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WO2006011682A1 - リンパ球の保存及び輸送方法 - Google Patents

リンパ球の保存及び輸送方法 Download PDF

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WO2006011682A1
WO2006011682A1 PCT/JP2005/014365 JP2005014365W WO2006011682A1 WO 2006011682 A1 WO2006011682 A1 WO 2006011682A1 JP 2005014365 W JP2005014365 W JP 2005014365W WO 2006011682 A1 WO2006011682 A1 WO 2006011682A1
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lymphocytes
transported
mononuclear cells
peripheral blood
lymphocyte
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Hidemasa Jinguji
Atsutaka Noguchi
Shiho Sato
Kazutoshi Sato
Hiroshi Goji
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Medinet Co Ltd
Original Assignee
Medinet Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C12N5/0087—Purging against subsets of blood cells, e.g. purging alloreactive T cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system

Definitions

  • the present invention relates to a method for storing lymphocytes.
  • the present invention also relates to a method for transporting lymphocytes.
  • cancer malignant neoplasm
  • immune cell therapy refers to collecting blood from a patient, separating and culturing lymphocytes contained in the blood, activating and / or proliferating the lymphocytes, activating and / or proliferating the lymphocytes. This refers to the treatment of returning activated lymphocytes (including activated and / or proliferated lymphocytes including lymphokine activated killer cells (hereinafter referred to as LAK cells)) to the patient's body.
  • LAK cells lymphokine activated killer cells
  • lymphocytes collected from the patient and the activated and Z or proliferated lymphocytes for a certain period of time in advance. There is a case.
  • red blood cells or platelets used for transfusion In general, however, only the storage temperature of whole blood, red blood cells or platelets used for transfusion is known. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a technique for maintaining the lymphocyte viable cell rate and the IFN-a producing cell rate during storage and transportation.
  • the viable cell ratio is maintained even after 10 hours or more, especially 24 hours or more.
  • the rate of IFN-a producing cells can be kept high.
  • the temperature may be maintained with a normal thermostatic device, and when transported, it may be transported in a state of being placed in the thermostatic device.
  • the cold storage for maintaining the temperature of the present invention may be stored and Z or transported in a normally used cold storage box having excellent heat insulation.
  • FIG. 1 is a graph showing changes in the percentage of viable cells over time when lymphocytes (L AK cells) are suspended in physiological saline and stored at 0, 6, 14 and 25 X.
  • FIG. 2 is a graph showing the change over time in the rate of IFN—r producing cells when lymphocytes (L AK cells) are suspended in physiological saline and stored in 0, 6, 14 and 2.
  • lymphocytes are collected and separated from the blood of patients with cancer and Z or infection.
  • peripheral blood mononuclear cells may be separated after collection.
  • any method for separating nucleated cells from red blood cells can be used as a method for separating peripheral blood mononuclear cells.
  • Ficoll pack Ficol 1-Paque density gradient method is generally used.
  • peripheral blood mononuclear cells By isolating peripheral blood mononuclear cells, the storage temperature range described above is expanded to 5 to 2 2 X.
  • the isolated peripheral blood mononuclear cells may be suspended in any carrier as long as they are isotonic with cells, but are preferably suspended in autologous plasma.
  • lymphocytes are cultured.
  • the lymphocyte refers to a T lymphocyte, a B lymphocyte, an NK cell, or an NKT cell.
  • the culture method is not particularly limited, and any culture method generally used in the art may be used. When used for activated autolymphocyte therapy, a method using an anti-CD3 antibody and IL-12 is particularly preferable.
  • the anti-CD3 antibody may be added to the medium or immobilized on the culture vessel, but it is preferable to seed lymphocytes in a culture vessel such as a flask on which the anti-CD3 antibody is immobilized.
  • the concentration of IL-2 is preferably added to the medium so as to have a concentration of 100 to 200 IUZmL.
  • Culture 3 4 to 3 8 ° C, preferably at 3 7 ° C,. 2 to 1 0% conducted preferably at C_ ⁇ 2 under 5% culture period from one day to 2 days 0, especially 1 ⁇ 2 weeks is preferred.
  • the medium that can be used is not particularly limited, but AIM-V medium (Invitrogen), RPM 1-1640 medium (Invitrogen), Dulbecco's modified medium (Invitrogen), Iskov medium (Invitrogen), KBM Commercially available media used for cell culture such as media (Kohjin Bio) and AL y S media (Cell Science Laboratory) can be used. If necessary, 5 to 20% of bovine serum, fetal bovine serum, human serum, human plasma, etc. can be added.
  • the culture vessel is not particularly limited, and culture plates, petri dishes, flasks, bags, etc. that are usually used in the field can be used.
  • the concentration for seeding each cell group can be freely set according to the situation.
  • the lymphocytes separated and cultured from the blood thus collected and then harvested are prepared as an injection using a commonly used carrier.
  • the carrier to be used is not particularly limited.
  • an isotonic solution such as physiological saline, P B S (phosphate buffered physiological saline) and the like can be mentioned.
  • a serum component such as albumin may be added to the isotonic solution.
  • lymphocytes preserved in this state maintain a high viable cell rate and an IFN-a-producing cell rate, and are useful as an injection for immune cell therapy.
  • it is useful as an injection for use in immune cell therapy for cancer and Z or infection.
  • the collected blood is stored and Z or transported at 16 to 22 ° C., so that peripheral blood mononuclear cells are well separated from the collected blood and proliferative. Can be maintained in a state.
  • the storage temperature range is expanded to 5 to 22 while maintaining a high proliferative state.
  • the lymphocytes obtained by culturing are stored and transported or transported at 0-6 ° C. Thereby, it is possible to obtain lymphocytes which maintain a high viable cell rate and an IFN-producing cell rate while maintaining a high proliferative state. Therefore, in lymphocyte culture, there is an excellent effect by imposing different handling on the sample blood before culturing and the lymphocyte obtained after culturing, and further, by combining these handling, a more excellent effect can be obtained it can.
  • culture method used here is not limited to the above-described conditions, but can also apply conditions commonly known in lymphocyte culture.
  • Human peripheral blood mononuclear cells are seeded in anti-CD3 antibody (Orthoclone: Janssen Pharma) solid-phase flask (Sumitomo Beichikrite) and IL-2 is adjusted to 280 I UZmL in the medium (KBM400: Kojin Bio) And cultured (37 ° C, C 0 2 : 5%).
  • lymphocytes After culturing for 14 days, lymphocytes (LAK cells) were collected by centrifugation and washed.
  • the cultured lymphocytes were stored in physiological saline (0.2% human serum albumin) at a density of 5 ⁇ 10 7 ce 11 s / mL.
  • the viable cell ratio after each storage time was determined by the PI (Propidiurn Iodide) method, and I FN-a producing cells.
  • the rate was measured by the measurement method of intracellular site force by PMA (Phorbo 1 1 2 -Myristate 13-Ac etate) and ionomycin (I ono myc in) stimulation.
  • Figure 1 shows the change in the viable cell ratio after 6, 30, 36, and 50 hours after harvesting at each storage temperature.
  • Figure 2 shows the change in the IFN-producing cell rate after 6, 24, 30, 36, and 50 hours after harvesting at each storage temperature.
  • the method of the present invention provides a method for storage and transport while maintaining a high lymphocyte viable cell rate and IFN-producing cell rate, It has excellent effects as a storage and Z or transport method for injections containing spheres.

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Abstract

保存及び／又は輸送中にリンパ球の生細胞率やＩＦＮ−γ産生細胞率が高く維持できる技術を提供することを目的とする。リンパ球を０～６℃で保存することにより、ハーベスト後、１０時間以上、とりわけ２４時間以上経過しても、生細胞率及びＩＦＮ−γ産生細胞率を高く維持することが可能となる。上記温度を保つには、通常の恒温機器で維持すれば良く、また、輸送する場合は、前記恒温機器に入れた状態で輸送すれば良い。簡単な方法としては、断熱性の優れた通常使用される保冷箱に本発明の温度を維持するための保冷剤を入れて輸送すれば良い。

Description

明細書
リンパ球の保存及び輸送方法 技術分野
本発明はリンパ球の保存方法に関する。また、 リンパ球の輸送方法に関する。 背景技術
日本人の最も多い死亡原因として悪性新生物 （以下、 癌という） が挙げられ る。 癌の治療法としては、 三大療法と言われる外科療法、 化学療法、 放射線療 法があるが、 夫々治療の困難性や副作用等といつた問題がある。
近年、 上記三大療法の他に癌の新しい治療法として免疫細胞療法が行われて おり、 この免疫細胞療法は、 上記の三大療法のような治療の困難性や副作用と いった問題が少ないため注目されている。 また、 免疫細胞療法は、 感染症、 と りわけ、 ウィルス感染症に対する新たな治療法としても注目されている。
ここで、 免疫細胞療法とは、 患者から血液を採取し、 その血液中に含まれる リンパ球を分離して培養し、 そのリンパ球を活性化及び/又は増殖させ、 その 活性化及び Z又は増殖させたリンパ球 （ここでいう活性化及び/又は増殖させ たリンパ球には L ym p h o k i n e A c t i v a t e d K i l l e r細 胞（以下、 L AK細胞という） を含む） を患者の体内に戻す療法のことをいう。 この免疫細胞療法を行うためには、 リンパ球を培養する細胞培養施設を備え ている必要があるが、 全国各地の医療機関 （以下、 病院等という） がその施設 を備えているわけではない。 そこで、 細胞培養施設を備えていない病院等でも 免疫細胞療法を容易に行うためには、 病院等から細胞培養施設までリンパ球培 養用血液を輸送し、 リンパ球培養を行った後点滴剤として調製し細胞培養施設 から病院等へ輸送する必要がある。
また、 輸送を伴わない場合でも、 患者の体内へ戻すスケジュール等によって は、 予め、 患者から採取したリンパ球や活性化及び Z又は増殖させたリンパ球 を一定時間保存しておくことが必要となる場合がある。
その場合、 リンパ球の細胞機能を表す指標の一つである生細胞率ゃィン夕ー フエロンァ （以下、 I F N—ァという） 産生細胞率等を維持しなければならな いという問題があった。
しかしながら、 一般に、 血液の保存及び Z又は輸送については、 輸血に用い られる全血、 赤血球又は血小板の保存温度が知られているのみである。 発明の開示
' 本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、 保存や輸送中にリンパ球の 生細胞率や I F N—ァ産生細胞率を維持するための技術を提供することを目的 とする。
本発明によれば、 リンパ球を注射剤 （例えば点滴剤等） として調製した後 0 〜 6 °Cで保存することにより、 1 0時間以上、 とりわけ 2 4時間以上経過して も、 生細胞率及び I F N—ァ産生細胞率を高く維持することが可能となる。 上 記温度を保つには、通常の恒温機器で維持すれば良く、 また、輸送する場合は、 前記恒温機器に入れた状態で輸送すれば良い。 簡単な方法としては、 断熱性の 優れた通常使用されている保冷箱に本発明の温度を維持するための保冷剤を入 れて保存及び Z又は輸送すれば良い。 図面の簡単な説明
図 1はリンパ球（L AK細胞） を生理食塩水に懸濁し、 0、 6、 1 4、 2 5 X で保存した場合の生細胞率の経時的変化を示したグラフである。
図 2はリンパ球 （L AK細胞） を生理食塩水に懸濁し、 0、 6、 1 4、 2 で保存した場合の I F N— r産生細胞率の経時的変化を示したグラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施形態について説明する。
まず、 癌及び Z又は感染症等の患者血液からリンパ球を採取分離する。
ここで、 採取した血液は 1 6〜2 2 °Cで保存及び/又は輸送することが好ま しい。 1 6〜2 2 °Cで保存及び/又は輸送することにより、 採取した血液から の末梢血単核球の分離性が良く、 かつ増殖性が高い状態で維持することができ るためである。
また、 採取後末梢血単核球分離を行っても良い。 末梢血単核球分離を行う方 法としては一般的に有核細胞を赤血球から分離するいかなる方法を用いること もできる。 例えばフィコールパック （F i c o l 1 - P a q u e ) 密度勾配を 利用する方法等が一般的に使用される。
末梢血単核球を分離しておくことにより、 先に述べた保存温度範囲が 5〜 2 2 Xに広がる。 分離した末梢血単核球は細胞と等張である担体であればいずれ の担体に懸濁しても良いが、 自己血漿に懸濁することが好ましい。
次いで、 保冷箱に 1 6〜 2 2 °Cが担保できるよう保冷剤と共に血液の入つた 採血管を入れ、 保存及び Z又は輸送する。
その後、 血液を分離し （予め、 末梢血単核球を分離している場合は、 この操 作は不要） リンパ球を培養する。 また、 本発明におけるリンパ球とは、 Tリンパ球、 Bリンパ球、 NK細胞又 は NKT細胞をいう。
培養方法は特に限定されないが、 通常当該分野で汎用されている培養方法で あればよく、 活性化自己リンパ球療法に用いる場合、 とりわけ、 抗 C D 3抗体 及び I L一 2を用いた方法が好ましい。
抗 C D 3抗体は培地中に添加しても、 培養容器に固相化してもよいが、 抗 C D 3抗体を固相化したフラスコ等の培養容器にリンパ球を播種することが好ま しい。 I L— 2の濃度は培地中に 1 0 0〜2 0 0 0 I UZmLの濃度となるよ うに添加することが好ましい。
培養は、 3 4〜3 8 °C、 好ましくは 3 7 °Cで、 2〜 1 0 %、 好ましくは 5 % の C〇2条件下で行い、 培養期間は 1日〜 2 0日、 特に 1〜 2週間程度が好まし い。
使用できる培地は特に限定されないが、 A I M— V培地（インビトロジェン）、 R P M 1 - 1 6 4 0培地（インビトロジェン）、ダルべッコ改変ィ一ダル培地（ィ ンビトロジェン）、 イスコフ培地 （インビトロジェン）、 K B M培地 （コージン バイオ)、 AL y S培地 （細胞科学研究所） 等細胞培養に使用されている市販の 培地を使用することができる。 また、 必要に応じて 5〜2 0 %の牛血清、 牛胎 児血清、 ヒト血清、 ヒト血漿等を添加することができる。
培養容器は特に限定されるものではなく、 通常当該分野で使用さ,れる培養用 プレート、 シャーレ、 フラスコ、 バッグ等を利用することができる。 各々の細 胞群を播種する濃度は実施する状況に応じて自由に設定することができる。 このように採取した血液から分離 ·培養後ハーべス卜されたリンパ球を、 通 常使用される担体を用いて、 注射剤として調製する。 用いられる担体としては 特に限定されないが、 例えば、 点滴剤として調製する場合、 生理食塩水、 P B S (リン酸緩衝生理食塩水） 等の等張化液が挙げられる。 なお、 等張化液に血 清成分例えばアルブミン等を添加してもよい。
次いで、 保冷箱に 0〜 6 °Cが担保できるよう保冷剤と共に点滴剤等の注射剤 を入れ、 保存及び/又は輸送する。
この状態で保存したリンパ球は高い生細胞率及び I F N—ァ産生細胞率を維 持しており、 免疫細胞療法に用いる注射剤として有用である。 とりわけ、 癌及 ぴ Z又は感染症に対する免疫細胞療法に用いる注射剤として有用である。
本発明では、 上記した通り、 採取した血液を 1 6〜2 2 °Cで保存及び Z又は 輸送することにより、 採取した血液からの末梢血単核球の分離性が良く、 かつ 増殖性が高い状態で維持することができる。 一方、 採取した血液から予め末梢 血単核球を分離すると、 増殖性が高い状態で維持しながら保存温度範囲が 5〜 2 2 に広がる。 このような増殖性が高い状態で維持される末梢血単核球を用い、 培養して得 られたリンパ球を 0〜 6 °Cで保存及び Z又は輸送する。 これによつて、 増殖性 が高い状態で維持されたまま、 高い生細胞率及び I FN—ァ産生細胞率を維持 するリンパ球を得ることができる。 従って、 リンパ球培養において、 培養前の 試料血液と培養後に得られるリンパ球に異なる取扱いを課すことによつて優れ た効果があり、 更に、 これらの取扱いの組み合わせによってより優れた効果を あげることができる。
なお、 ここで用いられる培養方法は、 上記した条件のみならず、 リンパ球培 養で通常知られた条件が適用可能である。 実施例
以下、 実施例を用いて本発明を詳細に説明する。 ただし、 本発明がこれに限 定されるものでないことはいうまでもない。
ヒト末梢血単核球を抗 CD 3抗体 （オルソクローン：ヤンセンファーマ） 固 相化フラスコ （住友べ一クライト） に播種し、 培地 （KBM400 ：コージン バイオ） に I L— 2を 280 I UZmLとなるように添加し培養 （37°C、 C 02： 5%) を行った。
14日間培養後、 遠心分離によりリンパ球 （LAK細胞） を回収し、 洗浄し た。
培養されたリンパ球を 5 X 107 c e 1 1 s /mLの密度で生理食塩水 （ 0. 2 %ヒト血清アルブミン） にて保存した。
フローサイトメ一夕一 （Cy t omi c s F C 500 ：ベックマンコール 夕一） を用いて、 各保存時間後の生細胞率を P I (P r o p i d i urn I o d i d e)法により、 また I FN—ァ産生細胞率を PMA (P h o r b o 1 1 2 -My r i s t a t e 13— Ac e t a t e)、 ィオノマイシン （I ono myc i n) 刺激による細胞内サイト力イン測定法により測定した。
1) 生細胞率への保存温度の影響
図 1に各保存温度での、 ハーべス卜後 6、 30、 36、 50時間後の生細胞 率の変化を示した。
保存時間 30時間の生細胞率は保存温度 14°C以下であればほとんど低下は みられなかった。
2) I FN—ァ産生細胞率
図 2に各保存温度での、 ハーべスト後 6、 24、 30、 36、 50時間後の I FN—ァ産生細胞率の変化を示した。
保存時間 24時間での I FN—ァ産生細胞率は保存温度 6で以下であれば低 下を最も抑えることができた。 以上のことから細胞機能を維持した状態を保つには、 保存及び z又は輸送の 温度は 0〜 6 °Cが適していることが明らかとなつた。
産業上の利用可能性
以上説明したように、 本発明方法はリンパ球の生細胞率や I F N—ァ産生細 胞率を高く維持したまま保存及びノ又は輸送するための方法を提供するもので あり、 免疫細胞療法におけるリンパ球を含む注射剤の保存及び Z又は輸送方法 として優れた効果を有するものである。

Claims

請求の範囲
I . リンパ球を 0 ~ 6でに保つことを特徴とするリンパ球の保存方法。
2 . 前記リンパ球が、 1 6〜 2 2 °Cで保存及び Z又は輸送されたリンパ球培養 用血液から分離された末梢血単核球であるか、 若しくはリンパ球培養用血 液から末梢血単核球を分離した後、 5〜2 2 °Cで保存及び Z又は輸送され た末梢血単核球を用いて培養されたリンパ球であることを特徴とする請求 項 1記載のリンパ球の保存方法。
3 . 前記リンパ球が、 1 6〜 2 2 °Cで保存及び/又は輸送されたリンパ球培養 用血液から分離された末梢血単核球、 又はリンパ球培養用血液から末梢血 単核球を分離した後 5〜 2 2 °Cで保存及び/又は輸送された末梢血単核球 を、 抗 C D 3抗体及び 1 0 0〜2 0 0 0 I U/mLの I L一 2存在下に、 3 4〜3 8 °Cで 2〜1 0 %の 〇2条件下で1〜2 0日培養することを特 徴とする請求項 1又は請求項 2に記載のリンパ球の保存方法。
4. 前記リンパ球が L AK細胞であることを特徴とする請求項 1〜3いずれか の項記載のリンパ球の保存方法。
5 . 前記リンパ球が癌及び Z又は感染症患者由来のリンパ球であることを特徴 とする請求項 1〜 4いずれかの項記載のリンパ球の保存方法。
6 . 前記リンパ球が点滴剤に調製されていることを特徴とする請求項 1 ~ 5い ずれかの項記載のリンパ球の保存方法。
7 . リンパ球を 0 ~ 6 °Cで輸送することを特徴とするリンパ球の輸送方法。
8 . 前記リンパ球が、 1 6〜 2 2 °Cで保存及び/又は輸送されたリンパ球培養 用血液から分離された末梢血単核球であるか、 若しくはリンパ球培養用血 液から末梢血単核球を分離した後、 5〜2 2 °Cで保存及び Z又は輸送され た末梢血単核球を用いて培養されたリンパ球であることを特徴とする請求 項 7記載のリンパ球の輸送方法。
9 . 前記リンパ球が、 1 6〜 2 2 °Cで保存及び Z又は輸送されたリンパ球培養 用血液から分離された末梢血単核球、 又はリンパ球培養用血液から末梢血 単核球を分離した後 5〜 2 2 で保存及び Z又は輸送された末梢血単核球 . を、 抗 C D 3抗体及び 1 0 0〜2 0 0 0 I UZmLの I L— 2存在下に、 3 4〜3 8 で2〜1 0 %の〇〇2条件下で1〜2 0日培養することを特 徴とする請求項 7又は請求項 8に記載のリンパ球の輸送方法。
1 0 . 前記リンパ球が L AK細胞であることを特徴とする請求項 7〜 9いずれ かの項記載のリンパ球の輸送方法。
I I . 前記リンパ球が癌及び Z又は感染症患者由来のリンパ球であることを特 徴とする請求項 7〜 1 0いずれかの項記載のリンパ球の輸送方法。 記リンパ球が点滴剤に調製されていることを特徴とする請求項 7〜1 いずれかの項記載のリンパ球の輸送方法。
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