WO2006090710A1

WO2006090710A1 - 骨組織の再生方法

Info

Publication number: WO2006090710A1
Application number: PCT/JP2006/303100
Authority: WO
Inventors: Hiroko Kojima; Toshimasa Uemura
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2006-02-15
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2007-08-25

Abstract

本発明は、骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子を単離された細胞に導入し、該細胞を三次元培養することにより骨組織を再生する方法、及び、前記方法によって再生された組織を利用した骨代替インプラントに関する。

Description

明細書骨組織の再生方法技術分野

本発明は、骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子導入による骨組織の再生方法、及び再生された組織を利用した骨代替ィンプラントに関する。背景技術

生体から取り出した自己の細胞を in vitroで培養 ·組織化して限りなく生体に近い組織を再構築するティッシュエンジニアリングの研究が進められている。ティッシュエンジニアリングは、再生能力の限られた骨組織の修復を可能にし、理想的な再生医療を実現する。

骨再生に関する技術としては、細胞の分化誘導をつかさどるサイトカイン (液性因子）を直接細胞に導入する技術が知られている。たとえば、 T G F— ^8 1を含浸させたコラーゲンスポンジ上で骨髄細胞等を培養する技術（特開 2001-316285 号）等が公知である。しかしながら、増殖因子そのものを細胞に添加するこれらの技術では、増殖因子活性の十分な持続が望めず、また添加した増殖因子が生体内で速やかに拡散してしまうため、その効果が数時間から 1 日程度で急激に低下するという問題があった。

これに対し、発明者らは骨誘導性転写因子（Cbfal) の遺伝子を細胞に導入する方法（W0 03011343 号）や、血管内皮細胞増殖因子（VEGF) の遺伝子を脂肪細胞に導入する方法（冊 03070291 号）を開発し、効果的な骨再生が得られることを確認した。発明の開示

本発明は、より迅速な骨再生を可能にし、臨床応用可能な骨再生技術を提供することを目的とする。

発明者らは、骨誘導性転写因子 (Cbfal)及び血管内皮細胞増殖因子（VEGF) の cDNAを組み込んだウィルスを細胞に同時感染させ、これを適当な足場材料に播種して三次元培養した。さらに、骨再生が最適となる条件を決定し、 Cbfal あるいは VEGF の遺伝子を単独導入した結果に比べて極めて効率のよい骨再生が実現することを確認した。

すなわち、本発明は、骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の両遺伝子を単離された細胞に導入し、該細胞を三次元培養する工程を含む、骨組織の作製方法に関する。

前記方法において、用いられる細胞としては間葉系幹細胞、骨芽細胞、脂肪細胞が好ましく、特にそれらの初代培養細胞を用いることが好ましい。

ある態様において、前記細胞は患者から単離された細胞である。

本発明の方法で用いられる骨誘導性転写因子としては、 Cbfal、 Cbfb、 osterix 等を挙げることができる。

本発明の方法において、細胞は多孔性ハイドロキシアパタイト、 a - T C P、 ]3 - T C P、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びヒアルロン酸、ならびにこれらの複合体からなる群より選ばれる 1種又は 2種以上の生体適合性材料を足場として三次元培養される。

ある態様において、本発明の方法は以下の工程を含む：

1 ) 生体から単離した細胞をデキサメタゾン、免疫抑制剤、骨形成蛋白質、及ぴ骨形成液性因子からなる群より選ばれる 1種又は 2種以上を用いて分化誘導する、

2 ) 上記細胞に骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子をアデノウィルスべクター、アデノ随伴ベクター、又はレト口ウィルスベクターを用レ、て導入する、

3 ) 上記細胞を多孔性ハイドロキシアパタイト、 a - T C P、 ]3 - T C P、コラ一ゲン、ポリ乳酸、ポリグリコー/レ酸、及びヒアルロン酸、ならびにこれらの複合体からなる群より選ばれる 1種又は 2種以上の生体適合性材料を足場として三次元培養する。

本発朋はまた、本発明の方法によって作製された骨組織を含むィンプラントを提供する。このインプラントは骨欠損部の再生医療に有用である。

本発明によれば、生体から取り出した細胞を培養 ·組織化して限りなく生体に近い骨組織を再構築することができる。図面の簡単な説明

図 1は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子組替えアデノウィルスベクターの構造を示す。

図 2は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子を導入した細胞（RBM0)の細胞増殖曲線を示す。図中、 ♦： Control、 ■ ： Adv- VEGF、 ▲： Adv- Cbfal、 X ： Adv- Cbfal +Adv- VEGF、 * ： Adv-mock₀

図 3は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子を導入した細胞（RBM0)のノーザンハイプリダイゼーションの結果を示す。図中、左から Control、Adv- VEGF、 Adv- Cbfal、 Adv_Cbfal +Adv- VEGF。また上段は full length の Cbfal cDNA、中段は full lengthの VEGF cDNAを、下段は internal standardとして GAPDHをプローブとして同じメンブレンにハイプリさせた結果。

図 4は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子を導入した細胞（RBM0)におけるアル力リフォスファターゼ活性（ALP activity) の測定結果を示す。図中、左から Control, Adv-VEGF、 Adv- Cbfal、 Adv- Cbfal +Adv-VEGF、 Adv- mock。

図 5は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子を導入した細胞（RBMO)におけるカルシゥム量を示す。図中、左から Control、 Adv- VEGF、 Adv-Cbfal , Adv-Cbf al + Adv_VfiGF。

図 6は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子を導入した細胞（RBMO)の、感染後 1、 2、 3週間後のァリザリンレツド染色像を示す。

図 7は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子を導入した細胞 (FAT)の細胞増殖曲線を示す。図中、♦： Contro 1、國： Adv- VEGF,▲： Adv-Cbfa 1、 X： Adv-Cbfa 1 + Adv- VEGF、 .* ： Adv_mock；。

図 8は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子を導入した細胞（FAT)におけるアル力リフォスファターゼ活性 (ALP activity)の測定結果を示す。図中、左から Control、 Adv- VEGF, Adv-Cbf al Adv- Cbfal + Adv- VEGF、 Adv- mock。

図 9は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子を導入した細胞（FAT)の、感染後 1、 2、 3週間後におけるォステオカルシン量の測定結果を示す。図中、左から Control, Adv_VEGF、 Adv-Cbf al, Adv- Cbfal + Adv- VEGF。

図 1 0は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子を導入した細胞（FAT)におけるカルシゥム量を示す。図中、左から Control、 Adv- VEGF、 Adv- Cbfal、 Adv- Cbfal + Adv-VEGFo

図 1 1は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子を導入した細胞 (FAT)の、感染後 1、2、 3週間後のァリザリンレツド染色像を示す。

図 1 2は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子を導入した細胞（FAT)におけるグリセロール一 3—リン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定結果を示す。図中、左から Control, Adv- VEGF、 Adv-Cbf al, Adv- Cbfal +Adv_VEGF、 Adv- mock。

図 1 3は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子を導入した細胞（RMB0)を吸着させたコンポジットのラット背上皮皮下移植 8 週間目のへマトキシリン /ェォジン染色像を示す。図中、左上： Control、左下： Adv_Cbfal、右上： Adv_VEGF、右下： Adv-Cbf al + Adv-VEGF₀

図 1 4は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子を導入した細胞 (RMB0)を吸着させたコンポジットのラット大腿骨欠損部移植 5 週間目のへマトキシリン /ェォジン染色像を示す。図中、左上： Control、左下： Adv- Cbfal、右上： Adv- VEGF、右下： Adv-Cbfal +Adv-VEGFo

図 1 5は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子を導入した細胞 (FAT)を吸着させたコンポジットのラット背上皮皮下移植 8 週間目のへマトキシリン /ェォジン染色像を示す。図中、右上： Control、左下： Adv- Cbfal、右下： Adv- Cbfal +Adv-VEGF。図 1 6は、 Cbfal及び/又は VEGF遺伝子を導入した細胞 (FAT)を吸着させたコンポジットのラット大腿骨欠損部移植 5 週間目のへマトキシリン /ェォジン染色像を示す。図中、右上： Contro 1、左下： Adv-Cbfa 1、右下： Adv-Cbfa 1 + Adv-VEGF。本明細書は、本願の優先権の基礎である特願 2 0 0 5— 5 1 7 1 4号の明細書に記載された内容を包含する。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明は、骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子を単離された細胞に導入し、該細胞を生体外で分化 ·増殖させる工程を含む、骨組織の作製方法に関する。

1 . 骨誘導性転写因子

本発明で用いられる骨誘導性転写因子は、未分化の細胞を骨に分化誘導する、骨誘導性の転写因子で、例えば Cbfal、Cbfb、osterix等を挙げることができる。 Cbfalは 1993年京都大学の小川らによってクローユングされ、大阪大学の小守らにより間葉系幹細胞から骨芽細胞に分化誘導するのに必要不可欠であることが確認された転写因子である (Komori, T, et al. , (1997) Cell 89, 755 - 764)。 Cbfbは造血に関与する因子として知られてきたが、近年 Runx2との相互作用により骨形成に必須の役割を担っていることが確認された。また、 Osterix は骨組織特異的に発現する Zinc- Finger型転写因子であり、骨芽細胞の分化等、骨形成に重要な役割を担っていることが確認されている。

これらの骨誘導性転写因子をコードする遺伝子の配列は既に公知であり、当該配列に基づき、骨髄由来細胞等から抽出された RNAを用いて常法に従い調製することができる。例えば、 Cbfal (ヒト： GenBank Accession Number AH005498、マウス： GenBank Accession Number AF010284等）、 Cbfb (ヒ卜： GenBank Accession Number匪— 022845，腿— 001755、マウス： GenBank Accession Number匪 _022309 等）、 osterix (ヒ卜： GenBank Accession Number AF466179、マウス： GenBank Accession Number AY803733等）の配列が公開されている。 2 . 血管内皮細胞増殖因子（VEGF)

本発明で用いられる血管内皮細胞增殖因子（VEGF) は、 in vitroでの血管誘導を飛躍的に向上させ、迅速な骨再生を可能にする。 VEGFをコードする遺伝子の配列は既に公知（ヒト： GenBank Accession Number AY047581、マウス： GenBank Accession Number蘭— 009505) であり、当該配列に基づき、細胞から抽出された RNAを用いて常法に従い調製することができる。

3 . 細胞

本発明に用いられる細胞は、分化 ·増殖能力を有する未分化の細胞であり、たとえば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、骨格筋幹細胞、神経幹細胞及び fp臓幹細胞、脂肪細胞等を挙げることができる。特に、骨髄由来の間葉系幹細胞、骨芽細胞、脂肪細胞が好ましく、脂肪細胞は脂肪前駆細胞を含むものとする。生体、特に脂肪組織から単離された脂肪細胞中には、体性幹細胞を含む fibroblast- like-cellが多く存在し、本発明で用いられる脂肪細胞には、そのような体性幹細胞が含まれていてもよい。

細胞は、市販のものを用いても、常法に従って調製してもよいが、患者の生体から単離された細胞を好適に用いることができる。該細胞は患者から採取された後、常法に従って結合組織等を除去して調製することが好ましい。また、細胞は初代培養細胞を用いることが好ましく、継代して用いてもよいが、継代数は 2回以下であることが好ましい。

4 . 生体適合性材料

本発明に用いられる生体適合性材料は、細胞培養の足場になると同時に、細胞ごと生体内に適用され、骨代替用インプラントとして機能する。ここで、「生体適合性材料」とは、生体に対して親和性が高く、安全性の確認されている材料を意味する。そのような材料としては、 SUS316L、パイタリゥム及び Ti - 6A1 - 4V 等の金属材料、超高分子量ポリエチレン、画 A骨セメント、ポリ乳酸ゃポリグリコール酸、及びそれらの誘導体（例えば、 PLLA (poly-l- lactic acid)と PDLA (poly- d- lactic acid)の重合体等）、ポリエチレンテレフタレート及ぴポリプロピレン等の高分子材料、ハイドロキシアパタイト、 j3 - TCP、 a - TCP及ぴバィォガラス等のセラミックス材料等を挙げることができる。ただし、細胞培養の足場として用いられるという点で、特にハイドロキシアパタイト、 - TCP、 a -TCPなどの多孔性セラミックス材料、コラ一ゲン、ポリ乳酸ゃポリグリコール酸、及びそれらの誘導体（例えば、 PLLA (poly-l- lactic acid) と PDLA (poly-d- lactic acid)の重合体等）、ならびにこれらの複合体、あるいは吸収性合成ポリマーを用いることが好ましい。

前記生体適合性材料は、細胞の均一な播種が可能となるよう、多孔性であることが好ましい。なお、本明細書中において「多孔 (性）」とは、気孔率が 40% 以上を意味するものとする。また、孔の大きさは特に限定されないが、骨再生が起きやすいという点では直径 200 ιη〜500 μ ηιが好ましレヽ。

前記生体適合性材料は、インプラントの目的や適用部位により、適宜最適なものを選ぶことが好ましい。たとえば、強度を必要とする移植箇所（あるいは手術法）については、ハイドロキシアパタイトが好ましく、強度を必要としない移植箇所（あるいは手術法）については、生体吸収性の /3 -TCPなどが好ましい。

前記生体適合性材料の形態及び形状は、特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、及びペースト状等、任意の形態及ぴ形状を用いることができる。こうした形態や形状は、ィンプラントの目的に応じて適宜選択すればよい。

5 . 骨組織再生

本発明の方法は、具体的には次の工程を含む： ■

( 1 ) ヒト細胞を in vitroで骨細胞へ分化誘導する工程

( 2 ) 上記細胞に、骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子をトランスフエクトする工程

( 3 ) 上記細胞を、生体適合性材料に播種して三次元的に培養、増殖させるェ程。

( 1 ) 細胞の分化誘導

細胞は適当な薬剤を用いて処理することにより、目的とする組織を構築する細胞に分化誘導をしておくことが必要である。たとえば、デキサメタゾン、 FK-506及びシクロスポリン等の免疫抑制剤、 BMP- 2、 BMP-4、 BMP- 5、 BMP- 6、 BMP - 7 及ぴ BMP- 9等の骨形成タンパク質（BMP : Bone Morphogenic Proteins) , TGF β 等の骨形成液性因子から選ばれる 1種又は 2種以上を添加することにより細胞を骨系細胞に分化誘導する。

( 2 ) 骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子の導入

骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子は、常法に従い、公知の配列を基に調製することができる。たとえば、骨芽細胞から R N Αを抽出し、公知の配列を元にプライマーを作製し、 PCR法でクローニングすることにより目的とする増殖因子遺伝子の cDNAが調製できる。

本発明において、骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子の細胞への導入は、動物細胞のトランスフエクシヨンに通常用いられる方法、たとえばリン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法、エレクト口ポレーシヨン法、マイクロインジェクション法、レトロウィルスやバキュ口ウィルスをベクターとして用いる方法等を用いることができるが、アデノウィルス又はレトロウイルスをベクターとして用いる方法が安全性、導入効率の点から好ましく、特にアデノウィルスを用いた方法が最も好ましい。

前記アデノウイルスベクターの調製は、例えば Miyakeらの方法（Miyake， S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 93 : 1320 - 1324， 1993) に基づいて行えばよい力市販の Adenovirus Cre/loxP Kit (宝酒造社製）を用いることもできる。このキットは P1ファージの Creリコンビナーゼとその認識配列である ΙοχΡを用いた新たな発現制御系（Kanegae Y. et al. , 1995, Nucl. Acids Res. 23, 3816) による組換えアデノウィルスベクター作製キットで、転写因子遺伝子を組み込んだ組換えアデノウイルスベクターを簡便に作製することができる。

なお、アデノウイルス感染の M0I (multiplicity of infection) は、組み込んだ遺伝子及び導入する細胞に依存しているため適宜決定する必要がある。ラットの間葉系幹細胞や骨芽細胞、脂肪細胞に遺伝子導入する場合、骨誘導性転写因子（Cbfal)組換えアデノウイルスは M0I =200〜1000 (より好ましくは 500 前後）、 VEGF組換えアデノウィルスは MOI = 50〜200 (より好ましくは 100前後）がよい。

( 3 ) 細胞培養

骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子を導入した細胞の培養は、前記した生体適合性材料からなる足場に、該細胞を播種して、通常の方法により行えばよレヽ。

細胞の播種は、足場である生体適合性材料に単に播種するだけでもよく、あるいは、緩衝液、生理食塩水、注射用溶媒、あるいはコラーゲン溶液等の液体とともに混合して播種してもよい。また、材料によって、細胞が孔の中にスムーズに入らない場合は、引圧条件下で播種してもよい。

播種する細胞の数（播種密度）は細胞の形態を維持して組織再生をより効率よく行わせるため、用いる細胞や足場材料に応じて適宜調整することが望ましい。たとえば、骨芽細胞であれば、播種密度は 100万個 Zml以上であることが望ましい。

細胞培養は、足場である生体適合性材料のもとで行う。培地としては、 MEM 培地、 a - MEM培地、 DMEM培地等、公知の培地を培養する細胞に合わせて適宜選んで用いることができる。また、該培地には、 FBS ( Sigma 社製）、 Antibiotic- Antimycotic (GIBC0 BRL社製）等の抗生物質等を添加しても良い。培養は、 3〜： 10% C0₂、 30〜40度、特に 5% C0₂、 37度の条件下で行うことが望ましい。培養期間は、特に限定されないが、少なくとも 4、好ましくは 7日、より好ましくは 1 0 程度であるとよレ、。 6 . インプラントの利用

本発明の方法によつて再生された組織は、足場材料である生体適合性材料とともに、埋入あるいは注入することで、骨代替用インプラントとして利用することができる。

本発明のインプラントの形態及ぴ形状は、特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、及びペースト状等、任意の形態及び形状を用いることができる。こうした形態や形状は、インプラントの目的に応じて適宜選択すればよレ、。

本発明のインプラントは、その目的と効果を損なわない範囲において、適宜他の成分を含んでいてもよい。そのような成分としては、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF)、血小板分化増殖因子（PDGF)、インスリン、インスリン様増殖因子（IGF)、肝細胞増殖因子（HGF)、グリア誘導神経栄養因子（GDNF)、神経栄養因子（NF)、ホルモン、サイト力イン、骨形成因子（BMP)、トランスフォーミング増殖因子（TGF)、血管内皮細胞増殖因子（VEGF) 等の増殖因子、骨形成タンパク質、 St、 Mg、 Ca及ぴ C0₃等の無機塩、クェン酸及びリン脂質等の有機物、薬剤等を挙げることができる。

本発明のィンプラントにおいて、骨細胞 ·組織の構築は移植前（in vitro) のみならず、移植後の骨欠損部（in vivo) においても引き続き行われてよい。本発明のインプラントは、骨親和性及び骨形成能が高く、生体適用後すみやかに生体骨と一体化し、骨欠損部の良好な再生を可能にする。特に、大型の骨欠損（1 cm径以上）においては、多孔性材料の中央部まで自然な血管導入が困難なため、大型骨欠損の十分な治療ができなかった。本発明のごとく、 VEGFの遺伝子導入を用いれば、中央部までの血管導入を可能にすることができ、大型骨欠損の十分な治療を行うことができる。実施例

以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。実施例 1 ： Cbfal、 VEGF遺伝子導入による in vitroでの骨再生

[方法] ( 1 ) アデノウイルス発現ベクターの作製

マウスの骨芽細胞から単離した Total RNAか蘭 reverse transcriptase を用いて cDNAを合成し、これを鍀型として Cbfalの cDNA に特異的なプライマ sense primer： 5， -ATGCTTCATTCGCCTCACAAAC- 3，（配列番号 1 )

ant is ens e primer： 5' - TCTGTTTGGCGGCCATATTGA- 3，（配列番号 2 ) を用いて PCRにより Cbfal (til- 1) cDNA (GenBank Accession Number AF010284) を増幅して得、シークェンスにより配列を確認した。 Cbfal cDNAは TA cloning vector (pCR II- T0P0， Invitrogen)にクローユングして大量調製した。 Cbfal cDNAを制限酵素 Spe Iと EcoR Vで切り出し、平滑末端に処理した。

マウス VEGFの cDNA (GenBank Accession Number丽— 009505) は、東京工業大学渡辺氏より供与を受けた。 VEGF cDNAも同様に大量調製し、制限酵素 EcoRI で切り出した後、平滑末端に処理した。

Cbfal cDNA及ぴ VEGF cDNA を、それぞれ Adenovirus Cre/loxP kit (宝酒造， 6151) を用いてコスミドベクター pAxCALNLwの Swa Iサイトに挿入し、 Kitの説明書に従って Cbfal組換えアデノウイルス（Adv- Cbfal) 及ぴ VEGF組換えァデノウィルス（Adv- VEGF) を作製した。作製したウィルスの力価は、それぞれ約 10^UPFU/ml (Adv-Cbf al) 約 2. 5 X 10⁹ PFU/ml (Adv-VEGF) の価を示し、感染効率が非常に高かった。これらのウィルスは E1領域欠失のため、標的細胞内では増殖することはできず、一過性の性質をもつ。また、目的遺伝子の上流にスタッファーをもっため、 Cre リコンビナーゼ発現ウィルスと共感染のときのみ遺伝子を発現する。 Creリコンビナーゼ発現アデノウイルス（Adv- cre) はキットに付属されていたものを用いた。

( 2 ) 骨髄細胞の採取及び培養方法

Rat Bone Marrow Osteobrast (RBM0) は 6週令の Fisherラット（ォス）の大腿骨より Maniatopoulosらの方法 (Maniatopoulos, C. , Sodek, J. , and Melcher, A. H. (1988) Cell Tissue Res. 254, 317- 330)に従って採取した。 15%FBS (Sigma, F- 9423)、 Antibiotic- Ant imy cot ic (GIBC0 BRL, 15240-062) 添加 MEM 培地 (Nacalai Tesque, 214-42)でコンフルェントになるまで培養した。直径 3. 5cm の dishに約 40万個の細胞を継代培養後、上述の培地に 5 nM Dexamethasone (Sigma, D - 8893)、 10 mM j3 -glycerophosphate (Sigma, G— 9891)、 50 μ g/ml ascorbic acid phosphate (Wako, 013-12061)を添加し、翌日、 RBM0に Cbfal組換えアデノウイルスと VEGF 組換えアデノウイルスを同時に、それぞれ multiplicity of infection (MOI) =500及び M0I=100で、 Creリコンビナーゼ遺伝子組換えアデノウイルスと共感染させた。また、上記と同量の Cbfal組換えアデノウイルス、 VEGF組換えアデノウイルスをそれぞれ単独で、 RMB0 に Cre リコンビナーゼ遺伝子組換えアデノウィルスと共感染させた。対照として、目的遺伝子を導入していない空のアデノウイルス（Adv- mock) を同様に共感染させた細胞、及ぴ未処理の細胞を同様に後述の実験に供した。

( 3 ) 脂肪細胞の採取及び培養方法

初代培養様脂肪細胞（FAT) は 8週令の Fi sherラット（ォス）の腹部皮下脂肪から採取した。皮下脂肪を生理食塩水で洗った後、細断し、 0. 075%コラゲナーゼを 37度で 30分間処理し、細胞を分散させた。 10% FBS (Sigma, F-9423) 添加 DMEM培地（Sigma, D- 5796) で中和した後、遠心し、その沈殿物を 160 mM 塩化アンモ-ゥム水溶液で 10分間処理した。その後遠心して得られた上清を 100 i mのナイロンメッシュでろ過し、 10% FBS、 Antibiotic- Antimycotic (GIBCO BRL， 15240-062)添加 DMEM培地でコンフルェントになるまで培養した。直径 3. 5cm の dish に約 40 万個の細胞を継代培養後、上述の培地に adipogenic supplement として 250 nM Dexamethasone (Si ma, D - 8893) 、 0. 5 mM 1— metyl— 3— isobuty丄 xanthin (Sigma, I一 7018)、 10 \x g/ral insulin (Sigma,

I - 5500)を、あるいは Osteogenic supplementとして 5 nM Dexamethasone (Sigma,

D- 8893)、 10 raM β -glycerophosphate (Sigma, G-9891)、 50 μ g/ml ascorbic acid phosphate (Wako, 013-12061)を添加して培養した。

翌日、 FATに Cbfal組換えアデノウィルスと VEGF組換えアデノウィルスを同時に、それぞれ multipl icity of infection (M0I) =500及ぴ M0I=100で、 Cre リコンビナーゼ遺伝子組換えアデノウイルスと共感染させた。また、上記と同量の Cbfal組換えアデノウィルス、 VEGF組換えアデノウィルスをそれぞれ単独で、 RMB0に Cre リコンビナーゼ遺伝子組換えアデノウィルスと共感染させた。対照として、目的遺伝子を導入していない空のアデノウイルス（Adv - mock) を同様に共感染させた細胞、及ぴ未処理の細胞を同様に後述の実験に供した。これらのアデノウィルス感染細胞はすべて上述の Osteogenic supplementを加えた骨芽細胞分化培地で培養した。また未処理の細胞に関しては Osteogenic supplementを加えた脂肪細胞分化培地及び Osteogenic supplementを加えた骨芽細胞分化培地で培養した。

( 4 ) 細胞数の計測法

各細胞 (画 0あるいは FAT) を 1% glutalaldehyde in PBSで 5分間固定した後、蒸留水で 2回洗い、 0. 1% crystal violetを用いて 30分間室温で染色した。蒸留水で 3回洗って余分な染料を除いた後、 10% acetic acid, 1% Triton X- 100 で脱色した。脱色液を希釈し吸収波長 595nmの吸光度を測定した。検量線は細胞を適当な濃度で播種し（dupl icate) , 上述の染色の後、トリプシン処理により単離した細胞をカウントすることにより作製した。

( 5 ) アル力リフォスファターゼ活性の測定

各細胞 (RBM0あるいは FAT) を 100 mM Tris (pH 7. 5)， 5mM MgCl₂で洗った後スクレイパーで集め、 500 1 1の lOO mM Tri s (pH 7. 5) , 5mM MgCl₂₎ 1% Triton X- 100に懸濁して超音波破砕した。破碎後 6， OOOgで 5分間遠心して上清を回収した。酵素活'! "生は 0. 056 M 2- amono—2- methyl - 1, 3-propandiol (pH 9. 9)， 10 mM p-nitrophenyl phosphate, 2 mM MgCl₂ に各上清 5 μ Ιを加え、 37°Cで 30分間ィンキュベートした後、すぐにマイクロプレートリーダ一で吸収波長 405 nm の吸光度を測定して求めた。検量線は nitrophenolを用いて作製した。 ( 6 ) カルシウム量の測定

各細胞（RBM0あるいは FAT)を 10%ホルマリン緩衝液で固定し、一昼夜 0. 6 M HC1 で脱灰した。脱灰液を希釈し Calcium reagents (Sigma, 587, 360-11) を用い、説明書に従ってカルシウム量を測定した。

( 7 ) ァリザリンレツド染色

各細胞（RBM0あるいは FAT)を 10%ホルマリン緩衝液で 5分間固定し、蒸留水で軽く洗い 1 %ァリザリンレツド水溶液を加えて 2分間ィンキュペートした。その後蒸留水で何度も洗い、結果をスキヤナ一で取り込んで比較した。

( 8 ) ォステオカルシン量の測定

各細胞（FAT) について、感染から 1、 2、 3週間後の培養上清を回収した。 RAT OSTEOCALCIN EIA KIT (Biomedical Technologies Inc.， Stoughton, MA, USA) を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってォステオカルシン量を計測した。

( 9 ) グリセ口一ルー 3—リン酸デヒドロゲナーゼ（GPDH) 活性の測定各細胞（FAT) について、感染から 3、 7、 10、 14日後のグリセロール一3—リン酸デヒドロゲナーゼ（GPDH) 活性を測定した。測定用サンプルはアルカリフォスファターゼ活性測定用サンプルと同様の方法で調製し、 GPDH活性は GPDH 活性測定キット（WAK0 309- 06141) を用いて測定した。各サンプルの 5 /z lをキットに添付されていた酵素抽出液で 10倍希釈し（50 μ 1)、これに 100 1の反応溶液を加えてマイクロプレートリーダ一で吸収波長 340nmの吸光度の減少を測定した。一分間あたりの吸光度の変化量より GPDH活性ュニットを求めた。

[結果]

1 . 間葉系幹細胞（RMB0)

( 1 ) 細胞数の変化

Cbfal及び VEGF遺伝子を単独あるいは同時導入した細胞（RBM0)の細胞増殖曲線を比較した結果を図 2に示す。その結果、 Cbfal及び VEGF遺伝子を導入した細胞（Adv- Cbfal +Adv_VEGF) と Cbfal遺伝子を単独導入した細胞（Adv- Cbfal) では、非感染細胞（Control, Adv- mock) や VEGF遺伝子を単独導入した細胞 (Adv-VEGF) に比較して顕著に高い細胞増殖能が確認された。細胞の増殖能力の高さは、アデノウィルス感染による細胞へのダメージが低いことを示唆している。

( 2 ) Cbfal及ぴ VEGF遺伝子発現の検出

各細胞（RBM0)における Cbfal及び VEGF遺伝子の発現量をノーザンハイブリダィゼーシヨンにより検出した結果を図 3に示す。図中、左から Control Adv-VEGF, Adv- Cbfal、 Adv- Cbfal +Adv- VEGF の結果を示す。また上段は full lengthの Cbfal cDNA、中段は full lengthの VEGF cDNAを、下段は internal standardとして GAPDHをプローブとして同じメンプレンにハイブリさせた結果である。 Cbfal及び VEGF遺伝子を同時導入した細胞では、感染後 3日目において非常に高い Cbfal及び VEGFの発現が認められた。一方、非感染細胞では Cbfal 及び VEGF遺伝子の発現は観察されなかった。

( 3 ) アルカリフォスファターゼ活性の比較

各細胞（RBM0)におけるアル力リフォスファターゼ活性（ALP activity) の測定結果を図 4に示す。図中、左から Control、 Adv-VEGF, Adv- Cbfal、 Adv- Cbfal +Adv_VEGF、 Adv- mockの結果を示す。 Cbfal及び VEGF遺伝子を同時導入した細胞では、 Cbfal を単独導入した細胞よりも、骨芽細胞の分化マーカーであるァルカリフォスファターゼ活性が顕著に誘導された。一方、非感染細胞（Control) や VEGF遺伝子を単独導入した細胞（Adv- VEGF)ではアル力リフォスファターゼ活性はほとんど確認されなかった。 Osteogenic supplement によっても、アル力リフォスファターゼ活性は誘導されたが、 Cbfal及ぴ VEGF遺伝子を同時導入した細胞に比べると非常に低い値であった。

( 4 ) カルシウム量の測定

各細胞 (RBM0)の、感染後 1、 2、 3週間後におけるカルシウム量の測定結果を図 5に示す。図中、左から Control, Adv-VEGF, Adv- Cbfal、 Adv- Cbfal +Adv- VEGF の結果を示す。 Cbfal及び VEGF遺伝子を同時導入した細胞と、 Cbfalを単独導入した細胞では、顕著なカルシウムの分泌誘導が確認された。一方、非感染細胞（Control) や VEGF遺伝子を単独導入した細胞（Adv- VEGF) ではカルシウムの分泌はほとんど認められなかった。

( 5 ) 石灰化の観察

各細胞（RBM0) を感染後 1、 2、 3週間後にァリザリンレッド染色した結果を図 6に示す。 Cbfalと VEGF遺伝子を同時導入した細胞と、 Cbfalを単独導入した細胞では、石灰化の進行が確認されたが、非感染細胞（Control) や VEGF遺伝子を単独導入した細胞 (Adv - VEGF)では石灰化はほとんど認められなかつた。 2 . 脂肪細胞（FAT)

( 1 ) 細胞数の変化

Cbfal及び VEGF遺伝子を単独あるいは同時導入した細胞 (FAT)の細胞増殖曲線を比較した結果を図 Ίに示す。その結果、 Cbfal及び VEGF遺伝子を導入した細胞（Adv- Cbfal + Adv- VEGF) と Cbfal遺伝子を単独導入した細胞（Adv- Cbfal) では、非感染細胞（Control, Adv- mock) や VEGF遺伝子を単独導入した細胞 (Adv- VEGF) に比較して顕著に高い細胞増殖能が確認された。細胞の増殖能力の高さは、アデノウイルス感染による細胞へのダメージが低いこと、及ぴ脂肪細胞が脱分化して骨芽細胞様細胞へと分化誘導されていることを示唆している。

( 2 ) アルカリフォスファターゼ活性の比較

各細胞（FAT)におけるアルカリフォスファターゼ活性（ALP activity) の測定結果を図 8に示す。図中、左から Control, Adv - VEGFヽ Adv- Cbfal、 Adv- Cbfal +Adv- VEGF、 Adv-mockの結果を示す。 Cbfal及び VEGF遺伝子を同時導入した細胞では、 Cbfal を単独導入した細胞よりも、骨芽細胞の分化マーカーであるァルカリフォスファターゼ活性が顕著に誘導された。一方、非感染細胞（Control) や VEGF遺伝子を単独導入した細胞（Adv- VEGF)ではアル力リフォスファターゼ活性はほとんど確認されなかった。 Osteogenic supplement によっても、アルカリフォスファターゼ活性は誘導されたが、 Cbfal及び VEGF遺伝子導入細胞に比べると非常に低い値であった。 .

( 3 ) ォステオカルシン量の測定

各細胞 (FAT)の、感染後 1、 2、 3週間後における培地中に分泌されたォステオカルシン量の測定結果を図 9に示す。図中、左から Control、 Adv- VEGF、 Adv-Cbfal、 Adv-Cbfal +Adv-VEGFの結果を示す。 Cbfal及び VEGF遺伝子を同時導入した細胞と、 Cbfalを単独導入した細胞では、非感染細胞（Control)や VEGF 遺伝子を単独導入した細胞（Adv- VEGF) に比較して、顕著なォステオカルシンの分泌誘導が確認された。また。 Cbfal及び VEGF遺伝子を同時導入した細胞では、 Cbfal を単独導入した細胞よりも、早期に顕著なォステオカルシンの分泌が誘導された。

( 4 ) カルシウム量の測定

各細胞（FAT)の、感染後 1、 2、 3週間後におけるカルシウム量の測定結果を図 1 0に示す。図中、左から Control、 Adv- VEGF、 Adv- Cbfal、 Adv-Cbfal+Adv-VEGF の結果を示す。 Cbfal及ぴ VEGF遺伝子を同時導入した細胞と、 Cbfalを単独導入した細胞では、非感染細胞（Control) や VEGF遺伝子を単独導入した細胞 (Adv- VEGF) に比較して、顕著なカルシウムの分泌誘導が確認された。 ( 5 ) 石灰化の観察

各細胞（RBM0) を感染後 1、 2、 3週間後にァリザリンレッド染色した結果を図 1 1に示す。 Cbfal及び VEGF遺伝子を同時導入した細胞と、 Cbfalを単独導入した細胞では、石灰化の進行が確認されたが、非感染細胞（Control)や VEGF 遺伝子を単独導入した細胞（Adv- VEGF) では石灰化はほとんど認められなかつた。

( 6 ) グリセロール— 3—リン酸デヒドロゲナーゼ活性の比較

各細胞 (FAT)における GPDH活性の測定結果を図 1 2に示す。図中、左から Control, Adv- VEGF、 Adv- Cbfal、 Adv- Cbfal +Adv- VEGF、 Adv- mock の結果を示す。非感染コントロール（Control) , あるいは空ベクター感染コントロール (Adv-mock) の細胞にのみ、脂肪代謝系の酵素であり、脂肪細胞のマーカーでもある GPDH活性が認められた。本実施例に用いた細胞が、脂肪への分化能を維持していることを示す。実施例 2 ：ラット生体内移植後の骨再生

[方法]

( 1 ) ラット背上皮皮下移植

実施例 1の方法に従い、コンフルェントになった細胞（RBM0あるいは FAT) に Cbfal組換えアデノウィルス及び/又は VEGF組換えアデノウィルスと Creリコンビナーゼ遺伝子組換えアデノウイルスを共感染させた。対照として未処理の細胞を同様に後述の実験に供した。各細胞を円柱形の 0PLAコンポジット（BD Biosciences, 直径 5 mmX高さ 3 mm)に細胞濃度 100万個/ mlで減圧下 (100 mHg) にて吸着させ、翌日ラットの背上皮皮下に移植した。移植後にコンポジットを摘出し、へマトキシリン/ェォジン染色して観察した。

( 2 ) ラット大腿骨欠損部移植

実施例 1の方法に従い、コンフルェントになった細胞（RBM0あるいは FAT) に Cbfal組換えアデノウィルス及び/又は VEGF組換えアデノウィルスと Creリコンビナーゼ遺伝子組換えアデノウィルスを共感染させた。対照として未処理の細胞を同様に後述の実験に供した。各細胞を円柱形の 0PLAコンポジット（BD Biosciences, 直径 5 mmX高さ 3 mm)に細胞濃度 100万個/ mlで減圧下（100 mHg) にて吸着させ、翌日ラットの大腿骨欠損部位に移植した。欠損部位はラットの大腿骨にドリルで 2. 5 mm立方の穴を開けて作製し、そこに上記のコンポジットを移植し、数週間後に摘出した。

( 3 ) 組織切片作製、染色法

摘出したコンポジットを 4% paraformaldehyde, 0. 05% glutaraldehydeでマイク口ウェーブ固定した後、翌日 10% EDTA， 100 mM Tris (pH7. 4)中で約 2週間脱灰した。脱灰後、エタノールで脱水し、レモゾールで透徹し、パラフィンに包埋した。の厚さで切片を作製し、脱パラフィン後、へマトキシリン続いてェォジンで染色した。サンプルは光学顕微鏡（IX- 70, Olympus, Tokyo, Japan)で観察し、 CCDカメラ (CoolSNAP cf, ROPER Scientific)により取り込んだデジタルイメージは MetaMorph softwareで解析した。

[結果]

1 . 間葉系幹細胞（RMB0)

( 1 ) ラット背上皮皮下移植（移植後 8週間目）

ラット背上皮皮下移植 8 週間目におけるコンポジットのへマトキシリン /ェォジン染色像を図 1 3に示す。新生骨のポア（孔）に対して占める割合は、画像解析から、非感染細胞（コントロール）で 18%、 Cbfal遺伝子導入細胞で 51%、 Cbfal, VEGF同時遺伝子導入細胞で 84%であった。 Cbfal及ぴ VEGF遺伝子を同時導入した細胞（Adv- Cbfal +Adv- VEGF) を吸着したコンポジットは、非感染細胞（Control) や VEGF遺伝子を単独導入した細胞（Adv- VEGF) に比較して顕著に高い骨再生が認められる。また、 Cbfal及び VEGF遺伝子を同時導入した細胞 (Adv-Cbfal + Adv- VEGF) を吸着したコンポジットは、 Cbfalを単独導入した細胞（Adv- Cbfal) を吸着したコンポジットと比較して、より多くかつ広範囲な骨再生が観察できる（写真、矢印)。

( 2 ) ラット大腿骨欠損部移植（移植後 5週間目）

ラット大腿骨欠損部移植 5 週間目におけるコンポジットのへマトキシリン / ェォジン染色像を図 1 4に示す。非感染細胞（Control) に比べて Cbfal遺伝子を単独導入した細胞（Adv-Cbfal) を吸着したコンポジットの方が、皮質骨の部分の骨再生が進行しており、皮質骨の欠損部位の大きさが小さくなつてきている様子が観察される。 Cbfal及び VEGF遺伝子を同時導入した細胞（Adv- Cbfal +Adv-VEGF) を吸着したコンポジットは、移植したコンポジットの溶解及び順調な骨再生が観察され、さらに移植したコンポジットと皮質骨の融合が観察できる。

2 . 脂肪細胞（FAT)

( 1 ) ラット背上皮皮下移植（移植後 8週間目）

ラット背上皮皮下移植 8週間目におけるコンポジットのへマトキシリン /ェォジン染色像を図 1 5に示す。 Cbfal 及ぴ VEGF遺伝子を同時導入した細胞 (Adv-Cbfal +Adv-VEGF) を吸着したコンポジットは、 Cbfalを単独導入した細胞（Adv-Cbfal) を吸着したコンポジットよりも、より多くかつ広範囲な骨再生が観察される（写真、矢印)。 ( 2 ) ラット大腿骨欠損部移植（移植後 5週間目）

ラット大腿骨欠損部移植 5週間目におけるコンポジットのへマトキシリン / ェォジン染色像を図 1 6に示す。新生骨のポア（孔）に対して占める割合は、画像解析から、非感染細胞（コント口ール）で Cbfal遺伝子導入細胞で 20%、 Cbfal, VEGF同時遺伝子導入細胞で 35%であった。非感染細胞（Control) に比ベて Cbfal遺伝子を単独導入した細胞（Adv- Cbfal)を吸着したコンポジットの方が、皮質骨の部分の骨再生が進行しており、皮質骨の欠損部位の大きさが小さくなってきている様子が観察される。 Cbfal及び VEGF遺伝子を同時導入した細胞（Adv- Cbfal +Adv_VEGF) を吸着したコンポジットは、移植したコンポジットの溶解及び順調な骨再生が観察され、さらに移植したコンポジットと皮質骨の完全な融合が観察できた。本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。産業上の利用の可能性

本発明によれば、生体から取り出した細胞を培養 ·組織化して限りなく生体に近い骨組織を再構築することができる。本発明の方法は、再生医療の分野で有用である。配列表フリーテキスト

配列番号 1一人工配列の説明：プライマー

配列番号 2—人工配列の説明：プライマー

Claims

請求の範囲

1. 骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子を単離された細胞に導入し、該細胞を三次元培養する工程を含む、骨組織の作製方法。

2. 前記細胞が間葉系幹細胞である、請求項 1に記載の方法。

3. 前記細胞が骨芽細胞である、請求項 1に記載の方法。

4. 前記細胞が脂肪細胞である、請汆項 1に記載の方法。

5. 前記細胞が初代培養細胞である、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。

6. 前記細胞が患者から単離された細胞である、請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の方法。

7. 骨誘導性転写因子が Cbfal、 Cbfb、又は osterixである、請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の方法。

8. 前記細胞を、多孔性ハイドロキシアパタイト、 a- TCP、 β-TCP コラーゲン、ポリ乳酸、ポリダリコール酸、及ぴヒアルロン酸、ならびにこれらの複合体からなる群より選ばれる 1種又は 2種以上の生体適合性材料を足場として三次元培養することを特徴とする、請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の方法。

9. 以下の工程を含む、請求項 7に記載の方法。

1) 生体から単離した細胞をデキサメタゾン、免疫抑制剤、骨形成蛋白質、及び骨形成液性因子からなる群より選ばれる 1種又は 2種以上を用いて分化誘導する、

2 ) 上記細胞に骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子をアデノウィルスベクター、アデノ随伴ベクター、又はレトロウイルスベクターを用いて導入する、 .

3) 上記細胞を多孔性ハイドロキシアパタイト、 a- TCP、 ]3- TCP、コラ一ゲン、ポリ乳酸、ポリダリコール酸、及びヒアルロン酸、ならびにこれらの複合体からなる群より選ばれる 1種又は 2種以上の生体適合性材料を足場として三次元培養する。

1 0 . 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の方法によって作製された骨組織を含むインプラント。