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WO2006005235A1 - Comparing method for expression amount of the same gene from different sources by base sequence measurement - Google Patents

Comparing method for expression amount of the same gene from different sources by base sequence measurement Download PDF

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WO2006005235A1
WO2006005235A1 PCT/CN2004/001333 CN2004001333W WO2006005235A1 WO 2006005235 A1 WO2006005235 A1 WO 2006005235A1 CN 2004001333 W CN2004001333 W CN 2004001333W WO 2006005235 A1 WO2006005235 A1 WO 2006005235A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
different sources
base sequence
sequence
different
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/CN2004/001333
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English (en)
French (fr)
Inventor
Guohua Zhou
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huadong Rearch Institute for Medicine and Biotechnics
Original Assignee
Huadong Rearch Institute for Medicine and Biotechnics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to US11/571,827 priority Critical patent/US20080286766A1/en
Publication of WO2006005235A1 publication Critical patent/WO2006005235A1/zh
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantitatively comparing the relative expression levels of the same gene in tissues or cells of different origins, in particular, a method for using the same gene to compare the expression levels of the same gene in different sources.
  • the method of base sequencing simultaneously measures the relative content of each DNA fragment in a mixture of DNA fragments labeled with different base sequences.
  • the analytical methods for the difference in expression amount mainly include SAGE method [4], RT-PCR method [5] and microarray method (ie gene chip) [6], but these methods still have some shortcomings, mainly in one comparison.
  • SAGE method is quite complicated, the steps are many, difficult to master, and the cost is high, which is difficult to popularize; RT-PCR method
  • the measurement requires the use of special instruments, and requires the use of internal standards to determine the complexity of the lock.
  • the micro-display method is a high-throughput method. Although the measurement volume is large, several genes can be simultaneously measured on one chip.
  • Bioluminescence assay using the nucleotide sequence is a newly developed a new technique [7-8], the method is simple and fast, the instrument is cheap, the measurement cost is low, and it is easy to automate. However, since only 10-30 base sequences can be determined, the method is limited to analysis of gene mutations and gene polymorphisms [9].
  • the object of the present invention is to use a technique for determining the relative expression of the same gene in different sources by the technique of base sequence determination, that is, how to determine the relative expression amount of the gene by measuring the sequence of several bases, High sensitivity, good quantitative, inexpensive, easy to operate, and used for clinical diagnosis.
  • the technical solution of the present invention is as follows, and the measurement principle thereof is as shown in FIG.
  • Base sequence method can be used to label the same gene from different sources.
  • the first method is DM adapter labeling, which first extracts total RNA or mRNA from different sources or cells and reverses it.
  • the double-stranded cDNA is recorded, and the cDNAs of different origins are cut into DNA fragments of different lengths by restriction endonucleases, and the cDNA enzymatic products of each source are respectively connected with the DNA adapters which can distinguish different sources, so that the sources are
  • the 'cDNA' tag is sequenced on a different DNA adapter.
  • the DNA adapter consists of two single-stranded DNAs that are not completely complementary. The structure is shown in Figure 2.
  • One end contains a sequence 1 complementary to the restriction endonuclease nick, and can be ligated with a double-stranded cDNA enzyme under the action of ligase.
  • the fragment is ligated; the other end is a "Y"-shaped structure consisting of a non-complementary base sequence 2 and 3.
  • sequence 3 can be designed to be complementary to sequence 2, but the 3' end of sequence 3 must be appropriate. The modification prevents it from undergoing an extension reaction under the action of a polymerase.
  • Sequence 2 contains a gene-specific sequence 4 and contains a base sequence 5 that does not vary with the source of the gene between the sequence and the 5' end of the strand.
  • Different gene-source-specific DNA adapters can be designed to differ only in the base sequence at sequence 4, while the base species and number that make up the sequence are the same.
  • the second method is reverse transcription primer labeling, which first extracts total RNA or mRNA from tissues or cells of different origins, and reverse-transcribes them into cDNAs with different primers, so that the cDNA sequences of each source are labeled. Different DNA fragments.
  • the structure of the reverse transcription primer is shown in Figure 3, Sequence 3 at the 3' end consists of multiple thymidine bases; there is a gene-specific sequence 2 between the T-terminus and the 5'-end, and in sequence 2 and the 5' end of the strand. There is a base sequence 3 that does not change with the source of the gene.
  • Different gene-derived specific reverse transcription primers can be designed to differ only in the base sequence at sequence 2, and the base species and number of the sequences constituting the segment are the same.
  • primer CP does not extend. . Since a pair of common primers CP and GSP are used to amplify the same gene fragment from different sources, and the Tm values of the amplified products are identical (the length and the base type are the same), the proportional amplification of the PCR can be ensured.
  • arm 3 will extend under the action of DNA polymerase, creating a template for primer CP annealing, which will not allow equal-proportional PCR amplification of genes from different sources.
  • the invention adopts a sequencing method based on PPi measurement to determine the sequence of the amplified products of different sources, and distinguishes the genes of each source according to the types of bases in the sequence, according to the peak intensity. Determine the difference in gene expression levels from different sources.
  • Gene expression analysis is an important part of genomics research, and the present invention aims to use sequencing techniques for comparative analysis of gene expression differences.
  • its innovation is characterized by the fact that the difference in expression of the same gene in multiple different individuals can be simultaneously measured by one analysis without additional measurement costs. Easy to instrument, no need for lasers, gels, fluorescent labels and electrophoresis.
  • the method of the invention has high sensitivity, good quantitative property, low price and convenient operation, and has great application prospects.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the difference in gene expression amount of the present invention.
  • 2 is a schematic view showing the configuration of a DNA adapter.
  • Figure 3 Schematic diagram of the structure of the reverse transcription primer.
  • Fig. 4 is a view showing the results of sequencing when the P53 gene in human brain cancer tissues, normal tissues, and liver cancer tissues is labeled by the DNA adapter method.
  • Fig. 1 is a schematic diagram showing the difference in gene expression amount of the present invention.
  • 2 is a schematic view showing the configuration of a DNA adapter.
  • Figure 3 Schematic diagram of the structure of the reverse transcription primer.
  • Fig. 4 is a view showing the results of sequencing when the P53 gene in human brain cancer tissues, normal tissues, and liver cancer tissues is labeled by the DNA adapter method.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of sequencing when the P53 gene in human liver cancer cells and human bladder cancer cells was labeled by a reverse transcription primer method.
  • DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The above methods are illustrated by specific examples. The main experimental steps are as follows -
  • Fragments of a certain length are ligated with a DNA adapter containing a gene-specific sequence, and then cDNA fragments of each source labeled with a DNA adapter are mixed as a template for a PCR amplification reaction.
  • a reverse transcription primer labeling method When labeled with a reverse transcription primer labeling method, mRNAs are reverse transcribed into cDNA using reverse transcription primers corresponding to each source, purified and mixed, and used as a template for a PCR amplification reaction.
  • the DNA template in (1) was subjected to PCR amplification using a common primer (CP) unrelated to the gene source, and a gene specific primer (GSP). Since the same gene is amplified from multiple sources by the same pair of primers CP and GSP, the relative proportion of the gene in each source remains unchanged during the amplification process, ie, the same ratio is amplified, and It changes as the number of amplifications increases. To separately determine the difference in the expression levels of multiple genes in the above different sources, only the gene-specific primer GSP needs to be changed.
  • CP common primer
  • GSP gene specific primer
  • the sequence of the base is determined by bioluminescence sequencing, that is, dNTP or ddNTP corresponding to the source of the gene is separately added to the solution containing the substrate, and if the added dNTP or ddNTP is complementary to the template, the pyrophosphate is released ( PPi), PPi can be rapidly converted to ATP by the action of enzyme, and ATP reacts with luciferin and luciferase to generate optical signals.
  • the base sequence in the obtained results represents different sources of the gene, and the signal intensity represents the amount of gene expression from each source. According to the difference in the amount of gene expression of each individual, the function of the gene and the discovery of functional genes related to the disease can be quickly determined.
  • Example 1 Measurement of the difference in the expression level of P53 gene in human normal tissues, brain cancer tissues and liver cancer tissues.
  • This example describes the relative expression levels of P53 genes in three different source tissues as determined by DNA adapter labeling. Three different DNA adapters were first designed and ligated to restriction endonuclease-digested cDNA fragments, which were then mixed for PCR amplification.
  • Digestion reaction Take 10 l of double-stranded cDNA, add 10 ⁇ l buffer solution 2 ⁇ , Mbo I TaKaRa endonuclease (10 U) 1 ⁇ , sterilized distilled water 7 ⁇ , total 20 ⁇ reaction system, set The reaction was carried out in a 37 ° C water bath for 2 h and then at 70 ° C for 10 min to inactivate the Mbo I enzyme.
  • the Mbo endonuclease is characterized by the ability to recognize the 5'-3' GATC sequence in DNA and cleave it to form a sticky end of the 5'-end GATC.
  • adp-1 and adp-4 form another DNA adapter 3 and both have a structure with a 5' end protruding four bases GATC .
  • DNA adapters 1, 2 and 3 were used to label the P53 gene in human normal tissues, brain cancer tissues and liver cancer tissues, respectively. Take 1 ⁇ l of the enzyme digestion solution, add 2 ⁇ l of each single strand (10 pmol/L) which constitutes the DNA adapter, 2 ⁇ l of 10 times ⁇ 4 DNA ligase buffer, sterilize distilled water 11 ⁇ l, and place at 70 ° C for 10 min. Then, the temperature was lowered to 16 ° C at a rate of 0.2 ° C / s, T4 DNA ligase (4 U / ⁇ ⁇ ) 2 ⁇ was added, and the reaction was carried out for 2 h.
  • PCR amplification The above three different sources of the ligation products are mixed in the same reaction tube in a ratio of 1: 1: 1, and the common primers CCP, 5, -ccc cac ttc ttgttc tct cat-3, respectively, are added. (10 pmol/L) 2 ⁇ , specific primer for biotinylated P53 gene
  • Base sequence assay compares the relative expression of the same gene in different source tissues.
  • the single-stranded DNA sample (microspheres in step 3) was prepared to contain 25 mM Mg 2+ and 5 mM Tris (pH 7.7).
  • the solution was added with 5 priiol of the common primer CP, and after heating at 70 ° C for 10 min, it was naturally cooled to room temperature. Take 1 ⁇ 5 ⁇ and add to 100 ⁇ sequence determination In the standard mixture, dNTPs were sequentially added to carry out the sequencing reaction.
  • the sequence standard mixture composition is: 0. l MTris-HAc (pH 7.7), 2 mM EDTA, 10 mM Mg(Ac) 2 , 0.1% albumin (BSA), ImM dithiothreitol (DTT), 3 ⁇ 5, - phosphorylated adenosine monophosphate (APS), O.4 mg/ml polyvinylpyrrolidone (PVP), 0.4 mM fluorescein, 200 mU/ml adenosine triphosphate sulfatase, 2 U/ml adenosine diphosphatase (apyrase) , 1 U DNAzyme Klenow without exonuclease activity, and an appropriate amount of luciferase.
  • the first base “C” of the sequence shown in the figure is from DNA adapter 2, representing the expression level of P53 gene in brain cancer tissue A1; the second base “G” is from DNA adapter 1, representing the expression level of P53 gene in normal tissues A2; the third base “A” is derived from earning adapter 3, representing the expression level of P53 gene in liver cancer tissue A3, the peak height ratio of these three base sequences Represents the difference in expression of the P53 gene in these three sources.
  • the results of the two measurements (Al: A2: A3) are: 28.20: 24.9: 46.9 and 28.1: 22.4: 49.5, average ratio (Al: A2: A3) For: 28.15: 23.65: 48.2.
  • Example 2 Measurement of the difference in the expression level of P53 gene in human liver cancer cells and bladder cancer cells.
  • the difference in expression of P53 gene in human hepatoma cells and bladder cancer cells was determined by reverse transcription primer labeling method, that is, the primers of different sequences were used to reverse-transcribe mRNAs from different sources to make cDNA markers of various origins. DNA fragments with different sequences. And compared with the results of RT-PCR measurements.
  • RNA was extracted from human hepatoma cells and bladder cancer cells according to the method of [Example 1]. After the quality of the electrophoresis assay was completed, the concentration was determined by ultraviolet light, and then the final concentration was adjusted to ⁇ / ⁇ with DEPC-H20. The mRNAs in human hepatoma cells and bladder cancer cells were reverse transcribed into cDNA using reverse transcription primers ⁇ -1 and ⁇ -2, respectively.
  • the sequences of the reverse transcription primers P-1 and P-2 are: P-1: 5' - ccc cac ttc ttg ttc tct cat cag ttt ttt ttt tttt-3'; P-2: 5, - ccc cac ttc ttg Ttc tct cat gac ttt ttt ttt tttttttttttttt -3, .
  • reaction steps were as follows: primer P1 or P-2 (10 pmol/L) 3 ⁇ and total RNA (1 ⁇ ⁇ / ⁇ 1) 3 ⁇ l, 70 °C lO min, placed on ice, added 5 times concentration One-chain buffer 4 ⁇ l, 0.1 mol/L DTT 2 ⁇ 1, Rnase inhibitor (40 U/ ⁇ ) 1 ⁇ , dNTP mixture (2.5 mmol/L each) 4 ⁇ , DEPC-H20 2 ⁇ 1, 37 At °C for 2 min, SuperscriptTM II RNase H-reverse transcriptase ⁇ was added and chilled on ice at 42 ° C for 1 h at 70 ° C for 10 min. After purification, an equal volume of the mixture was taken as a template for the PCR reaction.
  • Base sequence assay compares the relative expression of the same gene in different source tissues.
  • the above single-stranded DNA sample is prepared into a solution containing 25 mM Mg 2+ and 5 mM Tris (pH 7.7), and added separately.
  • the common primer CP of pmol was naturally cooled to room temperature after heating at 70 ° C for 10 min. Add 1 to 5 ⁇ M to 100 ⁇ of the standard mixture of standard assays, and then add dNTPs in sequence to perform the sequencing reaction.
  • the signal intensity obtained when dCTP was added represented the gene expression level derived from human liver cancer cells; when dGTP was added The resulting signal intensity represents the amount of gene expression derived from human bladder cancer cells.
  • the sequencing results are shown in Figure 5.
  • the first base "C” of the sequence shown in the figure is derived from the inversion.
  • Primer P-1 which represents the gene expression level of human hepatoma cells, Al;
  • the second base “G” is derived from the reverse transcription primer P-2, which represents the gene expression level A2 of human bladder cancer cells.
  • the peak-to-height ratio of these two base sequences represents the difference in the expression levels of the P53 gene in these three sources.
  • the results of the two measurements (Al: A2) are: 82.9:17.1, 87.4:12.6, 84.2:15.8, 89.5 : 10.5, the average value is 86:14 two 6.14:1, and the standard deviation is 3.0:3.0.
  • the expression levels of P53 gene in hepatoma cells and bladder cancer cells were 126359 copies/ ⁇ and 22093/ ⁇ 1, respectively, and the ratio was 5.72:1.
  • the relative average deviation is less than 2 ° /. , indicating that the method of the method of the present invention is relatively accurate.

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Description

采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法 技术领域 本发明涉及一种定量比较同一基因在不同来源的组织或细胞中相对 表达量的方法，·具体说是一种用碱基测序的方法同时测定经不同碱基序 列标记的 DNA片段混合物中各 DNA片段相对含量的方法。 背景技术 随着分子生物学和分析仪器的进步， 类基因组计划的测序工作已 经完成， 现已从构造分析转向功能分析 [1]， 即了解基因转写产物 mRNA 的分布状态及 mRNA 的翻译产物蛋白质在细胞及脏器组织中的存在量、 分布情况和作用。 通过比较健康和疾病个体间的基因表达量， 可以寻找 和发现疾病相关基因， 进而用于临床早期诊断 [2]。 在药物筛选中， 测 定给药组与未给药组的相.关基因表达量， 可以发现药物的作用靶点， 寻 找创制治疗疾病的特效药 [3]。 因此， 基因表达量的差异分析已逐渐成 为 "后测序时代〃 的主要任务之一。发达国家先后投入了很大的财力和 物力， 力争在该领域抢占制高点， 实行技术垄断。 目前用于比较基因表 达量差异的分析方法主要有 SAGE法 [4]、 RT - PCR法 [5]和微阵列法 (即 基因芯片） [6]等， 但这些方法仍有一些缺点， 主要表现在一次只能比 较两个个体间的基因表达量的差异， 仪器价格昂贵， 操作复杂和定量性 能差等。 如 SAGE法， 测定相当繁锁， 步骤多， 难以掌握， 成本也高， 很难普及； RT- PCR法的测定需使用专用仪器， 且需用内标， 测定繁锁， 重复性差； 微陈列法是一种高通量的测定方法， 虽然测定批量大， 可在 一块芯片上同时测定若干个基因， 但需要用荧光染料标记样品， 灵敏度 低，仪器价格昂贵， 数据处理也较复杂， 更主要的问题是其定量性能差， 难于准确比较某一基因在不同来源间表达量差异。 采用生物发光技术测定碱基序列是新近发展起来的一种崭新技术 [7-8]，该法简便快速，仪器价格便宜， 测定成本低， 易于自动化。 但由于 仅能测定 10- 30个碱基序列， 故该法仅限于分析基因的突变和基因的多 态性 [9]。 发明内容 本发明的目的就是为了采用碱基序列测定的技术研究同一基因在 不同来源中的相对表达量的方法， 即如何通过测定几个碱基的序列来测 定基因的相对表达量， 建立一种灵敏度高、 定量性好、 价格低廉、 操作 方便的方法， 并用于临床诊断。 本发明的技术解决方案如下， 其测定原理如图 1所示。
( 1 ) 碱基序列法标记不同来源的同一基因 有两种方法来实现： 第一种方法是 DM适配器标记法， 即先提取不 同来源组织或细胞中的总 RNA或 mRNA， 并将其反转录成双链 cDNA, 再用 限制性内切酶将各来源的 cDNA切成不同长度的 DNA片段，分别将各来源 的 cDNA酶解产物与可区分不同来源的—DNA适配器相连接， 使各来源的' cDNA标记上序列不同的 DNA适配器。 DNA适配器由两条不完全互补的单 链 DNA组成， 其结构如图 2所示， 即一端含有与上述限制性内切酶切口 互补的序列 1， 在连接酶作用下能与双链 cDNA酶解片段连接； 另一端为 " Y " 形结构， 由一段不互补的碱基序列 2和 3组成， 也可以将序列 3 设计成与序列 2互补， 但此时序列 3的 3 ' 端必须加以适当的修饰使之 不能在聚合酶的作用下发生延伸反应。 序列 2中含有一段基因来源特异 性的序列 4 ,并且在这段序列与该链的 5 ' 端之间含有一段不随基因来源 而,改变的碱基序列 5。 可以将不同的基因来源特异性 DNA适配器设计成 仅在序列 4处的碱基序列不同，而组成该段序列的碱基种类和数目相同。 第二种方法为反转录引物标记法， 即先'提取不同来源组织或细胞中 的总 RNA或 mRNA，用序列不同的引物分别将其反转录成 cDNA, 使各来源 的 cDNA标记上序列不同的 DNA片段。反转录引物的结构如图 3所示， 其 3 ' 端即图中序列 1由多个胸腺嘧 ^碱基组成， 在; T 端与 5 ' 端之间含 有一段基因来源特异性的序列 2，并且在序列 2与该链的 5 ' 端之间含有 一段不随基因来源而改变的碱基序列 3。 可以将不同的基因来源特异性 反转录引物设计成仅在序列 2处的碱基序列不同， 而组成该段序列的碱 基种类和数目相同。
( 2 ) PCR等比例扩增不同来源的同一基因片段 通常由组织中提取的目的基因的表达量很少，必须经过 PCR扩增才能 检测到。 如何在单管中等比 扩增上述经标记的不同来源的同一基因是 本专利的关键技术之一。 首先根据目的基因序列设计一条基因特异性引 物 GSP; 同时设计另一共用引物 CP, 其序列与图 2中的序列 5 (用 DNA 适配器标记时） 或图 3 .中的序列 3 (用反转录引物标记时） 相同。 在引 物 CP和 GSP的存在下， 若某来源中存在目的基因， 则 GSP首先与之退火 并发生延伸反应， 引物 CP与该延伸产物退火并延伸，如果没有 GSP的延 伸产物， 引物 CP不会延伸。 由于采用一对共同引物 CP和 GSP扩增不同 来源的同一基因片段， 且扩增产物的 Tm值完全相同（长度和碱基种类相 同）， 所以能够保证 PCR的等比例扩增。
如果图 2中臂 3与臂 2互补， 则臂 3就会在 DNA聚合酶的作用下延 伸，产生供引物 CP退火的模板， 这样就不能实现不同来源基因的等比例 PCR扩增。
( 3 ) 不同来源基因扩增产物的序列测定 目前通常的测序反应是基于凝胶电泳的原理， 但这种方法属于定性 测定序列， 定量性能差； 并且不能测定引物后面碱基的序列， 即不适用 于测定前 50个碱基的序列。基于 PPi测定的生物发光测定法， 如焦测序 法， 是通过依次逐个循环加入各 dNTP进行测序反应， 不但可以直接测定 引物后面的碱基序列， 而且定量性能很好， 能通过测量峰高确定重复碱 基的个数。 本发明采用基于 PPi测定的测序法测定不同来源基因扩增产 物的序列， 根据序列中碱基的种类区别各来源的基因， 根据峰强度就可 判断不同来源的基因表达量差异。 基因表达量分析是基因组学研究的重要内容， 本发明旨在将测序技 术用于基因表达量差异的比较分析中。 与现有技术相比， 其创新性表现 在- 通过一次分析就可以同时测得相同基因在多个不同个体中的表达量 差异， 且不需增加额外的测定成本。 易于仪器化， 不需要使用激光、 凝 胶、 荧光标记和电泳。、本发明方法灵敏度高、 定量性好、 价格低廉、 操 作方便， 具有很大的应用前景。 本发明方法对疾病相关基因的筛选、 对 临床早期诊断和创制治疗疾病的特效药具有重大意义， 也可以用于研究 人体、 动物或细胞在药物等方法处置下， 各相关基因的表达情况。 附图说明 图 1是本发明基因表达量差异测定原理图。 图 2是 DNA适配器的构造示意图。 图 3.是反转录引物构造示意图。 图 4是用 DNA适配器法标记人脑癌组织、 正常组织和肝癌组织中的 P53基因时的测序结果图。' 图 5是用反转录引物法标记人肝癌细胞和人膀胱癌细胞中的 P53基 因时的测序结果图。 具体实施方式 下面以具体事例来阐述以上方法， 主要实验步骤如下-
( 1 )标识不同来源的同一基因。 分别提取各个体中相关组织或细胞 中的总 RM或 mRNA, 并测定其浓度。 然后按照 DNA适配器标记法或反转 录引物标记法，使各来源的 cDNA标记上序列不同的 DNA适配器或序列不 同的 DNA片段。 当以 DNA适配器标记法标记时， 首先将 mRNA反转录成双 链 cDNA, 用可识别四个碱基序列的限制性内切酶 （Mob I ) 将 cDNA切割 成一定长度的片段， 分别用含有基因来源特异性序列的 DNA适配器与之 相连接， 然后再将经 DNA适配器标记的各来源 cDNA片段混合， 作为 PCR 扩增反应的模板。 当以反转录引物标记法标记时， 分别用各来源相对应 的反转录引物， 将 mRNA'反转录成 cDNA, 纯化后混合， 作为 PCR扩增反 应的模板。
( 2 ) PCR扩增。 以与基因来源无关的共用引物 （CP)， 和一个基因特 异性引物 （GSP ) 对 （1 ) 中的 DNA模板进行 PCR扩增反应。 由于釆用同 —对引物 CP和 GSP扩增多个.来源的同一基因，故该基因在各来源中的相 对比例在扩增过程中保持不变， 即以相同的比例扩增， 而不会随着扩增 次数的增加而变化。 如要分别测定多个基因在上述不同来源中的表达量 差异时， 仅需改变基因特异性引物 GSP即可。
( 3 ) 同时定量测定不同来源的基因片段扩增产物。 用微球技术或酶 切技术将扩增的 PCR产物制备成单链后， 加入与模板序列互补的通用引. 物进行退火。 也可以直接将 PCR产物纯化后， 加入与模板序列互补的通 用引物进行退火。 然后用生物发光测序法测定碱基的序列， 即在含有底 物的溶液中分别加入与基因来源相对应的 dNTP 或 ddNTP, 如所加入的 dNTP或 ddNTP与模板互补， 则释放出焦磷酸盐 （PPi )，. PPi在酶的作用 下可迅速转化成 ATP, ATP与 luciferin和 luciferase反应产生光信号。 所得结果中的碱基序列代表着基因的不同来源， 信号强度代表各来源的 基因表达量。 根据各个体的基因表达量的差异， 可迅速判断基因的功能 和发现与疾病相关的功能基因。
【实施例 1】 人正常组织、 脑癌组织和肝癌组织中 P53基因表达量差异 的测定。 本例叙述了以 DNA适配器标记法标记测定三个不同来源组织中 P53 基因的相对表达量。 首先设计三种不同的 DNA适配器， 分别与经限制性 内切酶消化过的 cDNA片段连接， 然后混合进行 PCR扩增。
1. cDNA样品的制备 (1) 总 RNA的提取： 取人正常组织、 脑癌组织和肝癌组织各 0. lg， 加 1 ml Trizol、于组织研磨器中研磨， 按照 Trizol说明书操作提取总 RNA。 经电泳鉴定其 28s和 18s条带完好无降解后， 用紫外吸收光谱法测 定其浓度， 再用灭菌 DEPC- H20调节终浓度为 1 μ^μ1。
(2) cDNA第一链的合成： 01igo(dt)16(100 praol/L) 1 μΐ和总 RNA (1 / Ι) 3 μ1， 70 °C 10 min后， 置于冰上， 加入 5倍浓度的第一链 缓冲液 4 μΐ, 0.1 mol/L DTT 2 μ1， RNase 抑制剂 （40 U/μΙ) 1 μΐ, dNTP混合物 （各 2.5 mmol/L) 4 μΐ, DEPC- Η20 4 μ1， 37°C 2 min, 加 入 Superscript II (200 U/μΐ) Ιμ1， 于 42°C 1 h， 70 °C 10 min, 冰上 冷却。
(3) 双链 cDNA的合成：在上述混和液中加入 5倍浓度的第二链缓 冲液 30 μ1， dNTP混合物 (2.5 mmol/L each) 12 μ1， Ε coli连接酶 (10 U/μΙ) 1 μ1， DNA.聚合酶 I (4 U/μΙ) 10 μΐ， RNase Η (2 U/μΙ) 1 μ1， 加入 DEPC- 0至总体积为 150 μΐ, 16°C 2 h， 70 °C 10 min。
2. 标识不同来源的同一基因
(1)酶切反应： 取双链 cDNA 10 l， 加入 10倍浓度的缓冲液 2 μΐ， Mbo I TaKaRa内切酶 （10 U ) 1 μΐ, 灭菌蒸馏水 7 μΐ, 共 20 μΐ反 应体系， 置于 37°C水浴中反应 2 h, 再置于 70°C 10 min, 使 Mbo I 酶 灭活。 Mbo l内切酶的特性是能识别 DNA中 5'— 3'的 GATC顺序， 并切断 使之形成 5'端突出 GATC的粘性末端。
(2) 连接反应： 取等体积的各来源的酶切反应液， 分别与三种不 同的 DNA适配器相连， 三个 DNA适配器中有一条链 adp- 4是相同的， 另 一条链中含有四个基因来源特异性的碱基， 这四个碱基仅是序列不同， 均由 c, t, g, c组成， 其序列分别为： adp- 1: 5， - ccc cac ttc ttg ttc tct cat gtca eg cat cac tcg- 3' ； adp- 2 ： 5^ - ccc cac ttc ttg ttc tct cat ctga eg cat cac tcg-3， ； adp- 3： 5， - ccc cac ttc ttg ttc tct cat at eg eg cat cac tcg-3， ； adp- 4： 5， -gat ccg agt gat gcgcta ag-3; , 其中下划线斜体部分为基因来源特异性的碱基。 adp - 1 与 adp- 4构成一个 DNA适配器 l，adp- 2与 adp- 4构成 DNA适配器 2，adp-l 与 adp-4构成另一个 DNA适配器 3， 且都具有 5' 端突出四个碱基 GATC 的结构。 DNA适配器 1， 2和 3分别用于标记人正常组织、 脑癌组织和肝 癌组织中的 P53基因。 取酶切液 1 μ1， 加入构成 DNA适配器的两条单链 (10 pmol/L) 各 2 μ1， 10倍 Τ4 DNA连接酶缓冲液 2μΐ， 灭菌蒸馏水 11 μ1， 置于 70°C 10 min， 然后以 0.2°C/s的速度降至 16°C， 加入 T4 DNA 连接酶 （4 U/μΐ) 2 μΐ, 反应 2 h。
3. PCR扩增及单链的制备
(1) PCR扩增： 将上述三个不同来源的连接产物按 1: 1： 1的比例 混合于同一反应管中， 分别加入共用引物 CCP， 5， -ccc cac ttc ttgttc tct cat-3, ) (10 pmol/L) 2 μΐ, 生物素标记的 P53基因的特异性引物
(5， - gga gca cta age gag cac tg_3， ) (10 pmol/L) 2 μ1， Mg2+ (25 ramol/L) 3 μΐ, dNTP Mixture (各 2.5 mmol/L) 4·μ1， 10 X PCR Buffer 5 μΐ, TaKaRa Taq DNA聚合酶 (5 U/μΙ) 0.5 μ1， 加灭菌蒸馏水至总体 积 50 μΐ， 进行 PCR扩增。 PCR反应条件为: 94°C 30s， 60°C 30s, 72 °C 30s, 反应 35个循环。 最终得到的产物'是生物素标记的双链 D.NA。
(2) 单链的制备： 取 25 μΐ Μ280磁珠， 按照使用说明书的要求洗 涤， 溶于 50 μ1的 2XB&WBuffer (洗涤缓冲液） 中， 加入等体积的 PCR 产物， 反应 30 min， 反应过程中轻轻振摇使磁珠始终处于悬浮状态。 用 磁铁固定磁珠， 弃去上清液， 用 lXB&W Buffer洗涤 2〜3次后加入 0.1 mol/L NaOH溶液 20 μ1， 反应 5 min, '吸取上清液至另一试管中， 用稀 HC1调节 pH值为 6〜7，冷藏保存。固相的磁珠洗涤后溶于 1 XB&W Buffer 中保存， 待用。
4. 碱基序列测定法比较同一基因在不同来源组织中的相对表达量 取上述单链 DNA样品 （步骤 3中的微球） 制备成含有 25 mM Mg2+和 5 mM Tris (pH 7.7) 的溶液， 并分别加入 5 priiol的共用引物 CP， 70°C 加热 lOmin后自然冷却至室温。 取 1〜5 μΐ加入到 100 μΐ的序列测定 标准混合液中， 然后依次加入 dNTP， 进行测序反应。
. 序列测定标准混合液组成为： 0. l MTris-HAc (pH7.7), 2mMEDTA, 10 mM Mg(Ac)2, 0.1%白蛋白 （BSA)， ImM二硫苏糖醇 （DTT)， 3 μΜ 5， - 磷酸化硫酸腺苷（APS)， O.4 mg/ml聚乙烯吡咯烷酮 （PVP), 0.4 mM荧光 素， 200 mU/ml 三磷酸腺苷硫酸化酶， 2U/ml 三磷酸腺苷双磷酸酶 (apyrase), 1U无外切酶活性的 DNA聚合酶 Klenow, 及适量荧光素酶。
5. 测定结果 由于 DNA适配器 1， 2和 3分别用于标记人正常组织、 脑癌组织和 肝癌组织中的 P53基因，当加入 dGTP时所得信号强度代表来源于人正常 组织的基因表达量，当加入 dCTP时所得信号强度代表来源于人脑癌组织 的基因表达量， 当加入 dATPoS (dATP的类似物） 时所得信号强度代表 来源于人肝癌组织的基因表达量。 测序结果如图 4所示， 图中所示序列 的第一个碱基 "C"来自于 DNA适配器 2，代表脑癌组织中 P53基因的表 达量 A1; 第二个碱基 "G" 来自于 DNA适配器 1， 代表正常组织中 P53 基因的表达量 A2; 第三个碱基 "A"来自于赚适配器 3， 代表肝癌组 织中 P53基因的表达量 A3， 这三个碱基序列的峰高比代表着 P53基因在 这三种来源中的表达量差异，两次测定结果（Al: A2: A3)分别为： 28.20： 24.9： 46.9和 28.1 ： 22.4： 49.5， 平均比值 (Al: A2: A3)为： 28.15： 23.65 ： 48.2。
【实施例 2】 人肝癌细胞和膀胱癌细胞中 P53基因表达量差异的测定。 本实施例主要是采用反转录引物标记法测定 P53基因在人肝癌细胞 和膀胱癌细胞中的表达量差异， 即用序列不同的引物分别反转录不同来 源的 mRNA, 使各来源的 cDNA标记上序列不同的 DNA片段。 并与 RT-PCR 的测定结果作对比。
1. 测定样品的制备 按 【实施例 1】 的方法， 分别从人肝癌细胞和膀胱癌细胞中提取总 RNA, 经电泳检定质量完好后， 紫外测定其浓度， 然后用 DEPC- H20调节 终浓度为 ΐμ /μΐ。分别用反转录引物 ρ- 1和 Ρ- 2将人肝癌细胞和膀胱癌 细胞中的 mRNA反转录成 cDNA。 反转录引物 P- 1和 P- 2的序列为， P- 1 : 5' - ccc cac ttc ttg ttc tct cat cag ttt ttt ttt ttt ttt-3' ； P-2： 5， - ccc cac ttc ttg ttc tct cat gac ttt ttt ttt ttt ttt -3， 。 反应步骤为：取引物 P-l或 P-2 (10 pmol/L) 3 μΐ和总 RNA (1 μδ/μ1) 3 μ1， 70 °C lO min后， 置于冰上， 加入 5倍浓度的第一链缓冲液 4 μ1， 0. 1 mol/L DTT 2 μ1， Rnase抑制剂 (40 U/μΙ) 1 μΐ , dNTP混合物 (2. 5 mmol/L each) 4 μΐ, DEPC-H20 2 μ1， 37°C 2 min, 加入 Superscript™ II RNase H— 反转录酶 Ιμΐ , 于 42°C 1 h， 70 °C 10 min, 冰上冷却。 将其纯化后， 取等体积混合， 作为 PCR反应的模板。
2. PCR扩增及单链的制备 按照 【实施例 1】 的方法进行 PCR扩增及制备单链， 其中共用引物 CP与基因特异性引物均与 【实施例 1】相同。 ·
3. 碱基序列测定法比较同一基因在不同来源组织中的相对表达量 取上述单链 DNA样品制备成含有 25 mM Mg2+和 5 mM Tris (pH 7. 7) 的溶液， 并分别加入 5 pmol的共用引物 CP， 70°C加热 lOmin后自然冷 却至室温。 取 1〜5 μΐ加入到 100 μΐ'的序列测定标准混合液中， 然后 依次加入 dNTP， 进行测序反应。 由于反转录引物 P- 1和 P- 2分别用于标记人肝癌细胞和膀胱癌细胞 中 P53基因，因此当加入 dCTP时所得信号强度代表来源于人肝癌细胞的 基因表达量；当加入 dGTP时所得信号强度代表来源于人膀胱癌细胞的基 因表达量。
4. 测定结果 测序结果如图 5所示， 图中所示序列的第一个碱基 "C"来自于反转 录引物 P- 1， 代表人肝癌细胞的基因表达量 Al; 第二个碱基 "G"来自于 反转录引物 P - 2， 代表人膀胱癌细胞的基因表达量 A2。 这两个碱基序列 的峰高比代表着 P53基因在这三种来源中的表达量差异， 两次测定结果 (Al: A2) 分别为： 82.9:17.1， 87.4:12.6， 84.2:15.8, 89.5:10.5， 平均值为： 86:14二 6.14:1， 测定标准偏差为 3.0:3.0。
用 RT- PCR法测定 P53基因在肝癌细胞和膀胱癌细胞的表达量分别为 126359拷贝 /μΐ和 22093/μ1， 比值为 5.72:1。
比较两种方法的测定结果， 相对平均偏差小于 2°/。， 说明本发.明的方 法测定结果比较准确。
文中标引：
1. Bentley, D. R. 2000. The Human Genome Project― an overview.
Medicinal Research Reviews 20: 189-96.
2. Zhang, L. , W. Zhou, V. E. Velculescu, S. E. Kern, R. H. Hruban, S. R. Hamilton, B. Vogelstein, and K. W. Kinzler. 1997. Gene expression profiles in normal and cancer cells. Science 21 &： 1268-72.
3. Debouck, C.， and P. N. Goodfellow. 1999. DNA microarrays in drug discovery and development. Nature Genetics 21: 48-50.
4. Velculescu, V. E.， L. Zhang, Β.· Vogelstein, and K. W. Kinzler.
1995. Serial analysis of gene expression. Science 270： 484-7.
5. Karet, F. E.， D. S. Charnock_Jones, M. L. Harrison_Woolrych, G. 0— Reilly, A. P. Davenport, and S. K. Smith. 1994. Quantification of mRNA in human tissue using fluorescent nested .reverse- transcriptase polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry 220: 384-90.
6. Schena, M.， D. Shalon, R. W. Davis, and P. 0. Brown. 1995. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270 : 467-70.
Ronaghi, M. , M. ' Uhlen, and P. Nyren, A sequencing method based on real-time pyrophosphate. Science, 1998. 28.1 (5375)： p. 363, 365.
周国华， 古卓良， 章杰兵. 生物发光分析法检测 P53基因上的突 变点. 药学学报， 2002 ; 37 (1) : 41-45.
Guo-Hua Zhou, Masao Kamahori, Kazunori Okano, Kunio Harada, and Hideki Kambara. Miniaturized pyrosequencer for DNA analysis with capi llaries to del iver deoxynucleotides. Electrophoresis, 2001， 22, 3497-3504.

Claims

权利要求
• 1. 一种采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量 的方法， 它具有如下特征-
( a) 用 DNA序列标记法使不同来源的信使核糖核酸 （mRNA) 的反 转录产物互补 DNA ( cDNA) 中含有一段来源特异性序列；
( b ) 将经标记的各来源 cDNA 混合于一管中， 作为聚合酶链反应 ( PCR) 的底物， 用一个共用引物和一个基因特异性引物进行 PCR扩增；
( c ) 用生物发光分析法测定上述 PCR 扩增产物中与基因来源相对 应的一段碱基序列， 以碱基种类代表基因的不同来源， 其信号强度代表 各来源中基因表达量。
2. 按权利要求项 1 所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不 同来源中的表达量的方法， 其特征在于所述的不同来源是指不同的组织 或细胞。 -
•3. 按权利要求项 1 所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不 同来源中的表达量的方法， 其特征在于所述的 DNA序列标记法是指用限 制性内切酶将不同来源的双链 cDNA酶解成适当长度的片段，再用序列不 同的 DNA适配器 （adapter) 与之相连接， 不同来源的 cDNA连有不同的 DNA适配器。
4. '按权利要求项 3 所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不 同来源中的表达量的方法， 其特征在于所述的醒适配器是指由两条不 完全互补的单链 DNA组成， 含有与权利要求项 3中限制性内切酶切口互 补的序列， 在连接酶作用下能与双链 cDNA酶解片段连接。
5. 按权利要求项 4 所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不 同来源中的表达量的方法， 其特征还在于所述的两条不完全互补的单链 DNA是指其中一条 DM单链中含有一段基因来源特异性的序列， 并且在 这段序列与该链的 5 ' 端之间含有一段不随基因来源而改变且不与另一 条链 3 ' 端互补的碱基序列。
6. 按权利要求项 1 所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不 同来源中的表达量的方法， 其特征还在于所述的 DNA序列标记法是指用 序列不同的引物分别反转录不同来源的 mRNA， 使各来源的 cDNA标记上 序列不同的 DNA片段。
7. 按权利要求项 6 所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不 同来源中的表达量的方法， 其特征还在于所述的序列不同的引物是指其 3 ' 端由多个胸腺嘧啶碱基组成， 在 3 ' 端.与 5， 端之间含有一段基因来 源特异性的序列， 并且在这段序列与该链的 5 ' 端之间含有一段不随基 因来源而改变的碱基序列。
8. 按权利要求项 1 所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不 同来源中的表达量的方法， 其特征在于所述的共用引物是指其序列与权 利要求项 5或权利要求项 7中所述的不随基因来源而改变的碱基序列中 的部分或全部序列相同。
9. 按权利要求项 1 所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不 同来源中的表达量的方法， 其特征还在于所述的生物发光分析法是指定 量测定延伸反应产生的焦磷酸盐 （PPi ) 的方法。
10. 按权利要求项 9所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不 同来源中的表达量的方法， 其特征还在于所述的延伸反应是指以权利要 求项 1中的 PCR扩增产物或其单链产物为模板，加入测序引物进行退火， 然后按一定次序逐个加入三磷酸脱氧核苷酸（dNTP：)， 或三磷酸双脱氧核 苷酸 （ddNTP ), 或它们的类似物，'在 DNA聚合酶的作用下， 当所加 dNTP 或 ddNTP或它们的类似物与模板互补时， 所发生的聚合反应。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110791580A (zh) * 2018-08-01 2020-02-14 福建省热带作物科学研究所 一种印度野牡丹chs基因表达量的检测方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5830656A (en) * 1996-06-28 1998-11-03 The Ohio State Research Foundation Detecting the expression of the catr1 gene in squamous cell carcinoma
JPH11155600A (ja) * 1997-11-28 1999-06-15 Shiseido Co Ltd サイトカイン遺伝子の発現を測定するための改良方法
CN1265155A (zh) * 1997-06-16 2000-08-30 俄亥俄医学院 利用复合竞争性逆转录酶－聚合酶链反应定量测定基因表达的方法
WO2002018616A1 (en) * 2000-09-01 2002-03-07 Hitachi Chemical Co., Ltd. Adjusting the efficiency of nucleic acid template amplification by attenuated pcr with template-mimic oligonucleotides
CN1362527A (zh) * 2001-11-19 2002-08-07 复旦大学 一种定量检测趋化因子表达水平的方法
WO2002083922A2 (en) * 2001-04-11 2002-10-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Modified random primers for probe labeling
CN1398988A (zh) * 2002-08-09 2003-02-26 周国华 基因表达量比较分析法
US20030064373A1 (en) * 2000-09-25 2003-04-03 Shahzi Iqbal Preferential display

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040058373A1 (en) * 2001-01-31 2004-03-25 Winkler Matthew M. Competitive amplification of fractionated targets from multiple nucleic acid samples

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5830656A (en) * 1996-06-28 1998-11-03 The Ohio State Research Foundation Detecting the expression of the catr1 gene in squamous cell carcinoma
CN1265155A (zh) * 1997-06-16 2000-08-30 俄亥俄医学院 利用复合竞争性逆转录酶－聚合酶链反应定量测定基因表达的方法
JPH11155600A (ja) * 1997-11-28 1999-06-15 Shiseido Co Ltd サイトカイン遺伝子の発現を測定するための改良方法
WO2002018616A1 (en) * 2000-09-01 2002-03-07 Hitachi Chemical Co., Ltd. Adjusting the efficiency of nucleic acid template amplification by attenuated pcr with template-mimic oligonucleotides
US20030064373A1 (en) * 2000-09-25 2003-04-03 Shahzi Iqbal Preferential display
WO2002083922A2 (en) * 2001-04-11 2002-10-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Modified random primers for probe labeling
CN1362527A (zh) * 2001-11-19 2002-08-07 复旦大学 一种定量检测趋化因子表达水平的方法
CN1398988A (zh) * 2002-08-09 2003-02-26 周国华 基因表达量比较分析法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUOHUA Z. ET AL: "P53 gene mutation detection by bioluminometry assay", ACTA PHARMACEUTICA SINICA, vol. 37, no. 1, 2002, pages 41 - 45 *
XIAOYONG W. ET AL: "Di-allele-specific-amplification with artifically modified primer for I823M mutation detection of Human ABC1 Gene", CHIN.J.MED.GENET., vol. 21, no. 1, February 2004 (2004-02-01), pages 86 - 88 *

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