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WO2006021639A1 - Milieu d'enrichissement selectif des salmonelles comprenant du tetrathionate et un sel de magnesium - Google Patents

Milieu d'enrichissement selectif des salmonelles comprenant du tetrathionate et un sel de magnesium Download PDF

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WO2006021639A1
WO2006021639A1 PCT/FR2005/001724 FR2005001724W WO2006021639A1 WO 2006021639 A1 WO2006021639 A1 WO 2006021639A1 FR 2005001724 W FR2005001724 W FR 2005001724W WO 2006021639 A1 WO2006021639 A1 WO 2006021639A1
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salmonella
medium
tetrathionate
enrichment
salt
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Alain Rambach
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Classifications

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a selective salmonella enrichment medium comprising tetrathionate or a salt thereof and at least one magnesium salt, and a method for detecting salmonella in a sample employing said selective enrichment medium.
  • Salmonella are at the origin of animal diseases transmissible to humans by food in particular and whose development can induce pathogenic effects. They are the source of accidents, in particular food, identified for a long time. Their detection is therefore very important, particularly in
  • Various methods allow the detection of the presence of salmonella from a suspected sample. Some of these methods comprise a salmonella development step possibly present, by bringing said sample into contact with a Salmonella-specific enrichment medium.
  • Enrichment media liquid, semi-solid or solid seeded with a polymicrobial product containing salmonella, can increase the growth and proportion of salmonella, and then detect them in a sample.
  • the inventor has shown that two salmonella-selective agents, tetrathionate and a magnesium salt are compatible with each other that they can be combined to obtain an efficient and robust enrichment medium, with improved performance. compared to conventional methods of enrichment on selective medium.
  • a further benefit of the described method is that the total time to demonstrate the presence or absence of salmonella from the test sample can be reduced to 44 h maximum while traditional methods require a first delay of 48 h (24 h of culture in revivification medium then 24 h of culture in a selective medium) before a step of isolation on selective medium (18-24 h), a total of 66 to 72 h.
  • An object of the present invention is therefore a Selenium selective enrichment medium characterized in that it comprises tetrathionate or a salt thereof, and at least one magnesium salt.
  • the magnesium salt is used at a concentration sufficient to create a high osmotic pressure in said medium.
  • any other compound having a similar effect on osmotic pressure in an aqueous medium could also be used as a replacement or supplement to the magnesium salt.
  • said magnesium salt is present in the enrichment medium of the invention at a concentration of between 0.1 and 50 g / l, preferably 2 and 40 g / l, and more preferably still between 7 and 35 g / l.
  • the magnesium salt is preferably selected from magnesium carbonate, magnesium chloride or magnesium sulfate.
  • the tetrathionate or one of its salts is present in the enrichment medium of the invention at a concentration of between 0.1 and 40 g / l, preferably 0, 5 and 30 g / l and more preferably still between 1 and 25 g / l.
  • the tetrathionate salt is preferably selected from potassium tetrathionate or sodium tetrathionate which may be used as the magnesium salt (s).
  • the present invention also relates to a method for detecting salmonella in a sample comprising the following steps:
  • the selective enrichment medium used for the enrichment step is as defined according to the present invention.
  • the stage of revivification is the stage allowing the growth and multiplication of salmonellae, including those in dormancy.
  • This step also allows the stressed bacteria to recover their stability.
  • the duration of this step is considerably reduced (approximately 4 hours according to the invention against approximately 24 hours according to the prior art) because of the quality of the step d subsequent enrichment.
  • the enrichment medium of the invention allows a salmonella enrichment of the revived medium such that the revivification stage does not need to be performed beyond about 4 hours to fully play its role.
  • this revivification step is not mandatory and is optional in the context of the present invention. However, it is of particular interest when the process of the invention is implemented in the field of food processing because the desired food safety requires reliable detection of salmonellae possibly present in the sample tested, including dormant salmonellae.
  • the salmonella isolation step is, for its part, carried out in a conventional manner well known to those skilled in the art. Given the high salmonella content obtained in the medium at the end of the enrichment step, this isolation step need not be selective (that is to say to allow detection salmonella compared to other bacteria) and may be specific only for salmonella. This isolation step may for example be carried out by immunological or PCR methods but also by very specific methods such as those carried out on Salmonella detection agar media (Hektoen agar, etc.).
  • the isolation step comprises an analysis procedure chosen from the group consisting of enzymatic immunological analyzes, hybridization analyzes of nucleic acid probes, pure culture assays. , analyzes using biochemical indicators revealed by colorimetric methods and immunoimmobilisation analyzes.
  • An example of isolation analysis is the technique.
  • the method of the present invention can be used to test food samples, beverages, solid, liquid environmental samples such as water, or aerial or clinical samples.
  • Each sample consists of 25 ml of yogurt inoculated in one case with a mixture of 100 Salmonella and 1,000,000 E. coli and in another case of 100 Salmonella and 1,000,000 Citrobacter so that the salmonella are in a proportion of 1 in 10,000 compared to the competitive flora.
  • Each sample is mixed with 225 ml of a revivification broth of formula (in grams per liter of water): peptone 5; NaCl 5; calcium carbonate 10.
  • 10 ml of the aforesaid mixture are recovered in a container and one adds: either, in the case of "control medium", 0.38 g of a supplement of formula (in grams per liter of water): bile 8; calcium carbonate 10; 0.07 glossy green and tetrathionate 20, or, in the case of the invention, 0.31 g of a supplement of formula (in grams per liter of water): bile 8; calcium carbonate 10; Bright green 0.07; tetrathionate 3 and magnesium chloride (Table 1).
  • control medium 0.38 g of a supplement of formula (in grams per liter of water): bile 8; calcium carbonate 10; 0.07 glossy green and tetrathionate 20, or, in the case of the invention, 0.31 g of a supplement of formula (in grams per liter of water): bile 8; calcium carbonate 10; Bright green 0.07; tetrathionate 3 and magnesium chloride (Table 1).

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Abstract

La présente invention concerne un milieu d'enrichissement sélectif de salmonelles comprenant du tétrathionate ou un de ses sels et au moins un sel de magnésium, ainsi qu'un procédé de détection de salmonelles dans un échantillon mettant en œuvre ledit milieu d'enrichissement sélectif.

Description

MILIEU D'ENRICHISSEMENT SELECTIF DES SALMONELLES COMPRENANT DU TETRATHIONATE ET UN SEL DE MAGNESIUM
La présente invention concerne un milieu d'enrichissement sélectif de salmonelles comprenant du tétrathionate ou un de ses sels et au moins un sel de magnésium, ainsi qu'un procédé de détection de salmonelles dans un échantillon mettant en œuvre ledit milieu d'enrichissement sélectif.
Les salmonelles sont à l'origine de maladies animales transmissibles à l'homme par l'alimentation notamment et dont le développement peut induire des effets pathogènes. Elles sont la source d'accidents, notamment alimentaires, recensés depuis longtemps. Leur détection est donc très importante, notamment dans
'l'industrie alimentaire, au niveau du contrôle des eaux, ou en médecine. Différents procédés permettent la mise en évidence de la présence de salmonelles à partir d'un échantillon suspecté. Certains de ces procédés comprennent une étape de développement des salmonelles éventuellement présentes, par la mise en contact dudit échantillon avec un milieu d'enrichissement spécifique des salmonelles.
Les milieux d'enrichissement, liquides, semi-solides ou solides ensemencés avec un produit polymicrobien renfermant des salmonelles, permettent d'augmenter la croissance et la proportion des salmonelles, et ensuite de les détecter dans un échantillon.
Depuis de très nombreuses années, trois familles de formules de milieux d'enrichissement sont généralement utilisées contenant respectivement comme agent sélectif soit du sélénite (depuis 1936), soit du tétrathionate, éventuellement formé extemporanément à partir de thiosulfate et de solution d'iodo-iodurée (depuis
1923), soit un sel de magnésium à concentration élevée (depuis 1956).
Cependant, les milieux d'enrichissement de salmonelles disponibles sur le marché ont des efficacités variables en fonctions de divers facteurs tels que les souches à détecter, le type d'échantillon ou la flore compétitive qui se trouve dans ces échantillons. De plus, actuellement l'un des principaux axes de recherche et de développement technologique porte sur la rapidité de détection des salmonelles. Ainsi, les techniques les plus récentes de « puces à ADN » permettent non seulement de procéder à des tests de présence/absence mais aussi de quantifier la présence bactérienne éventuelle. Cependant ses techniques sont complexes à mettre en œuvre, coûteuses et ne donnent pas d'indications sur la viabilité des bactéries. D'où un délai supplémentaire dans la détection.
Ainsi, il existe actuellement un besoin pour une technique de détection des salmonelles qui soit efficace et ne présente pas de variation de l'efficacité en fonctions de divers facteurs et qui permette une détection rapide des salmonelles vivantes.
De manière surprenante et inattendue, l'inventeur a montré que deux agents sélectifs des salmonelles, le tétrathionate et un sel de magnésium sont compatibles entre eux qu'ils peuvent être combinés pour obtenir un milieu d'enrichissement efficace et robuste, avec des performances améliorées par rapport aux méthodes classiques d'enrichissement sur milieu sélectif.
En outre, un intérêt supplémentaire de la méthode décrite est que le délai total pour la mise en évidence de la présence ou de l'absence de salmonelles à partir de l'échantillon testé peut être réduit à 44 h maximum tandis que les méthodes traditionnelles nécessitent un premier délai de 48 h (24 h de culture en milieu de revivification puis 24 h de culture en milieu sélectif) avant une étape d'isolement sur milieu sélectif (18-24 h), soit un total de 66 à 72 h.
Un objet de la présente invention est donc un milieu d'enrichissement sélectif de salmonelles caractérisé en ce qu'il comprend du tétrathionate ou un de ses sels, et au moins un sel de magnésium.
Dans le milieu d'enrichissement de l'invention, le sel de magnésium est utilisé à une concentration suffisante pour créer une forte pression osmotique dans ledit milieu. Ainsi, tout autre composé ayant un effet similaire sur la pression osmotique en milieu aqueux pourrait également être utilisé en remplacement ou en complément du sel de magnésium. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit sel de magnésium est présent dans le milieu d'enrichissement de l'invention à une concentration comprise entre 0,1 et 50 g/1, de préférence 2 et 40 g/1 et plus préférentiellement encore entre 7 et 35 g/1. Le sel de magnésium est choisi de préférence parmi le carbonate de magnésium, le chlorure de magnésium ou le sulfate de magnésium.
Selon un mode préféré de réalisation de la présente invention, le tétrathionate ou l'un de ses sels est présent dans le milieu d'enrichissement de l'invention à une concentration comprise entre 0,1 et 40 g/1, de préférence 0,5 et 30 g/1 et plus préférentiellement encore entre 1 et 25 g/1.
Le sel de tétrathionate est choisi de préférence parmi le tétrathionate de potassium ou le tétrathionate de sodium quel(s) que soi(en)t le(s) sel(s) de magnésium utilisé(s).
La présente invention a également pour objet un procédé de détection de salmonelles dans un échantillon comprenant les étapes suivantes :
- revivification des salmonelles par incubation dudit échantillon dans un bouillon de revivification,
- enrichissement des salmonelles par incubation d'une portion aliquote du milieu de revivification dans un milieu d'enrichissement sélectif des salmonelles, et
- isolement des salmonelles, caractérisé en ce que le milieu d'enrichissement sélectif utilisé pour l'étape d'enrichissement est tel que défini selon la présente invention.
L'étape de revivification (ou pré-enrichissement) est l'étape permettant la croissance et la multiplication de salmonelles, y compris de celles en dormance.
Cette étape permet également aux bactéries stressées de récupérer leur stabilité.
Dans le cadre du procédé de détection de salmonelles de la présente invention, la durée de cette étape est considérablement réduite (environ 4 h selon l'invention contre environ 24 h selon l'art antérieur) en raison de la qualité de l'étape d'enrichissement subséquente. En effet, le milieu d'enrichissement de l'invention permet un enrichissement en salmonelles du milieu revivifié tel que l'étape de revivification n'a pas besoin d'être réalisée au-delà d'environ 4 h pour jouer pleinement son rôle.
Il est à souligner que cette étape de revivification n'a aucun caractère obligatoire et est facultative dans le cadre de la présente invention. Elle présente toutefois un intérêt particulier quand le procédé de l'invention est mis en œuvre dans le domaine de l' agroalimentaire car la sécurité alimentaire recherchée nécessite une détection fiable des salmonelles éventuellement présentes dans l'échantillon testé, y compris des salmonelles en dormance.
L'étape d'isolement des salmonelles est, quant à elle, réalisée de façon classique bien connue de l'homme du métier. Compte tenu de la forte teneur en salmonelles obtenue dans le milieu à l'issue de l'étape d'enrichissement, cette étape d'isolement n'a pas besoin d'être sélective (c'est-à-dire de permettre une détection de salmonelles par rapport à d'autres bactéries) et peut être seulement spécifique des salmonelles. Cette étape d'isolement peut par exemple être réalisée par des méthodes immunologiques ou PCR mais également par des méthodes très spécifiques telles que celles réalisées sur milieux géloses de détection de salmonelles (Hektoen agar, etc).
Dans un mode particulier de réalisation dudit procédé, l'étape d'isolement comprend un mode opératoire d'analyse choisi dans le groupe consistant en des analyses immunologiques enzymatiques, des analyses d'hybridation de sondes d'acides nucléiques, des analyses en culture pure, des analyses utilisant des indicateurs biochimiques notamment révélés par des méthodes colorimétriques et des analyses d'immunoimmobilisation. On peut citer comme exemple d'analyse d'isolement la technique.
Le procédé selon la présente invention peut être utilisé pour tester des échantillons alimentaires, des boissons, des échantillons environnementaux solides, liquides tels que l'eau, ou aérien ou des échantillons cliniques.
L'invention ne se limite pas à la seule description ci-dessus et l'exemple ci- après est uniquement illustratif. EXEMPLE :
Comparaison d'un milieu d'enrichissement liquide ne contenant que le tétrathionate au titre de facteur sélectif avec un milieu d'enrichissement liquide contenant du tétrathionate et un sel de magnésium conformément à l'invention. Chaque échantillon est constitué de 25 ml de yaourt ensemencés dans un cas avec un mélange de 100 Salmonella et de 1 000 000 E. coli et dans un autre cas de 100 Salmonella et de 1 000 000 Citrobacter de telle sorte que les salmonelles sont dans une proportion de 1 pour 10 000 par rapport à la flore compétitive. 1. Revivification
Chaque échantillon est mélangé à 225 ml d'un bouillon de revivification de formule (en grammes par litre d'eau) : peptone 5 ; NaCl 5 ; carbonate de calcium 10.
Le mélange est mis à incuber à 37°C pendant 4 h. 2. Enrichissement
10 ml du susdit mélange sont récupérés dans un récipient et l'on ajoute : soit, dans le cas du « milieu témoin », 0,38 g d'un supplément de formule (en grammes par litre d'eau) : bile 8 ; carbonate de calcium 10 ; Vert brillant 0,07 et tétrathionate 20, - soit, dans le cas de l'invention, 0,31 g d'un supplément de formule (en grammes par litre d'eau) : bile 8 ; carbonate de calcium 10 ; Vert brillant 0,07 ; tétrathionate 3 et chlorure de magnésium 10 (Tableau 1).
Tableau 1
Figure imgf000007_0001
L'enrichissement est réalisé par une incubation du milieu à 37°C pendant 22 h. 3. Isolement
Environ 10 microlitres de la culture obtenue en 2. sont isolés sur milieu d'isolement différentiel et, après 18-24 h d'incubation à 37°C, la flore Salmonella d'une part et la flore compétitive d'autre part sont dénombrées (Tableau 2).
Tableau 2
Figure imgf000007_0002

Claims

REVENDICATIONS
1. Milieu d'enrichissement sélectif de salmonelles caractérisé en ce qu'il comprend du tetrathionate ou un de ses sels et au moins un sel de magnésium.
2. Milieu selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'il comprend le sel de magnésium à une concentration comprise entre 0,1 et 50 g/1, de préférence 2 et 40 g/1 et plus préférentiellement encore entre 7 et 35 g/1.
3. Milieu selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le sel de magnésium est choisi parmi le carbonate de magnésium, le chlorure de magnésium et le sulfate de magnésium.
4. Milieu selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'il comprend le sel de tetrathionate à une concentration comprise entre 0,1 et 40 g/1, de préférence 0,5 et 30 g/1 et plus préférentiellement encore entre 1 et 25 g/1.
5. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que le sel de tetrathionate est choisi parmi le tetrathionate de potassium et le tetrathionate de sodium.
6. Procédé de détection de salmonelles dans un échantillon comprenant les étapes suivantes :
- enrichissement des salmonelles par transfert d'une portion aliquote du milieu de revivification incubé dans un milieu d'enrichissement sélectif et incubation, et
- isolement des salmonelles, caractérisé en ce que le milieu d'enrichissement sélectif utilisé pour l'étape d'enrichissement est tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'étape d'enrichissement est précédée d'une étape de revivification par ensemencement de l'échantillon sur un milieu de revivification, et incubation,
8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que l'étape d'isolement comprend un mode opératoire d'analyse choisi dans le groupe consistant en des analyses immunologiques enzymatiques, des analyses d'hybridation de sondes d'acides nucléiques, des analyses en culture pure, des analyses utilisant des indicateurs biochimiques notamment révélés par des méthodes colorimétriques et des analyses d'immunoimmobilisation.
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