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WO2006035781A1 - 生体関連物質の銀染色方法 - Google Patents

生体関連物質の銀染色方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a silver staining method for a biological substance such as protein or nucleic acid.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting a biologically relevant substance on a gel such as a polyacrylamide gel after electrophoresis with high sensitivity. More specifically, biologically-related substances on gels such as polyacrylamide gel after electrophoresis are detected with extremely high sensitivity by silver staining. It is an object of the present invention to provide a method of taking out.
  • a method of silver-staining a gel obtained by separating a biological substance by electrophoresis comprising at least the following steps:
  • step (b) a step of immersing the gel obtained in the step (a) in a mixture of ethanol and aqueous sodium acetate;
  • the gel obtained in the step (b) is immersed in a mixture of ethanol and an aqueous silver nitrate solution without being washed with water. Law is provided.
  • a method for silver-staining a gel obtained by separating a biological substance by electrophoresis and at least the following steps:
  • step (a-2) a step of immersing the gel obtained in step (a) in a mixture of ethanol and aqueous acetic acid;
  • step (b ') a step of immersing the gel obtained in the above step (a-2) in a mixture of ethanol and aqueous sodium acetate;
  • the present invention provides a kit for performing the above method.
  • the above kit contains a combination of reagents used in each step of the above method. The invention's effect
  • FIG. 1 is a photograph of polyacrylamide that was stained with silver according to Example 1.
  • BSA indicates albumin
  • CA indicates carbonic anhydrase
  • LA indicates ⁇ -lactalbumin
  • the numbers in the figure are the minimum amount detected for each protein.
  • FIG. 2 is a photograph of a polyacrylamide gel stained with silver according to Example 2.
  • the arrow in ( ⁇ ) indicates the carbonic anhydrase band.
  • ( ⁇ ) is a diagram showing a mass spectrometry spectrum of a band indicated by an arrow in ( ⁇ ).
  • FIG. 3 is a photograph of a polyacrylamide gel stained with silver according to Example 3.
  • the method of the present invention is a method of silver-staining a gel obtained by separating a biological substance by electrophoresis, and is characterized by comprising at least the steps (a), (b), and (c). According to a preferred embodiment, the method includes the steps (a), (a-2), (b ′), and (.
  • the “biologically related substance” More specifically, for example, nucleic acids (including DNA and RNA) or proteins that can be separated and detected by gel electrophoresis can be exemplified.
  • biological materials are not limited to those of natural origin, but are interpreted in the broadest sense including non-natural nucleic acids and proteins newly created by genetic engineering techniques. I have to do it!
  • a method of separating the like gel electrophoresis Ya Agarosuge gel electrophoresis is widely used in the art, the method of the present invention, it is possible to use any type of gel.
  • the gels such Agarosugeru Or a polyacrylamide gel etc. can be mentioned, It is preferable to use a polyacrylamide gel.
  • As the agarose gel or polyacrylamide gel those having various concentrations can be selected and used depending on the kind of the biological substance.
  • the electrophoresis method is not particularly limited.
  • Step (a) is a step of immersing the untreated gel after electrophoresis in an aqueous sodium thiosulfate solution (sensitization step 1). This step is performed in order to prevent whitening of the protein band stained on the gel and to show a clear band. Conventionally, this step has been performed immediately before the dyeing step of immersing in an aqueous silver nitrate solution in accordance with the standard adopted in commercially available silver dyeing kits, etc. When this process was adopted, it was found that the background was stained without sufficient washing with water after immersion in an aqueous solution of sodium thiosulfate, and sufficient protein detection sensitivity could not be obtained by staining.
  • the subsequent step (a-2) (fixing step) And (b) or (b ') (2 steps of sensitization) can suppress background dyeing and sufficiently exert the sensitizing effect obtained by immersion in an aqueous sodium thiosulfate solution.
  • the concentration of sodium thiosulfate in the sodium thiosulfate aqueous solution is not particularly limited, but is preferably about 0.02%, for example.
  • the immersion time is not particularly limited, it is usually preferably about 2 minutes. If the sodium thiosulfate concentration is increased and the immersion time is increased, the background may be stained.
  • step (b): sensitization step 2 a step of immersing the gel obtained in step (a) in a mixture of ethanol and aqueous sodium acetate.
  • step (a-2): fixing step a step of immersing the gel obtained in step (a) in a mixture of ethanol and acetic acid aqueous solution
  • step (a-2): fixing step may generally be added. It is desirable to adopt this fixing process.
  • step (a-2) the gel obtained in step (a-2) can be immersed in a mixture of ethanol and aqueous sodium acetate (step 0> ')).
  • the concentration of ethanol in the mixture is not particularly limited, but for example, 40 times the total weight of the mixture.
  • the amount is preferably about%.
  • the concentration of acetic acid in the mixture is not particularly limited, but is preferably about 10% by weight, for example.
  • the immersion time in the immobilization process is preferably 30 minutes or longer. It is preferable to perform multiple immersions by appropriately changing the mixture of ethanol and aqueous acetic acid. Better ,. In particular, it is preferable to immerse twice with an immersion time of 30 minutes.
  • the immersion time in the fixing step can be long (for example, overnight), unnecessarily long immersion may reduce the detection sensitivity of low molecular weight proteins.
  • the concentration of ethanol in the mixture is not particularly limited. For example, about 20 to 40% by weight relative to the total weight of the mixture It is more preferable that it is 30% by weight.
  • the concentration of sodium acetate in the mixture is not particularly limited, but is preferably about 0.5 M to 1.0 M, for example. Sufficient sensitization effect may not be obtained at concentrations below 0.5 M and 1.0 M.
  • the immersion time in the mixture in the two sensitization steps is preferably 30 minutes or more, but if the immersion is performed unnecessarily for a long time, the detection sensitivity of a low molecular weight protein may be lowered.
  • a step of immersing the gel obtained in the step (b) or the step (b ′) in a mixture of ethanol and an aqueous silver nitrate solution is performed (dyeing step).
  • Previously reported papers (Schevchenko A et.a 1. Anal.Chem. (1996) 68 pp850-858 etc.) and commercially available silver staining kits, etc., have two sensitization steps in which the gel is treated with sodium acetate and silver nitrate.
  • a process of washing with water or the like is employed between the dyeing process to be treated, but according to the study by the present inventors, washing with water or the like is performed between the sensitization 2 process and the dyeing process.
  • the gel obtained in the sensitization step 2 (step (b) or step (b ′)) is subjected to a dyeing step without being washed with water, thereby sensitizing 2
  • the sensitizing effect of the detection sensitivity obtained in the process can be sufficiently exhibited, and the detection sensitivity of low molecular weight protein is sufficiently maintained.
  • a step of immersing the gel in a silver nitrate aqueous solution, a silver nitrate / formalin mixed aqueous solution, or a silver nitrate / sodium thiosulfate mixed aqueous solution is employed in the dyeing step.
  • a silver nitrate aqueous solution alone, but the use of silver nitrate and formalin aqueous solution improves staining, but chemical modification with protein by aldehyde may cause bowing.
  • formalin When analyzing, there is a problem that the use of formalin must be eliminated as much as possible.
  • the silver nitrate and sodium thiosulfate mixed aqueous solution has a problem that the dyeing is lowered due to the change in the composition of the gel.
  • the study by the present inventors by adding ethanol to an aqueous silver nitrate solution, it is possible to suppress the staining of the gel background and clearly improve the detection sensitivity by clarifying the protein band to be stained strongly. It was found.
  • the concentration of ethanol in the mixture of ethanol and silver nitrate aqueous solution is not particularly limited, but is, for example, about 15 to 20% by weight and more preferably 20% by weight with respect to the total weight of the mixture.
  • the concentration of silver nitrate in the mixture is preferably about 0.2 to 0.3% by weight, more preferably 0.25% by weight, based on the total weight of the mixture.
  • the immersion time in the dyeing process is preferably about 15 to 20 minutes. If the immersion time is long, excessive silver ions may not be cleaned in the subsequent cleaning process, resulting in background staining.
  • step (a) When higher alcohols are used, it is optimal to use ethanol because there is no significant difference in detection sensitivity but there is a tendency for background staining to increase. It should be noted that a small amount of ethanol can be added in one step of sensitization in step (a).
  • the temperature at which the above steps ( a ), ( a- 2), (b), (b ′), (c), and (c ′) are performed is not particularly limited, but is preferably about 25 ° C., for example.
  • step (d) a step of washing the gel obtained in the staining step with water (washing step); (e) a mixture of sodium carbonate and formalin obtained by washing the gel obtained in the washing step; Including water
  • the step of immersing in a solution (development step); and (D) the step of immersing the gel obtained in step (e) above in an acidic aqueous solution (development stop step) allows silver staining of the gel.
  • the above step (d) and force (e) can be carried out according to a method commonly used in the art.
  • the washing step is desirably performed in as short a time as possible so that excess silver ions can be sufficiently removed. Insufficient washing may result in background staining and may not detect protein bands.
  • the step of dipping and shaking for about 30 seconds to 1 minute is preferably repeated 2-3 times.
  • the concentration of sodium carbonate in the aqueous solution is preferably 2.5% by weight, for example, preferably 2-3% by weight.
  • the concentration of formalin in the aqueous solution is preferably 0.04 to 0.06% by weight, for example, and more preferably 0.06% by weight.
  • the soaking time in the development process can be appropriately determined depending on the relationship with the protein to be stained, but is usually about 1 to 10 minutes.
  • the protein may be chemically modified by the aldehyde, and analysis using a mass spectrometer may be impossible.
  • the type of acid used in the development stopping step is not particularly limited, and commonly used mineral acids and organic acids such as acetic acid can be used as appropriate.
  • acetic acid aqueous solution when an acetic acid aqueous solution is used as the acidic aqueous solution, it is sufficient that the concentration of acetic acid is, for example, 1% by weight or more.
  • the method of the present invention can be automated, and preferably an automated apparatus for silver staining for performing a silver staining method comprising at least the steps (a), (b), and (c), preferably Needless to say, an automated apparatus for performing a silver staining method including at least the steps (a), (a-2), (b ′), and (c ′) is included in the scope of the present invention. Furthermore, an automated apparatus for silver staining for performing a silver staining method including the above steps (d) to (e) in addition to the above steps (a), (b) and (c) is also within the scope of the present invention. Is included.
  • the kit provided by the present invention is provided as a kit containing at least two or more of the reagents used in the above steps (a), (b), and (c).
  • a combination of two or more kinds of reagents selected from the group power consisting of sodium acetate, sodium thiosulfate, and silver nitrate is preferable.
  • ethanol and Z or acetic acid may be provided in combination with this reagent combination.
  • a combination of sodium carbonate and formalin used in step (e) may be provided.
  • FIG. 1 A photograph of the polyacrylamide gel obtained is shown in Fig. 1.
  • BSA is albumin
  • CA carbonic anhydrase
  • LA ⁇ -latatoalbumin.
  • the numbers in the figure are the minimum amount detected for each protein, and the BSA power S30pg, CA power 3 ⁇ 40pg, and LA were 42pg, respectively.
  • the amount of BSA and CA added is 100 ng, 50 ng, 10 ng, 5 ng, lng, 500 pg, 100 pg, 50 pg, 30 pg, 10 pg, 5 pg, 3 pg from the left lane.
  • the gage obtained above The plate was washed with water for 1 minute x 2 times, immersed in a 2.5% sodium carbonate / 0.06% formalin mixed aqueous solution for 5 minutes, and immersed in a 1% aqueous acetic acid solution for 5 minutes for development and development stop.
  • a photograph of the polyacrylamide gel obtained is shown in Fig. 2 (A).
  • Fig. 2 (B) shows the mass spectrum obtained by analyzing the obtained fragmented peptide with a mass spectrometer (MALDI-TOF-TOF).
  • MALDI-TOF-TOF mass spectrometer
  • Each lane in the figure is 2.5 ⁇ g, 1.25 ⁇ g, 625 ng, 312.5 ng, 156.25 ng, 78.15 ng, 39.1 ng, 19.55 ng, 9.8 ng, 4.9 ng, 2.45 ng 1.25 ng.
  • a living body separated by gel electrophoresis by silver staining according to the method of the present invention can detect related substances with extremely high sensitivity

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Abstract

　核酸又はタンパク質などの生体関連物質を電気泳動により分離したポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲルなどのゲルを銀染色する方法であって、少なくとも下記の工程：(a)電気泳動後の未処理のゲルをチオ硫酸ナトリウム水溶液に浸漬する工程；(b)上記工程(a)で得られたゲルをエタノール及び酢酸ナトリウム水溶液の混合物に浸漬する工程；(c)上記工程(b)で得られたゲルをエタノール及び硝酸銀水溶液の混合物に浸漬する工程を含む方法。                                                                                 

Description

生体関連物質の銀染色方法
技術分野
[0001] 本発明はタンパク質又は核酸などの生体関連物質を対象とした銀染色方法に関す るものである。
背景技術
[0002] ドデシル硫酸ナトリウム ·ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE)の開発以来、 タンパク質や核酸などの生体試料の生化学的解析において PAGEは欠かすことので きない手段となっている。電気泳動後のポリアクリルアミドゲル上のタンパク質を検出 する手段としては、例えば CBB染色法、銀染色法、蛍光染色法などを利用すること ができる。生体組織や細胞内のタンパク質の全体像 (プロテオーム）を解析して医薬 開発に役立てようとする総合的研究 (プロテオミタス）においては、とりわけ検出感度 の高い手段が求められているが、これらの手段のうち、銀染色法は特別な検出装置 を必要とせずに最も高い検出感度を得られる方法として当業界で汎用されている。 現在提供されて ヽる市販の銀染色キット等を用いて銀染色を行なった場合、タンパク 質量が数 lOOpg以上での検出が可能である。
[0003] し力しながら、従来の銀染色法を用いても、 1細胞あたりの発現量の低いタンパク質 を検出するためには 108〜109個以上の細胞が必要であり、タンパク質の回収効率を 考慮するとさらに多くの細胞数が必要となり、現実的な解析は困難であるという問題 がある。このような事情から、少ないタンパク質量、たとえば数 10pg程度のタンパク質 量を用いて PAGEを行なった場合にもゲル上のタンパク質を鮮明に可視化できる方 法の開発が切望されている。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明の課題は、電気泳動後のポリアクリルアミドゲルなどのゲル上の生体関連物 質を高感度に検出する方法を提供することにある。より具体的には、電気泳動後のポ リアクリルアミドゲルなどのゲル上の生体関連物質を銀染色により極めて高感度に検 出する方法を提供することが本発明の課題である。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者は上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、下記の工程に従 つて銀染色を行なうことにより、極めて高感度に生体関連物質を検出できることを見 出した。
すなわち、本発明により、生体関連物質を電気泳動により分離したゲルを銀染色す る方法であって、少なくとも下記の工程：
(a)電気泳動後の未処理のゲルをチォ硫酸ナトリウム水溶液に浸漬する工程；
(b)上記工程 (a)で得られたゲルをエタノール及び酢酸ナトリウム水溶液の混合物に浸 漬する工程；
(c)上記工程 (b)で得られたゲルをエタノール及び硝酸銀水溶液の混合物に浸漬する 工程
を含む方法が提供される。
[0006] 上記発明の好ま 、態様によれば、上記工程 (c)にお 、て、上記工程 (b)で得られた ゲルを水洗することなくエタノール及び硝酸銀水溶液の混合物に浸漬する上記の方 法が提供される。
さらに好ましい態様によれば、生体関連物質を電気泳動により分離したゲルを銀染 色する方法であって、少なくとも下記の工程：
(a)電気泳動後の未処理のゲルをチォ硫酸ナトリウム水溶液に浸漬する工程；
(a-2)上記工程 (a)で得られたゲルをエタノール及び酢酸水溶液の混合物に浸漬する 工程；
(b')上記工程 (a-2)で得られたゲルをエタノール及び酢酸ナトリウム水溶液の混合物 に浸漬する工程；
(c')上記工程 (b')で得られたゲルを水洗することなくエタノール及び硝酸銀水溶液の 混合物に浸漬する工程
を含む方法が提供される。
上記方法において、ゲルとしては、例えばポリアクリルアミドゲル又はァガロースゲ ルを用いることができ、好ましくはポリアクリルアミドゲルを用いることができる。 [0007] 別の観点からは、本発明により、上記の方法を行なうためのキットが提供される。上 記のキットは上記方法の各工程において用いられる試薬の組み合わせを含む。 発明の効果
[0008] 本発明の方法に従って銀染色を行なうことにより、ゲル電気泳動で分離された生体 関連物質を極めて高感度に検出することができる。本発明の方法では、銀染色工程 においてホルマリンの使用を極力抑えることが可能であり、染色後のゲルに含まれる 生体関連試料が化学修飾を受ける可能性が低 、ことから、染色後の生体関連試料 を質量分析計により正確に分析できるという利点もある。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]例 1により銀染色を行なったポリアクリルアミドの写真である。 BSAはアルブミン、 CAはカーボニックアンヒドレーゼ、 LAは α -ラクトアルブミンを示し、図中の数字は各 タンパク質の検出された最低量である。
[図 2]例 2により銀染色を行なったポリアクリルアミドゲルの写真である。図中、（Α)の矢 印はカーボニックアンヒドレーゼのバンドを示す。（Β)は (Α)中に矢印で示したバンドの 質量分析スペクトルを示した図である。
[図 3]例 3により銀染色を行ったポリアクリルアミドゲルの写真である。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明の方法は、生体関連物質を電気泳動により分離したゲルを銀染色する方法 であって、少なくとも上記工程 (a)、（b)、及び (c)を含むことを特徴としており、好ましい 態様によれば、上記工程 (a)、（a-2)、（b')、及び ( を含むことを特徴としている。本明 細書にぉ 、て、「生体関連物質」とは生体を構成する高分子物質のことを意味してお り、より具体的には、例えば、ゲル電気泳動により分離及び検出が可能な核酸 (DNA 及び RNAを含む)又はタンパク質など例示することができる力 これらに限定されるこ とはない。また、生体関連物質は天然由来のものに限定されず、非天然型の核酸や 遺伝子工学の手法により新たに創製されたタンパク質などを含めて最も広義に解釈 しなければならな!/、。生体関連物質をポリアクリルアミドゲル電気泳動ゃァガロースゲ ル電気泳動などにより分離する方法は当業界で汎用されているが、本発明の方法は 、任意の種類のゲルを用いることが可能である。ゲルとしては、例えばァガロースゲル 又はポリアクリルアミドゲルなどを挙げることができ、ポロアクリルアミドゲルを用いるこ とが好ましい。ァガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルは、生体関連物質の種類に 応じて種々の濃度のものを選択して使用できる。また、本発明の方法において、電気 泳動の方法も特に限定されることはな 、。
[0011] 工程 (a)は、電気泳動後の未処理のゲルをチォ硫酸ナトリウム水溶液に浸漬するェ 程である（増感 1工程)。この工程は、ゲル上に染色されるタンパク質のバンドの白濁 化を防ぎ、明瞭なバンドを示すために行なわれる。従来、この工程は、市販の銀染色 キット等で採用されている標準に従って硝酸銀水溶液等への浸漬を行う染色工程直 前に行なわれていたが、本発明者らの研究によれば、この従来の工程を採用すると、 チォ硫酸ナトリウム水溶液に浸漬した後に水等による十分な洗浄を行わないと背景 が染色され、染色による十分なタンパク質の検出感度が得られなくなるという問題が 生じることが判明した。
[0012] 本発明の方法では、電気泳動を行なった直後に得られる未処理のゲルをチォ硫酸 ナトリウム水溶液に浸漬する工程を採用することにより、その後の工程 (a-2) (固定ェ 程)及び (b)又は (b') (増感 2工程)を経ることで背景の染色を抑え、かつ、チォ硫酸ナ トリウム水溶液への浸漬により得られる増感効果を十分に発揮することができる。 ェ 程 (a)において、チォ硫酸ナトリウム水溶液のチォ硫酸ナトリウム濃度は特に限定され ないが、例えば 0.02%程度が好ましい。浸漬時間も特に限定されないが、通常は 2分 程度が好ましい。チォ硫酸ナトリウム濃度を高くし浸漬時間を長くすると、背景が染色 されてしまう場合がある。
[0013] 上記工程 (a)に続き、工程 (a)で得られたゲルをエタノール及び酢酸ナトリウム水溶液 の混合物に浸漬する工程を行なうことができる（工程 (b)：増感 2工程)。この工程 (b)に 先立って、工程 (a)で得られたゲルをエタノール及び酢酸水溶液の混合物に浸漬する 工程 (工程 (a-2) :固定工程)を付加してもよぐ一般的には、この固定工程を採用する ことが望ましい。その場合、工程 (a-2)に続いて、工程 (a-2)で得られたゲルをエタノー ル及び酢酸ナトリウム水溶液の混合物に浸漬することができる（工程 0>'))。
[0014] エタノール及び酢酸水溶液の混合物にゲルを浸漬する固定工程において、混合 物中のエタノールの濃度は特に限定されないが、例えば混合物全重量に対して 40重 量％程度であることが好ましい。また、同混合物中の酢酸の濃度は特に限定されな いが、例えば 10重量％程度であることが好ましい。十分なタンパク質の固定ィ匕を達成 するために、固定工程における浸漬時間は 30分以上とすることが好ましぐエタノー ル及び酢酸水溶液の混合物を適宜交換して複数回の浸漬を行うことが好まし 、。特 に浸漬時間 30分で 2回の浸漬を行うことが好ましい。固定工程の浸漬時間は長時間（ 例えば一晩)とすることも可能であるが、不必要に長時間の浸漬を行なうと低分子量 のタンパク質の検出感度低下を生じることがある。
[0015] エタノール及び酢酸ナトリウム水溶液の混合物にゲルを浸漬する増感 2工程にぉ ヽ て、混合物中のエタノールの濃度は特に限定されないが、例えば混合物の全重量に 対して 20〜40重量％程度であることが好ましぐ 30重量％であることがより好ましい。 混合物中の酢酸ナトリウムの濃度も特に限定されないが、例えば 0.5 M〜1.0 M程度 であることが好ましい。 0.5 M以下、及び 1.0 M以上の濃度では十分な増感効果を得 ることができない場合がある。また、増感 2工程における混合物への浸漬時間は 30分 以上とすることが好ましいが、不必要に長時間の浸漬を行なうと低分子量のタンパク 質の検出感度低下を生じることがある。
[0016] 続いて、工程 (b)又は工程 (b')で得られたゲルをエタノール及び硝酸銀水溶液の混 合物に浸漬する工程を行なう（染色工程)。従来報告された論文 (Schevchenko A et.a 1. Anal.Chem.(1996)68 pp850-858など)や市販の銀染色キット等では、ゲルを酢酸ナ トリウムで処理する増感 2工程と硝酸銀で処理する染色工程との間に水などによる洗 浄を行う工程が採用されているが、本発明者らの研究によれば、増感 2工程と染色ェ 程の間に水等による洗浄をおこなうと低分子量のタンパク質の検出感度が低下する 等の問題が生じることが判明した。本発明の方法の好ましい態様によれば、増感 2ェ 程 (工程 (b)又は工程 (b'))で得られたゲルを水洗することなく染色工程に付することに より、増感 2工程で得られる検出感度の増感効果を十分に発揮させることができ、低 分子量のタンパク質の検出感度も十分保持される。
[0017] 従来の銀染色方法では、染色工程にお!ヽて硝酸銀水溶液、硝酸銀及びホルマリン 混合水溶液、又は硝酸銀及びチォ硫酸ナトリウム混合水溶液などにゲルを浸漬する 工程が採用されている。しかしながら、硝酸銀水溶液を単独で用いた場合には染色 性が不十分であり、硝酸銀及びホルマリン水溶液を用いた場合には染色性は向上す るものの、タンパク質へのアルデヒドによる化学修飾が弓 Iき起こされる可能性があるこ とから、質量分析計での解析を行う場合にはホルマリンの使用は極力排除しなけれ ばならないという問題がある。また、硝酸銀及びチォ硫酸ナトリウム混合水溶液では ゲルの組成変化による染色の低下が生じるという問題がある。本発明者らの研究によ り、硝酸銀水溶液にエタノールを添加することにより、ゲルの背景の染色を抑え、力 つ染色されるタンパク質のバンドを明確ィ匕して検出感度の向上を達成できることが見 出された。
[0018] 染色工程において、エタノール及び硝酸銀水溶液の混合物におけるエタノールの 濃度は特に限定されないが、例えば混合物の全重量に対して 15〜20重量％程度で あり、 20重量％であることがより好ましい。また、同混合物における硝酸銀の濃度は混 合物全重量に対して 0.2〜0.3重量％程度であることが好ましぐ 0.25重量％であるこ とがより好ましい。染色工程における浸漬時間は 15〜20分程度であることが好ましい 。浸漬時間が長くなると、その後の洗浄工程において余剰の銀イオンを洗浄しきれず に、結果として背景の染色が生じることがある。
[0019] 上記に説明したとおり、本発明の方法では、上記の工程 (a-2)、 (b) (又は (b'))、及び ( c) (又は (c'))において、エタノールと水とを含む混合溶液を用いており、これは本発 明の特徴の一つである。従来、固定工程及び Z又は増感工程でメタノールと水との 混合物を用いる報告があるが、本発明者らの研究によれば、メタノールを用いる場合 には、全体に染色が薄くなり、検出感度が低下するという問題が生じることが判明した 。また、本発明者らの研究により、上記の問題はメタノールに替えてエタノールを用い ることにより解決できることが見いだされた。さらに高級のアルコールを用いた場合に は、検出感度に大きな差は見られないが背景の染色が高くなる傾向が認められること から、エタノールを採用することが最適である。なお、工程 (a)の増感 1工程において 少量のエタノールを添カ卩しておくことは差し支えない。なお、上記工程 (a)、（a-2)、（b)、 (b')、（c)、及び (c')を行なう温度は特に限定されないが、例えば 25°C程度が好ましい。
[0020] 工程 (c)に続き、（d)上記染色工程で得られたゲルを水で洗浄する工程 (洗浄工程）； (e)上記洗浄工程で得られたゲルを炭酸ナトリウム及びホルマリンの混合物を含む水 溶液に浸漬する工程 (現像工程）；及び (D上記工程 (e)で得られたゲルを酸性水溶液 に浸漬する工程 (現像停止工程)を行なうことにより、ゲルの銀染色を行なうことがで きる。上記工程 (d)力も (e)は当業界で通常用いられている方法に従って行なうことが できる。
[0021] 洗浄工程は、なるべく短時間で、かつ余剰の銀イオンを十分除去できるように行うこ とが望ましい。洗浄が不十分だと背景の染色が認められ、タンパク質のバンドが検出 できない場合がある。具体的には、 30秒〜 1分程度にわたり浸漬及び振とうする工程 を 2〜3回繰り返し行うのが好ましい。現像工程において、該水溶液における炭酸ナト リウムの濃度は、例えば 2〜3重量％であることが好ましぐ 2.5重量％であることがさら に好ましい。該水溶液におけるホルマリンの濃度は、例えば 0.04〜0.06重量％である ことが好ましぐ 0.06重量％であることがより好ましい。現像工程における浸漬時間は 染色されるタンパク質との関係で適宜決定することができるが、通常は 1ないし 10分程 度である。不必要に長時間の浸漬を行なうと、タンパク質がアルデヒドにより化学修飾 を受ける可能性があり、質量分析計による解析が不可能になる場合がある。現像停 止工程にぉ ヽて用いられる酸の種類は特に限定されず、通常用いられる鉱酸類や 酢酸などの有機酸などを適宜使用可能である。例えば、酸性水溶液として酢酸水溶 液を用いる場合には、酢酸の濃度は例えば 1重量％以上あれば十分である。
[0022] 本発明の方法は自動化することも可能であり、少なくとも上記工程 (a)、（b)、及び (c) を含む銀染色方法を行なうための銀染色のための自動化装置、好ましくは少なくとも 上記工程 (a)、（a-2)、（b')、（c')を含む銀染色方法を行なうための自動化装置などは 本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。さらに、上記工程 (a)、（b)、及び (c) に加えて上記工程 (d)ないし (e)を含めた銀染色方法を行なうための銀染色のための 自動化装置も本発明の範囲に包含される。また、本発明により提供されるキットは、 上記の工程 (a)、（b)、及び (c)において用いられる試薬のうち少なくとも 2種以上を含む キットとして提供される。例えば、酢酸ナトリウム、チォ硫酸ナトリウム、及び硝酸銀から なる群力も選ばれる 2種以上の試薬の組み合わせなどが好ましい。また、この試薬の 組み合わせにエタノール及び Z又は酢酸を組み合わせて提供してもよい。さらに、ェ 程 (e)で用いられる炭酸ナトリウム及びホルマリンを組み合わせて提供してもよ 、。 実施例
[0023] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の 実施例に限定されることはない。
例 1
巿販の 15%ポリアクリルアミドゲル (バイオクラフト社製)を用いて、巿販のマーカー (L MWマーカー;アマシャムバイオサイエンス社製)をタンパク質の量を計算して添カロし、 20mAの定電流で電気泳動した。サンプルバッファ一は市販のメルカプトエタノールを 含むもの (第一化学社製)を用いた。電気泳動後のポリアクリルアミドゲルを直ちに 0.0 2%チォ硫酸ナトリウム水溶液に 2分浸漬し、続 、て 40%エタノール/ 10%酢酸混合水 溶液に 30分 X 2回浸漬し、 30%エタノール /0.5 M酢酸ナトリウム混合水溶液に 30分 浸漬し、さらに 20%エタノール /0.25%硝酸銀混合水溶液に 20分浸漬して銀染色を 行なった。上記で得られたポリアクリルアミドゲルを水で 1分 X 2回洗浄し、 2.5%炭酸 ナトリウム /0.06%ホルマリン混合水溶液に 6分浸漬し、 1%酢酸水溶液に 5分浸漬す ることにより現像及び現像停止を行なった。得られたポリアクリルアミドゲルの写真を 図 1に示す。図中、 BSAはアルブミン、 CAはカーボニックアンヒドレーゼ、 LAは α -ラタ トアルブミンを示す。図中の数字は各タンパク質の検出された最低量であり、それぞ れ、 BSA力 S30pg、 CA力 ¾0pg、 LAが 42pgであった。図中、 BSA及び CAの添カ卩量は、左 のレーンより 100ng、 50ng、 10ng、 5ng、 lng、 500pg、 100pg、 50pg、 30pg、 10pg、 5pg、 3 pgであり、同じく LAの添加量は 140ng、 70ng、 14ng、 7ng、 1.4ng、 700pg、 140pg、 70pg 、 42pg、 14pg、 7pg、 4.2pgである。
[0024] 例 2
巿販の 15%ポリアクリルアミドゲル (バイオクラフト社製)を用いて、巿販のカーボニック アンヒドレーゼ (CA;シグマ社製)を 1レーンあたり 1 μ g添加し、 20mAの定電流で電気 泳動した。サンプルバッファ一は市販のメルカプトエタノールを含むもの (第一化学社 製)を用いた。電気泳動後のポリアクリルアミドゲルを直ちに 0.02%チォ硫酸ナトリウム 水溶液に 2分浸漬し、続 、て 40%エタノール/ 10%酢酸混合水溶液に 30分 X 2回浸 漬し、 30%エタノール /0.5 M酢酸ナトリウム混合水溶液に 30分浸漬し、 20%エタノー ル /0.25%硝酸銀混合水溶液に 20分浸漬して銀染色を行なった。上記で得られたゲ ルを水で 1分 X 2回洗浄し、 2.5%炭酸ナトリウム /0.06%ホルマリン混合水溶液に 5分 浸漬し、 1 %酢酸水溶液に 5分浸漬することにより現像及び現像停止を行なった。得ら れたポリアクリルアミドゲルの写真を図 2(A)に示す。
[0025] 図 2(A)の矢印により示したバンドを切り出した後、 lOOmMチォ硫酸ナトリウム水溶液 、 30mMへキサシァノ鉄 (III)酸カリウム水溶液の 1 : 1混合水溶液で脱色し、水で数回洗 浄した。水を抜き、ゲルを約 lmm3の大きさに細分ィ匕して乾固した。必要量のトリプシン (プロメガ社製)を含んだ 50mM重炭酸アンモ-ゥム、 2%ァセトニトリル水溶液 (pH8.0) で 37°Cにて一晩処理し、 目的タンパク質を断片化した。断片化したペプチドは逆相 榭脂充填ピペットチップを用いて抽出、脱塩、及び濃縮した。得られた断片化べプチ ドを質量分析計 (MALDI-TOF-TOF)で解析した質量分析スペクトルを図 2(B)に示す 。このスペクトル力 タンパク質を検索 (ペプチドマスフィンガープリンティング法)したと ころ、カーボニックアンヒドレーゼが検索され、アミノ酸配列のカバー率は 74%であった
[0026] 例 3 (核酸の分離及び銀染色）
市販の 12.5%アクリルアミドゲル (アマシャムバイオサイエンス社製)を用いて、市販の マーカー (lOObp ladder;アマシャムバイオサイエンス社製)を添カ卩し、 50mAの定電流 で電気泳動した。サンプルバッファ一としては Tris— EDTAバッファー (pH7.5)を用い た。電気泳動後のポリアクリルアミドゲルを直ちに 0.02%チォ硫酸ナトリウム水溶液に 2分浸漬し、続いて 40%エタノール/ 10%酢酸混合水溶液に 30分 X 2回浸漬し、 30% エタノール /0.5M酢酸ナトリウム混合水溶液に 30分浸漬し、 20%エタノール /0.25% 硝酸銀混合水溶液に 20分浸漬した。上記で得られたポリアクリルアミドゲルを水によ り 1分 X 2回洗浄し、 2.5%炭酸ナトリウム /0.06%ホルマリン混合水溶液に 6分浸漬し、 1 %酢酸水溶液に 5分浸漬することにより現像及び現像停止を行った。得られたポリア クリルアミドゲルの写真を図 3に示す。図中各レーンには全核酸量で左のレーンより 2. 5 μ g, 1.25 μ g、 625ng, 312.5ng, 156.25ng, 78.15ng、 39.1ng、 19.55ng、 9.8ng、 4.9ng 、 2.45ngゝ 1.25ngである。
産業上の利用可能性
[0027] 本発明の方法に従って銀染色を行なうことにより、ゲル電気泳動で分離された生体 関連物質を極めて高感度に検出することができる

Claims

請求の範囲
[1] 生体関連物質を電気泳動により分離したゲルを銀染色する方法であって、少なくとも 下記の工程：
(a)電気泳動後の未処理のゲルをチォ硫酸ナトリウム水溶液に浸漬する工程；
(b)上記工程 (a)で得られたゲルをエタノール及び酢酸ナトリウム水溶液の混合物に浸 漬する工程；
(c)上記工程 (b)で得られたゲルをエタノール及び硝酸銀水溶液の混合物に浸漬する 工程
を含む方法。
[2] 上記工程 (c)において、上記工程 (b)で得られたゲルを水洗することなくエタノール及 び硝酸銀水溶液の混合物に浸漬する請求項 1に記載の方法。
[3] 生体関連物質を電気泳動により分離したゲルを銀染色する方法であって、少なくとも 下記の工程：
(a)電気泳動後の未処理のゲルをチォ硫酸ナトリウム水溶液に浸漬する工程；
(a-2)上記工程 (a)で得られたゲルをエタノール及び酢酸水溶液の混合物に浸漬する 工程；
(b')上記工程 (a-2)で得られたゲルをエタノール及び酢酸ナトリウム水溶液の混合物 に浸漬する工程；
(c')上記工程 (b')で得られたゲルを水洗することなくエタノール及び硝酸銀水溶液の 混合物に浸漬する工程
を含む方法。
[4] さらに下記の工程：
(d)上記染色工程 (c)又は ( で得られたゲルを水で洗浄する工程；
(e)上記工程 (d)で得られたゲルを炭酸ナトリウム及びホルマリンの混合物を含む水溶 液に浸漬する工程;及び
(1)上記工程 (e)で得られたゲルを酸性水溶液に浸漬する工程
を含む請求項 1な 、し 3の 、ずれか 1項に記載の方法。
[5] ゲルがポリアクリルアミドゲル又はァガロースゲルである請求項 1な!、し 4の!、ずれか 1項に記載の方法。
生体関連物質が核酸又はタンパク質である請求項 1な 、し 5の 、ずれか 1項に記載 の方法。
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