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WO2006006695A1 - アセチルリジンを認識するマウスモノクローナル抗体、標識抗体及びその利用 - Google Patents

アセチルリジンを認識するマウスモノクローナル抗体、標識抗体及びその利用 Download PDF

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WO2006006695A1
WO2006006695A1 PCT/JP2005/013105 JP2005013105W WO2006006695A1 WO 2006006695 A1 WO2006006695 A1 WO 2006006695A1 JP 2005013105 W JP2005013105 W JP 2005013105W WO 2006006695 A1 WO2006006695 A1 WO 2006006695A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
lysine
acetylyl
labeled
mouse monoclonal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2005/013105
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yasuhiko Komatsu
Hisako Iwabata
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Advanced Life Science Institute Inc
Original Assignee
Advanced Life Science Institute Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Advanced Life Science Institute Inc filed Critical Advanced Life Science Institute Inc
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Priority to JP2006529166A priority patent/JPWO2006006695A1/ja
Publication of WO2006006695A1 publication Critical patent/WO2006006695A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL

Definitions

  • the present invention relates to acetylyl lysine, which is one of the post-translational modifications of proteins.
  • It relates to an antibody that can be used for the detection of.
  • proteins are known to perform their functions after undergoing various post-translational modifications, rather than functioning in their translated form (Int. J. Biochem. 24, 19-28, 1992).
  • protein phosphorylation is important as a signal cascade in transmitting extracellular signals to the nucleus, or as a regulator for normal cell cycle progression, and histone acetylation is efficient in transcription. Is important to proceed to.
  • a protein is ubiquitinated, it is transported to the proteasome and decomposes, losing its activity s, and by cleaving the signal peptide by the signal peptide present in the endoplasmic reticulum membrane, many proteins are active. become a mold. In this way, proteins are subjected to various modifications after translation, so that each function is exhibited at an appropriate place at an appropriate time.
  • Acetylation of lysine residues in proteins is a post-translational modification discovered in the 1960s.
  • the first protein in which lysine acetylation was discovered is core histone (Pro Natl. Acad. Sci. USA 5 1, 78 6-794, 1964). From the beginning of discovery, the relationship between acetylation and gene expression has been suggested, but it has only recently been understood at the molecular level. It's about things. In addition to histone acetylation, many protein acetylations have been found, suggesting that they may be important post-translational modifications comparable to phosphorylation (EMBO J. 19, 1176). -1 179, 2000).
  • One effective method for such a purpose is to use an antibody capable of recognizing the acetylyl lysine residue without depending on the amino acid sequence around the acetyl lysine residue.
  • Such an antibody binds to an unknown acetyl lysine-containing protein. Therefore, it is necessary to efficiently detect and purify a novel acetyl lysine-containing protein by techniques such as immunological detection, affinity purification, and immunoprecipitation. Can do.
  • variable region sequences of these antibodies are known to converge into a single frame sequence, but the individual amino acid sequences are completely To detect unknown acetyl lysine-containing proteins, anti-acetyl lysine Even if antibodies have a common framework, reactivity may be improved by some partial sequence differences.
  • Patent Document 1 W002074962A1
  • Non-Patent Document 1 Int. J. Biochem. 24, 19-28, 1992
  • Non-Patent Document 2 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51, 786-794,
  • Non-Patent Document 3 EMBO J. 19, 1176-1179, 2000
  • Non-Patent Document 4 J Immunol. Methods 272, 161-175, 2003 Disclosure of the Invention
  • the task of this research is to acquire a more sensitive method than before, which recognizes acetylyllysine residues in proteins without much influence from the types of amino acids surrounding the acetylyllysine residues of proteins.
  • the acquisition of a novel anti-acetyl lysine antibody that can be used as a probe molecule and a labeled product thereof is a main subject of the present invention.
  • the present inventors have found that the above problems can be solved by an antibody having a specific variable region amino acid sequence and a label thereof. That is, the above problem can be solved by the following means.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region is defined by the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a sequence that differs from it by 2 to 3 amino acids, and the amino acid sequence of the heavy chain variable region is SEQ ID NO: 4 or 2 or 3 A mouse monoclonal antibody defined by a different sequence of mino acids.
  • amino acid sequence of the light chain variable region is defined by SEQ ID NO: 2
  • the mouse monoclonal antibody according to (1) above, wherein the amino acid sequence of the heavy chain variable region is defined by SEQ ID NO: 4.
  • An anti-acetylyl lysine labeled antibody obtained by binding a labeled molecule to a sulfhydryl group exposed by reducing an anti-acetylyl lysine antibody.
  • FIG. 1 shows the difference in reactivity of ACK2F12 antibody and ML5C1 antibody against non-acetylated BSA (A) and acetylated BSA (B). Either antibody reacts with acetylated BSA, but not with non-acetylated BSA.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structures of lysine, No; -acetylyllysine, and ⁇ -acetylyllysine.
  • FIG. 3 shows the effect of ⁇ -acetylyllysine ( ⁇ ) and ⁇ -acetylyllysine ( ⁇ ) on the binding of ACK2F12 antibody and AKL51 antibody to acetylated BSA. It can be seen that the binding of both antibodies is not competed by ⁇ -acetylyllysine but is competed by ⁇ -acetylyllysine.
  • FIG. 4 is a diagram showing the sequences of the acetylyllysine-containing peptide and non-containing peptide used in the experiment of FIG.
  • Fig. 5 ⁇ shows the reactivity of the anti-acetylyl lysine mouse monoclonal antibody AKL5C1 to various acetyl lysine-containing peptides.
  • Fig. 5 ⁇ shows the reaction of the anti-acetylyl lysine mouse monoclonal antibody ACK2F12 to various acetyl lysine-containing peptides.
  • FIG. 5C shows the reactivity of the anti-acetylyl lysine mouse monoclonal antibody Ac-K-103 (Cell Signaling) to various acetylyl lysine-containing peptides.
  • FIG. 5D shows the reactivity of anti-histone H3 (Ac-Lys-14) commercially available from UpState to various acetylyl lysine-containing peptides.
  • FIG. 3 is a view showing the reactivity of a Usagi polyclonal antibody to various acetylyl lysine-containing peptides.
  • FIG. 6 shows three anti-acetylyl lysine mouse monoclonal antibodies (A) of AKL5CK ACK2F12 and Ac-K-103 (Cell Signaling) (A) and anti-histone H3 (Ac-Lys-) commercially available from UpState.
  • FIG. 14 shows the results of comparing the detection powers of 14) and anti-histone H4 (Ac-Lys-16) usagi polyclonal antibody (B) by Western blot. Each lane contains lysate equivalent to 6 g protein. As the primary antibody concentration, 1 g / ml was used except for anti-histone H4 (Ac-Lys-16). Antihistone H4 (Ac-Lys-16) was used after diluting the stock solution 1000 times. It can be seen that the ACK2F12 antibody can detect the most bands.
  • Fig. 7 shows the results of comparing the detection power of AKL5C1 and ACK2F12 antibodies with Western blot using three types of cultured cells (M0LT-4F, HepG2, and 1B2C6) lysate (30 g / lane). It is.
  • the ACK2F12 antibody can detect more bands than the AKL5C1 antibody.
  • FIG 8 is a schematic diagram showing the difference between the two methods of labeling antibodies with horseradish peroxidase (HRP).
  • HRP horseradish peroxidase
  • Fig. 9 shows that Trichos Yutin A-treated, untreated MOLT-4F cell sate was electrophoresed (22 g / lane), transferred to PVDF membrane, and Ac-K-103, AKL5CK ACK2F 12 antibody was not used.
  • HRP-labeled anti-mouse IgG antibody is used as secondary antibody to detect acetylated protein in M0LT-4F cell lysate (A)
  • ACK2F12 antibody directly labeled with HRP It is a figure showing the result of comparing (B). It can be seen that the ACK2F12 antibody labeled with HRP via the SH group has the highest detection power.
  • Fig. 10 shows the results of detecting chemically acetylated BSA in Western blot using ACK2F12-HRP-SH labeled antibody. Both are able to detect 80 pg of protein.
  • Fig. 11 shows the results of detecting mouse organ lysate by electrophoresis (30 / lane), transferring it to PVDF membrane, and detecting acetylyllysine-containing proteins in each organ using ACK2F12-HRP-SH .
  • FIG. 12 shows that after developing mouse brain and stomach lysate by electrophoresis (15 g / lane), transferring to a PVDF membrane and reacting with ACK2F12-HRP-SH, 10 mM lysine, N
  • FIG. 4 is a diagram showing the results when co-existing acetylyl lysine or N ⁇ -acetyl lysine. ⁇ ⁇ ⁇ It can be seen that the detection of the band by the antibody is inhibited only in the presence of ⁇ _ acetylyl lysine.
  • Figure 13A shows the sequence of cDNA encoding the light chain variable region of the ACK2F12 antibody with AL3D5, AL11, AKL3H6,
  • FIG. 5 is a view showing the cDN A sequence encoding the variable region of the AKL5C1 antibody side by side. Matching points are indicated by white letters.
  • FIG. 13B shows the sequence of the cDNA encoding the heavy chain variable region of the ACK2F12 antibody, aligned with the cDNA sequence encoding the heavy chain variable region of the AL3D5, AL1K AKL3H6, and AKL5C1 antibodies. Matching points are indicated by white letters.
  • FIG. 14 shows the amino acid sequence of the variable region of the ACK2F12 antibody along with the amino acid sequence of the variable region of the AL3D5, ALU, AKL3H6, and AKL5C1 antibodies.
  • A Light chain
  • B Heavy chain. Matching points are indicated by white letters.
  • FIG. 15 is a table summarizing the numbers of nucleotides or amino acids that are different from each other in the cDNA sequence (A) and amino acid sequence (B) of the variable regions of the ACK2F12, AL3D5, AL1K AKL3H6, and AKL5C1 antibodies.
  • the upper right corner of the diagonal line shows the ligation in the light chain and the lower left corner in the heavy chain.
  • Figure 16 shows AL11, AL3D5, AKL3H6, AKL5CK ACK2F12, and commercially available A The figure which shows the result of having determined the amino acid sequence from the N terminal of the light chain and heavy chain of c-K-103 antibody to 10 residues with a protein sequencer. All results were obtained for the light chain, but for the heavy chain, the PTH amino acid was not excised and the sequence could not be determined.
  • any method can be used to produce an anti-acetylyl lysine antibody, but as an antigen used for immunization, for example, chemically acetylated limpet hemocyanin (KLH) mash serum albumin (BSA) Equal protein can be used, or a peptide containing a acetylyl lysine residue bound to a protein such as KLH can be used.
  • KLH chemically acetylated limpet hemocyanin
  • BSA mash serum albumin
  • Equal protein or a peptide containing a acetylyl lysine residue bound to a protein such as KLH can be used.
  • Proteins that can be used practically for the above purpose are not limited to KLH and BSA, but also include ovalbumin, human serum albumin, transferrin, thyroglobulin, and the like.
  • the amino acid sequence of the variable region of the antibody is defined.
  • the amino acid sequence of the variable region of the antibody can be determined, for example, by the following method. RNA is extracted from a hybridoma that produces monoclonal antibodies, and cDNA is prepared using the RNA as a cage. Next, PCR is carried out using a primer set corresponding to the region sandwiching the variable region of the antibody, and cDNA encoding the variable region is amplified. The amplified cDNA can be read directly through the DNA sequencer, or it can be read once after being placed in the cloning vector and incorporated into E. coli. By translating the obtained cDNA sequence into an amino acid sequence, the amino acid sequence of the variable region can be known.
  • antibody molecules are reduced and separated into light and heavy chains, and then separated by means such as electrophoresis, and each amino acid sequence is divided into the principles of Edman degradation. It can also be determined directly using a means such as a gas phase sequencer used.
  • a technique such as Western blot using an antibody can be considered.
  • the established antibody may be used as it is, and a corresponding labeled anti-immunoglobulin antibody may be used as a secondary antibody.
  • the present inventors directly label the antibody with a repo overnight enzyme. As a result, it was found that the detection sensitivity was greatly improved.
  • several methods have been reported as methods for labeling an antibody with a labeling molecule such as HRP.
  • anti-acetylyl lysine antibodies are exposed by a weak reduction of the antibody compared to methods using amino groups on the antibody molecule. It was found that the method using the sulfhydryl group was superior. That is, for anti-acetylyl lysine antibodies, it is desirable not to use the amino group on the antibody for binding to other molecules.
  • mice The method of immunizing animals will be explained using mice as examples.
  • Produced antigen-containing emulsion is subcutaneous, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, or multiple Inject into the site. After completion of the first immunization, an interval of 1 to 4 weeks is provided, and the second immunization is similarly performed.
  • the immunization is continued until the antibody titer of the anti-acetylyl lysine antibody in the blood rises.
  • the antibody titer can be measured as follows. Dissolve ushi serum albumin acetylated in the same manner as KLH in PBS to a concentration of 10/2 g / ml, add it to each well of the 96-well ELISA plate in a volume of 50 1 per well, and add 4 ° Adsorb overnight with C.
  • ACK2F12 (deposit number FERM) as a high-pridoma clone obtained by the above method B P- 1 03 5 1).
  • This clone was transferred to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (Tsukuba Satohito 1-chome, 1-chome, 1-Chuo 6) on June 18th, 2006.
  • FERM BP- 1 03 5 1 As an international deposit (transferred from FERM P-2008 9 deposited on June 18, 2006).
  • the antibody obtained by the above method recognizes an acetylyl lysine residue without depending much on the surrounding amino acid sequence.
  • the antibody recognizes a acetylyl lysine residue because the reactivity of the antibody to the immobilized acetylated protein is inhibited by externally added acetylyl lysine.
  • the fact that it does not depend much on the surrounding amino acid sequence can be determined by examining whether or not the antibody reacts with any of the various acetylyl lysine peptides having surrounding sequences.
  • animal protein lysate is electrophoresed, transferred to a PVDF membrane or nitrocellulose membrane, and stained with an antibody using the Western blot method to stain multiple proteins.
  • any method can be used to label the antibody with a molecule of a repo such as an enzyme or a fluorescent dye.
  • the amino group on the antibody molecule is not used. Is preferred. Specifically, by gently reducing the antibody with a reducing agent such as cysteamine, the sulfhydryl group in the molecule is exposed and a labeled molecule activated with maleimide or the like is bound to the antibody molecule.
  • the antibody can be labeled with a reporter molecule without using the amino group above.
  • Whether the prepared antibody and modified antibody are superior to the conventional antibody can be detected by detecting more acetylyllysine-containing protein bands when using the same concentration of antibody or modified antibody, for example. I can confirm.
  • the antibodies and modified antibodies provided by the present invention are not only useful for searching for a acetylyllysine-containing protein as a new target molecule useful for diagnosis and treatment of diseases, but in addition to discovering promising target molecules, It can be used for functional control purposes and diagnostic purposes. For example
  • the hybridoma ACK2F12 that produces an anti-acetylyllysine monoclonal antibody whose amino acid sequence of the light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 2 and whose amino acid sequence of the heavy chain variable region is shown in SEQ ID NO: 4 is as follows. Produced.
  • KLH chemically acetylated keyhole limpet to mosyanin
  • Acetylated KLH was prepared by the following method. Dissolve 10 mg KLH in 1 mL borate buffer (20 mM Na 2 B (10 07 > pH 9.3), add 10 N NaOH 50 1 and acetic anhydride 22.6 ⁇ il under ice-cooling, Incubated for 30 minutes Gel filtration column (PD-10, Amersham) was used to replace the solvent with PBS. Using.
  • mice were immunized as follows.
  • the acetylated KLH solution was mixed 1: 1 with Titer Max Gold (CytRx), and repeatedly passed through the joint with two syringes joined by an AC joint to produce an emulsion.
  • the prepared antigen-containing emulsion was immunized three times at intervals of 1 to 4 weeks, either subcutaneously or intraperitoneally. As a single antigen amount, 50 to 100 g was used.
  • acetylated urushi serum albumin (hereinafter referred to as BSA) in the same manner as KLH was immobilized on an ELISA plate and confirmed to increase the antibody titer in blood by the method described below.
  • BSA acetylated urushi serum albumin
  • Acetylated KLH dissolved in PBS 4 days before fusion was administered intraperitoneally and 3 days prior to the tail vein (dose: 100 g / mouse).
  • the antibody titer was measured as follows.
  • HRP horse radish peroxidase
  • the antibody-producing cells and myeloma were fused as follows. Three days after intravenous antigen administration, the spleen was removed and spleen cells were isolated. 5 x 10 7 of these were cultured separately and mouse myeloma SP2 / 0-Agl4 1 Fused with 7 X10 by using polyethylene glycol. Cells that were successfully fused were selectively cultured in HAT (hypoxanthine aminopterin 'thymidine) medium. The culture was continued for 11 days while changing half of the medium every few days, and then the antibody titer of the culture supernatant was measured. Positive 'well cells were cloned by limiting dilution to obtain the target antibody-producing hyperpridoma ACK2F12 (deposit number FERM BP-10351). The production monochrome isotype was IgGl ⁇ .
  • Example 2 Measurement of antibody reactivity to acetylated protein To confirm that the monoclonal antibody established this time reacts with acetylated protein, the reactivity to immobilized acetylated BSA and non-acetylated BSA was determined by ELISA. We investigated by the method. Acetylated or non-acetylated BSA diluted in PBS to a concentration of 10 g / ml was added to each well of the ELISA plate in a volume of 50 1 / well, adsorbed overnight at 4 ° C, and washed with PBST. did. Each purified antibody was serially diluted with PBST, added to each well, and allowed to react at room temperature for 30 minutes.
  • FIG. 2 there are two different molecules in acetylyl lysine. No; -acetylyl lysine and ⁇ -acetylyl lysine .
  • Figure 3 shows the results of color development. As shown in this figure, neither antibody was competed at all by ⁇ -acetylyllysine that was competed by ⁇ -acetylyllysine. This result indicates that these antibodies have a high ability to specifically bind to those in which the ⁇ -amino group of the resin is acetylated.
  • acetylyllysine-containing peptides listed in Fig. 4 were used in ELISA plates (AduaBind, M & E, Denmark). The reactivity of each antibody was examined in the same manner as in Example 2. Peptide conjugation was performed according to the manufacturer's instructions, but the concentration of peptide used for conjugation was 10 / g / ml.
  • Example 5 Comparison of Reactivity of Each Antibody Using MOLT-4F Cells 1 ys ate To compare the reactivity of each antibody, an experiment using Western b 1 o 11 ing was performed. Cell lysate was prepared after treating M0LT-4F cells, a human T-cell leukemia cell line, with Trichosyutin A, a histone acetylase inhibitor, at a concentration of 1 M for 6 hours. As a control, lysate of lysate that had not been treated with Trichosanthin A was also prepared.
  • the five anti-acetyl lysine antibodies compared were ML5C1, ACK2F12, Ac-K-103, anti-Ac-H3-K14, and anti-Ac-H4-K-16 as in Example 4.
  • the results are shown in FIG.
  • Each lane was electrophoresed with 15% SDS-PAGE for the amount of 6 proteins and transferred to a PVDF membrane.
  • HRP-labeled anti-mouse IgG antibody was used, and the band was detected with Amersham ECL Plus.
  • anti-Ac-H3-K14 is histone H3. Only the acetylene was recognized almost selectively, and the accumulation of acetylation of this molecule by treatment with trichostactin A was detected. anti-Ac-H4-K16 reacted only weakly with histone H4 when treated with Trichos-Yuchin.
  • Western blotting was performed under the same conditions except that each of the A KL5C1 antibody and the ACK2F12 antibody was used at a concentration of 1 g / ml, and detection of acetylated protein at the basal level of each cell was attempted. The results are shown in FIG. Similar to the results in FIG. 6, it was confirmed that the ACK2F12 antibody was able to detect more bands than the AKL5C1 antibody, and that ACK2 2 had better power in Western b 1 ot.
  • Example 7 Enhancement of detection power by direct labeling of anti-acetyl lysine antibody Since it has been found that various anti-acetylyl lysine antibodies can be used to detect various acetylyl lysine-containing proteins, antibodies are intended to further enhance the detection power.
  • the other method is a weak reduction with cysteamine to break the disulfide bond between the heavy chains and the exposed free sulfhydryl group to bind maleimide activated HRP.
  • labeling was performed according to the following procedure. Dissolve 0.5 nig of antibody in 0.5 ml of 0.1 M sodium phosphate, 5 mM EDTA, pH 6 and add 3 mg cysteamine. did. After 1.5 hours of reaction at 37, the solvent was replaced with PBS containing 5 mM EDTA (PBS-EDTA) by gel filtration to obtain a reduced antibody.
  • PBS-EDTA PBS containing 5 mM EDTA
  • 3 mg of HRP was dissolved in 1.5 ml of PBS-EDTA, and 3 mg of sulfo_SMCC (Pie rce) was added thereto and reacted at 37 ° C for 30 minutes.
  • the solvent was replaced with PBS-EDTA by gel filtration to obtain HRP activated with maleimide.
  • the reduced antibody solution and the HRP solution activated with maleimide were mixed, concentrated to 500 ⁇ 1 with an ultrafiltration membrane with a molecular weight exclusion of 50000, and then reacted at 4 ° C overnight.
  • 1 mg of cysteamine was added and reacted at room temperature for 30 minutes to crush unreacted maleimide, and the solvent was replaced with PBS by gel filtration to obtain a labeled antibody.
  • the labeled antibody prepared by this method is abbreviated as Ab-HRP-SH.
  • a schematic diagram comparing the two labeling methods is shown in FIG.
  • Figure 9B shows the results of detecting the same sample with HRP-labeled ACK2F 12 antibody, but clearly more bands were detected compared to the power of unlabeled antibody. It can be seen that more anti-acetylyllysine antibodies can detect more acetylyllysine-containing proteins. The effect was particularly remarkable when HRP was bound via a sulfhydryl group. This suggests that the amino group in the antibody molecule may play an important role in the recognition of antibody acetylyllysine.
  • Example 8 Detection of chemically acetylated BSA with ACK2F12-HRP-SH
  • This chemically modified BSA appears to be acetylated at multiple sites, so it can be used to detect intact proteins that are thought to be acetylated at only one or several sites within a molecule. Although this cannot be done directly, this result shows the high detection power of this modified antibody.
  • a system that can detect acetylyllysine-containing proteins with high sensitivity has been obtained, and an attempt was made to detect acetylyllysine-containing proteins in mouse lysates.
  • Each organ of Balb / c mice (early) was sonicated in 9.8 M urea, 4% CHAPS, 100 mM dithiothreitol (DTT), and the centrifuged supernatant was used for analysis.
  • Each organ lysate was electrophoresed on a 12% gel so that the protein amount in each lane was 30 g, transferred to a PVDF membrane, and Western Mot was performed with ACK2F12-HRP-SH.
  • the sample before electrophoresis was diluted with 130 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 15% glycerol, 80 mM DTT, 0.01% bromophenol blue, and treated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the results are shown in FIG. Depending on the organ, it shows very characteristic staining patterns, especially multiple bands in the brain. Strongly stained.
  • characteristic bands were observed in the lungs, stomach, and liver. In most organs, a prominent band was observed at the low molecular weight position (14.4-21. 5K), which seems to be histone, but not in skeletal muscle.
  • the brain and stomach of the same mouse organ lysate are confirmed.
  • 10 mM lysine, ⁇ -acetylyl lysine, and ⁇ -acetylyl lysine were allowed to coexist with the labeled antibody, and a competition experiment was conducted. The results are shown in FIG.
  • the ACK2F 12 antibody has been shown to have superior properties to the previously reported pan-reactive anti-acetyl lysine antibodies.
  • the variable region of this antibody was cloned according to a previous report, and the base sequence of cMA coding for the variable region of each of the light and heavy chains was determined.
  • the results are shown in FIG. 13A and FIG. 13B along with the cDNA sequences of the anti-acetylyl lysine antibody variable regions reported so far.
  • the amino acid sequence deduced from the cDNA sequence is shown in FIG. 14 along with the previously reported antibody sequence.
  • SEQ ID NOs: 1 and 3 each have an ACK2F 12 antibody
  • the light chain and heavy chain variable region cDNA sequences and the corresponding amino acid sequences are shown side by side.
  • the ACK2F12 antibody has basically the same framework sequence as the four types of antibodies whose sequences have been reported so far. However, the sequence is not completely the same, and in the reported antibody and base sequence, the light chain has a minimum of 6 sites, the heavy chain has a minimum of 23 sites, the amino acid sequence has a light chain of at least 4 sites and the heavy chain has a minimum of 14 sites I found that there was a difference in the location. The results of summing up the number of mismatches between each sequence are shown in FIG. From these results, the basic framework sequence of the ACK2F12 antibody established this time is very similar to the previously reported sequence, but there are still many sequence differences. It is thought that power was brought about.
  • the hybridoma is not available. However, after development by electrophoresis, it is transferred to a PVDF membrane, and the heavy and light chains are excised. It was determined by the sequencer (Beckman, LF-3000).
  • FIG. 16 shows the results of examining AL11, AL3D5, AKL3H6, and AKL5C1 antibodies by the same method. As shown in the figure, the N-terminal sequence of the L chain of the Ac-K-103 antibody was DAVMTQTPLS, which completely matched the N-terminal sequence of other antibodies except ACK2F12. In addition, the N-terminal sequence of the heavy chain could not be determined for any antibody. This is probably because the N-terminus of any antibody is blocked.
  • mouse monoclonal antibodies recognizing acetylyl lysine residues without depending much on the peripheral sequence basically have a common framework sequence.
  • some differences in the variable region sequence had a significant effect on the antibody's power and other properties.
  • the anti-acetylyl lysine monoclonal antibody and the enzyme-labeled product thereof provided by the present invention are useful for searching for a new acetyl lysine-containing protein that can be a cause of a disease or a diagnostic marker. Furthermore, the anti-acetylyllysine monoclonal antibody and enzyme label provided by the present invention are useful in the control of biomolecular functions in which acetylation of lysine residues plays an important role, and in disease diagnosis by detecting acetylyllysine-containing proteins. Is also useful.

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Abstract

軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列表１またはそれと２ないし３アミノ酸異なる配列で規定され、かつ重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列表２またはそれと２ないし３アミノ酸異なる配列で規定される、マウスモノクローナル抗体。

Description

ァセチルリジンを認識するマウスモノクローナル抗体、 標識抗体及 びその利用
技術分野
本発明は、 夕ンパク質の翻訳後修飾の一つであるァセチルリジン 明
の検出に使用しうる抗体に関する。
田 背景技術
タンパク質は、 多くの場合、 翻訳されたそのままの形で機能を発 揮するのではなく、 様々な翻訳後修飾を受けた後に、 本来の機能を 発揮することが知られている （I n t. J. B i ochem. 24, 19-28, 1992 ) 。 例えば、 タンパク質のリン酸化は細胞外シグナルを核まで伝達 する際のシグナルカスケードとして、 あるいは正常な細胞周期が進 行するための制御因子として重要であるし、 ヒス トンのァセチル化 は転写が効率的に進行するために重要である。 タンパク質がュビキ チン化されるとプロテアゾームに運ばれて分解して活性を失う力 s、 小胞体膜に存在するシグナルべプチダ一ゼによってシグナルべプチ ドが切り取られることにより、 多くのタンパク質は活性型になる。 この様に、 タンパク質は翻訳後に様々な修飾を受けることにより適 切な時期に適切な場所でそれぞれの機能を発揮することになる。
タンパク質中のリジン残基のァセチル化は、 1960年代に発見され た翻訳後修飾である。 最初にリジンァセチル化が発見された夕ンパ ク質はコアヒス トンである （P ro Na t l . Acad. Sc i . USA 5 1, 78 6-794, 1964) 。 発見当初から、 ァセチル化と遺伝子の発現の関係 が示唆されていたが、 分子レベルでその理解が進んだのは最近にな つてのことである。 ヒス トンのァセチル化に加えて、 多くのタンパ ク質のァセチル化が見出される様になり、 リン酸化に匹敵する重要 な翻訳後修飾である可能性が示唆されている （EMBO J. 19, 1176-1 179, 2000) 。 従って、 今後もこれまでに見出されていない、 多く のァセチルリジン含有タンパク質が発見されると思われ、 その内の いくつかは、 治療薬の標的分子や、 疾患の診断目的で重要な分子で ある可能性があり、 効率的に未知のァセチル化タンパク質を見出す 手段が望まれている。
その様な目的のために有効な一つの方法は、 ァセチルリジン残基 のまわりのアミノ酸配列に依存せずにァセチルリジン残基を認識で きる抗体を用いる方法である。 その様な抗体は、 未知のァセチルリ ジン含有タンパク質に対して結合するので、 免疫学的な検出や、 ァ フィニティー精製、 免疫沈降等の手法により効率的に新規ァセチル リジン含有タンパク質を検出精製することができる。
周辺配列にあまり依存しない抗体としては、 いくつかのものが巿 販、 または発表されている。 市販されているモノクローナル抗体と しては、 例えば、 Cell Signaling社から市販されているモノクロ一 ナル抗体である Ac- K- 103がー例として挙げられる。 また、 小松らは ァセチルリジン含有ペプチドを Keyhole Limpet hemocyan in (KLH) または化学的にァセチル化した KLHを用いた免疫により、 4種類の 異なった抗ァセチルリジンマウスモノクローナル抗体の樹立を行つ ている （J Immunol. Methods 272, 161-175, 2003; W002074962A1 これらの抗体の可変領域の配列はいずれもただ一つのフレームヮ —ク配列に収斂することが分かっているが、 個々のァミノ酸配列は 完全には同じではなかった。 未知のァセチルリジン含有タンパク質 を検出するためには、 少しでも検出力に優れた抗ァセチルリジン抗 体が望まれており、 共通のフレームワークを持つ抗体であっても、 部分的な配列のいくつかの違いにより、 反応性の改善が図れる可能 性がある。
特許文献 1 W002074962A1
非特許文献 1 Int. J. Biochem. 24, 19-28, 1992
非特許文献 2 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51, 786-794,
64
非特許文献 3 EMBO J. 19， 1176-1179, 2000
非特許文献 4 J Immunol. Methods 272, 161- 175, 2003 発明の開示
タンパク質中のァセチルリジン残基を、 タンパク質の種類ゃァセ チルリジン残基の周辺アミノ酸の種類にあまり影響されずに認識す る、 従来よりも感度の良い方法を獲得することが本研究の課題であ る。 特に、 そのためのプローブ分子として用いうる新規抗ァセチル リジン抗体及びその標識体の取得が本発明の主たる課題である。 上記課題を解決するために鋭意努力を行った結果、 本発明者らは 特定の可変領域アミノ酸配列を有する抗体、 及びその標識体により 上記課題を解決できることを見いだした。 すなわち、 上記課題は以 下の手段により解決できる。
( 1 ) 軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号 ： 2に記載の配列 またはそれと 2ないし 3アミノ酸異なる配列で規定され、 かつ重鎖 可変領域のアミノ酸配列が配列番号 ： 4またはそれと 2ないし 3ァ ミノ酸異なる配列で規定される、 マウスモノクローナル抗体。
( 2 ) Ν ε -ァセチルリジンを認識する、 上記 （ 1 ) に記載のマウ スモノクローナル抗体。
( 3 ) 軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号 ： 2で規定され、 かつ重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号 ： 4で規定される、 上 記 （ 1 ) に記載のマウスモノクローナル抗体。
( 4 ) N ε -ァセチルリジンを認識する、 上記 （ 3 ) に記載のマウ スモノクローナル抗体。
( 5 ) 寄託番号 FERM BP- 10351で規定されるマウスハイプリ ドー マにより産生される、 上記 （ 4 ) に記載のモノクローナル抗体。
( 6 ) 抗ァセチルリジン抗体を還元して露出させたスルフヒ ドリ ル基に標識分子を結合させることにより得られる、 抗ァセチルリジ ン標識抗体。
( 7 ) 前記標識分子が西洋ヮサビペルォキシダ一ゼである、 上記 ( 6 ) に記載の抗ァセチルリジン標識抗体。
( 8 ) 標識前の抗ァセチルリジン抗体が上記 （ 2 ) に記載の抗ァ セチリジン抗体である、 上記 （ 6 ) 又は （ 7 ) に記載の抗ァセチル リジン標識抗体。
( 9 ) 標識前の抗ァセチルリジン抗体が上記 （ 4 ) に記載の抗ァ セチルリジン抗体である、 上記 （ 6 ) 又は （ 7 ) に記載の抗ァセチ ルリジン標識抗体。
(10) 標識前の抗ァセチルリジン抗体が上記 （ 5 ) に記載の抗ァ セチルリジン抗体である、 上記 （ 6 ) 又は （ 7 ) に記載の抗ァセチ ルリジン標識抗体。
(11) 抗ァセチルリジン抗体に標識分子を結合させる手法として 、 抗体のアミノ基以外の部分を用いて結合させる方法を用いること により得る、 上記 （ 7 ) 〜 （10) のいずれかに記載の抗ァセチルリ ジン標識抗体。
(12) アミノ基以外の部分が抗体を還元することにより露出した スルフヒ ドリル基である、 上記 （11) に記載の抗ァセチルリジン標 識抗体。 図面の簡単な説明
図 1は、 非ァセチル化 BSA (A) 及びァセチル化 BSA (B) に対する ACK2F12抗体及び ML5C1抗体の反応性の違いを示した図である。 い ずれの抗体もァセチル化 BSAに対しては反応するが、 非ァセチル化 B SAに対しては反応しない。
. 図 2は、 リジン、 No;-ァセチルリジン、 及び Νε -ァセチルリジン の構造を示した図である。
図 3は、 ァセチル化 BSAに対する ACK2F12抗体及び AKL5 1抗体の結 合に及ぼす Ν -ァセチルリジン （Α) 及び Νε -ァセチルリジン （Β) の影響を示した図。 どちらの抗体の結合も、 Να-ァセチルリジンに よっては競合されず、 Νε -ァセチルリジンによって競合されること が分かる。
図 4は、 図 5の実験に使用したァセチルリジン含有ペプチド及び 非含有ペプチドの配列を示した図である。
図 5Αは、 抗ァセチルリジンマウスモノク口一ナル抗体 AKL5C1の、 各種ァセチルリジン含有ペプチドに対する反応性を示した図である 図 5Βは、 抗ァセチルリジンマウスモノクローナル抗体 ACK2F12の 、 各種ァセチルリジン含有ペプチドに対する反応性を示した図であ る。
図 5Cは、 抗ァセチルリジンマウスモノク口一ナル抗体 Ac-K - 103 ( Cell Signaling社） の、 各種ァセチルリジン含有ペプチドに対する 反応性を示した図である。
図 5Dは、 UpState社から市販されている抗ヒス トン H3 (Ac-Lys-14 ) の、 各種ァセチルリジン含有ペプチドに対する反応性を示した図 である。
図 5Eは、 UpState社から市販されている抗ヒス トン H4 (Ac-Lys-16 ) ゥサギポリクローナル抗体の、 各種ァセチルリジン含有ペプチド に対する反応性を示した図である。
図 6は、 AKL5CK ACK2F12, 及び Ac - K-103 (Cell Signaling社) の 3種類の抗ァセチルリジンマウスモノクローナル抗体 （A) 並び に UpState社から市販されている抗ヒス トン H3 (Ac-Lys-14) 及び抗 ヒス トン H4 (Ac-Lys-16) ゥサギポリクロ一ナル抗体 （B) の検出力 を Western bl o tで比較した結果を示した図である。 各レーンには 6 gタンパク質相当の lysateを流動している。 一次抗体濃度として は、 抗ヒス トン H4 (Ac-Lys-16) 以外は 1 g/mlを使用した。 抗ヒ ス トン H4 (Ac-Lys-16) は原液を 1000倍希釈して使用した。 ACK2F12 抗体が最も多くのバンドを検出できることが分かる。
図 7は、 AKL5C1及び ACK2F12抗体の検出力を、 3種類の培養細胞 (M0LT-4F、 HepG2, 及び 1B2C6) lysate (30 g/lane) を用いて We stern bl o tで比較した結果を示した図である。 ACK2F12抗体の方が A KL5C1抗体より も多くのバンドを検出できる。
図 8は、 抗体を西洋ヮサビペルォキシダーゼ （HRP) で標識する 二つの方法の違いを模式的に示した図である。
図 9は、 トリコス夕チン A処理、 未処理の MOLT- 4F細胞 sateを 電気泳動後 （2 2 g/レーン） 、 PVDF膜に トランスファ一した後に、 Ac-K-103 、 AKL5CK ACK2F 12抗体を非標識のまま一次抗体として用 い、 HRP 標識抗マウス IgG抗体を二次抗体として用いて M0LT-4F細胞 lysate中のァセチル化タンパク質を検出した場合 （A) と、 ACK2F12 抗体に直接 HRP 標識したものを用いて検出した場合 （B) を比較し た結果を示した図である。 SH基を介して HRP 標識した ACK2F12抗体 が最も検出力が高いことが分かる。
図 10は、 化学的にァセチル化した BSAを ACK2F12-HRP- SH標識抗体 を用いた Western b lotにて検出した結果を示した図であり、 少なく とも 80 pgのタンパク質を検出することが可能である。
図 11は、 マウス臓器 lysateを電気泳動で展開後 （30 /レーン ) 、 PVDF膜に転写し、 各臓器中のァセチルリジン含有タンパク質を ACK2F12- HRP-SHを用いて検出した結果を示した図である。
図 12は、 マウス脳及び胃 lysateを電気泳動で展開後 （15 g/レ —ン） 、 PVDF膜に転写し、 ACK2F12- HRP-SHを反応させる際に、 10 m Mのリジン、 Nひ -ァセチルリジン、 または N ε -ァセチルリジンを共 存させた時の結果を示す図である。 Ν ε _ァセチルリジンを共存させ た時のみ、 抗体によるバンドの検出が阻害されていることが分かる 図 13Aは、 ACK2F12抗体の軽鎖可変領域をコ一ドする cDNAの配列を AL3D5、 AL11、 AKL3H6、 及び AKL5C1抗体の可変領域をコードする cDN A配列と並べて示した図である。 一致している箇所は、 白抜き文字 で示される。
図 13Bは、 ACK2F12抗体の重鎖可変領域をコ一ドする cDNAの配列を AL3D5, AL1K AKL3H6, 及び AKL5C 1抗体の重鎖可変領域をコードす る cDNA配列と並べて示した図である。 一致している箇所は、 白抜き 文字で示される。
図 14は、 ACK2F12抗体の可変領域のアミノ酸配列を、 AL3D5、 ALU 、 AKL3H6, 及び AKL5C1抗体の可変領域のアミノ酸配列と並べて示し た図である。 （A) 軽鎖、 （B) 重鎖。 一致している箇所は、 白抜き 文字で示される。
図 15は、 ACK2F12、 AL3D5、 AL1K AKL3H6, 及び AKL5C 1抗体の可変 領域の cDNA配列 （A) 、 及びアミノ酸配列 （B) において、 お互いに 異なる塩基またはアミノ酸の数を一覧にまとめた図である。 対角線 の右上が軽鎖、 左下が重鎖における結舉を、 それぞれ示す。
図 16は、 AL11、 AL3D5, AKL3H6, AKL5CK ACK2F12, 及び市販の A c - K- 103抗体の軽鎖及び重鎖の N末から 10残基までのアミノ酸配列を 、 プロテインシーケンサーで決定した結果を示す図。 軽鎖に関して は全て結果が得られたが、 重鎖については、 PTHアミノ酸の切り出 しが起こらず、 配列を決定できなかった。 発明を実施するための最良の形態
抗ァセチルリジン抗体を作製する方法としては、 いかなる方法を 用いても良いが、 免疫するのに用いる抗原としては、 例えば化学的 にァセチル化したスカシガイへモシァニン （KLH) ゃゥシ血清アル ブミン （BSA) 等めタンパク質を用いることもできるし、 ァセチル リジン残基を含むぺプチドを KLH等のタンパク質に結合させたもの を用いることができる。 上記目的に実用的に用いうるタンパク質と しては、 KLH、 BSAに加えて、 オボアルブミン、 ヒ ト血清アルブミン 、 トランスフェリン、 チログロブリン等を挙げることができる力 、 これらに限定されるものでない。
本発明においては、 抗体の可変領域のアミノ酸配列を規定してい るが、 抗体の可変領域のアミノ酸配列は、 例えば次の方法で決定す ることができる。 モノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマか ら RNAを抽出し、 それを铸型として cDNAを作製する。 次いで、 抗体 の可変領域を挟む部分に対応したプライマーセッ トを用いて PCR反 応を行い、 可変領域をコードする cDNAを増幅する。 増幅された cDNA はそのまま DNAシーケンサ一にかけ配列を読んでも良いし、 一旦ク ローニングベクタ一に入れ、 大腸菌に組み込み増やした後に配列を 読んでも良い。 得られた cDNA配列をアミノ酸配列に翻訳することに より、 可変領域のアミノ酸配列を知ることができる。 別の方法とし ては、 抗体分子を還元して軽鎖と重鎖に分けた後に、 電気泳動等の 手段で分離し、 それぞれのアミノ酸配列をェドマン分解の原理を利 用した気相シーケンサ一等の手段を用いて直接決定することもでき る。
ァセチルリジン含有タンパク質を検出する手段としては、 抗体を 用いた Western blot等の手法が考えられる。 その際、 樹立した抗体 をそのまま使用して、 二次抗体として対応する標識抗ィムノグロブ リン抗体を用いても良いが、 本発明者らは、 それよりも抗体を直接 レポ一夕一酵素により標識することにより検出感度が大きく向上す ることを見出した。 また、 抗体を HRP等の標識分子で標識する方法 としては、 いくつかの方法が報告されているが、 抗ァセチルリジン 抗体に関しては抗体分子上のアミノ基を用いる方法よりも、 抗体の 弱い還元により露出したスルフヒ ドリル基を用いる方法が優れてい ることを見出した。 即ち、 抗ァセチルリジン抗体に関しては、 抗体 上のアミノ基を他分子との結合に使用しない方が望ましいと考えら れる。
以下、 化学的にァセチル化したスカシガイ (Keyhole limpet) へ モシァニン （KLH) を用いて免疫したマウス脾臓細胞を用いて樹立 したハイプリ ドーマの産生する抗ァセチルリジン抗体を例に、 本発 明について詳しく述べるが、 本発明の実施の形態はこれに限定され るものではない。
化学的にァセチル化した KLHは既報 （J. Immunol. Methods 272, 161-175, 2003) に従って作製できる。
動物を免疫する方法を、 マウスを例に取り説明する。 ァセチル化 KLH溶液をフロインド完全アジュバント、 TiterMax Gold (CytRx社 ) 等のアジュバンドと 1: 1に混ぜ、 交流ジョイントで結合した二本 の注射筒で繰り返しジョイントを通過させる、 あるいは超音波処理 する等の方法によりェマルジヨンを作製する。 作製した抗原含有ェ マルジヨ ンを、 皮下、 皮内、 筋肉内、 腹腔内のいずれか、 または複 部位に注入する。 一回目の免疫終了の後、 1〜4週間の間隔を開け 、 二回目の免疫を同様に実施する。 その際、 一回目にフロイン ド完 全アジュバントを使用した場合は二回目以降の免疫にはフロインド 不完全アジュバントを使用することが望ましい。 以後同様に血中の 抗ァセチルリジン抗体の抗体価が上昇するまで、 免疫を続ける。 抗体価の測定は以下の様に行う ことができる。 KLHと同様の方法 でァセチル化したゥシ血清アルブミンを 10 /2 g/mlの濃度に PBSに溶 解し、 wellあたり 50 1の容量で 96穴 ELISA プレー トの各ゥエルに 添加し、 4°Cで一晩吸着する。 0.05% Tween 20入り PBS (PBST) で各 ゥエルを洗浄後アツセィに用いる。 アツセィの前に、 1%BSA入り PB ST等でブロッキングを行っても良い。 眼窩静脈叢、 尾静脈または尾 動脈等から採血し、 PBSTで 30倍に希釈した後遠心を行う。 得られた 上清を PBSTで希釈系列を作成し、 ァセチル化 BSAをコ一トした ELISA plateの各ゥエルに 50 /i lずつ添加する。 室温で 30分反応後、 PBST で洗浄し、 PBSTで適切に希釈した西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ （HR P) 標識抗マウス IgG溶液を各ゥエルに 50 /x lずつ添加する。 更に室 温で 30分反応後、 オルトフエ二レンジアミン等の HRP基質液を添加 することにより発色させる。
十分に夕イタ一が上昇していることを確認した後、 脾臓を取り出 し、 脾臓細胞を単離する。 別に培養しておいてマウスミエローマ （ 例えば SP2/0- Agl4等） と、 ポリエチレングリコール等を用いること により融合する。 融合に成功した細胞を HAT (ヒポキサンチン ， ァ ミノプテリ ン · チミジン） 培地で選択培養する。 7〜14日程度、 数 日おきに培地を半量交換しながら培養を継続した後、 培養上清の抗 体価を測定する。 ポジティブ · ゥエルの細胞を限界希釈法にてクロ 一二ングし、 目的の抗体産生ハイプリ ドーマを得る。 上記方法によ り得られたハイプリ ドーマクローンとして ACK2F12 (寄託番号 FERM B P- 1 03 5 1 ) を挙げることができる。 このクローンは、 独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター （茨城県つくば巿東 1丁 目 1番地 1 中央第 6 ) に平成 1 6年 6月 1 8日に FERM BP- 1 03 5 1として 国際寄託されている （平成 1 6年 6月 1 8日に寄託された FERM P- 2008 9 より移管） 。
上記方法で得られた抗体が、 周囲のアミノ酸配列にあまり依存せ ずにァセチルリジン残基を認識していることは、 例えば以下の様な 方法で確認することができる。 まず、 当該抗体が、 ァセチルリジン 残基を認識していることは、 固相化したァセチル化タンパク質に対 する抗体の反応性が、 外部から添加したァセチルリジンにより阻害 されることにより確認できる。 更に、 周囲のアミノ酸配列にあまり 依存しないことは、 種々の周辺配列をもつァセチルリジン含有ぺプ チドのいずれに対しても抗体が反応するかどうかを調べることで判 定できる。 更に、 動物細胞可溶化物を電気泳動後、 PVDF膜あるいは ニトロセルロース膜に転写し、 抗体により We s t e rn b l o tの手法で染 色した時に、 複数のタンパク質が染色されることでも示される。
抗体を酵素や蛍光色素等のレポ一夕一分子で標識する方法として は、 いかなる方法を用いても良いが、 抗ァセチルリジン抗体を標識 するに際しては、 抗体分子上のアミノ基を使用しない様にした方が 、 好ましい。 具体的には、 抗体をシステアミン等の還元剤で穏やか に還元することにより、 分子内のスルフヒ ドリル基を露出させ、 そ こにマレイミ ド等で活性化した標識分子を結合させることにより、 抗体分子上のアミノ基を使用しないで抗体をレポ一ター分子で標識 することができる。
作製した抗体及び修飾抗体が従来の抗体よりも優れているかどう かは、 例えば同じ濃度の抗体または修飾抗体を使用した際に、 より 多くのァセチルリジン含有タンパク質のバンドを検出できることで 確認できる。
本発明により提供される抗体及び修飾抗体は、 疾病の診断や治療 に有用な新たな標的分子としてのァセチルリジン含有タンパク質の 探索に有用であるのみならず、 有望な標的分子の発見の暁には、 そ の機能制御の目的や、 診断の目的で使用することができる。 例えば
、 抗体によるァセチル化レベルの変動を Western blotあるいは ELIS A等の手段でモニタして、 その変動と標的分子機能の変動を比較す る実験を行う ことが可能である。 また、 有望な標的分子に対する特 異的な抗体を作製して、 その抗体と組み合わせたサンドイッチ ELIS A系、 RIA系、 等の免疫学的な測定手段を構築することにより、 修飾 された状態の標的分子の量を定量することが可能となり、 例えば疾 病の診断に有効である。 実施例
次に、 実施例により本発明を更に具体的に説明する。
実施例 1. 抗ァセチルリジンマウスモノクローナル抗体産生ハ ィブリ ドーマ ACK2F12の作製
軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号 ： 2に、 重鎖の可変領 域のアミノ酸配列が配列番号 ： 4に示される抗ァセチルリジンモノ クローナル抗体を産生するハイプリ ドーマ ACK2F12は以下の方法で 作製した。
免疫用の抗原としては化学的にァセチル化したスカシガイ （Keyh ole limpet) へモシァニン （以下 KLHと記載） を用いた。 ァセチル 化 KLHは以下の方法で作製した。 10 mgの KLHを 1 mLのホウ酸バッフ ァー （20 mM Na2B(107> pH9.3) に溶かし、 氷冷下 10 N NaOH 50 1 及び無水酢酸 22.6 ^i lを添加して、 30分インキュベートした。 ゲル ろ過カラム （PD-10、 アマシャム） で溶媒を PBSに置換して、 免疫に 用いた。
マウスの免疫は以下の様に実施した。 ァセチル化 KLH溶液を Ti ter Max Gold (CytRx社） と 1:1に混ぜ、 交流ジョイントで結合した二本 の注射筒で繰り返しジョイントを通過させ、 ェマルジヨ ンを作製し た。 作製した抗原含有エマルジョンを、 皮下あるいは腹腔内のいず れかに、 1〜 4週間の間隔を開け、 三回免疫を行った。 一回の抗原量 としては 50〜100 gを使用した。 KLHと同様の方法でゥシ血清アル ブミン （以下 BSAを記載する） をァセチル化したものを ELISAプレー 卜に固相化し、 後述の方法で血液中の抗体価の上昇を確認したら、 ミェローマとの融合の 4日前に PBSで溶解したァセチル化 KLHを腹腔 内に、 3日前に尾静脈内に投与した （投与量は、 100 g/マウス） 抗体価の測定は以下の様に行った。 KLHと同様の方法でァセチル 化したゥシ血清アルブミンを 10 g/mlの濃度に PBSに溶解し、 well あたり 50 /X 1の容量で 96穴 ELISAプレートの各ゥエルに添加し、 4°C で一晩吸着した。 0.05% Tween 20入り PBS (PBST) で各ゥエルを洗 浄後アツセィに用いた。 採血は尾動脈から行い、 PBSTで 30倍に希釈 した後遠心を行った。 得られた上清を PBSTで希釈系列を作成し、 ァ セチル化 BSAをコ一トした ELISAプレー卜の各ゥエルに 50 n 1ずつ添 加した。 室温で 30分反応後、 PBSTで洗浄し、 PBSTで適切に希釈した 西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ （HRP) 標識抗マウス IgG抗体溶液を各 wellに 50 lずつ添加した。 更に室温で 30分反応後、 オルトフエ二 レンジアミンを基質として用い 492 ηπιにおける吸光度を測定するこ とにより活性を評価した。
抗体産生細胞とミエローマの融合は以下の様に行った。 静脈内へ の抗原投与の三日後に脾臓を取り出し、 脾臓細胞を単離した。 その 5 X 107個を、 別に培養しておいてマウスミエローマ SP2/0-Agl4の 1 X107個と、 ポリエチレングリコールを用いることにより融合した 。 融合に成功した細胞を HAT (ヒポキサンチン · アミノプテリ ン ' チミジン） 培地で選択培養した。 11日間、 数日おきに培地を半量交 換しながら培養を継続した後、 培養上清の抗体価を測定した。 ポジ ティブ ' ゥエルの細胞を限界希釈法にてクローニングし、 目的の抗 体産生ハイプリ ドーマ ACK2F12 (寄託番号 FERM BP- 10351) を得た。 産生モノクロのアイソタイプは IgGl κであった。
実施例 2. ァセチル化タンパク質に対する抗体の反応性の測定 今回樹立したモノクローナル抗体がァセチル化したタンパク質に 反応することを確かめるために、 固相化したァセチル化 BSA及び非 ァセチル化 BSAに対する反応性を ELISA法にて調べた。 10 g/mlの 濃度に PBSで希釈したァセチル化 BSAまたは非ァセチル化 BSAを 50 1/ゥエルの容量で ELISA プレートの各ゥエルに添加し、 4°Cで一晩 吸着させた後に、 PBSTで洗浄した。 各精製抗体は PBSTで段階希釈を 行い、 各ゥエルに 50 i l添加して、 30分室温で反応させた。
PBSTで洗浄後、 二次抗体として HRP標識抗マウス IgG抗体を反応さ せ、 0-フエ二レンジァミン （0PD) を基質として用いて結合した抗 体量をモニターした。 結果を図 1 に示す。 比較のために、 これまで に報告されている汎反応性の抗ァセチルリジンマウスモノクローナ ル抗体である AKL5C1を用いた結果を併せて示した。 図 1 に示される 様に、 これら二つの抗体は、 非ァセチル化 BSAに対しては、 全く反 応を示さなかったが、 ァセチル化した BSAに対しては強い反応性を 示した。 このことから、 これら両者はァセチル化されたタンパク質 に対して特異的に反応する抗体であると考えられる。
実施例 3. ァセチルリジンによる ELISA反応の競合
図 2 に示した様に、 ァセチルリジンには二種類の違った分子が存 在する。 No;-ァセチルリジンと Νε -ァセチルリジンの二種類である 。 実施例 2と同様の方法でァセチル化 BSAを固相化して、 1 xg/ml の濃度の AKL5C1抗体または ACK2F12抗体を種々の濃度の Να-ァセチ ルリジンまたは Νε -ァセチルリジンと共存させて反応させた際の発 色の結果を図 3に示した。 この図に示される通り、 どちらの抗体も Ν ε -ァセチルリジンによっては競合されたカ^ Ν -ァセチルリジン によっては全く競合されなかった。 この結果は、 これらの抗体がリ ジンの ε -アミノ基がァセチル化されたものに対して特異的に結合 する能力が高いことを示している。
実施例 4. 種々のァセチルリジン含有ペプチドに対する抗ァセ チルリジン抗体の反応
抗体がァセチルリジンの周辺のアミノ酸配列にあまり依存しない でァセチルリジンを認識することができるかどうかを確かめるため に、 図 4にリス トした種々のァセチルリジン含有ペプチドを ELISA プレート （AduaBind、 M & E、 Denmark) に共有結合で結合し、 実 施例 2と同様の方法で各抗体の反応性を調べた。 ぺプチドの結合は メーカーの指示に従って実施したが、 結合に用いたペプチドの濃度 は 10 / g/mlである。
用いた抗体は AKL5C1、 ACK2F12の抗ァセチルリジンマウスモノク ローナル抗体に加えて、 やはり汎反応性が謳われている市販の抗ァ セチルリジンマウスモノクローナル抗体である Ac- K- 103、 及び部位 特異的な抗体の例として抗ーァセチル化ヒス トン H3 (Lys-14) (ant i - Ac_H3- K14と略記） 及び抗—ァセチル化ヒス トン H4 (Lys-16) (an ti - Ac - H4- K16と略記） の二つのゥサギポリクローナル抗体である。 結果を図 5A〜図 5Eに示した。 市販の Ac- K- 103を含めた 3種の抗ァ セチルリジンマウスモノクローナル抗体に関しては、 ACK2F12が若 千他の二つに較べてまんべんなく反応する傾向は認められるものの 、 今回調べた全てのァセチルリジン含有べプチドに対して反応性を 示した。 しかし、 いずれも非ァセチル化ペプチドである H3RAには全 く反応しなかった。
一方、 部位特異的抗ァセチルリジン抗体の二つは、 それぞれ謳わ れているァセチル化部位を含むペプチドに対して、 最も強く反応し た。
実施例 5. MOLT- 4F細胞 1 ys a t eを用いた各抗体の反応性の比較 各抗体の反応性を比較するために、 Western b 1 o 11 ingを用いた実 験を実施した。 ヒ 卜 T細胞白血病細胞株である M0LT-4F細胞をヒス ト ンデァセチラ一ゼ阻害剤である トリコス夕チン Aにより 1 Mの濃 度で 6時間処理した後に細胞 lysateを調製した。 対照としてトリコ ス夕チン A未処理の細胞 lysateも併せて調製した。 比較した抗ァセ チルリジン抗体は、 実施例 4と同様に ML5C1、 ACK2F12, Ac-K-103 、 anti-Ac-H3-K14, 及び ant i- Ac-H4- K- 16の 5つである。 結果を図 6に示した。 各レーンには 6 タンパク量相当を 15%SDS-PAGEで 電気泳動し、 PVDF膜に転写した。 二次抗体としては HRP標識した抗 マウス IgG抗体を用い、 アマシャム社の ECL Plusにてバンドを検出 した。
まず、 3つのマウスモノクローナル抗体の比較においては、 今回 樹立した ACK2F12抗体が一番多くのァセチルリジン含有タンパク質 を検出することが出来た。 次いで AKL5C1で、 一番悪かったのが市販 の Ac-K- 103であった。 反応はいずれも 1 g/mlの濃度での結果であ る。 これらの抗体の種々のァセチルリジン含有ペプチドに対する反 応性を ELISAで調べる限りでは大きな差が認められなかつたが （図 5) 、 Western bio tの手法を用いると検出能力に大きな差があるこ とが分かった。 いずれの抗体も、 トリコス夕チン A処理による複数 のタンパク質のァセチル化の蓄積を検出できた。 一方、 ァセチル化 部位特異的な二つの抗体については、 anti-Ac- H3-K14はヒス トン H3 のみをほぼ選択的に認識し、 トリコス夕チン A処理によるこの分子 のァセチル化の蓄積を検出した。 anti-Ac-H4- K16はトリコス夕チン 処理した時のヒス トン H4にのみ弱く反応した。
実施例 6. 細胞種によるァセチル化レベルの違いの検出と抗体 の比較
MOLT- 4F、 HepG2、 1B2C6の 3種類の細胞株の細胞 lysa t eを調製し 、 1レーン当たり 30 /x g泳動後に、 PVDF膜にトランスファーした。 A KL5C1抗体及び ACK2F12抗体それぞれ 1 g/mlの濃度で用いて、 それ 以外は同じ条件で Western blotを実施して、 各細胞のベーサルレべ ルでのァセチル化タンパク質の検出を試みた。 結果を図 7に示した 。 図 6 における結果と同様に、 ACK2F12抗体は AKL5C1抗体に比して より多くのバンドを検出でき、 Western b 1 o tにおける検出力は ACK2 Π2の方が優れていることが確認された。
実施例 7. 抗ァセチルリジン抗体の直接標識による検出力増強 樹立した抗ァセチルリジン抗体を用いて種々のァセチルリジン含 有タンパク質を検出できることは分かったので、 その検出力を更に 増強させることを企図して、 抗体を直接レポーター酵素で標識する ことを試みた。 試みた方法は二種類。 一つは、 Pierce社の EZ- link Plus Activated Perioxidaseを用いる方法である。 これは、 抗体分 子中のアミノ基に反応する様にアルデヒ ド基を導入された HRPを用 いる方法である。 標識はメーカ一提供のプロ トコールに従って実施 した。 この方法で作製した標識抗体を Ab- HRP-題 2と略記する。
もう一つは、 システアミンで弱く還元して、 重鎖間のジスルフィ ド結合を切り離し、 露出したフリーのスルフヒ ドリル基にマレイミ ドで活性化した HRP を結合させるという方法である。 具体的には以 下の手順で標識を実施した。 0.5 nigの抗体を 0.5 mlの 0.1M リ ン酸 ナト リウム、 5 mM EDTA、 pH6に溶解し、 3 mgのシステアミンを添加 した。 37 で 1. 5時間反応後、 ゲルろ過で溶媒を 5 mM EDTA 入り PBS ( PBS-EDTA) に置換し、 還元された抗体を得た。 一方 3 mgの HRPを 1 . 5 mlの PBS- EDTAに溶解し、 そこに 3 mgの su l f o_SMCC (P i e rce)を添 加して 37°Cで 30分反応させた。
ゲルろ過で溶媒を PBS- EDTAに置換してマレイミ ドで活性化された HRPを得た。 還元された抗体液と、 マレイミ ドで活性化された HRP液 を混合し、 排除分子量 50000の限外ろ過膜で 500 ^ 1まで濃縮した後 に 4°Cで一晩反応を進めた。 反応終了後 1 mgのシステアミ ンを添加 し、 室温で 30分反応させて未反応のマレイミ ドを潰した後に、 ゲル ろ過で溶媒を PBSに置換して標識抗体を得た。 この方法で作製した 標識抗体を Ab- HRP-SHと略記する。 二つの標識方法を比較した模式 図を図 8に示した。
実施例 5に記載したのと同様の方法で調製した、 MOLT- 4F細胞の s a t eを用いて、 これら標識抗体の検出力の比較を行った。 結果を図 9に示した。 トリコス夕チン A処理及び無処理の M0LT-4F細胞 l ys a t e を 2 g/レーンの用量で 12%SDS- PAGEゲルで電気泳動を行い、 PVDF に転写した。 検出はいずれも l g/m l濃度相当の抗体を用いて実施 した。 図 9の Aには非標識抗体を用いる方法を示したが、 図 6の結果 と同様に、 ACK2F 12が最も検出力が高いことが分かる。
図 9の Bには同じサンプルを HRP標識した ACK2F 12抗体で検出した結 果を示したが、 非標識の抗体の検出力に較べて明らかに多くのバン ドが検出されており、 直接標識された抗ァセチルリジン抗体によつ てより多くのァセチルリジン含有タンパク質を検出できる様になる ことが分かる。 特にその効果は、 スルフヒ ドリル基を介して HRP を 結合した場合に顕著であった。 このことは、 抗体のァセチルリジン 認識に抗体分子中のアミノ基が重要な役割を果たしている可能性を 示唆しているものと思われる。 実施例 8. ACK2F12- HRP- SHによる化学的にァセチル化された BSA の検出
ACK2F12-HRP- SHによる化学的にァセチル化された BSA の検出を We stern blotの手法にて行う ことにより、 どれく らい少量の修飾タン パク質まで検出できるかを調べた。 結果を図 10に示した。 各レーン には実施例 1に記載のやり方で作製したァセチル化 BSAを最大 50ng/ レーンから、 最少 80 pg /レーンまでの量で電気泳動し、 PVDF膜に転 写後に ACK2F12-HRP-SH標識抗体にて検出したものである。 図に示さ れる通り、 化学的に修飾した BSAであればわずか 80 pg であっても 十分検出することが可能であることが分かった。 この、 化学的に修 飾された BSAは複数箇所がァセチル化しているものと思われるので 、 一分子内に一ヶ所ないし数力所しかァセチル化されていないと思 われるインタク トなタンパク質の検出にそのまま外揷できる訳では ないが、 この結果は本修飾抗体の高い検出力を示すものである。
実施例 9. マウス臓器 lysate中のァセチルリジン含有タンパク 質の検出
高感度にァセチルリジン含有タンパク質を検出できる系を手に出 来たので、 それを用いてマウス各臓器 lysate中のァセチルリジン含 有タンパク質の検出を試みた。 Balb/cマウス （早） の各臓器を、 9. 8M 尿素、 4% CHAPS, 100 mMジチオスレィ トール （DTT) 中で超音波 破砕し、 遠心した上清を分析に用いた。 各レーンのタンパク量が 30 gとなる様に各臓器 lysateを 12%ゲルで電気泳動し、 PVDF膜に転 写後に ACK2F12- HRP-SHにて Western Motを実施した。
電気泳動前のサンプルは、 130 mM Tris-HCl， pH6.8, 4% SDS, 15 % glycerol, 80 mM DTT, 0.01% ブロモフエノールブルーで希釈し 、 37°Cで 30分処理した。 結果を図 1 1に示した。 臓器によって非常 に特徴的な染色パターンを示し、 特に、 脳において複数のバンドが 強く染色された。 その他、 肺、 胃、 肝臓等においても特徴的なバン ドが認められた。 ほとんどの臓器ではヒス トンと思われる低分子量 位置 （14. 4-21. 5K) に顕著なバンドが認められたが、 骨格筋では認 められなかった。
次に、 ここで検出されたバンドがァセチルリジンを含むタンパク 質であり、 抗ァセチルリジン抗体により特異的に認識されているこ とを確認するために、 同じマウス臓器 l ys a t eの内、 脳及び胃の l ys a t eを 1レーン当たり 15 流し、 同様の方法で PVDF膜に転写した後 、 10 mMのリジン、 Ν α -ァセチルリジン、 Ν ε -ァセチルリジンを標 識抗体と共存させ、 競合実験を行った。 結果は図 12に示した。 We s t e rn b l o tで検出されている多くのバンドは、 Ν ε -ァセチルリジンを 共存させた時のみに消失したことから、 これらのバンドは抗体の非 特異的な結合の結果見えたものではなく、 特異的に検出されたもの 、 即ちァセチルリジン含有タンパク質であることが強く示唆される 。 この様に、 本発明の標識抗体を使用することにより、 新規ァセチ ルリジン含有タンパク質を効率良く検出することが可能になるもの と思われる。
実施例 10. ACK2F 12抗体可変領域の配列決定
ACK2F 12抗体が、 これまでに報告されている汎反応性の抗ァセチ ルリジン抗体よりも優れた性質を有することを示して来たが、 この 違いが、 抗体分子の構造上のどのような違いに起因するかを調べる ために、 既報に従い本抗体の可変領域をクローニングして、 軽鎖、 重鎖それぞれの可変領域をコ一ドする cMAの塩基配列を決定した。 結果を、 これまでに報告されている抗ァセチルリジン抗体可変領域 の cDNA配列と並べて図 13A及び図 13Bに示した。 また、 cDNAの配列か ら予想されるアミノ酸配列を、 やはり既報の抗体の配列と並べて図 14に示した。 更に、 配列番号 ： 1及び 3にはそれぞれ ACK2F 12抗体 軽鎖及び重鎖可変領域の cDNA配列と対応するァミノ酸配列を並べて 示し 7こ。
図に示される様に、 ACK2F 12抗体もこれまでに配列が報告されて いる 4種類の抗体と、 基本的には同じフレームワーク配列を有する ことが分かった。 しかし、 その配列は完全に同じではなく、 既報告 の抗体と塩基配列においては軽鎖で最低 6箇所、 重鎖で最低 23箇所 、 アミノ酸配列においては軽鎖で最低 4箇所、 重鎖で最低 14箇所の 違いがあることが分かつた。 各配列間での不一致数をまとめた結果 を図 15に示した。 この結果から、 今回樹立した ACK2F 12抗体は、 基 本的なフレームワーク配列は既報の配列と良く似てはいるが、 尚多 くの配列上の違いがあり、 これらの違いによってこの抗体の高検出 力がもたらされているものと考えられる。
また、 市販の Ac- K- 103抗体に関しては、 ハイプリ ドーマは手に入 らないが、 、 電気泳動で展開後 PVDF 膜に転写し、 重鎖、 軽鎖を切 り出し、 N末配列をプロテインシーケンサ一 （Beckman, LF-3000) で決定した。 同じ方法で AL 1 1、 AL3D5、 AKL3H6、 及び AKL5 C 1抗体に ついても調べた結果と併せて図 16に示した。 図に示される様に、 A c- K- 103抗体の L鎖の N末配列は DAVMTQTPLSであり、 ACK2F 12を除く他 の抗体の N末配列と完全に一致した。 また、 重鎖の N末配列はいずれ の抗体に関しても決定できなかった。 これは、 どの抗体の N末もブ ロックされているからであると思われる。
以上の結果から、 周辺配列にあまり依存しないでァセチルリジン 残基を認識するマウスモノクローナル抗体は基本的に共通のフレー ムワーク配列を有することが分かった。 しかし、 可変領域配列のい くつかの違いにより、 抗体の検出力等の性質に大きな影響が出るこ ともまた分かった。 産業上の利用可能性
本発明により提供される抗ァセチルリジンモノクローナル抗体及 びその酵素標識体は、 疾患の原因や診断マーカーとなりうる新たな ァセチルリジン含有タンパク質の採索に有用である。 更に、 本発明 により提供される抗ァセチルリジンモノクローナル抗体及び酵素標 識体は、 リジン残基のァセチル化が重要な役割を果たす生体分子機 能の制御や、 ァセチルリジン含有タンパク質の検出による疾病診断 においても有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号 ： 2またはそれと 2 ないし 3アミノ酸異なる配列で規定され、 かつ重鎖可変領域のアミ ノ酸配列が配列番号 ： 4またはそれと 2ないし 3アミノ酸異なる配 列で規定される、 マウスモノクローナル抗体。
2 . Ν ε -ァセチルリジンを認識する、 請求項 1 に記載のマウスモ ノク口一ナル抗体。
3 . 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号 ： 2で規定され 、 かつ前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号 ： 4で規定され る、 請求項 1 に記載のマウスモノクローナル抗体。
4 . Ν ε _ァセチルリジンを認識する、 請求項 3 に記載のマウスモ ノクロ一ナル抗体。
5 . 寄託番号 FERM BP- 1035 1で規定されるマウスハイプリ ドーマ により産生される、 請求項 4に記載のマウスモノクローナル抗体。
6 . 抗ァセチルリジン抗体を還元して露出させたスルフヒ ドリル 基に標識分子を結合させることにより得られる、 抗ァセチルリジン 標識抗体。
7 . 前記標識分子が西洋ヮサビペルォキシダーゼである、 請求項 6 に記載の抗ァセチルリジン標識抗体。
8 . 標識前の抗ァセチルリジン抗体が請求項 2に記載の抗ァセチ ルリジン抗体である、 請求項 6又は 7 に記載の抗ァセチルリジン標 識抗体。
9 . 標識前の抗ァセチルリジン抗体が請求項 4に記載の抗ァセチ ルリジン抗体である、 請求項 6又は 7 に記載の抗ァセチルリジン標 識抗体。
1 0 . 標識前の抗ァセチルリジン抗体が請求項 5に記載の抗ァセ チルリジン抗体である、 請求項 6又は 7 に記載の抗ァセチルリジン 標識抗体。
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