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WO2007055429A1 - 非天然アミノ酸をタンパク質に導入するためのtRNA変異体 - Google Patents

非天然アミノ酸をタンパク質に導入するためのtRNA変異体 Download PDF

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Publication number
WO2007055429A1
WO2007055429A1 PCT/JP2006/323064 JP2006323064W WO2007055429A1 WO 2007055429 A1 WO2007055429 A1 WO 2007055429A1 JP 2006323064 W JP2006323064 W JP 2006323064W WO 2007055429 A1 WO2007055429 A1 WO 2007055429A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
trna
amino acid
protein
codon
base
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2006/323064
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takahiro Hohsaka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
Japan Science and Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science and Technology Agency filed Critical Japan Science and Technology Agency
Priority to US12/084,967 priority Critical patent/US8372960B2/en
Priority to JP2007544247A priority patent/JP4917044B2/ja
Publication of WO2007055429A1 publication Critical patent/WO2007055429A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)

Definitions

  • the present invention relates to a tRNA for introducing a non-natural amino acid such as a labeled amino acid into a protein.
  • amino acids are first bound to the 3 ′ end of tRNA and then transported to the ribosome, where protein synthesis occurs.
  • the ribosome translates from codon to amino acid.
  • Non-intrinsic amino acids can be incorporated into proteins by using tRNA bound to non-natural amino acids.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 As a method for introducing an unnatural amino acid into a protein, the codon at the site to be introduced is substituted with a termination codon UAG, and translation is carried out in the presence of tRNA aminoacylated with the unnatural amino acid having CUA in the anticodon.
  • tRNA for yeast phenylalanin see Non-Patent Documents 1 and 2
  • tRNA for Escherichia coli Asparagine tRNA for Detrahimenaglutamine
  • Non-Patent Document 3 tRNA for Escherichia coli glycine
  • Non-Patent Document 2 Nucl eic Ac ids Res., 18, 83-88, 1989
  • Non-Patent Document 3 Chem. Biol., 3, 1033-1038, 1996
  • Non-Patent Document 4 J. Am. Chem. Soc., 1 11, p. 8013, 1989 Disclosure of Invention
  • the present invention provides a tRNA that has CUA in an anticodon and is aminoacylated with an unnatural amino acid, and can efficiently introduce an unnatural amino acid into a protein without competing with a termination factor. With the goal.
  • the present inventor searched tRNA that can efficiently introduce an unnatural amino acid into a protein using a terminating codon UAG from tRNAs derived from various species, and is a tRNA for Trp that is converted into an anticodon. We found that those with CUA can be introduced efficiently. Also, by modifying it, a trp tRNA with CUA in the anticodon, G in 5 ', and the base paired with 5' G (usually defined as No. 72) It was found that C, the next base of which is A, can be introduced more efficiently and is not subject to the addition of natural amino acids by aminoacyl tRNA synthetase.
  • Trp tRNA (G1-C72) I found it suitable.
  • the introduction efficiency of unnatural amino acids can be improved by inserting a single base immediately before the CCA sequence at the 3 'end of tRNA.
  • the present invention solves the above-mentioned problem so that unnatural amino acids can be efficiently introduced by using the above tRNA even when competing with a termination factor.
  • the present invention is as follows.
  • a tRNA mutant for tritophan which has CUA as an anticodon and pairs with a termination codon.
  • the 5 ′ end is G
  • the base paired with G at the 5 ′ end is C
  • the base adjacent to the 3 ′ side of C is A. Paired with the termination codon of [1] TRNA variant to be combined.
  • the position of C that matches G at the 5 ′ end is the 72nd position from the 5 ′ end, and the position of A adjacent to the 3 ′ side of the C is the 73rd position from the 5 ′ end.
  • a tRNA variant that pairs with a stop codon is the position of C that matches G at the 5 ′ end.
  • [4] A tRNA mutant that pairs with a termination codon of any one of [1] to [3], which is a prokaryotic cell-derived tRNA.
  • [5] A tRNA mutant that pairs with the stop codon of [4], which is a tRNA derived from E. coli or Mycoplasma capricolum.
  • a tRNA mutant derived from Mycoplasma capricolum consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, which pairs with a stop codon.
  • [7] A tRNA mutation paired with one of the termination codons of [1] to [6], wherein either one of A, G, or U is inserted immediately before the CCA sequence at the 3 'end body.
  • the position of C that matches G at the 5 ′ end is the 72nd position from the 5 ′ end, and the position of A adjacent to the 3 ′ side of the C is the 73rd position from the 5 ′ end.
  • [1 0] A tRNA variant that pairs with the termination codon of [9], wherein the amino acid is an unnatural amino acid or a derivative thereof.
  • [1 1] A tRNA variant that pairs with a termination codon according to [10], wherein the amino acid derivative is selected from the group consisting of hydroxy acid, mercapto acid, and carboxylic acid.
  • [1 2] A tRNA mutant that pairs with the termination codon of any one of [9] to [11], wherein the amino acid is fluorescently labeled.
  • [1 3] A method of introducing a desired amino acid into a protein, which is mRNA of the protein to be amino acid introduced, and the codon corresponding to the introduction position of the amino acid to be introduced is the termination code: / mRNA and any end of [1]-[1 2]
  • [1 6] A tRNA variant that pairs with the 4-base codon of [14] or [15], which is a tRNA variant for phenylalanin.
  • [17] A tRNA mutant that binds to a 4-base codon of any one of [14;] to [16], which is a yeast-derived tRNA.
  • a tRNA variant derived from yeast consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 40, which pairs with a 4-base codon.
  • [1 9] A tRNA variant that pairs with a 4-base codon of any one of [14] to [18] that is aminoacylated with an amino acid.
  • [2 1] The tRNA variant that pairs with the 4-base codon of [20], wherein the amino acid derivative is selected from the group consisting of hydroxy acid, mercapto acid, and carboxylic acid.
  • a method for introducing a desired amino acid into a protein which is mRNA of a protein to which an amino acid is to be introduced and whose codon corresponding to the introduction position of the amino acid to be introduced is a 4-base codon
  • [14] A method for introducing an amino acid into a protein by using a tRNA mutant that pairs with a 4-base codon according to any one of [14] to [22] and assigning the tRNA mutant to a 4-base codon.
  • a protein comprising a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy donor for fluorescence resonance energy transfer and a fluorescent labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy acceptor, wherein the protein binds to the protein.
  • a step of preparing mRNA of a protein in which one 4-base codon and one stop codon are inserted, and the position where the 4-base codon and the stop codon are inserted interacts with other molecules.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of a method for producing fluorescently labeled amino acid-tRNA.
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of a method for evaluating the introduction of fluorescently labeled amino acids.
  • FIG. 3A shows the structure of tRNA derived from E. coli.
  • FIG. 3B shows the structure of tRNA derived from E. coli.
  • ⁇ Fig. 3C shows the structure of tRNA derived from E. coli.
  • Fig. 3D shows the structure of tRNA derived from E. coli.
  • Fig. 3E shows the structure of tRNA derived from E. coli.
  • Fig. 3F shows the structure of tRNA derived from E. coli.
  • Fig. 3G shows the structure of tRNA derived from E. coli.
  • Fig. 3H shows the structure of tRNA derived from E. coli.
  • Fig. 4 is a fluorescence image of SDS-PAGE when tRNA added with a fluorescently labeled amino acid is added, and is a photograph showing the result of introduction of the fluorescently labeled amino acid into UAG by an E. coli-derived tRNA mutant.
  • FIG. 5 shows the structure of a tRNA mutant for E. coli-derived tributophan.
  • Figure 6A shows the results of introduction of fluorescently labeled amino acids into UAG using tRM mutants for E. coli-derived tributophan, and is a photograph showing the results of SDS-PAGE fluorescence imaging using tRNAs without added amino acids. is there.
  • FIG. 6B is a photograph showing the results of introduction of a fluorescently labeled amino acid into UAG by a tRNA mutant for Escherichia coli-derived tributophan, and the results of Western blotting when using a tRNA to which a fluorescently labeled amino acid has been added.
  • FIG. 6C shows the results of introduction of fluorescently labeled amino acid to UAG by the tRNA mutant for E. coli-derived tributophan, and shows the fluorescence band intensity of the introduced protein when each mutant is used.
  • FIG. 7A shows the structure of tRNA derived from Mycoplasma capricolumn.
  • FIG. 7B shows the structure of tRNA derived from Mycoplasma capriram.
  • FIG. 7C shows the structure of tRNA derived from Mycoplasma capriram.
  • FIG. 7D shows the structure of Mycoplasma capricolumn-derived tRNA.
  • Fig. 7E shows the structure of tRNA derived from Mycoplasma capriram.
  • FIG. 7F shows the structure of tRNA derived from Mycoplasma 'capri alam.
  • FIG. 7G shows the structure of tRNA derived from Mycoplasma capriram.
  • Fig. 7H shows the structure of tRNA derived from Mycoplasma and Capriram.
  • FIG. 7A shows the structure of tRNA derived from Mycoplasma capricolumn.
  • FIG. 7B shows the structure of tRNA derived from Mycoplasma capriram.
  • FIG. 8 is a photograph showing the result of introduction of a fluorescently labeled amino acid into UAG by a Mycoplasma 'capricolumn-derived tRNA mutant.
  • FIG. 9 is a diagram showing the structure of a mycoplasma capricolumn-derived tryptophan tRNA mutant.
  • Figure 1 OA shows the results of introduction of fluorescently labeled amino acids into UAG using a mycoplasma capricolumn-derived tryptophan tRNA mutant, using tRNA with no amino acid added and tRNA with a fluorescently labeled amino acid added. It is a photograph which shows the result of the fluorescence imaging in the case.
  • BFLAF indicates tRNA added with fluorescently labeled amino acid
  • no AA indicates tRNA without added amino acid.
  • Figure 10B shows the results of introduction of fluorescently labeled amino acids into UAG using the Mycoplasma capricolumn-derived tryptophan tRNA mutant, and shows the fluorescence band intensity of the introduced protein when each mutant is used. is there.
  • Figure 11A shows the structure of tRNA (Gl-C72, A73) mutants for tryptophan derived from various organisms.
  • FIG. 11B shows the structures of tryptophan tRNA (Gl-C72, A73) mutants derived from various organisms.
  • Fig. 12A is a photograph showing the results of introduction of fluorescently labeled amino acid to UAG by tryptophan tRNA (Gl-C72, A73) mutants derived from various organisms.
  • FIG. 12B is a photograph showing the results of introduction of fluorescently labeled amino acids into UAG by tryptophan tRNA (G1-C72, A73) mutants derived from various organisms.
  • Figure 13 A shows the results of introduction of fluorescently labeled amino acids into UAG by tryptophan tRNAs (Gl-C72, A73) ⁇ variants derived from various organisms. It is a photograph which shows the result of fluorescence imaging at the time of using tRNA which added the fluorescence labeled amino acid.
  • BFLAF indicates tRNA with a fluorescently labeled amino acid added
  • no AA indicates tRNA with no amino acid added.
  • Figure 13 B shows the results of introduction of fluorescently labeled amino acids into UAG by tryptophan tRNA (Gl-C72, A73) mutants derived from various organisms. Introduction using each mutant It is a figure which shows the fluorescence band intensity
  • FIG. 14A is a diagram showing an outline of a method for double introduction of fluorescently labeled amino acids into maltose binding protein (MBP) by the 4-base codon method.
  • Figure 14 4B shows fluorescence to maltose binding protein (MBP) by the 4-base codon method. It is a photograph which shows the result of double introduction of a labeled amino acid.
  • FIG. 15 A shows an overview of the double introduction method of fluorescently labeled amino acids into maltose-binding protein (MBP) by the termination codon method using the tRNA mutant of the present invention.
  • Fig. 15 B is a photograph showing the results of double introduction of fluorescently labeled amino acids into maltose binding protein (MBP) by the termination codon method using the tRNA mutant of the present invention. is there.
  • FIG. 16A shows the chemical structure of a fluorescently labeled amino acid having TAMRA.
  • Figure 16B shows the introduction of a fluorescently labeled amino acid with TAMRA against UAG by the Mycoplasma 'capricolumn-derived tryptophan tRNA mutant, and the introduction of fluorescently labeled amino acid with TAMRA against CGGG with the yeast-derived tyrosine mutant for phenylalanine. It is a photograph showing the results, and is a photograph showing the results of fluorescence imaging in the case of using tRNA added with fluorescently labeled amino acid.
  • Figure 16C shows the results of introduction of fluorescently labeled amino acids with TAMRA for UAG by Mycoplasma 'capricolumn-derived tryptophan tRNA mutant and introduction of fluorescently labeled amino acids with TAMRA for CGGG by yeast-derived tyrosine mutant for vinylalanine. It is a figure which shows, and is a figure which shows the fluorescence band intensity
  • Figure 17 shows the structure of a mycoplasma 'capricolumn-derived tryptophan tRNA mutant with a single base inserted immediately before the CCA sequence at the 3' end.
  • Figure 18A is a photograph showing the result of introduction of fluorescently labeled amino acid to UAG using a Mycoplasma capricolumn-derived tributephan tRNA mutant with a single base inserted immediately before the 3'-terminal CCA sequence. It is a photograph showing the result of fluorescence imaging when tRNA added with fluorescently labeled amino acid is used.
  • FIG. 5 is a diagram showing the fluorescence band intensity of the introduced protein when each mutant is used.
  • Figure 1 9A shows the mycoplasma 'capricolumn-derived tryptophan tRNA variant This is a photograph showing the result of introduction of phosphorylated tyrosine using a streptavidin mRNA in which the second site is substituted with UAG by inserting a single base immediately before the 3 'terminal CCA sequence.
  • Fig. 19A is a photograph showing the results of Western blotting using an anti-phosphotyrosine antibody when tRNA added with phosphorylated tyrosine is used.
  • Fig. 19B is a mycoplasma 'capricolumn-derived tryptophan tRNA variant, in which a single base was inserted immediately before the CCA sequence at the 3' end, and the streptavidin mRNA with the second site replaced by UAG. It is a figure which shows the result of the introduction
  • Figure 2 OA is a Mycoplasma 'capricolumn-derived tryptophan tRNA variant with a single base inserted immediately before the CCA sequence at the 3rd end, with a T7tag at the N-terminus and the 83rd site replaced by UAG
  • This is a photograph showing the result of introduction of phosphorylated tyrosine when using the streptavidin mRNA, and a photograph showing the result of Western blotting with anti-T7tag antibody when using tRNA added with phosphorylated tyrosine. is there.
  • Fig. 20 B is a tRNA mutant for tryptophan derived from Mycoplasma capricolumn, which has a T7 tag at the N-terminus and a UAG at the 83rd site, with one base inserted immediately before the 3'-terminal CCA sequence.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of introduction of phosphorylated tyrosine when using streptavidin mRNA substituted in FIG. 4, and showing the western plot band intensity of the introduced protein when each mutant is used.
  • Figure 21 shows a tRNA mutant for yeast-derived felanuaranin with a 4-base CCCG in the anticodon and a single base inserted immediately before the CCA sequence at the 3 terminal (73. 1 A, 73. 1 C, 73.1G, 73.1U).
  • Fig. 2 2A is a yeast-derived tRNA mutant with a 4-base codon introduced at the 83rd position of streptavidin, with a single base inserted just before the 3'-terminal CCA sequence. It is a photograph showing the result of introducing a fluorescently labeled amino acid into CGGG, and a photograph showing the result of fluorescence imaging when using a tRNA added with a fluorescently labeled amino acid.
  • Figure 2 2B shows a 4-base codon introduced at the 83rd position of streptavidin, which is a tRNA mutant for yeast-derived phenylalanin with a single base inserted immediately before the CCA sequence at the 3 'end. It is a figure which shows the result of introduce
  • Figure 2 3A is a yeast-derived tRNA mutant for felan lanalanin with a single base inserted immediately before the 3'-terminal CCA sequence. It is a photograph showing the result of introducing a fluorescently labeled amino acid having TAMRA when avidin mRNA is used, and a photograph showing the result of fluorescence imaging when using a tRNA to which a fluorescently labeled amino acid has been added.
  • Figure 2 3B is a yeast-derived tRNA mutant with a T7tag sequence at the N-terminus and a CGGG introduced immediately after the CCA sequence at the 3 'end. It is a figure which shows the result of having introduce
  • the tRNA of the present invention is a tRNA for tryptophan, which is a tRNA mutant that has CUA as an anticodon and pairs with a termination codon.
  • the tRNA mutant can be obtained by modifying the anticodon of tRNA corresponding to tryptophan derived from microorganisms to CUA.
  • Microorganisms include Escherichia coli, Mycoplasma 'Capri column
  • the tRNA of the present invention includes a tryptophan tRNA, wherein the tRNA variant having CUA as an anticodon and paired with a stop codon is further mutated.
  • the base at the 5 ′ end of the base sequence of tRNA is replaced with G, and when the tRNA has a clover leaf structure, the base paired with G at the 5 ′ end is replaced with C.
  • the base pairing with G at the 5 ′ end is the 72nd base from the 5 ′ end. That is, the tRNA variant of the present invention is typically one in which the 72nd base is replaced with C and the 73rd base is replaced with A or G.
  • tRNA mutants in which the 5 ′ terminal base is replaced with G, the 72nd base is replaced with C, and the 73rd base is replaced with A or G are respectively G1-C72, A73 or G1 -Expressed as C72, G73.
  • the tRNA of the present invention may be Mycoplasma capricolum (E. coli), Nonnores halodouranns, Bacillus subtillis, Bole! 'Bergdonolehueri
  • tRNA for tryptophan derived from N315 (Staphylococcus aureus N315), which is a tRNA variant that has CUA as an anticodon and pairs with a termination codon, and has a G at the 5 end and a G at the 5 ′ end.
  • Examples include tRNA variants that pair with a stop codon where the position of C to pair is 72nd from the 5 'end and the position of A adjacent to the 3' side of the C is 73rd from the 5 'end
  • FIG. 5 shows the structure of the tRNA for use
  • Figure 9 shows the structure of the tRNA for tryptophan derived from Mycoplasma 'capricolumn.
  • the base at the 5 'end is replaced with G
  • the 72nd base paired with the 5' end is replaced with C
  • the 3 'base of the base substituted with C is further replaced. It is shown that.
  • the tRNA of the present invention includes a mutant in which one base of any of A, G, C, or U is inserted immediately before the CCA sequence at the 3 ′ end.
  • Mutants in which one of the bases A, G, C, or U is inserted immediately before the CCA sequence at the 3 'end usually replaces the 72nd base with C, and usually replaces the 73rd base with A. Or, it is substituted with G and further inserted with either A, G, C or U as the 74th base.
  • the number of bases such as the loop part and stem part, may differ, so the base paired with the base at the 5 'end may not be the 72nd position.
  • the base numbers of the numbered and 74th substitution sites may be shifted by several, for example 1, 2, 3, 4, or 5.
  • the tRNA has a three-dimensional structure, the base pairing with the 5'-end and 5'-end bases is replaced, and one of the bases is replaced with the 3'-side base. As long as the efficiency is increased, it is included in the mutant tRNA of the present invention.
  • the mutant tRNA of the present invention is substituted with a base corresponding to the 72nd base from the 5 ′ end of a typical normal tRNA, for example, a tRNA for tryptophan derived from E. coli or a tRNA for tryptophan derived from Mycoplasma capricom.
  • a typical normal tRNA for example, a tRNA for tryptophan derived from E. coli or a tRNA for tryptophan derived from Mycoplasma capricom.
  • One of the bases that is, a mutant tRNA in which the base corresponding to the 73rd base from the 5 'end of the tRNA for tryptophan derived from Escherichia coli or the tRNA for tryptophan derived from Mycoplasma capricom is substituted.
  • the base corresponding to the 72nd base means the base at the position where the 5 'terminal base is paired
  • the base corresponding to the 73rd base is one of the
  • tRNA mutants with one base inserted immediately before the CCA sequence are 73.1A, 73.1C,
  • the tRNA mutant of the present invention includes a tRNA mutant for Mycoplasma capricolumn-derived tryptophan, in which one base is inserted immediately before the CCA sequence.
  • the mutant tRNA of the present invention includes a mutant tRNA that pairs with a 4-base codon for introducing an unnatural amino acid using a 4-base codon CGGG.
  • the mutant tRNA is a yeast tRNA mutant having 4-base CCCG in anticodon and one of A, C, G or U immediately before the CCA sequence at the 3 ′ end. This is a tRNA mutant with the base inserted.
  • the mutant of tRNA can be synthesized based on the sequence information.
  • the mutant of tRNA can be prepared by introducing a mutation into tRNA such as tRNA for tryptophan derived from the microorganism. Mutants can be created using known genetic engineering techniques.
  • a mutation introduction kit for example, a mutant-directed mutagenesis method using a site-directed mutagenesis method, for example, by a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a method similar thereto
  • -K manufactured by TAKARA
  • Mutant-G manufactured by TAKARA
  • the present invention further includes an aminoacyl tRNA in which the above tRNA is aminoacylated with an amino acid or an analog thereof.
  • Amino acids or their analogs used for aminoacylation are not limited, and include natural amino acids or non-natural amino acids or derivatives thereof. Also included are modified amino acids generated by post-translational modifications such as phosphorylation, methylation and acetylation.
  • Non-natural amino acid refers to any non-naturally occurring artificial compound having an amino skeleton in the same molecule, and can be prepared by binding various labeled compounds to the amino acid skeleton.
  • the “amino acid skeleton” contains a carboxyl group, an amino group, and a part connecting them in an amino acid.
  • labeled amino acid which is an amino acid linked to a labeling compound.
  • labeling compound there is an amino acid obtained by binding a labeling compound to an amino acid having an amino acid skeleton containing an aromatic ring such as a benzene ring in the side chain.
  • photoresponsive amino acids photoswitch amino acids
  • fluorescent probe amino acids fluorescently labeled amino acids and the like.
  • amino acid derivatives include hydroxy acid, mercapto acid, carboxylic acid and the like.
  • the labeling compound used in the present invention is a dye compound, fluorescent substance, chemical / bioluminescent substance, enzyme substrate, coenzyme, antigenic substance and protein binding substance known to those skilled in the art.
  • fluorescent labeling compound those having an excitation wavelength in the visible light region (near 400 to 700 nm ) and further having an emission wavelength in the visible light region are preferred, and those having a strong emission intensity in an aqueous solution are particularly preferred.
  • Chemical or bioluminescent substances such as luciferin and solemidin or derivatives thereof can also be used in the present invention as labeling compounds.
  • coenzymes, substances with antigenicity, and substances that are known to bind to a specific protein are added to the target protein! Can be used as a labeling compound in the present invention.
  • a substrate for a specific enzyme for example, a substrate for alkaline phosphatase or] 3 galactosidase
  • the color reaction by the enzyme can be used for detection.
  • a substance labeled with an antigenic substance or a substance known to bind to a specific protein can be used for an indirect detection method using an antibody or a binding protein. It has the advantage of being simple.
  • a functional protein labeled with piotin using the method of the present invention has a function of binding to avidin or streptavidin via piotin, and if this function is used, the present invention It is possible to establish a detection system for a specific substance by using this method or by using a bond with avidin or streptavidin chemically labeled with a fluorescent compound or the like.
  • various dyes and substances detectable by various biochemical, chemical, and immunochemical detection methods can be used for the labeled compound.
  • the amino acid and the labeled compound can be linked via a spacer or not.
  • spacer refers to the amino acid part and the standard in a labeled amino acid molecule. It refers to the part that connects the sensing compound. That is, when the amino acid side chain in the labeled amino acid molecule and the labeled compound are not directly bonded, but one or more atoms are present between the amino acid side chain and the labeled compound, the amino acid of the labeled amino acid The label and the labeled compound are said to be linked via a spacer. Spacer is in the main chain
  • the main chain structure of the spacer is preferably one in which the above atoms are 2 to 10, preferably 3 to 8, more preferably 5, 6 or 7 bonded in a straight chain.
  • the structure may contain one or more double bonds.
  • the spacer may have 1 to several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, cyclic structures such as a benzene ring and / or a hexyl ring. Les. Further, it may be a cyclic structure such as a benzene ring or a cyclohexyl ring, or a structure in which a cyclic structure and the linear structure are combined.
  • polyolefins such as polyethylene, polypropylene, polyisobutene, polystyrene, polybule, polychlorinated bur
  • polyethers such as polyoxyethylene, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyamide, polyester, polyimide, polyimide Examples include urethane and polycarbonate.
  • binding via a spacer reduces steric hindrance to the labeling compound in the introduced protein.
  • the labeled amino acid of the present invention has an aromatic ring in the side chain of the amino acid part, and the labeled compound is bound to the aromatic ring via a spacer or without a spacer.
  • a spacer or without a spacer are preferred.
  • aromatic ring generally refers to any unsaturated cyclic compound.
  • a 5- or 6-membered heteroaromatic ring or 2 or more, preferably 2
  • polycyclic compounds containing -5, more preferably 2-3 ring structures are also included.
  • the aromatic ring is preferably a benzene ring.
  • phenylalanine, triftophan and tyrosine contain aromatic rings in their side chains.
  • An aromatic amino acid, wherein a labeling compound is bound to the aromatic ring (via a spacer or without a spacer) can be mentioned as a preferred example of the unnatural amino acid of the present invention. it can.
  • a bond between appropriate functional groups may be used.
  • a labeled compound is attached to one of the functional groups, with or without a spacer.
  • ком ⁇ онентs such as succinimide ester, isothiocyanate, sulfonyl chloride, NBD-halide, and dichlorotriazine are used as amino group labeling probes.
  • Alkyl halide, maleimide, Compounds such as aziridines can use diazomethane compounds, aliphatic bromides, carbodiimides, etc. as probes for labeling carboxyl groups.
  • a succinimide ester can be introduced into a labeling compound via a spacer or not, and an amino group can be introduced into the aromatic ring of an amino acid, and both can be bound by an amide bond.
  • an amino acid having an amino group introduced into an aromatic ring there can be mentioned, for example, an aminophenylalanine.
  • the functional group used in this case can be appropriately selected and introduced, and the bonding method can also be selected as appropriate.
  • the amide bond formation reaction is carried out at about pH 5, so that it can be selectively reacted with the amino group of the side chain of aminophenylalanine even if other amino groups are present.
  • other amino groups may be protected by Boc, etc., and de-Boc after the reaction. This method may be referred to, for example, the description of “Shinsei Chemistry Laboratory 1 Protein VI Structure-Function Relationship”.
  • the aromatic ring is directly bonded to the atoms forming the amino acid skeleton, or indirectly bonded through at least one 1, 2, or 3 atoms of 0, N and S Good.
  • the aromatic ring is a benzene ring
  • the position where the spacer or labeling compound is bonded to the benzene ring is in the para or meta position relative to the position of the amino acid skeleton, the incorporation efficiency into the ribosome is higher. More preferably, and particularly preferably in the para position.
  • the labeled compound is bonded to the functional group of the aromatic ring with or without a spacer. In the case of aminophenylanine, paraaminophenylanine and metaaminophenylanine are preferable.
  • aminoacyl-tRNA In order to make aminoacyl-tRNA by binding amino acid to tRNA, it is necessary to bind the necessary specific group. For example, if dinucleotide (pdCpA) is bound to the carboxyl group of an amino acid, it is bound to tRNA lacking the 3'-terminal CA dinucleotide (tRNA (-CA)) to produce an artificial aminoacyl tRNA. be able to.
  • Artificial aminoacyl tRNA can be prepared according to the description of W02004 / 009709 International Publication Pamphlet and the like.
  • the ⁇ -amino group of amiso acid is protected with Boc
  • the side chain functional group is protected with Boc or OtBoc
  • Boc-amino acid is converted to cyanomethyl ester and then reacted with pdCpA, or the condensing agent carbonyl imidazole
  • Aminoacyl pdCpA can be prepared by a method of reacting Boc amino acid with pdCpA using CDI).
  • T4 RNA ligase may be used for ligation with tRNA (-CA).
  • a stop codon TAG is introduced at the codon position corresponding to the DNA introduction site encoding the protein to which the amino acid or the derivative is to be introduced.
  • Synthesis by cell-free translation system can be achieved by expressing the gene by mixing it with the necessary reagents in vitro without introducing an expression vector containing the gene to be expressed into the host cell ( Spirin, AS et al, (1988) "A continuous cell-free translation system capable of production reproduction in high yield” Science 242, 1162; Kim, DM, et al., (1996) "A highly efficient cell-free protein synthesis system from E. col i "Eur. J. Biochem. 239,
  • the cell-free protein synthesis system may refer only to the cell-free translation system that reads the genetic information of mRNA and synthesizes the protein on the ribosome, or the cell-free replication system that synthesizes RNA using DNA as a template. Sometimes it includes both cell-free translation systems. Biological extracts are used in cell-free translation systems.
  • Biological extracts include ribosomes, 20 aminoacyl tRNA synthetases, Onyl _ t RNA Transformylase, 3 types of translation initiation factors (IF1, IF2, IF3), 3 types of translation elongation factors (EF-G, EF-Tu, EF-Ts), 3 types of translation termination factors (RF1, RF2, RF3), ribosome recycling factor (RRF),
  • the biological extract may be any of those derived from E. coli, those derived from wheat germ, those derived from rabbit reticulocytes, and those derived from animal cells or insect cells.
  • the biological extract can be obtained by breaking with a French press or crushing with glass beads.
  • An E. coli-derived microbial extract is S30 extract, which can be obtained by the method of Pratt et al. (Pratt, Transcription and
  • the S30 extract consists of ribosomes, 20 aminoacyl tRNA synthetases, methylol-tRNA transformylase, 3 translation initiation factors (IF1, IF2, IF3), and 3 translation elongation factors. (translation elongation factor; EF-G, EF-Tu, EF_Ts), three types of translation termination factors (RF1, RF2, RF3), and ribose recycling factor (RRF).
  • the cell-free protein synthesis system is an ATP regeneration system, a promoter containing a nucleic acid that encodes a protein to be expressed, or a protein encoding the protein to be expressed. , TRNA, RNA polymerase, RNAase inhibitors, energy sources such as ATP, GTP, CTP, UTP, buffers, amino acids, salts, antibacterial agents, etc. Good.
  • the ATP regeneration system is not limited, and a known combination of a phosphate donor and a kinase can be used. Examples of this combination include phosphoenolpyruvate (PEP) -pyruvate kinase (PK), creatine phosphate (CP) -creatine kinase (CK), acetylyl phosphate (AP) -acetate kinase (AK) If these combinations add the ATP regeneration system to the cell-free protein synthesis system, Good.
  • PEP phosphoenolpyruvate
  • PK phosphoenolpyruvate
  • CP creatine phosphate
  • CK creatine phosphate
  • AP acetylyl phosphate
  • AK acetylyl phosphate
  • the cell-free protein synthesis system also requires mRNA encoding the protein to be produced.
  • the mRNA may include a system that transcribes nucleic acid into a cell-free protein synthesis system, that is, a system that produces mRNA encoding the protein. In this case, add DNA.
  • mRNA may be separately synthesized from the cocoon-type DNA by transcription using T7 DNA polymerase or the like, and the obtained mRNA may be included in the cell-free protein synthesis system of the present invention.
  • the production of mRNA can be achieved by a plasmid containing a suitable promoter and DNA encoding the protein to be produced located downstream of the promoter, and RNA polymerase acting on the promoter.
  • the plasmid to be used is not limited, and a known plasmid can be used. It can be used by introducing an appropriate promoter, ribosome binding site, etc. by a known genetic engineering technique. A person skilled in the art can appropriately select a plasmid to be used in the present invention and design and construct it himself.
  • the promoter may be an endogenous promoter possessed by the microorganism used in the cell-free protein synthesis system, or an exogenous promoter.
  • the above Trc promoter, T7 promoter and Tac promoter are excellent in terms of efficiency and are preferably used. Proteins can be expressed using commercially available cell-free expression kits.
  • kits include Rapid Translatation System (RTS) (Roche) and Expressway In Vitro Protein Synthesis System (lnvitrogen).
  • RTS Rapid Translatation System
  • lnvitrogen Expressway In Vitro Protein Synthesis System
  • the expression vector to be used is not limited. However, since there is a vector suitable for each cell-free translation system, it may be used.
  • the former kit expression vector includes pIVEX2.2bNde, and the latter kit expression vector includes pEXPl and pEXP2.
  • a non-natural amino acid such as amino acid labeled with a fluorescent substance can be introduced at an arbitrary position of the protein, and a fluorescently labeled protein can be produced.
  • fluorescently labeled streptavidin can be prepared by introducing PDIPY F reaminophenylanine into the Tyr84 site of streptidin.
  • the fluorescence resonance energy transfer donor and donor are located at any two positions on the protein.
  • one fluorescently labeled amino acid may be introduced by the 4-base codon method.
  • the 4-base codon method is described in Hohsaka T., et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 9778-9779, 1996 and Hohsaka T., et al., J. Am. Chem. Soc., 121 , 34-40, 1999.
  • proteins in this case include all proteins whose three-dimensional structure changes by interacting with molecules.
  • proteins include calmodulin, cGMP-dependent protein kinase, steroid hormone receptor, ligand binding domain of steroid hormone receptor, protein kinase, inositol-1,4,5-triphosphate receptor, Examples include recovelin, maltose binding protein, and DNA binding protein.
  • Molecules that interact with proteins are specific to each protein, and include other organic or inorganic low molecular weight molecules such as proteins, nucleic acids, sugars, and ions.
  • calmodulin-binding protein is calcium ion.
  • CGMP-dependent protein kinase includes cGMP
  • maltose-binding protein includes maltose.
  • steroid hormone receptors and DNA-specific proteins include steroid hormones and DNA specific for each protein.
  • Fluorescence resonance energy transfer energy One donor (donor) and one energy transfer energy acceptor include BODIPY compounds, rhodamine (TAMRA), fluorescein (FITC;), Texas Red And any known fluorescent substance including Atharidin Orange, Cyber Green, Cy3, Cy5, and the like, and derivatives thereof.
  • the excitation spectrum of substances that serve as energy acceptors serves as the energy donor. Select so that it overlaps with the radiation spectrum of the material.
  • BODIPY (registered trademark) FL may be selected as the energy donor
  • BODIPY (registered trademark) 558/568 may be selected as the energy acceptor.
  • the energy donor and the energy acceptor when the conformation changes, the energy donor and the energy acceptor must maintain the proper orientation to cause fluorescence resonance energy transfer. There is.
  • a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance may be introduced into a specific site in the protein.
  • the position at which the fluorescently labeled amino acid is introduced differs depending on the protein into which the fluorescently labeled amino acid is introduced, but the three-dimensional structure is analyzed based on the amino acid sequence of the natural protein, and the fluorescently labeled amino acid is located at a position close to the three-dimensional structure. Should be introduced.
  • the three-dimensional structure of the protein can be predicted by using, for example, commercially available protein three-dimensional structure analysis software. In some cases, either the energy donor or energy acceptor is introduced at the N-terminus or C-terminus of the protein, and the other is introduced at several to several tens of locations inside the protein. What is necessary is just to identify the introduction position suitable for this invention from the inside.
  • the protein is calmodulin, an amino acid labeled with 4, 4-difluoguchi-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-S-indacene-3-propionic acid (BODIPY FL) And 4-difluoro-5- (2-cellyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-S-indacene-3-propionic acid (BODIPY 558/568) labeled amino acids, respectively. May be introduced at the 40th and N-terminus of the amino acid sequence of, or at the 99th and N-terminus of the amino acid sequence of calmodulin.
  • the three-dimensional structure of the protein of the present invention changes, and the distance and orientation of the energy acceptor and energy donor change.
  • the energy donor and the energy acceptor Fluorescence resonance energy transfer (FRET) occurs between them, but the efficiency and FRET efficiency changes as the distance and orientation of the energy acceptor and energy-donor changes.
  • a light source for the excitation light a light source in which a broad ultraviolet light or visible light is set to a desired wavelength range using a filter or a spectroscope may be used, or a monochromatic light such as a laser may be used.
  • a laser primary light source helicopter Umuka Domiumureza one (442 nm) is the force s, blue diode laser (405 nm) is common, ⁇ Roh Legong ion, single THE one (457 nm), LD pumped solid-state laser (di ode- pumped solid-state laser) (430 nm) or the like may be used.
  • a pulse laser near 800 nm may be used.
  • the protein is the following protein.
  • a protein comprising a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy donor for fluorescence resonance energy transfer and a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy acceptor, which can bind to the protein
  • fluorescently labeled amino acids at positions where the three-dimensional structure changes when the molecule is bound, and the distance and orientation of the energy donor fluorescent material and energy acceptor fluorescent material change. Proteins whose efficiency can vary,
  • One of the fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy donor for fluorescence resonance energy transfer and the fluorescent labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy acceptor are present at the N-terminal or C-terminal of the protein.
  • the other protein is present at a site other than the N-terminus and C-terminus,
  • Fluorescent substance as energy donor and fluorescent substance as energy acceptor are based on 4, 4-difluoro_4_bora-3a, 4a-diaza-S-indacene in their chemical structure 5.
  • the protein according to 5 above which is a molecule included as a skeleton or a salt thereof or a derivative thereof, 7.
  • a fluorescent substance serving as an energy donor is 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza -s-yndacene-3-propionic acid or its salt, and the fluorescent substance that is the energy acceptor is 4, 4-difluo- 5-(2-chenyl) -4_bora-3a, 4a-diaza-s- The protein of the above 6, which is indacene-3-propionic acid or a salt thereof,
  • the efficiency of fluorescence resonance energy transfer is altered when calmodulin interacts with calmodulin-binding proteins and calcium ions when an amino acid labeled with a fluorescent substance as an energy donor and a fluorescent substance as an energy acceptor.
  • the calmodulin of 9 above present at a position on the calmodulin where the distance and orientation can change to
  • the fluorescent substance as an energy donor is 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof,
  • the fluorescent substance is 4-dibulo-5- (2-chenyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-yndacene-3-propionic acid or its salt, and is labeled with the fluorescent substance
  • the amino acid is present at a position on the calmodulin where the distance and orientation can change such that the efficiency of fluorescence resonance energy transfer changes when calmodulin interacts with calmodulin-binding protein and calcium ions.
  • Example 1 Method for producing fluorescently labeled amino acid-tRNA
  • oligonucleotides were chemically synthesized based on the base sequence of each tRNA.
  • PCR KOD Dash buffer, 0.2 mM dNTP, 1.25 units KOD Dash, using a primer containing the T7 promoter and the tRNA base sequence from 1 to 31 and a primer containing the tRNA base sequence from 24 to 46, Double-stranded DNA was obtained by including 50 nmol of each primer in 50 / L).
  • PCR was carried out under the same conditions as above using a primer with the T7 promoter sequence (CTAATACGACTCACTATA) (SEQ ID NO: 3 2) and a primer containing the 39th to 74th nucleotide sequences of tRNA.
  • CTAATACGACTCACTATA CTAATACGACTCACTATA
  • tRNA (-CA) was synthesized by a transcription reaction.
  • Reaction solution lOO / L consists of 40 mM Tris-HC1 (pH 8.0), 20 mM MgCl 2 , 5 mM DTT, 4 mM NTP, 20 mM GMP, 2 mM spermidine, 10 ⁇ g / mL BSA, 40 units ribonuclease inhibitor, Contains 1 unit inorganic pyrophosphatase, 400 units T7 RNA Polymerase, 10 ⁇ g tRNA (_CA) gene.
  • the reaction solution was reacted at 37 ° C for 18 hours, and tRNA (-CA) was purified with a DEAE-cellulose column (Whatman).
  • 5xLigation Buffer (275mM Hepes one Na pH7.5, 75mM MgCl 2, 16.5m DTT, 5mM ATP) was 4 ⁇ , 200 ⁇ M tRNA (-CA ) 2.5 / i and, BODIPY FL-aminophenylalanine-pdCpA of DMS0 Solution 2 / i L, 0.1% BSA 0.4 ⁇ L, T4 RNA Ligase (25 units / ⁇ L) 1.2 ⁇ , and water 9.9 ⁇ were mixed and reacted at 4 ° C. for 2 hours.
  • the mRNA sequence of streptavidin in which the Tyr83 site is substituted with UAG is shown below (SEQ ID NO: 33). It shows from the start codon to the original end codon. The underlined portion indicates the inserted stop codon.
  • Example 3 Introduction of fluorescence-labeled amino acids to UAG by using E. coli-derived tRNA mutants 22 types of tRNA having an E. coli-derived tRNA sequence and substituting anticodon with CUA were prepared by the method described in Example 1. Subsequently, introduction of fluorescently labeled amino acid was evaluated by the method described in Example 2.
  • Fig. 4 shows the fluorescence image of SDS-PAGE when tRNA added with fluorescently labeled amino acid is added.
  • Fig. 6 Western blotting results when using tRNA with no amino acid added to A.
  • Fig. 6B is a fluorescence image of SDS-PAGE when using tRNA with fluorescent labeled amino acid.
  • Fig. 6 C indicates the fluorescence band intensity of the introduced protein when each mutant is used.
  • FIGS. 6A to 6C G1-C72, A73 and G1-C72, G73 have high introduction activity.
  • Gl-C72 and G73 produce a full-length protein even without the addition of a fluorescently labeled unnatural amino acid, so it is considered that a natural amino acid is added in the translation system. Therefore, G1-C72, A73, which does not receive the addition of natural amino acids, is optimal.
  • Fig. 8 shows the results of introduction of fluorescently labeled amino acid to UAG using a Mycoplasma 'capricolumn-derived tRNA mutant. As shown in Fig. 8, it was found that among tRNA mutants derived from Mycoplasma capriculum, tRNA for tributophan is suitable for introduction of unnatural amino acids.
  • Fig. 1 Fluorescence image using tRNA with no amino acid added to OA and tRNA with fluorescent labeled amino acid added.
  • Fig. 10 B Fluorescence band of introduced protein when each mutant is used. Indicates strength. As shown in Figure 1 OA and Figure 10 B, Mycoplasma capricolumn-derived tRNA mutants have higher transduction activity than all tRNA mutants for E. coli tryptophan (G1-C72, A73 mutants). showed that. In particular, G1-C72 and A73, which produce almost no full-length protein when no fluorescently labeled amino acid is added, are optimal.
  • FIG. 11A and 11B show the sequences of 31 tRNA mutants in which mutations of tryptophan tRNAs G1-C72 and A73 derived from various organisms were introduced and the anticodon was replaced with CUA. Number 1-31).
  • Fig. 1 1 A and Fig. 1 1 B U is expressed as T.
  • SEQ ID NOs: 1 to 31 the effect of the present invention can be obtained even if the 73rd base is a force G that is A (G1-C72, G73).
  • Figures 12A and 12B show the results of introduction of fluorescently labeled amino acids to UAG by tryptophan tRNA (G1-C72, A73) mutants derived from various organisms.
  • Fig. 13 Results of fluorescence imaging when using tRNA with no amino acid added to 3A and tRNA with added fluorescently labeled amino acid
  • Fig. 13B shows fluorescence bands of introduced protein when each mutant is used Indicates strength.
  • 8 types of tryptophan tRNA including Mycoplasma 'capricolumn showed high introduction activity.
  • Mycoplasma capricolum from t RNA mutant full-length protein does not generate almost when not adding the fluorescent-labeled amino acid (GL- C72, A73 mutant) is most suitable.
  • BODIPY FL-aminophenyl alanine-tRNA having ACCC in anticodon
  • BODIPY 558 / 568_aminophenylalanine_tRNA having CCCG in anticodon
  • a fluorescently labeled amino acid was double introduced by the method described in Example 2.
  • electricity was used.
  • fluorescence detection of the electrophoresis gel was performed by 532 nm excitation / 605 nm detection.
  • Fig. 14 A shows an overview of the double introduction method of fluorescently labeled amino acids into maltose binding protein (MBP) by the 4-base codon method
  • Fig. 14 B shows maltose-binding protein (MBP) by the 4-base codon method.
  • tRNA having ACCC also introduced fluorescently labeled amino acid to a gene not having GGGU. That is, in this gene, the fluorescent surface amino acids are 4-base codons Since it was introduced into sites other than GGGU, we tried to use a termination codon UAG instead of a 4-base codon.
  • the mRNA sequence of a maltose binding protein having CGGG at the N-terminal part and GGGU at the C-terminal part is shown below (SEQ ID NO: 34). It shows from the start codon to the original end codon. The underlined part shows the inserted codon.
  • B0DIPY 558 / 568-aminophenylalanine-tRNA (having CCCG in anticodon) was prepared by the method described in Example 1 using tRNA for yeast phenylalanin.
  • FL-aminophenyl alanine-tRNA (having CUA in the anticodon) was prepared. Subsequently, maltose-binding protein mRNA (CGGG at the N-terminal part and UAG at the C-terminal part) The fluorescently labeled amino acid was double introduced by the method described in Example 2. However, the fluorescence detection of the electrophoresis gel was performed by 532 nm excitation / 605 nm detection in addition to 488 nm excitation / 520 nm detection.
  • Fig. 15 B shows the outline of the double introduction method of fluorescently labeled amino acids into maltose binding protein (MBP) by the 4-base codon method and the stop codon method using the tRNA mutant of the present invention.
  • 15 5 Mycoplasma capricolumn-derived tRNA showing the results of double introduction of fluorescently labeled amino acids into maltose binding protein (MBP) by the 4-base codon method and the termination codon method using the tRNA mutant of the present invention
  • the mutant (G1-C72, A73 mutant) was able to introduce a fluorescently labeled amino acid only to the gene with UAG.
  • the introduction efficiency was similar to that of the 4-base codon GGGU. From this, it was found that the combination of CGGG and UAG is also good for introducing two types of fluorescently labeled amino acids.
  • the mRNA sequence of a maltose binding protein having CGGG at the N-terminal portion and UAG at the C-terminal portion is shown below (SEQ ID NO: 35). It shows from the start codon to the original end codon. The underlined part shows the inserted codon.
  • TAMRA-X-aminopheny la lanine-tRNA was prepared by the method described in Example 1 using a Mycoplasma capricolumn-derived tRNA mutant (Gl-C72, A73 mutant). Subsequently, a TAMRA-labeled amino acid was introduced by the method described in Example 2 using streptavidin mRNA (SA2UAG) in which the second site was substituted with UAG. However, the fluorescence of the electrophoresis gel was detected by 532 nm excitation / 605 nm detection.
  • SA2UAG streptavidin mRNA
  • FIG. 16A shows the chemical structure of fluorescently labeled amino acid (TAMRAXAF) with TAMRA.
  • TAMRAXAF fluorescently labeled amino acid
  • Fig. 1 6 A “5, 6” indicates that it is a mixture of those bonded at positions 5 and 6.
  • Figure 16B shows the results of fluorescence imaging using tRNA with fluorescently labeled amino acid added.
  • Fig. 16 C shows the fluorescence band intensity of the introduced protein. As shown in FIG. 16B and FIG.
  • the Mycoplasma capriculum-derived tRNA mutant (G1-C72, A73 mutant) is the same as the fluorescently labeled amino acid having BODIPY FL described in Example 4.
  • fluorescently labeled amino acids with TAMRA could be introduced efficiently.
  • the transduction activity was higher than that of the 4-base codon CGGG, compared to the case where the anticodon was introduced with tRNA for yeast phenylalanine having 4-base CCCG.
  • the mRNA sequence of streptavidin in which the second site is substituted with UAG is shown below (SEQ ID NO: 36). It shows from the start codon to the original end codon. The underlined portion indicates the UAG that was introduced.
  • the mRNA sequence of streptavidin in which the second site is substituted with CGGG is shown below (SEQ ID NO: 37). Shown from start to end. The underlined part shows the introduced CGGG.
  • Example 8 Introduction of non-natural amino acid by a tRNA mutant in which one base was inserted immediately before the CCA sequence at the 3 ′ end
  • Mycoplasma 'capricolumn-derived tryptophan tRNA mutant Mycoplasma capricolumn-derived tryptophan tRNA (G1-C72, A73) mutant, A, G, U immediately before the 3'-terminal CCA sequence
  • a product in which any one of the above was inserted was prepared by the method described in Example 1.
  • such a mutant tRNA is sometimes referred to as a 1-base extended tRNA, for example, a tRNA for tryptophan derived from Mycoplasma capriculum (G1-C72, A73), which has a CCA sequence at the 3 ′ end.
  • FIG. 17 shows the structure of the tRNA variant used (SEQ ID NOs: 1 and 3 8).
  • Figure 18 shows the results of introducing BFLAF into SA83UAG using single base extension MycW.
  • Figure 18 shows fluorescence imaging results using tRNA with a fluorescently labeled amino acid in Figure A.
  • Figure 18 shows each mutant in B. The fluorescence band intensity of the introduced protein when using is shown.
  • the 3 'end The tRNA with any one of A, C, G, and U inserted immediately before the CCA sequence showed the same high transduction activity as the original tRNA.
  • This result also shows that the tRNA for tributophan derived from Mycoplasma capricolumn (Gl-C72, A73) can efficiently introduce phosphorylated tyrosine in addition to fluorescently labeled amino acids.
  • tRNA was prepared by the method described in Example 1 using phosphorylated tyrosine instead of fluorescently labeled amino acids. Subsequently, introduction of phosphorylated tyrosin was evaluated by the method described in Example 2. However, fluorescence imaging was not performed, and only Western blotting with an anti-phosphorylated thycin antibody or anti-T7tag antibody was performed.
  • Figure 19 shows the result of introduction of phosphorylated tyrosine (pTyr) into SA2UAG by single base extension MycW.
  • Figure 19 9A shows streptavidin mRNA and phosphorylated tyrosine with the second site replaced by UAG. As a result of the Western plot when tRNA added with is used, Fig.
  • FIG. 19B shows the band intensity of the Western blot of the introduced protein.
  • tRNA with any one of A, C, G, U inserted just before the 3 'CCA sequence is as high as the original tRNA. showed that.
  • FIG. 20B shows the band intensity of the Western blot of the introduced protein.
  • tRNA with any one of A, C, G, U inserted just before the CCA sequence at the 3 'end shows higher introduction activity than the original tRNA, In particular, one inserted C is more efficient.
  • Figure 22 Results of fluorescence imaging using tRNA with fluorescently labeled amino acid added to 2A.
  • Figure 22.B shows the fluorescence band intensity of the introduced protein when each mutant is used. 3 'end as shown in Figure 2 2 A and Figure 2 2 B Some tRNAs with one base inserted just before the CCA sequence at the end and tRNAs with one base deleted just before the CCA sequence showed the same introduction activity as the original tRNA.
  • Fig. 23 Results of fluorescence imaging using tRNA with fluorescently labeled amino acid added to 3A.
  • Fig. 23B shows the fluorescence band intensity of the introduced protein when each mutant is used. As shown in FIGS. 23A and 23B, some tRNAs with a single base inserted just before the 3'-terminal CCA sequence showed higher introduction activity than the original tRNA.
  • the mRNA sequence of streptavidin having a T7tag sequence at the N-terminus and CGGG introduced immediately thereafter is shown below (SEQ ID NO: 41).
  • the start codon to the stop codon are shown.
  • the underlined portion indicates the inserted CGGG codon.
  • tRNAs that can efficiently introduce unnatural amino acids into proteins using the terminating codon UAG and by modifying them, it is possible to efficiently modify unnatural amino acids.
  • This tRNA can be used to synthesize fluorescently labeled proteins into which fluorescently labeled unnatural amino acids have been introduced (W02004 / 009709 A1), and to become donors and acceptors of fluorescence resonance energy transfer at specific sites of proteins.
  • fluorescently labeled non-natural amino acids it is possible to detect the interaction between the protein and other molecules more efficiently.
  • the amino acid to be introduced is not limited to the fluorescence-labeled unnatural amino acid, and any amino acid or amino acid analog such as hydroxy acid that is introduced into a protein can be applied.
  • tRNA exhibits translational activity in different species, this tRNA can be used not only in E. coli cell-free translation systems, but also for cell-free translation systems derived from any organism species or in-cell translation. Can be used.

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Abstract

アンチコドンにCUA又はCCCGを持ち非天然アミノ酸でアミノアシル化されたtRNAであって、終結因子と競合することなく、非天然アミノ酸を高効率でタンパク質に導入することができるtRNAの提供を目的とする、5'末端がGであり、該5'末端のGに対合する塩基がCであり、該Cの3'側に隣接する塩基がAであるトリプトファン用tRNA変異体であって、アンチコドンとしてCUAを有し終止コドンに対合するtRNA変異体または3'末端のCCA配列の直前に１個の塩基が挿入された、アンチコドンとしてCUAまたはCCCGを有し終止コドンまたは４塩基コドンに対合するtRNA変異体。

Description

非天然アミノ酸をタンパク質に導入するための tRNA変異体
技術分野
本発明は、 標識ァミノ酸等の非天然ァミノ酸をタンパク質に導入するための tRNAに関する。 明
背景技術
機能性基を蛋白質表面に導入する場合、 一般に用いられるのが蛋白質の特定残 書
基への化学修飾である。 この化学修飾は簡単であり、 一度に多数の特定の残基を 修飾できるというメ リッ 卜がある反面、 修飾部位および または修飾数の制御の 再現性という点では優れた結果が得られ難いという課題もある。 近年の遺伝子ェ 学の発展により、 蛋白質中のアミノ酸残基の置換が可能となり、 蛋白質合成某を 改変することで、 ァミノ骨格を有する所望の非天然型アミノ酸を蛋白質中に導入 することが可能となり、 機能性基を担持する蛋白質を再現性よく合成することが 可能となった。
蛋白質合成においてアミノ酸はまず tRNAの 3 ' 末端に結合し、 次に蛋白質合成 の場であるリボソームへ運ばれる。 リボソームではコ ドンからアミノ酸への翻訳 が行われる。非天然型アミノ酸を結合させた tRNAを用いることによって非夫然型 アミノ酸を蛋白質に組み込むことができる。
非天然アミノ酸をタンパク質へ導入する方法として、 導入したい部位のコ ドン を終止コ ドン UAGに置換しておき、 アンチコ ドンに CUAを持ち非天然アミノ酸で アミノアシル化された tRNA存在下で翻訳する方法がある（非特許文献 1から 4参 照）。 これら方法において、 tRNA として酵母フエ二ルァラニン用 tRNA (非特許文 献 1および 2参照）、 大腸菌ァスパラギン用 tRNA、 デトラヒメナグルタミン用 t RNA (非特許文献 3参照）、 大腸菌グリシン用 tRNA (非特許文献 4参照） などが用 いられていた。
しかし、 アンチコ ドンに CUA を持ち非天然アミノ酸でアミノアシル化された tRNAは、 UAGを翻訳する際に終結因子と競合するため、 非天然ァ
効率は高くなかった。
非特許文献 1 Sc i ence, 244， p. 182. 1989
非特許文献 2 Nucl e ic Ac ids Res.， 18， 83-88, 1989
非特許文献 3 Chem. Biol .， 3， 1033-1038, 1996
非特許文献 4 J. Am. Chem. Soc. , 1 11, p. 8013, 1989 発明の開示
本発明は、 アンチコ ドンに CUAを持ち非天然アミノ酸でアミノアシル化された tRNAであって、 終結因子と競合することなく、 非天然アミノ酸を高効率でタンパ ク質に導入することができる tRNAの提供を目的とする。
本発明者は、 終止コ ドン UAGを用いて非天然アミノ酸をタンパク質に効率良く 導入するこどのできる tRNAを種々の生物種由来の tRNAの中から探索し、 Trp用 の tRNAであってアンチコ ドンに CUAを持つものが効率良く導入できることを見い 出した。 また、 それを改変して、 Trp用の tRNAであってアンチコドンに CUAを持 ち、 5 ' に Gを持ち、 その 5 ' の Gに対合する塩基 （通常は 72番と定義される） が Cでその次の塩基が Aであるものが、 より効率良く導入でき、 かつ、 アミノア シル tRNA合成酵素による天然アミノ酸の付加を受けないことを見い出した。さら にこれらの tRNA の う ち、 GGGAGAGUAG UUCAAUGGUA GAACGUCGGU CUCUAAAACC GAGCGUUGAG GGUUCGAUUC CUUUCUCUCC CACCA (配列番号 1 ) の配列を有するマイコ プラズマ 'カプリコラム （Mycopl asma capr icolum) Trp tRNA (G1-C72, A73変異体） が最も適していることを見い出した。 これらに加えて、 tRNAの 3 ' 末端の CCA配 列の直前に 1個の塩基を挿入することによって、 非天然アミノ酸の導入効率を向 上させることができることを見い出した。本発明は、以上の tRNAを用いることで 終結因子との競合する場合でも非天然ァミノ酸を効率良く導入することができる よう、 上記課題を解決したものである。
すなわち、 本発明の以下のとおりである。
[ 1 ] トリブトファン用 tRNA変異体であって、アンチコ ドンとして CUAを有し終 止コ ドンに対合する tRNA変異体。 [2] 5' 末端が Gであり、 該 5' 末端の Gに対合する塩基が Cであり、 該 Cの 3' 側に隣接する塩基が Aである [ 1 ]の終止コ ドンに対合する tRNA変異体。
[3] 5' 末端の Gに対合する Cの位置が 5' 末端から 72番目であり、 該 Cの 3' 側に隣接する Aの位置が 5'末端から 73番目である [2]の終止コ ドンに対合する tRNA変異体。
[4] 原核細胞由来の tRNA である [ 1 ]〜[3]のいずれかの終止コ ドンに対合す る tRNA変異体。
[5] 大腸菌またはマイコプラズマ .カプリコラム (Mycoplasma capricolum) 由 来の tRNAである [4]の終止コ ドンに対合する tRNA変異体。
[6] 配列番号 1で表される塩基配列からなるマイコプラズマ ·カプリコラム (Mycoplasma capricolum) 由来の tRNA変異体であって、 終止コ ドンに対合する tRNA変異体。
[7] 3' 末端の CCA配列の直前に A、 Gまたは Uのいずれかの 1個の塩基が揷 入された [ 1 ]〜[6 ]のいずれかの終止コ ドンに対合する tRNA変異体。
[8] 5' 末端の Gに対合する Cの位置が 5' 末端から 72番目であり、 該 Cの 3' 側に隣接する Aの位置が 5' 末端から 73番目であり、 さらに 5'末端から 74番目 に A、 Gまたは Uのいずれかの 1個の塩基が挿入された [7]の終止コ ドンに対 合する tRNA変異体。
[9] アミノ酸でアミノアシル化された [ 1 ]〜[8 ]のいずれかの終止コ ドンに対 合する tRNA変異体。
[1 0] アミノ酸が非天然アミノ酸またはその誘導体である、 [9]の終止コ ドン に対合する tRNA変異体。
[1 1 ] アミノ酸の誘導体がヒ ドロキシ酸、 メルカプト酸およびカルボン酸から なる群から選択される [1 0]の終止コ ドンに対合する tRNA変異体。
[1 2] アミノ酸が蛍光標識されたものである [9 ]〜[ 1 1 ]のいずれかの終止コ ドンに対合する tRNA変異体。
[1 3] タンパク質に所望のアミノ酸を導入する方法であって、 アミノ酸を導入 しょうとするタンパク質の mRNA であって導入しようとするアミノ酸の導入位置 に対応するコ ドンが終止コ ド: /である mRNA および [1]〜[1 2]のいずれかの終 止コ ドンに対合する tRNA変異体を用い、 終止コ ドンに該 tRNA変異体を割り当て ることによりタンパク質にアミノ酸を導入する方法。
[1 4] アンチコ ドンとして 4塩基からなる配列を有し、 4塩基コ ドンに対合す る tRNA変異体であって、 3' 末端の CCA配列の直前に A、 G、 Cまたは Uのいずれ かの 1個の塩基が挿入された 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体。
[1 5] アンチコ ドンとして CCCGを有し、 4塩基コ ドン CGGGに対合する [1 4] の 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体。
[1 6] フエ二ルァラニン用 tRNA 変異体である [1 4]または[1 5]の 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体。
[ 1 7] 酵母由来の tRNA である [1 4；]〜 [1 6]のいずれかの 4塩基コ ドンに対 合する tRNA変異体。
[1 8] 配列番号 4 0で表される塩基配列からなる酵母由来の tRNA 変異体であ つて、 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体。
[1 9] アミノ酸でアミノアシル化された [1 4]〜[1 8]のいずれかの 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体。
[20] アミノ酸が非天然アミノ酸、 修飾化アミノ酸またはそれらの誘導体であ る、 [ 1 9]の 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体。
[2 1 ] アミノ酸の誘導体がヒ ドロキシ酸、 メルカプト酸およびカルボン酸から なる群から選択される [20]の 4塩基コドンに対合する tRNA変異体。
[22] アミノ酸が蛍光標識されたものである [ 1 9]〜[2 1 ]のいずれかの 4塩 基コ ドンに対合する tRNA変異体。
[23] タンパク質に所望のアミノ酸を導入する方法であって、 アミノ酸を導入 しょうとするタンパク質の mRNA であって導入しようとするアミノ酸の導入位置 に対応するコ ドンが 4塩基コ ドンである mRNA および [1 4]〜[22]のいずれか の 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体を用い、 4塩基コ ドンに該 tRNA変異体を 割り当てることによりタンパク質にァミノ酸を導入する方法。
[24] 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した 蛍光標識ァミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識ァ ミノ酸を含むタンパク質であって、 該タンパク質と結合し得る分子と結合したと きに立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質の 距離および配向が変化するような位置に 2種類の蛍光標識ァミノ酸が存在し蛍光 共鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質の製造方法であって、
1つの 4塩基コ ドンおよび 1つの終止コ ドンが挿入されたタンパク質の mRNA を調製する工程であって、 4塩基コ ドンおよび終止コ ドンを挿入する位置が前記 タンパク質が他の分子と相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変 化するように距離および配向が変化し得るタンパク質上の位置に対応する mRNA の位置である工程、
蛍光共鳴エネルギー移動を起こし得る 2種類の蛍光物質でそれぞれ標識した 2 種類のァミノ酸であって、前記 4塩基コ ドンに対するアンチコ ドンを有する tRNA が結合したアミノ酸および [1 ]〜[ 1 2]のいずれかの tRNA 変異体が結合したァ ミノ酸を調製する工程、 ならびに
前記 mRNAおよびアミノ酸結合 tRNAを用いてタンパク質を合成する工程とを含 む製造方法。
[25] 4塩基コ ドンに対するアンチコ ドンを有する tRNA が [1 4；！〜 [22]の . いずれかの 4塩基コ ドンに対合する tRNA 変異体である [24]のタンパク質の製 造方法。
[26] 無細胞翻訳系でタンパク質を合成する [1 3]の方法。
[27] 無細胞翻訳系でタンパク質を合成する [23]の方法。
[28] 無細胞翻訳系でタンパク質を合成する [24]の方法。
[29] 無細胞翻訳系でタンパク質を合成する [25]の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-329115号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 蛍光標識ァミノ酸- tRNAの作製方法の概要を示す図である。
図 2は、 蛍光標識アミノ酸の導入評価方法の概要を示す図である。
図 3Aは、 大腸菌由来 tRNAの構造を示した図である。
図 3Bは、 大腸菌由来 tRNAの構造を示した図である。 · 図 3 Cは、 大腸菌由来 tRNAの構造を示した図である。
図 3 Dは、 大腸菌由来 tRNAの構造を示した図である。
図 3 Eは、 大腸菌由来 tRNAの構造を示した図である。
図 3 Fは、 大腸菌由来 tRNAの構造を示した図である。
図 3 Gは、 大腸菌由来 tRNAの構造を示した図である。
図 3 Hは、 大腸菌由来 tRNAの構造を示した図である。
図 4は、 蛍光標識アミノ酸を付加した tRNAを加えた場合の SDS-PAGEの蛍光ィ メージであり、大腸菌由来 tRNA変異体による UAGに対する蛍光標識アミノ酸の導 入の結果を示す写真である。
図 5は、 大腸菌由来トリブトフアン用 tRNA変異体の構造を示す図である。 図 6 Aは、大腸菌由来トリブトファン用 tRM変異体による UAGに対する蛍光標 識アミノ酸の導入の結果を示し、アミノ酸を付加していない tRNAを用いた場合の SDS-PAGEの蛍光ィメージングの結果を示す写真である。
図 6 Bは、大腸菌由来トリブトファン用 tRNA変異体による UAGに対する蛍光標 識アミノ酸の導入の結果を示し、蛍光標識アミノ酸を付加した tRNAを用いた場合 のウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
図 6 Cは、大腸菌由来トリブトファン用 tRNA変異体による UAGに対する蛍光標 識ァミノ酸の導入の結果を示し、 各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光 バンド強度を示す図である。
図 7 Aは、 マイコアラズマ •カプリコラム由来 tRNAの構造を示した図である。 図 7 Bは、 マイコプラズマ •カプリ ラム由来 tRNAの構造を示した図である。 図 7 Cは、 マイコフラズマ •カプリ ラム由来 tRNAの構造を示した図である。 図 7 Dは、 マイコプラズマ •カプリコラム由来 tRNAの構造を示した図である。 図 7 Eは、 マイコプラズマ •カプリ ラム由来 tRNAの構造を示した図である。 図 7 Fは、 マイコプラズマ 'カプリ aラム由来 tRNAの構造を示した図である。 図 7 Gは、 マイコプラズマ •カプリ ラム由来 tRNAの構造を示した図である。 図 7 Hは、 マイコプラズマ ，カプリ ラム由来 tRNAの構造を示した図である。 図 8は、マイコプラズマ 'カプリコラム由来 tRNA変異体による UAGに対する蛍 光標識アミノ酸の導入の結果を示す写真である。 図 9は、マイコプラズマ 'カプリコラム由来トリプトファン用 tRNA変異体の構 造を示す図である。
図 1 O Aは、 マイコプラズマ ·カプリコラム由来トリプトファン用 tRNA変異体 による UAGに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す図であり、 アミノ酸を 付加していない tRNAおよび蛍光標識ァミノ酸を付加した tRNAを用いた場合の蛍 光ィメ一ジングの結果を示す写真である。 図 1 O A中、 BFLAFは、 蛍光標識ァミノ 酸を付加した tRNAを示し、 no AAは、 アミノ酸を付加していない tRNAを示す。 図 1 0 Bは、 マイコプラズマ 'カプリコラム由来トリプトファン用 tRNA変異体 による UAGに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す図であり、 各変異体を 用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す図である。
図 1 1 Aは、種々の生物体由来のトリプトファン用 tRNA (Gl-C72， A73)変異体の 構造を示す図である。
図 1 1 Bは、種々の生物体由来のトリプトファン用 tRNA (Gl- C72, A73)変異体の 構造を示す図である。
図 1 2 Aは、種々の生物体由来のトリプトファン用 tRNA (Gl- C72, A73)変異体に よる UAGに対する蛍光標識ァミノ酸の導入の結果を示す写真である。
図 1 2 Bは、種々の生物体由来のトリプトファン用 tRNA (G1-C72, A73)変異体に よる UAGに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す写真である。
図 1 3 Aは、種々の生物体由来のトリプトファン用 tRNA (Gl- C72， A73) ^異体に よる UAGに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す図であり、 アミノ酸を付 加していない tRNAおよび蛍光標識アミノ酸を付加した tRNAを用いた場合の蛍光 イメージングの結果を示す写真である。 図 1 3 A中、 BFLAFは、 蛍光標識アミノ酸 を付加した tRNAを示し、 no AAは、 アミノ酸を付加していない tRNAを示す。 図 1 3 Bは、種々の生物体由来のトリプトファン用 tRNA (Gl- C72, A73)変異体に よる UAGに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す図であり、 各変異体を用 いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す図である。
図 1 4 Aは、 4塩基コ ドン法によるマルト一ス結合タンパク質 （MBP) への蛍光 標識ァミノ酸の二重導入方法の概要を示す図である。
図 1 4 Bは、 4塩基コ ドン法によるマルトース結合タンパク質 （MBP) への蛍光 標識アミノ酸の二重導入の結果を示す写真である。
図 1 5 Aは、 4塩基コ ドン法おょぴ本発明の tRNA変異体を用いた終止コ ドン法 によるマルト一ス結合タンパク質（MBP)への蛍光標識ァミノ酸の二重導入方法の 概要を示す図である。 本法において、 UAG 以外の部位に蛍光標識アミノ酸を導入 することはなレ、。
図 1 5 Bは、 4塩基コ ドン法おょぴ本発明の tRNA変異体を用いた終止コ ドン法 によるマルトース結合タンパク質（MBP)への蛍光標識ァミノ酸の二重導入の結果 を示す写真である。
図 1 6 Aは、 TAMRAを有する蛍光標識アミノ酸の化学構造を示す図である。 図 1 6 Bは、 マイコプラズマ 'カプリコラム由来トリプトファン用 tRNA変異体 による UAGに対する TAMRAを有する蛍光標識アミノ酸の導入と、 酵母由来フエ二 ルァラニン用 tRNA変異体による CGGGに対する TAMRAを有する蛍光標識アミノ酸 の導入の結果を示す写真であり、蛍光標識ァミノ酸を付加した tRNAを用いた場合 の蛍光イメージングの結果を示す写真である。
図 1 6 Cは、 マイコプラズマ 'カプリコラム由来トリプトファン用 tRNA変異体 による UAGに対する TAMRAを有する蛍光標識アミノ酸の導入と、 酵母由来フヱニ ルァラニン用 tRNA変異体による CGGGに対する TAMRAを有する蛍光標識アミノ酸 の導入の結果を示す図であり、導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す図である。 図 1 7は、マイコプラズマ 'カプリコラム由来トリプトファン用 tRNA変異体で、 3 ' 末端の CCA配列の直前に 1個の塩基を挿入したものの構造を示す図である。 図 1 8 Aは、 マイコプラズマ ·カプリコラム由来トリブトファン用 tRNA変異体 で、 3 ' 末端の CCA配列の直前に 1個の塩基を挿入したものによる UAGに対する蛍 光標識ァミノ酸の導入の結果を示す写真であり、 蛍光標識ァミノ酸を付加した tRNAを用いた場合の蛍光イメージングの結果を示す写真である。
図 1 8 Bは、 マイコプラズマ 'カプリコラム由来トリプトファン用 tRNA変異体 で、 3 ' 末端の CCA配列の直前に 1個の塩基を挿入したものによる UAGに対する蛍 光標識アミノ酸の導入の結果を示す図であり、 各変異体を用いた場合の導入タン パク質の蛍光バンド強度を示す図である。
図 1 9 Aは、 マイコプラズマ 'カプリコラム由来トリプトファン用 tRNA変異体 で、 3 ' 末端の CCA配列の直前に 1個の塩基を挿入したものによる、 2番目の部位 を UAGに置換したストレプトアビジンの mRNAを用いた場合のリン酸化チロシンの 導入の結果を示す写真であり、図 1 9 Aはリン酸化チロシンを付加した tRNAを用 いた場合の抗リン酸化チロシン抗体によるウェスタンプロッ 卜の結果を示す写真 である。
図 1 9 Bは、 マイコプラズマ 'カプリコラム由来トリプトファン用 tRNA変異体 で、 3 ' 末端の CCA配列の直前に 1個の塩基を挿入したものによる、 2番目の部位 を UAGに置換したストレプトアビジンの mRNAを用いた場合のリン酸化チロシンの 導入の結果を示す図であり、 各変異体を用いた場合の導入タンパク質のウェスタ ンブロットのバンド強度を示す図である。
図 2 O Aは、 マイコプラズマ 'カプリコラム由来トリプトファン用 tRNA変異体 で、 3， 末端の CCA配列の直前に 1個の塩基を挿入したものによる、 N末端に T7tag を持ち 83番目の部位を UAGに置換したストレプトアビジンの mRNAを用いた場合 の、 リン酸化チロシンの導入の結果を示す写真であり、 リン酸化チロシンを付加 した tRNAを用いた場合の抗 T7tag抗体によるウェスタンブロッ トの結果を示す写 真である。
図 2 0 Bは、 マイコプラズマ ·カプリコラム由来トリプトファン用 tRNA変異体 で、 3 ' 末端の CCA配列の直前に 1個の塩基を挿入したものによる、 N末端に T7 tag を持ち 83番目の部位を UAGに置換したストレプトアビジンの mRNAを用いた場合 の、 リン酸化チロシンの導入の結果を示す図であり、 各変異体を用いた場合の導 入タンパク質のウェスタンプロッ トのバンド強度を示す図である。
図 2 1は、酵母由来フエ二ルァラニン用 tRNA変異体で、 アンチコ ドンに 4塩基 CCCGを持ち、 3， 末端の CCA配列の直前に 1個の塩基を挿入したもの（73. 1 A、73. 1 C、 73. 1G、 73. 1U) の構造を示す図である。
図 2 2 Aは、 酵母由来フエ二ルァラニン用 tRNA変異体で 3 ' 末端の CCA配列の 直前に 1個の塩基を挿入したものにより、ス トレプトアビジンの 83番目に導入し た 4塩基コ ドン CGGGに対して蛍光標識アミノ酸を導入した結果を示す写真であり、 蛍光標識アミノ酸を付加した tRNA を用いた場合の蛍光イメージングの結果を示 す写真である。 図 2 2 Bは、 酵母由来フエ二ルァラニン用 tRNA変異体で 3 ' 末端の CCA配列の 直前に 1個の塩基を挿入したものにより、ス トレプトアビジンの 83番目に導入し た 4塩基コ ドン CGGGに対して蛍光標識アミノ酸を導入した結果を示す図であり、 各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す図である。
図 2 3 Aは、 酵母由来フエ二ルァラニン用 tRNA変異体で 3 ' 末端の CCA配列の 直前に 1個の塩基を挿入したものにより、 N末端に T7tag配列を持ちその直後に CGGGを導入したストレプトァビジンの mRNAを用いた場合の、 TAMRAを有する蛍光 標識ァミノ酸を導入した結果を示す写真であり、 蛍光標識ァミノ酸を付加した tRNAを用いた場合の蛍光イメージングの結果を示す写真である。
図 2 3 Bは、 酵母由来フエ二ルァラニン用 tRNA変異体で 3 ' 末端の CCA配列の 直前に 1個の塩基を挿入したものにより、 N末端に T7tag配列を持ちその直後に CGGGを導入したストレプトァビジンの mRNAを用いた場合の、 TAMRAを有する蛍光 標識ァミノ酸を導入した結果を示す図であり、 各変異体を用いた場合の導入タン パク質の蛍光バンド強度を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の tRNAは、 トリプトファン用 tRNAであって、 アンチコ ドンとして CUA を有し終止コ ドンに対合する tRNA変異体である。 該 tRNA変異体は、 微生物由来 のトリプトフアンに対応した tRNAのアンチコ ドンを CUAに改変することにより得 ることができる。 微生物と しては、 大腸菌、 マイコプラズマ ' カプリコラム
(Mycoplasma capricolum)、 ノヽンノレス · /ヽロ 卜 フンス (Baci l lus halodourannsリ、 バシノレス · サブチリ ス （Baci l lus subt i l l i s)、 ボレ リ ア ' バーグ ドルフェ リ
(Borrel i a burgdorferiノ、マイ コフ フズマ · 7'ニ夕リ クム (Mycoplasma gen i tal iumノ マイコプラズマ ·プネゥモニァ (Mycopl asma pneumoniae)およびスタフィロコッカ ス ·ァウレウス N315 (Staphylococcus aureus N315)が好ましい。 天然に見出され る大 fl昜菌またはマイコプラズマ 'カプリコラム（Mycoplasma capricolum)のトリプ トファンに対応した tRNAの構造をそれぞれ図 3 A〜図 3 Hおよび図 7 A〜図 7 Hに 示す。 この中でも大腸菌またはマイコプラズマ 'カプリコラム由来 tRNA変異体が 好ましく、 特にマイコプラズマ 'カプリコラム由来 tRNA変異体が好ましい。 公知 のアンチコ ドンとして CUAを有する tRNAを用いた場合に、終結因子と競合が生じ 導入効率が悪くなるのに対して、上記本発明の tRNAに標識ァミノ酸等の非天然ァ ミノ酸を結合させて、 タンパク質に導入する場合は、 競合することなく効率的に 非天然アミノ酸をタンパク質に導入することができる。
さらに、 本発明の tRNAは、 上記トリプトファン用 tRNAであって、 アンチコ ド ンとして CUAを有し終止コ ドンに対合する tRNA変異体をさらに変異させた変異体 を含む。 該変異体は、 tRNAの塩基配列の 5' 末端の塩基を Gに置換し、 tRNAがク ローバー葉構造をとった場合に、前記 5'末端の Gに対合する塩基を Cに置換し、 該 Cの 3' 側に隣接する塩基を Aに置換した変異体である。 通常、 前記 5' 末端の Gに対合する塩基は 5' 末端から 72番目の塩基である。 すなわち、 本発明の tRNA 変異体は、 典型的には 72番目の塩基を Cに置換し、 73番目の塩基を Aまたは G に置換したものである。このうち 73番目の塩基を Aに置換したものが特に好まし レ、。 本発明において、 5' 末端の塩基を Gに置換し、 72番目の塩基を Cに置換し、 73番目の塩基を Aまたは Gに置換した tRNA変異体をそれぞれ、 G1-C72, A73また は G1 - C72, G73 と表現する。 このような tRNA変異体に標識ァミノ酸等の非天然ァ ミノ酸を結合させて、 タンパク質に導入する場合、 さらに非天然アミノ酸の導入 効率が高くなり、 さらに、 G1-C72, A73の場合は、 tRNAに天然ァミノ酸が付加する ことなく さらに非天然ァミノ酸の導入効率が高くなる。
例えば、 本発明の tRNA として、 マイコプラズマ ' カプリコラム（Mycoplasma capricolum 、大 |]悬 ¾ (E. col i)、 ノヽンノレス ·ノヽ 口 ドフンス (Baci llus halodouranns)、 バシノレス ' サブチリス （Bacillus subtillis) , ボレ ！ ァ ' バーグドノレフエ リ
(Borrel ia burgdorferi;、マイコ ~7 ~7スマ *ヮ リ ゥム (Mycoplasma genital ium) マイコプラズマ ·プネゥ七ニァ 1 (Mycoplasma pneumoniae 1)、 マイコプラズマ · プネゥモニァ 2 (Mycoplasma pneumoniae 2)およびスタフイロコッカス · ァウレゥ ス N315 (Staphylococcus aureus N315)由来のトリプトファン用 tRNAであって、 アンチコ ドンとして CUAを有し終止コ ドンに対合する tRNA変異体であって、 5， 末端が Gであり、 5' 末端の Gに対合する Cの位置が 5'末端から 72番目であり、 該 Cの 3' 側に隣接する Aの位置が 5' 末端から 73番目である終止コ ドンに対合 する tRNA変異体が挙げられる。 それぞれの配列を配列番号 1、 2、 4、 5、 6、
1 8、 1 9、 2 0および 2 5に示す。 また、 大腸菌（E. coli)由来トリブトファン 用 tRNAの構造を図 5に示し、マイコプラズマ 'カプリコラム由来トリプトファン 用 tRNAの構造を図 9に示す。図 5および図 9において、 5'末端の塩基を Gに置換 し、 5'末端と対合する 72番目の塩基を Cに置換し、 さらに Cに置換した塩基の 3'側の塩基を置換することを示している。
以上に加えて、 本発明の tRNAは、 3 ' 末端の CCA配列の直前に A、 G、 Cまたは Uのいずれかの 1個の塩基を挿入した変異体を含む。上記の本発明の tRNAは、 3 ' 末端の CCA配列の直前すなわち通常 73番目には、 5 ' 末端の塩基とは対合しない 1個の塩基が存在する。 3 ' 末端の CCA配列の直前に A、 G、 Cまたは Uのいずれか の 1個の塩基を挿入した変異体は、 通常 72番目の塩基を Cに置換し、 通常 73番 目の塩基を Aまたは Gに置換し、 さらに 74番目の塩基として A、 G、 C又は Uのい ずれかを挿入したものを含む。 tRNAの種類によっては、 ループ部分ゃステム部分 などの塩基数が異なるため、 5'末端の塩基と対合する塩基が 72番目にならない場 合があり、すなわち上記の 5'末端から 72番目、 73番目及び 74番目の置換部位の 塩基番号が数個、 例えば、 1個、 2個、 3個、 4個または 5個ずれる場合がある。 tRNAが立体構造をとつた場合に、 5'末端および 5'末端の塩基に対合する塩基が置 換し、 その塩基の一つ 3'側の塩基が置換されており、 非天然アミノ酸の導入効率 が上昇している限り、 本発明の変異 tRNAに包含される。 言い換えれば、 本発明の 変異 tRNAは典型的な通常の tRNA、例えば大腸菌由来トリプトファン用 tRNAまた はマイコプラズマカプリコム由来トリプトファン用 tRNAの 5'末端から 72番目の 塩基に相当する塩基が置換され、 さらにその塩基の一つ 3'側の塩基、 すなわち大 腸菌由来ト リプトファン用 tRNA またはマイコプラズマカプリコム由来トリブト ファン用 tRNAの 5'末端から 73番目の塩基に相当する塩基が置換された変異 tRNA である。 ここで、 72番目の塩基に相当する塩基とは 5 ' 末端の塩基に対合する位 置にある塩基を意味し、 73番目の塩基に相当する塩基とは 72番目の塩基の一つ 3 ' 側の位置にある塩基を意味する。
本発明では、 CCA配列の直前に 1個の塩基を挿入した tRNA変異体を 73. 1A、73. 1C、
73, 1 Gまたは 73· 1U (A、 G、 Uはそれぞれ挿入した塩基の種類を示す） と表現 する。このような tRNA変異体に標識ァミノ酸等の非天然ァミノ酸を結合させてタ ンパク質に導入する場合、 非天然アミノ酸の導入効率が高くなる。 例えば、 本発明の tRNA変異体として、 マイコプラズマ ·カプリコラム由来のト リプトフアン用の tRNA変異体であって、 CCA配列の直前に 1個の塩基を挿入した tRNA変異体が挙げられる。
また、 本発明の変異 tRNAは、 4塩基コ ドン CGGGを用いて非天然アミノ酸を導 入するための 4塩基コ ドンに対合する変異 tRNAを含む。 例えば、 該変異 tRNAは アンチコ ドンに 4塩基 CCCGを有する、 酵母由来のフエ二ルァラニン用 tRNA変異 体であり、 3 ' 末端の CCA配列の直前に A、 C、 G又は Uのいずれかの 1個の塩基を 挿入した tRNA変異体である。
上記 tRNAの変異体は、 配列情報に基づいて合成することができる。 また、 上記 tRNAの変異体は上記微生物由来のトリプトファン用 tRNA等の tRNAに変異を導入 して作製することができる。 変異体の作成は、 公知の遺伝子工学の技法を用いて 行うことができる。
例えば、 遺伝子に変異を導入するには、 Kunkel法や Gapped duplex法などの公 知の手法又はこれに準ずる方法により、 例えば部位特異的突然変異誘発法を利用 しだ変異導入用キッ ト （例えば Mutant-K (TAKARA社製）や Mutant- G (TAKARA社製） など） を用いて、 あるレヽは、 TAKARA社の LA PCR in v itro Mutagenes is シリーズ キッ トを用いて行うことができる。
本発明はさらに、上記 tRNAをァミノ酸またはその類似体でァミノアシル化した アミノアシル tRNAを包含する。アミノアシル化に用いるアミノ酸またはその類似 体は限定されないが、 天然ァミノ酸もしくは非天然ァミノ酸またはそれらの誘導 体がある。 また、 リン酸化やメチル化、 ァセチル化などの翻訳後修飾によって生 じる修飾化アミノ酸も含まれる。
「非天然アミノ酸」 とは、 同一分子内にアミノ骨格を有する天然に存在しない 人工のあらゆる化合物を指し、 種々の標識化合物をアミノ酸骨格に結合させるこ とにより作製することができる。「アミノ酸骨格」はアミノ酸中のカルボキシル基、 アミノ基、 およびこれらを連結している部分を含有する。
非天然アミノ酸の一例として、 標識化合物と結合したアミノ酸である 「標識化 アミノ酸」 が挙げられる。 例えば、 側鎖にベンゼン環等の芳香環を含むアミノ酸 骨格を有するアミノ酸に標識化合物を結合させたアミノ酸がある。 また、 機能を 考慮した場合、光応答性ァミノ酸、光スィッチアミノ酸、蛍光プローブアミノ酸、 蛍光標識アミノ酸等がある。
また、 アミノ酸の誘導体としては、 ヒ ドロキシ酸、 メルカプト酸、 カルボン酸 等が挙げられる。
本発明において用いる標識化合物は、当業者には公知の色素化合物、蛍光物質、 化学/生物発光物質、 酵素基質、 補酵素、 抗原性物質およびタンパク質結合性物質 である。
蛍光標識化合物としては、 可視光域内 （400〜700nm 付近） に励起波長を有し、 さらに可視光域内に発光波長を有するものが好ましく、 水溶液中での発光強度が 強いものが特に好ましい。
ルシフエリン、 ソレミジヱン等の化学もしくは生物発光物質またはその誘導体も 標識化合物として本発明に用いることができる。
さらに、 補酵素類、 抗原性を有する物質および特定のタンパク質に結合するこ とが判つている物質などの中から、 対象とするタンパク質に付与した!/、機能に応 じて適宜選んで、それを標識化合物として本発明に用いることができる。例えば、 特定の酵素に対する基質 （例えば、 アルカリホスファターゼまたは ]3ガラク トシ ダーゼに対する基質等） を導入すれば、 その酵素による呈色反応を利用して検出 することができる。 また、 抗原性を有する物質、 特定のタンパク質に結合するこ とが判っている物質で標識されたタンパク質は、 抗体または結合するタンパク質 を用いた間接的検出法に用いることができる、 および、 精製が簡便であるという 利点を有している。 例えば、 本発明の方法を用いてピオチンで標識した機能性タ ンパク質は、 ピオチンを介してァビジンまたはス トレプトアビジンと結合すると いう機能を有しており、 この機能を利用すれば、 本発明の方法によりまたは化学 的に蛍光化合物等で標識したアビジンもしくはストレブトァビジンとの結合を利 用して特定の物質の検出系を確立することが可能である。 この他、 種々の色素、 ならびに、 さまざまな生化学的、 化学的、 免疫化学的な検出方法で検出可能な物 質を標識化合物に用いることができることが、 当業者には理解できる。
アミノ酸と標識化合物とはスぺーサーを介してまたは介さず連結することがで きる。 「スぺーサ一」 という用語は、 標識化アミノ酸分子におけるアミノ酸部と標 識化合物とを連結している部分を指す。 即ち、 標識化アミノ酸分子内のアミノ酸 側鎖と標識化合物が直接結合しているのではなく、 アミノ酸側鎖と標識化合物と の間に 1つ以上の原子が存在する場合、 該標識化アミノ酸のアミノ酸部と標識化 合物はスぺ一サーを介して連結しているという。 スぺーサ一は、 その主鎖部分に
C, 0、 Nおよび S のうちの少なく とも 1種を少なく とも 1つ以上含んでいればよ い。 またスぺ一サ一の主鎖構造は、 上記原子が 2〜10 個、 好ましくは 3〜8個、 さらに好ましくは 5、 6または 7個が直鎖状に結合したものが好ましく、 直鎖構 造内には、 二重結合が 1つ以上含まれていてもよい。 さらに、 スぺーサ一は、 ベ ンゼン環および/またはシク口へキシル環などの環状構造を 1〜数個、好ましくは 1〜 5個、 さらに好ましくは 1〜 3個、 有していてもよレ、。 また、 ベンゼン環や シクロへキシル環などの環状構造、 もしくは環状構造と上記直鎖構造とが組み合 わされた構造のものでもよい。 具体的には、 ポリエチレン、 ポリプロピレン、 ポ リイソプテン、 ポリスチレン、 ポリ ビュル、 ポリ塩化ビュルなどのポリオレフィ ン、 ポリオキシエチレン、 ポリエチレングリコール、 ポリ ビニルアルコールなど のポリエーテル、 ポリアミ ド、 ポリエステル、 ポリイ ミ ド、 ポリ ウレタン、 ポリ カーボネートなどが挙げられる。
標識化合物の種類によっては、 導入されたタンパク質内においてその機能をよ り効果的に発揮するために、 スぺーサーを介してアミノ酸と結合することが有利 なものもある。 例えば、 標識化合物の種類によっては、 スぺ一サーを介して結合 している方が、 導入されたタンパク質内での該標識化合物への立体障害が軽減さ れるということが考えられる。
さらに、 本発明の標識化アミノ酸は、 アミノ酸部の側鎖に芳香環を有し、 該芳 香環に、 スぺーサーを介してまたはスぺ一サーを介ざずに、 標識化合物が結合し ているものが好ましい。
本明細書で用いる 「芳香環」 とは、 一般的に、 あらゆる不飽和環状化合物を指 す。 したがって、 5もしくは 6員の複素芳香環、 または 2個以上、 好ましくは 2
〜5個、 さらに好ましくは 2〜 3個の環構造を含む多環性化合物も含む。 特に、 芳香環はベンゼン環であることが好ましい。 天然型アミノ酸のうち、 フエニルァ ラニン、 トリブトファンおよびチロシンはその側鎖に芳香環を含有する天然型芳 香族アミノ酸であり、 該芳香環に標識化合物が （スぺ一サーを介してまたはスぺ 一サーを介さずに） 結合したものは、 本発明の非天然アミノ酸の好ましい例とし て挙げることができる。
芳香環を有するアミノ酸と標識化合物の結合およびスぺーサーを介した芳香環 を有するアミノ酸と標識化合物との結合は、 適当な官能基どう しの結合を利用す ればよい。 タンパク質合成の際にペプチド伸長反応に関与しない、 天然型あるい は非天然型アミノ酸の、 アミノ基、 チオール基、 カルボキシル基、 水酸基、 アル デヒ ド基、 ァリル基、 ハロゲン化アルキル基など種々の官能基のいずれかに標識 化合物を、 スぺーサーを介して、 または介さずに結合する。 アミノ基標識用プロ ーブと してスクシンイ ミ ドエステル、 イソチオシァネート、 スルホニルクロライ ド、 NBD -ハライ ド、 ジクロロ トリアジンなどの化合物が、 チオール基標識用プロ ーブとしてアルキルハラィ ド、 マレイミ ド、 アジリジンなどの化合物が、 カルボ キシル基標識用プローブとしてジァゾメタン化合物、 脂肪族臭化物、 カルボジィ ミ ドなどが利用できる。 例えば、 標識化合物にスぺーサーを介して、 または介さ ずに、 スクシンイミ ドエステルを導入し、 かつアミノ酸の芳香環にアミノ基を導 入しアミ ド結合により両者を結合させることができる。 芳香環にアミノ基を導入 したアミノ酸として、 例えばァミノフエ二ルァラニンが挙げられる。 この際に用 いる官能基は、 適宜選択導入できるし、 結合方法も適宜選択できる。 この際、 ァ ミ ド結合形成反応を pH 5程度で行なうことで、 他にアミノ基が存在していても、 アミノフエ二ルァラニンの側鎖のアミノ基に選択的に反応させることができる。 あるいは、 他のアミノ基を Boc化等により保護し、 反応後脱 Boc化すればよい。 この方法は、 例えば、 「新生化学実験講座 1 タンパク質 VI 構造機能相関」 の 記載等を参照すればよい。
アミノ酸骨格を形成する原子に芳香環が直接結合していても、 0、 Nおよび S のうちの少なく とも 1種の 1、 2、 または 3個の原子を介して間接的に結合して いてもよい。 芳香環はベンゼン環である場合、 ベンゼン環上にスぺーサーまたは 標識化合物が結合する位置は、 アミノ酸骨格の位置に対して、 パラ位またはメタ 位であると、 リボゾームへの取り込み効率がより高くなり、 より好ましく、 特に パラ位であることが好ましい。 前述のように、 芳香環の官能基にスぺーサーを介してまたは介さずに標識化合 物を結合させる。アミノフエ二ルァラニンの場合、パラアミノフエ二ルァラニン、 メタアミノフエ二ルァラニンが好ましい。
tRNAにアミノ酸を結合させ、 アミノアシル tRNAを作製するためには、 必要な 特定の基を結合させておく必要がある。 例えば、 アミノ酸のカルボキシル基にジ ヌクレオチド （pdCpA) を結合させておけば、 3' 末端の CAジヌクレオチドを欠落 させた tRNA ( t RNA(-CA)) と結合させ、 人工アミノアシル t RNAを作製すること ができる。 人工アミノアシル tRNAの作製は、 W02004/009709国際公開パンフレツ ト等の記載に従って行うことができる。 例えば、 アミソ酸の αアミノ基を Boc基 で、 側鎖官能基を Bocもしくは OtBocで保護し、 Boc-ァミノ酸をシァノメチルェ ステル化した後、 pdCpA と反応させるか、 縮合剤カルボ二ルイミダゾ一ル （CDI) を用いて Bocアミノ酸と pdCpAを反応させる方法により、 アミノアシル pdCpAを 作製することができる。 tRNA(- CA)との連結は T4 RNA リガーゼを用いればよい。 本発明の tRNAを用いたタンパク質へのァミノ酸またはその誘導体の導入ば、ァ ミノ酸またはその誘導体を導入しようとするタンパク質をコードする DNAの導入 部位に相当するコ ドン位置に終止コドン TAGを導入した DNAとアミノ酸またはそ の誘導体を結合させた本発明のアミノアシル tRNA を用いて細胞内または無細胞 翻訳系でタンパク質を合成することにより行うことができる。
無細胞翻訳系による合成は、 発現させようとする遺伝子を含む発現ベクターを 宿主細胞に導入することなく、 in vitro で必要な試薬と混合し遺伝子を発現させ ることにより ίラうことができる（Spirin, A. S. et al, (1988) "A continuous cell - free translation system capable of production polypeptides in high yield" Science 242, 1162； Kim, D. M. , et al. , (1996) "A highly efficient cell-free protein synthesis system from E. col i " Eur. J. Biochem. 239,
881-886)。 無細胞タンパク質合成系は、 mRNAの有する遺伝情報を読み取ってリボ ソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみをさす場合もあるし、 DNA を テンプレートとして RNAを合成する無細胞耘写系と前記無細胞翻訳系の両方を包 含するものをさす場合もある。 無細胞翻訳系においては、 生物抽出液が用いられ る。 生物抽出液とは、 リボソーム、 20種類のアミノアシル tRNA合成酵素、 メチ ォニル _tRNA トランスフオルミラーゼ、 3種類の翻訳開始因子 （translation initiation factor ； IF1 , IF2、 IF3)、 3種類の翻訳伸長因子 （translation elongation factor； EF-G、 EF- Tu、 EF- Ts)、 3種類の翻訳終結因子 （translation termination factor ; RF1、 RF2、 RF3)、 リボソームリサイクリング因子 （RRF)、
RNA ポリメラーゼ等のタンパク質合成に必要な成分を含む生物の抽出液をいう。 ここに挙げた以外のタンパク質を効率的な翻訳のために添加してもよく、 当業者 ならばより効率的な添加のために如何なるタンパク質を添加すればよいか決定で きる。 生物抽出液は、 大腸菌由来のもの、 コムギ胚芽由来のもの、 ゥサギ網状赤 血球由来のもの、 動物細胞や昆虫細胞由来のものいずれを用いてもよい。 生物抽 出液はフレンチプレスによる破碎またはグラスビーズを用いた破砕等によって得 ることができる。 大腸菌由来微生物抽出液としては S30ェクス トラタ トがあり、 例えば Pratt らの方法により得ることができる （Pratt, Transcription and
Translation一 a practical approach, Henes, B. D. and higgins, S. J. ed.， IRL
Press, Oxford. , 179-209 [1984])。 S30ェクス トラク トは、 リボソーム、 20種類 のアミノアシル tRNA合成酵素、 メチォ二ル- tRNA トランスフオルミラーゼ、 3種 類の翻訳開始因子 （translation initiation factor； IF1、 IF2、 IF3)、 3種類の 翻訳伸長因子 (translation elongation factor； EF - G、 EF - Tu、 EF_Ts)、 3種類 の翻訳終結因子 (translation termination factor； RF1, RF2、 RF3)、 リボソ一 ムリサイクリング因子 （RRF) 等を含む。 無細胞タンパク質合成系は、 上記生物抽 出液の他、 ATP 再生系、 プロモータ一および発現させようとするタンパク質をコ 一ドする核酸を含むプラスミ ドまたは発現させようとするタンパク質をコードす る mRNA、 tRNA, RNAポリメラーゼ、 RNAァーゼ阻害剤、 ATP、 GTP、 CTP、 UTP等の エネルギー源、 緩衝剤、 アミノ酸、 塩類、 抗菌剤等を含んでいてもよく、 それぞ れの濃度は適宜決定すればよい。
ATP 再生系は限定されず、 公知のリン酸ドナーおよびキナーゼの組合せを用い ることができる。 この組合せとして例えば、 ホスホェノールピルビン酸 （PEP) - ピルビン酸キナーゼ （PK) の組合せ、 ク レアチンリン酸 （CP) -クレアチンキナー ゼ （CK) の組合せ、 ァセチルリン酸 （AP) -アセテートキナーゼ （AK) の組合せ等 が挙げられ、 これらの組合せで ATP再生系を無細胞タンパク質合成系に加えれば よい。
無細胞タンパク質合成系には製造しよう とするタンパク質をコードする mRNA も必要である。該 mRNAは無細胞タンパク質合成系に核酸を転写する系、すなわち 該タンパク質をコードする mRNAを産生する系を包含させてもよい。 この場合は、 DNAを添加する。 また、 別途 mRNAを踌型 DNAより T7 DNAポリメラーゼ等を用い た転写等により合成し、得られた mRNAを本発明の無細胞タンパク質合成系に含ま せてもよい。 mRNAの産生は、 適当なプロモーターおよび該プロモーターの下流に 位置する製造しようとするタンパク質をコードする DNAを含むプラスミ ドならび に該プロモーターに作用する RNAポリメラーゼにより達成できる。 ここで、 用い るプラスミ ドは限定されず、 公知のものが用いられ、 公知の遺伝子工学的手法に より、 適当なプロ.モータ一やリボソーム結合部位等を導入して用いることができ る。 当業者ならば、 本発明で用いるプラスミ ドを適宜選択し、 また自ら設計して 構築することができる。 プロモーターは無細胞タンパク質合成系で用いる微生物 が有する内在性のプロモーターを用いてもよいし、 外来性のプロモーターを用い てもよレ、。プロモーターとしては、上記 Trcプロモーター、 T7プロモーターや Tac プロモーターが効率の面で優れており好適に用いられる。 市販の無細胞発現キッ トを用いてタンパク質を発現させることができる。 この よ う なキッ ト と して例えば、 Rapid Translat ion System (RTS) (Roche)や Expressway In Vi tro Protein Synthesis System (lnvi trogen)等力 Sある。 この際、 用いる発現ベクターは限定されないが、 それぞれの無細胞翻訳系に適したべクタ 一があるのでそれを使用すればよい。 前者のキッ ト用発現ベクターとして、 pIVEX2. 2bNdeが挙げられ、 後者のキッ ト用発現ベクターとして、 pEXPl や pEXP2 が挙げられる。
本発明の tRNAを用いることにより、タンパク質の任意の位置に蛍光物質で標識 したァミノ酸等の非天然アミノ酸を導入することができ、 蛍光標識タンパク質を 製造することができる。 例えば、 PDIPY Fレアミノフエ二ルァラニンをス トレプト 了ビジンの Tyr84部位に導入し、 蛍光標識ス トレプトアビジンを作製することが できる。
また、 タンパク質の任意の 2ケ所の位置に蛍光共鳴エネルギー移動の供与体お よび受容体となる蛍光標識アミノ酸を導入することでタンパク質を他の分子との 相互作用の検出を行うことができる。 この場合、 一方の蛍光標識アミノ酸を 4塩 基コ ドン法で導入すればよい。 4塩基コ ドン法は、 Hohsaka T.， et al. , J. Am. Chem. Soc.， 118， 9778-9779, 1996および Hohsaka T.， et al . , J. Am. Chem. Soc. , 121， 34-40, 1999 の記載に従って実施することができる。 この場合のタンパク質とし て分子と相互作用することにより立体構造が変化するあらゆるタンパク質が挙げ られる。 このようなタンパク質として、 例えば、 カルモジュリン、 cGMP依存性蛋 白質キナーゼ、 ステロイ ドホルモン受容体、 ステロイ ドホルモン受容体のリガン ド結合ドメイン、 タンパク質キナーゼ 、 イノシトール- 1, 4, 5-トリホスフェー ト 受容体、 レコベリン、 マルトース結合タンパク質、 DNA 結合タンパク質等が挙げ られる。 タンパク質と相互作用する分子は、 タンパク質ごとに決まっており、 タ ンパク質、 核酸、 糖、 イオン等のその他の有機または無機の低分子量分子が含ま れる。 例えば、 タンパク質がカルモジュリンの場合、 カルモジュリン結合タンパ ク質ゃカルシウムイオンが挙げられる。 また、 cGMP 依存性蛋白質キナーゼには cGMP、 マルトース結合タンパク質にはマルトースが挙げられる。 さらに、 ステロ ィ ドホルモン受容体や DNA結合タンパク質には、 それぞれのタンパク質に特異的 なステロイ ドホルモンや DNAが挙げられる。 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギ 一供与体 （ドナー） となる物質およびエネルギー移動のエネルギー受容体 （ァク セプター） となる物質としては、 BODIPY化合物、 ローダミン （TAMRA)、 フルォレ セィン （FITC；)、 テキサスレッ ド、 アタリジンオレンジ、 サイバーグリーン、 Cy3、 Cy5 等、 ならびにこれらの誘導体を含む公知のあらゆる蛍光物質が挙げられる。 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体 （ドナー） となる蛍光物質およびェ ネルギー移動のエネルギー受容体 （ァクセプター） どなる蛍光物質は、 エネルギ 一受容体となる物質の励起スぺク トルがエネルギー供与体となる物質の放射スぺ ク トルと重複するよ うに選択すればよい。 例えば、 エネルギー供与体と して BODIPY (登録商標） FL、 エネルギー受容体として BODIPY (登録商標） 558/568 を選択すればよい。 あるいは、 エネルギー供与体とエネルギー受容体の組み合わ せとして、 BODIPY FLと BODIPY 576/586、 BODIPY FLと TAMRA、 BODIPY FLと Cy3、
Fluorescein と BODIPY 558/568、 Alexa488 と BODIPY 558/568、 BODIPY 558/568 と Cy5、 などでもよレ、。
本発明のタンパク質において、 立体構造に変化が生じたときにエネルギー供与 体とエネルギー受容体が蛍光共鳴エネルギー移動を起こすのに適切な配向を保つ 相対的位置に存在するようにタンパク質中に含ませる必要がある。
このためには、 タンパク質中の特定の部位に蛍光物質で標識した蛍光標識アミ ノ酸を導入すればよい。 蛍光標識アミノ酸を導入する位置は、 蛍光標識アミノ酸 を導入するタンパク質によって異なるが、 天然タンパク質のァミノ酸配列に基づ いて立体構造を解析し、 立体構造上近接する位置にあるアミノ酸部位に蛍光標識 アミノ酸を導入すればよい。 タンパク質の立体構造は、 例えば市販のタンパク質 立体構造解析ソフトウエアを用いることにより予測することができる。あるレ、は、 エネルギー供与体とエネルギー受容体のどちらか一方をタンパク質の N末端ある いは C末端に導入しておき、 もう一方をタンパク質の内部の数〜数十ケ所に導入 して、 その中から本発明に適した導入位置を特定すればよい。
例えば、 タンパク質がカルモジュリンである場合、 4, 4-ジフルォ口- 5, 7 -ジメチ ル- 4-ボラ- 3a, 4a-ジァザ- S-インダセン- 3-プロピオン酸 （BODIPY FL) で標識した ァミノ酸および， 4-ジフルォロ- 5- (2-チェ二ル）- 4-ボラ- 3a， 4a-ジァザ- S-ィンダ セン -3-プロピオン酸（BODIPY 558/568)で標識したァミノ酸をそれぞれカルモジ ュリンのァミノ酸配列の 40番目と N末端、またはカルモジュリンのアミノ酸配列 の 99番目と N末端に導入すればよい。 一方、 4， 4 -ジフルォロ- 5, 7_ジメチル- 4 - ボラ- 3a, 4a-ジァザ- S-ィンダセン- 3-プロピオン酸で標識したァミノ酸および， 4- ジフルォロ- 5- (2-チェ-ル）- 4-ボラ- 3a， 4a -ジァザ- s-ィンダセン- 3-プロピオン 酸で標識したァミノ酸をそれぞれカルモジュリンのァミノ酸配列の 113番目と N 末端、 または 148番目と N末端に導入した場合は、 タンパク質が他の分子と相互 作用しても充分な蛍光共鳴エネルギー移動の効率の変化が起こらない。 このよう にして得られた、 本発明のタンパク質を用いてタンパク質と該タンパク質と他の 分子の相互作用を検出することができる。 本発明のタンパク質に他の分子を相互 作用させることにより、 本発明のタンパク質の立体構造が変化し、 エネルギー受 容体とエネルギー供与体の距離および配向が変化する。 該状態のタンパク質にェ ネルギー供与体の励起光を照射すると、 エネルギー供与体とエネルギー受容体の 間で蛍光共鳴エネルギー移動 （FRET) が起こるが、 エネルギー受容体とエネルギ —供与体の距離および配向が変化することにより、 FRETの効率も変化する。 これ を測定することによりタンパク質の構造変化を検出することができる。
励起光の光源としては、 ブロードな紫外光や可視光をフィルターや分光器を用 いて所望の波長範囲とした光源を用いてもよいし、 レーザー等の単色光を用いて もよい。 レーザ一光源を使う場合は、ヘリ ゥムカ ドミゥムレーザ一（442nm)が一般 的である力 s、ブルーダイオードレーザー（405nm)、ァノレゴンイオンレ一ザ一（457nm)、 LD 励起固体レーザー（di ode- pumped sol i d-state laser) (430nm) 等を用いても よい。 二光子励起法であれば 800nm付近のパルスレーザーを用いてもよい。
上記タンパク質は以下のようなタンパク質である。
1 . 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍 光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミ ノ酸を含むタンパク質であって、 該タンパク質と結合し得る分子と結合したとき に立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質の距 離および配向が変化するような位置に 2種類の蛍光標識ァミノ酸が存在し蛍光共 鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質、
2 . 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍 光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミ ノ酸の一方がタンパク質の N末端または C末端に存在し、 もう一方が N末端およ び C末端以外の部位に存在する上記 1のタンパク質、
3 . 蛍光物質で標識したアミノ酸を 4塩基コ ドン法により導入した上記 1また は 2のタンパク質、
4 . タンパク質と結合し得る分子が、 タンパク質、 核酸、 糖および低分子量分 子からなる群から選択される上記 1〜 3のいずれかのタンパク質、
5 . エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質 が、 可視光域に励起波長および発光波長を有する蛍光物質である上記 1〜4のい ずれかのタンパク質、
6 . エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質 が、 その化学構造に 4, 4-ジフルォロ _4_ボラ- 3a, 4a-ジァザ- S-インダセンを基本 骨格として含む分子又はその塩もしくはその誘導体である上記 5のタンパク質、 7 . エネルギー供与体となる蛍光物質が、 4， 4-ジフルォロ- 5, 7-ジメチル- 4-ボ ラ- 3a, 4a-ジァザ- s-ィンダセン- 3-プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受 容体となる蛍光物質が 4, 4-ジフルォ口- 5- (2-チェニル）- 4_ボラ- 3a， 4a-ジァザ - s-ィンダセン- 3-プロピオン酸又はその塩である上記 6のタンパク質、
8 . エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質 が p-ァミノフエ二ルァラニンのパラ位ァミノ基に結合している上記 1〜 7のい ずれかのタンパク質、
9 . タンパク質が、カルモジュリンである上記 1〜 8のいずれかのタンパク質、
1 0 . エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物 質で標識したアミノ酸が、 カルモジュリンがカルモジュリン結合タンパク質およ びカルシウムイオンと相互作用したときに、 蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変 化するように距離および配向が変化し得るカルモジュリン上の位置に存在する、 上記 9のカルモジュリン、
1 1 . エネルギー供与体となる蛍光物質が、 4， 4-ジフルォロ- 5, 7-ジメチル -4- ボラ - 3a, 4a-ジァザ- s-ィンダセン -3-プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー 受容体となる蛍光物質が， 4-ジブルォ口- 5 -（2-チェニル） -4-ボラ- 3a, 4a-ジァザ - s -ィンダセン- 3-プロピオン酸又はその塩であり、 それらの蛍光物質で標識した ァミノ酸が、 カルモジュリンがカルモジュリン結合タンパク質およびカルシウム イオンと相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距 離および配向が変化し得るカルモジュリ ン上の位置に存在する、 上記 1 0のカル モジュリン、 ならびに
1 2 . 4, 4-ジフルォ口- 5， 7-ジメチル- 4-ボラ- 3a, 4 a-ジァザ- S-インダセン- 3- プロピオン酸又はその塩ならびに， 4-ジフルォ口- 5-（2-チェ-ル）- 4 -ボラ- 3a， 4a - ジァザ- s-ィンダセン- 3-プロピオン酸又はその塩をそれぞれカルモジュリンのァ ミノ酸配列の 40番目と N末端、 またはカルモジュリンのァミノ酸配列の 99番目 と N末端に含むカルモジュリン。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例 によって限定されるものではなレ、。 実施例 1 蛍光標識ァミノ酸- tRNAの作製方法
それぞれの tRNAの塩基配列に基づいて、 3個のオリゴヌクレオチドを化学合成 した。 T7プロモーターと tRNAの 1〜31番目までの塩基配列を含むプライマーと、 tRNA の 24〜46 番目までの塩基配列を含むプライマーを用いて、 PCR (KOD Dash buffer, 0.2 mM dNTP, 1.25 units KOD Dash, 50nmolのそれぞれのプライマーを 50 / L中に含む） により 2本鎖 DNAを得た。 この反応液の 1 しを铸型として、 T7 プロモーター配列 （CTAATACGACTCACTATA) (配列番号 3 2) を持つプライマー と、 tRNAの 39〜74番目の塩基配列を含むプライマーを用いて、 上記と同じ条件 で PCRを行ない、 tRNA (-CA)遺伝子を作製した。 MinElute PCR Purification kit (キアゲン社製） を用いて精製した。
次に、 tRNA (-CA)を転写反応により合成した。 反応液 lOO/ Lは、 40 mM Tris- HC1 (pH 8.0)， 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 4 mM NTP, 20 mM GMP, 2 mM spermidine, 10 μ g/mL BSA, 40 units ribonuclease inhibitor, 1 unit inorganic pyrophosphatase, 400 units T7 RNA Polymerase, 10 μ g tRNA (_CA)遺伝子を含む。 反応液を 37°C、 18時間反応させて、 DEAE-セルロースカラム （Whatman社製） に より tRNA(- CA)を精製した。
続レヽて、 5xLigation Buffer (275mM Hepes一 Na pH7.5, 75mM MgCl2, 16.5m DTT, 5mM ATP) 4μし、 200 μ M tRNA (-CA) 2.5 /iし、 BODIPY FL-aminophenylalanine-pdCpA の DMS0溶液 2/i L、 0.1% BSA 0.4μ L, T4 RNA Ligase (25 units/^ L) 1.2μ Ι, 水 9.9μ ίを混合し、 4°Cで 2時間反応させた。 3M AcOK pH4.5を 10ju L、 水 70 μ Lを加え、 等量のフエノール/ク口口ホルム = 1/1(0.3M AcOK pH4.5で飽和させたも の）を加え撹拌し、 遠心した。 上層を回収し、 等量のクロ口ホルムを加え、 撹拌、 遠心した。 上層を回収し、 エタノール 300 しを加え、 軽く混合し、 - 20°Cで 1時 間置いた。 15000rpm 30min 4°Cで遠心した後、 上清を除き、 _20°Cで保存してある 70% EtOH 200 μ Lを加え、 15000rpm 4°Cで 5秒遠心した。 上清を除き、 減圧乾燥 した。 ImM 酢酸カリ ゥム pH4.5 2 / Lに溶角 させた。
実施例 2 蛍光標識ァミノ酸の導入評価
反応液 （10// L) に、 55 mM Hepes-KOH (pH 7.5), 210 mM グルタミン酸カリ ゥ ム， 6.9 mM 鲊酸アンモニゥム， 1.7 mM ジチオスレィ ト一ノレ， 1.2 mM ATP, 0.28 mM GTP， 26 mMホスホェノールピルビン酸， I mMスペルミジン， 1. 9 % ポリエチレン グリコール- 8000, 35 a g/mL 葉酸， 12 mM 酢酸マグネシウム， 0. 1 mM 20種類の アミノ酸、 ス トレプトアビジン mRNA (終止コ ドン UAGが Tyr83部位に導入された もの） 8 / g/ Lを 1 レ 大腸菌抽出液 （Promega社製） を 2 L、 蛍光標識アミノ 酸- tRNA溶液を 1 μ L混合した。 37°Cで 1時間翻訳反応を行なった。
翻訳反応液 1 /x Lに、 水 9 μしと 2 Χサンプルバッファー 10 // Lを加え、 95°C5分 間加熱した。 このうちの 5 しを 15% SDS-PAGEに流し、 この電気泳動ゲルを蛍光 スキャナー （日立ソフトウェアエンジニアリング社製 FMBI0- I II) で観察した。 488nm励起/ 520nm検出により、 蛍光標識アミノ酸の導入を確認し、 その導入効率 を定量した。 また同一の電気泳動ゲルを用いて、 抗 T7tag抗体 （Novagen社製） によりウェスタンブロッ ト分析を行なった。
Tyr83部位を UAGに置換したストレプトアビジンの mRNA配列を以下に示す（配 列番号 3 3 )。 開始コ ドンから本来の終止コ ドンまでを示してある。 下線部は挿入 した終止コ ドンを示す。
Figure imgf000026_0001
CCUCUAGACGCUGUUCAGCAACACCACCACCACCACCACUAA
実施例 3 大腸菌由来 tRNA変異体による UAGに対する蛍光標識アミノ酸の導入 大腸菌由来 tRNA配列を持ちアンチコ ドンを CUAに置換した 22種類の tRNAを、 実施例 1に記述の方法で作製した。 続いて実施例 2に記載の方法で蛍光標識ァミ ノ酸の導入評価を行なった。
図 4に蛍光標識ァミノ酸を付加した tRNAを加えた場合の SDS-PAGEの蛍光ィメ ージを示す。 図 4に示すように、 大腸菌 tRNAの中では、 トリブトファン tRNAが 非天然アミノ酸の導入に適していることがわかった。 図 6 Aにァミノ酸を付加していない tRNAを用いた場合のウェスタンブロッティ ングの結果、図 6 Bは蛍光標識ァミノ酸を付加した tRNAを用いた場合の SDS- PAGE の蛍光イメージ、 図 6 C は各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド 強度を示す。 図 6 A〜図 6 Cに示すように、 G1- C72， A73および G l- C72，G73は高い 導入活性を有する。 ただし、 Gl- C72, G73は蛍光標識非天然アミノ酸を付加してい なくても、 完全長タンパク質が生成することから、 翻訳系内で天然アミノ酸が付 加されていると考えられる。 従って、 天然アミノ酸の付加を受けない G1 - C72，A73 が最適である。
実施例 4 マイコプラズマ 'カプリコラム由来 tRNA変異体による UAGに対する蛍 光標識ァミノ酸の導入
マイコプラズマ..カプリコラム由来 tRNA配列を持ちアンチコ ドンを CUAに置換 した 30種類の tRNAを、 実施例 1に記述の方法で作製した。 続いて実施例 2に記 載の方法で蛍光標識アミノ酸の導入評価を行なった。
図 8にマイコプラズマ 'カプリコラム由来 tRNA変異体による UAGに対する蛍光 標識ァミノ酸の導入の結果を示す。 図 8に示すようにマイコプラズマ · カプリコ ラム由来 tRNA変異体の中でもトリブトファン用 tRNAが非天然アミノ酸の導入に 適していることがわかった。
図 1 O Aにァミノ酸を付加していない tRNAおよび蛍光標識ァミノ酸を付加した tRNAを用いた場合の蛍光イメージを、 図 1 0 Bに各変異体を用いた場合の導入タ ンパク質の蛍光バンド強度を示す。図 1 O Aおよび図 1 0 Bに示すように、マイコ プラズマ ·カプリコラム由来 tRNA変異体は、全ての変異体において大腸菌トリプ トフアン用 tRNA変異体（G1-C72, A73変異体）よりも高い導入活性を示した。特に、 蛍光標識ァミノ酸を付加していないときに完全長タンパク質がほとんど生成しな い G1-C72, A73が最適である。
実施例 5 種々の生物体由来のトリプトファン用 tRNA変異体 （Gl- C72， A73変異 体）による UAGに対する蛍光標識ァミノ酸の導入
種々の生物体由来のトリプトファン用 tRNA配列を持ち、 G 1-C72，A73の変異を 導入してアンチコ ドンを CUAに置換した 31種類の tRNAを、 実施例 1に記述の方 法で作製した。 続いて実施例 2に記載の方法で蛍光標識ァミノ酸の導入評価を行 なった。 図 1 1 A 及び図 1 1 B に種々の生物体由来のトリプトファン用 tRNA、 G1-C72, A73の変異を導入してアンチコ ドンを CUAに置換した 31種類の tRNA変異 体の配列を示す （配列番号 1〜3 1 )。 図 1 1 A及び図 1 1 B中では、 Uを T と表 現してある。 なお、 配列番号 1〜 3 1においては、 73番目の塩基は Aである力 Gであっても （Gl- C72, G73)、 本発明の効果を奏することができる。
図 1 2 A 及び図 1 2 B に種々の生物体由来の ト リ プ トフ ァ ン用 tRNA (G1-C72, A73)変異体による UAGに対する蛍光標識ァミノ酸の導入の結果を示す。 図 1 3 Aにアミノ酸を付加していない tRNAおよび蛍光標識アミノ酸を付加した tRNAを用いた場合の蛍光イメージングの結果を、 図 1 3 Bに各変異体を用いた場 合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す。図 1 3 Aおよび図 1 3 Bに示すよう に、マイコプラズマ 'カプリコラムを含む 8種類のトリプトファン用 tRNAが高い 導入活性を示した。 この中では、 蛍光標識アミノ酸を付加していないときに完全 長タンパク質がほとんど生成しないマイコプラズマ ·カプリコラム由来 tRNA変異 体 （Gl- C72, A73変異体） が最も適している。
実施例 6 マルトース結合タンパク質 （MBP) への蛍光標識アミノ酸の二重導入 ( 1 ) 4塩基コ ドン法のみによる導入
酵母フエ二ルァラニン用 tRNA を用いて、 実施例 1に記載の方法で BODIPY FL- aminophenyl alanine- tRNA (アンチコ ドンに ACCCを有する）、 および、 BODIPY 558/568_aminophenylalanine_tRNA (アンチコ ドンに CCCGを有する）を作製した。 続いて、マルトース結合タンパク質の tiiRNA (N末端部分に CGGG、( 末端部分に GGGU を有する） を用いて、 実施例 2に記載の方法で蛍光標識アミノ酸の二重導入を行 なった。ただし、電気泳動ゲルの蛍光検出は、 488nm励起/ 520nm検出に加えて 532nm 励起/ 605nm検出でも行なった。
図 1 4 Aに 4塩基コ ドン法によるマルトース結合タンパク質 （MBP) への蛍光標 識アミノ酸の二重導入方法の概要を示し、 図 1 4 B に 4塩基コ ドン法によるマル トース結合タンパク質（MBP)への蛍光標識ァミノ酸の二重導入の結果を示す。 CCCG を有する tRNAは、 CGGGを有する遺伝子に対してのみ蛍光標識アミノ酸を導入し た。 一方、 ACCCを有する tRNAは、 GGGUを有しない遺伝子に対しても蛍光標識ァ ミノ酸を導入した。 すなわち、 この遺伝子では蛍光表域アミノ酸が 4塩基コ ドン GGGU以外の部位へも導入されてしまうため、 4塩基コ ドンの代わりに終止コ ドン UAGの使用を試みた。
N末端部分に CGGG、 C末端部分に GGGU を有するマルトース結合タンパク質の mRNA 配列を以下に示す （配列番号 3 4 )。 開始コ ドンから本来の終止コ ドンまで を示してある。 下線部は挿入したコ ドンを示す。
Figure imgf000029_0001
UAUCACCAAGGGGUAGCCACCACCACCACCACCACUAA
( 2 ) 4塩基コ ドン法および本発明の tRNA変異体を組合せた導入
酵母フエ二ルァラニン用 tRNA を用いて、 実施例 1に記載の方法で B0DIPY 558/568-aminophenylalan i ne- tRNA (アンチコ ドンに CCCGを有する）を作製した。 一方、 マイコプラズマ · カプリ コラム由来 ト リ プトファン用 tRNA 変異体
( G1-C72, A73 変異体） を用いて、 実施例 1 に記載の方法で B0DIPY
FL-ami nophenyl a lan i ne-tRNA (アンチコ ドンに CUAを有する） を作製した。 続い て、 マルトース結合タンパク質の mRNA (N末端部分に CGGG、 C末端部分に UAGを 有する） を用いて、 実施例 2に記載の方法で蛍光標識アミノ酸の二重導入を行な つた。 ただし、電気泳動ゲルの蛍光検出は、 488nm励起/ 520nm検出に加えて 532nm 励起/ 605nm検出でも行なった。
図 1 5 Bに 4塩基コ ドン法および本発明の tRNA変異体を用いた終止コ ドン法に よるマルトース結合タンパク質（MBP)への蛍光標識ァミノ酸の二重導入方法の概 要を示し、 図 1 5 Bに 4塩基コ ドン法および本発明の tRNA変異体を用いた終止コ ドン法によるマルトース結合タンパク質（MBP)への蛍光標識ァミノ酸の二重導入 の結果を示すマイコプラズマ ·カプリコラム由来 tRNA変異体 （G 1-C72，A73変異 体） は、 UAGを有する遺伝子に対してのみ蛍光標識アミノ酸を導入できた。 また、 その導入効率も 4塩基コ ドン GGGUと同程度であった。 これより、 2種類の蛍光標 識アミノ酸を導入するために CGGGと UAGの組合せも良好であることがわかった。
N末端部分に CGGG、C末端部分に UAGを有するマルトース結合タンパク質の mRNA 配列を以下に示す（配列番号 3 5 )。 開始コ ドンから本来の終止コ ドンまでを示し てある。 下線部は挿入したコ ドンを示す。
UAUCACCAAGUAGCACCACCACCACCACCACUAA 実施例 7 TAMRAを有する蛍光標識ァミノ酸の導入
マイコプラズマ . カプリコラム由来 tRNA変異体 （Gl- C72， A73変異体） を用い て、 実施例 1に記載の方法で TAMRA- X- aminopheny la lan ine-tRNAを作製した。 続 いて、 2番目の部位を UAGに置換したストレプトアビジンの mRNA (SA2UAG)を用 いて、 実施例 2に記載の方法で TAMRA標識アミノ酸の導入を行なった。 ただし、 電気泳動ゲルの蛍光検出は、 532nm励起/ 605nm検出で行なった。 比較のために、 アンチコ ドンに 4塩基 CCCGを持つ酵母フヱニルァラニン用 tRNAにより、 2番目 の部位を CGGGに置換したストレプトアビジンの mRNAを用いて同様に導入を行な つた。図 1 6 Aに TAMRAを有する蛍光標識ァミノ酸（TAMRAXAF)の化学構造を示す。 図 1 6 A中、 「5、 6」 の部分は、 5と 6の位置に結合したものの混合物であるこ とを示す。 また、 図 1 6 Bに蛍光標識ァミノ酸を付加した tRNAを用いた場合の蛍 光イメージングの結果を示す。 さらに、 図 1 6 C に導入タンパク質の蛍光バンド 強度を示す。 図 1 6 Bおよび図 1 6 Cに示すように、 マイコプラズマ ·カプリコラ ム由来 tRNA変異体 （G1-C72, A73変異体） は、 実施例 4に記載の BODIPY FLを有 する蛍光標識アミノ酸の場合と同様に、 TAMRA を有する蛍光標識アミノ酸も効率 良く導入できた。 また、 4塩基コ ドン CGGGに対してアンチコ ドンに 4塩基 CCCG を持つ酵母フエ二ルァラニン用 tRNA により導入した場合よりも高い導入活性を 示した。
2番目の部位を UAGに置換したストレプトアビジンの mRNA配列を以下に示す (配列番号 3 6 )。 開始コ ドンから本来の終止コ ドンまでを示してある。 下線部は 導入した UAGを示す。 また、 2番目の部位を CGGGに置換したス トレプトアビジンの mRNA配列を以下 に示す （配列番号 3 7 )。 開始コ ドンから終止コ ドンまでを示してある。 下線部は 導入した CGGGを示す。
Figure imgf000032_0001
実施例 8 3 ' 末端の CCA配列の直前に 1個の塩基を挿入した tRNA変異体による 非天然ァミノ酸の導入
( 1 ) マイコプラズマ ' カプリコラム由来のトリプトファン用 tRNA変異体 マイコプラズマ · カプリコラム由来のトリプトフアン用 tRNA (G1-C72, A73)変 異体であって、 3 ' 末端の CCA配列の直前に A、 G、 Uのいずれか 1個を挿入し たものを、 実施例 1に記載の方法で作製した。 本発明において、 このような変異 tRNAを 1塩基伸長 tRNA と呼ぶことがあり、 例えばマイコプラズマ ·カプリコラ ム由来のトリプトファン用 tRNA (G1-C72, A73)変異体であって、 3 ' 末端の CCA配 列の直前に A、 C、 G、 Uのいずれか 1個を挿入したものを、 MycWの 1塩基伸長 tRNA と呼ぶことがある。 続いて実施例 2に記載の方法で蛍光標識アミノ酸の導入評価 を行なった。図 1 7に使用した tRNA変異体の構造を示す（配列番号 1及び 3 8 )。 図 1 7右 （配列番号 3 8 ) 力 3 ' 末端の CCA配列の直前に A、 C、 G、 Uのいずれ か 1個を挿入したものである。 図 1 8に 1塩基伸長 MycW による SA83UAG への BFLAFの導入の結果を示し、 図 1 8 Aに蛍光標識アミノ酸を付加した tRNAを用い た場合の蛍光イメージングの結果、 図 1 8 B に各変異体を用いた場合の導入タン パク質の蛍光バンド強度を示す。 図 1 8 Aおよび図 1 8 Bに示すように、 3 ' 末端 の CCA配列の直前に A、 C、 G、 Uのいずれか 1個を挿入した tRNAは元の tRNA と同 程度の高い導入活性を示した。 またこの結果は、 マイコプラズマ ' カプリコラム 由来のトリブトファン用 tRNA (Gl- C72, A73)変異体が、 蛍光標識アミノ酸以外に もリン酸化チロシンを効率良く導入できることを示す。
さらに、 蛍光標識アミノ酸の代わりにリン酸化チロシンを使用して、 実施例 1 に記載の方法で t RNA を作製した。 続いて実施例 2に記載の方法でリン酸化チロ シンの導入評価を行なった。 ただし蛍光イメージングは行なわず、 抗リン酸化チ 口シン抗体または抗 T7tag抗体によるウェスタンブロットのみを行なった。 図 1 9に 1塩基伸長 MycWによる SA2UAGへのリン酸化チロシン（pTyr)の導入の結果を 示し、図 1 9 Aに 2番目の部位を UAGに置換したス トレプトアビジンの mRNAとリ ン酸化チロシンを付加した tRNAを用いた場合のウェスタンプロットの結果、図 1 9 Bに導入タンパク質のウェスタンブロッ トのバンド強度を示す。図 1 9 Aおよび 図 1 9 Bに示すように、 3 ' 末端の CCA配列の直前に A、 C、 G、 Uのいずれか 1個 を挿入した tRNAは元の tRNAと同程度の高い導入活性を示した。
一方、 図 2 O Aに 83番目の部位を UAGに置換したストレプトァビジンの mRNA
(SA83UAG)とリン酸化チロシンを付加した tRNA を用いた場合のウェスタンブロ ッ卜の結果、 図 2 0 B に導入タンパク質のウェスタンブロッ トのバンド強度を示 す。 図 2 O Aおよび図 2 0 Bに示すように、 3 ' 末端の CCA配列の直前に A、 C, G、 Uのいずれか 1個を挿入した tRNAは元の tRNAよりも高い導入活性を示し、特に C を 1個挿入したものが効率が良い。
( 2 ) 酵母由来のフエ二ルァラニン用 tRNA変異体
アンチコ ドンに CCCG を有する酵母由来のフエ二ルァラニン用 tRNA 変異体
(YF (CCCG) )であって、末端に塩基を挿入あるいは削除したものを、実施例 1に記 載の方法で作製した。 続いて実施例 2に記載の方法で蛍光標識アミノ酸の導入評 価を行なった。 ただしストレプトアビジンの mRNAとしては、 Tyr83部位に UAGの 代わりに CGGGを含むものを用いた。 図 2 1に使用した tRNA変異体の構造を示す
(配列番号 3 9および 4 0 )。 図 2 2 Aに蛍光標識アミノ酸を付加した tRNAを用 いた場合の蛍光イメージングの結果、 図 2 2 B に各変異体を用いた場合の導入タ ンパク質の蛍光バン ド強度を示す。 図 2 2 Aおよび図 2 2 Bに示すように、 3 ' 末 端の CCA配列の直前に 1個の塩基を挿入した tRNA、 および、 CCA配列の直前の 1 個の塩基を削除した tRNAは、 元の tRNAと同程度の高い導入活性を示すものがあ つた。
さらに、 N末端に T7tag配列を持ちその直後に CGGGを導入したス トレプトアビ ジンの mRNAを用いて、実施例 2に記載の方法で蛍光標識ァミノ酸の導入評価を行 なった。 図 2 3 Aに蛍光標識アミノ酸を付加した tRNAを用いた場合の蛍光ィメ一 ジングの結果、 図 2 3 B に各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド 強度を示す。 図 2 3 Aおよび図 2 3 Bに示すように、 3 ' 末端の CCA配列の直前に 1個の塩基を挿入した tRNAは、 元の tRNAよりも高い導入活性を示すものがあつ た。
N末端に T7tag配列を持ちその直後に CGGG を導入したストレプトアビジンの mRNA 配列を以下に示す （配列番号 4 1 )。 開始コ ドンから終止コドンまでを示し てある。 下線部は挿入した CGGGコ ドンを示す。
Figure imgf000034_0001
CAACGGUAACCCUCUAGACGCUGUUCAGCAACACCACCACCACCACCACUAA
産業上の利用可能性
非天然アミノ酸をタンパク質に導入することで、 タンパク質の機能改変や構造 機能解析が行なわれている。 非天然ァミノ酸をタンパク質に導入するための手法 として、 導入したい部位のコ ドンを終止コ ドン UAGに置換しておき、 アンチコ ド ンに CUAを持ち非天然ァミノ酸でァミノアシル化された tRNA存在下で翻訳する方 法があった。 しかし、 この tRNAが UAGを翻訳する際には終結因子との競合が生じ る。 これまで用いられてきた酵母 Phe用 tRNAなどでは、 この終結因子との競合が 強く生じ、 非天然ァミノ酸の導入の効率が低下していた。
そこで、 終止コ ドン UAGを用いて非天然アミノ酸をタンパク質に効率良く導入 することのできる tRNAを種々の生物種由来の tRNAの中から探索し、 さらにそれ を改変することで、効率良く非天然アミノ酸を導入できる tRNAを見い出した。 こ の tRNAを用いることで、蛍光標識非天然ァミノ酸を導入した蛍光標識タンパク質 を合成すること （W02004/009709 A1 ) や、 タンパク質の特定部位に蛍光共鳴エネ ルギー移動の供与体と受容体となる蛍光標識非天然ァミノ酸を導入することでタ ンパク質と他の分子との相互作用の検出することを、 より効率良く行なうことが 可能である。
例えば、 蛍光標識非天然アミノ酸 BODIPY FL -ァミノフエ二ルァラニンを Tyr83 部位に導入したス小レプトアビジンを合成することや、 4塩基コ ドン CGGGと組み 合わせてマルトース結合タンパク質へ蛍光共鳴エネルギー移動の供与体と受容体 となる蛍光標識非天然ァミノ酸を導入することができる。
導入するアミノ酸は蛍光標識非天然アミノ酸に限定されず、 あらゆるアミノ酸 あるいはヒ ドロキシ酸などのアミノ酸類似体であってタンパク質へ導入されるも のについて適用できる。 また、 tRNAは異なる生物種においても翻訳活性を示すこ とから、本 tRNAが使用できるのは大腸菌無細胞翻訳系に限定されず、 あらゆる生 物種由来の無細胞翻訳系あるいは細胞内での翻訳に使用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1. トリブトファン用 tRNA変異体であって、 アンチコ ドンとして CUAを有し 終止コ ドンに対合する tRNA変異体。
2. 5' 末端が Gであり、 該 5' 末端の Gに対合する塩基が Cであり、 該 Cの 3' 側に隣接する塩基が Aである請求項 1記載の終止コ ドンに対合する tRNA変異 体。
3. 5'末端の Gに対合する Cの位置が 5'末端から 72番目であり、該 Cの 3' 側に隣接する Aの位置が 5'末端から 73番目である請求項 2記載の終止コ ドンに 対合する tRNA変異体。
4. 原核細胞由来の tRNAである請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の終止コ ドンに対合する tRNA変異体。
5. 大月昜菌またはマイコプラズマ ·カプリコラム (Mycoplasma capricolum) 由来の tRNAである請求項 4記載の終止コ ドンに対合する tRNA変異体。
6. 配列番号 1で表される塩基配列からなるマイコプラズマ · カプリコラム (Mycoplasma capricolum) 由来の tRNA変異体であって、 終止コ ドンに対合する tRNA変異体。 .
7. 3' 末端の CCA配列の直前に A、 Gまたは Uのいずれかの 1個の塩基が 挿入された請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の終止コドンに対合する tRNA 変 異体。
8. 5'末端の Gに対合する Cの位置が 5'末端から 72番目であり、該 Cの 3' 側に隣接する Aの位置が 5' 末端から 73番目であり、 さらに 5'末端から 74番目 に A、 C、 Gまたは Uのいずれかの 1個の塩基が挿入された請求項 7記載の終止コ ドンに対合する tRNA変異体。
9. アミノ酸でアミノアシル化された請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の 終止コ ドンに対合する tRNA変異体。
1 0. アミノ酸が非天然アミノ酸、 修飾化アミノ酸またはそれらの誘導体で ある、 請求項 9記載の終止コ ドンに対合する tRNA変異体。
1 1. アミノ酸の誘導体がヒ ドロキシ酸、 メルカプト酸およびカルボン酸か らなる群から選択される請求項 1 0記載の終止コ ドンに対合する tRNA変異体。
1 2 . アミノ酸が蛍光標識されたものである請求項 9〜 1 1のいずれか 1項 に記載の終止コ ドンに対合する tRNA変異体。
1 3 . タンパク質に所望のアミノ酸を導入する方法であって、 アミノ酸を導 入しょうとするタンパク質の mRNA であって導入しようとするアミノ酸の導入位 置に対応するコ ドンが終止コ ドンである mRNA および請求項 1〜 1 2のいずれか 1項に記載の終止コ ドンに対合する tRNA変異体を用い、 終止コ ドンに該 tRNA変 異体を割り当てることによりタンパク質にアミノ酸を導入する方法。
1 4 . アンチコ ドンとして 4塩基からなる配列を有し、 4塩基コ ドンに対合 する tRNA変異体であって、 3 ' 末端の CCA配列の直前に A、 G、 Cまたは Uのいず れかの 1個の塩基が挿入された 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体。
1 5 . アンチコ ドンとして CCCGを有し、 4塩基コ ドン CGGGに対合する請求 項 1 4に記載の 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体。
1 6 . フエ二ルァラニン用 tRNA変異体である請求項 1 4または 1 5に記載の 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体。
1 7 . 酵母由来の tRNAである請求項 1 4〜 1 6のいずれか 1項に記載の 4塩 基コ ドンに対合する tRNA変異体。
1 8 . 配列番号 4 0で表される塩基配列からなる酵母由来の tRNA変異体であ つて、 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体。
1 9 . アミノ酸でァミノアシル化された請求項 1 4〜 1 8のいずれか 1項に 記載の 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体。
2 0 . アミノ酸が非天然アミノ酸、 修飾化アミノ酸またはそれらの誘導体で ある、 請求項 1 9記載の 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体。
2 1 . アミノ酸の誘導体がヒ ドロキシ酸、 メルカプト酸およびカルボン酸か らなる群から選択される請求項 2 0記載の 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体。
2 2 . アミノ酸が蛍光標識されたものである請求項 1 9〜 2 1のいずれか 1 項に記載の 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体。
2 3 . タンパク質に所望のアミノ酸を導入する方法であって、 アミノ酸を導 入しょうとするタンパク質の mRNA であって導入しょうとするアミノ酸の導入位 置に対応するコ ドンが 4塩基コ ドンである mRNA および請求項 1 4〜2 2のいず れか 1項に記載の 4塩基コ ドンに対合する tRNA変異体を用い、 4塩基コ ドンに該 tRNA変異体を割り当てることによりタンパク質にアミノ酸を導入する方法。
2 4 . 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識し た蛍光標識ァミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識 アミノ酸を含むタンパク質であって、 該タンパク質と結合し得る分子と結合した ときに立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質 の距離および配向が変化するような位置に 2種類の蛍光標識アミノ酸が存在し蛍 光共鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質の製造方法であって、
1つの 4塩基コ ドンおよび 1つの終止コ ドンが挿入されたタンパク質の mRNA を調製する工程であって、 4塩基コ ドンおよび終止コ ドンを挿入する位置が前記 タンパク質が他の分子と相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変 化するように距離および配向が変化し得るタンパク質上の位置に対応する mRNA の位置である工程、
蛍光共鳴エネルギー移動を起こし得る 2種類の蛍光物質でそれぞれ標識した 2 種類のァミノ酸であって、前記 4塩基コ ドンに対するアンチコ ドンを有する tRNA が結合したアミノ酸および請求項 1〜 1 2のいずれか 1項に記載の tRNA 変異体 が結合したアミノ酸を調製する工程、 ならびに
前記 mRNAおよびアミノ酸結合 tRNAを用いてタンパク質を合成する工程とを含 む製造方法。
2 5 . 4塩基コ ドンに対するアンチコ ドンを有する tRNAが請求項 1 4〜 2 2 のいずれか 1項に記載の 4塩基コ ドンに対合する tRNA 変異体である請求項 2 4 記載のタンパク質の製造方法。
2 6 . 無細胞翻訳系でタンパク質を合成する請求項 1 3に記載の方法。
2 7 . 無細胞翻訳系でタンパク質を合成する請求項 2 3記載の方法。
2 8 . 無細胞翻訳系でタンパク質を合成する請求項 2 4に記載の方法。
2 9 . 無細胞翻訳系でタンパク質を合成する請求項 2 5に記載の方法。
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