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WO2006011485A1 - アミロイドペプチドの凝集を抑制する蛋白質とその作用 - Google Patents

アミロイドペプチドの凝集を抑制する蛋白質とその作用 Download PDF

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WO2006011485A1
WO2006011485A1 PCT/JP2005/013658 JP2005013658W WO2006011485A1 WO 2006011485 A1 WO2006011485 A1 WO 2006011485A1 JP 2005013658 W JP2005013658 W JP 2005013658W WO 2006011485 A1 WO2006011485 A1 WO 2006011485A1
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WO
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pgds
human
alanine
seq
mouse
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PCT/JP2005/013658
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Yoshihiro Urade
Masako Taniike
Kosuke Aritake
Takahisa Kanekiyo
Yuji Goto
Tadato Ban
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Osaka Bioscience Institute
Kansai Technology Licensing Organization Co Ltd
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka Bioscience Institute
Osaka University NUC
Kansai Technology Licensing Organization Co Ltd
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Publication date
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to an agent that suppresses or improves the symptoms of Arno and Imah's disease. More specifically, the present invention relates to a drug that suppresses and improves the symptoms of Alzheimer's disease by inhibiting aggregation of amyloid peptide and interacting with a glycolipid component present on the surface of brain cell membrane.
  • a peptide forms a sheet structure in the brain parenchyma and aggregates and deposits, and is thought to be caused by the binding with lipid components present on the brain cell surface. It causes plaque formation and neurogenic changes in euron.
  • a j8 vaccine ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇
  • Beta-sheet breaker peptides inhibit nbnllogenesis in a rat brain model of amyloidosis: implications for Alzheimer's therapy. Nat Med. 1998 4: 822-6.). However, both are non-physiological substances and may have side effects.
  • Non-Patent Document 1 Neuron. 2003 38: 547-554
  • Non-Patent Document 2 Nature. 2000 408: 979-982
  • Non-Patent Document 3 Nat Med. 1998 4: 822-826
  • the present invention suppresses the aggregation of amyloid peptide and is a sugar present on the surface of brain cell membrane
  • the purpose is to provide a method for suppressing and improving Alzheimer's disease symptoms by interacting with lipid components.
  • L-PGDS Lipocalin-type prostaglandin D synthase
  • L-PGDS Lipocalin-type prostaglandin D synthase
  • the present invention is a drug used for the suppression and improvement of the symptoms of Arno and Imah's disease
  • L—PGDS Lipocalin-type prostaglandin D synthase
  • L—PGDS variants in which at least one cysteine residue of L—PGDS is replaced by another amino acid residue, eg alanine or serine;
  • a gist is a drug containing a compound selected from the group consisting of as active ingredients.
  • Substances that enhance the expression of LPGDS protein in vivo, particularly in the brain, include estrogen, darcocorticoid, interleukin-1 j8, and thyroid hormone.
  • the invention's effect include estrogen, darcocorticoid, interleukin-1 j8, and thyroid hormone.
  • the suppression of amyloid peptide aggregation and the interaction with a glycolipid component present on the surface of brain cell membrane can suppress or improve the symptoms of Alzheimer's disease. You can do good.
  • FIG. 1 is a micrograph of a micrograph in which binding of L PGDS to senile plaques in an autopsy brain of an Arno-Ima disease patient is detected by immunohistochemical staining. * Indicates amyloid 'plaque, and arrow indicates LPGDS expressed in oligodendrocytes.
  • FIG. 2 Alzheimer's disease model mouse Tg2576 amyloid 'plaque located in L
  • FIG. 3 is a graph showing the results of examining the concentration-dependent binding of human L-PGDS (Ala2.3.4) to human amyloid 'beta 1-40 peptide by surface plasmon resonance.
  • 4 is a graph showing the results of investigating the dose-dependent inhibitory effect of 4 by ThT Atsay.
  • FIG. 7 A graph showing the results obtained by examining the inhibitory effect of Ala2.3.4 on A ⁇ 1-40 peptide whose aggregation is promoted in the presence of Gandarioside GM-1 and ribosome by ThT Atsei.
  • FIG. 8 A graph showing the results of examining the dose-dependent inhibitory effect of trace on the seed-dependent aggregation of ⁇
  • ThT Atsey showed the antagonism of two mouse anti-human LPGDS monoclonal antibodies against the inhibitory effect of Ala2.3.4 peptide on seed-dependent aggregation of peptides. It is a graph to show.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of examining the binding ability of several mouse L PGDS mutants to A
  • FIG. 5 is a photocopy showing the results of detecting the human A1-42 peptide remaining in the brain of a knockout mouse in a ligamentous and woven manner.
  • 81-42 peptide labeled with piotin was used.
  • L PGDS is the active ingredient.
  • L PGDS is derived from mammals, from human (SEQ ID NO: 1, amino acids 1 to 21 are signal peptides) and from mouse (SEQ ID NO: 2, amino acids 1 to 24 are signal peptides) Those derived from humans are preferred.
  • the second embodiment of the drug used for suppressing and improving the symptoms of the Arno-i-maima disease of the present invention comprises an L-PGDS mutant as an active ingredient.
  • the L PGDS mutant in the present invention is a substitution mutant of L PGDS, wherein at least one of the three cysteine residues is replaced with another amino acid residue, preferably glycine, alanine, serine, norin, histidine, treasure.
  • a relatively small variant of L-PGDS including substitutions with amino acids such as nin, asparagine, aspartate, etc.
  • Proteins of human L—PGDS (SEQ ID NO: 1) with the cysteines at positions 65 and 167 substituted with alanine or serine (hereinafter, may be abbreviated as “Alal. 3” and “Serl. 3”, respectively);
  • substitution mutants those in which one to several amino acid residues are further substituted with other amino acid residues can also achieve the object of the present invention.
  • Mammal-derived L PGDS is a force gene that can also obtain the tissue power of mammals. It is convenient to manufacture by recombinant technology.
  • the amino acid sequence of human or mouse-derived lipocalin-type prostaglandin D synthase (L-PGDS) is known.
  • the amino acid sequence of human-derived L—PGDS is shown in SEQ ID NO: 1 (Hoffinann A et al., J. Neurochem. 1993 Aug 61 (2) 45-46) (amino acid residues 1 to 21 of SEQ ID NO: 1) Is a signal peptide).
  • the amino acid sequence of L PGDS derived from mouse is shown in SEQ ID NO: 2 (Hoffinann A et al.,
  • the amino acid residues 1 to 24 of SEQ ID NO: 1 are signal peptides.
  • the nucleotide sequence of cDNA encoding L—PGDS is also known.
  • the nucleotide sequence of cDNA encoding human L-PGDS is shown in SEQ ID NO: 3 (nucleotide residues 1 to 63 of SEQ ID NO: 3 encode a signal peptide).
  • the nucleotide sequence of cDNA encoding mouse-derived LPG DS is shown in SEQ ID NO: 4 (nucleotide residues 1 to 72 of SEQ ID NO: 4 encode a signal peptide). Therefore, an expression vector that expresses recombinant L-PGDS can be constructed in an appropriate host system. Recombinant LPGDS can be produced by transforming host cells with the obtained expression vector and culturing the transformant under conditions suitable for expression of DNA encoding LPGDS.
  • An expression vector containing DNA encoding L-PGDS of the present invention can be constructed by methods known to those skilled in the art.
  • a vector suitable for L-PGDS expression would have a promoter for transcription initiation immediately upstream of the DNA insertion site.
  • Appropriate promoters are also known in the art and can be selected according to their functional properties in the host cell.
  • the promoter of the SV40 virus early gene, the peptide chain extension factor EF-1a promoter, the metamouthoneine gene promoter, the 13-cutin promoter, the CMV vinores promoter, etc. can be expressed in animal cell systems, Merase promoters and beta-galactosidase gene promoters can be used for expression in bacteria and E. coli. It is desirable that there is a transcription termination signal downstream of the insertion site of human hematopoietic PGD synthase DNA.
  • a selectable marker such as a drug resistance marker is present in the vector.
  • an expression vector containing a polynucleotide encoding L-PGDS Transformation may be performed simultaneously using a plasmid encoding drug resistance such as antibiotics separate from Kuta.
  • DNA encoding L-PGDS is inserted into an appropriate vector.
  • a suitable vector is selected from those known in the art in consideration of the promoter, transcription termination signal, selection marker and other conditions.
  • a DNA vector that can be used for the purpose of expressing this cDNA by inserting LPGDS cDNA and introducing it into cultured cells for example, pKCR, pEF-BOS, CDM8, pCEV4 In E. coli, such as papillomavirus DNA, pGEMEX, pUC, etc. can be mentioned.
  • the cells that can be used for the expression of LPGDS may be any cells that can replicate and can express DNA encoding LPGDS.
  • prokaryotic microorganisms such as E. coli
  • eukaryotic microorganisms such as S. cerevisiae
  • mammalian cells are used.
  • Tissue culture cells include avian or mammalian cells such as murine, rat and monkey cells. Selection and use methods of suitable host cell-vector systems are known to those skilled in the art, and a system suitable for the expression of cDNA encoding their internal L-PGDS can be arbitrarily selected.
  • a desired protein can be obtained by culturing the transformed cells according to a conventional method.
  • the medium used for the culture can be appropriately selected depending on the properties of the host. For example, when the host is E. coli, LB medium or TB medium is used. When the host is a mammalian cell, RPMI 1640 medium. Etc. can be used as appropriate.
  • the isolation and purification of the protein used in the present invention by the culture force obtained by this culture can be carried out by conventional methods.
  • the culture can be obtained by using various physical and chemical properties of the protein.
  • This processing operation can be performed. Specifically, treatment with a protein precipitating agent, ultrafiltration, high performance liquid chromatography, centrifugation, electrophoresis, affinity chromatography and the like can be used alone or in combination.
  • the obtained protein solution can be powdered by lyophilization if necessary. In lyophilization, stabilizers such as sorbitol, mannitol, dextrose, maltose, and glycerol can be added.
  • a site-directed mutagenesis method is used to produce a mutant of LPGDS.
  • This method is well known, and kits for implementation (for example, Quick Change (registered trademark) Site-Directed Mutagenesis Kit manufactured by STRATAGENE) are commercially available.
  • a primer pair of about 30 to 40 bases containing mismaticodone at the target site was synthesized, and a wild-type plasmid was transformed into a saddle type using these primers.
  • the reaction mixture contains both the plasmid and the synthesized mutant plasmid. Treat the plasmid with Dpnl endonuclease, purify the mutant plasmid by decomposing and removing the plasmid.
  • Lactoglobulin is a protein that is contained in milk and belongs to the lipocalin family.
  • a substance that enhances the expression of PGDS is used as an active ingredient.
  • estrogen As a substance that enhances the expression of L PGDS, estrogen (Otsuki M et al. Specific regulation of lipocalin—type prostaglandin D synthase in mouse heart by estrogen receptor beta. Mol Endocrinol. 2003 Sep; 17 (9): 1844-55 Epub 2003 Jun 26.), Darciacorticoid (Garcia- Fernand ez LF et al. Dexamethasone induces lipocalin— type prostaglandin D synthase gene e xpression in mouse neuronal cells. J Neurochem. 2000 Aug; 75 (2): 460-70.
  • the active ingredient of the drug of the present invention is a protein
  • the protein is mixed with a carrier known per se It can be diluted and formulated as a liquid, for example.
  • the liquid preparation can be prepared using, for example, purified water, physiological saline, alcohols such as ethanol “propylene glycol” glycerin ”polyethylene glycol, and a solvent such as triacetin.
  • the liquid thus prepared can be used by diluting, for example, a lactate Ringer's solution, a maintenance solution comprising an infusion electrolyte solution, a postoperative recovery solution, a dehydration replenisher, a drip physiological saline solution, or the like.
  • buffering agents for pH adjustment for example, phosphate buffer, borate buffer, citrate buffer, tartrate buffer, acetate buffer, etc.
  • isotonic Agents eg sorbitol, glycerin, polyethylene glycol, propylene glycol, glucose, sodium chloride, etc.
  • Such preparations may further include pharmaceutically acceptable salts, sodium benzoyl alcohol, paraoxybenzoates, etc.
  • Benzyl alcohol «lachlormethaxinol, chlorcresol, phenethyl alcohol, sorbic acid or salts thereof, suitable antiseptic disinfectants such as thimerosal, chlorobutanol, humectants such as talc, emulsifiers such as polyethylene glycol monooleate, Auxiliary agents such as dispersants, stabilizers such as sulfites, bisulfites, metabisulfites It may be added. It is also preferable to administer as a suspending agent using gum arabic, kaolin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, etc. as a suspending agent.
  • Non-oral administration is preferred as the route of administration, for example, including intravenous administration, transcerebral spinal fluid administration, transarterial local administration by catheter, or surgical local administration.
  • the dosage of the active ingredient of the present invention is 0.01 to 20.0 mgZkgZ days, preferably 0.5 to 5 mgZkgZ days.
  • the active ingredient of the drug of the present invention is a low molecular compound such as estrogen or darcocorticoid
  • it can be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier to produce the drug.
  • the carrier can take a wide variety of forms depending on the form of preparation desired for administration. As a route of administration, parenteral administration and oral administration! /, Or deviation can be used. Powders, pills, capsules and tablets for oral administration are excipients such as ratatoses, glucose, sucrose, and maltol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc.
  • binders such as polybulal alcohol, hydroxypropylcellulose, and gelatin, surfactants such as fatty acid esters, and plasticizers such as glycerin Can be manufactured.
  • the dose of the active ingredient of the present invention is 0.001 to 10 mgZkgZ day, preferably 0.01 to LmgZkgZ day.
  • the present invention uses LPGDS or a mutant gene thereof for gene therapy, and locally expresses LPGDS or a mutant in the brain, thereby producing ⁇
  • the gene of the present invention is incorporated into a vector and introduced into the brain.
  • Vectors used for gene therapy include retrovirus vectors, any virus vectors including adenovirus vectors, and ribosome vectors. More specifically, a viral vector is a gene in which a pathogenic gene is cut out using a part of the virus shell and a gene, and an L PG DS gene modified to be expressed in brain membrane or oligodendrocyte is inserted instead. is there.
  • a ribosome vector is a microsphere composed mainly of artificial lipid bilayers, which incorporates the L-PGDS gene modified so that it is expressed in brain membranes or oligodendrocytes (lipofection method).
  • a ribosome called phosphatidylserine is usually used. Instead of this negatively charged phospholipid, a cation called DOTMA (N— [1,1- (2,3 dioleoxy) pill] —N, N, N trimethylammo-um chloride) that makes it easier to produce more stable ribosomes Lipids are now on sale.
  • DOTMA N— [1,1- (2,3 dioleoxy) pill] —N, N, N trimethylammo-um chloride
  • the ribosome When positively charged, the ribosome is negatively charged, adsorbs the cells to the surface, and fuses with the cell membrane to introduce DNA into the cells.
  • This vector is administered by intravenous injection, arterial injection, intramuscular injection, intrathecal administration, or local administration.
  • the human L—PGDS gene from Ala21 to C-terminus was obtained by PCR amplification from the cDNA library, the signal peptide was deleted, and the expression vector pGEX—2T (Amersham) from the 67th to the 3 ′ end of the DNA sequence of SEQ ID NO: 3 was obtained. ⁇ Harumacia ⁇ Biotech) Then, Escherichia coli DH5a was transformed with the expression vector.
  • pGEX-2T is an expression vector for inserting the target gene into the downstream of the dartathione-S-tonsphrase (GST) gene and expressing the target protein as a GST fusion protein. Subsequently, the vector was transformed into Escherichia coli BL21 strain.
  • IPTG isopropyl 1-1-thio-13-D-galactoside
  • E. coli was recovered from the culture solution, and proteins were extracted from the cells by ultrasonic disruption. Unnecessary substances were removed by centrifugation, and then retained on a dartathione sepharose 4B column. The fusion protein retained on the column was extinguished with thrombin, and the L-PGDS fraction was eluted. Subsequently, it was purified by gel filtration column chromatography to obtain a human-derived lipocalin-type prostaglandin D synthase.
  • Example 1 In Example 1, except that human-derived PGDS-encoding cDNA was replaced with mouse-derived L PGDS-encoding cDNA (up to the 3rd end at the 70th force of the DNA sequence of SEQ ID NO: 4). Similarly, a mouse-derived lipocalin-type prostaglandin D synthase was obtained.
  • Cys65 and 167Ala expression vectors were prepared using the QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit.
  • E. coli was recovered from the culture solution, and proteins were extracted from the cells by ultrasonic disruption. Unnecessary substances were removed by centrifugation, and then retained on a dartathione sepharose 4B column. The fusion protein retained on the column was extinguished with thrombin, and the L-PGDS fraction was eluted. Subsequently, purification was performed by gel filtration column chromatography to obtain a human PGDS mutant (Alal. 3) in which 65 and 167 cysteines of human L-PGDS were substituted with alanine.
  • the Cys65Ser expression vector was prepared using the QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit manufactured by STRATAGENE. Further, a pair of synthetic oligomers containing the mismatched codon at the target site using the obtained expression vector as a saddle type:
  • a Cyso5, 16 / 3 ⁇ 4 ⁇ expression vector was prepared using the Quick; hange; te-Directed Mutagenesis Kit.
  • An expression vector in which Cys65 and 167 were substituted with serine was transformed into Escherichia coli BL21 strain.
  • the Escherichia coli strain transformed with the expression plasmid was cultured in LB medium (containing 50 gZmL ampicillin) 37. After culturing in C, add IPTG (Isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galatatoside) to a final concentration of 0.4 to 0.6 mM and add GST and L-PGDS fusion protein. Expression was induced and further cultured for 4-6 hours.
  • E. coli was recovered from the culture solution, and proteins were extracted from the cells by ultrasonic disruption. Unnecessary substances were removed by centrifugation, and then retained on a dartathione sepharose 4B column. The fusion protein retained on the column was extinguished with thrombin, and the L-PGDS fraction was eluted. Subsequently, it was purified by gel filtration column chromatography to obtain a mutant (Serl. 3) in which the 65th and 167th human L-PGDS were substituted with serine.
  • Example 4 except that the design of the synthetic oligomer was changed, a mutant (Ala 2.3.4) in which the 89, 167 and 186th cysteines of human L-PGDS were replaced with alanine was the same as in Example 3. Manufactured.
  • Example 6 a mutant (Ala2.3) in which murine L-PGDS 89 and 186th cysteines were substituted with alanine was produced in the same manner as in Example 6 except that the design of the synthetic oligomer was changed.
  • Example 6 as a synthetic oligomer
  • Example 6 In the same way as in Example 6, the following is a mutant (A1 a2. 3) in which mouse L-PGDS 89 and 186th systemine and 54th tributophane are replaced with alanine. Manufactured.
  • Example 6 as a synthetic oligomer
  • Mouse L A variant made of PGDS 89 and 186th cysteine and 111th histidine in alanine.
  • Example 6 as a synthetic oligomer
  • mutants were prepared by substituting the 89th and 186th systems of mouse L-PGDS and the 111th tributophane with alanine.
  • Example 6 except that the design of the synthetic oligomer was changed, in the same manner as in Example 6, a mutant was prepared in which mouse L-PGDS 89 and 186th cysteine were replaced with alanine and 43th tryptophan was replaced with riguranine. did.
  • Alzheimer's disease autopsy brain and Alzheimer's disease model mouse Tg2576 (Hsia 0 K et al., Orrelative memory deficits, Abeta elevation, ana amyloid plaques in tran sgenic mice. Science. 274: 99-102.1996; Hsiao KK et al. Age- related CNS disorder and early death in transgenic FVB / N mice overexpressing Alzheimer amyloid precur sor proteins. Neuron.l5: 1203— 18. 1995) (See Fig. 1 and Fig. 2) L-PGDS was identified to bind to the amyloid 'plaque site in both the autopsy brain of Alzheimer's disease patients and the Arno-Ima disease model mouse. [0036]
  • N D Below detection limit (> 1 ⁇ )
  • ThT is a fluorescent substance that specifically recognizes the cross-beta sheet structure, and it is known that the fluorescence intensity of ThT increases with the growth of amyloid fibrils in vitro. Therefore, a mixed solution of phosphate buffer (50 mM, pH 7.5) and NaCl (lOOmM) ⁇ A j8 1-40 (50 M) was prepared and kept at 37 ° C. At that time, a group in which the concentrations of L-PGDS analogues were adjusted and mixed was also set.
  • the aggregation reaction of human amyloid beta is promoted by adding fibrotic human amyloid beta as a seed.
  • 8 1 -40 peptide was analyzed by laser fluorescence microscopy and atomic force microscopy. (See Figures 4 and 6).
  • Aggregation reaction of human amyloid beta can also be promoted by adding gandarioside GM1 ribosome as a seed.
  • ThT assay the mutant of human L-PGDS (Ala2.3.4) also showed strong aggregation inhibitory action against GM1 liposome-dependent aggregation of A j81-40 peptide (see Fig. 7).
  • mutant mouse L-PGDS (Examples 3-11) prepared by recombinant technology
  • the surface plasmon resonance method (Biacore) described above was used to detect mutant L-PGDS for human amyloid 'beta 140 peptide.
  • the binding ability was analyzed (see Fig. 10). Dissociation constant As for Cys 89 ′ 185 Ala and His m Ala, the binding ability was 13.2 nM, for Cys 89, 185 Ala and Trp 54 Ala 4.
  • OnM Cys 89 ′ 185 Ala was 3.5 nM.
  • a positive relationship was observed between the enzyme activity of mutant L-PGDS and affinity for human amyloid 'beta 1-40 peptide (Table 2).
  • FIG. 11 is a photomicrograph of a brain section taken 1 hour after 50 ⁇ 1 intraventricular administration of 100 ⁇ piotin-labeled human amyloid beta 1-42 to wild-type mice and L-PGDS knockout mice, respectively.
  • L PGDS knockout mice Compared to wild-type mice (left), L PGDS knockout mice (right) showed aggregation of amyloid beta in the ventricle (upper center), and more intense deposition in the brain parenchyma (lower).
  • the color intensity shows that the clearance of amyloid beta, which is significantly 4.82 times stronger in L-PGDS knockout mice than in wild-type mice, is attenuated.

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Abstract

　本発明は、アルツハイマー病の症状を抑制・改善することを目的とする。 １）リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ－ＰＧＤＳ）； ２）Ｌ－ＰＧＤＳの少なくとも１つのシステイン残基を他のアミノ酸残基によって置換したＬ－ＰＧＤＳの変異体；および ３）β－ラクトグロブリン ４）エストロジェン、グルココルチコイド、インターロイキン－１β、サイロイドホルモンよりなる群から選択される、Ｌ－ＰＧＤＳ蛋白質の発現を増強する物質； よりなる群から選択されるポリペプチドを有効成分として含む薬剤を投与する。このポリペプチドはβアミロイドペプチドと結合し、且つ、脳細胞膜表面の脂質成分とβアミロイドペプチドと相互作用を調節することにより、その凝集を抑制する。

Description

明 細 書
アミロイドペプチドの凝集を抑制する蛋白質とその作用
技術分野
[0001] この発明は、アルッノ、イマ一病の症状を抑制 '改善させる薬剤に関する。さらに詳 しくは、この発明はアミロイドペプチドの凝集を抑制し、且つ、脳細胞膜表面に存在 する糖脂質成分と相互作用することにより、アルツハイマー病の症状を抑制 ·改善さ せる薬剤に関するものである。
背景技術
[0002] 高齢ィ匕社会の到来とともに痴呆患者も増カロしており、 65歳以上の約 5%が痴呆患 者と言われて 、るが、神経変性疾患であるアルッノヽイマ一病は老年期の痴呆のほと んどを占める重要な疾患である。その病態発生の第 1段階は脳実質に A ペプチド がシート構造をとり凝集'沈着することにあり、脳細胞表面に存在する脂質成分との結 合により惹起されると考えられており、ひきつづき老人斑の形成と-ユーロンの神経 原性変化を引き起こす。近年、この A j8ペプチドの凝集 ·沈着を阻害するために、 A j8ワクチン ·¾Α |8抗体、 j8シートブレイカーの投与が考えられている（Hock C et al. Antibodies against beta— amyloid slow cognitive decline in Alzneimer s disease. Neur on. 2003 38:547—54., Janus C et al. A beta peptide immunization reduces behaviour al impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease. Nature. 2000 408:979- 82., Soto C et al. Beta-sheet breaker peptides inhibit nbnllogenesis in a rat brain m odel of amyloidosis: implications for Alzheimer's therapy. Nat Med. 1998 4:822-6.) 。しかし、いずれも非生理的物質であり副作用を合併する恐れがある。
非特許文献 1 : Neuron. 2003 38:547-554
非特許文献 2 : Nature. 2000 408:979-982
非特許文献 3 : Nat Med. 1998 4:822-826
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] この発明はアミロイドペプチドの凝集を抑制し、且つ、脳細胞膜表面に存在する糖 脂質成分と相互作用することにより、アルツハイマー病の症状を抑制 '改善させる方 法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0004] 上記目的を達成する本発明者は鋭意研究を行 、、次のような知見を得たことに基 づ!、て本発明を完成させた。
1)アルツハイマー病患者剖検脳およびアルツハイマー病モデルマウスにお!、てアミ ロイド ·プラークにし - PGDSが沈着して!/、る。
2)ヒトアミロイド蛋白質に対し、リポカリン型プロスタグランジン D合成酵素 (L - PGD S)が強い親和性を示し、さらにチオフラビン T(ThT)アツセィによる凝集試験におい て強い凝集抑制作用を示す。
3)脳細胞膜表面に存在する糖脂質成分であるスフインゴ糖脂質群に対し、リポカリン 型プロスタグランジン D合成酵素 (L— PGDS)が強い親和性を示し、さらにスフインゴ 糖脂質とヒトアミロイド蛋白質との結合抑制作用を極めて低濃度において示す。
4)上記 2)および 3)の効果はリポカリン型プロスタグランジン D合成酵素のみならずそ の変異体によっても生ずる。その変異体にはプラスタグランジン D合成酵素の活性部 位のシスティン残基を置換したものも含まれる。
[0005] 即ち、本発明は、アルッノ、イマ一病の症状の抑制.改善に用いる薬剤であって、
1)リポカリン型プロスタグランジン D合成酵素（L— PGDS)；
2) L— PGDSの少なくとも 1つのシスティン残基を他のアミノ酸残基、例えばァラニン またはセリンによって置換した L— PGDSの変異体；
3) β ラクトグロブリン
4)生体内、特に脳内での L PGDS蛋白質の発現を増強する物質
よりなる群から選択される化合物を有効成分として含む薬剤を要旨とする。
生体内、特に脳内での L PGDS蛋白質の発現を増強する物質としては、エストロ ジェン、ダルココルチコイド、インターロイキン— 1 j8、サイロイドホルモンを含む。 発明の効果
[0006] 本発明の薬剤によれば、アミロイドペプチドの凝集を抑制し、かつ脳細胞膜表面に 存在する糖脂質成分と相互作用することによりアルツハイマー病の症状の抑制、改 善をすることができる。
図面の簡単な説明
[図 1]アルッノヽイマ一病患者剖検脳の老人斑への L PGDSの結合を免疫組織染色 法によって検出した顕微鏡写真の模写図である。 *はアミロイド'プラーク、矢印はォ リゴデンドロサイトに発現する L PGDSを、それぞれ示す。
[図 2]アルツハイマー病モデルマウス Tg2576のアミロイド'プラークに局在している L
— PGDSを免疫組織染色法によって検出した顕微鏡写真の模写図である。
[図 3]ヒトアミロイド'ベータ 1—40ペプチドに対するヒト L— PGDS (Ala2. 3. 4)の濃 度依存的な結合を表面プラズモン共鳴法によって調べた結果を示すグラフである。
[図 4]Α |8 1—40ペプチドのシード依存的な凝集に対する Ala2. 3. 4の抑制効果を レーザー蛍光顕微鏡)で観察した結果を示す写真の模写図である。
[図 5]A j8 1—40ペプチドあるいは A j8 1—42ペプチドの自然凝集に対する Ala2, 3
, 4の用量依存的な抑制効果を ThTアツセィによって調べたした結果を示すグラフで ある。
[図 6]Α |8 1—40ペプチドのシード依存的な凝集に対する Ala2. 3. 4の抑制効果を 原子間力顕微鏡 (AFM)で観察した結果を示す写真の模写図である。
[図 7]ガンダリオシド GM— 1とリボゾーム存在下に凝集が促進される A β 1—40ぺプ チドに対する Ala2. 3. 4の抑制効果を ThTアツセィによって調べた結果を示すダラ フである。
[図 8]Α |8 1—40ペプチドおよび A |8 1—42ペプチドのシード依存的凝集に対する traceの用量依存的な抑制効果を ThTアツセィによって調べた結果を示すグラフ である。
[図 9]Α |8 (1— 40)ペプチドのシード依存的凝集に対する Ala2. 3. 4ペプチドの抑制 効果に対する 2種類のマウス抗ヒト L PGDSモノクローナル抗体の拮抗作用を ThT アツセィによって調べた結果を示すグラフである。
[図 10] A |8 ( 1— 40)ペプチドに対する数種のマウス L PGDS変異体の結合能を表 面プラズモン共鳴法によって調べた結果を示すグラフである。
[図 11]ヒト A j8 1— 42ペプチドを脳室内に投与した野生型マウスあるいは L PGDS ノックアウトマウスの脳内に残存するヒト A 1—42ペプチドを糸且織ィ匕学的に検出した 結果を示す写真の模写図である。検出にはピオチンで標識したヒト Α |8 1—42ぺプ チドを使用した。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明のアルッノヽイマ一病の症状の抑制 '改善に用いる薬剤の第一の態様は L
PGDSを有効成分とする。 L PGDSは哺乳動物由来のものであり、ヒト由来（配 列番号 1、その 1から 21番目のアミノ酸はシグナルペプチドである）およびマウス由来 (配列番号 2、その 1から 24番目のアミノ酸はシグナルペプチドである）のものが好ま しぐヒト由来のものが特に好ましい。
[0009] 本発明のアルッノヽイマ一病の症状の抑制'改善に用いる薬剤の第二の態様は L— PGDS変異体を有効成分とする。本発明における L PGDS変異体は、 L PGDS の置換変異体であって、 3つのシスティン残基の少なくとも 1つを他のアミノ酸残基、 好ましくはグリシン、ァラニン、セリン、ノ リン、ヒスチジン、トレ才ニン、ァスパラギン、ァ スパラギン酸等の比較的サイズの小さ 、アミノ酸で置換した置換体を含む L - PGDS の変異体であり、その具体的な例は、
1)ヒト L— PGDS (配列番号 1)の 65と 167番目のシスティンをァラニンあるいはセリン に置換した蛋白質 (以下、「Alal. 3」および「Serl. 3」とそれぞれ略すことがある）；
2)ヒト L— PGDS (配列番号 1)の 89、 167と 186番目のシスティンをァラニンあるい はセリンに置換した蛋白質（以下、「Ala2. 3. 4」および「Ser2. 3. 4」とそれぞれ略 すことがある）；
3)マウス L PGDS (配列番号 2)の 65番目のシスティンをァラニンあるいはセリンに 置換した蛋白質 (以下、「Alal」および「Serl」とそれぞれ略すことがある）；
4)マウス L— PGDS (配列番号 2)の 89と 186番目のシスティンをァラニンあるいはセ リンに置換した蛋白質 (以下、「Ala2. 3」、「Ser2. 3」とそれぞれ略すことがある） である。
これらの置換変異体において、さらに 1ないし数個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残 基で置換したものも本発明の目的を達成することができる。
[0010] 哺乳動物由来 L PGDSは哺乳動物の組織力 得ることも可能である力 遺伝子 組み換え技術により製造するのが便利である。ヒトまたはマウス由来リポカリン型プロ スタグランジン D合成酵素（L— PGDS)のアミノ酸配列は公知である。ヒト由来 L— P GDSのアミノ酸配列を配列番号 1に示す（Hoffinann A et al. , J. Neurochem. 1993 A ug 61(2) 45-46) (配列番号 1の 1から 21番目のアミノ酸残基はシグナルペプチドであ る）。マウス由来の L PGDSのアミノ酸配列を配列番号 2に示す（Hoffinann A et al. ,
Dev Dyn.1996 Nov. 207(3) 332—43; Irikura D et al" J. Biochem. (Tokyo) 2003, Jan.
133(1) 29-32) (配列番号 1の 1から 24番目のアミノ酸残基はシグナルペプチドである )。 L— PGDSをコードする cDNAのヌクレオチド配列も知られている。ヒト由来 L— P GDSをコードする cDNAのヌクレオチド配列を配列番号 3に示す（配列番号 3の 1か ら 63番目のヌクレオチド残基はシグナルペプチドをコードする）。マウス由来 L PG DSをコードする cDNAのヌクレオチド配列を配列番号 4に示す（配列番号 4の 1から 72番目のヌクレオチド残基はシグナルペプチドをコードでする）。従って、適当な宿 主系内で組換え L— PGDSを発現する発現ベクターを構築することができる。得られ た発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を L PGDSをコードす る DNAの発現に適した条件下で培養することにより、組換え L PGDSを製造する ことができる。
[0011] 本発明の L— PGDSをコードする DNAを含有する発現ベクターは当業者既知の方 法で構築することができる。 L— PGDSの発現に適したベクターは、該 DNAの挿入 部位の直ぐ上流に転写開始のためのプロモーターを有するものであろう。適当なプロ モーターも当該技術分野で既知であり、宿主細胞内での機能特性に応じて選択する ことができる。例えば、 SV40ウィルス初期遺伝子のプロモーター、ペプチド鎖延長因 子 EF— 1 aのプロモーター、メタ口チォネイン遺伝子のプロモーター、 13 了クチン のプロモーター、 CMVウイノレスのプロモーター等を動物細胞系での発現で、 T7ポリ メラーゼのプロモーターやベータ一ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター等を細菌 、大腸菌での発現に用いることができる。ヒト造血器型 PGD合成酵素 DNAの挿入部 位下流には転写終結シグナルがあることが望ましい。
[0012] ベクター中にはたとえば薬物耐性マーカーのような選択可能マーカーが存在する ことが望ましい。あるいは、 L— PGDSをコードするポリヌクレオチドを含有する発現べ クタ一と別個の抗生物質等の薬物耐性をコードするプラスミドを用いて同時に形質転 換してちよい。
[0013] 発現ベクターを構築するには L—PGDSをコードする DNAを適当なベクターに揷 入する。適当なベクターは、プロモーター、転写終結シグナル、選択マーカーその他 の条件を考慮し、当該技術分野で既知のものから選択する。 L PGDScDNAを挿 入し、培養細胞に導入してこの cDN Aを発現する目的に用いることができる DNAベ クタ一として、例えば動物細胞での発現においては pKCR、 pEF— BOS、 CDM8、 pCEV4ゥシパピローマウィルス DNAなど、大腸菌においては pGEMEX、 pUC等を 挙げることができる。
[0014] L PGDSの発現に用い得る細胞は複製可能で L PGDSをコードする DNAを 発現し得るものであればよい。例えば、大腸菌のような原核性微生物、 S.セレビジェ のような真核性微生物、さらには哺乳類細胞が用いられる。組織培養細胞にはトリ、 または哺乳類細胞、例えばネズミ、ラットおよびサル細胞が含まれる。適当な宿主細 胞ーベクターシステムの選択および使用方法等は、当業者に既知であり、それらの 内力 L— PGDSをコードする cDNAの発現に適した系を任意に選択することができ る。
形質転換した細胞を常法に従い培養することにより所望の蛋白質が得られる。培養 に用いる培地は宿主の性質に応じて適宜選択することができるが、例えば宿主が大 腸菌である場合には LB培地や TB培地力 宿主が哺乳動物細胞である場合には RP MI 1640培地等を適宜用いることができる。
この培養により得られる培養物力ゝらの本発明に用いる蛋白質の単離および精製は 常法により行うことが可能であり、例えば培養物を蛋白質の物理的およびィ匕学的性 質を利用した各種の処理操作を用いて行うことが可能である。具体的には蛋白質沈 殿剤による処理、限外濾過、高速液体クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳動、ァフ ィ-ティクロマトグラフィーなどを単独で、または組み合わせて用いることができる。得 られる蛋白質溶液は必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすることができる。凍結乾 燥に際しては、ソルビトール，マン-トール，デキストロース，マルトース，グリセロール などの安定剤を加えることができる。 [0015] L PGDSの変異体を製造するには好ましくは位置指定突然変異導入法を用いる 。この方法は周知であり、実施するためのキット（例えば、 STRATAGENE社製、 Quick Change (登録商標） Site- Directed Mutagenesis Kit )が市販されている。
位置指定突然変異導入法により変異を入れるためには、目的の部位にミスマツチコ ドンを含む約 30〜40塩基のプライマ——対を合成し、これらのプライマーを用いて、 野生型のプラスミドを铸型として Pfuポリメラーゼでプラスミド全体を PCR増幅する。 P CR終了後、反応液中には铸型プラスミドと合成された変異体プラスミドが混在するの で、 Dpnlエンドヌクレアーゼ酵素処理を行い、铸型プラスミドを分解除去して変異体 プラスミドを精製する。
[0016] 本発明のアルッノヽイマ一病の症状の抑制'改善に用いる薬剤の第三の態様では j8 ラクトグロブリンを有効成分とする。 ラクトグロブリンは、牛乳中に含まれ、リポカリン ファミリーに属する蛋白質である。 |8ラクトグロブリンは、市販されているものを (例え ば Sigma社)用いることができる。
[0017] 本発明のアルッノヽイマ一病の症状の抑制 '改善に用いる薬剤の第四の態様では L
PGDSの発現を増強させる物質を有効成分とする。 L PGDSの発現を増強させ る物質としては、ェストロジェン（Otsuki M et al. Specific regulation of lipocalin— type prostaglandin D synthase in mouse heart by estrogen receptor beta. Mol Endocrinol. 2003 Sep;17 (9) :1844-55. Epub 2003 Jun 26.)、ダルココルチコイド（Garcia- Fernand ez LF et al. Dexamethasone induces lipocalin— type prostaglandin D synthase gene e xpression in mouse neuronal cells. J Neurochem. 2000 Aug;75 (2) :460-70.)、インタ ~~ロイキン一 1 β (Fujimori K et al. Regulation of lipocalin— type prostaglandin D synt hase gene expression by Hes— 1 through E— box and interleukin— 1 beta via two NF— k appa B elements in rat leptomeningeal cells. J Biol し hem. 2003 Feb 21;278 (8) :6018 -26. Epub 2002 Dec 17.)、サイロイドホルモン（Leone MG et al. Lipocalin type prost aglandin D— synthase: which role in male fertility Contraception. 2002 Apr; 65 (4) :29 3-5.)がある。これらの物質は生体内、特に脳内で L PGDSの発現を増強させるこ とが知られている。
[0018] 本発明の薬剤の有効成分が蛋白質の場合、当該蛋白質を自体公知の担体と混合 希釈して、たとえば液剤などとして製剤化することができる。液剤を調製するには、例 えば精製水、生理食塩水、エタノール 'プロピレングリコール 'グリセリン 'ポリエチレン グリコール等のアルコール類、トリァセチン等の溶媒を用いて行うことができる。このよ うに調整した液剤は、たとえば乳酸リンゲル液、輸液用電解質液よりなる維持液、術 後回復液、脱水補給液、点滴用生理食塩液等に希釈して用いることができる。通常 液剤に適宜選択して用いられる添加剤、例えば、 pH調整用の緩衝剤（例えば、リン 酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クェン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、酢酸緩衝液等）、等張 化剤（例えば、ソルビトール、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコー ル，グルコース、塩ィ匕ナトリウム等)このような製剤にはさらに薬学上許容しうる塩ィ匕べ ンザルコ-ゥム、パラォキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール、ノ《ラクロルメ タキシノール、クロルクレゾール、フエネチルアルコール、ソルビン酸またはその塩、 チメロサール、クロロブタノール等の適当な防腐殺菌剤、タルク等の湿潤剤、モノォレ イン酸ポリエチレングリコール等の乳化剤、分散剤、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、メタ 重亜硫酸塩等の安定剤のような補助剤を加えても良い。またアラビアゴム、カオリン、 メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を懸濁化剤として用いた 懸濁剤として投与することも好ま ヽ剤型の 1つと!/、える。
[0019] 投与経路としては非径口的投与が好ましぐ例えば経静脈的投与、経脳脊髄液投 与、カテーテルによる経動脈的な局所投与、もしくは外科的な局所投与を含む。本 発明の有効成分の投与量は、 0. 01〜20.0mgZkgZ日、好ましくは 0. 5〜5mgZ kgZ日である。
[0020] 本発明の薬剤の有効成分がエストロジェン、ダルココルチコイド等の低分子化合物 である場合にも医薬的に受容しうる担体と混合して薬剤を製造できる。この担体は投 与に対して望ましい製剤の形態に応じて広い範囲の形態をとることができる。投与経 路としては非経口的投与、および経口的投与の!/、ずれも使用できる。経口的投与の ための散剤、丸薬、カプセルおよび錠剤は、ラタトース、グルコース、シユークロース、 マ-トール等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシ ゥム、タルク等の滑沢剤、ポリビュルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラ チン等の結合剤、脂肪酸エステルなどの表面活性剤、グリセリン等の可塑剤を用い て製造できる。本発明の有効成分の投与量は、 0. 001〜10mgZkgZ日、好ましく は 0. 01〜： LmgZkgZ日である。
[0021] さらに、本発明は L PGDSまたはその変異体の遺伝子を遺伝子治療に用い、脳 内で局所的に L PGDS、または変異体を発現させることで、 Α |8蛋白質の凝集'沈 着を抑制し、且つ、脳細胞膜表面に存在する糖脂質成分と相互作用することにより、 アルツハイマー病の症状予防 ·抑制 ·改善に用いる方法を提供する。
本発明のし PGDSまたはその変異体の遺伝子をベクターに組み込み脳内に導 入する。遺伝子治療法に用いるベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウィル スベクターを含むあらゆるウィルスベクター、リボソームベクターを含む。さらに詳しく は、ウィルスベクターとはウィルスの殻と遺伝子の一部を用い病原性を司る遺伝子を 切り取り、代わりに脳膜もしくはオリゴデンドロサイトで発現するように修飾した L PG DS遺伝子をはめ込んだものである。リボソームベクターとは、主に人工的な脂質二 重膜でできたミクロの球体に、脳膜もしくはオリゴデンドロサイトで発現するように修飾 した L—PGDS遺伝子を組み込んだものである（リポフエクシヨン法)。通常ホスファチ ジルセリンカ なるリボソームが用いられる。この陰電荷を有するリン脂質の代わりに、 より安定したリボソームを作り易い DOTMA(N— [1一（2, 3 ジォレイルォキシ）プ 口ピル]— N, N, N トリメチルアンモ -ゥムクロライド）と呼ばれる陽イオン脂質が巿 販されるようになった。正に荷電して 、るリボソームが負に荷電して 、る細胞を表面に 吸着し、細胞膜と融合することで DNAを細胞内に導入する。このベクターを、静脈注 射、動脈注射、筋肉注射、髄腔内投与、局所投与にて投与する。
以下に本発明を実施例により更に説明するが、本発明が実施例により限定されるも のでないことは明らかである。
実施例
[0022] ¾細
ヒト由 リポカリン型プロスタグランジン D合成酵素の觀告
Ala21から C末端までのヒト L— PGDS遺伝子を cDNAライブラリーから PCR増幅 により得、シグナルペプチドを欠損させて配列番号 3の DNA配列の 67番目から 3'末 端までを発現ベクター pGEX— 2T (アマシャム ·フアルマシア ·バイオテック社）に揷 入して、その発現ベクターで大腸菌（Escherichia coli) DH5 aを形質転換した。 pG EX— 2Tは目的遺伝子をダルタチオン— S トタンスフエラーゼ（GST)遺伝子の下 流に挿入し、 目的蛋白質を GST融合蛋白質として発現するための発現ベクターであ る。続いて、該ベクターを Escherichia coliBL21株に形質転換させた。発現プラスミド で形質転換された該大腸菌株を LB培地（50 μ gZmLアンピシリン含有）にて 37°C で培養した後、 IPTG (イソプロピル一 1—チォ一 13—D—ガラクトシド）を終濃度が 0 . 4力ら 0. 6mMになるように添カ卩して GSTと L—PGDSの融合蛋白質の発現を誘導 し、さらに 4— 6時間培養した。
培養終了後、培養液カゝら大腸菌を回収して、これから超音波破砕処理によって菌 体から蛋白質を抽出した。遠心分離によって、不用物を除去した後、ダルタチオンセ ファロース 4Bカラムに保持させた。カラムに保持された融合蛋白質をトロンビンで消 化し、 L— PGDSフラクションを溶出させた。続いて、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ 一にて精製しヒト由来リポカリン型プロスタグランジン D合成酵素を得た。
[0023] 実飾 12
マウス由 リポカリン型プロスタグランジン D合成酵素の製造
実施例 1にお 、てヒト由来し PGDSをコードする cDNAを、マウス由来 L PGDS をコードする cDNA (配列番号 4の DNA配列の 70番目力 3 '末端まで）に変えた外 は実施例 1と同様にしてマウス由来リポカリン型プロスタグランジン D合成酵素を得た
[0024] 実施例 3
ヒト L— PGDSの 65と 167番目のシスティンをァラニンに置換した変異体 (Ala l . 3) の製造
ヒト L— PGDSの Cys65をァラニンに置換した変異体を作成するために、実施例 1 で得られた発現ベクターを铸型として目的部位 (Cys65)にミスマツチコドンを含む一 対の合成オリゴマー：
0 — gcgttgtccatgGCCaagtctgtggtggcc— 3， (目 ti歹 U番号 5)
5 -ggccaccacagactt GL,catggacaacgc-j (酉己列 号 b)
を作成し、 STRATAGENE社製の QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用 いて、 Cys65Ala発現ベクターを作成した。
さらに、得られた発現ベクターを铸型として、 目的部位 (Cysl67)にミスマツチコドン を含む一対の合成オリゴマー：
5 - attcaccgccttc Cし aaggcccagggct- 3 (酉己列 号
5 -agccctgggccttGGCgaaggcggtgaat-3 (酉己歹 号 8)
を作成し、 QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、 Cys65、 167Ala 発現ベクターを作成した。
[0025] Cys65および 167をァラニンに置換した発現ベクターを Escherichia coliBL21株に 形質転換させた。発現プラスミドで形質転換された該大腸菌株を LB培地（50 gZ mLアンピシリン含有）にて 37°Cで培養した後、 IPTG (イソプロピル— 1—チォ— 13 —D—ガラクトシド）を終濃度が 0. 4力ら 0. 6mMになるように添カ卩して GSTと L— PG DSの融合蛋白質の発現を誘導し、さらに 4— 6時間培養した。
培養終了後、培養液カゝら大腸菌を回収して、これから超音波破砕処理によって菌 体から蛋白質を抽出した。遠心分離によって、不用物を除去した後、ダルタチオンセ ファロース 4Bカラムに保持させた。カラムに保持された融合蛋白質をトロンビンで消 化し、 L— PGDSフラクションを溶出させた。続いて、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ 一にて精製しヒト L— PGDSの 65と 167のシスティンをァラニンに置換したヒト PGDS 変異体 (Alal. 3)を得た。
[0026] 実施例 4
ヒト L— PGDSの 65と 167番目のシスティンをセリンに置換した変異体（Serl. 3)の 製诰
Cys65をセリンに置換した変異体を作成するために、実施例 1で得られた発現べク ターを铸型として目的部位 (Cys65)にミスマツチコドンを含む一対の合成オリゴマー
(Cys- 65- Ser用合成オリゴマー）：
5 — gcgttgtccatgTCCaagtctgtggtggcc— 3， (目 ti歹 U番号 9)
5 -ggccaccacagacttGLrAcatggacaacgc-3 (酉列 ¾·号 10J
を作成し、 STRATAGENE社製の QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用 いて、 Cys65Ser発現ベクターを作成した。 さらに、得られた発現ベクターを铸型として、 目的部位にミスマツチコドンを含む一 対の合成オリゴマー：
5 - attcaccgccttc fCし aaggcccagggct- 3 (目己列 ¾·号 11)
0 -agccctgggccttGGAgaaggcggtgaat-3' (酉己歹 U番号上 2)
作成し、 Quickし hange； te— Directed Mutagenesis Kitを用 ヽて、 Cyso5、 16 / ¾ΘΓ 発現ベクターを作成した。
[0027] Cys65および 167をセリンに置換した発現ベクターを Escherichia coliBL21株に形 質転換させた。発現プラスミドで形質転換された該大腸菌株を LB培地（50 gZmL アンピシリン含有）にて 37。Cで培養した後、 IPTG (イソプロピル一 1—チォ一 β— D —ガラタトシド）を終濃度が 0. 4力ら 0. 6mMになるように添カ卩して GSTと L— PGDS の融合蛋白質の発現を誘導し、さらに 4— 6時間培養した。
培養終了後、培養液カゝら大腸菌を回収して、これから超音波破砕処理によって菌 体から蛋白質を抽出した。遠心分離によって、不用物を除去した後、ダルタチオンセ ファロース 4Bカラムに保持させた。カラムに保持された融合蛋白質をトロンビンで消 化し、 L— PGDSフラクションを溶出させた。続いて、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ 一にて精製し、ヒト L— PGDSの 65と 167番目をセリンに置換した変異体（Serl. 3) を得た。
[0028] 実飾 15
ヒト L— PGDSの 89. 167 186番目のシスティンをァラニンに置椽した栾異体 (Ala 2. 3. 4)の製造
実施例 4において、合成オリゴマーの設計を変更した以外は実施例 3と同様にして ヒト L— PGDSの 89, 167と 186番目のシスティンをァラニンに置換した変異体 (Ala 2. 3. 4)を製造した。
[0029] 実施例 6
マウス L— PGDSの 65番目のシスティンをァラニンに置換した変異体 (Alal)の製造
STRATAGENE社製の QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、実 施例 2で得られたマウス由来 L PGDS発現プラスミドを铸型としてマウス L PGDS の 65番目のシスティンをァラニンに置換した変異体 (Alal)を次のように製造した。 Cys65を Alaに置換されるようにミスマツチコドンを含む一対の合成オリゴマー
5 ' - gctgtattgtatatgGCAaagacagtggta-3 ' (酉己列番号 13)
5 - taccactgtcttT Ccatatacaatacagc-3 (目 G列 ¾·号 14)
を合成し、これを用いて L— PGDS発現プラスミドを铸型として Cys65Ala変異体ブラ スミドを PCR増幅して得た。得られた変異体発現プラスミドを Escherichia coliBL21株 に形質転換させ、実施例 2と同様の方法でマウス L PGDSの 65番目のシスティン をァラニンに置換した変異体 (Alal)を製造した。
[0030] 実施例 7
マウス L— PGDSの 89と 186番目のシスティンをァラニンに置換した変異体 (Ala2. 3)の ¾¾告
実施例 6において、合成オリゴマーの設計を変更した以外は実施例 6と同様にして マウス L— PGDSの 89と 186番目のシスティンをァラニンに置換した変異体 (Ala2. 3)を製造した。
[0031] ms
マウス L— PGDSの 89 186番目のシスティンおよび 54番目のトリプトファンをァラニ ンに 橼した 謝木の観告
実施例 6において、合成オリゴマーとして
5 ― gcctccaactcaagc CAttccgggagaag—3 ( 歹 ϋ¾·号 l oノ
5 - cttctcccggaa TGCgcttgagttggaggc -3 (目 ΰ列 ¾·号上り)
を設計をし、以下は実施例 6と同様にしてマウス L— PGDSの 89と 186番目のシステ インおよび 54番目のトリブトファンをァラニンに置換した変異体に置換した変異体 (A1 a2. 3)を製造した。
[0032] 実施例 9
マウス L— PGDSの 89と 186番目のシスティンをァラニンに 54番目のトリプトファンを フエ二ルァラニンに置換した変異体の製造
実施例 6において、合成オリゴマーとして
5 - gcctccaactcaagcTTL,ttccgggagaag S ' (酉己列番号 1
ΰ - cttctcccggaaGAAgcttgagttggaggc -3 ' (酉己列番 18) を設計をし、以下は実施例 6と同様にしてマウス L—PGDSの 89と 186番目のシステ インをァラニンに 54番目のトリブトファンをフエ二ルァラニンに置換した変異体を製造 した。
[0033] 実施例 10
マウス L— PGDSの 89と 186番目のシスティンおよび 111番目のヒスチジンをァラニ ンに置椽した栾異体の製诰
実施例 6において、合成オリゴマーとして
5 - acctacagcagccccGし Ctcgggcagcatc -3 (目己列 ¾·号 19)
0 - gatgctgcccgagGCGgggctgctgtaggt -3 ' (酉己歹 U番号 20)
を設計をし、以下は実施例 6と同様にしてマウス L—PGDSの 89と 186番目のシステ インおよび 111番目のトリブトファンをァラニンに置換した変異体を製造した。
[0034] 実施例 11
マウス L— PGDSの 89 186番目のシスティンをァラニンに 43番目のトリプトファンを フエ二ルァラニンに置橼した栾虽体の観告
実施例 6において、合成オリゴマーの設計を変更した以外は実施例 6と同様にし てマウス L— PGDSの 89と 186番目のシスティンをァラニンに 43番目のトリプトファン をフエ二ルァラニンに置換した変異体を製造した。
[0035] 実施例 12
アルツハイマー病モデルマウスにおけるアミロイド'プラークへのリポカリン型プロスタ グランジン D合成酵素の結合
アルツハイマー病患者剖検脳およびアルツハイマー病モデルマウス Tg2576 (Hsia 0 K et al., し orrelative memory deficits, Abeta elevation, ana amyloid plaques in tran sgenic mice. Science. 274:99-102.1996; Hsiao KK et al. Age-related CNS disorder and early death in transgenic FVB/N mice overexpressing Alzheimer amyloid precur sor proteins. Neuron.l5:1203— 18. 1995)を用いて、アミロイド'プラークと L— PGDS の関連性を免疫組織染色法により解析した（図 1および図 2参照) L— PGDSが、ァ ルツハイマー病患者剖検脳およびアルッノヽイマ一病モデルマウスともにアミロイド'プ ラーク部位に結合して 、ることを同定した。 [0036] 実施例 13
ヒトアミロイド ·ベータペプチドに対する L PGDSの結合能
表面プラズモン共鳴法（Biacore)を用いて、ヒトアミロイド'ベータ 1 40ペプチドに 対する L PGDSのリコンビナント蛋白質 (Ala2. 3. 4)の結合能を解析した（図 3参 照）。 Ala2. 3. 4ίまヒトアミロイド'ベータ 1—40、 1 42ペプチド、更に ίま、 1— 28、 2 5— 35ペプチド断片にも強固な結合を示したが、 1— 16断片には結合を認めなかつ た。また、線維化したヒトアミロイド'ベータ 1—40、 1—42ペプチドにも強固な結合能 を示した。表 1は、表面プラズモン共鳴法による、種々の Α |8ペプチドに対する Ala2 . 3. 4の解離定数を示す。
[0037] [表 1]
A βぺプチド 解離定数 （η Μ)
Α β ( 1-40) 2 0
Α β ( 1-42) 2 7
A β ( 1-16) N D
A β ( 1-28) 1 9
A β ( 25-35) 1 8
A β ( 1-40) 線維 3 1
A β ( 1-42) 線維 2_6
N D ： 検出限界以下 （〉 1 μ Μ )
[0038] 実施例 14
ヒトアミロイド 'ベータべプチ に針する L PGDSおよび β -traceの凝暴 ¾制作用
ThT/'ッセィ (Ban T et al., Direct ooservation of amyloid fibril growth monitored b y thioflavin T fluorescence.J Biol Chem. 278:16462—5. 2003)を用い、 A j8 1—40ぺ プチドの凝集に対するヒト髄液より精製した L— PGDS ( β TRACE)およびヒト L— P GDSの変異体 (Ala2. 3. 4)の影響を解析した（図 4〜8参照)。
ThTはクロス'ベータシート構造を特異的に認識する蛍光物質であり、 in vitroで アミロイド線維の伸長とともに ThTの蛍光強度が増加することが知られて 、る。そこで リン酸緩衝液（50mM、 pH7. 5)、 NaCl (lOOmM)ゝ A j8 1—40 (50 M)の混合液 を調製し 37度で保温した。なおその際に L— PGDSの類似物質をそれぞれ濃度調 節し混合させる群も設定した。その各 5 μ 1を lmlの ThT (5 μ Μ)とグリシン緩衝液（5 OmM、 pH8. 5)に混ぜ、蛍光光度計 (励起波長 446nm、蛍光波長 490nm)にて蛍 光強度を経時的に測定した。 ThTアツセィを用い、 Α |8 1— 40および 1 42ペプチド の自然凝集に対するヒト L— PGDSの変異体 (Ala2. 3. 4)の影響を解析したところ、 用量依存的に強 ヽ凝集抑制作用を示した (図 5参照)。
ヒトアミロイド .ベータの凝集反応は線維化ヒトアミロイド ·ベータをシードとして添加す ることで促進される。レーザー蛍光顕微鏡および原子間力顕微鏡により、 A |8 1 -40 ペプチドのシード依存性凝集に対するヒト L— PGDSの変異体 (Ala2. 3. 4)の影響 を解析したところ、強い凝集抑制作用を示した (図 4、 6参照)。
ヒトアミロイド ·ベータの凝集反応はガンダリオシド GM1リボソームをシードとして添 加することでも促進される。 ThTアツセィにより、 A j8 1—40ペプチドの GM1リポソ一 ム依存性凝集に対してもヒト L— PGDSの変異体 (Ala2. 3. 4)は強い凝集抑制作用 を示した (図 7参照)。
上に述べた ThTアツセィを用い、 A j8 1—40および 1—42ペプチドのシード依存性 凝集に対するヒト髄液より精製した i8—traceの影響を解析したところ、用量依存性に 強い凝集抑制作用を示した。（図 8参照）
[0039] 実施例 15
マウス由 ¾杭 PGDSモノクローナル杭体による L PGDSのヒトアミロイド ·ベータ ί 40凝暴 ¾制効 の阳. ,験
上に述べた ThTアツセィを用いて、マウスモノクローナル抗体（1B7および 9A6)と前 処置したヒト Ala2. 3. 4の A j8 1—40ペプチドのシード依存性凝集に対しての影響 を解析したところ、 L— PGDSの Tyr116Thr123付近を認識する 1B7抗体（Oda et.al D evelopment and evaluation of a practical JJ¾A for human urinary lipocalin— type pro staglandin D synthase. Clin Chem. 2002 Sep; 48 (9) :1445- 53.)が抑制効果の阻害を 示した（図 9参照)。
[0040] 実施例 16
ヒトアミロイド .ベータペプチドに対する変異型 L PGDSの結合能
リコンビナント技術により調製した変異型マウス L— PGDS (実施例 3— 11)につい て、上に述べた表面プラズモン共鳴法（Biacore)を用いて、ヒトアミロイド'ベータ 1 40ペプチドに対する変異型 L— PGDSの結合能を解析した（図 10参照)。解離定数 は、 Cys89'185Ala, HismAlaについては 13. 2nM, Cys89,185Ala, Trp54Alaについては 4. OnM Cys89'185Alaについては 3. 5nMと極めて強固な結合能を示した。変異型 L— P GDSの酵素活性とヒトアミロイド'ベータ 1—40ペプチドに対する親和性に正の関連 性を認めた (表 2)。
[表 2]
Figure imgf000018_0001
[0041] 実施例 17
野生型マウスおよび L— PGDSノックアウトマウス（Eguchi N. et al. Proc. Natl. Aca d. Sci., USA, 1999 Jan 19, 96 (2) 726-730)に対するピオチン標識ヒトアミロイドべ タ 1—42脳室内投与実験を行った。図 11は、野生型マウスおよび L— PGDSノックァ ゥトマウスに対し、それぞれ 100 μ Μピオチン標識ヒトアミロイドベータ 1—42を 50 μ 1 脳室内投与した 1時間後に摘出した脳切片の顕微鏡写真である。野生型マウス (左） にくらべ L PGDSノックアウトマウス (右）では、脳室内（上 '中央）にアミロイドベータ の凝集を認め、さらに脳実質 (下）においても沈着を強く認めた。その発色強度は野 生型マウスにくらべ L— PGDSノックアウトマウスでは有意に 4. 82倍強ぐアミロイド ベータのクリアランスが減弱して 、ることを示して 、る。
産業上の利用可能性
[0042] アルツハイマー病の症状の抑制 ·改善に用いる薬剤の製造に用いることができる。

Claims

請求の範囲 [1] アルッノ、イマ一病の症状の抑制 ·改善に用いる薬剤であって、 1)リポカリン型プロスタグランジン D合成酵素（L— PGDS)； 2) L— PGDSの置換変異体であって、 3つのシスティン残基の少なくとも 1つを他の アミノ酸残基によって置換した置換体を含む L PGDSの置換変異体； 3) β ラクトグロブリン；および 4)ェストロジェン、ダルココルチコイド、インターロイキン— 1 j8、サイロイドホルモンより なる群から選択される、 L PGDS蛋白質の発現を増強する物質； よりなる群力 選択されるポリペプチドを有効成分として含む薬剤。 [2] リポカリン型プロスタグランジン D合成酵素 (L— PGDS)がヒト由来 (配列番号 1)ま たはマウス由来 (配列番号 2)である請求項 1に記載の薬剤。 [3] L— PGDSの置換変異体力 L— PGDSの 3つのシスティン残基の少なくとも 1つを グリシン、ァラニン、セリン、パリン、ヒスチジン、トレオニン、ァスパラギン、およびァス ノ ギン酸よりなる群力も選択されるアミノ酸残基によって置換したものである請求項1に記載の薬剤。 [4] L— PGDSの置換変異体が、
(1)配列番号 1のヒト L— PGDSの 65と 167番目のシスティンをァラニンあるいはセリ ンに置換した蛋白質；
(2)配列番号 1のヒト L— PGDSの 89, 167と 186番目のシスティンをァラニンあるい はセリンに置換した蛋白質；
(3)配列番号 2のマウス L— PGDSの 65番目のシスティンをァラニンあるいはセリン に置換した蛋白質;および
(4)配列番号 2のマウス L— PGDSの 89と 186番目のシスティンをァラニンあるいは セリンに置換した蛋白質；
よりなる群力 選択される請求項 1又は 2に記載の薬剤。
[5] 請求項 3または 4に記載の置換変異体のアミノ酸残基のさらに 1ないし数個を他の アミノ酸残基により置換した請求項 1に記載の薬剤。
[6] アルツハイマー病の症状の抑制 ·改善に対する遺伝子治療法に用いる、請求項 1 〜5のいずれかに記載の L PGDSおよびその置換変異体をコードする核酸。
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