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WO2006108201A1 - Promotor zur expression von fremdgenen in neuronalen zellen - Google Patents

Promotor zur expression von fremdgenen in neuronalen zellen Download PDF

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WO2006108201A1
WO2006108201A1 PCT/AT2006/000140 AT2006000140W WO2006108201A1 WO 2006108201 A1 WO2006108201 A1 WO 2006108201A1 AT 2006000140 W AT2006000140 W AT 2006000140W WO 2006108201 A1 WO2006108201 A1 WO 2006108201A1
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WO
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nucleic acid
sequence
promoter
gene
acid sequence
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/AT2006/000140
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English (en)
French (fr)
Inventor
Manfred Windisch
Ulrike Bauer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JSW-RESEARCH FORSCHUNGSLABOR GmbH
JSW Research Forschungslabor GmbH
Original Assignee
JSW-RESEARCH FORSCHUNGSLABOR GmbH
JSW Research Forschungslabor GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP06721198A priority patent/EP1869178A1/de
Priority to AU2006235186A priority patent/AU2006235186A1/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
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    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
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    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/40—Vector systems having a special element relevant for transcription being an insulator

Definitions

  • the invention relates to a promoter for the expression of foreign genes in neuronal cells.
  • a promoter represents a regulatory start-up sequence important to gene expression within the genome of each organism; it determines if, how and to what extent the transcription of a gene into messenger RNA (mRNA) takes place.
  • mRNA messenger RNA
  • strong and weak promoters ie, those that cause the formation of numerous or less numerous mRNA transcripts of the gene
  • constitutive constantly active
  • inducible ie, those that control transcription depending on particular conditions
  • tissue-specific promoters tissue-specific promoters.
  • the neuron-specific Thyl promoter of the mouse has already been used several times to generate transgenic mice that express foreign genes in their central nervous system. Such mouse strains represent important instruments, in particular for the investigation of the molecular mechanisms of neurodegenerative diseases and for the development of related potential therapies.
  • the mThyl promoter is an atypical promoter without TATA box. It consists of two identical promoter nonamers, each followed by a short untranslated exon (exons Ia and Ib). Exon Ib is followed by intron A followed by the first translated exon (exon 2). This is followed by exons 3 and 4, each separated by another intron (introns B and C).
  • This sequence (first promoter-nonamer up to and including exon 4) is flanked by untranslated regions (5'- and 3'-UTR), with the 3'UTR containing the poly A signal. It is believed that the 5 'UTR, exons Ia and Ib, and intron A have regulatory properties that may also be responsible for neuron-specific expression of the promoter (E. Spanopoulou et al., Mol. Cell. Biol 8: 3847-3856 and 1991; 11 (4): 2216-2228). The original mThyl promoter also displayed expression in the thymus in addition to neuronal expression. By deleting the region from exon 2 to exon 4, thymus expression could be eliminated (HA Ingraham and GA Evans, Mol.
  • the mThyl deletion deletion promoter of exon 2-4 was and is used to direct transgene expression in the generation of transgenic animals to specifically express the corresponding transgene in the neurons.
  • transgenic mice that express a mutated alpha-synuclein protein found in a rare hereditary form of Parkinson's disease under mThyl promoter control exhibit similar symptoms as the corresponding patients (H. van der Putten et al. J Neurosci 2000; 20 (16): 6021-9; B. Sommer et al., Exp Gerontol 2000; 35 (9-10): 1389-403).
  • the thyl promoter has significant disadvantages.
  • the considerable size of the thyl promoter makes it difficult for genetic engineering work, especially for the installation of larger gene constructs, difficult to handle.
  • the promoter size considerably restricts the size of the gene to be transferred.
  • the thyl promoter is often not strong enough to effect expression of the foreign gene in the transgenic animals to the desirable extent. It was therefore the object of the invention to modify the known mThyl promoter structure so that
  • Promotors can be solved, the only certain (original or slightly different) partial sequences of the mThyl promoter in
  • the invention relates to a promoter comprising a nucleic acid sequence derived from Thy-1 mammals which effects the neuron-specific transcription of a heterologous, 3 'downstream promoter nucleic acid sequence in both mammalian and non-mammalian cells.
  • the invention further relates to a nucleic acid sequence consisting of the sections
  • the invention further relates to a nucleic acid construct comprising an expression cassette comprising the portions (a), (b), (c), (d), (e), (f) and (g) characterized according to claim 2 and a heterologous Nucleic acid sequence positioned between and operatively linked to sections (e) and (f) is associated with.
  • the invention further relates to advantageous embodiments of this nucleic acid construct as disclosed according to claims 4 to 8.
  • the invention relates to an isolated cell or cell line comprising the promoter according to claim 1.
  • the invention also relates to an isolated cell or
  • a cell line comprising the nucleic acid sequence of claim 2.
  • This isolated cell or cell line advantageously comprises
  • the invention relates to a transgenic non-human animal comprising the promoter according to claim 1.
  • the invention also relates to a transgenic non-human animal comprising the nucleic acid sequence according to claim 2.
  • the transgenic non-human animal advantageously comprises a nucleic acid construct according to any one of claims 3 to claim 8.
  • the invention relates to a method for gene expression in neuronal and non-neuronal cells, which comprises the transformation / transfection of the cells with a vector comprising the nucleic acid sequence according to claim 2 or a nucleic acid construct according to any one of claims 3 to 8.
  • the invention relates to advantageous embodiments of this method with the features according to claims 16 to 18.
  • the invention relates to the use of a vector comprising the nucleic acid sequence of claim 2 or a nucleic acid construct according to any one of claims 3 to 8 for the preparation of injection solutions, which are for injecting in the central nervous system or in the cerebrospinal fluid are suitable.
  • the invention relates to the use of a vector comprising the nucleic acid sequence according to claim 2 or a nucleic acid construct according to one of claims 3 to 8 for the preparation of injection solutions for the treatment of neuronal functional disorders, such as stroke, ischemia, epilepsy, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's Disease, Brain and Spinal Cord Trauma, Amyotrophic Lateral Sclerosis.
  • neuronal functional disorders such as stroke, ischemia, epilepsy, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's Disease, Brain and Spinal Cord Trauma, Amyotrophic Lateral Sclerosis.
  • the invention relates to the use of a vector comprising the nucleic acid sequence of claim 2 or a nucleic acid construct according to any one of claims 3 to 8 for the preparation of Injection solutions for the treatment of neurogenic disorders.
  • the invention relates to a kit for the expression of recombinant gene products comprising isolated cells or cell lines according to one of claims 9 to 11.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a promoter according to claim 1.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a protein which is encoded by the nucleic acid sequence according to claim 2.
  • the invention further relates to a medicament comprising a nucleic acid construct according to one of claims 3 to 8.
  • Possible ways to carry out the invention can be represented as follows: starting from the mThyl expression cassette (Moechars et al., 1996, EMBO J. 15 (6), 126574), which has an original size of about 8.2 kb and which instead of the When mThyl Exons 2 to 4 contains an Xho I linker, larger deletions were made with the help of restriction endonucleases, followed by smaller insertions, resulting in a 1.6 kb promoter cassette.
  • the mThyl expression cassette was cleaved with Sma I, thereby removing the region adjacent to the 5 'end of the MThyl 5'-UTR.
  • the resulting construct into which 3 'terminal of mThyl intron A the eGFP reporter gene (coded for a green fluorescent protein, which is harmless for the mouse and serves as a fluorescence microscopic marker), was integrated by transfection into two neuronal cell lines (SH- SY5Y and Neuro-2A) for promoter activity (eGFP expression).
  • mTUB promoter mouse T_hylsable for brain expression; see Figure 3 for the sequence.
  • mTUB promoter mouse T_hylsable for brain expression; see Figure 3 for the sequence.
  • the functionality was transfected into SH-SY5Y and neuro-2A cells and control of eGFP expression compared to eGFP construction under the control of the unchanged mThyl promoter (s) for human platelet-derived growth factor (hPDGF ) and cytomegalovirus (CMV), as shown below.
  • s mThyl promoter
  • hPDGF human platelet-derived growth factor
  • CMV cytomegalovirus
  • Promoter properties may be different in vitro and in vivo.
  • the intrinsic neuron-specific mThyl promoter after transfection of the hamster ovarian cell line CHO-Kl with a mThyl / eGFP construct causes strong expression of the eGFP reporter gene.
  • mTUB-eGFP-tg transgenic mouse strain
  • the mTUB-eGFP transgenic mouse strain was generated as follows, whereby for microinjection the promoter-gene construct was incorporated into an insulator cassette (chicken- ⁇ -globin insulator sequences) which should facilitate expression and protect against foreign regulation (plasmid pC2xINS, JSW Research). 1. Preparation and Preparation of the Vector for Microinjection:
  • mTUB-eGFP construct has Not I or Nde I ends; Nde I end is filled in with polymerase I Klenow fragment
  • the linear insulator mTUB-eGFP insulator construct was isolated from a 0.8% TAE agarose gel without ethidium bromide, purified and diluted with microinjection buffer such that there were 1000 DNA molecules per injection volume. The injection was carried out according to the standard protocol (Brem et al., 1985). 3 weeks old hormone-treated female CB6F1 were used for this purpose
  • mice mated with C57BL / 6 males.
  • the resulting fertilized CB6F1 (B6) oocytes were removed and cultured until two clear pronuclei were visible.
  • the purified DNA construct was then injected into the pronucleus followed by overnight culture through to
  • the control gene eGFP was used to characterize promoter properties and transgene expression as quickly and easily as possible.
  • the eGFP gene can be replaced by any other neuron-specific gene to be expressed (see Fig. 3, sequence of the mTUB promoter cassette).
  • the functional regions are assigned to the following nucleotide regions in the sequence:
  • control gene eGFP (not part of the disclosure)
  • the coding sequence which extends from nucleotide 1393 to 2112, represents the reporter gene eGFP, which is not part of the disclosure. Following the reporter gene sequence is the late SV40 poly A
  • the following table shows a comparison of the mTUB promoter according to the invention with the unchanged murine thyl promoter, as well as the promoters of the human platelet-derived growth factor (hPDGF) and the cytomegalovirus (CMV).
  • hPDGF human platelet-derived growth factor
  • CMV cytomegalovirus
  • the mTUB promoter in both neuronal cell lines is the mThyl promoter both in terms of transfection efficiency as well as the expression intensity far superior.
  • mTUB achieved a 25-fold higher transfection efficiency than the hPDGF promoter with approximately the same average signal intensity
  • Neuro-2A cells a 1.5-fold higher transfection efficiency than the hPDGF promoter at approximately 6-fold average signal intensity.
  • the transfection efficiency is comparable to that of the CMV promoter, with significantly higher average signal intensity (in Neuro-2A).
  • FIG. 4 shows fluorescence microscopic images of brain sections of the transgenic mouse strain mTUB-eGFP-tg in comparison to the corresponding nontransgenic strain C57BI6 ntg.
  • the cerebral sections clearly show the eGFP-expressing neurons of the transgenic mouse compared to the eGFP-negative brain section of the non-transgenic mouse.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Promotor umfassend eine Thy-1 Säugetieren abgeleitete Nukleinsäuresequenz, welche die neuronenspezifische Transkription einer heterologen, 3' -abwärts zum Promotor befindliche Nukleinsäuresequenz sowohl in Säuger- als auch in Nicht-Säugerzellen bewirkt.

Description

Promotor zur Expression von Fremdgenen in neuronalen Zellen
Die Erfindung betrifft einen Promotor zur Expression von Fremdgenen in neuronalen Zellen. Ein Promotor stellt eine für die Genexpression wichtige regulatorische Startsequenz innerhalb des Genoms eines jeden Organismus dar; er bestimmt ob, wie und in welchem Ausmaß die Transkription eines Gens in Boten-RNA (mRNA) stattfindet. Es gibt „starke" und „schwache" Promotoren (d.h. solche, die die Bildung von zahlreichen oder weniger zahlreichen mRNA-Transkripten des Gens bewirken) , sowie konstitutive (ständig aktive) , induzierbare (d.h. solche, die Transkription in Abhängigkeit von bestimmten Bedingungen steuern) und gewebespezifische Promotoren.
Der neuronenspezifische Thyl-Promotor der Maus wurde bereits mehrfach eingesetzt um transgene Mäuse zu erzeugen, die Fremdgene in ihrem Zentralnervensystem exprimieren. Solche Mausstämme stellen wichtige Instrumente insbesondere zur Erforschung der molekularen Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen sowie zur Entwicklung diesbezüglicher potentieller Therapien dar. Bei dem mThyl-Promotor handelt es sich um einen atypischen Promotor ohne TATA-Box. Er setzt sich aus zwei identischen Promotor-Nonameren zusammen, denen jeweils ein kurzes nicht translatiertes Exon folgt (Exon Ia und Ib) . An Exon Ib schließt sich das Intron A an, welches von dem ersten translatierten Exon (Exon 2) gefolgt wird. Darauf folgen die Exons 3 und 4, jeweils durch ein weiteres Intron voneinander getrennt (Introns B und C) . Diese Sequenz (erstes Promotor-Nonamer bis inklusive Exon 4) wird von nicht-translatierten Regionen flankiert (5'- und 3'-UTR), wobei die 3' -UTR das Poly-A-Signal beinhaltet. Es wird angenommen, dass die 5'-UTR, die Exons Ia und Ib sowie das Intron A regulatorische Eigenschaften besitzen, die auch für die neuronenspezifische Expression des Promotors verantwortlich sein können (E. Spanopoulou et al., Mol. Cell. Biol. 1988; 8: 3847-3856 and 1991; 11(4): 2216-2228). Der ursprüngliche mThyl-Promotor zeigte zusätzlich zur neuronalen Expression auch eine Expression im Thymus. Durch die Deletion des Bereiches von Exon 2 bis Exon 4 konnte die Thymusexpression ausgeschaltet werden (H.A. Ingraham and G.A. Evans, Mol. Cell. Biol. 1986; 6(8): 2923-2931; M. Vidal et al., EMBO 1990; 9(3): 833-840). Der mThyl-Promotor mit Deletion von Exon 2-4 wurde und wird zur Steuerung der Transgen-Expression bei der Generierung transgener Tiere verwendet, um das entsprechende Transgen spezifisch in den Neuronen zu exprimieren. So weisen beispielsweise transgene Mäuse, die ein bei einer seltenen erblichen Form der Parkinson' sehen Krankheit gefundenes mutiertes alpha-Synuklein-Protein unter mThyl-Promotor-Kontrolle exprimieren, ähnliche Symptomatik auf wie die entsprechenden Patienten (H. van der Putten et al . , J Neurosci. 2000; 20(16): 6021-9; B. Sommer et al . , Exp Gerontol. 2000; 35(9-10): 1389-403). Ähnliche murine Tiermodelle existieren für bestimmte menschliche Tauopathien, bei denen mutierte Formen des mit den Mikrotubuli assoziierten Proteins Tau gefunden werden (J. Götz et al . , J Biol Chem. 2001; 276(1): 529-34). Sehr verbreitet eingesetzt werden Tiermodelle der Alzheimer' sehen Krankheit, in denen Amyloid Precursor Protein (APP, das Vorläuferprotein des Beta-Amyloids, das in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten die sogenannten Plaques bildet unter Thyl-Kontrolle exprimiert bzw. überexprimiert werden. Dabei kann sowohl normales Amyloid (E. Masliah und E. Rockenstein, J Neural Transm Suppl . 2000; 59: 175-83) als auch mutiertes Amyloid aus bekannten erblichen Formen der Alzheimer- Demenz (J. Davis et al . , J Biol Chem. 2004; 279(19): 20296-306) gebildet werden.
Jedoch hat der Thyl-Promotor entscheidende Nachteile. Die erhebliche Größe des Thyl-Promotors macht ihn für gentechnische Arbeiten, insbesondere für den Einbau größerer Genkonstrukte, schwer handhabbar.
Angesichts der Tatsache, dass die für die Generierung transgener Tiere ebenfalls verwendbaren viralen Vektoren nur begrenzte Mengen an Fremd-DNA aufnehmen können, schränkt die Promotorgröße die Größe des zu übertragenden Gens erheblich ein. Ferner ist der Thyl-Promotor oft nicht stark genug, um in den transgenen Tieren eine Expression des Fremdgens im wünschenswerten Ausmaß zu bewirken. Es stellte sich daher die erfindungsgemäße Aufgabe, die bekannte mThyl-Promotorstruktur so zu modifizieren, dass
a) die Promotorgröße derart verkleinert wird, dass seine
Verwendung für gentechnische Arbeiten erleichtert und die Übertragung größerer Fremdgene bzw. Genfragmente mit stabilen Vektoren ermöglicht wird, b) die Expression dieser Fremd-DNA in den so erzeugten transgenen Mäusen signifikant erhöht wird und c) die Expression des von dem Promotor zu kontrollierenden Transgens neuronenspezifisch erfolgt.
Es stellte sich nunmehr heraus, dass die oben beschriebene
Aufgabe durch die Konstruktion eines gentechnisch veränderten
Promotors gelöst werden kann, der nur bestimmte (ursprüngliche oder geringfügig veränderte) Teilsequenzen des mThyl-Promotors in
Kombination mit anderen regulatorischen Elementen enthält.
Die Erfindung betrifft einen Promotor umfassend eine von Thy- 1 Säugetieren abgeleitete Nukleinsäuresequenz, welche die neuronenspezifische Transkription einer heterologen, 3' -abwärts zum Promotor befindlichen Nukleinsäuresequenz sowohl in Säugerais auch in Nicht-Säugerzellen bewirkt.
Die Erfindung betrifft weiters eine Nukleinsäuresequenz bestehend aus den Abschnitten
(a) der mThyl 5' -„untranslated region" (UTR), der 5'-UTR vorgelagerten 20bp umfassenden Sequenz und der Sequenz des ersten nonameren Promotors bestehend aus 9 Nukleotiden und flankierenden Regionen des Maus-Thy-1-Gens
(b) der Sequenz des Exons Ia des Maus-Thy-1-Gens
(c) der Sequenz des zweiten nonameren Promotors bestehend aus 9 Nukleotiden des Maus-Thy-1-Gens
(d) der Sequenz des Exons Ib des Maus-Thy-1-Gens
(e) der kompletten oder teilweisen Sequenz des Introns A des Maus-Thy-1- Gens
(f) der Sequenz eines PoIy A Signals (g) der Säuger-Thy-1-Gen-Promotorsequenz, welche mit der unter (a) , (b) , (c) , (d) , (e) und (f) beschriebenen Sequenz hybridisiert, wobei die Promotorsequenz, wenn sie kombiniert wird mit einer heterologen Gensequenz, diese neuronenspezifisch sowohl in Säuger- als auch in Nicht- Säugerzellen transkribiert.
Die Erfindung betrifft weiters ein Nukleinsäure-Konstrukt, umfassend eine Expressionskassette, welche die gemäß Anspruch 2 gekennzeichneten Abschnitte (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) und (g) sowie eine heterologe Nukleinsäure-Sequenz, welche zwischen den Abschnitten (e) und (f) positioniert und operativ mit diesen assoziiert ist, enthält. Die Erfindung betrifft weiters vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Nukleinsäure-Konstruktes wie sie gemäß Ansprüchen 4 bis 8 offenbart sind.
Die Erfindung betrifft eine isolierte Zelle oder Zelllinie umfassend den Promotor nach Anspruch 1.
Die Erfindung betrifft ebenso eine isolierte Zelle oder
Zelllinie umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2. Diese isolierte Zelle oder Zelllinie umfasst vorteilhafter Weise ein
Nukleinsäure-Konstrukt mit den Merkmalen nach den Ansprüchen 3 bis 8.
Die Erfindung betrifft ein transgenes nicht-menschliches Tier, umfassend den Promotor nach Anspruch 1.
Die Erfindung betrifft ebenso ein transgenes nichtmenschliches Tier, umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2. Dabei umfasst das transgene nicht-menschliche Tier vorteilhafter Weise ein Nukleinsäure-Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis Anspruch 8.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Genexpression in neuronalen und nicht-neuronalen Zellen, welches die Transformation/Transfektion der Zellen mit einem Vektor umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder ein Nukleinsäure- Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 8 beinhaltet.
Die Erfindung betrifft vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Verfahrens mit den Merkmalen gemäß Ansprüchen 16 bis 18. Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Vektors umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder ein Nukleinsäure- Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 8 zur Herstellung von Injektionslösungen, welche für das Injizieren in das Zentralnervensystem oder in die Zerebrospinalflüssigkeit geeignet sind.
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Vektors umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder ein Nukleinsäure- Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 8 zur Herstellung von Injektionslösungen zur Behandlung von neuronalen Funktions- Störungen, wie Schlaganfall, Ischämie, Epilepsie, Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer, Morbus Huntington, Hirn- und Rückenmarkstrauma, Amyotrophe Lateralsklerose.
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Vektors umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder ein Nukleinsäure- Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 8 zur Herstellung von Injektionslösungen zur Behandlung von neurogenetischen Funktionsstörungen.
Die Erfindung betrifft einen Kit zur Expression rekombinanter Genprodukte umfassend isolierte Zellen oder Zelllinien nach einem der Ansprüche 9 bis 11.
Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel umfassend einen Promotor nach Anspruch 1.
Die Erfindung betrifft ebenso ein Arzneimittel umfassend ein Protein, welches durch die Nukleinsäureseqenz gemäß Anspruch 2 codiert ist.
Die Erfindung betrifft weiters ein Arzneimittel umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 8.
Mögliche Wege zur Ausführung der Erfindung lassen sich wie folgt darstellen: Ausgehend von der mThyl-Expressionskassette (Moechars et al . 1996, EMBO J. 15(6), 126574), welche eine ursprüngliche Größe von ca. 8.2 kb hat und die anstelle der mThyl Exons 2 bis 4 einen Xho I - Linker enthält, wurden mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen größere Deletionen gesetzt und anschließend kleinere Insertionen vorgenommen, sodass am Ende eine nur 1.6 kb große Promotorkassette entstand.
Ausgehend von der mThyl-Expressionskassette (Moechars et al . 1996, EMBO J. 15(6), 126574), welche eine ursprüngliche Größe von ca. 8.2 kb hat und die anstelle der mThyl Exons 2 bis 4 einen Xho I - Linker enthält, wurden mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen größere Deletionen gesetzt und anschließend kleinere Insertionen vorgenommen, sodass am Ende eine nur 1.6 kb große Promotorkassette entstand.
Im ersten Schritt wurde die mThyl-Expressionskassette mit Sma I gespalten und damit der am 5' -Ende an die mThyl 5'-UTR angrenzende Bereich entfernt. Das entstandene Konstrukt, in welches 3' -terminal vom mThyl Intron A das eGFP Reportergen (kodiert für ein Green Fluorescent Protein, das für die Maus harmlos ist und als fluoreszenzmikroskopischer Marker dient) integriert wurde, wurde mittels Transfektion in zwei neuronale Zelllinien (SH-SY5Y und Neuro-2A) auf Promotoraktivität (eGFP- Expression) hin untersucht.
In einem zweiten Schritt wurde die Sequenz mit den
Restriktionsenzymen Nco I und Nde I verdaut, wodurch Teile des mThyl Introns A, das Kontrollgen eGFP, die mThyl 3'-UTR samt dem mThyl PoIy A - Signal und den 3' flankierenden mThyl- Sequenzbereichen entfernt wurden. Anstelle dessen wurde eine Sequenz bestehend aus der eGFP-Sequenz und dem „late SV40 PoIy A Signal" mit der verkleinerten mThyl-Promotorsequenz ligiert. Die vorgenannten Schritte sind in Abb.l, dem Korrelanzdiagramm mThyl- Gensequenz (A) / mThyl Promotorkassette (B) / mTUB Promotorkassette (C), dargestellt. Oberhalb der jeweiligen Abbildung ist der mThyl-Anteil beschriftet, unterhalb der Nicht-mThyl-Anteil .
Die so entstandene Sequenz exklusive der eGFP-Gensequenz wurde als mTUB-Promotor bezeichnet (mouse T_hyl üsable for Brain expression; Sequenz siehe Abb. 3). Auch hier wurde die Funktionalität mittels Transfektion in SH-SY5Y und Neuro-2A-Zellen und Kontrolle der eGFP-Expression im Vergleich zu eGFP- Konstruktion unter der Kontrolle des unveränderten mThyl-Promotors bzw. der Promotoren für humanen Platelet-Derived Growth Factor (hPDGF) und Cytomegalovirus (CMV) , wie im folgenden dargestellt, bestätigt.
Promotoreigenschaften können in vitro und in vivo unterschiedlich sein. So bewirkt z.B. der an sich neuronenspezifische mThyl-Promotor nach Transfektion der Hamster- Ovarienzellinie CHO-Kl mit einem mThyl/eGFP-Konstrukt eine starke Expression des eGFP-Reportergens . Um einerseits den erfindungsgemäßen Promotor mTUB umfassend charakterisieren zu können und andererseits den zweiten Teil der erfindungsgemäßen Aufgabe zu lösen (Neuronenspezifität) , wurde ein transgener Mausstamm (mTUB-eGFP-tg) generiert, welcher eGFP unter der Kontrolle des mTUB Promotors exprimiert. Abbildung 4 zeigt Fluoreszenzmikrographien von Hirnschnitten dieses Mausstammes. In den Neuronen des transgenen Mausstammes konnte eine eindeutige eGFP-Expression nachgewiesen werden. Schnitte durch verschiedenste Organe des transgenen Mausstammes zeigten außer eGFP-positiven Nervenzellen keine eGFP-positiven Körperzellen. Es kann eindeutig gezeigt werden, dass der mTUB-Promotor das Gen, welches unter seiner Kontrolle steht, neuronenspezifisch exprimiert. Der mTUB-eGFP-transgene Mausstamm wurde wie folgt generiert, wobei zur Mikroinjektion das Promotor-Gen-Konstrukt in eine Insulatorkassette (Huhn-ß-globin Insulator-Sequenzen) eingebaut wurde, welche die Expression erleichtern und vor Fremdregulation schützen soll (Plasmid pC2xINS, JSW-Research) . 1. Herstellen und Vorbereiten des Vektors zur Mikroinjektion:
• Ausgangsplasmid = pmTUB-eGFP (JSW-Research)
• Verdau mit Not I, Pvu I und Nde I zur Gewinnung des Promotor-Insert-Konstruktes
• mTUB-eGFP-Konstrukt hat Not I- bzw. Nde I-Enden; Nde I- Ende wird mit Polymerase I Klenow-Fragment aufgefüllt
• Einbau des mTUB-eGFP-Konstruktes in den mit Not I und PmI I geöffneten Insulatorvektor pC2xINS • Sequenzierung der Klonierungsübergänge
• Entfernung der Vektorsequenzen (pKO Backbone) und Linearisierung des Insulator-mTUB-eGFP-Insulator- Konstruktes mit MIu I, siehe Abb. 2: Konstrukt vor Linearisierung • Gelelution des linearen Konstruktes „Insulator-mTUB- eGFP-Insulator" (7280 bp)
2. Mikroinjektion des linearen Konstruktes
Für die Mikroinjektion wurde das lineare Insulator-mTUB- eGFP-Insulator-Konstrukt aus einem 0.8% TAE-Agarosegel ohne Ethidiumbromid isoliert, gereinigt und soweit mit Mikroinjektionspuffer verdünnt, dass pro Injektionsvolumen 1000 DNA-Moleküle vorhanden waren. Die Injektion erfolgte laut Standardprotokoll (Brem et al . , 1985). Dazu wurden im Vorfeld 3 Wochen alte hormonbehandelte weibliche CB6F1
Mäuse mit C57BL/6 Männchen verpaart. Die resultierenden befruchteten CB6F1(B6) Oozyten wurden entnommen und kultiviert, bis zwei klare Pronuklei sichtbar waren. Das gereinigte DNA-Konstrukt wurde dann in den Pronukleus injiziert gefolgt von einer Übernacht-Kultivierung bis zum
Zweizellstadium. Die Zweizell-Embryonen wurden dann in pseudopregnante Fostermäuse implantiert. Nach 18-19 Tagen wurden die Jungen geboren.
Das Kontrollgen eGFP wurde verwendet, um Promotoreigenschaften und Transgen-Expression möglichst schnell und einfach charakterisieren zu können. Das eGFP-Gen kann durch jedes andere neuronenspezifisch zu exprimierende Gen ersetzt werden, (siehe Abb. 3, Sequenz der mTUB Promotorkassette) . Dabei sind die funktionellen Bereiche folgenden Nukleotidbereichen in der Sequenz zugewiesen:
1 - 222: 3' -Teil der mThyl 5'-UTR 223 - 291: 1. nonamerer iriThyl-Promotor und flankierende Regionen 292 - 345: mThyl Exon Ia 537 - 545: 2. nonamerer mThyl-Promotor 592 - 733: mThyl Exon Ib 346 - 1378: 5' -Teil vom mThyl-Intron A 1379 - 1392: Polylinker I
1393 - 2112: Kontrollgen eGFP (nicht Teil der Offenbarung)
Die kodierende Sequenz, welche von Nukleotid 1393 bis 2112 reicht, steht für das Reportergen eGFP, welches nicht Teil der Offenbarung ist. Anschließend an die Reportergensequenz befindet sich die late SV40 poly A
Sequenz, welche durch jede andere poly A Sequenz ersetzt werden kann 2113 - 2130: Polylinker II 2131 - 2350: SV40 late Poly A Signal
Nachfolgende Tabelle zeigt einen Vergleich des erfindungsgemäßen mTUB-Promotors mit dem unveränderten murinen Thyl-Promotor, sowie den Promotoren des menschlichen Platelet- derived Growth Factor (hPDGF) und des Cytomegalovirus (CMV) . Es wurden sowohl SH-SY5Y- als auch Neuro-2A-Zellen mit dem eGFP- Reportergen unter Kontrolle des jeweiligen Promotors transfiziert und die Transfektionseffizienz (TE in %) sowie die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI in willkürlichen Einheiten) , beides gemessen mittels FacScan, verglichen (Transfektionseffizienz in Potenz = (fluoreszierende Zellen/nicht fluoreszierende Zellen)xl00) .
Figure imgf000009_0001
Somit ist der mTUB-Promotor in beiden neuronalen Zelllinien dem mThyl-Promotor sowohl hinsichtlich der Transfektionseffizienz als auch der Expressionsintensität weit überlegen. In SH-SY5Y- Zellen erzielt mTUB eine 25-fach höhere Transfektionseffizienz als der hPDGF-Promotor bei etwa gleicher durchschnittlicher Signalintensität, in Neuro-2A-Zellen eine 1.5-fach höhere Transfektions- effizienz als der hPDGF-Promotor bei etwa 6-facher durchschnittlicher Signalintensität. Die Transfektionseffizienz ist mit der des CMV-Promotors vergleichbar, bei deutlich höherer durchschnittlicher Signalintensität (in Neuro-2A) .
In Abb. 4 sind Fluoreszenzmikroskopische Bilder von Gehirn- schnitten des transgenen Mausstammes mTUB-eGFP-tg im Vergleich zum entsprechenden nicht transgenen Stamm C57BI6 ntg gezeigt. In den Hirnschnitten erkennt man ganz deutlich die eGFP-exprimierenden Neuronen der transgenen Maus im Vergleich zu dem eGFP-negativen Hirnschnitt der nichttransgenen Maus.

Claims

Ansprüche :
1. Promotor umfassend eine von Thy-1 Säugetieren abgeleitete Nukleinsäuresequenz, welche die neuronenspezifische Transkription einer heterologen, 3' -abwärts zum Promotor befindlichen Nukleinsäuresequenz sowohl in Säuger- als auch in Nicht- Säugerzellen bewirkt.
2. Nukleinsäuresequenz bestehend aus den Abschnitten (a) der mThyl 5' -„untranslated region" (UTR), der 5'-UTR vorgelagerten 20bp umfassenden Sequenz und der Sequenz des ersten nonameren Promotors bestehend aus 9 Nukleotiden und flankierenden Regionen des Maus-Thy-1-Gens
(b) der Sequenz des Exons Ia des Maus-Thy-1-Gens (c) der Sequenz des zweiten nonameren Promotors bestehend aus 9 Nukleotiden des Maus-Thy-1-Gens
(d) der Sequenz des Exons Ib des Maus-Thy-1-Gens
(e) der kompletten oder teilweisen Sequenz des Introns A des Maus-Thy-1- Gens (f) der Sequenz eines PoIy A Signals
(g) der Säuger-Thy-1-Gen-Promotorsequenz, welche mit der unter (a) , (b) , (c) , (d) , (e) und (f) beschriebenen Sequenz hybridisiert, wobei die Promotorsequenz, wenn sie kombiniert wird mit einer heterologen Gensequenz, diese neuronenspezifisch sowohl in Säuger- als auch in Nicht- Säugerzellen transkribiert.
3. Nukleinsäure-Konstrukt, umfassend eine Expressionskassette , welche die gemäß Anspruch 2 gekennzeichneten Abschnitte (a) , (b) ,
(c) , (d) , (e), (f) und (g) sowie eine heterologe Nukleinsäure- Sequenz, welche zwischen den Abschnitten (e) und (f) positioniert und operativ mit diesen assoziiert ist, enthält.
4. Nukleinsäure-Konstrukt nach Anspruch 3, durch gekennzeichnet, dass der Abschnitt (g) eine therapeutische Gensequenz ist.
5. Nukleinsäure-Konstrukt umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 als Bestandteil eines Plasmides.
6. Nukleinsäure-Konstrukt nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleinsäure-Sequenz zwischen den Abschnitten (e) und (f) für ein Protein kodiert.
7. Nukleinsäure-Konstrukt umfassend einen Vektor und ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2.
8. Nukleinsäure-Konstrukt nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Virus ist oder von einem Virus stammt .
9. Isolierte Zelle oder Zelllinie umfassend den Promotor nach Anspruch 1.
10. Isolierte Zelle oder Zelllinie umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2.
11. Isolierte Zelle oder Zelllinie umfassend ein Nukleinsäure- Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 8.
12. Transgenes nicht-menschliches Tier, umfassend den Promotor nach Anspruch 1.
13. Transgenes nicht-menschliches Tier, umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2.
14. Transgenes nicht-menschliches Tier, umfassend ein Nukleinsäure-Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis Anspruch 8.
15. Verfahren zur Genexpression in neuronalen und nicht-neuronalen Zellen, welches die Transformation/Transfektion der Zellen mit einem Vektor umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder ein Nukleinsäure-Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 8 beinhaltet.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor für den Gentransport mit einer polymeren Trägersubstanz gemischt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass als polymere Trägersubstanz ein kationisches Polymer und/oder ein
Lipid eingesetzt wird (werden) .
18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass als polymere Trägersubstanz Polyethylenimin eingesetzt wird.
19. Verwendung eines Vektors umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder ein Nukleinsäure-Konstrukt nach einem der
Ansprüche 3 bis 8 zur Herstellung von Injektionslösungen, welche für das Injizieren in das Zentralnervensystem oder in die Zerebrospinalflüssigkeit geeignet sind.
20. Verwendung eines Vektors umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder ein Nukleinsäure-Konstrukt nach einem der
Ansprüche 3 bis 8 zur Herstellung von Injektionslösungen zur Behandlung von neuronalen Funktionsstörungen, wie Schlaganfall, Ischämie, Epilepsie, Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer, Morbus Huntington, Hirn- und Rückenmarkstrauma, Amyotrophe Lateralsklerose.
21. Verwendung eines Vektors umfassend die Nukleinsauresequenz nach Anspruch 2 oder ein Nukleinsaure-Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 8 zur Herstellung von Injektionslosungen zur Behandlung von neurogenetischen Funktionsstörungen.
22. Kit zur Expression rekombinanter Genprodukte umfassend isolierte Zellen oder Zelllinien nach einem der Ansprüche 9 bis 11.
23. Arzneimittel umfassend einen Promotor nach Anspruch 1.
24. Arzneimittel umfassend ein Protein, welches durch die Nukleinsaureseqenz gemäß Anspruch 2 codiert ist.
25. Arzneimittel umfassend ein Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 8.
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