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WO2006003183A1 - Peptide zur blockierung von fviii-inhibitoren - Google Patents

Peptide zur blockierung von fviii-inhibitoren Download PDF

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WO2006003183A1
WO2006003183A1 PCT/EP2005/053139 EP2005053139W WO2006003183A1 WO 2006003183 A1 WO2006003183 A1 WO 2006003183A1 EP 2005053139 W EP2005053139 W EP 2005053139W WO 2006003183 A1 WO2006003183 A1 WO 2006003183A1
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WO
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peptide
amino acid
peptides
fviii
acid sequence
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Alois Jungbauer
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Individual
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • inhibitors [5,6] Antibodies that form against the coagulation factor VIII and impair biological activity are called inhibitors [5,6], These
  • X 8 K, W or Y
  • the peptides of the invention may be modified at the N and / or C-terminus of the amino acid sequence with groups which delay degradation of the peptide. Furthermore, the peptides listed under points a) -e) are claimed, provided that they are composed of the amino acids in the corresponding D configuration.
  • the manufacturing technology is established and is accepted for the production of drugs, the small size of the peptides promises low immune responses, only the affected patient population must be treated,) - if it turns out that antibodies to different epitopes must be blocked, a variety of substances can be made available and that only minor side effects are to be expected.
  • the detection method chosen is the chemiluminescence measurement, which is characterized by its high sensitivity.
  • Either anti-human IgG peroxidase (secondary antibody system) or streptavidin-peroxidase (biotin-streptavidin system) can be used as the conjugate.
  • biotin-streptavidin system the inhibitor antibodies are directly labeled with biotin, thereby bypassing nonspecific signals that may be caused by the secondary antibody. Biotin labeling is carried out by means of NHS-activated biotin via free amino groups of the antibodies.
  • the peptides of the invention were tested for displacement of inhibitors by liquid phase displacement assays.
  • microtiter plates are coated with FVIII and then incubated with a mixture of inhibitor IgG and increasing peptide concentrations.
  • the detection of bound inhibitors takes place with peroxidase-bound conjugate and chemiluminescence measurement.
  • IC 50 is used as a measure for comparing the individual peptides. This is the peptide concentration at which 50% of the inhibitors can be displaced.
  • Peptides with the strongest displacement effect (IC 50 as low as possible) are chosen and conjugated with polyethylene glycol. This step should be followed by re-running the displacement assay to ensure that PEGylated peptides are still biologically active.
  • the peptides were tested for their effect in displacement tests. Since interesting peptides should have the broadest possible spectrum of activity, i. To block different inhibitors, they were tested with several inhibitor sera.
  • the peptides Sl / 173 ( Figure 16), Sl / 139 ( Figure 17) and Sl / 151 ( Figure 18) show displacing action on the inhibitors, followed by aggregation.
  • Peptide Sl / 173 displaces inhibitors 5 and 6 in a concentration range of 0.05-0.1 mg / ml.
  • Peptide Sl / 139 points to inhibitors 1 and 6 in> concentration range 0.025-0.5 mg / ml displacement effect and peptide Sl / 151 displaces inhibitor 6 between 0.05 and 0.1 mg / m! Peptide. The displacement becomes visible through decreasing bond strength.

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Abstract

Verwendung eines Peptids zur Blockierung der Wirkung von FVIII-Inhibitoren, wobei das Peptid acht bis 15 Aminosäuren umfasst und in der Aminosäuresequenz gleichzeitig folgende Aminosäuren vorhanden sein müssen: mindestens zwei Tyr, mindestens eine Aminosäure, die unter physiologischen Bedingungen eine positive oder negative Gesamtladung trägt, mindestens eine Aminosäure mit hydrophobem aromatischem Rest; am N-terminalen Ende eine Aminosäure vorhanden ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pro, Arg, Tyr oder Phe; am C-terminalen Ende Asp, Phe, Arg, Lys oder His vorhanden ist; und kein Cys und/oder Val-Val in der Aminosäuresequenz vorkommt.

Description

Peptide zur Blockierung von FVIII-Inhibitoren
Ca 35 % der Hämophilie A Patienten mit großen Gendeletionen, Geninversionen und Stopmutationen entwickeln Autoantikörper und Alloantikörper gegen Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) [l,2],die auch Inhibitoren genannt werden, weil sie die biologische Aktivität von FVIII beeinträchtigen. Dies führt dazu, dass die Substitutionstherapie mit FVIII aus Plasma oder rekombinanten FVIII
(rFVIII) nicht mehr wirkt. Weiters wird immer häufiger beobachtet, dass
Patienten mit normalem Gerinnungsstatus Autoantikörper gegen FVIII entwickeln [3]. Die Gruppe der spontanen Inhibitorpatienten ist ebenfalls sehr schwer zu therapieren.
FVIII ist ein Protein, das aus 2332 Aminosäuren besteht, und als Kofaktor für den aktivierten Faktor IX in der eigentlichen Blutgerinnungskaskade wirkt. FVIII ist aus 6 Domänen mit der Anordnung A1-A2-B-A3-C1-C2 aufgebaut. Die Al und A2 Domäne stellen die leichte Kette dar, die A3-C1-C2 Domänen die schwere Kette. Die Funktion der B-Domäne ist nicht bekannt. FVIII liegt als Komplex mit dem von Willebrand Faktor (vWF) vor [4],
Hämophilie A ist eine X-Chromosomen-abhängige rezessive Krankheit, die durch Abwesenheit oder unzureichende Mengen an funktionellen FVIII charakterisiert ist und sich in Blutungen in Gelenken, Muskeln und weichen Geweben niederschlägt. Patienten mit weniger als 1% an normalen funktionellen FVIII werden als schwere Hämophile bezeichnet und repräsentieren ca. 50% des Patientenkollektives. 10% des Patientenkollektives haben einen funktionellen FVIII-Spiegel von 1-5% des Normalwertes und werden als mittelschwer eingestuft. Der Rest, die Patienten mit milder Hämophilie, haben eine FVIII- Aktivität im Bereich von 5-30% des Normalwertes. Der derzeitige Stand der Therapie ist die Substitutionstherapie mit FVIII aus Plasma oder rekombinantem FVIIL
Antikörper die sich gegen den Blutgerinnungsfaktor VIII bilden und die biologische Aktivität beeinträchtigen werden Inhibitoren genannt [5,6], Diese
Antikörper gehören der Klasse IgG an und haben ein physiologisch normales Subklassenprofil [7]. Die Frage stellt sich, ob sich die Inhibitoren gegen eine bestimmte Domäne richten oder zufällig ein Bereich im FVIII-Molekül betroffen ist (Tabelle 1). Letzte Untersuchungsergebnisse deuten darauf hin, dass Inhibitoren vermehrt gegen bestimmte Domänen gerichtet sind, obwohl man früher der Meinung war, dass Inhibitoren an allen verfügbaren Stellen angreifen.
Tabelle 1: Zusammenfassung der Epitope von FVIII-In hibitoren.
Figure imgf000003_0001
*) Hat keine Auswirkungen auf den Gerinnungstatus, weil FVIII ohne B-Domäne aktiv ist.
Man glaubte auch, dass Inhibitoren gegen denaturierte Bestandteile des FVIII gebildet werden und Substitutionstherapie mit FVIII schlechter Qualität die Inhibitorenbildung provoziert. Von dieser These ist man mittlerweile abgekommen. Auch bei der Substitutionstherapie mit hochreinem FVIII wurde die Inhibitorbildung in gleicher Frequenz wie bei der Substitutionstherapie mit Plasma-FVIII beobachtet. Vermehrt werden Inhibitoren gegen FVIII- Mutanten, Punktmutation und im Besonderen Deletionen gebildet [2]. Es zeigt sich auch, dass Inhibitoren gegen den FVIII-vWF Komplex eine geringere Affinität haben [17] Dies wird durch sterische Behinderung erklärt. Es wurde auch die Hypothese aufgestellt, dass der FVIII-vWF Komplex die Immunogenität moduliert [18]. Weiters wird vermehrt beobachtet, dass Patienten mit normalem Gerinnungsstatus, die nie mit heterologem FVIII in Kontakt waren spontan Inhibitoren bilden [3], und dass im Serum gesunder Patienten Antikörper gegen FVIII vorhanden sind [3,19-26]. Heute ist man geneigt, die Inhibitorbildung als eine Autoϊmmunkrankheit anzusehen [2]. Man versucht nicht nur die Epitope der Inhibitoren zu erfassen, sondern auch durch Untersuchung der DNA-Sequenzen und der Art wie der Antikörper aufgebaut ist auf den Mechanismus der Inhibitorbiidung rückzuschließen.
Derzeit werden Patienten mit AiIo- und Autoantikörpern gegen FVIII durch Präparatwechsel, Gabe von tierischem FVIII oder auftretende. Blutungen mit Gerinnungsfaktor FVIIa behandelt (Tabelle 2). Es gibt auch Ansätze, Patienten mit antiidiotypischen Antikörpern gegen Inhibitoren zu immunisieren. Diese Antikörper haben ähnlich strukturelle Eigenschaften wie die Epitope am FVIII- Molekül und können somit die Inhibitoren blockieren. Bei anderen Therapiekonzepten versucht man mit "non-depleting" anti-CD4(+) Antikörpern oder CD20(+) Antikörpern (ReFuximab) die Immunantwort zu modulieren [27- 29]. Dieses Konzept ist aber erst im Versuchsstadium. Die gemeinsame Verabreichung von Gerinnungsfaktoren und anti-CD4 Antikörpern verringerte signifikant das Auftreten von Inhibitoren. Konventionelle Immunsuppressiva wurden auch zur Therapie von Inhibitorpatiervten eingesetzt. Dies stellt aber eine große Belastung dar. Eine andere Methode ist die Gabe von intravenösem Immunglobulin, das antiidiotypische Antikörper gegen FVIII-Inhibitoren enthält [3].
Die Therapie konzepte versuchen entweder (I) FVIII zu ersetzen, (II) die entstandenen Antikörper zu blockieren oder (III) den Immunantwort zu modulieren (Tabelle 2).
Die Suppression der Immunantwort wäre zwar die eleganteste Methode, weil man Antikörper gar nicht entstehen lässt, diese Therapie ist aber mit großen Nebenwirkungen verbunden. Die Gabe antiidiotypischer Antikörper scheint aufs erste attraktiv, weil ebenfalls eine körpereigene Modulation des Immunresponses aktiviert wird, besser ist es über Vakzinierung antiidiotypische Antikörper zu induzieren. Zu bedenken ist aber, dass kreuzreaktive Antikörper induziert werden können, die zu extrem schweren Nebenwirkungen führen können und dass bei erfolgreicher Komplexierung der Inhibitoren eine Glomerulonephritis (die Verstopfung der Nierenkanälchen) auftreten kann. Tabelle 2: Behandlungsmöglichkeiten und Therapiekonzepte für AIIo- und Autoantikörper gegen FVIII.
Figure imgf000005_0001
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es Peptide bereitzustellen, die in der Lage sind, den Inhibitor zu blockieren, ohne die eingangs erwähnten Nachteile zu bewirken. Die erfindungsgemäßen Peptide sollen eine Immunisierung auslösen, damit antiidiotypische Antikörper einen Langzeitschutz gewährleisten.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Peptide mit der Fähigkeit,
Inhibitorantikörper gegen Blutgerinnungsfaktor VIII zu blockieren bzw. aus dem
Komplex zwischen Faktor VIII und Inhibitorantikörper zu verdrängen.
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Peptids zur Blockierung der Wirkung von FVIII Inhibitoren, wobei das Peptid acht bis 15 Aminosäuren umfasst und in der Aminosäuresequenz gleichzeitig folgende Aminosäuren vorhanden sein müssen mindestens zwei Tyr, mindestens eine Aminosäure, die unter physiologischen Bedingungen eine positive oder negative Gesamtladung trägt, mindestens eine Aminosäure mit hydrophobem aromatischem Rest, S - am N-terminalen Ende eine Aminosäure vorhanden ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pro, Arg, Tyr oder Phe am C-terminalen Ende Asp, Arg, Lys, His oder Phe vorhanden ist, und kein Cys und/oder VaI-VaI in der Aminosäuresequenz vorkommt.
3 Es kann bevorzugt sein, dass in der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz höchstens vier Tyr vorhanden sind. Darüber hinaus kann bevorzugt sein, dass die geladene Aminosäure unter physiologischen Bedingungen eine positive Ladung trägt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann es sich bei der positiv geladenen Aminosäure um Lys oder Arg handeln.
Die erfindungsgemäße Aminosäure mit hydrophobem aromatischem Rest kann bevorzugt Trp und/oder Phe und/oder Tyr sein.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Aminosäuresequenz ein Dekapeptid umfassen.
Das erfindungsgemäße Peptid kann ausgewählt sein aus der Gruppe der Peptide mit der Seq. ID No. Sl/1-240, S2/1-131 und S3/1-128. Bevorzugt ist das Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq ID No. S3/58, Sl/238, S2/48, S2/35, S2/129, Sl/160, Sl/171, Sl/173.
Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Peptid mit anderen Molekülen konjugiert sein, die eine Halbwertszeit in vivo verlängern. Beispiele für geeignete Moleküle sind hochmolekulares Polyethylenglycol, Dextran oder Agarose.
Ferner wird ein Peptid zur Blockierung der Wirkung von FVIII Inhibitoren beansprucht, wobei das Peptid acht bis 15 Aminosäuren umfasst und in der Aminosäuresequenz gleichzeitig folgende Aminosäuren vorhanden sein müssen mindestens zwei Tyr, mindestens eine Aminosäure, die unter physiologischen Bedingungen eine positive oder negative Gesamtladung trägt, mindestens eine Aminosäure mit hydrophobem aromatischem Rest, am N-terminalen Ende eine Aminosäure vorhanden ist, die ausgewählt ist ' aus der Gruppe bestehend aus Pro, Arg, Tyr oder Phe am C-terminalen Ende Asp, Arg, Lys, His oder Phe vorhanden ist, und kein Cys und/oder VaI-VaI in der Aminosäuresequenz vorkommt.
Bevorzugt werden Peptide mit den folgenden Strukturen beansprucht: a) Peptid mit der Struktur
RHYX1X2X3X4X5HF mit
X1 = Q oder K X2 = Y oder Q X3 = N oder Y X4 = F oder Q X5 = Q oder F.
b) Peptid mit der Struktur
X6X7X8X9X10X11YKYD mit
X6 = P oder H
X7 = Y oder H
X8 = K, W oder Y
5 X9 = Y, R, K oder V
X10 = W oder T
X" = F oder Q.
c) Peptid mit der Struktur wie in b), mit X6 = P und X7 = Y und
D X8 = K, W oder Y
X9 = Y, R oder K
X10 = W oder T
X11 = F oder Q. d) Peptid mit der Struktur wie in b), mit X8 = K, X9 = Y, X10 = T und X11 = F sowie X6 = P oder H und X7 = Y oder H.
e) Peptid mit der Struktur wie in b), mit X10 = W und X11 = Q und X6 = P und X7 \ = Y sowie
X8 = W oder Y und .
X9 = R oder K-
Die erfindungsgemäßen Peptide können am N- und/oder C-Terminus der ) Aminosäuresequenz mit Gruppen modifiziert sein, die einen Abbau des Peptids verzögern. Ferner werden die unter den Punkten a)-e) aufgeführten Peptide beansprucht, sofern sie aus den Aminosäuren in der entsprechenden D- Konfiguration aufgebaut sind.
5 Die erfindungsgemäßen Peptide können in Arzneimitteln enthalten sein. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Peptide bei der Herstellung von Vakzinen verwendet werden.
Schließlich wird ein Verfahren beansprucht, durch welches die D erfindungsgemäßen Peptide mittels chemischer oder gentechnischer Verfahren hergestellt werden können.
Die erfindungsgemäßen Peptide stellen keine Teilsequenzen von FVIII selbst dar. Die erfindungsgemäßen Peptide scheinen die Epitope der Inhibitoren nachzuahmen, sind aber nicht mit diesen identisch. Dadurch besteht die Möglichkeit, Substanzen zu identifizieren, die nicht nur als Epitop gegen die Bindungsstelle eines Inhibitorantikörpers gerichtet sind, sondern eine Vielzahl unterschiedlicher FVIII-Inhibitoren blockieren können.
Die Verwendung von relativ kleinen Peptiden, die die erfindungsgemäßen Peptide sind, hat den Vorteil, dass nur die Bindungsstelle der Inhibitoren blockiert wird, durch geeignetes Screening Substanzen mit breiterem Wirkungsspektrum gefunden werden können und somit ein einziges Peptid aufgefunden werden kann, das Inhibitorantikörper mit unterschiedlicher Epitoperkennung binden kann, eine Immunantwort nur gegen die Epitope der Inhibitoren zu erwarten ist und nicht gegen andere Teile, wie bei der konventionellen antiidiotypischen Vakzinierung,
- - die Herstellungstechnologie etabliert ist und für die Produktion von Arzneimitteln akzeptiert ist, die geringe Grosse der Peptide geringe Immunreaktionen verspricht, nur das betroffene Patientenkollektiv behandelt werden muss, ) - falls sich herausstellt, dass Antikörper unterschiedlichen Epitops blockiert werden müssen, eine Vielzahl von Substanzen zur Verfügung gestellt werden können und dass nur geringe Nebenwirkungen zu erwarten sind.
> Rg. 1 zeigt die Struktur von α-Methoxy-ω-NHS-PEG (mPEG); PEG ist in unterschiedlichen Längen erhältlich.
Fig. 2 zeigt die Struktur von α-Methoxy-ω-NHS-PEG (mPEG); PEG ist in unterschiedlichen Längen erhältlich. )
Figur 3 zeigt das Chromatogramm einer Reinigung von IgG aus Humanserum mittels Protein A.
Figur 4 zeigt den Verlauf einer Reinigung von IgG über FVIII-Sepharose zur Gewinnung von Anti-FVIII-AntikÖrpern.
Figur 5 zeigt die Verdrängungskurve von Inhibitor 5 mit Peptid S2/129, IC50 914 μM.
Figur 6 zeigt die Verdrängungskurve von Inhibitor 5 mit Peptid S2/35, IC50 79.22 μM.
Figur 7 zeigt die Verdrängungskurve von Inhibitor 1 mit Peptid Sl/238, IC5O 20.94 μM. Figur 8 zeigt die Verdrängungskurve von Inhibitor 5 mit Peptid Sl/238 Serum 5, IC50 1.85 μM.
Figur 9 zeigt die Verdrängungskurve der Inhibitoren 1, 3 und 5 mit Peptid S S2/48.
Figur 10 zeigt die Verdrängungskurve von Inhibitor K3 mit Peptid Sl/238, IC50 401.78 μM.
3 Figur 11 zeigt die Verdrängungskurve von Inhibitor K4 mit Peptid Sl/238, IC50 402.73 μM.
Figur 12 zeigt die Verdrängungskurve von A) Inhibitor 3 und B) Inhibitor 6 mit Peptid Sl/238. 5
Figur 13 zeigt die Verdrängungskurve von A) Inhibitor Kl und B) Inhibitor K2 mit Peptid Sl/238.
Figur 14 zeigt die Verdrängungskurve der Inhibitorantikörper 1, 3, 5 und 6 mit 0 Peptid S3/58.
Figur 15 zeigt die Verdrängungskurve der Inhibitorantikörper Kl, K2, K3, und K4 mit Peptid S3/58.
5 Figur 16 zeigt die Verdrängugskurve von A) Inhibitor 5 und B) Inhibitor 6 mit Peptid Sl/173.
Figur 17 zeigt die Verdrängungskurve von A) Inhibitor 1 und B) Inhibitor 6 mit Peptid Sl/139. 0
Figur 18 zeigt die Verdrängungskurve von Inhibitor 6 mit Peptid Sl/151.
Figur 19 zeigt die Verdrängungskurve von mabO38 mit Peptid Sl/238; IC5O 35.78 μM.
;5 Figur 20 zeigt die Verdrängungskurve von mabO38 mit Peptid Sl/160; IC50 38.72 μM.
Figur 21 zeigt die Verdrängungskurve von mabO38 mit Peptid S2/35. 5
■Figur 22 zeigt die Verdrängungskurve von OBT0037 mit Peptid Sl/171.
Figur 23 zeigt die Verdrängungskurve von ESH8 mit Peptid Sl/171.
D Figur 24 zeigt einen Verdrängungstest von Serum 3 mit PEGyliertem Peptid Sl/238.
Figur 25 zeigt einen Verdrängungstest von Serum 5 mit PEGyliertem Peptid Sl/238.
5
Figur 26 zeigt einen Verdrängungstest von mabO38 mit PEGyliertem Peptid Sl/238.
Sollten die erfindungsgemäßen Peptide eine kurze Halbwertszeit besitzen, kann diese durch Konjugation mit anderen Molekülen wie z. B. hochmolekularem
Polyethylenglycol, Dextran oder Agarose aufgehoben werden. Durch Auswahl geeigneter Substanzen kann die Halbwertszeit erhöht werden, wobei eine
Beeinträchtigung der biologischen Aktivität ist nicht zu erwarten ist. Eine
Vielzahl unterschiedlicher PEG-Arten mit unterschiedlichem Molekulargewicht sind verfügbar, was eine ideale Anpassung von PEG an die erforderlichen
Bedürfnisse ermöglicht.
In Figur 1 ist ein mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) aktiviertes PEG dargestellt, welches auf einer Seite durch eine Methoxygruppe blockiert ist. Dadurch wird ein homogeneres Produkt gewährleistet.
Zur Messung der pharmakologische Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide, die in der Lage sind, den FVIII vom Inhibitor zu verdrängen, kann in hämophilen Mäusen getestet werden. Dies ist ein großer Vorteil, nachdem im Jahr 1995 zum ersten Mal. hämophile Mäuse gezüchtet wurden [39,40]. Man ist nicht mehr auf größere Tiere angewiesen. Bei diesen Mäusen ist das FVIII-Gen am Exon 17 unterbrochen. Es wurde gezeigt, dass diese Tiere ähnlich wie beim Menschen Antikörper gegen FVIII entwickeln [41,42]. Die Reaktionskinetik der entwickelten Antikörper ist ähnlich wie bei der menschlichen Hämophilie A und die Subklassenverteilung ist normal [41,42]. Somit eignet sich ein solches -Modell ausgezeichnet für die Testung von Substanzen, die Inhibitoren blockieren.
Der erste Schritt ist die Auswahl von Patientenseren mit FVIII-Inhibitor-Bildung. Für die Sceeningversuche ist es notwendig, mittels Affinitätschromatographie Inhibitor-IgG aus dem Serum herauszureinigen, um möglichst spezifische Ergebnisse erhalten zu können. Zuerst wird Gesamt-IgG der Subklassen IgGl, IgG2 und IgG4 mittels Protein A erhalten. Die Weiterreinigung erfolgt über .eine Affinitätssäule, an die rekombinanter FVIII gekoppelt wurde. Auf diese Weise werden spezifische FVIII-bindende Antikörper erhalten.
Als Detektionsmethode wird die Chemilumineszenzmessung gewählt, die sich durch ihre hohe Empfindlichkeit auszeichnet. Als Konjugat kann entweder Anti- Human-IgG-Peroxidase (Sekundärantikörper-System) oder Streptavidin- Peroxidase (Biotin-Streptavidin-System) verwendet werden. Bei Anwendung des Biotin-Streptavidin-Systems werden die Inhibitorantikörper direkt mit Biotin markiert, wodurch unspezifische Signale, die durch den Sekundärantikörper verursacht werden können, umgangen werden. Die Biotinmarkierung erfolgt mittles NHS-aktiviertem Biotin über freie Aminogruppen der Antikörper.
Die erfindungsgemäßen Peptide, die z. B. durch Merrifield-Festphasen- Peptidsynthesen [44] hergestellt werden, wurden auf Verdrängung von Inhibitoren mittels Flüssigphasen-Verdrängungstests geprüft. Dazu werden Mikrotiterplatten mit FVIII beschichtet und anschließend mit einer Mischung aus Inhibitor-IgG und steigenden Peptidkonzentrationen inkubiert. Die Detektion gebundener Inhibitoren erfolgt mit Peroxidase-gebundenem Konjugat und Chemilumineszenzmessung. Als Maß zum Vergleich der einzelnen Peptide wird die sogenannte IC50 herangezogen. Dabei handelt es sich um die Peptidkonzentration, bei der 50% der Inhibitoren verdrängt werden können. Peptide mit der stärksten Verdrängungswirkung (möglichst niedrige IC50) werden gewählt und mit Polyethylenglycol konjugiert. Diesem Schritt sollte eine erneute Durchführung des Verdrängungstests folgen, um sicherzustellen, dass PEGylierte Peptide nach wie vor biologisch aktiv sind.
Beispiel 1
Präparation von Inhibitor-Seren
Inhibitor-Seren
Für die durchgeführten Versuche standen 7 Blutseren von Inhibitorpatienten zur Verfügung. Die Eigenschaften, sowie die Herkunftsländer dieser Proben sind in Tabelle 3 angeführt.
Tabelle 3: Eigenschaften und Herkunft der für Versuche verwendeten Inhibitor-
Figure imgf000013_0001
Seren.
Protein A-Affinitätschromatographie
Inhibitor-Seren wurden 2 h mit 0.5 % Triton X-100 virusinaktiviert, anschließend 1:5 mit Äquilibrierungspuffer verdünnt und filtriert.
Für die Reinigung von Inhibitor-Seren wurde rProtein A-Sepharose FF (Pharmacia) verwendet. Die gepackte Säule hatte ein Volumen von 7.85 ml. Zum Äquilibrieren der Säule wurde 25 mM Tris/HCI, 0.15 M NaCI, pH 7.2-7.5 verwendet mit einer Flussrate von 3 ml/min. 6-10 ml verdünntes Serum wurden auf die Säule bei einem Fluss von 0.65 ml/min geladen. Die Elution von gebundenem IgG erfolgte mit Hilfe eines Stufengradienten mit 0.1 M Glycin, 0.15 M NaCI, pH 3.0 bei geringer Flussrate von 0.65 ml/min. Die Regeneration der Protein A-Säule wurde mit 0.1 M Glycin, 0.15 M NaCI, pH 2.5 durchgeführt. Abschließend wurde die Säule mit Äquilibrierungspuffer äquilibriert. Gewonnene Eluate wurden sofort mit 1 M Tris neutralisiert und mittels rFVIII-Sepharose weitergereinigt oder bei -800C eingefroren.
FVIII-Affinitä tsch roma tographie
Zum Beladen von CNBr-activated Sepharose 4 FF (Pharmacia) wurde rFVIII (Fa. Baxter) mit einer FVIII-Aktivität von 6400 U/ml verwendet. Die Herstellung der Affinitätssäule erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Die gepackte Säule hatte ein Volumen von 1.3 ml.
Zum Äquilibrieren der Sepharose wurde 10 mM Hepes, 0.1 M NaCI, 5 mM CaCI2, 0.1% Tween 80, pH 7.4 verwendet. Aus der Reinigung mittels Protein A gewonnenes Eluat wurde auf die Säule aufgetragen und spezifische Anti-FVIII- Antikörper mit 0.1 M Glycin, 0.15 M NaCI, 5 mM CaCI2, 0.1% Tween 80, pH 2.8 eluiert und sofort mit 1 M Tris neutralisiert. Nach der Reinigung wurde die Sepharose mit Äquilibrierungspuffer neutralisiert. Gewonnene Eluat wurden sofort für weitere Versuche verwendet oder bei -800C gelagert.
Aus 6 ml Humanserum wurden so etwa 100 μg Inhibitor-IgG erhalten.
Biotinylierung von Inhibitor-IgG
Vor der Biotinylierung wurde Inhibitor-IgG gegen PBS, pH 7.4 dialysiert, um freie Aminogruppen zu entfernen. Anschließend wurden die Antikörper nach den Angaben des Herstellers (Pharmacia) mit NHS-LC-Biotin markiert.
Herstellung der Decapeptidlibraries mittels Spotsynthese und Screening
Die Synthese der erfindungsgemäßen Peptide erfolgte auf Cellulosemembranen über einen ß-Alanin-Linker [45] unter Verwendung eines Pipettierroboters. Sämtliche für die Synthese verwendete Aminosäuren liegen als Pentafluorophenyl (OPfp)-Ester vor und sind N-terminal durch 9- Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) geschützt. Als Seitenketten-Schutzgruppen wurden Trityl- für Cystein, Histidin, Asparagin und Glutamin, t-Butyl- für Aspartat, Glutamat, Serin, Threonin und Tyrosin, t-Butoxycarbonyl- für Lysin und Tryptophan sowie Pentamethylchroman- für Arginin verwendet. Die Membran wurde mit 0.2 M Fmoc-ß-Alanin-OH aktiviert, mit 0.24 M Diisopropylcarbodiimid und 0.4 M l-Methylimidazol funktionalisiert, dann wurde ein zusätzlicher ß-Alanin-Rest als Spacer eingefügt. Die Synthese des entsprechenden Peptids wurde mit 0.3 M Aminosäure-Lösungen in N- Methylpyrrolidon durchgeführt.
J
■ Die Testung -der erfindungsgemäß zu verwendenden Peptide kann ähnlich wie bei einem Western Blot erfolgen. Cellulosemembranen können mit PBS mit 0.1% Tween-20 (PBS-T) äquilibriert werden und 1 Stunde oder über Nacht bei 40C mit 3% BSA in PBS-T blockiert werden. Die Inkubation mit den
) Inhibitorantikörpem erfolgte in PBS-T mit 1% BSA für 2 Stunden. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS-T wurde entweder 15 Minuten mit Streptavidin- Peroxidase-Konjugat (1:2000) oder 1 Stunde mit Anti-Human-IgG-Peroxidase (1:10000) in PBS-T mit 0.5 M NaCI und 1% BSA inkubiert. Nach erneutem mehrmaligen Waschen wurde gebundenes Konjugat mit Chemilumineszenz- Substrat (SuperSignal®, Pierce) und anschließender Belichtung (Lumilmager) sichtbar gemacht.
Festphasenpeptidsynthese
Insbesondere wurden die erfindungsgemäß zu verwendenden Peptide für Verdrängungstests mit Hilfe eines Peptide Synthesizers 433A (Applied Biosystems) auf einem HMP-Harz als Träger synthetisiert. Die Synthese erfolgte mittels Fmoc-Chemie unter Verwendung von Seitenkettenschutzgruppen für reaktive Aminosäure-Seitenketten.
Nach dem Abspalten der Seitenketten-Schutzgruppen wurden die Peptide gereinigt und mittels RP-HPLC und MALDI-TOF-MS analysiert.
Verdrängungstests
Die Peptide wurden in Verdrängungstests auf ihre Wirkung getestet. Da interessante Peptide ein möglichst breites Wirkungsspektrum aufweisen sollen, d.h. unterschiedliche Inhibitoren blockieren sollen, wurden sie mit mehreren Inhibitorseren getestet.
Dazu wurden MaxiSorp Mikrotϊterplatten mit 2 μg/ml plasma derived FVIII (pdFVIII) vorgecoatet (2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur). Als Coating-Puffer wurde ein 0.1 M NaHCO3-Puffer, pH 9.6 verwendet. Anschließend wurde 1 Stunde mit 3% BSA in PBS-T blockiert und 2 Stunden mit Mischungen aus Inhibitoren und unterschiedlichen Konzentrationen an Peptid inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS-T wurde 1 Stunde mit dem entsprechendem ; Peroxidase-Konjugat in PBS-T mit 1 % BSA inkubiert. Nach Waschen mit PBS-T wurde mit Chernilumineszenzsubstrat (SuperSignal®, Pierce) inkubiert und die Platte am Lumilmager belichtet. Die Lichtintensität ist ein Maß für gebundene Inhibitoren.
) Die Verdrängung wird durch das sogenannte "fractional binding" angegeben. Dabei handelt es sich um den Anteil an noch durch Inhibitoren gebundenen FVIIL Dieser Wert sollte bei wirksamen Peptiden schon bei geringen Peptid konzentrationen stark absinken.
Peptid S2/129 zeigt Verdrängungswirkung auf Inhibitor 5 mit einer IC50 von 914 μM (Figur 5). Für Peptid S2/35 wurde eine IC50 von 79.22 μM für Inhibitor 5 erreicht (Figur 6). Mit Peptid Sl/238 konnten alle sieben bisher untersuchten Inhibitorantikörper verdrängt werden. Wegen Aggregation der Peptide mit den Seren bei Verwendung höherer Peptidkonzentrationen durch Immunkomplexbildung war die Berechnung der IC50 nur für Inhibitor 1, 5, K3 und K4 möglich und lag für Inhibitor 1 bei 20.94 μM (Figur 7), für Inhibitor 5 bei 1.85 μM (Figur 8). Die Inhibitoren K3 und K4 konnten mit diesem Peptid mit einer IC50 von 401.78 μM bzw. 402.73 verdrängt werden (Figur 10 und 11).
Der Anstieg in der Bindungsstärke nach einem anfänglichen starken Absinken wird durch Aggregation von IgG (bzw. IgG mit Peptid) bei Zugabe des Peptids ab einer bestimmten Konzentration beobachtet. Dieser Effekt könnte von der Peptidsequenz, vom Zustand der IgG-Lösung, vom verwendeten Lösungsmittel, bzw. vom pH-Wert der Inkubationslösung abhängig sein und tritt deshalb manchmal früher, manchmal später oder gar nicht auf. Peptid S3/58 wurde auf seine Verdrängungswirkung auf die Inhibitoren 1, 3, 5 und 6 sowie Kl, K2, K3 und K4 überprüft. In allen Fällen führte das Peptid zu einer starken Verdrängung der Inhibitoren schon bei geringer Peptid konzentration (Figur 14 bzw. 15). Auch die Peptide Sl/173 (Figur 16), Sl/139 (Figur 17) und Sl/151 (Figur 18) zeigen verdrängende Wirkung auf die Inhibitoren, gefolgt von Aggregation. Peptid Sl/173 verdrängt die Inhibitoren 5 und 6 in einem Konzentrationsbereich von 0.05-0.1 mg/ml. Peptid Sl/139 zeigt auf die Inhibitoren 1 und 6 im > Konzentrationsbereich 0.025-0.5 mg/ml Verdrängungswirkung und Peptid Sl/151 verdrängt Inhibitor 6 zwischen 0.05 - und 0.1 mg/m! Peptid. Sichtbar wird die Verdrängung durch sinkende Bindungsstärke.
Verdrängungstests wurden zusätzlich mit monoklonalen Antikörpern gegen FVIII ) durchgeführt. Es wurden Antikörper getestet, die gegen unterschiedliche Regionen im FVIII gerichtet sind. MabO38 bindet an die leichte Kette von FVIII und konnte erfolgreich mit den Peptiden Sl/238, Sl/160 und S2/35 verdrängt werden. Die IC50 der Peptide Sl/238 und Sl/160 wurde mit 35.78 μM bzw. 38.72 μM berechnet (Figur 19 und Figur 20). Peptid S2/35 bewirkte eine 5 Verdrängung des Antikörpers, gefolgt von Aggegation (Figur 21).
Bei OBT0037 handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper, der gegen die schwere Kette von FVIII gerichtet ist und der mit Peptid Sl/171 verdrängt werden konnte (Figur 22).
ESH8 bindet an die C2-Domäne von FVIII und konnte bei Verwendung von kleinen Peptid konzentrationen mit Peptid Sl/171 verdrängt werden. Die
Kurvenform könnte auch auf eine leichte Form von Aggregation zurückgeführt werden (Figur 23).
Konjugation von Peptid Sl/238 mit Polvethylenαlvcol
Peptid Sl/238 ist ein Peptid mit einem sehr breiten Wirkungsspektrum bei gleichzeitig niedriger IC50 und wurde deshalb für Konjugationsversuche gewählt.
Mit der Sequenz PYWKWQYKYD besitzt diese Peptid 3 mögliche Aminogruppen, über die Polyethylenglycol gekoppelt werden kann. 2 Aminogruppen werden durch die Seitenketten der beiden Lysin-Reste zur Verfügung gestellt, die dritte
Aminogruppe ist am N-Terminus zu finden. Die Reinigung der Reaktionsmischung erfolgte mittels RP-HPLC. Die Effizienz der Reinigung wurde mittels RP-HPLC und mittels SEC überprüft. Die Identität des Peptids konnte mittels MALDI-TOF-MS bestätigt werden.
Der Verdrängungstest mit PEGyliertem Peptid S1/238-PEG wurde bisher mit den Inhibitorantikörpern 1, 3 und 5, sowie mit den monoklonalen Antikörpern mabO38 und ESH8 durchgeführt. Verdrängungswirkung konnte bei den Inhibitoren 3 (Figur 24) und 5 (Figur 25), sowie mabO38 (Figur 26) erzielt werden. Die IC50 wurde für Inhibitor 3 mit 51.68 μM, für Inhibitor 5 mit 58.33 μM und für mabO38 mit 80.57 μM berechnet. Inhibitor 1 und ESH8 konnten nicht mit Peptid S1/238-PEG verdrängt werden.
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Seq ID No. S1/1-24Q
1. FAYRTFYIIR 34. FAYRWQYIIR 67. PYKYVFYISR
2. FAYRTFYISR 35. FAYRWQYISR 68. PYKYVFYITR
3. FAYRTFYITR 36. FAYRWQYITR 69. PYKYVFYIVR 4." FAYRTFYIVR 37. FAYRWQYIVR 70. PYKYVFYITK
5. FAYRTFYITK 38. FAYRWQYITK 71.YHKYVFYIIR
6. FAYRTFYIYD 39. FAYRWQYIYD 72.YHKYVFYISR
7. PYYRTFYIIR 40. PYYRWQYIIR 73.YHKYVFYrTR
8. PYYRTFYISR 41. PYYRWQYISR 74. YH KYVFYIVR
9. PYYRTFYITR 42. PYYRWQYITR 75.YHKYVFYITK
10. PYYRTFYIVR 43. PYYRWQYIVR 76. FAKYWQYIIR
11. PYYRTFYITK 44. PYYRWQYITK 77. FAKYWQYISR 12.PYYRTFYIYD 45. PYYRWQYIYD 78. FAKYWQYITR 13. YHYRTFYIIR 46. YHYRWQYIIR 79. FAKYWQYIVR 14. YH YRTFYISR 47.YHYRWQYISR 80. FAKYWQYITK 15. YH YRTFYITR . . 48.YHYRWQYITR 81. FAKYWQYIYD 16.YHYRTFYIVR 49. YHYRWQYIVR 82. PYKYWQYIIR
17. YH YRTFYITK 50. YH YRWQYITK 83. PYKYWQYISR
18. YHYRTFYIYD 51. YHYRWQYIYD 84. PYKYWQYITR
19. FAYRVFYIIR 52. FAKYTFYII R 85. PYKYWQYIVR
20. FAYRVFYISR 53. FAKYTFYISR 86. PYKYWQYITK
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23. FAYRVFYITK 56. FAKYTFYITK 89.YHKYWQYISR
24. PYYRVFYIIR 57. PYKYTFYIIR 90.YHKYWQYITR
25. PYYRVFYIS R 1 58. PYKYTFYISR 91. YH KYWQYI VR
26. PYYRVFYITR 59. PYKYTFYITR 92.YH KYWQYITK
27. PYYRVFYIVR 60. PYKYTFYIVR 93.YH KYWQYIYD
28. PYYRVFYITK 61. PYKYTFYITK 94. FAWKTFYIIR 29.YHYRVFYIIR 62.YHKYTFYIIR 95. FAWKTFYISR 30.YHYRVFYISR ' 63. YH KYTFYISR 96. FAWKTFYITR 31. YHYRVFYITR 64.YH KYTFYITR 97. FAWKTFYIVR 32.YHYRVFYIVR 65. YH KYTFYIVR 98. FAWKTFYITK 33. YH YRVFYITK 66. YH KYTFYITK 99. FAWKTFYIYD 100. PYWKTFYIIR 135. f -AYRTFYKIR 170. PYKYTFYKVR 101. PYWKTFYISR 136. FAYRTFYKSR 171. PYKYTFΎKYD
102. PYWKTFYITR 137. FAYRTFYKTR 172. YHKYTFYKVR
103. PYWKTFYIVR 138. FAYRTFYKVR 173. YHKYTFYKYD 104.PYWKTFYITK 139 . FAYRTFYKYD 174. FAKYVFYKTR 105. PYWKTFYIYD 140 . PYYRTFYKTK 175. FAKYVFYKTK 106.YHWKTFYIIR 141 . PYYRTFYKYD 176. FAKYVFYKYD 107.YHWKTFYISR 142 . YHYRTFYKYD 177. PYKYVFYKIR 108. YH WKTFYITR 143 . FAYRVFYKSR 178. PYKYVFYKSR 109.YHWKTFYIVR 144 . FAYRVFYKTK 179. PYKYVFYKTR
110. YH WKTFYITK 145 . FAYRVFYKYD 180. PYKYVFYKVR
111. YH WKTFYIYD 146 . PYYRVFYKIR 181. PYKYVFYKTK 112. PYWKVFYITR 147 . PYYRVFYKSR 182. PYKYVFYKYD
113. PYWKVFYIVR 148 . PYYRVFYKTR 183. YHKYVFYKIR
114. PYWKVFYITK 149 . PYYRVFYKVR 184. YHKYVFYKSR
115. PYWKVFYIYD 150 . PYYRVFYKTK 185. YHKYVFYKTR 116.YHWKVFYIIR 151 . PYYRVFYKYD 186. YHKYVFYKVR
117. FAWKWQYIIR 152 . YHYRWQYKVR 187. YHKYVFYKTK
118. FAWKWQYIS R 153 . YHYRWQYKYD 188. YHKYVFYKYD 119. FAWKWQYITR 154 . FAYRWQYKSR 189. FAKYWQYKIR
120. FAWKWQYIVR 155 . FAYRWQYKTR 190. FAKYWQYKSR 121. FAWKWQYITK 156 . FAYRWQYKVR 191. FAKYWQYKTR
122. FAWKWQYIYD 157 . FAYRWQYKYD 192. FAKYWQYKVR
123. PYWKWQYIIR 158 . PYYRWQYKIR 193. FAKYWQYKYD
124. PYWKWQYISR 159, . PYYRWQYKVR 194. PYKYWQYKIR
125. PYWKWQYITR 160, . PYYRWQYKYD 195. PYKYWQYKVR 126. PYWKWQYIVR 161. . YHYRWQYKVR 196. PYKYWQYKYD 127. PYWKWQYITK 162, . YHYRWQYKYD 197. YHKYWQYKYD 128. PYWKWQYIYD 163, , FAKYTFYKIR 198. FAWKTFYKIR 129.YHWKWQYIIR 164. , FAKYTFYKSR 199. FAWKTFYKSR 130.YHWKWQYISR 165. , FAKYTFYKTR 200. FAWKTFYKTR 131.YHWKWQYITR 166. , FAKYTFYKVR 201. FAWKTFYKVR 132.YHWKWQYIVR 167. , FAKYTFYKTK 202. FAWKTFYKTK 133.YHWKWQYITK 168. FAKYTFYKYD 203. FAWKTFYKYD 134.YHWKWQYIYD 169. PYKYTFYKIR 204. PYWKTFYKIR 205. PYWKTFYKVR 217. PYWKVFYKTR 229. FAWKWQYKTR
206. PYWKTFYKYD 218. PYWKVFYKVR 230. FAWKWQYKVR
207. YHWKTFYKIR 219. PYWKVFYKTK 231. FAWKWQYKTK
208. YHWKTFYKYD 220. PYWKVFYKYD 232. FAWKWQYKYD
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216. PYWKVFYKSR 228. FAWKWQYKSR 240. YHWKWQYKYD
Seq ID No. S2/1-131
I. RHKKNFQFFF 33. RHYQNFQFHF 65. YRYQYN FQH F 2,. RHYKNFQFFF 34. RH KKQYQFH F 66. RH KKN FQFHH
3. RHYQNFQFFF 35. RHYKQYQFH F 67.RHYKNFQFHH
4. RHKKQYQFFF 36. RHYQQYQFH F 68.RHYQNFQFHH
5. RHYKQYQFFF 37. RH KKYNQFH F 69. RHKKQYQFHH
6. RHYQQYQFFF 38. RHYKYNQFH F 70.RHYKQYQFHH
7. RHKKYNQFFF 39. RHYQYNQFHF 71. RHYQQYQFHH
8. RHYKYNQFFF 40. RHKKNFFQHF 72.RHKKYNQFHH
9. RHYQYNQFFF 41. RHYKN FFQH F 73. RHYKYNQFHH 10.RHKKQYFQFF 42.RHYQNFFQHF 74. RHYQYN QFH H
II. RH YKQYFQFF 43. RH KKQYFQH F 75.RHKKNFFQHH 12. RHYQQYFQFF 44. RHYKQYFQHF 76. RHYKN FFQHH 13. RH KKYN FQFF 45. RHYQQYFQH F 77.RHYQNFFQHH 14.RHYKYNFQFF 46. RH KKYN FQH F 78.RHKKQYFQHH 15. RHYQYNFQFF 47. RHYKYNFQHF 79. RHYKQYFQHH 16.YRKKNFQFFF 48. RHYQYNFQHF 80. RHYQQYFQHH 17.YRYKNFQFFF 49.YRKKNFQFHF 81. RHKKYNFQHH
18. YRKKQYQFFF 50.YRYKNFQFHF 82. RHYKYNFQHH
19. YRYKQYQFFF 51. YRYQN FQFH F 83. RHYQYN FQH H
20. YRYQQYQFFF 52. YRKKQYQFH F 84.YRKKNFQFHH 21. YRKKYNQFFF 53. YRYKQYQFH F 85.YRYKNFQFHH 22.YRYKYNQFFF 54. YRKKYNQFH F 86.YRYQNFQFHH 23.YRYQYNQFFF 55. YRYKYNQFH F 87.YRKKQYQFHH 24.YRKKN FFQFF 56. YRYQYNQFH F 88.YRYKQYQFHH 25. YRYKN FFQFF 57.YRKKNFFQHF 89. YRYQQYQFH H 26. YRKKQYFQFF 58.YRYKNFFQHF 90.YRKKYNQFHH 27.YRYKQYFQFF 59. YRYQN FFQH F 91. YRYKYNQFHH 28. YRKKYN FQFF 60. YRKKQYFQH F 92. YRYQYNQFH H 29. YRYKYN FQFF 61. YRYKQYFQH F 93.YRKKNFFQHH
30. YRYQYN FQFF 62. YRYQQYFQH F 94.YRYKNFFQHH
31. RH KKN FQFH F 63.YRKKYNFQHF 95.YRYQNFFQHH 32.RHYKNFQFHF 64.YRYKYNFQHF 96.YRKKQYFQHH 97.YRYKQYFQHH 110. RHYQYNQFYF 123. YRYQYNQFYF
98.YRYQQYFQHH 111. RHKKQYFQYF 124. YRKKNFFQYF
99.YRKKYNFQHH 112. RHYKQYFQYF 125. YRYKNFFQYF
100. YRYKYNFQHH 113. RHYQQYFQYF . 126. YRKKQYFQYF
101. YRYQYIMFQHH 114. RHKKYNFQYF 127. YRYKQYFQYF
102. RHKKNFQFYF 115. RHYKYNFQYF 128. YRYQQYFQYF
103. RHYKNFQFYF 116. RHYQYNFQYF 129. YRKKYNFQYF
104. RHYQNFQFYF 117. YRKKNFQFYF 130. YRYKYNFQYF
105. RHKKQYQFYF 118. YRYKNFQFYF 131. YRYQYNFQYF
106. RHYKQYQFYF 119. YRYQNFQFYF
107. RHYQQYQFYF 120. YRKKQYQFYF
108. RHKKYNQFYF 121. YRKKYNQFYF
109. RHYKYNQFYF 122. YRYKYNQFYF
Seq lD No. S3/ 1-128
1. AYWKWQYKYD 31. PTWKWQYKYD 61. PYWKIQYKYD
2. NYWKWQYKYD 32. PWWKWQYKYD 62. PYWKLQYKYD
3. DYWKWQYKYD 33. PVWKWQYKYD 63. PYWKFQYKYD
4. QYWKWQYKYD 34. PYAKWQYKYD 64. PYWKYQYKYD
5. EYWKWQYKYD 35. PYEKWQYKYD 65. PYW KVQYKYD
6. GYWKWQYKYD 36. PYIKWQYKYD 66. PYWKWAYKYD
7. HYWKWQYKYD 37. PYLKWQYKYD 67. PYWKWNYKYD
8. IYWKWQYKYD 38.PYFKWQYKYD 68. PYWKWDYKYD
9. LYWKWQYKYD 39. PYYKWQYKYD 69. PYWKWEYKYD
10. KYWKWQYKYD 40. PYVKWQYKYD 70. PYWKWGYKYD
11. MYW KWQYKYD 41. PYWAWQYKYD 71. PYWKWHYKYD
12. FYWKWQYKYD 42. PYWRWQYKYD 1 72. PYWKWIYKYD
13. SYWKWQYKYD 43. PYWN WQYKYD 73. PYWKWLYKYD 14.TYWKWQYKYD 44. PYWDWQYKYD 74. PYWKWKYKYD 15. WYWKWQYKYD 45. PYWQWQYKYD 75. PYWKWMYKYD 16.YYWKWQYKYD 46. PYWEWQYKYD 76. PYWKWFYKYD 17.VYWKWQYKYD 47. PYWGWQYKYD 77. PYWKWSYKYD 18. PAWKWQYKYD 48. PYWHWQYKYD 78. PYWKWTYKYD 19.PNWKWQYKYD 49. PYWI WQYKYD 79. PYWKWWYKYD
20. PDWKWQYKYD 50. PYWLWQYKYD 80. PYWKWYYKYD
21. PQWKWQYKYD 51. PYWMWQYKYD 81. PYWKWVYKYD
22. PEWKWQYKYD 52. PYWFWQYKYD 82. PYWKWQAKYD 23.PGWKWQYKYD 53. PYWPWQYKYD 83. PYWKWQN KYD
24. PHWKWQYKYD 54. PYWSWQYKYD 84. PYWKWQDKYD
25. PIWKWQYKYD 55. PYWTWQYKYD 85. PYWKWQQKYD
26. PLWKWQYKYD 56. PYWWWQYKYD 86. PYWKWQEKYD
27. PMWKWQYKYD 57. PYWYWQYKYD 87. PYWKWQGKYD
28. PFWKWQYKYD 58. PYWVWQYKYD 88. PYWKWQHKYD 29.PPWKWQYKYD 59. PYWKAQYKYD 89. PYWKWQIKYD 30. PSWKWQYKYD 60. PYWKHQYKYD 90. PYWKWQLKYD 91. PYWKWQFKYD 104. PYWKWQYIYD 117. PYWKWQYKED
92.PYWKWQSKYD 105.PYWKWQYLYD 118.PYWKWQYKGD
93. PYWKWQTKYD 106. PYWKWQYMYD 119. PYWKWQYKHD
94.PYWKWQWKYD 107.PYWKWQYFYD 120.PYWKWQYKID
95. PYWKWQVKYD 108. PYWKWQYPYD 121. PYWKWQYKLD
96. PYWKWQYAYD 109. PYWKWQYSYD 122. PYWKWQYKFD
97.PΫWKWQYRYD 110.PYWKWQYWYD 123. PYWKWQYKPD
98. PYWKWQYNYD 111. PYWKWQYYYD 124. PYWKWQYKSD
99. PYWKWQYDYD 112. PYWKWQYVYD 125. PYWKWQYKTD
100. PYWKWQYQYD 113. PYWKWQYKAD 126. PYWKWQYKWD
101. PYWKWQYEYD 114.PYWKWQYKND 127.PYWKWQYKVD
102. PYWKWQYDYD 115. PY W KWQYKD D 128. PYW KWQYKYE
103. PYWKWQYHYD 116. PYWKWQYKQD

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines Peptids zur Blockierung der Wirkung von FVIII
Inhibitoren, wobei das Peptid acht bis 15 Aminosäuren umfasst und in der Aminosäuresequenz gleichzeitig folgende Aminosäuren vorhanden sein müssen mindestens zwei Tyr, - indestens eine Aminosäure, die unter physiologischen Bedingungen eine positive oder negative Gesamtladung trägt, mindestens eine Aminosäure mit hydrophobem aromatischem Rest, am N-terminalen Ende eine Aminosäure vorhanden ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pro, Arg, Tyr oder Phe - am C-terminalen Ende Asp, Arg, Lys, His oder Phe vorhanden ist, und kein Cys und/oder VaI-VaI in der Aminosäuresequenz vorkommt.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei höchstens vier Tyr in der Aminosäuresequenz vorhanden sind.
3. Verwendung nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei die geladene Aminosäure unter physiologischen Bedingungen eine positive Ladung trägt.
4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei die positiv geladene Aminosäure Lys oder Arg ist.
5. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Aminosäure mit hydrophobem aromatischem Rest Trp und/oder Phe und/oder Tyr ist.
6. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Aminosäuresequenz ein Dekapeptid umfasst.
7. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe der Peptide mit der
Seq ID No. Sl/1-240, S2/1-131 und S3/1-128.
8. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Peptid mit anderen Molekülen konjugiert ist, die eine Halbwertszeit in vivo verlängern, wie mit z. B. hochmolekularem Polyethylenglycol, Dextran oder Agarose.
9. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Seq ID No. S3/58, Sl/238, S2/48, S2/35, S2/129, Sl/160, Sl/171, Sl/173.
10. Peptid zur Blockierung der Wirkung von FVIII Inhibitoren wobei das Peptid acht bis 15 Aminosäuren umfasst und in der Aminosäuresequenz gleichzeitig folgende Aminosäuren vorhanden sein müssen mindestens zwei Tyr, mindestens eine Aminosäure, die unter physiologischen Bedingungen eine positive oder negative Gesamtladung trägt, - mindestens eine Aminosäure mit hydrophobem aromatischem Rest, am N-terminalen Ende eine Aminosäure vorhanden ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pro, Arg, Tyr oder Phe am C-terminalen Ende Asp, Arg, Lys, His oder Phe vorhanden ist, und kein Cys und/oder VaI-VaI in der Aminosäuresequenz vorkommt.
11. Peptid mit der Struktur
RHYX1X2X3X4X5HF mit
X1 = Q oder K
X2 = Y oder Q
X3 = N oder Y
X4 = F oder Q
X5 = Q oder F.
12. Peptid mit der Struktur
X6X7X8X9X10X11YKYD mit X6 = P oderH
X7 = YoderH
X8 = K, WoderY
X9 = Y, R, KoderV x10 — WoderT
X" = FoderQ.
13. Peptid mit der Struktur nach Anspruch 12, mit X6 = P und X7 = Y
und
X8 ~" K,WoderY
X9 = Y, RoderK
X10 = W oderT
X11 = F oderQ.
14. Peptid mit der Struktur nach Anspruch 12, mit X8 = K, X9 = Y, X10 = T und X" = F sowie X6 = P oder H und X7 = Y oder H.
15. Peptid mit der Struktur nach Anspruch 12, mit X10 = W und X ■11 = Q
und
X6 = P und X7 = Y sowie X8 = W oder Y und X9 = R oder K.
16. Peptide nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei der N- und/oder C-Terminus der Aminosäuresequenz mit Gruppen modifiziert ist, die einen Abbau des Peptids verzögern.
17. Peptide gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, aufgebaut aus den Aminosäuren in der entsprechenden D-Konfiguration.
18. Arzneimittel enthaltend mindestens eines der in den Ansprüchen 1 bis 17 genannten Peptiden.
19. Verwendung der in den Ansprüchen 1 bis 17 genannten Peptide zur Herstellung einer Vakzine.
20. Verfahren zur Herstellung der in den Ansprüchen 1 bis 17 genannten Peptide mittels chemischer oder gentechnischer Verfahren.
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