 実際、ノ ィロットとして行ったポジティブスクリーニング工程を通過した化合物は 0. 14 2%以下であった。
[0018] また、以下の実施例で記載するように、ポジティブスクリーニング工程を通過したィ匕 合物 18種類のうち、 3種類の化合物 2, 13および 16は IL— 6による STAT3の活性 化を特異的に抑えた。よって 18種類のうち 3種類は STAT3の活性ィ匕を、 4種類は IL 6シグナル伝達系の別の分子の活性ィ匕を阻害していると考えられる。いずれも IL - 6依存性ヒトレンネルト T細胞リンパ腫細胞株 (KT- 3細胞）の増殖を抑制した。こ のことから、ポジティブスクリーニング工程を通過したィ匕合物のうち、最終的にポジティ ブであったィ匕合物の割合は 38. 9% (7Z18)という、高い値となった。これらはいず れも、ポジティブスクリーニングの有効性を示すものである。
また、生化学的スクリーニング工程においてはウェスタンプロット等の生化学的手段 用いることによって、 IL— 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する化合物 をさらに確実に選択することができる。そして、ポジティブスクリーニング工程により選 択された化合物が IL 6シグナル伝達系のどの部分 (サイト力イン ·レセプター ·キナ ーゼ ·転写因子等)の活性ィ匕を阻害して 、るかを検討することが可能である。
[0019] さらにまた、ポジティブスクリーニング工程と生化学的スクリーニング工程の間に、ネ ガティブスクリーニング工程を IL 6の刺激により増殖する細胞の増殖抑制を指標と して行い、 IL 6シグナル伝達系を抑制する化合物を絞り込むことも可能である。 [0020] 「IL 6シグナル伝達系」とは、分泌性タンパク質である IL 6が受容体 IL 6R a に結合し、それにより活性ィ匕した細胞内の JAKが他のタンパク質をリン酸ィ匕すること を発端とするシグナルカスケードをいう。図 1に示されるように、 STATを介する経路、 Rasを介する経路、並びに PI3Kおよび Aktを介する経路等が知られている。したが つて、本発明の態様において、本発明の「IL— 6シグナル伝達系の構成因子」は、図 1に示されたいずれかの任意の分子、または複数の分子力 なる分子群を含む。好 ましくは STAT3を介する経路の構成因子、 Rasを介する経路の構成因子、または PI 3Kおよび Aktを介する経路の構成因子である。
[0021] 「構成因子の活性ィ匕を阻害する」とは、特に限定されず、構成因子のリン酸化'脱リ ン酸化の阻害、キナーゼ 'ホスファターゼ活性の阻害、他の因子との結合阻害、およ び核内移行の阻害等、構成因子の正常な機能 (生物学的機能)を阻害する全ての 態様を含むものとする。「阻害」は、完全に阻害する場合の他、構成因子の活性化を 一部阻害する場合、活性化を減少させる場合も含む。
[0022] i)ポジティブスクリーニング工程
本発明のスクリーニング方法のポジティブスクリーニング工程は、 IL— 6の刺激によ り死滅する細胞を用い、 IL 6で刺激したときに当該細胞の死滅を抑制する化合物 を選択する。
[0023] 本発明のポジティブスクリーニング工程の好ましい態様において、使用する IL— 6 の刺激により死滅する細胞は、マウスまたはヒト由来である。
[0024] また、本発明のポジティブスクリーニング工程のさらに好ましい態様において、使用 する IL 6の刺激により死滅する細胞は、マウス由来の Ml細胞に由来するクローン または、遺伝子工学的に作成された細胞である。
[0025] 「IL 6の刺激により死滅する細胞」とは、細胞培養の過程において、培養培地中 に IL 6を添加することにより、完全に死滅する細胞を言う。当業者はこのような細胞 を容易に理解 ·把握することができ、公知の培養細胞からの選抜、修飾等により、ある いは公知の細胞力も遺伝子工学的に容易に作成することが可能である。限定される 訳ではないが、好ましくは、マウスまたはヒト由来である。より好ましくは、マウス由来の Ml細胞に由来するクローン (Mlクローン）、または遺伝子工学的に作成された細胞 である。ここで、 Mlクローンとは、既知のマウス白血病細胞 Ml細胞（ATCC番号 TI B— 192等)から IL— 6の添カ卩により死滅しやすいクローンを選択することによって獲 得されるクローンをいう。この Mlクローンは、培養培地中の IL— 6濃度が 10 ngZm 1、好ましくは 7. 5 ngZml、さらに好ましくは 5 ngZmlの条件で死滅することを指 標に選択することができる。
[0026] また、「遺伝子工学的に作成された細胞」とは、 STAT3、 c Jun、 ATF— 2または Elk— 1などのように、 IL— 6シグナル伝達系の下流に存在する転写因子により転写 が制御されるプロモーター配列の下流に、自殺遺伝子を配置する構成の DNA構築 体を有するように遺伝子工学的手法によりに作成された細胞を 、う。 自殺遺伝子は、 HSV—tkのように細胞毒性のある物質を作り出す遺伝子、または p53のようなアポト 一シスを誘導する遺伝子でもよい。このような、特定のプロモーター配列の下流に目 的の遺伝子を組み込んだ構築体を作成し、一過的に発現させる方法、またはゲノム 中に挿入し構成的に発現させる方法は、当該技術分野において周知である。
[0027] また、「細胞の死滅を抑制する」とは、限定されるわけではな 、が、培養して!/、る細 胞のうち、 10%以上、好ましくは 30%以上、より好ましくは 50%以上、さらに好ましく は 90%以上が生存することを 、う。
細胞の生存率は、 FACSを用いる方法 (実施例に記載）、トリパンブルーを用いて染 色する方法など、当該技術分野における通常の知識を用いることによって測定可能 である。
[0028] 本ポジティブスクリーニング工程では、 IL 6の刺激により死滅する細胞を培養する 培地中に化合物を 20 /z M、好ましくは 5 M、より好ましくは 1. 25 /ζ Μ、さらに好ま しくは 0. 3 μ Μの濃度で添加し、その後に IL— 6を 5ngZml、好ましくは lOngZml 、さらに好ましくは 20ngZmlの濃度で添加し、当該細胞が生存する化合物を選択す ることにより、化合物ライブラリ一力も IL— 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を 阻害する化合物をスクリーニングすることができる。
[0029] 従来行われていたネガティブスクリーニング (IL 6の刺激により増殖する細胞を用 い、当該細胞の IL 6依存的増殖を抑制する化合物を選択するスクリーニング)では 、細胞増殖の抑制が化合物の作用によるものなのか細胞抑制によるものなのかが不 明であるという問題点があった。し力しながら、本発明のポジティブスクリーニングェ 程により選択されてきたィ匕合物は、細胞毒性を有さず、且つ IL 6シグナル伝達系の 構成因子の活性ィ匕を阻害する機能を有する化合物であるといえる。これは、 IL— 6シ グナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する化合物は、抗癌剤等として医薬組成 物に用いられることが期待されるものであるから、これらの特性は望ましい。
[0030] ii)生化学的スクリーニング工程
本発明の生化学的スクリーニング工程は、上記スクリーニング工程等により選択さ れたィ匕合物について、生化学的手段により、 IL 6シグナル伝達系のいずれかの構 成因子の活性化を阻害する化合物をさらに選択する。
[0031] 本発明の方法の生化学的スクリーニング工程の一態様において、生化学的手段は 、ウェスタンプロット法、キナーゼアツセィ、転写活性測定アツセィ、表面プラズモン共 鳴法、免疫沈降法、細胞染色法、ジーンチップによる遺伝子発現解析、ノーザンプロ ット法、および RT—PCR法力 なる群より選択されるいずれかの手法、あるいはこれ らの組み合わせを用いて行われる。
[0032] ここで「生化学的手段」とは、生化学分野の研究で利用されうる免疫学的手段およ び物理学的手段を含む手段をいう。「免疫学的手段」とは、ウェスタンプロット法、免 疫沈降法、細胞染色法など、抗体を用いた手段をいう。例えば、ウェスタンプロット法 では、 IL— 6シグナル伝達系の構成因子のリン酸ィ匕状態、または核内におけるタン ノ ク質量の増減などを決定することができる。「物理学的手段」とは、表面プラズモン 共鳴等、タンパク質やィ匕合物等の物理学的特性を利用することにより、それらの結合 強度等、生化学的に重要なパラメーターを測定する手段をいう。
[0033] 表面プラズモン共鳴とは、タンパク質と化合物等の結合の動態を調べることができ る手段である。具体的には、化合物の水溶液と固定したタンパク質等で被覆したバイ ォセンサー表面との境界から出る反射光を関知して結合相互作用を検出する。化合 物の水溶液は、タンパク質等と相互作用する力否かでその濃度が変化し、そこでこの 微少な減少率 (共鳴シグナル)を測定することにより、化合物タンパク質間の相互作 用の程度を測定することができる。具体的には、 BIA core system (BIACORE社 )による方法が一般的であり、これにより目的の化合物とタンパク質間の相互作用お よび解離定数 (Kd)等を求めることができる。
[0034] し力しながら「生化学的手段」は、これらの方法に限られず、既知の細胞内シグナル 分子の活性を測定する方法、例えばキナーゼアツセィ、または転写活性測定アツセ ィ等が含まれる。
[0035] キナーゼアツセィとは、特定のキナーゼの機能を調節する物質の影響を測定する ために行われるアツセィである。即ち、キナーゼ活性を有するタンパク質の化合物に よる阻害の度合いを決定することができる。キナーゼアツセィは、適切な緩衝液中に 目的の化合物、キナーゼ活性を有するタンパク質、キナーゼの基質および ATPを添 加し、一定時間のキナーゼ反応後に残存した ATP量を同定することにより行うことが できる。 ATPの検出方法は、定量的であればいずれの方法によってもよぐ例えばル シフェリンが酵素ルシフェラーゼの作用を受けて ATPを利用して、酸化ルシフェリン に変化する際の発光量を測定することにより行うことができる。あるいは、キナーゼ活 性に対する目的の化合物の影響の定量化は、蛍光色素、発光色素または放射性同 位元素を用いて行ってもよぐ例えば [ γ —32 P]ATPを用いることで、基質の結合し た γ —32 Ρの量をシンチレーシヨンカウンターを用いることにより測定することも可能で ある。
[0036] 転写活性測定アツセィとは、遺伝子の転写レベルの調節を解析するアツセィであり 、あるいは標的遺伝子を活性ィ匕する転写因子やその上流の構成因子の活性ィ匕を測 定するアツセィでもある。具体的には、ルシフェラーゼアツセィまたは CAT (クロラムフ ェ-コールァセチルトランスフェラーゼ）アツセィなどが知られている。これらの方法は
、標的遺伝子の転写調節に至るシグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を測定するた めに、 目的とする遺伝子の転写調節領域の下流にレポーターとしてルシフェラーゼ 遺伝子または CAT遺伝子を組み込んだプラスミドを作成し、そのプラスミドを導入し た細胞の酵素活性を測定するものである。具体的なルシフェラーゼアツセィの手順は 実施例に例示する。
[0037] また、免疫沈降法、細胞染色法、ジーンチップによる遺伝子発現解析、ノーザンブ ロット法、および RT— PCR法とは、当該技術分野で通常行われる実験手法であり、 公知である。 [0038] iii)ネガティブスクリーニング工程
本発明のスクリーニング方法は、ポジティブスクリーニング工程と生化学的スクリー ユング工程の間に、ポジティブスクリーニング工程で選択されたィ匕合物から、 IL— 6の 刺激により増殖する細胞を用い、当該細胞の IL 6依存的増殖を抑制する化合物を 選択する、ネガティブスクリーニング工程をさらに含んでもょ 、。
[0039] 本発明のネガティブスクリーニング工程の一態様において、ネガティブスクリーニン グ工程で使用する IL - 6の刺激により増殖する細胞は、好ましくはヒト由来である。
[0040] 本発明のネガティブスクリーニング工程の好ま U、態様にぉ 、て、ネガティブスクリ 一-ング工程で使用する IL— 6の刺激により増殖する細胞は、 IL— 6依存性腫瘍性 細胞株である。
[0041] 「IL 6の刺激により増殖する細胞」とは、限定されるわけではないが、細胞培養の 過程において、培養培地中に 5ngZml、好ましくは 3ngZml、さらに好ましくは lng Zmlの IL 6を添加することにより、増殖する細胞を!ヽぅ。
好ましくはヒト由来であり、より好ましくは IL— 6依存性腫瘍性細胞株である。さらに好 ましくは、ヒトレンネルト T細胞リンパ腫細胞株 KT— 3細胞 (非特許文献 12) (入手先； 西本憲弘先生、大阪大学大学院生命機能研究科 ·免疫制御学講座)またはヒト骨髄 腫細胞株 INA— 6細胞（非特許文献 13) (入手先； Martin Gramatzki, M. D.、 Director, Division of Stem Cell and Immunotherapy 2nd Medical Department, University of Kiel Schittenhelmstr. 1224105 Kiel Germ any)である。
[0042] 本ネガティブスクリーニング工程では、 IL 6の刺激により増殖する細胞を培養する 培地中に IL— 6を l— 20ngZml、好ましくは 2— 10ngZml、さらに好ましくは 5ngZ mlの濃度で添加する。その後、化合物を 0. 1— 50 M、好ましくは 1— 25 M、さ らに好ましくは 2— 10 Mの濃度で添加する。当該細胞が増殖することを阻害する 化合物を選択することにより、ポジティブスクリーニングにより選択されたィ匕合物から、 さら〖こ IL 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する化合物をスクリ一ニン グすることができる。
[0043] 「細胞の IL 6依存的増殖を抑制する」とは、対照実験における細胞増殖に比べて 、増殖している細胞の割合力 少なくとも 50%以下、好ましくは 25%以下、さらに好 ましくは 10%以下、より好ましくは 1%以下である。細胞の増殖率は、 FACSを用いる 方法 (実施例に記載）、プロモデォキシゥリジン (BrdU)の取込みを測定する方法等 により測定可能である。
[0044] 従来は本ネガティブスクリーニング工程を初めに行うことにより、化合物の細胞毒性 により細胞増殖が阻害される化合物も選択されてきていた。し力しながら、本発明で は、本ネガティブスクリーニング工程をポジティブスクリーニング工程の後に行うことに より、この可能性を排除している。
[0045] また本発明のネガティブスクリーニング工程の好ましい態様において、 IL— 6の刺 激により増殖する細胞はヒト由来である。これは、ポジティブスクリーニング工程が非ヒ ト細胞で行われた場合、ポジティブスクリーニング工程により選択されたィ匕合物力 ヒ ト細胞において IL 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する化合物である かを決定するために重要である。
[0046] Π. TL 6シグナル伝捧 の構成 早の活件ィ [^阳害する化合物
本発明は、上記スクリーニング方法により同定された IL— 6シグナル伝達系の構成 因子の活性化を阻害する化合物を提供する。
[0047] IL— 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する化合物は、以下の式（1)
(6)の構造式を有する、
式 (1) :
[0048] [化 1]
Figure imgf000013_0001
R 2
[0049] [式中、
R1は、水素、（C— C )アルキル、またはハロゲンであり；そして R2は、水素、（C— C )アルキル、ヒドロキシ基または（C— C )アルコキシ基であり
1 6 1 6
である]；
式 (2):
[0050] [化 2]
Figure imgf000014_0001
[0051] [式中、
R1は、水素、（C— C )アルキル、またはハロゲンであり；そして
1 6
R2は、水素、（C— C )アルキル、ヒドロキシ基または（C— C )アルコキシ基であり
1 6 1 6
である]；
式 (3):
[0052] [化 3]
Figure imgf000014_0002
[0053] 中、
R1は、水素または（C— C )ァノレキノレである]；
1 10
式 (4):
[0054] [化 4]
Figure imgf000015_0001
4
[0055] [式中、
および R3は、それぞれ同一または異なる、水素またはハロゲンであり；そし て
R4は、水素またはハロゲンである]；
式 (5) :
[0056] [化 5]
Figure imgf000015_0002
[式中、
R1は、水素またはハロゲンであり；そして
R2、 R3および R4は、それぞれ同一または異なる、水素、（C— C )アルキル、ヒドロキ
1 6
シ基または（C— C )アルコキシ基である]；
1 6
および、
式 (6) : [0058] [ィ匕 6]
Figure imgf000016_0001
[0059] [式中、
および R3は、それぞれ同一または異なる、水素またはハロゲンであり；そし て
R4、 R5、および R6は、それぞれ同一または異なる、水素またはハロゲンである]。
[0060] 本明細書中で後述する実施例では、実際に以下の化合物が、 IL 6シグナル伝達 系の構成因子、 STAT3の活性ィ匕を阻害する化合物 (ィ匕合物 No. 1, 2, 7, 10, 13
, 14および 16)として選択された。
[0061] 化合物 No. 1
[0062] [化 7]
Figure imgf000016_0002
[0063] 化合物 No. 2
[0064] [化 8]
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0002
[0069] 化合物 No. 13 [0070] [化 11]
Figure imgf000018_0001
[0071] 化合物 No. 14
[0072] [化 12]
Figure imgf000018_0002
[0073] 化合物 No. 16
[0074] [化 13]
Figure imgf000018_0003
よって、式（1)の化合物において、好ましくは、 Rはメチル基であり、そして Rはメト キシ基である。また好ましくは、 R1は塩素であり、そして R2は水素である。 [0076] 式（2)の化合物にお!、て、好ましくは、 Rは塩素であり、そして まメトキシ基である
[0077] 式（3)の化合物にお! 、て、好ましくは、 R1は n—ォクチル基である。
[0078] 式（4)の化合物にお! 、て、好ましくは、
Figure imgf000019_0001
R2、および R3はフッ素であり、そして R4 は塩素である。
[0079] 式（5)の化合物にお! 、て、好ましくは、 R1は塩素であり、そして R2、
Figure imgf000019_0002
および R4は メトキシ基である。
[0080] 式（6)の化合物にお! 、て、
Figure imgf000019_0003
R2、および R3はフッ素であり、そして R4、 R5、および R6もフッ素である。
図面の簡単な説明
[0081] [図 1]図 1は、 IL 6シグナル伝達系を示す。
[図 2]図 2は、ィ匕合物 No. 1 , 2, 4, 7, 10, 13, 14および 16力 KT— 3糸田胞の IL— 6依存的増殖を阻害することを示す。具体的には、ネガティブスクリーニング工程での 各化合物による KT 3細胞の細胞増殖の阻害活性を、 FACSにより測定した結果を 示す。黒線の枠内に囲まれた領域にプロットされる細胞が増殖している細胞であり、 横に全体における割合を％で示す。 IL 6は 5ngZml、化合物 No. 4は 2 μ Μであ り、その他の化合物は 10 μ Μであった。
[図 3]図 3は、化合物 No. 13および 16が Ml細胞における STAT3の IL 6に誘導さ れるチ口シンリン酸化を阻害することを示す。具体的には、生化学的スクリーニングェ 程で、化合物 No. 1 , 2, 7, 10, 13, 14または 16を 10 Mで処理し、その 30分後 に lOngZmlの IL— 6で処理し、処理後 1時間による STAT3のリン酸化の阻害を、 Ml細胞を用いたウェスタンプロットにより検討した結果を示す。化合物 No. 13およ び 16で明らかな STAT3のリン酸化の阻害が観察された。
[図 4]図 4は、化合物 No. 2、 13および 16が STAT3の IL— 6に誘導される転写活性 を阻害することを示す。生化学的スクリーニング工程で、 20 /z Mの化合物 No. 2, 13 ,または 16での処理後 1時間で、 lOngZmlの IL— 6で処理し、その処理後 16時間 にアツセィにかけた。化合物による処理から 17時間後、 STAT3のリン酸ィ匕の阻害を 、 293T細胞を用いたウェスタンプロットにより検討した結果を示す。化合物 No. 13 および 16だけでなく No. 2でも明らかな STAT3のリン酸化の阻害が観察された。
[図 5]図 5は、生化学的スクリーニング工程で、化合物 No. 2, 13,または 16による S TAT3の転写活性の阻害を、 293T細胞を用いたルシフェラーゼアツセィにより検討 した結果を示す。実験系は図 4と同様である。化合物 No. 2、 13および 16において S TAT3の IL 6に誘導される転写活性の阻害が観察された。
[図 6]図 6は、化合物 No. 2が STAT3の IL 6に誘導されるチロシンリン酸化を阻害 するが、 ERK1Z2のリン酸ィ匕は阻害しないことを示す。生化学的スクリーニング工程 で、化合物 No. 2の STAT3リン酸ィ匕阻害効果をタイムコースを追って検討した。 IL 6は lOngZmlであり、化合物 No. 2は 5 μ Μであり、そして Dは DMSOである。
[図 7]図 7は、化合物 No. 13および 16が STAT3の IL— 6に誘導されるチロシンリン 酸化を阻害することを示す。生化学的スクリーニング工程で、化合物 No. 13および 1 6の STAT3リン酸ィ匕阻害効果をタイムコースを追って検討した。 IL— 6は 10ng/ml であり、化合物は 10 μ Μである、 Dは DMSOである。
[図 8]図 8は、様々なタンパク質のチロシンリン酸化および ERK1Z2のリン酸化が Ml 細胞において化合物 No. 4処理の後に誘導されたことを示す。化合物 No. 4の 2 Mで、 14時間処理した。
[図 9]図 9は、 MEK、 p38MAPK、 JNKおよび Aktのリン酸化が Ml細胞において化 合物 No. 4により誘導されなかったことを示す。化合物 No. 4の 2 Mで、 14時間処 理した。
実施例
[0082] 以下、実施例によって本発明を説明する力 実施例は例証のためのものであり、本 発明を制限するものではない。本発明の範囲は、請求の範囲の記載に基づいて判 断される。さらに、当業者は本明細書の記載に基づいて、容易に修正、変更を加える ことが可能である。
[0083] I.ポジティブスクリーニング（一次スクリーニング)
Mlクローンの作成
マウス白血病細胞 Ml細胞を 10%ゥシ胎児血清 (FCS)添加 RPMI培地中にて限 界希釈法により 200クローン単離した。続 、てその中で増殖の速 、ものを 20クローン 単離した。それらについて 10%ゥシ胎児血清（FCS)添加 RPMI培地にマウス IL 6 を 5ngZmlで添カ卩し 72時間後に FACSにて評価を行 ヽ、最も死滅しやす!/、細胞（ 生存率 1%以下)を選択した。
[0084] スクリーニング手順
マウス白血病細胞 Ml細胞を 384ゥエルプレートを用いて 10%ゥシ胎児血清（FCS )添加 RPMI培地 50 μ 1中に 2000個 Ζゥエルでまき、 Blankおよび 12700種類のィ匕 合物を各々 ImMDMSO溶液としたものを 2 μ 1 (最終濃度 2 μ Μ)添加し、マウス IL - 6を最終濃度 lOngZmlで添加した。 72時間培養後に細胞数測定用 WST— 8キ ット溶液（LIFE SCIENCE REAGENTS SERIES— 3)を 5 1添カロした。 2時間 培養後、 OD450nmにて吸光度を測定し生細胞数を算出した。このプライマリーハイ スループットスクリ一ユングにより 74種類の化合物が陽性となった。それらについて D MSOを用いずに直接溶解し最終濃度を 20Z5Z1. 25/0. 3 Mの 4段階にて、 プライマリースクリーニングと同様に、マウス IL— 6最終濃度 10ng/mlで添加後の生 細胞数の評価をおこなった。また化合物を各々添カ卩しマウス IL 6を添カ卩しないサン プルも同様に作製し、 72時間培養後に生細胞数を測定した。それにより各々の化合 物について細胞毒性を評価した。そして 74種類の中で 18化合物が細胞毒性をもた ない濃度にぉ 、て IL - 6が誘導する細胞死を抑制することが判明し、一次スクリ一- ング陽'性とした。
[0085] II.ネガティブスクリーニング（二次スクリーニング)
一次スクリーニングにより、 IL— 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する ことが予測された 18種類の化合物（No. 1— 18)について、ネガティブスクリーニング を行った。
[0086] スクリーニング手順
ネガティブスクリーニングには、 IL 6の刺激により増殖する性質を有することが知 られて 、る、ヒト腫瘍性細胞株 KT— 3細胞を用いた。
[0087] KT— 3細胞を十分量まで増殖させ、ヒト IL— 6 (5ngZml)を添カ卩した 10%ゥシ胎 児血清（FCS)添加 RPMI培地中に、 1 X 105細胞 Zゥエルで 6ゥエルプレートにま！ヽ た。 3時間培養後、ジメチルスルホキシド（DMSO)、および 18種類の化合物（No. 1 - 18)を、それぞれ最終濃度 10 μ M (No. 4のみは 2 μ Μ)で添カ卩し 48時間培養し た。
[0088] フローサイトメトリーによる解析
上記処理を行ったヒト腫瘍性細胞株 ΚΤ— 3細胞を、 1 X 106細胞/ 100 1程度と なるように 10%FCS添加 RPMI培地で懸濁した。次いで、この細胞を F ACS Calib ur (Becton Dickinson)を使用して、 FSC、 SSCドットプロットを得た。図 2に結果 の一例を示す。黒線で囲まれた領域内のものが増殖をしている細胞である。化合物 も溶媒も加えない細胞（コントロール）およびィ匕合物の溶媒である DMSOのみをカロえ た細胞では、それぞれ 57%および 55%の細胞増殖が見られた。一方、化合物 No. 1, 2, 4, 7, 10, 13, 14および 16では、細胞増殖の抑制が観察された。
[0089] 腿
一次スクリーニングにより選択された 18種類の化合物 (No. 1 - 18)のうち、本ネガ ティブスクリーニング工程により 8種類のィ匕合物（No. 1, 2, 4, 7, 10, 13, 14および 16)が選択された。
[0090] III.牛.化学的スクリーニング（三次スクリーニング)
ウェスタンブロッテイング (Ml細朐）
培養ディッシュの 10%ゥシ胎児血清 (FCS)添加 RPMI培地中で培養して ヽる指数 的に増殖している Ml細胞に、最終濃度 10 Mとなるようにジメチルスルホキシド（D MSO)、および化合物 No. 1, 2, 7, 10, 13, 14または 16を添カ卩し、 30分間培養し た。次いで、最終濃度が lOngZmlとなるようにマウス IL— 6を添加するものと添カロし ないものに等分し、さらに 1時間培養した。その後、 Ml細胞を溶解バッファー（0. 5 % Triton X— 100、 50mM Tris— HC1、 (pH7. 5)、0. lmMEDTA、 150m M NaCU 200 μ M Na VO、 50mM NaF、 ImM ジチオスレィトール（DTT)ゝ
3 4
0. 4mM フエ-ルメチルスルフォ-ルフルオライド（PMSF)、 3 gZmL ァプロチ ニン、 2 μ g/mL ぺプスタチン A、 1 μ g/mL ロイぺプチン）により 1 X 107細胞/ mlの濃度で溶解し、氷上に 30分間置いた。細胞溶解物を 12000gで 15分間遠心分 離することにより沈殿物を取り除いた。
[0091] こうして得られた試料を硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SD S— PAGE)により電気泳動した。次いで、メタノール等に 10〜20秒浸した後にトラン スファーバッファー（25mM tris、 192mM グリシン、 10% メタノール、 0. 1% S DS)に浸した PVDFメンブレンの転写膜上に、上記泳動後のゲルを乗せ、トランスフ ァーバッファーを浸み込ませた濾紙 5枚ずつにより挟み込み、セミドライ型転写法によ りタンパク質を転写膜に転写した。
[0092] 転写後、転写膜をブロッキングバッファー（5% BSA、 1% BSA、 0. 1% NaN )
3 に浸し、 30分以上振盪した。次いで、 PBST(137mM NaCl、 2. 7mM KC1、 1. 5mM KH PO、 8. ImM Na HPO、 0. 05% Tween20)に置換して振盪しな
2 4 2 4
力 洗浄を、 5分ずつ 3回行った。一次抗体として抗 STAT3ポリクローナル抗体 (C 20、 Santa Cruz Biotechnology、カルフォルニア州サンタクルズ）および抗リ ン酸化 STAT3モノクローナル抗体（B— 7、 Santa Cruz Biotechnology)をいず れも 1： 1000の希釈倍率により PBSTで希釈し、メンブレンを浸して 60分間振盪した
[0093] その後、 PBSTに置換して振盪しながら洗浄を、 5分ずつ 3回行った。二次抗体とし て HRPO標識抗ゥサギもしくはマウス IgG抗体を 1： 5000の希釈倍率により希釈し、 メンブレンを浸して 30分間振盪した。その後、 PBSTに置換して振盪しながら洗浄を 、 5分ずつ 3回行った。
[0094] 次いで、公知の発色方法により発色工程を行い、バンドを検出した。これによる結 果を図 3に示す。 STAT3のチロシンリン酸ィ匕を検討したところ、化合物 No. 13およ び 16において明らかな STAT3のチロシンリン酸化の阻害が観察された。
[0095] ウェスタンブロッテイング（293T細朐）
培養ディッシュの 10%ゥシ胎児血清 (FCS)添加ダルベッコ変法イーグル培地（D MEM)中で培養している指数的に増殖している 293T細胞に、最終濃度 20 Mと なるようにジメチノレスノレホキシド（DMSO)、およびィ匕合物 No. 1, 2, 4, 7, 10, 13, 14または 16を添加し、 1時間培養した。次いで、最終濃度が lOngZmlとなるように マウス IL— 6を添加するものと添加しないものに等分し、さらに 16時間培養した。その 後、 293T細胞を溶解バッファ一により 1 X 107細胞 Zmlの濃度で溶解し、氷上に 30 分間置いた。細胞溶解物を 12000gで 15分間遠心分離することにより沈殿物を取り 除いた。
[0096] 以下のウェスタンブロット工程は、上述の方法により行った。これによる結果を図 4に 示す。 STAT3のチロシンリン酸化を検討したところ、化合物 No. 2、 13および 16に おいて明らかな STAT3のチロシンリン酸ィ匕の阻害作用が観察された。
[0097] ルシフェラーゼアツセィ
12ゥエルプレート中の 1 X 106細胞/ゥエルの濃度の 293T細胞に、 glial fibrillar y acidic protein (GFAP)遺伝子のプロモーター配列の下流にホタルルシフェラ ーゼ遺伝子を連結したレポーターベクター（2 μ g)と EF1遺伝子のプロモーターをゥ ミシィタケルシフェラーゼ遺伝子に連結したインターナルコントロールベクター（0. 1 g)を、製造業者の取扱説明書にしたがって Lipofectamine Plus Reagent (Lif e Technologies、メリーランド州ベセズダ）によりトランスフエクシヨンした。トランスフ ェクシヨンから 23時間後、ジメチルスルホキシド（DMSO)、および化合物 No. 1, 2, 4, 7, 10, 13, 14および 16を最終濃度 20 Mで添加した。化合物添加から 1時間 後、それぞれの化合物を加えたものにつき、刺激を与えない細胞と与える細胞に等 分し、刺激を与える細胞には最終濃度 lOngZmlでヒト IL— 6を添加した。 16時間後 、それぞれの細胞から細胞抽出液を作成し、 Dual lucif erase reporter system (Promega,ウィスコンシン州マディソン）を用いて、ホタルルシフェラーゼのゥミシイタ ケルシフェラーゼに対する比活性を測定した。
[0098] 結果を図 5に示す。化合物 No. 2、 13および 16においては、明らかな STAT3によ る転写活性の阻害作用が観察された。
[0099] 化合物 No. 2の解析
培養ディッシュの 10%ゥシ胎児血清 (FCS)添加 RPMI培地中で培養して ヽる指数 的に増殖している Ml細胞に、 DMSOのみおよび最終濃度が 5 Mの化合物 No. 2 をおのおの添カ卩した。その直後に、マウス IL— 6を最終濃度 10ng/mlで添カ卩し、そ れぞれ 0、 30分、 1、 3、 6、および 24時間後に細胞抽出液を I X 107細胞 Zmlの濃 度で作成した。
[0100] それぞれの試料について、上述のウェスタンブロット法に従い、 STAT3のチロシン リン酸化を検討した。結果を図 6に示す。化合物 No. 2で処理した細胞では化合物の 添加後 3、 6、 24時間で明らかな STAT3のチロシンリン酸ィ匕の阻害が観察された。 一方、化合物 No. 2は、 IL 6刺激が誘導する STAT3を介する経路とは別経路で ある ERK1Z2のリン酸ィ匕には影響を与えないことが明ら力となった。この結果力 考 慮すると、化合物 No. 2は STAT3を介する経路を特異的に阻害していると思われる
[0101] 化合物 No. 13、 16の解析
化合物 No. 2の場合と同様の方法で、化合物 No. 13、 16 (最終濃度は 10 M)に ついても同様の実験を行った。結果を図 7に示す。化合物 No. 13、 16で処理した細 胞では化合物の添加後 3時間以降で STAT3にチロシンリン酸ィ匕が阻害されることが 明らかとなった。
[0102] 化合物 No. 4の解析
化合物 No. 4はステロイド系の骨格を有していた。このような化合物を有する化合 物は、細胞の分ィ匕ゃ死滅を非特異的に抑える活性を有することが知られている。
[0103] 化合物 No. 4の効果につ!、て、 、くつかのタンパク質につ ヽてチ口シンリン酸化を 検討した。具体的には、 Ml細胞を用いて最終濃度 2 Mの化合物 No. 4を添加し、 14時間培養した。その後、上述のウェスタンプロットと同様の方法でタンパク質のチ 口シンリン酸ィ匕を検討した。
[0104] 結果を図 8に示す。 STAT3については、化合物 No. 4の存在によりチロシンリン酸 化 STAT3のタンパク質量は変化しなかった力 ERK1Z2については、化合物 No. 4の存在によりチロシンリン酸化 ERK1Z2のタンパク質量が顕著に増加して!/、た。ま た、リン酸ィ匕チ口シンに特異的に結合するモノクローナル抗体 4G10を使用したところ 、化合物 No. 4がタンパク質のチロシンリン酸ィ匕を非特異的に顕著に亢進することが 明らかとなった。
[0105] また、同様の実験系で異なるタンパク質についてチロシンリン酸ィ匕を検討した。結 果を図 9に示す。化合物 No. 4は、 MEK、 p38MAPK、 JNK、 Aktについては、チ 口シンのリン酸ィ匕を亢進しな力つた。しかし、上記実験と同様に、 ERKについてはチ 口シンリン酸ィ匕が亢進して 、た。
[0106] ERKは、細胞増殖および細胞生存に関与することが知られているキナーゼである。 したがって、ポジティブスクリーニングにおいて、化合物 No. 4は、非特異的に ERK を活性ィ匕することによって Mlクローンの細胞死を抑えたのであって、本発明の目的 とする IL 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を特異的に阻害する化合物では なぐ本スクリーニング法における稀なノックグラウンドの一例と考えられる。
[0107] 本スクリーニングによる結果物
本スクリーニング方法のポジティブおよびネガティブスクリーニング工程により、化合 物 No. 1, 2, 7, 10, 13, 14および 16の 7種類が選択された。本実施例の生化学的 スクリーニング工程は、 IL 6シグナル伝達系の中でも主に STAT3について解析を 行い、少なくとも化合物 No. 2, 13および 16が STAT3のリン酸ィ匕に影響を及ぼすこ とが明ら力となった。これら以外の化合物に関しても、ポジティブおよびネガティブスク リー-ング工程より選択されてきているため、 STAT3を介する経路、 Rasを介する経 路、並びに PI3Kおよび Aktを介する経路を含む、 IL 6シグナル伝達系の構成因 子の活性ィ匕を阻害していると考えられる。
[0108]
本願発明により、 IL 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する化合物を スクリーニングする方法が提供され、実際に IL 6シグナル伝達系の構成因子の活 性ィ匕を阻害する化合物が得られた。本願発明の方法を用いて、他の化合物ライブラ リーをスクリーニングすることで、さらなる IL— 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕 を阻害する化合物を同定することが可能である。また、こうして同定されたィ匕合物が、 癌をはじめとする IL 6シグナル伝達系が関係する疾患の治療薬をなることが期待さ れる。

Claims

請求の範囲
[1] IL 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する化合物をスクリーニングす る方法であって、
(a) IL— 6の刺激により死滅する細胞を用い、 IL 6で刺激したときに当該細胞の死 滅を抑制する化合物を選択する、ポジティブスクリーニング工程、次いで
(b)工程 (a)で選択されたィ匕合物について、生化学的手段により、 IL— 6シグナル伝 達系のいずれかの構成因子の活性化を阻害する化合物をさらに選択する、生化学 的スクリーニング工程、
を含む、前記方法。
[2] ポジティブスクリーニング工程 (a)で使用する IL— 6の刺激により死滅する細胞が、 マウスまたはヒト由来である、請求項 1の方法。
[3] ポジティブスクリーニング工程 (a)で使用する IL— 6の刺激により死滅する細胞が、 マウス由来の Ml細胞に由来するクローンである、請求項 1または 2の方法。
[4] ポジティブスクリーニング工程 (a)で使用する IL— 6の刺激により死滅する細胞が、 遺伝子工学的に作成された細胞である、請求項 1または 2の 、ずれかの方法。
[5] IL— 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する化合物の標的分子が、 ST
AT3を介する経路の構成因子である、請求項 1な!、し 4の ヽずれかの方法。
[6] IL— 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する化合物の標的分子力 Ras を介する経路の構成因子である、請求項 1な 、し 4の ヽずれかの方法。
[7] IL— 6シグナル伝達系の構成因子の活性ィ匕を阻害する化合物の標的分子が、 PI3
Kおよび Aktを介する経路の構成因子である、請求項 1な!、し 4の ヽずれかの方法。
[8] 生化学的スクリーニング工程 (b)の生化学的手段が、ウェスタンプロット法、キナー ゼアツセィ、転写活性測定アツセィ、表面プラズモン共鳴法、免疫沈降法、細胞染色 法、ジーンチップによる遺伝子発現解析、ノーザンブロット法、および RT— PCR法か らなる群より選択される 、ずれかの手法、あるいはこれらの組み合わせを用いて行わ れる、請求項 1ないし 6のいずれかの方法。
[9] ポジティブスクリーニング工程 (a)と生化学的スクリーニング工程 (b)の間に、工程（ a)で選択された化合物から、 IL 6の刺激により増殖する細胞を用い、当該細胞の I L— 6依存的増殖を抑制する化合物を選択する、ネガティブスクリーニング工程をさら に含む、請求項 1ないし 7のいずれかの方法。
[10] ネガティブスクリーニング工程で使用する IL— 6の刺激により増殖する細胞が、ヒト 由来である、請求項 8の方法。
[11] ネガティブスクリーニング工程で使用する IL— 6の刺激により増殖する細胞が、 IL
- 6依存性腫瘍性細胞株である、請求項 8または 9の方法。
[12] 以下の式（1)一（6)からなる群より選択される、 IL 6シグナル伝達系の構成因子 の活性化を阻害する化合物：
式 ( 1) :
[化 1]
Figure imgf000028_0001
[式中、
R1は、水素、（C— C )アルキル、またはハロゲンであり；そして
1 6
R2は、水素、（C— C )アルキル、ヒドロキシ基または（C— C )アルコキシ基であり
1 6 1 6
である]；
式 (2) :
[化 2] 2
Figure imgf000028_0002
[式中、
R1は、水素、（C— C )アルキル、またはハロゲンであり；そして
1 6
R2は、水素、（C— C )アルキル、ヒドロキシ基または（C, Cj)アルコキシ基であり である]；
式 (3) :
[化 3]
Figure imgf000029_0001
中、
R1は、水素または (C— C )アルキルである] ;
1 10
式 (4) :
[化 4]
Figure imgf000029_0002
4
[式中、
および R3は、それぞれ同一または異なる、水素またはハロゲンであり；そし て
R4は、水素またはハロゲンである]； 式 (5) :
[化 5]
Figure imgf000030_0001
中、
R1は、水素またはハロゲンであり；そして
R2、 R3および R4は、それぞれ同一または異なる、水素、（C— C )アルキル、ヒドロキ
1 6
シ基または（C— C )アルコキシ基である]；
1 6
および、
式 (6) :
[化 6]
Figure imgf000030_0002
[式中、
および R3は、それぞれ同一または異なる、水素またはハロゲンであり；そし て R4、 R5、および R6は、それぞれ同一または異なる、水素またはハロゲンである]。 以下の式（7) - (13)力もなる群より選択される、 IL— 6シグナル伝達系の構成因子 の活性化を阻害する化合物：
式 (7)
[化 7]
Figure imgf000031_0001
式 (9)
[化 9]
Figure imgf000031_0002
Figure imgf000032_0001
式 (11) [化 11]
Figure imgf000032_0002
および、 式（13) [化 13]
Figure imgf000033_0001
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