WO2006030784A1

WO2006030784A1 - サンプリング方法、サンプリング装置、ｌｏｇＤ測定方法及びｌｏｇＤ測定システム

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Publication number: WO2006030784A1
Application number: PCT/JP2005/016841
Authority: WO
Inventors: Yukifumi Dohta
Original assignee: Banyu Phamaceutical Co Ltd
Current assignee: MSD KK
Priority date: 2004-09-15
Filing date: 2005-09-13
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2007-03-15
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Abstract

　２種類の液体が２層に分かれている液体から混入を生じさせず、かつ簡易に下層の液体をサンプリングする。　本発明に係るサンプリング方法は、管状の先端部１１ａを備え当該先端部１１ａを上方から液体に挿入して当該先端部１１ａから当該液体を抽出する抽出手段１１を用いて、上層の液体（オクタノール）５０ａと下層の液体（バッファー液）５０ｂとの２層に分かれた液体を含んで構成される液体から当該下層の液体５０ｂをサンプリングするサンプリング方法であって、上層の液体５０ａと互いに混合しないプラグ用液体５１を抽出手段１１の先端部１１ａに注入するプラグ注入ステップと、プラグ注入ステップにおいてプラグ用液体５１が注入された抽出手段１１により、下層の液体５０ｂを抽出する抽出ステップとを含む。

Description

明細書

サンプリング方法、サンプリング装置、 logD測定方法及び logD測定システム

技術分野

[0001] 本発明は、液体をサンプリングするサンプリング方法、サンプリング装置、並びに当該サンプリング方法に基づく logD測定方法及び logD測定システムに関する。

背景技術

[0002] 多くの医薬品に関して、薬物の吸収性、代謝性及び溶解性等と薬物として用いられる化合物の疎水性との間には相関がある。従来から化合物の疎水性を示す指標として logD (水とォクタノールとの分配係数）が求められている（例えば、以下特許文献 1 〜3参照）。

特許文献 1：特開 2001 _ 124756号公報

特許文献 2：特許第 3444872号公報

特許文献 3：特許第 3523207号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0003] logDを求める方法として、上記特許文献 1〜3に記載されているように、 HPLC (Hi gh Performance Liquid Chromatography：尚速 ¾¾体クロマトグフフィ¹ ~ )におけるィ禾持時間に基づき logDを算出するものがある。し力しながら、この方法は算出される logD が推定値であるため、以下に述べるような実測値を用いる方法に比べて誤差が生じやすいという問題がある。

[0004] また、 logDを求める別の方法として、攪拌フラスコ法がある。攪拌フラスコ法は、フラスコに測定対象の化合物、水及びォクタノールを入れて振とうし、化合物の水における濃度とォクタノールにおける濃度とをそれぞれ実測してその測定値に基づいて log Dを求める。

[0005] 攪拌フラスコ法において、それぞれの溶液の濃度を測定する方法として、水とオタタノールとを分液して測定する方法があるが、この分液操作は煩雑であり多検体を一括で処理するには向いていなレ、。また、そもそも分液操作では容器等に吸着を生じるため誤差が生じるおそれがある。

[0006] また、リキッドハンドラ一等により水溶液とォクタノールとをそれぞれサンプリングする方法がある。し力ながら、水層がォクタノール層の下側に位置しているため、通常この方法では、水溶液をサンプリングする際にォクタノールが混入してしまいコンタミネーシヨンが発生する問題がある。特に、 logDが 4〜6程度の大きい値の場合、水溶液における濃度はォクタノールにおける濃度の iZio⁴〜iZio⁶となるので、ォクタノールのわずかな混入が logD算出の際には、致命的な問題となる。

[0007] 本発明は上記のような問題を解決するためになされたものであり、 2種類の液体が 2 層に分かれている液体から混入を生じさせず、かつ簡易に下層の液体をサンプリングすることができるサンプリング方法、サンプリング装置、並びに当該サンプリング方法に基づく logD測定方法及び logD測定システムを提供することを目的とする。課題を解決するための手段

[0008] 上記目的を達成するために、本発明に係るサンプリング方法は、管状の先端部を備え当該先端部を上方から液体に挿入して当該先端部から当該液体を抽出する抽出手段を用いて、上層の液体と下層の液体との 2層に分かれた液体を含んで構成される液体から当該下層の液体をサンプリングするサンプリング方法であって、上層の液体と互いに混合しないプラグ用液体を抽出手段の先端部に注入するプラグ注入ステツプと、プラグ注入ステップにおいてプラグ用液体が注入された抽出手段により、下層の液体を抽出する抽出ステップと、を含むことを特徴とする。

[0009] このサンプリング方法では、プラグ注入ステップにおレ、てプラグ用液体を注入手段の先端部に注入する。続く抽出ステップにおいて、下層の液体を抽出するために抽出手段を液体に挿入して抽出手段の先端部が上層の液体を通過する際、プラグ用液体が上層の液体を撥ねて注入手段に混入することを防ぐ。即ち、下層の液体を抽出する際の上層の液体によるコンタミネーシヨンが発生することを防ぐ。また、プラグ用液体の注入も簡易に行えることから簡易なサンプリングが可能である。

[0010] また、上層の液体は、所定の化学物質が溶解したォクタノールであり、下層の液体は、当該所定の化学物質が溶解したバッファー液であり、プラグ用液体は、バッファ一液である、ことが望ましい。この構成によれば、 logDを算出するため等の溶液のサンプリングを、ォクタノールの混入を生じさせずに容易に行うことができる。

[0011] 本発明に係る logD測定方法は、管状の先端部を備え当該先端部を上方力液体に挿入して当該先端部から当該液体を抽出する抽出手段を用いて、上層である所定の化学物質が溶解したォクタノールと下層である当該所定の化学物質が溶解したノッファー液との 2層に分かれた液体を含んで構成される液体から当該バッファー液をサンプリングして当該化学物質の logDを測定する logD測定方法であって、ォクタノールと互いに混合しなレ、プラグ用液体を抽出手段の先端部に注入するプラグ注入ステップと、プラグ注入ステップにおいてプラグ用液体が注入された抽出手段により、ノくッファー液を抽出する抽出ステップと、抽出ステップにおいて抽出されたバッファー液における化学物質の濃度を測定するバッファー液中濃度測定ステップと、ノくッファ一液中濃度測定ステップにおいて測定された濃度に基づいて logDを算出する logD 算出ステップと、を含むことを特徴とする。

[0012] この logD算出方法では、上記のサンプリング方法によりサンプリングしたバッファー液における化学物質の濃度を測定して当該測定した濃度に基づき logDを算出する。この方法によれば、上述したようにコンタミネーシヨンを発生させずかつ容易にバッファー液をサンプリングすることができるので、バッファー液における化学物質の濃度を正確に測定することができる。従って、容易かつ正確に logDを算出することができる。なお、ここでバッファー液とは、 logDを測定する際に化学物質を溶解させる一方の媒質であり、例えば、水やリン酸水溶液等が相当する。

[0013] また、バッファー液中濃度測定ステップにおける濃度の測定は質量分析計を用いて行われることが望ましい。この構成によれば、バッファー液における化学物質の濃度が低い場合でも正確に濃度が測定でき、特に logDが 4〜6程度の大きい値をとる場合でも、正確な logDを算出することができる。

[0014] また、ォクタノールにおける化学物質の濃度を測定するォクタノール中濃度測定ステツプを更に含み、 logD算出ステップにおいて、バッファー液中濃度測定ステップ及びォクタノール中濃度測定ステップにおいて測定された濃度に基づいて logDを算出する、ことが望ましい。この構成によれば、ォクタノールにおける濃度の実測値に基づレ、たより正確な logDを算出することができる。

[0015] また、ォクタノール中濃度測定ステップは、ォクタノールを抽出して希釈し、当該希釈したォクタノールにおける化学物質の濃度を、質量分析計を用いて測定することにより化学物質の濃度を測定する、ことが望ましい。この構成によれば、ォクタノールにおける濃度がバッファー液における濃度に比べて高い場合等でも正確に logDを算出すること力 Sできる。

[0016] 本発明は、上記の方法の発明を提供する他に、以下のようにサンプリング装置及び logD測定システムの発明を提供することができる。

[0017] 本発明に係るサンプリング装置は、管状の先端部を備え当該先端部を上方力液体に挿入して当該先端部から当該液体を抽出する抽出手段と、上層の液体と互いに混合しなレ、プラグ用液体を抽出手段の先端部に注入するプラグ注入手段と、プラグ注入手段によりプラグ用液体が注入された抽出手段を下層の液体を抽出するように制御する抽出制御手段と、を備えることを特徴とする。

[0018] 本発明に係る logD測定システムは、上層である所定の化学物質が溶解したォクタノールと下層である当該所定の化学物質が溶解したバッファー液との 2層に分かれた液体を含んで構成される液体から当該バッファー液をサンプリングして当該化学物質の logDを測定する logD測定システムであって、管状の先端部を備え当該先端部を上方から液体に揷入して当該先端部から当該液体を抽出する抽出手段と、オタタノールと互いに混合しなレ、プラグ用液体を抽出手段の先端部に注入するプラグ注入手段と、プラグ注入手段によりプラグ用液体が注入された抽出手段を、バッファー液を抽出するように制御する抽出制御手段と、抽出制御手段による制御において抽出されたバッファー液における化学物質の濃度を測定するバッファー液中濃度測定手段と、バッファー液中濃度測定手段により測定された濃度に基づいて logDを算出する 1 ogD算出手段と、を備えることを特徴とする。

発明の効果

[0019] 本発明によれば、プラグ用液体が上層の液体を撥ねて注入手段に混入することを防ぐので、下層の液体を抽出する際の上層の液体によるコンタミネーシヨンが発生することを防ぐ。また、プラグ用液体の注入も簡易に行えることから簡易なサンプリングが可能である。

図面の簡単な説明

[0020] [図 1]本発明の実施形態における logD測定システムの構成を模式的に示した図である。

[図 2]本発明の実施形態におけるサンプリング方法及び logD測定方法における処理のフローを示したである。

[図 3]サンプリングの各フェーズを模式的に示した図である。

[図 4]プラグ用液体を用いていない場合の試料を HPLCで分離して質量分析計にかけたときのピークのグラフである。

[図 5]プラグ用液体を用いた場合の試料を HPLCで分離し質量分析計にかけたときのピークのグラフである。

[図 6]本実施形態により質量分析計で濃度を測定した logDの測定値と UVを用いた方法で濃度を測定した logDの測定値との散布図である。

[図 7]本実施形態により測定した logDの実測値と文献値との散布図である。

符号の説明

[0021] 10…測定システム、 11…シリンジ、 11a…ニードノレ、 12…ウエノレプレート、 12a…ゥェノレ、 13· · ·才ー卜サンプラー、 14- - -HPLC, 15· · ·質量分析計、 16· · ·制 ί卸分析用 PC 、 50a…ォクタノーノレ、 50b…/ ッファー ί夜、 51…プラグ、用 ί夜体。

発明を実施するための最良の形態

[0022] 以下、図面とともに本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。

[0023] 図 1は、本発明に係る logD測定システム 10の実施形態の構成を模式的に示した図である。 logD測定システム 10は、化合物等の化学物質の logDをバッファー液及びォクタノールに溶解した当該化合物の濃度を実測することにより測定するものである。濃度を実測する際には、化合物が溶解したバッファー液及びォクタノールを抽出して行う。ここで、バッファー液は logDを測定する際に化合物を溶解させる一方の媒質であり、例えば、水やリン酸水溶液等が相当する。なお、 logDは pH毎に異なる値を取るので、例えば製薬の目的で logDを測定する場合は、バッファー液として人体の体液と同じ pH7. 4の液体を用いることが好ましレ、。例えば pH7. 4のリン酸水溶液は、例えば NaH PO水溶液と Na HPO水溶液とを用いて調整することができる。バ

2 4 2 4

ッファー液として用いるリン酸水溶液の濃度は、 10〜200mM程度であるのが好ましレ、。

[0024] ところで、上述したように logDが 4〜6程度の大きい値をとる場合、バッファー液における濃度はォクタノールにおける濃度の 1/10⁴〜1/10⁶となるので、バッファー液の抽出の際のォクタノールのわずかな混入が logD算出の際には、致命的な問題となる。例えば、後述するようにバッファー液を 2· 5 μ ΐ抽出するとし、 10%のコンタミネーシヨンを許したとする。化合物の logDが 4だとすると、ノくッファー液における濃度はォクタノールにおける濃度の 1/10⁴である。この場合のォクタノールの混入の許容量は、抽出量（2. 5 μ 1) X濃度比（1/10⁴) X許容率（10%)でわずか 25plとなる。従って、本システム 10においては、バッファー液の抽出の際のォクタノールの混入を十分に防止することが必要となる。

[0025] 以下、 logD測定システム 10の構成を説明する。図 1に示すように、 logD測定システム 10は、ゥエルプレート 12と、オートサンプラー 13と、 HPLC14と、質量分析計 15 と、制御分析用 PC (Personal Computer) 16とを含んで構成されている。

[0026] ウエノレプレート 12は、液体を保持できるように複数のゥエル 12aが設けられており、当該ゥエル 12aにおいてォクタノール層とバッファー液層の 2層力らなる、 logDを測定するためのサンプルを調整及び保持するためのものである。ゥヱル 12aは、多検体のサンプノレを同時に調整及び保持できるように、例えば 96個設けられていることが好ましい。

[0027] オートサンプラー 13は、所定位置に置かれたゥヱルプレート 12のゥヱル 12aに保持された液体を抽出する抽出手段である。抽出された液体 (サンプル）は、 HPLC14及び質量分析計 15で分析されるために、自動的に HPLC14に送られる。オートサンプラー 13にはシリンジ 11が備えられており、図 3に示すように、シリンジ 11には液体を抽出する管状の先端部であるニードル 1 laを備えて構成されてレ、る。シリンジ 11は、ニードル 11 aを上方から液体に挿入してニードル 11 aから液体を抽出する。ここで二ードノレ 11aは、その内径がコンマ数 mm単位、長さが数十 mm単位のものを用いることが好ましい。シリンジ 11は、制御分析用 PC16からの制御を受け、 μ ΐ単位での正確な液体の抽出が可能である。なお、オートサンプラー 13として、具体的には例えば CTC Analytics社の HTS PALを用いることができる。

[0028] HPLC14は、オートサンプラー 13から送られたサンプノレを分離して質量分析計 15 に送る。 HPLC14として、具体的には例えば Waters社の allliance 2690を用レヽること力 Sできる。

[0029] 質量分析計 15は、サンプルに含まれる化合物の量の定量値を測定する。具体的には、当該化合物の質量に対応するピークの値に基づいて定量値を測定する。測定されたデータは制御分析用 PCに送信される。なお、質量分析計 15におけるイオン化電圧は、測定対象の化合物のァセトニトリル溶液等の調整用サンプノレを用いて、 lo gDの測定の前に予め適切な値に設定されていることが好ましい。質量分析計 15として、具体的には例えば Waters社の ZQ2000を用いることができる。

[0030] 制御分析用 PC16は、オートサンプラー 13、 HPLC14及び質量分析計 15を制御する。各装置がどのように動作するように制御するのかは後述する。これらの制御は、制御用のプログラム及びソフトウェアを用いて行うのが好ましい。また、制御分析用 P C16は、質量分析計 15により取得された化合物の量の定量値力濃度を算出し、その濃度から logDを算出する。具体的算出方法については、後述する。 HPLC14、質量分析計 15及び制御分析用 PC16は、バッファー液及びォクタノールにおけるィ匕合物の濃度を測定する各濃度測定手段に相当する。また、制御分析用 PC16は測定された濃度から logDを算出する logD算出手段に相当する。

[0031] 次に、 logD測定システム 10を用いた本発明に係るサンプリング方法及び logD測定方法の実施形態について、図 2に示すフローチャートを参照しつつ説明する。

[0032] まず、 logDを測定するためのサンプルを以下のように調整する（S01)。このサンプルは、 logDの測定対象となる化合物をバッファー液及びォクタノールに溶解させて 2 層に分離したものである。測定対象の化合物は、サンプル調整の前に予め DMSO ( Dimethyl Sulfoxide)に ImMあるいは 10mM等の所定の濃度で溶解させておくことが好ましレ、。ォクタノール及びバッファー液に化合物を溶解させやすくするためである。 [0033] サンプル調整のために、まず、化合物を溶解させた DMSOを、 10 μ 1等の所定の分量ずつゥヱルプレート 12の各ゥヱル 12aにピペットを用いて分注する。なお、ピぺットは、ピペットに備えられるマイクロプロセッサの制御を受け、 μ ΐ単位での正確な液体の抽出及び添カ卩が可能であるものを用いることが好ましい。また、多検体のサンプルを同時に抽出できるようにピペットには複数のチャンネルが設けられていることが好ましい。

[0034] 続いて、 300 μ 1等の所定の分量のォクタノールをゥエルプレート 12の各ゥエル 12a にピペットを用いて添加する。その後、各ゥヱル 12aにゥエルキャップ等で蓋をし、ゥェルプレート 12に対して攪拌処理及び遠心処理を行うことが好ましレ、。 DMSOはオタタノールよりバッファー液に溶解しやすレ、ので、予めォクタノールに溶解させておく。正確な logDを測定できるようにするためである。攪拌処理は、例えば振とう機により室温で 5分間激しく行う。また遠心処理は、例えば攪拌処理後に遠心分離機にて 20 OOirpmで 5分間行う。

[0035] 続いて、ゥエルプレート 12にした蓋を外して、 600 μ ΐ等の所定の分量のバッファー液を各ゥエル 12aにピペットを用いて添加する。その後、各ゥエル 12aに再度蓋をし、ゥエルプレート 12に対して攪拌処理及び遠心処理を行う。攪拌処理は、例えば振とう機により室温で 1時間激しく行う。また遠心処理は、例えば攪拌処理後に遠心分離機にて 2000rpmで 5分間行う。以上の処理がなされると、各ウエノレ 12aには、図 3 (b)に示すように、上層のォクタノール層 50aと下層のバッファー液層 50bとが分離した log Dを測定するためのサンプノレが生成される。

[0036] 引き続いて、濃度を測定するためにォクタノール 50a及びバッファー液 50bのサンプリングを行う（S02〜S04)。まず、バッファー液 50bのサンプリングについて、図 3を用いて説明する。上記調整されたサンプルがゥエル 12aに含まれるゥヱルプレート 12 をオートサンプラー 13の所定位置に蓋を外した状態で置く。制御分析用 PC 16から制御を受けたオートサンプラー 13は図 3 (a)に示すように、ゥヱルプレート 12とは別の位置に設けられた、容器でもあるゥォッシュポート 20からシリンジ 11に所定量のブラグ用液体 51を注入する（S02、プラグ注入ステップ)。この注入により、図 3 (a)に示すように、シリンジ 11のニードル 11aは、プラグ用液体 51が含まれている状態となる。上記所定量は、例えば 2. 5 μ ΐ等の適当な量である。なお、図 3に示すように、上記のゥォッシュポート 20の底部には、管 21が接続されている。また、管 21には電磁弁 22が設けられており、この電磁弁 22を開閉することにより下記の洗浄前後でゥォッシュポート 20内の液を管 21から交換することができる。

[0037] プラグ用液体 51は、下層のバッファー液 50bを抽出する際に上層のォクタノール 5 0aがシリンジ 1 1に混入することを防止するものである。プラグ用液体 51としては、上層のォクタノール 50aと互いに混合しないものを用いる。具体的には例えば、水ゃリン酸水溶液を用いることが好ましい。即ちバッファー液 50bと同じもの（化合物が溶解していなレ、もの）を用いることが好ましい。なお、このステップにおける制御分析用 PC 16は、抽出手段の先端部であるニードル 11aにプラグ用液体を注入するように制御するプラグ注入 (制御）手段の役割を果たす。

[0038] 続いて、プラグ用液体がニードル 11aに注入されたシリンジ 11により、下層のバッファー液を抽出する（S03、抽出ステップ)。この抽出は、制御分析用 PC16から制御を受けたオートサンプラー 13が図 3 (b；)〜（e)に示すように、サンプルが入ったゥエル 1 2aにシリンジ 1 1のニードル 11aを挿入することにより行われる。図 3 (b)に示すように、ニードル 11aがォクタノール層 50aを通過する際、ニードル 1 laにはプラグ用液体 5 1が含まれた状態になっているので、当該プラグ用液体 51が、ォクタノール 50aを撥ねォクタノール 50aのシリンジ 11内への混入を防止する。図 3 (c)に示すように、ニードル 11aがバッファー液層 50bに揷入されると、ニードル 11aから所定量のバッファー液 50bを抽出する。この抽出がされると、ニードル 11aには、バッファー液 50bが含まれている状態となる。上記所定量は、例えば 2. 5 μ ΐ等の適当な量である。

[0039] 続いて、図 3 (d)に示すように、ニードル 11aを引き抜くときにォクタノール層 50aを通過する際、ニードル 11aにはバッファー液 50bが含まれた状態になっているので、当該バッファー液 50b力ォクタノール 50aを撥ねォクタノール 50aのシリンジ 11内への混入を防止する。なお、ォクタノール 50aとバッファー液 50bとは、 2層に分かれる性質を有しているので、上記のようにバッファー液 50bはォクタノール 50aを撥ねることができる。続いて、図 3 (e)に示すようにニードル 11aは、サンプルから引き抜かれる。サンプルから引き抜かれた後、ゥォッシュポート 20で水やエタノール等を用いて二一ドル 11aの周囲を洗浄し、ニードル 11aの周囲に付着したォクタノール 50aによりコンタミネーシヨンが発生することを防止する。サンプリングされたバッファー液 50bは、 HPLC14に自動的に送られる。なお、このステップにおける制御分析用 PC16は、抽出手段に対レノファー液 50bを抽出するように制御する抽出制御手段の役割を果たす。

[0040] また、プラグ用液体 51とバッファー液 50bとは通常、図 3に示すように 2層に別れず混合するが（図 3では説明を分力^やすくするため 2層に分けている）、抽出したバッファー液層 50bに含まれる化合物の量は変わらないので、バッファ一層中の濃度の測定を行うことができる。

[0041] 次に、ォクタノール 50aのサンプリングについて、説明する。ォクタノール層 50aは上層であるので、抽出の際のコンタミネーシヨンのおそれはないので、ピペット等により抽出を行う（S04)。ところで、ォクタノール 50aにおける化合物の濃度は、バッファ一液 50bにおける化合物の濃度に比べて高レ、。上述したように例えば logDが 4のとき、ォクタノールにおける化合物の濃度はバッファー液 50bにおける化合物の濃度の 1000倍である。従って、質量分析計 15におけるイオン飽和を避けるため、抽出したォクタノール 50aをエタノール等の希釈用の溶媒で希釈することが好ましい。 logDが 4〜6の高い値をとる場合でも正確に測定できるように、希釈は例えば数千倍のォーダで行われることが望ましい。希釈されたォクタノール 50aは、別のゥヱルプレートに入れ、バッファー液の抽出と同様にオートサンプラー 13により抽出され HPLC14に自動的に送られる。なお、バッファー液 50bのサンプリングが先に行われる必要はなく、ォクタノール 50aのサンプリングが先に行われてもよレ、。

[0042] 引き続いて、ゥヱル 12aから抽出され HPLC14に送られたォクタノール 50a及びバッファー液 50bにおける logD測定対象の化合物の濃度力 HPLC14及び質量分析計 15を用いてそれぞれ測定される（S05、バッファー液中濃度測定ステップ、ォクタノール中濃度測定ステップ)。濃度の測定は具体的には、質量分析計 15により取得されたスペクトルデータにおける当該化合物に対応するピーク値から、各溶液に含まれる化合物の量の定量値を算出することにより行われる。なお、定量値の算出等の情報処理は制御分析用 PC16において行われる。なお、ォクタノール 50a及びバッファー液 50bにおける濃度の測定は、それぞれ別々のタイミングで行われる。

[0043] なお、 S05での各溶液中における濃度の測定は、例えば上記のような質量分析計

15を用いた方法でなぐ UV (Ultra Violet :紫外線）の吸光率に基づいた測定法を用いて行うこととしてもよい。

[0044] 引き続いて、制御分析用 PC16が、測定された濃度から次の式を用いて logDを算出する（S06、 logD算出ステップ)。

logD = log ( [ォクタノール層濃度]/レノファー液層濃度] )

=log ( [希釈ォクタノール濃度 X希釈倍率] / [バッファー液層濃度] )

[0045] 上記のように、本実施形態によれば、プラグ用液体 51を用いることにより、下層のバッファー液 50b抽出の際の、上層のォクタノール 50aによるコンタミネーシヨンの発生を防ぐ。また、本実施形態におけるサンプリング方法は、プラグ用液体の注入も簡易に行えることから簡易なサンプリングが可能である。また、コンタミネーシヨンを防止できていることから、正確な濃度の測定が可能となる。従って、容易かつ正確に logDを算出することができる。また、上記のように本実施形態は容易に実施でき、またサンプリングから logDの測定までを自動化することができるので、従来の方法に比べて、多検体を短期間に分析することに適してレ、る。

[0046] なお、サンプリングに用いる 2層の液体は、必ずしも上述したものでなくてもよレ、。上層の液体は、 logD測定対象の化学物質等の所定の化学物質が非水系溶媒に溶解した非水系溶液であればよい。非水系溶媒は、具体的には例えば、炭素数が 4以上のアル力ノールが相当する。また、下層の液体は、上記の所定の化学物質が、水系溶媒に溶解した水系溶液であればょレ、。水系溶媒は、上記の非水系溶媒に不溶な液体であり、具体的には例えば、水又は所定の塩が溶解した水溶液が相当する。また、プラグ用液体も、上記の水系溶媒であればよい。

[0047] 本サンプリング方法が従来の方法と比べてコンタミネーシヨンを防止できていることを、図 4及び図 5を用いて説明する。図 4及び図 5は試料を HPLC14で分離したときのクロマトグラムであり、各クロマトグラムにおいて横軸は時間、縦軸は測定されたピーク強度を示している。図 4及び図 5において（a)は、何も試料を HPLC14に送らなかった場合（ブランク）のクロマトグラムである。（b)は、 logD測定用に調整してぉレ、たォクタノール層 50aとバッファー液層 50bと 2層になっているものから予めォクタノール層 50aのみを除いたバッファー液 50bを抽出したものを測定した場合（ォクタノールによるコンタミネーシヨンが発生しえない場合）のクロマトグラムである。（c)は上述したようにォクタノール層 50aとバッファー液層 50bと 2層になっているもの力もバッファー液 50bを抽出したものを測定した場合のクロマトグラムである。 (d)は（a)と同様にブランクの場合のグラフである。なお、（a)から（まで、同一の装置を用いて連続的に測定を行っている。

[0048] 図 4は、ォクタノール層 50aとバッファー液層 50bと 2層になっているものからのバッファー液 50bを抽出の際（（c)に対応）に、プラグ用液体を用いなかった場合のクロマトグラム、図 5は用いた場合 (本実施形態のようにサンプリングした場合）のクロマトダラムである。図 4 (a)及び図 5 (a)と図 4 (b)及び図 5 (b)との比較等から分かるように、 2. 32-2. 35の範囲の時間のピークが測定対象の化合物に対応するものである。図 4 ( c)では、その 2. 32〜2. 35の範囲の時間のピークが幅をもってしまっているのに対して、図 5 (c)では、 2. 32〜2. 35の範囲の時間のピークが図 4 (b)及び図 5 (b)と同様の形状になっている。これは、プラグ用液体を用いなかった場合（図 4)、ォクタノール 50aによるコンタミネーシヨンが発生し、ォクタノール 50aに含まれる化合物まで検出されてしまっていることを示している。一方、プラグ用液体を用いた場合（図 5、本実施形態の場合）、ォクタノール 50aによるコンタミネーシヨンが発生せず、バッファー液 50bに含まれる化合物のみが検出されたことを示している。

[0049] また、本実施形態のように抽出手段としてニードル 1 1aを備えて構成されるシリンジ 11を用いることとすれば、プラグ用液体 51の注入等の扱いが容易である。また、ニードノレ 11aは、コンマ数 mm単位の内径及び数十 mm単位の長さを有しているのでプラグ用液体を保持しやすぐより確実なコンタミネーシヨンの防止が可能となる。

[0050] また、本実施形態のように質量分析計 15を用いることとすれば、バッファー液における化合物の濃度が低い場合等、即ちバッファー液から抽出したものに含まれるィ匕合物の量が微小な場合等でも、化合物の量の定量ィ匕を行うことができ正確に logDを算出すること力 Sできる。

[0051] 特に logDが 4〜6程度の高い値をとる場合には、より正確に測定することが可能である。質量分析計 15を用いて測定した logDと UVを用いて測定した logDとを化合物毎にプロットしたものが図 6である。図 6に示すように、 UVを用いた方法で十分精度よく測定できなかったもの（グラフ中で" UV>4"と表示してある点、便宜的に logD = 5 としてプロットしてある）や、 UVを用いた方法で測定できなかったもの（グラフ中で "U V N. D. " (Not Detected)と表示してある点、便宜的に logD = 6としてプロットしてある)も測定することが可能となっている。

[0052] また、本実施形態のようにォクタノール 50aにおける濃度も求めることとすれば、より正確な logDの算出が可能となる。また、本実施形態のように logDの値を考慮してォクタノール 50aを希釈して濃度を測定することとすれば、ォクタノール 50aにおける濃度がバッファー液 50bにおける濃度に比べて高い場合でも正確に logDを算出することがでさる。

[0053] また、本実施形態ではバッファー液 50bが特定の pHをとる場合についての logDの測定を行うこととした力本発明の方法を用いて、例えば、バッファー液 50bの pHを複数回変更して logDを測定して logPを算出することもできる。

実施例 1

[0054] 上記の実施形態における実施例を以下に示す。本実施例においては次の器具及び試薬等を用いた。

ゥエルプレート 12 : 96 deep well plate (Agilent) (また、ゥエルプレート 12の蓋として、 9

6 well Cap (Agilent)を用いた）

ォクタノール 50a： Wako特級 1- Octanol

DMSO： DSMO紫外線吸収スペクトル用純溶媒（Dojindo)

エタノール： Wako HPLC用 EtOH

また、 logDの測定対象の化合物としては、以下の表 1に示すものを用いた。

1] 1 mM DMSO溶液 10mM DMSO溶液

リドカイン (Lidocaine) ェストラジオ一ル (estradiol)

アルプレノロ一ル (Alprenolol) ビホナゾ一ル (bifonazole)

アンチピリン (Antipyrine) クロルプロマジン (Chlorpromazine) メトプロロール (Metoprolol) クロザピン (Clozapine)

テルブタリン (Terbutaline) ィ: 5プフ (Imipramine)

ァセブトロール (Acebutolol) ジルチアゼム (Diltiazem)

力ゾレノくマゼヒン (Carbamazepine) クロラムフエニコ一ル (Chloramphenicol) 丁ンプフ；；ン (Desipramme) 丁キサメゾン (Dexamethason)

プロプラノロ一ル (Propranolol) ァミノダロン、 amiodarone)

卜リメ卜プリム (Trimethoprim) これらの化合物は、巿販薬の成分であり、 logDが既知なものである。

上記した本実施形態に係る方法により各化合物について logDを測定した値を以下の表 2及び図 7のグラフに示す。表 2及び図 7のグラフに示す実測値は、ァミノダロンを除き 1つの化合物につき本実施形態による方法での 3回の測定を行い（アミノダロンは 1回測定）、それらの測定値の平均をとつた値である。

[表 2]

表2及び図7のグラフに示す文献値は ^6 (¾6111.2001，44，2490-2497 10 00 ：八 Tool for Lipophilicity Determination in Drug Discovery.2. Basic and Neutral Compo unds、 Franco Lombardo, Marina Y.Shalaeva, Karl A.Tupper, and Feng Gao)に記載されたものである。表 2及び図 7のグラフに示すように、文献値に近い実測値が得られており、本実施形態に係る方法で正確な logDが得られることを示している。

Claims

請求の範囲

[1] 管状の先端部を備え当該先端部を上方から液体に挿入して当該先端部から当該液体を抽出する抽出手段を用レ、て、上層の液体と下層の液体との 2層に分かれた液体を含んで構成される液体から当該下層の液体をサンプリングするサンプリング方法であって、

前記上層の液体と互いに混合しないプラグ用液体を前記抽出手段の先端部に注入するプラグ注入ステップと、

前記プラグ注入ステップにおいて前記プラグ用液体が注入された抽出手段により、前記下層の液体を抽出する抽出ステップと、

を含むサンプリング方法。

[2] 前記上層の液体は、所定の化学物質が溶解したォクタノールであり、

前記下層の液体は、当該所定の化学物質が溶解したバッファー液であり、前記プラグ用液体は、バッファー液である、

ことを特徴とする請求項 1に記載のサンプリング方法。

[3] 管状の先端部を備え当該先端部を上方から液体に挿入して当該先端部から当該液体を抽出する抽出手段を用いて、上層である所定の化学物質が溶解したオタタノールと下層である当該所定の化学物質が溶解したバッファー液との 2層に分かれた液体を含んで構成される液体から当該バッファー液をサンプリングして当該化学物質の logDを測定する logD測定方法であって、

前記ォクタノールと互いに混合しなレ、プラグ用液体を前記抽出手段の先端部に注入するプラグ注入ステップと、

前記プラグ注入ステップにおいて前記プラグ用液体が注入された抽出手段により、前記バッファー液を抽出する抽出ステップと、

前記抽出ステップにおいて抽出されたバッファー液における前記化学物質の濃度を測定するバッファー液中濃度測定ステップと、

前記バッファー液中濃度測定ステップにおいて測定された濃度に基づいて前記 lo gDを算出する logD算出ステップと、

を含む logD測定方法。

[4] 前記バッファー液中濃度測定ステップにおける濃度の測定は質量分析計を用いて行われることを特徴とする請求項 3に記載の logD測定方法。

[5] 前記ォクタノールにおける前記化学物質の濃度を測定するォクタノール中濃度測定ステップを更に含み、

前記 logD算出ステップにおいて、前記バッファー液中濃度測定ステップ及び前記ォクタノール中濃度測定ステップにおいて測定された濃度に基づいて前記 logDを算出する、

ことを特徴とする請求項 3又は 4に記載の logD測定方法。

[6] 前記ォクタノール中濃度測定ステップは、前記ォクタノールを抽出して希釈し、当該希釈したォクタノールにおける前記化学物質の濃度を、質量分析計を用いて測定することにより前記化学物質の濃度を測定する、

ことを特徴とする請求項 5に記載の logD測定方法。

[7] 上層の液体と下層の液体との 2層に分かれた液体を含んで構成される液体から当該下層の液体をサンプリングするサンプリング装置であって、

管状の先端部を備え当該先端部を上方から液体に挿入して当該先端部から当該液体を抽出する抽出手段と、

前記上層の液体と互いに混合しないプラグ用液体を前記抽出手段の先端部に注入するプラグ注入手段と、

前記プラグ注入手段により前記プラグ用液体が注入された抽出手段を前記下層の液体を抽出するように制御する抽出制御手段と、

を備えるサンプリング装置。

[8] 上層である所定の化学物質が溶解したォクタノールと下層である当該所定の化学物質が溶解したバッファー液との 2層に分かれた液体を含んで構成される液体から当該バッファー液をサンプリングして当該化学物質の logDを測定する logD測定システムであって、

前記ォクタノールと互いに混合しなレ、プラグ用液体を前記抽出手段の先端部に注入するプラグ注入手段と、

前記プラグ注入手段により前記プラグ用液体が注入された抽出手段を、前記バッファー液を抽出するように制御する抽出制御手段と、

前記抽出制御手段による制御において抽出されたバッファー液における前記化学物質の濃度を測定するバッファー液中濃度測定手段と、

前記バッファー液中濃度測定手段により測定された濃度に基づいて前記 logDを算出する logD算出手段と、

を備える logD測定システム。