WO2006118299A1

WO2006118299A1 - Ｇｐｃｒ阻害剤

Info

Publication number: WO2006118299A1
Application number: PCT/JP2006/309143
Authority: WO
Inventors: Takeaki Ohsu; Sen Takeshita; Yuzuru Eto
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2005-05-02
Filing date: 2006-05-02
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2007-11-02
Also published as: JPWO2006118299A1

Abstract

　システイン、メチオニン、及びオルニチン並びにこれらのアミノ酸の骨格を含む誘導体から選ばれる１種又は２種以上を、セロトニン受容体、ヒスタミン受容体、及びムスカリン受容体等のＧＰＣＲの阻害剤とする。

Description

明細書

GPCR阻害剤

技術分野

[0001] 本発明は GPCR阻害剤に関するものである。 GPCR阻害剤は、各種疾患に対する医薬品として有用である。

背景技術

[0002] Gタンパク質共役型受容体 (以下、「GPCR」とも呼ぶ）は、 7つの膜貫通へリックスドメインである共通の構造モチーフを典型的に共有し、約 800種の受容体スーパーフアミリーを成す。 GPCRは広範囲の組織の細胞に発現し、各々の GPCRは、ァミン、タンパク質、ペプチド、脂質、核酸など多種類にわたる特異的な生体内リガンドに応答し、グァニンヌクレオチド結合タンパク質を活性ィ匕することで細胞内にシグナルを増幅して伝達し、それによつて様々な生理学的機能が調節されて、る。

[0003] 一方で、既に上巿されている治療薬の約 3分の 1は GPCRの阻害剤もしくは促進剤である。例えば、イミトレックス (Imitrex、セロトニン受容体阻害、頭痛薬)、ァレガ (Alleg a、ヒスタミン受容体阻害、アレルギー疾患薬)、ジブレキサ (Zyprexa、ドーパミン受容体阻害、精神疾患薬)、ミアカルシック (Miacalcic カルシトニン受容体促進剤、骨粗鬆症薬)など、医薬品売り上げの上位に入る GPCR阻害剤もしくは促進剤は数多い。

[0004] GPCRが関与することが知られている疾患は、内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、歯科系疾患にわたる。例えば、 GPCRリガンドであるセロトニンは、学習および記憶、睡眠、体温調節、気分、運動活動、痛み、性的および攻撃的行動、食欲、神経変性性調節、ならびに生体リズムに関連するプロセスにおいて役割をもっと考えられている。セロトニン受容体阻害剤は、性的機能障害、鬱病、欲求障害、不安、精神分裂病、胃腸障害、頭痛、および心臓血管障害などの病態を改善することが期待される。

[0005] ゲノム研究の発展と相まって、 GPCRの新しい調節機能が今後も更に明らかになつていくと考えられている。従って、 GPCRは、内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、歯科系疾患における治療薬の開発のための重要な薬剤標的であり、安全かつ薬理学的に優れた GPCR阻害剤の開発が大、に必要とされて、る。

[0006] 現在まで、多くの GPCR阻害剤が開発されてきたが、いずれも、薬効、吸収性、あるいは安定性等の面で、十分満足できるものではない。これらのうち、特に重要であるのが生体への安全性である力従来のほとんどの GPCR阻害剤は生体に存在しない化合物であるため、疾患の治療効果以外に予期しない毒性を併せ持つことが多ぐ投与量を厳密に制御しなければ重篤な副作用が起きる可能性があった。

[0007] 一方、生体に存在するアミノ酸などの成分は安全性が高、ことが期待されるが、 GP CR阻害剤として報告されているものはない。アミノ酸に近いものとして、アミノ酸の誘導体による GPCR阻害剤として以下のような例が報告されて、る。フエニルダリシン誘導体が代謝型グルタミン酸受容体阻害剤として (非特許文献 1)、フエ二ルァラニン誘導体がコレストキニン受容体阻害剤として (非特許文献 2)機能する。

非特許文献 1 :J. Neurosci., 1994, 14(5 Pt 2), 3370-7

非特許文献 2 : Eur. J. Med. Chem., 2002, 37(5), 379-89

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明は、安全性が高ぐ経口投与可能で、汎用性のある GPCR阻害剤を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者は、上述した課題を解決するため、生体に存在し、高い安全性があることが確認されている生体成分に着目し、それらの生体成分に GPCR阻害活性があるかについて研究を行った。

[0010] 具体的には、 GPCRの代表例としてセロトニン受容体、ヒスタミン受容体、ムスカリン受容体を用い、アフリカッメガエル卵母細胞タンパク質発現系を用いた電気生理学的手法により、生体成分の阻害活性の有無を評価した結果、システィン、メチォニン、及びオル二チンに、セロトニン受容体、ヒスタミン受容体、及びムスカリン受容体に対する阻害活性が有ることを見出し、本発明を完成するに至った。

[0011] すなわち、本発明は、以下のとおりである。

(1)システィン、メチォニン、及びオル-チン並びにこれらのアミノ酸の骨格を含む誘導体力選ばれる 1種又は 2種以上力なる GPCR阻害剤。

(2) GPCRがセロトニン受容体、ヒスタミン受容体、及びムスカリン受容体から選ばれる受容体である前記 GPCR阻害剤。

(3)前記 GPCR阻害剤を有効成分として含有する医薬品であって、内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、若しくは歯科系疾患の治療又は予防に用いられる医薬。

(4)前記 GPCR阻害剤を含有し、 GPCR阻害作用を有する旨の表示を付した食品。

(5)前記 GPCR阻害剤の GPCR阻害活性を抑制する物質をスクリーニングする方法であって、

GPCR活性を測定するための GPCR活性測定系に、前記 GPCR阻害剤、又は前記 GPCR阻害剤及び被検物質を添加して、 GPCR活性を測定するステップと、前記測定系に前記 GPCR阻害剤のみ添加したときの GPCR活性と、前記 GPCR阻害剤及び被検物質を添加したときの GPCR活性を比較するステップと、

被検物質を添加したときに高い GPCR活性を示す被検物質を選択するステップと、を含む方法。

図面の簡単な説明

[0012] [図 1]セロトニン受容体に対するセロトニンの応答電流を示す図。

[図 2]ヒスタミン受容体に対するヒスタミンの応答電流を示す図。

[図 3]ムスカリン受容体に対する力ルバミルコリンの応答電流を示す図。

[図 4]セロトニン受容体に対するシスティンによる阻害を示す図。システィン非存在下の応答電流に対する、システィンが共存下の応答電流の比を縦軸に示した。

[図 5]セロトニン受容体に対するメチォニンによる阻害を示す図。メチォニン非存在下の応答電流に対する、メチォニンが共存下の応答電流の比を縦軸に示した。

[図 6]セロトニン受容体に対するオル-チンによる阻害を示す図。オル-チン非存在下の応答電流に対する、オル二チンが共存下の応答電流の比を縦軸に示した。

[図 7]ヒスタミン受容体に対するシスティンによる阻害を示す図。システィン非存在下の応答電流に対する、システィンが共存下の応答電流の比を縦軸に示した。

[図 8]ムスカリン受容体に対するシスティンによる阻害を示す図。システィン存在下の応答電流に対する、システィンが共存下の応答電流の比を縦軸に示した。

発明を実施するための最良の形態

[0013] 以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の GPCR阻害剤は、システィン、メチォニン、及びオル-チン並びにこれらのアミノ酸の骨格を含む誘導体力選ばれる 1種又は 2種以上力なる。尚、本明細、て、アミノ酸及びそれらの誘導体は!、ずれも L 体である。

前記アミノ酸の骨格とは、それらのアミノ酸を構成する炭素原子、 αァミノ基の窒素原子、並びにシスティン及びメチォニンにっヽてはこれらの原子に加えて硫黄原子力もなる骨格を意味する。前記アミノ酸の骨格を含む誘導体とは、前記骨格を維持しながら、 1又は 2以上の水素原子が他の置換基で置換された化合物をいう。このような誘導体として具体的には、シスチン、ホモシスチンチオラタトン、硫黄原子が、炭素数 1から 6の、分岐していてもよいアルキル基で置換されているシスティン、硫黄原子力炭素数 1から 6の、分岐していてもよいアルキル基で置換されているホモシスティンを含まれる。また、これらの誘導体に含まれる硫黄原子または窒素原子は任意に酸化されていてもよい。

[0014] 本発明において、前記アミノ酸又はその誘導体は単独で用いてもよぐまた任意の 2種又は 3種以上を混合して用いることもできる。

[0015] システィン、メチォニン、オル-チンは、該評価で行った複数の GPCRを阻害する作用を有しており、 GPCR阻害剤として使用することができる。尚、「GPCRを阻害する」とは、 GPCRにリガンドが結合し、グァニンヌクレオチド結合タンパク質を活性ィ匕してシグナルを伝達すること、その結果として引き続き生じる一連のシグナル伝達を介して起こりうる細胞の機能変化を阻害することを意味する。 [0016] 本発明の GPCR阻害剤は、 GPCRが関与する各種疾患の治療又は予防に用いる医薬品の有効成分して使用することができる。本発明の医薬品には、医薬及び医薬部外品が含まれる。

[0017] 前記 GPCRが関与する疾患としては、内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、及び歯科系疾患等が挙げられる。

[0018] 前記 GPCR阻害剤を含有する本発明の医薬品の適用方法としては、特に制限されず、経口投与又は非経口投与を採用することができる。非経口投与としては、注射、又は経皮投与等が挙げられる。

[0019] 本発明の医薬品の剤型は、特に制限されず、投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられる。これらの製剤は、製剤上の常套手段により調製することができる。

[0020] 上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マン二トール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレンダルコール、ヒドロキシェチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ァミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することちでさる。

[0021] 本発明の医薬品の有効投与量は、患者の年齢、体重、症状、患者の程度、投与経路、投与スケジュール、製剤形態、阻害活性の強さなどにより、適宜選択、決定される力例えば、経口投与の場合、システィン、メチォニン及びオル-チン並びにこれらの誘導体の合計量として、一般に 1日当たり 0. lgZ人〜 loogZ人程度、好ましくは、 1日当たり 20gZ人程度である。これらの投与量を、 1日に一度投与してもよぐ数回に分けて投与してもよい。アミノ酸であるシスティン、メチォニン、オル-チンは生体成分であることから、人体に対する毒性が低ぐ毎日、長期間に亘つて服用しても安全性の点で優れてヽると考えられる。

[0022] また、本発明の GPCR阻害剤は、食品に含有させることもできる。本発明の食品は、 GPCR阻害作用を有する旨の表示を付し、前記の GPCRが関与する各種疾患の治療又は予防に用いることができる。本発明の食品は、 GPCR阻害剤を含有させること以外は、通常の食品原料を用いて、通常の方法により製造することができる。食品の形態は特に問わず、固形であっても液状であってもよい。また、食品には、特定保健用食品、栄養剤、サプリメント等も含まれる。

[0023] また、本発明の GPCR阻害剤は、 GPCRが関与する各種疾患の予防又は治療効果を有する食品の成分として使用することができる。食品としては、システィン、メチォニンもしくはオル二チン又はこれらの誘導体を安定に保持できるものであれば特に制限されない。本発明の食品は、通常の食品の製造に用いられる食品原料に、システイン、メチォニンもしくはオル-チン又はこれらの誘導体を配合すること以外は、通常の食品の製造法にしたがって製造することができる。食品の形態としては特に制限されず、液状、粉条、固体状等のいずれであってもよい。

[0024] 本発明の GPCR阻害剤は、本発明の GPCR阻害剤に対するアンタゴニスト、すなわち本発明の GPCR阻害剤の持つ GPCR阻害活性を抑制する物質 (以下、「GPC R阻害活性抑制剤」ともいう。）をスクリーニングすることができる。このような GPCR阻害活性抑制剤は、生体内に存在するシスティン、メチォニン、オル-チンによって阻害を受ける GPCRが疾患に関係する場合に、その疾患に対する治療薬として開発することが期待できる。

[0025] スクリーニングに用いる GPCRは、セロトニン受容体、ヒスタミン受容体、ムスカリン受容体のいずれであってもよいが、システィン、メチォニン、オル-チンによって阻害を受けるものであれば、他の GPCRであってもよい。 GPCRは、天然物であっても糸且換え体であってもよい。また、 GPCRの由来は特に制限されず、哺乳動物であるヒト型やマウス型、下等動物である魚類、両生類、昆虫などの種由来の GPCRが挙げられる力これらの中ではヒト型又はマウス型が好ましい。

[0026] GPCR阻害活性抑制剤は、例えば以下のステップによりスクリーニングすることができるが、これらの工程に限定されるものではない。 [0027] i) GPCR活性を測定するための GPCR活性測定系に、本発明の GPCR阻害剤、又は本発明の GPCR阻害剤及び被検物質を添加して、 GPCR活性を測定する。

ii)前記測定系に本発明の GPCR阻害剤のみ添加したときの GPCR活性と、本発明の GPCR阻害剤及び被検物質を添加したときの GPCR活性を比較する。

iii)被検物質を添加したときに高い GPCR活性を示す被検物質を選択する。

[0028] 「GPCR活性」とは、 GPCRにリガンドが結合し、グァニンヌクレオチド結合タンパク質を活性ィ匕してシグナルを伝達すること、その結果として引き続き生じる一連のシグナル伝達を介して起こりうる細胞の機能変化に至る過程である。

[0029] GPCR活性の測定は、例えば、 GPCRを発現する細胞を用いた測定系を用いて行われる。前記細胞は、 GPCRを内在的に発現している細胞であっても、外来の GPC R遺伝子が導入された組換え細胞であってもよい。 GPCRの種類としては、実施例に挙げたセロトニン受容体、ヒスタミン受容体、ムスカリン受容体の中の 1つを選んでもよいし、他の GPCRでもよい。また、これらの受容体のサブタイプも特に制限されない。

[0030] GPCR活性測定系は、前記 GPCRを発現する細胞に各々の GPCRに特異的な細胞外リガンドを加えたときに、リガンドと GPCRとの結合を検出することができる力、又は、リガンドと GPCRとの結合に応答して細胞内に検出可能なシグナルを伝達するものであれば、特に制限なく使用することができる。

[0031] GPCR活性の測定方法としては、実施例に記載されたアフリカッメガエル卵母細胞を用、た電気生理学的方法の他にも、細胞内シグナル伝達を利用した方法 (Brandis h, P.E.,et. al (2003). Anal. Biochem., 313, 311- 318.)、又はリガンドと GPCRの結合を測定する方法などを用いることができる（Roth BL et.al(1998) Adv Pharmacol 42:48 2-485.) oこのとき、 GPCRの種類に応じて、種々の Gタンパク質、もしくは CFTR (cys tic fibrosis transmembrane conductance regulator)乂 ίま IRK ((J protein— activated ι nwardly rectifying K+ channel)のような補助因子を共発現させたり、 Gqタイプ Gタンパク質と Giタイプもしくは Gsタイプ Gタンパク質とのキメラタンパク質を利用したりすることによって、測定をより効率的にすることが可能である。

[0032] また、 GPCR活性ィ匕および細胞内シグナル伝達を利用する場合には、測定方法として、 GPCR活性ィ匕に伴う細胞代謝の変化を利用したり、細胞内伝達物質の局在又は量の変化を利用して測定することもできるが、これら以外にも GPCR評価方法ならどのようなものでも利用可能である。測定の形態は、方法に適したものが選択され、電気生理学的測定や細胞用マルチウエルプレートを用いた同時多検体測定が一例としてあげられる。

[0033] 次に、 GPCR活性を測定するための GPCR活性測定系に、 GPCR阻害剤、又は G PCR阻害剤及び被検物質を添加して、 GPCR活性を測定する。その際、 GPCR活性測定系に GPCRに対応するリガンドを添加する。 GPCR活性測定系に添加するリガンドの量は、予め GPCR阻害剤を添加せずに GPCR活性を測定することにより、作用濃度を調べておき、その濃度に応じて決定することができる。また、 GPCR阻害剤も、作用濃度を予め調べておき、 GPCR阻害作用を示す限り低濃度で GPCR活性測定系に添加することが好ま、。

[0034] GPCR阻害剤は、システィン、メチォニン、オル-チンの、ずれであってもよぐこれらの任意の混合物であってもよい。また、被検物質の濃度は、 GPCR活性測定系自体に影響を与えない限り、任意であってよい。さらに、被検物質は単一の化合物であつてもよく、複数の化合物を含む混合物又は組成物であってもよい。尚、リガンド、 G PCR阻害剤及び被検物質の GPCR活性測定系への添カ卩は、通常同時に行われる力 GPCR阻害剤の GPCR活性抑制活性を検出し得る限り、同時でなくてもよい。

[0035] 続!、て、 GPCR測定系に GPCR阻害剤のみ添カ卩したときの GPCR活性と、 GPCR 阻害剤及び被検物質を添加したときの GPCR活性を比較する。そして、被検物質を添加したときに高い GPCR活性を示す被検物質を選択する。

[0036] 上記の操作により、又は上記の操作を繰返すことによって、本発明の GPCR阻害剤の持つ GPCR阻害活性を抑制する物質又は複数の化合物を含む混合物又は組成物等をスクリーニングすることができる。

[0037] 上記のようにして選ばれた GPCR阻害活性抑制剤は、該 GPCRの新たな調節物質として、該 GPCRが関連する各種疾患の治療薬又はその候補として期待される。実施例

[0038] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 [0039] 〔実施例 1〕GPCR遺伝子の調製

セロトニン受容体サブタイプ 2A遺伝子、ヒスタミン受容体サブタイプ 1遺伝子、ムスカリン受容体サブタイプ 3遺伝子は、以下に示す PCR法で取得した。 NCBIに登録されて、る各受容体の DNA配列（各々順に GenBank accession NM_000621、 NM_00 0861、 NM_000740)を元に、 PCR法に用いるオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。セロトニン受容体遺伝子には配列番号 1及び 2に記載のプライマーを、ムスカリン受容体遺伝子には配列番号 3及び 4に記載のプライマーを、ヒスタミン受容体遺伝子には配列番号 5及び 6に記載のプライマーを使用した。

[0040] ヒト脳由来の cDNA (Clontech社製）を材料として、 Pfu ultra DNA Polymera se (Stratagene社製）を用い、以下の条件で PCRを実施した。 94°Cで 3分の後、 94 °Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 2分を 35回繰り返した後、 72°Cで 7分の反応を行つた。増幅産物の有無及び大きさは、ァガロース電気泳動法により確認した。

[0041] プラスミドベクター pBR322を制限酵素 EcoRV(Takara社製)によって切断した。その切断部位に PCRによって増幅された各遺伝子断片を Ligation Kit (Promega社製 )を用いて連結した。この反応溶液でェシエリヒア'コリ DH5 _a株を形質転換し、 PCR 増幅産物がクローユングされたプラスミドを保持する形質転換体を選抜した。各々の PCR増幅産物がセロトニン受容体遺伝子、ヒスタミン受容体遺伝子、又はムスカリン受容体遺伝子であることを、 DNA塩基配列解析によって確認した。これらの組換えプラスミドを铸型とし、 cRNA作製キット (Ambion社)を用いて各受容体遺伝子の cR NAを作製した。

[0042] 〔実施例 2〕各種試料の調製

アミノ酸試料として、各々特級グレードのァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、ノリン、オル-チン、タウリンの 22種類を用いた。各アミノ酸は、グルタミン酸、ァスパラギン酸、トリプトファンは 25mM、その他は lOOmMに以下の糸且成の緩衝液に溶解させた。 NaCl 96mM, KC1 2mM, MgCl ImM, CaCl 1. 8m

2 2

M, Hepes 5mM, pH = 7. 2。尚、グルタミン、システィンは用事調製し、他の試薬は調製後、— 20°Cに保存した。 pHは使用前に 7. 2となるよう調製した。

[0043] アフリカッメガエル卵母細胞の調製用の溶液、及びリガンド溶液にも、前記緩衝液を使用した。また、卵母細胞の培養用の培地には、同緩衝液に 2mMピルビン酸と 10

U/mlペニシリンと 10 μ g/mlストレプトマイシンを加えたものを使用した。

[0044] 〔実施例 3〕アフリカッメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的測定による GPCR評価

GPCR活性及び GPCR阻害の測定方法は、アフリカッメガエル卵母細胞発現系を用いた。任意の GPCRを発現させたアフリカッメガエル卵母細胞に、各リガンドを添加すると、細胞内の Caイオンが増加する。次に Ca濃度イオン依存性 C1チャネルが開き、イオン電流として細胞内電流値が変化する。この細胞内電流値の変化を測定することで、 GPCR活性及び GPCR阻害の有無を知り得ることが出来る。

[0045] アフリカッメガエル腹部を切開し、卵塊を取り出した後、 1%コラゲナーゼ溶液により 20°Cで 2時間処理して卵母細胞を分散させることにより、卵母細胞を得た。 1個あたりの卵母細胞に、マイクロガラスキヤピラリーを用いて 50nlの受容体 cRNA溶液（1 μ g Z 1)又は 50nlの滅菌水を導入した。卵母細胞は、直径 5cmのシャーレに 10mlの前記培地で 18°Cにて 2〜3日培養した。

[0046] 電気生理学的測定は、増幅器 Geneclamp500 (Axon社製）および記録用ソフト A X_OS_COpe9.0 (Ax_On社製)を用いて行った。培養後、卵母細胞を 2電極膜電位固定法により― 70mVに膜電位固定し、 Ca濃度イオン依存性 C1イオンを介した細胞内電流を測定した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。

[0047] 膜電位固定した各々の卵母細胞に対し、終濃度が下記の括弧内に示されたリガンド溶液を添加した。各リガンドは、ナカライテスタ社から入手した。セロトニン受容体 cR NAを導入した卵母細胞にはセロトニン（ΙΟηΜ)、ヒスタミン受容体を導入した卵母細胞にはヒスタミン（ΙΟηΜ)、ムスカリン受容体を導入した卵母細胞には力ルバミルコリン（30nM)を添カ卩した。

[0048] リガンドを添加した後、各々の細胞の Ca濃度イオン依存性 C1イオン電気応答を測定した。リガンド濃度と電流応答の関係を図 1〜3に示す。この結果より、卵母細胞に導入したセロトニン受容体、ヒスタミン受容体、ムスカリン受容体の cRNAが機能的に発現して!/ヽること、 GPCR評価法が完成されたことが確認された。

[0049] 〔実施例 4〕セロトニン受容体に対するアミノ酸の阻害活性の評価

セロトニン受容体に対する種々のアミノ酸の阻害活性の有無を以下のように評価した。実施例 3に記載した方法を用いて、セロトニン受容体遺伝子を導入した卵母細胞を調製し、 2電極膜電位固定法により— 70mVに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞にアミノ酸を 1種類ずつ添カ卩した後、セロトニン（ΙΟηΜ)を添カ卩し、 Ca イオン濃度依存性 C1電流応答を測定した。試験したアミノ酸及びその最終濃度は、以下のとおりである。ァラニン（lOmM)、アルギニン（lOmM)、ァスパラギン（lOmM )、ァスパラギン酸（lOmM)、システィン（lOmM)、グルタミン（lOmM)、グルタミン酸（lOmM)、グリシン（lOmM)、ヒスチジン（lOmM)、イソロイシン（lOmM)、口イシン（10mM)、リジン（lOmM)、メチォ-ン（lOmM)、フエ-ルァラニン（lOmM)、プ口リン（lOmM)、セリン（10mM)、トレオ-ン（10mM)、トリプトファン（lOmM)、チロシン（lOmM)、パリン（lOmM)、オル-チン（lOmM)、タウリン（10mM)。

[0050] 阻害活性の有無は、アミノ酸溶液存在下におけるリガンド溶液の応答電流値をリガンド溶液単独添加時の応答電流値で割った比で表した。すなわちアミノ酸非存在下の応答電流比は 1となり、アミノ酸に阻害活性が見られる場合は応答電流比が 1より小さい値を示す。セロトニンに対する電流応答比力 0.6以下に減少させる場合を阻害活性有りとして判定した。結果、システィン、メチォニン、オル-チンを添加した場合にのみ、セロトニン受容体の阻害活性が見られた。システィン、メチォニン、オル- チン以外のアミノ酸に関しては、阻害活性は認められな力つた (表 1)。

[表 1]

表 1

ァラニンアルギニンァスパラギンァスハ。ラキ'ン酸システィン

0. 76 1. 13 0. 91 0. 89 0. 18 グルタミングルタミン酸グリシンヒスチジンイソロイシン 1. 09 0. 92 0. 81 1. 02 1. 09 ロイシン 11ジンメチォニンフエ二ルァラニンプロリン 0. 89 0. 93 0. 57 1. 01 1. 15 セリン卜レオニントリフ。トフアンチロシンバリン

0. 97 0. 92 1. 11 0. 89 0. 82 オル二チンタウリン

0. 35 1. 07 [0051] 〔実施例 6〕 3種類のアミノ酸のセロトニン受容体阻害活性の濃度依存性評価阻害活性の認められた 3種類のアミノ酸について、セロトニン受容体に対する阻害活性の濃度依存性評価を以下の方法で行った。実施例 3に記載した方法を用いて、セロトニン受容体遺伝子を導入した卵母細胞を調製し、 2電極膜電位固定法により 70mVに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に阻害活性を評価する 3種類のアミノ酸を 1種類ずつ添カ卩した後、セロトニン（ΙΟηΜ)を添カ卩し、 Caイオン濃度依存性 C1電流応答を測定した。各アミノ酸濃度は以下の 3点で行った。システィン（1 mM、 3mM、 5mM)、メチォニン（lmM、 5mM、 10mM)、オル-チン（lmM、 5m M、 10mM)。結果を図 4〜6に示す。

[0052] 〔実施例 7〕 GPCRに対するシスティンの阻害活性の濃度依存性評価

セロトニン受容体以外の GPCRとして、ヒスタミン受容体、ムスカリン受容体に対するシスティンの阻害活性の評価を、以下の方法で行った。実施例 3に記載した方法を用いて、ヒスタミン受容体遺伝子又はムスカリン受容体遺伝子を導入した卵母細胞を調製し、 2電極膜電位固定法により— 70mVに膜電位固定した。膜電位固定した卵母細胞にシスティン（lmM、 3mM、 5mM)を添カ卩した後、ヒスタミン（ΙΟηΜ)又は力ルバミルコリン（30nM)を添加し、 Caイオン濃度依存性 C1電流応答を測定した。結果を図 7〜8に示す。その結果、システィンを添加した場合に、セロトニン受容体と同様に、ヒスタミン受容体とムスカリン受容体に対する濃度依存的な阻害活性が認められた。

産業上の利用の可能性

[0053] 本発明により、安全性が高ぐかつ汎用性のある GPCR阻害剤が提供される。

Claims

請求の範囲

[1] システィン、メチォニン、及びオル-チン並びにこれらのアミノ酸の骨格を含む誘導体力も選ばれる 1種又は 2種以上力もなる Gタンパク質共役型受容体 (GPCR)阻害剤。

[2] GPCRがセロトニン受容体、ヒスタミン受容体、及びムスカリン受容体から選ばれる受容体である請求項 1に記載の GPCR阻害剤。

[3] 請求項 1に記載の GPCR阻害剤を有効成分として含有する医薬品であって、内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、若しくは歯科系疾患の治療又は予防に用いられる医薬品。

[4] 請求項 1に記載の GPCR阻害剤を含有し、 GPCR阻害作用を有する旨の表示を付し/こロロ ο

[5] 請求項 1に記載の GPCR阻害剤の GPCR阻害活性を抑制する物質をスクリーニングする方法であって、