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WO2006085518A1 - 抗体の改良方法 - Google Patents

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WO2006085518A1
WO2006085518A1 PCT/JP2006/302036 JP2006302036W WO2006085518A1 WO 2006085518 A1 WO2006085518 A1 WO 2006085518A1 JP 2006302036 W JP2006302036 W JP 2006302036W WO 2006085518 A1 WO2006085518 A1 WO 2006085518A1
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WO
WIPO (PCT)
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antibody
chain
human
amino acid
family
Prior art date
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Application number
PCT/JP2006/302036
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English (en)
French (fr)
Inventor
Masaharu Torikai
Toshihiro Nakashima
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Original Assignee
Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to CA2596925A priority patent/CA2596925C/en
Priority to US11/815,838 priority patent/US9873730B2/en
Priority to CN2006800113520A priority patent/CN101155832B/zh
Priority to AU2006213321A priority patent/AU2006213321B2/en
Priority to EP06713179.7A priority patent/EP1860120B1/en
Publication of WO2006085518A1 publication Critical patent/WO2006085518A1/ja
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Definitions

  • the present invention relates to a technique for improving properties such as expression level and stability by modifying a human antibody molecule by amino acid substitution.
  • This technology should be a means to improve low production, aggregation, denaturation, and inactivation during handling, which is often a major obstacle in promoting research and development using antibodies. There is expected.
  • Antibody drugs are highly anticipated because they are based on the biological defense mechanism of humans and are molecular targeted therapeutics targeting specific functional molecules.
  • the high level of effectiveness in the oncology field and rheumatology field is supporting the recent global development rush, and the global market scale will continue to expand for a while. It is considered.
  • In vivo antibody sequences are generated by random genetic recombination and mutations that occur as B cells mature, and B cells with more optimized antibody sequences are selected. Multiply. The optimization depends mainly on the antigen-binding ability, but there are other domain stability, heavy chain and light chain interactions, variable region and constant region interactions, protease sensitivity, and cellular strength. Many factors such as secretion efficiency are thought to contribute in a complex way. The Thus, natural antibody sequences are not necessarily optimized for stability.
  • Non-Patent Document 4 improved the stability of the VL domain by performing amino acid substitution of scFv by modifying the 34th position of VL (according to Kabat numbering) and There is a report by Hugo et al. (Non-Patent Document 5) in which the expression level is improved, but these are the antibodies to be modified, and the antibody is a mouse antibody.
  • Non-patent Document 6 there is a report by Ewert et al. (Non-patent Document 6) in which the stability and expression level of scFv are improved by substituting one or more amino acids in VH for human antibodies.
  • the VH6 family is the target of modification here, and the frequency of use of genes belonging to this family is only 1.4-2.4% (Non-patent Document 7), so this is a widely applicable technology. It's hard to say.
  • Non-Patent Document 1 Vriend et al., J. Comput. Aided Mol. Des., 7 (4), p.367-396 (1993)
  • Non-Patent Document 2 Worn et al., Biochemistry, 37, p.13120-13127 (1998)
  • Non-Patent Document 3 Knappik et al., Protein Eng., 8 (1), p.81-89 (1995)
  • Non-Patent Document 4 Steipe et al., J. Mol. Biol, 240, p.188-192 (1994)
  • Non-Patent Document 5 Hugo et al., Protein Eng., 16 (5), p.381-386 (2003)
  • Non-Patent Document 6 Ewert et al., Biochemistry, 42, p. 1517-1528 (2003)
  • Non-Patent Document 7 Brezinschek et al., J. Clin. Invest., 99 (10), p.2488-2501 (1997) Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to target a human antibody or humanized antibody having low immunogenicity to humans, while maintaining low immunogenicity and specific binding properties, and high productivity and excellent It is to establish a general improvement method of antibodies to obtain antibodies with stability. Means for solving the problem
  • the present inventors have conducted extensive research, and as a result, the amino acid of the variable region light chain (VL chain) of a human antibody is substituted with another amino acid sequence to express the antibody. As a result, the present invention has been completed. More specifically, the present invention relates to at least one amino acid at position 8, 12, 15, or 18 (according to Kabat numbering) of a variable region light chain (hereinafter referred to as VL chain) of a human antibody. Substitution with other amino acids except for sting.
  • the present invention includes the following inventions 1) to 18).
  • VL chain variable region light chain
  • VL chain force The method according to any one of the above 1) force 3) belonging to any one of the human VK 1 family, human VK 2 family or human VK 3 family. 5) The amino acid force at each position after substitution of the VL chain belonging to the human VK 1 family.
  • force 4 which is selected from the following amino acid forces.
  • FR1 before substitution of the VL chain belonging to the human V ⁇ 1 family is a VL chain having a sequence derived from DPK9 (GenBank Accession No. X59315).
  • FR1 of the VL chain belonging to the human VK1 family after substitution is an amino acid sequence selected from the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 2 to 7.
  • FR1 of the VL chain belonging to the human VK2 family after substitution is an amino acid sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 9 to 25.
  • FR1 of the VL chain belonging to the human VK3 family after substitution is an amino acid sequence selected from the amino acid sequence powers set forth in SEQ ID NOs: 27 to 30.
  • the antibody is a complete antibody, or Fab, Fab ′, F (ab ′), scAb, scFv, diabody [short Homologous or heterologous variable region heavy chains (VH chains) and recombinant dimeric antibodies that also have VL chain strength] or antibody fragments such as scFv—Fc, or other proteins and other proteins 14.
  • force 13 which is a fusion antibody or fusion antibody fragment, an antibody or antibody fragment to which a low molecular weight label is bound, or an antibody or antibody fragment modified with a polymer modification.
  • VL chain Human antibody or humanized antibody, or at least any of positions 8, 12, 15, or 18 (according to Kabat numbering) of the variable region light chain (hereinafter referred to as VL chain) of human antibody fragment or humanized antibody fragment
  • VL chain variable region light chain
  • a gene encoding the amino acid sequence of an antibody or humanized antibody or human antibody fragment or humanized antibody fragment is prepared, the gene is transformed into a eukaryotic or prokaryotic host, and the human antibody is transformed from the host.
  • a humanized antibody, or a human antibody fragment or a humanized antibody fragment so that the human antibody or humanized antibody, or Recovering the human antibody fragment or humanized antibody fragment.
  • the antibody improving method of the present invention uses human antibodies or humanized antibodies as materials, and the amino acids in the framework region are targeted for modification, the development of antibody drugs as diagnostics or therapeutics Widely available.
  • the amino acids in the framework region are targeted for modification, the development of antibody drugs as diagnostics or therapeutics Widely available.
  • only one amino acid is modified, there is minimal concern about antigenicity when administered to humans.
  • the antibody improvement method of the present invention is expected to greatly contribute to the development of antibody medicine. Furthermore, since the application range of the antibody is not limited to the medical field and is diverse, the present invention can be expected to be applicable to a wide range of fields such as related research and industrial progress.
  • the human antibody or humanized antibody or human antibody or humanized antibody fragment obtained by the improved method of the present invention is excellent in expression level and Z or stability, and loses activity in the purification stage. And the loss due to the formation of aggregates and the like, and can also provide usefulness in antibody production and purification steps. Furthermore, since the improved method of the present invention can naturally provide human antibody molecules or humanized antibody molecules with excellent stability, it can provide many options in formulation design and can provide great advantages in formulation.
  • FIG. 1 shows the structure of a plasmid used for Fab expression.
  • FIG. 2 is a diagram comparing the expression levels of the periplasmic fractions of SEB3-2-7 wild-type and L chain 8-position variant as functional Fab proteins by ELISA.
  • FIG. 3 is a diagram comparing the thermal stability of SEB3-2-7 wild-type and L chain 8-position variant when treated at 42 ° C by ELISA.
  • FIG. 4 ELISA comparison of acid resistance of SEB3-2-7 wild-type and L chain 8-position variant treated with pH 4.5.
  • FIG. 5 is a diagram comparing the expression levels of the RNOK203 wild-type and L-chain 12-mutant culture supernatant fractions as functional Fab proteins by ELISA.
  • FIG. 6 ELISA comparison of the thermal stability of RNOK203 wild-type and L chain 12-position variants treated at 40 ° C.
  • FIG. 7 ELISA comparison of acid resistance of RNOK203 wild-type and L chain 12-position variants treated at pH 4.0.
  • FIG. 8 is a diagram comparing freeze-thaw resistance of RNOK203 wild-type and L chain 12-position variants by ELISA.
  • FIG. 9 is a diagram comparing the expression level of CTLA4-3-l as a Fab protein having a function for the periplasmic fraction of wild type CTLA4-3-l and the L chain 15-position variant.
  • FIG. 10 is a diagram showing the structure of an expression plasmid of a CTLA4- 3-lFab wild-type and P15R variant in which a synthetic oligo DNA encoding E tag is inserted into the C-terminus of the Fd chain.
  • Panel (a) shows the wild type and panel (b) shows the expression plasmid of the P15R variant.
  • FIG. Ll Expression levels of CTLA4-3-l Fab-E wild-type and Fd chain and L chain constituting P15R variant in culture supernatant fraction and periplasm fraction, respectively The figure which compared by Western blot analysis.
  • Panel (a) shows the case where Fd chain is detected by HRP-labeled ant and E tag Ab
  • panel (b) shows the case where L chain is detected by HRP-labeled ant and c-myc tag Ab.
  • Lane 1 Marker
  • Lane 2 CTLA4-3-l Fab-E wild-type culture supernatant fraction
  • Lane 3 CTLA4-3-l Fab-E P15R variant culture supernatant fraction
  • Lane 4 CTLA4-3-1 Fab-E wild-type periplasm fraction
  • Lane 5 CTLA4-3-l Fab- E P15R variant periplasm fraction.
  • FIG. 12 Expression of a complex of Fd chain and L chain in the culture supernatant fraction and periplasm fraction of CTLA4-3-l Fab-E wild type and P15R variant The figure which compared quantity by sandwich ELISA. Panel (a) shows the culture supernatant fraction, and panel (b) shows the periplasmic fraction.
  • FIG. 13 is a diagram comparing the thermal stability of CTLA4-3-l wild-type and L-chain 15-position variant when treated at 28 ° C by ELISA.
  • FIG. 14 is a diagram comparing acid resistance of CTLA4-3-l wild-type and L-chain 15-position variants by ELISA.
  • Panel (a) shows the case treated at pH 4.0
  • panel (b) shows the case treated at pH 3.5.
  • FIG. 15 is a diagram comparing the expression levels of the RNOK203 wild-type and L-chain 15-modified variants as a Fab protein having a function by ELISA.
  • FIG. 16 is a diagram comparing the acid resistance of RNOK203 wild-type and L-chain 15-position variant treated with pH 5.0 by ELISA.
  • Fig. 18 is a diagram comparing acid resistance of the wild-type SEB3-2-7 and L chain 15-position variant by ELISA.
  • Panel (a) shows the case treated at pH 4.5
  • panel (b) shows the case treated at pH 4.0.
  • FIG. 19 ELISA comparison of the thermal stability of RNOK203 wild-type and L chain 18-position variants treated at 45 ° C.
  • FIG. 20 is a diagram comparing the acid resistance of RNOK203 wild-type and L chain 18-position modified when treated at pH 4.0 by ELISA.
  • FIG. 21 is a diagram comparing freeze-thaw resistance of RNOK203 wild-type and L chain 18-position variants by ELISA.
  • the VL chain of the human antibody to be modified includes ⁇ chain or ⁇ chain, but 97% of mouse L chain is a rabbit chain (Immunology Dictionary 2nd edition, 2001, Tokyo Chemical Dojin ) In most humanization technologies, human VK is used as a saddle-type sequence, and in human L chain, ⁇ chain accounts for 67% (Knappik et al., J. Mol. Biol, 296, p.57-86 (2000)), preferably using the kappa chain.
  • VK is known to have VK 1 force as well as VK 6 family.
  • the combined use frequency of VK 1, V ⁇ 2 and V ⁇ 3 is 92%, and human V ⁇ (Foster et al., J. Clin. Invest., 99 (7), p.1614- 1627 (1997)), V ⁇ 1 force V ⁇ 3 It is more preferable to use any of these.
  • the antibody modification strategy is in the framework (FR) 1 region, which is important for maintaining the three-dimensional structure of the human ⁇ antibody VL chain. It is known that the sheet structure may be destroyed, and the amino acid residue proline (Pro; P ) was used for substitution, and amino acid substitution was examined.
  • the present inventors have studied by an evolutionary engineering approach. That is, the amino acid to be modified was replaced with a random amino acid, and a desired modified substance exhibiting properties was selected from the group.
  • VK 1 (anti-SEB antibody SEB3- 2-7): DIVMTQSPSSLSASVGDTVTITC (SEQ ID NO: 1)
  • VK 2 (anti-FasL antibody RNOK203): DWMTQTPLSLPVTLGQPASISC (SEQ ID NO: 8)
  • VK 3 (anti-CTLA-4 antibody CTLA4-3-1): EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO: 26)
  • P8R R (SEQ ID NO: 4)
  • V15R (SEQ ID NO: 6)
  • V15S (SEQ ID NO: 7)
  • P12S (SEQ ID NO: 9)
  • P12H (SEQ ID NO: 1 0
  • P18A (SEQ ID NO: 2 2
  • Model antibodies include human anti-SEB antibody (clone name: SEB3-2-7) and human anti-CTLA-4 antibody (clone name: CTLA4) against the V ⁇ 1, V ⁇ 2, and V ⁇ 3 families. -3-1) and human baboon anti-FasL antibody RNOK were used.
  • the mutagenized VL chain was amplified by the PCR method described above. By substituting this amplified mutagenized VL chain with the VL region of the wild-type Fab expression plasmid, a modified Fab expression plasmid was constructed. JM83 was transformed and a large number of obtained clones were isolated, and expression was induced in a 96-well microtiter plate. Expression Fab in the periplasm fraction was evaluated by Dot Blot, and characterization was performed on clones whose expression was confirmed. Fab is an antibody molecule that can be expressed soluble in Escherichia coli, and is a molecule that allows easy examination of the properties of the variable region.
  • the expression level is determined by, for example, performing induction of induction in a shaker flask culture, performing ELISA using the collected culture supernatant or periplasmic fraction, and having a function for the obtained absorbance. As an indication of the amount of the Fab protein, the clones can be compared and evaluated.
  • the thermal stability can be obtained, for example, by diluting the culture supernatant or periplasmic fraction in which Fab is expressed, treating in a water bath at a predetermined temperature for 2 hours, and then returning to room temperature and performing ELISA.
  • the ratio of the absorbance to the absorbance of the untreated sample can be evaluated as a residual activity by comparing the clones.
  • Resistance to acid is obtained, for example, by diluting the culture supernatant or periplasmic fraction in which Fab is expressed, adjusting to a predetermined pH and allowing to stand for 2 hours, and then neutralizing and performing ELISA.
  • the ratio of the obtained absorbance to the absorbance of the untreated sample can be evaluated by comparing the clones as residual activity.
  • resistance to freezing and thawing is, for example, prepared by repeating a predetermined number of times of freezing and thawing for a culture supernatant or periplasmic fraction in which Fab is expressed, performing ELISA, and The ratio of the absorbance to the absorbance of one sample can be evaluated by comparing the clones as the residual activity.
  • the prepared modified antibody is not only a complete antibody but also an antibody fragment such as Fab, Fab ', F (ab'), scAb, scFv, diabodv, or scFv-Fc. Can be used in
  • antibodies or antibody fragments may be fusion antibodies fused with other proteins or peptides.
  • these expressed antibodies can be used by labeling various drugs, radioactive elements, and the like, and further, synthetic high molecules such as polyethylene glycol can be modified.
  • the antibody or antibody fragment improved according to the present invention uses a gene recombination technique and, based on the gene sequence information encoding them, an appropriate host (eg, bacteria, Bacillus subtilis, yeast, animal). For example, cells).
  • an appropriate host eg, bacteria, Bacillus subtilis, yeast, animal. For example, cells).
  • human rabbit antibody refers to a human antibody in which only the complementarity determining region (CDR) in the variable region is derived from a non-human animal antibody such as a mouse, and the frame in the variable region other than CDR.
  • CDR complementarity determining region
  • FR constant region
  • the JM83 strain (Gene, 33, p.103-119 (1985)) was used.
  • the plasmid pTrc99A-Fabmyc encodes each Fab clone under the control of the trc promoter.
  • the Cys residue at the C-terminal and C ⁇ region at the C-terminus is replaced with Ser, and the disulfide bond between both chains is missing.
  • a c-myc tag is added to the C-terminus of the L chain to facilitate detection.
  • a pelB sequence signal (Lei et al., J. BacterioL, 169, p.4379-4383 (1987)) is inserted in front of the coding region of both strands for secretion into the periplasm and culture supernatant (Fig. 1). .
  • the oligo DNA used was synthesized by SIGMA GENOSYS.
  • a scFv display fuzzy library constructed from peripheral blood lymphocytes from 20 healthy volunteers as a starting material is also a human antibody that specifically recognizes SEB, isolated by the pan-Jung method using recombinant SEB protein.
  • VH has a sequence derived from a segment of DP-75 belonging to the VH1 family
  • VL has a sequence derived from a segment of DPK9 (GenBank Accession No. X59 315) belonging to the V ⁇ 1 family.
  • the amino acid sequence of FR1 of the VL domain is shown in SEQ ID NO: 1.
  • VL has a sequence derived from a segment of DPK18 (GenBank Accession No. X63403) belonging to the VK 2 family.
  • the amino acid sequence of FR1 of the VL domain is shown in SEQ ID NO: 8.
  • a scFv display fuzzy library constructed using lymphocytes derived from peripheral blood from 20 healthy subjects as a starting material
  • a human antibody that specifically recognizes CTLA-4, isolated by pan-jung method using recombinant CTLA-4 protein is there.
  • VH has a sequence derived from a segment of DP-25 belonging to the VH1 family
  • VL has a sequence derived from a segment of DPK22 (GenBank Accession No. X59315) belonging to the V ⁇ 3 family.
  • the amino acid sequence of FR1 of the VL domain is shown in SEQ ID NO: 26.
  • the modification effect confirmed with the Fab molecular type is likely to be retained even when converted to the IgG molecular type. Since most of the current antibody drugs are of the IgG molecular type, the improved technology according to the present invention can be expected to contribute more to the antibody drug field than the known technologies.
  • VH and VL genes were amplified by the PCR method using Pyrobest DNA Polymerase (TAKARA), the VH gene region was Sfil, the VL gene region was Xhol and Cleaved with Notl and inserted in sequence into pTrc99A-Fab-myc vector
  • Transform JM83 as a competent cell and contain 50 g / mL ampicillin It was applied to LB agar medium and cultured overnight at 30 ° C. The obtained clone was isolated and cultured, and a plasmid was prepared by a conventional method, and the DNA base sequence was analyzed.
  • the DNA base sequence of the modified VL gene is converted to CEQ DTCS Quick Start Kit (BECKMAN C
  • the constructed expression strain was analyzed for DNA sequence and confirmed to be as designed.
  • the wild-type Fab expression plasmid is a cocoon type, and the codon at the mutagenesis site is NNK (N is A or
  • the VL gene was amplified by PCR as described above and replaced with the VL region of the wild-type Fab expression plasmid. JM83 was transformed and the resulting clones were induced for expression in 96-well microtiter plates.
  • the expression level was analyzed by Dot Blot.
  • the periplasm fraction obtained above was spotted on a 0.45 ⁇ m-trocellulose filter (Millipore), blocked with PBS_0.05% Tween20 containing 2% skim milk, and then peroxidase (HRP) labeled anti-Fab Ab ( CAPPEL).
  • HRP peroxidase
  • CAPPEL peroxidase labeled anti-Fab Ab
  • the expressed and purified recombinant SEB was immobilized at 200 ng / 100 ⁇ L / well on an ELISA plate (Nunc) at 4 ° C. overnight, washed, and then blocked with 1% BSA-PBS at 4 ° C. overnight.
  • a periplasmic fraction or culture supernatant fraction of the wild-type Z variant of SEB3-2-7 it was diluted with 1% BSA-PBS and reacted at 100 ⁇ L / well for 1 hour at 37 ° C.
  • Detection was performed using a combination of piotinylated anti-Kappa Ab (Southern Biotechnology) and peroxidase (HRP) -labeled streptavidin (Vector Lab.). Absorbance at 650 nm / 450 nm was measured using a microplate reader Vmax (Molecular Devices).
  • SEB3-2-7 wild type / modified periplasmic fractions were serially diluted and subjected to ELISA to compare and evaluate the expression level of the functional Fab protein. As a result, the expression level of SEB3-2-7 P8G variant was improved (Fig. 2).
  • the culture supernatant fraction of the SEB3-2-7 wild-type Z variant was diluted with 1% BSA-PBS, made 50 ⁇ L / tube, and treated in a 42 ° C water bath for 2 hours. Then, it returned to room temperature and the ratio of the light absorbency obtained by performing ELISA with respect to the light absorbency of an untreated sample was shown on the graph as a residual activity. As a result, improved thermal stability was observed for P8T, P8G, P8R and P8S variants of SEB3-2-7 (Fig. 3).
  • the culture supernatant fraction of SEB3-2-7 wild-type Z variant was diluted with 1% BSA-PBS to make 50 ⁇ L / tube.
  • the pH was adjusted to 4.5 using IN HC1 and a pH meter (HORIBA), and treated at 25 ° C for 2 hours. After that, the pH was adjusted to 7 with 1M Tris-HCl (pH 9.5), and the absorbance obtained by performing ELISA was The ratio of the untreated sample to the absorbance is shown in the graph as the residual activity. as a result
  • FasL a commercially available recombinant Fas Ligand (R & D systems) attached with a His-tag was immobilized on an NI chelate plate (Nunc) at 50 ng / 100 ⁇ L / well for 2 hours at room temperature.
  • the culture supernatant fraction of RNOK203 wild-type Z variant was diluted with Block Ace (Dainippon Pharmaceutical) and reacted at 100 L / well for 1 hour at 37 ° C.
  • Detection was performed using a combination of piotinylated ant and Kappa Ab (Southern Biotechnology) and peroxidase (HRP) labeled streptavidin (Vector Lab.). Absorbance at 650 nm / 450 nm was measured using a microplate reader Vmax (Molecular Devices).
  • the culture supernatant fraction of the wild-type Z variant of RNOK203 was serially diluted and subjected to ELISA to compare and evaluate the expression level of the functional Fab protein. As a result, an improvement in the expression level was observed for the P12S variant of RNOK203 (Fig. 5).
  • the culture supernatant fraction of RNOK203 wild-type Z variant was diluted with Block Ace, treated to 50 ⁇ L / tube, and treated in a 40 ° C. water bath for 2 hours. Thereafter, the temperature was returned to room temperature, and the ratio of the absorbance obtained by performing ELISA to the absorbance of the untreated sample was compared as a residual activity and compared between the variants.
  • improved thermal stability was observed for the RNOK203 P12S, P12H, P12V, P12G, P12L, P12R, P12F, P12M and P12E variants. Representative examples are shown in the graph (Fig. 6), and the ratios of the remaining activities to the wild-type remaining activities for the remaining variants are summarized in Table 1.
  • the culture supernatant fraction of the wild-type Z variant of RNOK203 was diluted with Block Ace to make 50 ⁇ L / tu be.
  • the pH was adjusted to 4.0 using IN HC1 and a pH meter (HORIBA), and treated at 25 ° C for 2 hours. Thereafter, the pH was adjusted to 7 with 1M Tris-HCl (pH 9.5), and the ratio of the absorbance obtained by ELISA to the absorbance of the untreated sample was shown as a residual activity in the graph. As a result, improved resistance to acid was observed for the P12V variant of RNOK203 (Fig. 7).
  • CTLA-4 commercially available recombinant CTLA-4 (R & D systems) was immobilized on an ELISA plate (Nunc) for 1 hour at lOOng / 100 / ⁇ L / well, washed, and then washed with Block Ace for 1 hour at room temperature. Blocked. Using the periplasmic fraction of CTLA4-3-1 wild-type Z variant, it was diluted with Block Ace and reacted at 100 / z L / well for 1 hour at 37 ° C. Detection was performed by combining piotinylated ant i-Kappa Ab (Southern Biotechnology) and peroxidase (HRP) -labeled streptavidin (Vector Lab.). Absorbance at 650 nm / 450 nm was measured using a microplate reader Vmax (Molecular Devices). ⁇ Example 20: Evaluation of expression level of L chain 15-position variant using CTLA4-3-1 >>
  • CTLA4-3-1 wild-type Z variant periplasmic fractions were serially diluted and subjected to ELISA to compare and evaluate the expression levels of functional Fab proteins.
  • the expression level of CTLA4-3-1 P15R, P15S and P15G variants was improved (Fig. 9).
  • a force with a dramatic effect of about 100-fold increase has been reported so far. Absent.
  • the Fab expression plasmid was modified.
  • a CTLA4-3-lFab wild-type ZP15R variant expression plasmid was constructed in which a synthetic oligo DNA encoding E tag was inserted into the C-terminus of the Fd chain (referring to the region of the H chain up to VH force CH1) (( Figure 10).
  • a Fab containing an Fd chain to which an E tag is added is called Fab-E.
  • transformation was performed, and the DNA sequence analysis confirmed that the sequence was as designed.
  • the Fd and L chains constituting the Fab can be detected using the E tag for the Fd chain and the C-myc tag for the L chain.
  • Anti-c-myc tag Ab 9E10 was fixed to an ELISA plate (Nunc) at 200 ng / 100 ⁇ L / well for 1 hour at room temperature, washed, and then blocked with 1% BSA-PBS for 1 hour at room temperature. Each collected fraction was diluted with 1% BSA-PBS and reacted at 100 ⁇ L / well for 1 hour at 37 ° C. Detection was performed using HRP-labeled ant and E tag Ab, and the absorbance at 650 nm / 450 nm was measured using a microplate reader Vmax (Molecular Devices).
  • CTLA4-3-1 wild-type Z variant The periplasmic fraction of CTLA4-3-1 wild-type Z variant was diluted with Block Ace to 50 ⁇ L / tube and treated in a 28 ° C. water bath for 2 hours. Thereafter, the temperature was returned to room temperature, and the ratio of the absorbance obtained by performing ELISA to the absorbance of the untreated sample was shown as a residual activity in the graph. As a result, CTLA4-3-1 P15R, P15S, P15G and P15F variants were found to have improved thermal stability (Fig. 13).
  • the periplasmic fraction of CTLA4-3-1 wild type Z variant was diluted with Block Ace to make 50 ⁇ L / tube.
  • the pH was adjusted to 4.0 or 3.5 using IN HC1 and a pH meter (HORIBA), and treated on ice for 2 hours. Thereafter, the pH was adjusted to 7 with 1M Tris-HCl (pH 9.5), and the ratio of the absorbance obtained by ELISA to the absorbance of the untreated sample was shown as a residual activity in the graph.
  • CTLA4-3-1 P15R, P15S, P15G and P15F variants were found to have improved resistance to acid (FIG. 14).
  • the culture supernatant fraction of the wild-type Z variant of RNOK203 was serially diluted and subjected to ELISA to compare and evaluate the expression level of the functional Fab protein. As a result, an improvement in the expression level of the L15R variant of RNOK203 was observed (FIG. 15).
  • the culture supernatant fraction of the wild-type Z variant of RNOK203 was diluted with Block Ace to make 50 ⁇ L / tu be.
  • the pH was adjusted to 5.0 using IN HC1 and a pH meter (HORIBA) and treated at 25 ° C for 2 hours. Thereafter, the pH was adjusted to 7 with 1M Tris-HCl (pH 9.5), and the ratio of the absorbance obtained by ELISA to the absorbance of the untreated sample was shown as a residual activity in the graph.
  • the L15R variant of RNOK203 showed improved resistance to acid (Fig. 16).
  • the culture supernatant fraction of the SEB3-2-7 wild-type Z variant was diluted with 1% BSA-PBS, made 50 ⁇ L / tube, and treated in a 42 ° C water bath for 2 hours. Then, it returned to room temperature and the ratio of the light absorbency obtained by performing ELISA with respect to the light absorbency of an untreated sample was shown on the graph as a residual activity. As a result, improved thermal stability was confirmed for the V15R and V15S variants of SEB3-2-7. (Fig. 17).
  • the culture supernatant fraction of SEB3-2-7 wild-type Z variant was diluted with 1% BSA-PBS to make 50 ⁇ L / tube.
  • the pH was adjusted to 4.5 or 4.0 using IN HC1 and a pH meter (HORIBA) and treated at 25 ° C for 2 hours. Thereafter, the pH was adjusted to 7 with 1M Tris-HCl (pH 9.5), and the ratio of the absorbance obtained by ELISA to the absorbance of the untreated sample was shown as a residual activity in the graph.
  • improved resistance to acid was observed for the V15R and V15S variants of SEB3-2-7 (Fig. 18).
  • the culture supernatant fraction of the RNOK203 wild-type Z variant was diluted with Block Ace to make 50 ⁇ L / tube and treated in a 45 ° C. water bath for 2 hours. Thereafter, the temperature was returned to room temperature, and the ratio of the absorbance obtained by ELISA to the absorbance of the untreated sample was shown in the graph as the residual activity. As a result, improved thermal stability was observed for P18R, P18S and P18F variants of RNOK203 (Fig. 19).
  • the culture supernatant fraction of the wild-type Z variant of RNOK203 was diluted with Block Ace to make 50 ⁇ L / tu be.
  • the pH was adjusted to 4.0 using IN HC1 and a pH meter (HORIBA), and treated at 25 ° C for 2 hours. Thereafter, the pH was adjusted to 7 with 1M Tris-HCl (pH 9.5), and the ratio of the absorbance obtained by performing ELISA to the absorbance of the untreated sample was compared between the variants.
  • improved resistance to acid was observed for the P18F, P18A, P18W, P18L, P18R, P18Q and P18S variants of RNOK203.
  • a representative example is shown in a graph (FIG. 20), and the ratio of each remaining activity to the remaining wild-type activity is summarized in Table 2 for the remaining variants.
  • the human antibody or humanized antibody improvement method of the present invention is in accordance with the 8, 12, 15, or 18 position (Kabat numbering) of the variable region light chain (hereinafter referred to as VL chain) of the human antibody or humanized antibody. ) At least one amino acid is replaced with another amino acid other than proline or cysteine, and the expression level and Z or stability can be improved by substituting only one amino acid at a specific site of a strong antibody. It is possible to obtain improved antibodies. Therefore, the human antibody or humanized antibody with improved expression level and Z or stability obtained by the method of the present invention has high antigen specificity, low immunogenicity, high productivity and improved stability. Because it has excellent features, it is very useful in clinical settings such as human diagnosis and treatment as a specific antibody targeting disease-related antigens.

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Abstract

　抗体の発現量や安定性等の性状を改善する方法を提供する。ヒト抗体またはヒト化抗体の可変領域軽鎖（以下、ＶＬ鎖）の８位、１２位、１５位または１８位（Kabat numberingに従う）の少なくともいずれか一つのアミノ酸をプロリンまたはシステインを除く他のアミノ酸に置換することを特徴とする、ヒト抗体またはヒト化抗体を改良して発現量および／または安定性の向上した抗体を得る方法、および当該方法により得られた、発現量および／または安定性の向上したヒト抗体またはヒト化抗体またはヒト抗体もしくはヒト化抗体フラグメント。

Description

明 細 書
抗体の改良方法
技術分野
[0001] 本発明は、ヒト抗体分子のアミノ酸置換による分子改変を行い、発現量や安定性等 の性状を改善する技術に関する。当該技術は、抗体を用いた研究または開発を推進 する上でしばしば大きな障害となる、産生量の低さや、取り扱い時の凝集や変性、失 活等に対して、それらを改善する手段となることが期待される。
背景技術
[0002] 抗体医薬品は、ヒトの持つ生体防御機構を基盤としており、特定の機能分子をター ゲットとした分子標的治療薬であることから、大きな期待が寄せられている。特に癌分 野やリウマチ分野にぉ 、て高 、有効性が示されつつあることが、近年の世界的な開 発ラッシュを後押しする状況となっており、世界市場規模はしばらく拡大を続けるもの と考えられている。
[0003] そうした社会背景に伴い、抗体医薬または抗体工学の分野においては、著しい技 術の進展が展開されているものの、取得した抗体分子のクローンによっては、産生量 の低さや安定性の低さなど、取り扱いにかなり苦労することもしばしばであり、それら を解決するのは容易ではない。そうした問題が、抗体を用いた研究または開発を推 進する上での大きな障害となって 、る。
[0004] また、抗体医薬品の力かえる課題として、コストの問題が挙げられている。比較的多 量の抗体が治療に必要であり、製造設備等への多額の投資も発生するため、患者の 負担のみならず国の医療費も増大することとなる。従って、抗体医薬品の開発におい ては、生産性の向上を達成し、コストを削減させることが大きな命題となっている。
[0005] 生体内での抗体の配列は、 B細胞の成熟に伴って起こるランダムな遺伝子組換え や突然変異によって生じ、その中でより最適化された抗体配列を有する B細胞が選 択されて増殖する。その最適化は、主には抗原結合能に依存するが、他にもドメイン 安定性、 H鎖と L鎖の相互作用、可変領域と定常領域との相互作用、プロテアーゼ 感受性、更には細胞力もの分泌効率など、多数の因子が複雑に寄与すると考えられ る。よって、必ずしも天然の抗体配列が安定性に関して最適化されているとは言えな い。
[0006] 分離された抗体クローンを組換えタンパク質として発現させ解析しょうとしても、かな り不安定である場合が往々にしてある。その結果、（1)発現量が非常に低い、（2)可 溶性に発現されずに封入体となりリフォールデイングが必要となる、（3)精製の際に 酸に曝すことにより変性が起こってしまう、或いは (4)室温或いは 4°Cでの静置によつ てさえ沈殿や変性が起こり反応性が消失してしまう、といった様々な問題に直面する
[0007] それらの問題を解決するための対処法として、一つ目には、個々の抗体クローン毎 に、操作条件や緩衝液等の至適条件の検討を行うことが考えられる。しかしながら、 その検討には多くの労力とコストを要するば力りでなぐ場合によっては解決すること が出来ずに、有望な反応性を有する抗体クローンのその後の解析或いは開発を断 念せざるを得な 、こともある。
[0008] また二つ目には、抗体の性状を改良するような、アミノ酸置換や分子形体の変換と いった分子改変を行うことが考えられる。通常、蛋白質の安定性を向上させるための 改変の方法としては、ホモロジ一を有する他の配列から、より保存されたアミノ酸を移 植する方法や、コンピューターモデリングを実施して rational designを行い、分子表面 の親水性を上昇させる、または疎水性コアの内部の疎水性を上昇させてパッキング の強度を増カロさせる、などといった方法が検討される (非特許文献 1)。
[0009] 抗体分子のアミノ酸置換による安定性の向上或いは発現量の向上に関して、これ までの報告例では、個々の抗体クローンの配列に特徴的なアミノ酸の改変を行ったも のが多ぐ一般ィ匕しうるような改変技術の例はそれほど多くない。一般ィ匕が可能と考 えられるような改変技術としては、 VHに 1または 2箇所のアミノ酸置換を行うことにより 一本鎖抗体 (scFv)の安定性を向上させた Wornらの報告 (非特許文献 2)や、 VHに 1 または複数箇所のアミノ酸置換を行うことにより Fvフラグメントの発現量を向上させ、 凝集反応を抑制させた Knappikらの報告 (非特許文献 3)、 VLに 1または 2箇所のアミ ノ酸置換を行うことにより VLドメインの安定性を向上させた Steipeらの報告 (非特許文 献 4)、 VLの 34位（Kabat numberingに従う）を改変することによる scFvの安定性およ び発現量を向上させた Hugoらの報告 (非特許文献 5)があるが、これらは改変の対象 として 、る抗体がマウス抗体である。
[0010] 抗体医薬に関しては、マウス抗体を用いると、その高 、免疫原性によって、ヒトに対 して投与した場合、異物として認識'排除される。したがって、それらを疾患の治療薬 剤として用いることは困難である。この問題を解決する方法として、マウスモノクローナ ル抗体を、蛋白工学的手法を用いてキメラ化することが考えられるが、マウス由来の 配列が 3割以上を占めるため、反復投与や長期投与により、投与するキメラ抗体の活 性を阻害するような抗体が作られ、その効果を著しく減弱するだけでなぐ重篤な副 作用を招く可能性がある。
[0011] そのため、マウス可変領域の相補性決定領域 (CDR)をヒト可変領域に移植したヒト 化抗体や、完全にヒト由来の配列を有するヒト抗体を構築することにより、それらの問 題を解決するアプローチが主流となって 、る。
[0012] 一方、ヒト抗体を対象として、 VHに 1または複数箇所のアミノ酸置換を行うことにより scFvの安定性および発現量を向上させた Ewertらの報告 (非特許文献 6)がある。し かし、ここで改変の対象とされたのは VH6ファミリーであり、このファミリーに属する遺 伝子の使用頻度は 1.4〜2.4%に過ぎないため（非特許文献 7)、広く適用可能な技術 とは言い難い。
[0013] 以上のように、疾病関連抗原をターゲットとする特異的抗体は、ヒトの診断や治療と いった臨床の場において非常に有用であるため、高い抗原特異性、低い免疫原性、 および高！ヽ生産性と！/ヽぅ特徴を合わせ持つ抗体の作製技術の確立が広く切望されて いた。
[0014] 非特許文献 1： Vriendら、 J. Comput. Aided Mol. Des., 7(4), p.367- 396 (1993)
非特許文献 2 : Wornら、 Biochemistry, 37, p.13120-13127 (1998)
非特許文献 3 : Knappikら、 Protein Eng., 8(1), p.81- 89 (1995)
非特許文献 4 : Steipeら、 J. Mol. Biol, 240, p.188-192 (1994)
非特許文献 5 : Hugoら、 Protein Eng., 16(5), p.381- 386 (2003)
非特許文献 6 : Ewertら、 Biochemistry, 42, p.1517-1528 (2003)
非特許文献 7 : Brezinschekら、 J. Clin. Invest., 99(10), p.2488- 2501 (1997) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0015] 本発明の課題は、ヒトに対して免疫原性の低いヒト抗体またはヒト化抗体を対象とし て、低い免疫原性および特異的な結合性を保持しつつ、高い生産性および優れた 安定性を有する抗体を得るための抗体の一般的な改良方法を確立することである。 課題を解決するための手段
[0016] 上記のような状況を鑑み、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ヒト抗体の可変領 域軽鎖 (VL鎖）のアミノ酸を他のアミノ酸配列で置換することにより抗体の発現性や 安定性を著しく向上させることに成功し、本発明を完成するに至った。さらに詳細に は、本発明は、ヒト抗体の可変領域軽鎖（以下、 VL鎖）の 8位、 12位、 15位または 18 位（Kabat numberingに従う）の少なくともいずれか一つのアミノ酸をプロリンまたはシ スティンを除く他のアミノ酸に置換することを特徴とするものである。
[0017] すなわち、本発明は、下記 1)〜18)の発明を含むものである。
1)ヒト抗体またはヒト化抗体の可変領域軽鎖（以下、 VL鎖）の 8位、 12位、 15位また は 18位（Kabat numberingに従う）の少なくともいずれか一つのアミノ酸をプロリンまた はシスティンを除く他のアミノ酸に置換することを特徴とする、ヒト抗体またはヒト化抗 体を改良して発現量および Zまたは安定性の向上した抗体を得る方法。
2) VL鎖の 8位、 12位、 15位または 18位のいずれかに位置する少なくとも一つのプ 口リン、または 15位のアミノ酸を、プロリンまたはシスティンを除く他のアミノ酸に置換 することを特徴とする上記 1)に記載の方法。
3)置換後の各位のアミノ酸力 それぞれ下記の!/、ずれかのアミノ酸力 選ばれる上 記 1)または 2)に記載の方法。
8位： Gly, Thr, Argまたは Ser
12位： Ser, His, Val, Gly, Leu, Arg, Phe, Metまたは Glu
15位: Arg, Ser, Glyまたは Phe
18位： Arg, Ser, Phe, Ala, Trp, Leuまたは Gin
4)当該 VL鎖力 ヒト V K 1ファミリー、ヒト V K 2ファミリーまたはヒト V K 3ファミリーのい ずれかに属する上記 1)力 3)のいずれかに記載の方法。 5)ヒト V K 1ファミリーに属する VL鎖の置換後の各位のアミノ酸力 それぞれ下記の いずれかのアミノ酸力 選ばれる上記 1)力 4)のいずれかに記載の方法。
8位： Gly, Thr, Argまたは Ser
15位: Argまたは Ser
6)当該ヒト V κ 1ファミリーに属する VL鎖の置換前の FR1が、 DPK9 (GenBank Acce ssion No. X59315)由来の配列を有する VL鎖である上記 5)に記載の方法。
7)置換後のヒト V K 1ファミリーに属する VL鎖の FR1が、配列番号 2〜7に記載のアミ ノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列である上記 5)または 6)の 、ずれかに記載の方法
8)ヒト V K 2ファミリーに属する VL鎖の置換後の各位のアミノ酸力 それぞれ下記の いずれかのアミノ酸力 選ばれる上記 1)力 4)のいずれかに記載の方法。
12位： Ser, His, Val, Gly, Leu, Arg, Phe, Metまたは Glu
15位： Arg
18位： Arg, Ser, Phe, Ala, Trp, Leuまたは Gin
9)当該ヒト V κ 2ファミリーに属する VL鎖の置換前の FR1が、 DPK18 (GenBank Ac cession No. X63403)由来の配列を有する VL鎖である上記 8)に記載の方法。
10)置換後のヒト V K 2ファミリーに属する VL鎖の FR1が、配列番号 9〜25に記載の アミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列である上記 8)または 9)の 、ずれかに記載の 方法。
1 1 )ヒト V K 3ファミリーに属する VL鎖の置換後の各位のアミノ酸力 下記のいずれか のアミノ酸力 選ばれる上記 1)力 4)のいずれかに記載の方法。
15位: Arg, Ser, Glyまたは Phe
12)当該ヒト V κ 3ファミリーに属する VL鎖の置換前の FR1が、 DPK22 (GenBank A ccession No.X59315)由来の配列を有する VL鎖である上記 11)に記載の方法。
13)置換後のヒト V K 3ファミリーに属する VL鎖の FR1が、配列番号 27〜30に記載 のアミノ酸配列力 選ばれるアミノ酸配列である上記 11)または 12)のいずれかに記 載の方法。
14)当該抗体が、完全抗体、または Fab、 Fab'、 F(ab')、 scAb、 scFv、 diabody [短いリ ンカーペプチドにより連結された同種または異種の可変領域重鎖 (VH鎖）および VL 鎖力もなる組換え二量体抗体]もしくは scFv— Fc等の抗体フラグメント、或 、はそれ らと他の蛋白との融合抗体または融合抗体フラグメント、低分子標識体が結合された 抗体または抗体フラグメント、高分子修飾体で修飾された抗体または抗体フラグメント である上記 1)力 13)のいずれかに記載の方法。
15)アミノ酸置換を遺伝子組換え技術により行う、上記 1)から 14)のいずれかに記載 の方法。
16)上記 1)から 14)のいずれかに記載の方法により得られた、発現量および Zまた は安定性の向上したヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒト化 抗体フラグメント。
17)ヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグメント の可変領域軽鎖（以下、 VL鎖）の 8位、 12位、 15位または 18位（Kabat numberingに 従う）の少なくともいずれか一つのアミノ酸がプロリンまたはシスティンを除く他のアミノ 酸で置換された、発現量および Zまたは安定性の向上した抗体の製造方法であって 、該置換後の VL鎖のアミノ酸配列を含む該ヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体 フラグメントまたはヒト化抗体フラグメントのアミノ酸配列をコードする遺伝子を作製し、 該遺伝子を真核系または原核系生物の宿主に形質転換し、該宿主から該ヒト抗体ま たはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグメントを発現させ、 っ 、で該ヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグ メントを回収することを含む方法。
18)上記 17)に記載の方法により製造された、発現量および Zまたは安定性の向上 したヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグメント
発明の効果
本発明により、ヒト抗体分子のアミノ酸置換による分子改変を行った結果、抗体の発 現量や安定性等の性状を著しく改善することが可能となった。当該技術は、抗体を用 いた研究または開発を推進する上でしばしば大きな障害となる、産生量の低さや、取 り扱い時の凝集や変性、失活等に対して、それらを改善する手段として利用可能とな る。
[0019] さらに、本発明の抗体改良方法は、ヒト抗体或いはヒト化抗体を材料として用い、フ レームワーク領域のアミノ酸を改変の対象としているため、診断薬または治療薬として の抗体医薬品の開発に広く利用可能である。また、僅か 1アミノ酸のみの改変である ため、ヒトに投与する際の抗原性惹起の懸念も最低限に抑えられている。
[0020] 分子改変により熱安定性を向上させることで、 in vivoでの癌組織へのターゲティン グが向上したことも報告されており（Willudaら、 Cancer Res., 59, p.5758-5767 (1999) )、安定性の向上が薬効の向上にもつながることが期待できる。このように、本発明の 抗体改良方法は抗体医療の発展に多大なる貢献をもたらすものと期待される。さらに 、抗体の応用範囲は医療分野に限らず多岐に及ぶことから、本発明は、関連する研 究ゃ産業の進展など広い領域に適用可能であることが期待できる。
[0021] したがって、本発明の改良方法により得られたヒト抗体またはヒト化抗体またはヒト抗 体もしくはヒト化抗体フラグメントは、発現量および Zまたは安定性に優れており、精 製段階における活性の消失や凝集体の生成などによる損失を低下させる効果があり 、抗体生産や精製段階における有用性も提供できる。さらに、本発明の改良方法は 当然安定性に優れたヒト抗体分子またはヒト化抗体分子を提供できることから製剤設 計における多くの選択肢を提供でき、製剤化において大きなメリットを提供しうるもの である。
図面の簡単な説明
[0022] [図 l]Fabの発現に用いたプラスミドの構造を示す図。
[0023] [図 2]SEB3-2-7の野生型および L鎖 8位改変体のペリプラズム画分について、機能を 有する Fab蛋白質としての発現量を ELISAにより比較した図。
[0024] [図 3]SEB3-2-7の野生型および L鎖 8位改変体について、 42°Cで処理した場合の熱 安定性を ELISAにより比較した図。
[0025] [図 4]SEB3-2-7の野生型および L鎖 8位改変体について、 pH4.5で処理した場合の 酸耐性を ELISAにより比較した図。
[0026] [図 5]RNOK203の野生型および L鎖 12位改変体の培養上清画分について、機能を 有する Fab蛋白質としての発現量を ELISAにより比較した図。 [0027] [図 6]RNOK203の野生型および L鎖 12位改変体について、 40°Cで処理した場合の 熱安定性を ELISAにより比較した図。
[0028] [図 7]RNOK203の野生型および L鎖 12位改変体について、 pH4.0で処理した場合の 酸耐性を ELISAにより比較した図。
[0029] [図 8]RNOK203の野生型および L鎖 12位改変体について、凍結融解耐性を ELISAに より比較した図。
[0030] [図 9]CTLA4-3-lの野生型および L鎖 15位改変体のペリプラズム画分について、機 能を有する Fab蛋白質としての発現量を ELISAにより比較した図。
[0031] [図 10]Fd鎖の C末端に E tagをコードする合成オリゴ DNAを挿入した CTLA4- 3- lFa bの野生型および P15R改変体の発現プラスミドの構造を示す図。パネル (a)は野生 型、パネル (b)は P15R改変体の発現プラスミドをそれぞれ示す。
[0032] [図 ll]CTLA4-3-l Fab— Eの野生型および P15R改変体を構成する Fd鎖および L鎖 のそれぞれにつ 、て、培養上清画分およびペリブラズム画分での発現量をウェスタ ンブロット分析により比較した図。パネル (a)は Fd鎖を HRP標識 antト E tag Abにより 検出した場合、パネル (b)は L鎖を HRP標識 antト c-myc tag Abにより検出した場合を それぞれ示す。レーン 1 :マーカー、レーン 2 : CTLA4-3-l Fab— Eの野生型の培養 上清画分、レーン 3 : CTLA4-3-l Fab— Eの P15R改変体の培養上清画分、レーン 4 : CTLA4-3-1 Fab— Eの野生型のペリプラズム画分、レーン 5 : CTLA4-3-l Fab— Eの P15R改変体のペリプラズム画分。
[0033] [図 12]CTLA4-3-l Fab— Eの野生型および P15R改変体の培養上清画分およびペリ プラズム画分にっ 、て、 Fd鎖と L鎖との複合体としての発現量をサンドイッチ ELISA により比較した図。パネル (a)は培養上清画分、パネル (b)はペリブラズム画分をそ れぞれ示す。
[0034] [図 13]CTLA4-3-lの野生型および L鎖 15位改変体について、 28°Cで処理した場合 の熱安定性を ELISAにより比較した図。
[0035] [図 14]CTLA4-3-lの野生型および L鎖 15位改変体について、酸耐性を ELISAにより 比較した図。パネル（a)は pH4.0で処理した場合、パネル (b)は pH3.5で処理した場 合をそれぞれ示す。 [0036] [図 15]RNOK203の野生型および L鎖 15位改変体の培養上清画分について、機能を 有する Fab蛋白質としての発現量を ELISAにより比較した図。
[0037] [図 16]RNOK203の野生型および L鎖 15位改変体について、 pH5.0で処理した場合 の酸耐性を ELISAにより比較した図。
[0038] [図 17]SEB3-2-7の野生型および L鎖 15位改変体について、 42°Cで処理した場合の 熱安定性を ELISAにより比較した図。
[0039] [図 18]SEB3- 2- 7の野生型および L鎖 15位改変体について、酸耐性を ELISAにより比 較した図。パネル（a)は pH4.5で処理した場合、パネル (b)は pH4.0で処理した場合 をそれぞれ示す。
[0040] [図 19]RNOK203の野生型および L鎖 18位改変体について、 45°Cで処理した場合の 熱安定性を ELISAにより比較した図。
[0041] [図 20]RNOK203の野生型および L鎖 18位改変体について、 pH4.0で処理した場合 の酸耐性を ELISAにより比較した図。
[0042] [図 21]RNOK203の野生型および L鎖 18位改変体について、凍結融解耐性を ELISA により比較した図。
発明を実施するための最良の形態
[0043] 改変を行うヒト抗体の VL鎖としては、 λ鎖または κ鎖があるが、マウスの L鎖は 97 %が Κ鎖であるので (免疫学辞典第 2版、 2001年、東京化学同人)、ヒト化技術にお いてはほとんどの場合、ヒト V Kが铸型配列として用いられること、ヒトの L鎖について も、 κ鎖の方が 67%と多数を占めていることから（Knappikら、 J. Mol. Biol, 296, p.57 -86 (2000))、 κ鎖を用いるのが好ましい。
[0044] さらに、ヒト V Kには、 V K 1力も V K 6のファミリーがあることが知られている力 V K 1、 V κ 2、および V κ 3の使用頻度を合わせると 92%となり、ヒト V κの大部分をカバ 一していることになることから（Fosterら、 J. Clin. Invest. , 99(7), p.1614- 1627 (1997)) 、 V κ 1力 V κ 3の 3種のいずれかを用いるのがより好ましい。
[0045] 抗体改変の戦略としては、ヒトイ匕抗体の VL鎖の立体構造維持に重要とされている フレームワーク（FR) 1の領域にあり、フォールデイングの律速となる場合や αヘリック スゃ j8シート構造を壊す場合があることが知られて 、るアミノ酸残基、プロリン (Pro； P )を置換の対象として、アミノ酸置換の検討を行った。
[0046] 具体的には、ヒト抗体またはヒトイ匕抗体の VL鎖の 8位、 12位、 15位または 18位の 少なくともいずれか一つのアミノ酸を改変の対象とした。なお、本明細書において抗 体の VL鎖中のアミノ酸残基の位置の特定は、 Kabatの numbering schemeに従って行 つた (Kabat, E. A.ら、 Sequences of Proteins of Immunological Interest ^弟 b版、 NIH Publication No. 91-3242、 1991)。
[0047] 改変の方法としては、これまでの報告例では、前述したように、 rational designによる アプローチがほとんどであった。より高度に保存されたアミノ酸を移植する方法につ いては、自然界において選択された抗体の配列は、上述の通り抗原結合能、ドメイン 安定性、 H鎖と L鎖の相互作用、可変領域と定常領域との相互作用、プロテアーゼ 感受性、細胞力 の分泌効率など多数の因子が複雑に寄与して選択されたものであ るため、必ずしも天然の抗体配列が安定性に関して最適化されているとは言えず、こ の方法には限界があるということになる。また、コンピューターモデリングを利用する方 法については、大きな労力を要するにも拘わらず、実際に安定性が増すとは限らず、 現時点では効率的なアプローチとは言えない。
[0048] そこで本発明者らは、進化工学的なアプローチによる検討を行った。すなわち、改 変の対象としたアミノ酸をランダムなアミノ酸と置換し、その集団の中から望まし 、性 状を示す改変体を選択した。
[0049] その結果、以下の実施例に示すように、 VL鎖の FR1 (1位〜 23位）において下記 のいずれかのアミノ酸置換が行われたものが発現量や安定性に改善を示すことが確 f*i¾ れ 。
8位： Gly, Thr, Argまたは Ser
12位： Ser, His, Val, Gly, Leu, Arg, Phe, Metまたは Glu
15位: Arg, Ser, Glyまたは Phe
18位： Arg, Ser, Phe, Ala, Trp, Leuまたは Gin
[0050] ここで、置換が行われる元の VL鎖の FR1の配列（wild)の代表例として、以下のアミ ノ酸配列が挙げられる。
V K 1 (抗 SEB抗体 SEB3- 2- 7) ： DIVMTQSPSSLSASVGDTVTITC (配列番号 1) VK 2 (抗 FasL抗体 RNOK203) ： DWMTQTPLSLPVTLGQPASISC (配列番号 8) VK 3(抗 CTLA- 4抗体 CTLA4- 3- 1)： EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC (配列番号 26)
[0051] さらに、詳細には、本発明において下記に示す改変を行い、得られた抗体につい て発現量および安定性 (熱耐性、酸耐性、凍結融解耐性等）について評価した結果 、いずれも顕著な改善効果が確認された。なお、「-」で示した箇所については、野生 型 (wild)のアミノ酸配列と同様であることを意味する。
[0052] (1) V K
wild DIVMTQSPSSLSASVGDTVTITC (配列番号 1 )
P8G G (配列番号 2)
P8T T (配列番号 3)
P8R R (配列番号 4)
P8S
V15R （配列番号 6)
V15S
Figure imgf000012_0001
(配列番号 7)
[0053] ( 2 ) V κ 2
wild： DWMTQTPLSLPVTLGQPASISC (配列番号 8 )
P12S： (配列番号 9 )
P12H： (配列番号 1 0
P12V： (配列番号 1 1
P12G： (配列番号 1 2
P12L： (配列番号 1 3
P12R： (配列番号 1 4
P12F： (配列番号 1 5
P12M： (配列番号 1 6
P12E： (配列番号 1 7
L15R： (配列番号 1 8
P18R： (配列番号 1 9
P18S： (配列番号 2 0
P18F： (配列番号 2 1
P18A： (配列番号 2 2
P18W： (配列番号 2 3
P18L： (配列番号 2 4
P18Q：
Figure imgf000013_0001
(配列番号 2 5
[0054] V K 3
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC (配列番号 2 6
(配列番号 2 7
(配列番号 2 8
(配列番号 2 9
(配列番号 3 0
[0055] これらの改変については、ヒト由来の抗体は言うにおよばず他の動物種由来の抗 体についてすら、これまでの報告例および先行特許でも実施されておらず、本願の 報告が初めての検討例である。
[0056] 特に、 L鎖 15位が Arg (R)に置換された改変体 (P15R)においては、機能性分子とし ての発現量が約 100倍に増加するという劇的な効果を示した。 Fabの 1アミノ酸のみの 置換でこれ程の効果を示した例はこれまでに報告された例がない。また、 L鎖 15位を Argまたは Serに置換することにより、発現量或いは安定性を向上させる改変技術は、 少なくとも V κ 1、 V κ 2および V κ 3のファミリーに対して適用可能であり、汎用性の 高 、技術であることが確認された。
[0057] 本発明におけるアミノ酸置換は、モデル抗体を用いて、 VL鎖の 8位、 12位、 15位、 または 18位にランダムなアミノ酸が導入された改変体ライブラリーをそれぞれ構築し て行った。モデル抗体としては、 V κ 1、 V κ 2および V κ 3の各ファミリーに対して、ヒ ト抗 SEB抗体（クローン名： SEB3- 2- 7)、ヒト抗 CTLA- 4抗体（クローン名： CTLA4- 3- 1) およびヒトイヒ抗 FasL抗体 RNOKをそれぞれ用いた。それぞれの抗体の VL鎖遺伝子 の対象アミノ酸コドンをランダムコドン NNK (Nは Aまたは Cまたは Gまたは T、 Κは Gまた は Τ)で置換したオリゴ DNAプライマーを用いて、野生型 VLを铸型とした PCR法によ り変異導入型 VL鎖を増幅させた。この増幅させた変異導入型 VL鎖を野生型 Fab発 現プラスミドの VL領域と置換することにより、改変型 Fab発現プラスミドを構築した。 J M83に形質転換し、得られたクローンを多数分離して、 96ウェルマイクロタイタープレ ートで発現誘導を行った。ペリブラズム画分における発現 Fabを Dot Blotにより評価し 、発現の確認されたクローンについて性状解析を行った。 Fabは大腸菌で可溶性に 発現可能な抗体分子であると共に、可変領域の性状を簡便に調べることが出来る分 子である。
[0058] 改変型 Fabの発現量比較から、野生型に比べて発現量が高いと思われたクローン について、 DNA塩基配列分析を行い、 1アミノ酸置換体であることを確認した。さらに 、そのクローンに関して、発現量、熱安定性、酸に対する耐性、凍結融解に対する耐 性を評価した。
[0059] 発現量は、例えば、シエイカーフラスコ培養で発現誘導を行 ヽ、回収した培養上清 或いはペリブラズム画分を用いて ELISAを行い、得られた吸光度について、機能を持 つた Fab蛋白質の量を示すものとして、クローン間で比較評価することができる。
[0060] 熱安定性は、例えば、 Fabを発現させた培養上清或いはペリブラズム画分を希釈し て、所定温度の水浴で 2時間処理し、その後、室温に戻して、 ELISAを行い、得られ た吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性として、クローン間 で比較することにより評価することができる。
[0061] 酸に対する耐性は、例えば、 Fabを発現させた培養上清或いはペリブラズム画分を 希釈して、所定 pHに調整して 2時間静置し、その後、中和して ELISAを行い、得られ た吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性として、クローン間 で比較することにより評価することができる。
[0062] さらに、凍結融解に対する耐性は、例えば、 Fabを発現させた培養上清或いはペリ ブラズム画分について、凍結融解を所定回数繰り返したサンプルを用意し、 ELISAを 行い、複数回行ったサンプルの吸光度の、 1回のサンプルの吸光度に対する割合を 残存活性として、クローン間で比較することで評価することができる。
[0063] これらの改変評価の結果、本発明者らは上記で詳述した改変を加えることにより、 抗体の性状を改良することができることを見出した。
[0064] 本発明にお 、て、作製された改変抗体は、完全抗体のみならず、 Fab, Fab'、 F(ab' )、 scAb、 scFv、 diabodv,または scFv—Fc等の抗体フラグメントの形で用いることが
2
出来る。また、それらの抗体または抗体フラグメントは、他の蛋白質或いはペプチドと 融合させた融合抗体であってもよい。またこれらの発現抗体に、各種の薬剤や放射 性元素などを標識して用いることも出来、さらにポリエチレングリコールなどの合成高 分子を修飾することも可能である。
[0065] 本発明により改良した抗体または抗体フラグメントは、遺伝子組換え技術を用い、そ れらをコードする遺伝子配列情報をもとに、適当な宿主 (例えば、細菌、枯草菌、酵 母、動物細胞など）に導入して発現させることによって作製することができる。
[0066] 本明細書において「ヒトイ匕抗体」とは、ヒト抗体において可変領域中の相補性決定 領域 (CDR)のみがマウス等の非ヒト動物抗体由来であり、 CDR以外の可変領域中 のフレームワーク領域 (FR)および定常領域はヒト抗体由来であるものをいう。
[0067] 以下、本願発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本願発明は何らこれらに限 定されるものではない。
実施例
[0068] 《実施例 1：大腸菌株および DNA》
( 1)大腸菌株
JM83株（Gene, 33, p.103- 119 (1985))を用いた。
[0069] (2)プラスミド
プラスミド pTrc99A- Fab- mycは、 trcプロモーターのコントローノレ下で各 Fabクローン をコードする。大腸菌での発現およびフォールデイングをスムーズにするために、 CH 1および C κ領域 C末端の Cys残基は Serに置換されており、両鎖間のジスルフイド結 合は欠損した分子型になっている。検出を容易にするために、 L鎖の C末端に c-myc tagを付加している。ペリブラズムおよび培養上清へ分泌させるため、 pelB配列シグ ナル（Leiら、 J. BacterioL , 169, p.4379- 4383 (1987))を両鎖のコード領域の前方に 挿入している（図 1)。
[0070] (3)オリゴ DNA
利用したオリゴ DNAは SIGMA GENOSYS社にお!、て合成されたものを使用した。
[0071] 《実施例 2 :抗体クローン》
( 1)抗 SEB抗体 SEB3-2-7
健常者 20名由来末梢血由来リンパ球を出発材料として構築した scFvディスプレイフ ァージライブラリ一力も組換え SEB蛋白質を用いたパンユング法により分離した、 SEB を特異的に認識するヒト抗体である。 VHは VH1ファミリーに属する DP-75のセグメン ト由来の配列を、 VLは V κ 1ファミリーに属する DPK9 (GenBank Accession No. X59 315)のセグメント由来の配列を有する。 VLドメインの FR1のアミノ酸配列を配列番号 1に示す。
[0072] (2)抗 FasL抗体 RNOK203
文献（Nakashimaら、 J. Immunol., 167, p.3266-3275 (2001))に報告された、 Fas Liga ndを特異的に認識し、中和能を有するヒト化抗体である。 VLは V K 2ファミリーに属 する DPK18 (GenBank Accession No. X63403)のセグメント由来の配列を有する。 V Lドメインの FR1のアミノ酸配列を配列番号 8に示す。 [0073] (3)抗 CTLA- 4抗体 CTLA4- 3- 1
健常者 20名由来末梢血由来リンパ球を出発材料として構築した scFvディスプレイフ ァージライブラリ一力 組換え CTLA-4蛋白質を用いたパンユング法により分離した、 CTLA-4を特異的に認識するヒト抗体である。 VHは VH1ファミリーに属する DP-25の セグメント由来の配列を、 VLは V κ 3ファミリーに属する DPK22 (GenBank Accessio n No.X59315)のセグメント由来の配列を有する。 VLドメインの FR1のアミノ酸配列を 配列番号 26に示す。
[0074] 《実施例 3：野生型 Fab発現プラスミドの構築》
前述の先行技術や報告例にぉ ヽては、 VLドメイン単独や scFvを用いたものがほと んどであるのに対し、本発明においては Fabを用いて改変の検討を行った。 IgGであ れば動物細胞による発現が必要となるため解析に時間と労力を要するのに対し、フ ラグメントであれば細菌による産生が可能であるため検討が迅速に行えるという利点 を有する。ドメイン単独や scFvに関しては、その VHおよび VLの配列を組み換えて Ig G分子型に変換した際に、おそらく構造の変化によると思われる抗原親和性の低下 等の性状の変化がしばしば起こるのに対し、 Fabでは IgG分子型に変換した際に、そ のような変化は比較的起こりにくいことが知られている。従って、 Fab分子型で確認し た改変の効果は、 IgG分子型に変換した際にも保持される可能性が高いと考えられる 。現行の抗体医薬品はほとんどが IgG分子型であることから、本発明による改良技術 は既知の技術よりも、抗体医薬分野への貢献度が大きいことが期待できる。
[0075] SEB3- 2- 7および CTLA4- 3- 1につ!/、ては scFv発現プラスミド（ベクター； pCANTAB5 E)を、また RNOK203については IgG発現プラスミド（ベクター； pCAG : Gene 108, p.19 3-200, 1991)を出発材料として、 Pyrobest DNA Polymerase (TAKARA社）を用いた P CR法により、 VH遺伝子および VL遺伝子を増幅し、 VH遺伝子領域を Sfilで、 VL遺 伝子領域を Xholおよび Notlで切断し、順番に pTrc99A-Fab-mycベクターに挿入した
[0076] 《実施例 4 :形質転換》
形質転換は、 Gene Pulser (BIO- RAD社）を用い、エレクト口ポレーシヨン法により行 つた。 JM83株をコンビテントセルとして、形質転換し、 50 g/mLのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布、 30°Cで一夜培養した。得られたクローンを分離'培養し、プラス ミドを常法により調製して DNA塩基配列を分析した。
[0077] 《実施例 5 : DNA塩基配列分析》
改変した VL遺伝子の DNA塩基配列を CEQ DTCS Quick Start Kit (BECKMAN C
OULTER)を用いて決定した。構築した発現株については、 DNA塩基配列を解析し、 設計通りの配列であることを確認した。
[0078] 《実施例 6：改変型 Fab発現プラスミドの構築》
野生型 Fab発現プラスミドを铸型として、変異導入部位のコドンを NNK (Nは Aまたは
Cまたは Gまたは T、 Κは Gまたは Τ)としたオリゴ DNAを用いて、上記と同様に、 PCR法 により VL遺伝子を増幅し、野生型 Fab発現プラスミドの VL領域と置換した。 JM83に 形質転換し、得られたクローンにつ ヽて 96ウェルマイクロタイタ一プレートで発現誘導 を行った。
[0079] 《実施例 7：プレート培養による Fabの発現誘導》
96ゥエルプレート（COSTAR)に入れた 50 μ g/mLのアンピシリンを含む 2 X ΥΤ培地 に、上で得られたクローンおよびコントロールとして野生型 Fab発現株を植菌し、 30°C で 5〜6時間培養し、終濃度 ImMになるように IPTGを添カロして、更に一夜培養して Fa bの発現誘導を行った。培養終了後菌体を遠心回収し、 ImM EDTAを含む PBSに懸 濁して氷中に 30分菌体を放置した。次いで 2,000rpmで 15分間遠心し、上清を回収し てペリブラズム画分とした。
[0080] 《実施例8 : 00 810
発現量の解析は、 Dot Blotにより行った。 0.45 μ m-トロセルロースフィルター（Millip ore)に上で得られたペリプラズム画分をスポットし、 2%スキムミルクを含む PBS_0.05%T ween20でブロッキングした後、ペルォキシダーゼ（HRP)標識 anti- Fab Ab (CAPPEL) で検出した。野生型に比べて発現量が高いと思われたクローンについて、上記と同 様にして DNA塩基配列分析を行 ヽ、 1アミノ酸置換体であることを確認できたクローン について、以下の評価を行った。
[0081] 《実施例 9：シエイカー培養による Fabの発現誘導》
50 g/mLのアンピシリンを含む LB寒天培地に大腸菌懸濁液を塗布し、 30°Cで一 夜培養後、シングルコロニーを、 50 g/mLのアンピシリンを含む 2 XYT培地に植菌し 、 30°Cで O.D.600nm=0.5〜1.0まで培養し、終濃度 ImMになるように IPTGを添カ卩して 、更に一夜培養して Fabの発現誘導を行った。培養終了後菌液を遠心し、上清を培 養上清画分とした。沈殿した菌体を、 ImM EDTAを含む PBSに懸濁して氷中に 30分 菌体を放置した。次いで 8,900 X gで 15分間遠心し、上清を回収してペリブラズム画分 とした。
[0082] 《実施例 10： ELISAによる SEB反応性の評価》
発現'精製した組換え SEBを 200ng/100 μ L/wellで、 ELISAプレート（Nunc)に 4°C一 夜固定化し、洗浄後、 1%BSA-PBSで 4°C一夜ブロッキングした。 SEB3-2-7の野生型 Z改変体のペリブラズム画分または培養上清画分を用いて、 1%BSA-PBSで希釈し、 100 μ L/wellで 37°C1時間反応させた。検出は、ピオチン化 anti-Kappa Ab (Southern Biotechnology)とペルォキシダーゼ（HRP)標識ストレプトアビジン（Vector Lab.)とを 組み合わせて行った。 650nm/450nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダー Vm ax (Molecular Devices)を用いて測定した。
[0083] 《実施例 11： SEB3-2-7を用 Vヽた L鎖 8位改変体の発現量の評価》
SEB3-2-7の野生型/改変体のペリプラズム画分にっ 、て段階希釈し、 ELISAを行 つて機能を持った Fab蛋白質の発現量を比較評価した。その結果、 SEB3-2-7の P8G 改変体について、発現量の向上が認められた（図 2)。
[0084] 《実施例 12： SEB3-2-7を用 V、た L鎖 8位改変体の熱安定性の評価》
SEB3-2-7の野生型 Z改変体の培養上清画分を 1%BSA-PBSで希釈し、 50 μ L/tube にして、 42°Cの水浴で 2時間処理した。その後、室温に戻し、 ELISAを行って得られた 吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した 。その結果、 SEB3-2-7の P8T、 P8G、 P8Rおよび P8S改変体について、熱安定性の向 上が認められた（図 3)。
[0085] 《実施例 13： SEB3-2-7を用いた L鎖 8位改変体の酸耐性の評価》
SEB3-2-7の野生型 Z改変体の培養上清画分を 1%BSA-PBSで希釈し、 50 μ L/tube にした。 IN HC1と pHメーター（HORIBA)を用いて pH4.5に調整し、 25°Cで 2時間処理 した。その後、 1M Tris-HCl (pH9.5)で pH7とし、 ELISAを行って得られた吸光度の、 未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した。その結果
、 SEB3-2-7の P8T、 P8G、 P8Rおよび P8S改変体について、酸に対する而性の向上が 認められた（図 4)。
[0086] 《実施例 14： ELISAによる FasL反応性の評価》
FasLについては、 His- tagを付カ卩された市販の組換え Fas Ligand (R&D systems)を 50ng/100 μ L/wellで、 NIキレートプレート（Nunc)に室温 2時間固定化した。 RNOK20 3の野生型 Z改変体の培養上清画分を用いて、ブロックエース (大日本製薬)で希釈 し、 100 L/wellで 37°C1時間反応させた。検出は、ピオチン化 antト Kappa Ab (South ern Biotechnology)とペルォキシダーゼ（HRP)標識ストレプトアビジン（Vector Lab.) とを組み合わせて行った。 650nm/450nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダ 一 Vmax (Molecular Devices)を用いて測定した。
[0087] 《実施例 15： RNOK203を用いた L鎖 12位改変体の発現量の評価》
RNOK203の野生型 Z改変体の培養上清画分にっ 、て段階希釈し、 ELISAを行つ て機能を持った Fab蛋白質の発現量を比較評価した。その結果、 RNOK203の P12S 改変体について、発現量の向上が認められた（図 5)。
[0088] 《実施例 16： RNOK203を用いた L鎖 12位改変体の熱安定性の評価》
RNOK203の野生型 Z改変体の培養上清画分をブロックエースで希釈し、 50 μ L/tu beにして、 40°Cの水浴で 2時間処理した。その後、室温に戻し、 ELISAを行って得られ た吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性として、改変体間で 比較した。その結果、 RNOK203の P12S、 P12H、 P12V、 P12G、 P12L、 P12R、 P12F、 P 12Mおよび P12E改変体について、熱安定性の向上が認められた。代表例について グラフに示し（図 6)、残りの改変体については各々の残存活性の、野生型の残存活 性に対する比率を表 1にまとめた。
[0089] [表 1] 改変体 w i l dとの比較 （％)
P 1 2 S 1 4 0
P 1 2 H 1 5 0
P 1 2 V 2 7 0
P 1 2 G 2 3 0
P 1 2 L 2 5 0
P 1 2 R 1 9 0
P 1 2 F 1 7 0
P 1 2 M 1 4 0
P 1 2 E 2 1 0
[0090] 《実施例 17 : RNOK203を用いた L鎖 12位改変体の酸耐性の評価》
RNOK203の野生型 Z改変体の培養上清画分をブロックエースで希釈し、 50 μ L/tu beにした。 IN HC1と pHメーター（HORIBA)を用いて pH4.0に調整し、 25°Cで 2時間処 理した。その後、 1M Tris-HCl (pH9.5)で pH7とし、 ELISAを行って得られた吸光度の 、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した。その結 果、 RNOK203の P12V改変体について、酸に対する耐性の向上が認められた（図 7)
[0091] 《実施例 18： RNOK203を用いた L鎖 12位改変体の凍結融解耐性の評価》
RNOK203の野生型 Z改変体の培養上清画分にっ 、て、凍結融解を 6回繰り返した サンプルと 1回のみのサンプルを準備して ELISAを行い、凍結融解 1回のサンプルの 吸光度に対する、凍結融解 6回のサンプルの吸光度の割合を残存活性としてグラフ に示した。その結果、 RNOK203の P12S、 P12V、 P12G、 P12L、 P12Rおよび P12F改変 体にっ 、て、凍結融解に対する耐性の向上が認められた（図 8)。
[0092] 《実施例 19： ELISAによる CTLA- 4反応性の評価》
CTLA- 4については、市販の組換え CTLA- 4 (R&D systems)を lOOng/100 /ζ L/well で、 ELISAプレート（Nunc)に室温 1時間固定化し、洗浄後、ブロックエースで室温 1時 間ブロッキングした。 CTLA4-3-1の野生型 Z改変体のペリプラズム画分を用いて、ブ ロックエースで希釈し、 100 /z L/wellで 37°C1時間反応させた。検出は、ピオチン化 ant i- Kappa Ab (Southern Biotechnology)とペルォキシダーゼ（HRP)標識ストレプトアビ ジン (Vector Lab.)とを組み合わせて行った。 650nm/450nmにおける吸光度を、マイ クロプレートリーダー Vmax (Molecular Devices)を用いて測定した。 [0093] 《実施例 20： CTLA4-3-1を用いた L鎖 15位改変体の発現量の評価》
CTLA4-3-1の野生型 Z改変体のペリプラズム画分にっ 、て段階希釈し、 ELISAを 行って機能を持った Fab蛋白質の発現量を比較評価した。その結果、 CTLA4-3-1の P15R、 P15Sおよび P15G改変体について、発現量の向上が認められた（図 9)。特に P 15R改変体に関しては、約 100倍もの上昇という劇的な効果が認められた力 わずか 1 アミノ酸の置換により、機能を有する Fab蛋白の発現量力これ程上昇した例は、これ までに報告されていない。
[0094] 《実施例 21 : CTLA4-3-l Fab— E野生型 ZP15R改変体発現プラスミドの構築》
実施例 20において認められた PI 5R改変による発現量の向上を更に確認するため に、 Fab発現プラスミドの改変を行った。 Fd鎖 (H鎖のうち、 VH力 CH1までの領域 を指す）の C末端に E tagをコードする合成オリゴ DNAを挿入した CTLA4-3-lFabの 野生型 ZP15R改変体の発現プラスミドを構築した（図 10)。以下、 E tagを付加した F d鎖を含む Fabを Fab— Eと呼ぶ。 JM83株をコンビテントセルとして、形質転換を行い 、 DNA塩基配列解析により設計通りの配列であることを確認した。これにより、 Fabを 構成する Fd鎖および L鎖について、 Fd鎖は E tagを利用して、 L鎖は C- myc tagを利 用して検出することが可能となった。
[0095] 構築した CTLA4-3-1 Fab—E野生型ZP15R改変体にっぃて、実施例 9と同様にシ エイカー培養による発現誘導を行 ヽ、培養上清画分およびペリブラズム画分を回収し た。
[0096] 《実施例 22 :ウェスタンブロットによる CTLA4-3-1 Fab— E野生型 ZP15R改変体の発 現量の評価》
実施例 21で得た培養上清画分およびペリブラズム画分にっ 、て、ウェスタンブロッ トにより、 Fd鎖および L鎖の検出を行った。 Fd鎖を HRP標識 anti- E tag Ab (Amersha m Biosciences)で、 L鎖を HRP標識 anti- c- myc tag Ab (Roche)で検出したところ、 Fd 鎖と L鎖のいずれも野生型では検出できないのに対して、 P15R改変体ではほぼ設計 通りの分子量 (Fd鎖 'L鎖それぞれ約 27kDaと約 26kDa)の位置にバンドが検出された (図 11)。これらの結果から、 P15R改変により、 Fd鎖と L鎖のいずれも発現量が向上し ていることが確かめられた。 [0097] 《実施例 23：サンドイッチ ELISAによる CTLA4- 3-1 Fab—E野生型ZP15R改変体の 発現量の評価》
Fd鎖と L鎖が会合 (アセンブリー）し、 Fabとしての分子形態を正しく形成して 、るか を調べるために、以下のサンドイッチ ELISA系での検討を行った。 anti-c-myc tag Ab 9E10を 200ng/100 μ L/wellで、 ELISAプレート（Nunc)に室温 1時間固定化し、洗浄後 、 1%BSA-PBSで室温 1時間ブロッキングした。各回収画分について、 1%BSA-PBSで 希釈し、 100 μ L/wellで 37°C1時間反応させた。検出は HRP標識 antト E tag Abで行い 、 650nm/450nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダー Vmax (Molecular Device s)を用いて測定した。
[0098] その結果、野生型では検出できないのに対して、 P15R改変体では濃度依存の反応 が認められ、特にペリブラズム画分にぉ ヽては P15R改変体で数十倍の高 、反応が 確認された（図 12)。これらの結果から、 P15R改変により、 Fd鎖と L鎖の複合体として の発現量も大幅に向上していることが確かめられた。
[0099] 《実施例 24： CTLA4-3-1を用いた L鎖 15位改変体の熱安定性の評価》
CTLA4-3-1の野生型 Z改変体のペリプラズム画分をブロックエースで希釈し、 50 μ L/tubeにして、 28°Cの水浴で 2時間処理した。その後、室温に戻し、 ELISAを行って 得られた吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフ に示した。その結果、 CTLA4-3-1の P15R、 P15S、 P15Gおよび P15F改変体について 、熱安定性の向上が認められた（図 13)。
[0100] 《実施例 25： CTLA4-3-1を用いた L鎖 15位改変体の酸耐性の評価》
CTLA4-3-1の野生型 Z改変体のペリプラズム画分をブロックエースで希釈し、 50 μ L/tubeにした。 IN HC1と pHメーター（HORIBA)を用いて pH4.0または pH3.5に調整し 、氷上で 2時間処理した。その後、 1M Tris- HCl (pH9.5)で pH7とし、 ELISAを行って 得られた吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフ に示した。その結果、 CTLA4-3-1の P15R、 P15S、 P15Gおよび P15F改変体について 、酸に対する耐性の向上が認められた（図 14)。
[0101] 《実施例 26 : RNOK203の L鎖 15位改変体の構築》
実施例 20から実施例 25に示した、 L鎖 15位を Argまたは Serに改変することによる 効果が、 RNOK203 (L鎖 15位は Leu)においても認められるか否かを検討した。
[0102] 野生型 Fab発現プラスミドを铸型として、 L鎖 15位のコドンを CGT (Arg)および TCT ( Ser)としたオリゴ DNAを用いて、上記と同様に、 PCR法により VL遺伝子を増幅し、野 生型 Fab発現プラスミドの VL領域と置換した。 JM83に形質転換し、得られたクローン について DNA塩基配列を解析し、設計通りの配列であることを確認した。
[0103] 《実施例 27： RNOK203を用いた L鎖 15位改変体の発現量の評価》
RNOK203の野生型 Z改変体の培養上清画分にっ 、て段階希釈し、 ELISAを行つ て機能を持った Fab蛋白質の発現量を比較評価した。その結果、 RNOK203の L15R 改変体について、発現量の向上が認められた（図 15)。
[0104] 《実施例 28： RNOK203を用いた L鎖 15位改変体の酸耐性の評価》
RNOK203の野生型 Z改変体の培養上清画分をブロックエースで希釈し、 50 μ L/tu beにした。 IN HC1と pHメーター（HORIBA)を用いて pH5.0に調整し、 25°Cで 2時間処 理した。その後、 1M Tris-HCl (pH9.5)で pH7とし、 ELISAを行って得られた吸光度の 、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した。その結 果、 RNOK203の L15R改変体について、酸に対する耐性の向上が認められた（図 16)
[0105] 《実施例 29： SEB3-2-7の L鎖 15位改変体の構築》
実施例 20から実施例 28に示した、 L鎖 15位を Argまたは Serに改変することによる 効果が、 SEB3-2_7 (L鎖 15位は Val)においても認められるか否かを検討した。
[0106] 野生型 Fab発現プラスミドを铸型として、 L鎖 15位のコドンを CGT (Arg)および TCT ( Ser)としたオリゴ DNAを用いて、上記と同様に、 PCR法により VL遺伝子を増幅し、野 生型 Fab発現プラスミドの VL領域と置換した。 JM83に形質転換し、得られたクローン について DNA塩基配列を解析し、設計通りの配列であることを確認した。
[0107] 《実施例 30： SEB3-2-7を用いた L鎖 15位改変体の熱安定性の評価》
SEB3-2-7の野生型 Z改変体の培養上清画分を 1%BSA-PBSで希釈し、 50 μ L/tube にして、 42°Cの水浴で 2時間処理した。その後、室温に戻し、 ELISAを行って得られた 吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した 。その結果、 SEB3-2-7の V15Rおよび V15S改変体について、熱安定性の向上が認め られた（図 17)。
[0108] 《実施例 31： SEB3-2-7を用いた L鎖 15位改変体の酸耐性の評価》
SEB3-2-7の野生型 Z改変体の培養上清画分を 1%BSA-PBSで希釈し、 50 μ L/tube にした。 IN HC1と pHメーター（HORIBA)を用いて pH4.5または pH4.0に調整し、 25°C で 2時間処理した。その後、 1M Tris-HCl (pH9.5)で pH7とし、 ELISAを行って得られ た吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示し た。その結果、 SEB3-2-7の V15Rおよび V15S改変体について、酸に対する耐性の向 上が認められた（図 18)。
[0109] 《実施例 32： RNOK203を用いた L鎖 18位改変体の熱安定性の評価》
RNOK203の野生型 Z改変体の培養上清画分をブロックエースで希釈し、 50 μ L/tu beにして、 45°Cの水浴で 2時間処理した。その後、室温に戻し、 ELISAを行って得られ た吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示し た。その結果、 RNOK203の P18R、 P18Sおよび P18F改変体について、熱安定性の向 上が認められた（図 19)。
[0110] 《実施例 33 : RNOK203を用いた L鎖 18位改変体の酸耐性の評価》
RNOK203の野生型 Z改変体の培養上清画分をブロックエースで希釈し、 50 μ L/tu beにした。 IN HC1と pHメーター（HORIBA)を用いて pH4.0に調整し、 25°Cで 2時間処 理した。その後、 1M Tris-HCl (pH9.5)で pH7とし、 ELISAを行って得られた吸光度の 、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性として、改変体間で比較した。 その結果、 RNOK203の P18F、 P18A、 P18W、 P18L、 P18R、 P18Qおよび P18S改変体 について、酸に対する耐性の向上が認められた。代表例についてグラフに示し（図 2 0)、残りの改変体については各々の残存活性の、野生型の残存活性に対する比率 を表 2にまとめた。
[0111] [表 2] 改変体 W i l dとの比較 （％)
P 1 8 F 1 8 0
P 1 8 A 1 6 0
P 1 8 W 2 0 0
P 1 8 L 1 5 0
P 1 8 R 1 6 0
P 1 8 Q 1 7 0
P 1 8 S 1 4 0
[0112] 《実施例 34： RNOK203を用いた L鎖 18位改変体の凍結融解耐性の評価》
RNOK203の野生型 Z改変体の培養上清画分にっ 、て、凍結融解を 6回繰り返した サンプルと 1回のみのサンプルを準備して ELISAを行い、凍結融解 1回のサンプルの 吸光度に対する、凍結融解 6回のサンプルの吸光度の割合を残存活性としてグラフ に示した。その結果、 RNOK203の P18R、 P18Q、 P18S、 P18Fおよび P18L改変体につ いて、凍結融解に対する耐性の向上が認められた（図 21)。
産業上の利用可能性
[0113] 本発明のヒト抗体またはヒト化抗体の改良方法は、ヒト抗体またはヒト化抗体の可変 領域軽鎖（以下、 VL鎖）の 8位、 12位、 15位または 18位（Kabat numberingに従う）の 少なくともいずれか一つのアミノ酸をプロリンまたはシスティンを除く他のアミノ酸に置 換することを特徴とするものであり、力かる抗体の特定部位における 1のみのアミノ酸 置換により発現量および Zまたは安定性の向上した抗体を得ることを可能にするもの である。したがって、本発明の方法により得られる発現量および Zまたは安定性の向 上したヒト抗体またはヒト化抗体は、高い抗原特異性、低い免疫原性、高い生産性お よび安定性の向上と 、つた優れた特徴を合わせ持っため、疾病関連抗原をターゲッ トとする特異的抗体としてヒトの診断や治療といった臨床の場において非常に有用で ある。

Claims

請求の範囲
[1] ヒト抗体またはヒト化抗体の可変領域軽鎖（以下、 VL鎖）の 8位、 12位、 15位また は 18位（Kabat numberingに従う）の少なくともいずれか一つのアミノ酸をプロリンまた はシスティンを除く他のアミノ酸に置換することを特徴とする、ヒト抗体またはヒト化抗 体を改良して発現量および Zまたは安定性の向上した抗体を得る方法。
[2] VL鎖の 8位、 12位、 15位または 18位のいずれかに位置する少なくとも一つのプロ リン、または 15位のアミノ酸を、プロリンまたはシスティンを除く他のアミノ酸に置換す ることを特徴とする請求項 1に記載の方法。
[3] 置換後の各位のアミノ酸が、それぞれ下記のいずれかのアミノ酸力も選ばれる請求 項 1または 2に記載の方法。
8位： Gly, Thr, Argまたは Ser
12位： Ser, His, Val, Gly, Leu, Arg, Phe, Metまたは Glu
15位: Arg, Ser, Glyまたは Phe
18位： Arg, Ser, Phe, Ala, Trp, Leuまたは Gin
[4] 当該 VL鎖力 ヒト V K 1ファミリー、ヒト V K 2ファミリーまたはヒト V K 3ファミリーのい ずれかに属する請求項 1から 3のいずれかに記載の方法。
[5] ヒト V κ 1ファミリーに属する VL鎖の置換後の各位のアミノ酸力 それぞれ下記のい ずれかのアミノ酸力 選ばれる請求項 1から 4のいずれかに記載の方法。
8位： Gly, Thr, Argまたは Ser
15位: Argまたは Ser
[6] 当該ヒト V κ 1ファミリーに属する VL鎖の置換前の FR1が、 DPK9 (GenBank Acces sion No. X59315)由来の配列を有する VL鎖である請求項 5に記載の方法。
[7] 置換後のヒト V κ 1ファミリーに属する VL鎖の FR1が、配列番号 2〜7に記載のアミ ノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列である請求項 5または 6のいずれかに記載の方法
[8] ヒト V κ 2ファミリーに属する VL鎖の置換後の各位のアミノ酸力 それぞれ下記のい ずれかのアミノ酸力 選ばれる請求項 1から 4のいずれかに記載の方法。
12位： Ser, His, Val, Gly, Leu, Arg, Phe, Metまたは Glu 15位： Arg
18位： Arg, Ser, Phe, Ala, Trp, Leuまたは Gin
[9] 当該ヒト V κ 2ファミリーに属する VL鎖の置換前の FR1が、 DPK18 (GenBank Acc ession No. X63403)由来の配列を有する VL鎖である請求項 8に記載の方法。
[10] 置換後のヒト V κ 2ファミリーに属する VL鎖の FR1が、配列番号 9〜25に記載のァ ミノ酸配列力 選ばれるアミノ酸配列である請求項 8または 9のいずれかに記載の方 法。
[11] ヒト V K 3ファミリーに属する VL鎖の置換後の各位のアミノ酸力 下記のいずれかの アミノ酸力 選ばれる請求項 1から 4のいずれかに記載の方法。
15位: Arg, Ser, Glyまたは Phe
[12] 当該ヒト V κ 3ファミリーに属する VL鎖の置換前の FR1が、 DPK22 (GenBank Acc ession No.X59315)由来の配列を有する VL鎖である請求項 11に記載の方法。
[13] 置換後のヒト V κ 3ファミリーに属する VL鎖の FR1が、配列番号 27〜30に記載の アミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列である請求項 11または 12の 、ずれかに記載 の方法。
[14] 当該抗体が、完全抗体、または Fab、 Fab'、 F(ab')、 scAb、 scFv、 diabodyもしくは sc
2
Fv—Fc等の抗体フラグメント、或いはそれらと他の蛋白との融合抗体または融合抗 体フラグメント、低分子標識体が結合された抗体または抗体フラグメント、高分子修飾 体で修飾された抗体または抗体フラグメントである請求項 1から 13のいずれかに記載 の方法。
[15] アミノ酸置換を遺伝子組換え技術により行う、請求項 1から 14のいずれかに記載の 方法。
[16] 請求項 1から 14のいずれかに記載の方法により得られた、発現量および Zまたは 安定性の向上したヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒトイ匕 抗体フラグメント。
[17] ヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグメントの 可変領域軽鎖（以下、 VL鎖）の 8位、 12位、 15位または 18位（Kabat numberingに従 う）の少なくともいずれか一つのアミノ酸がプロリンまたはシスティンを除く他のアミノ酸 で置換された、発現量および Zまたは安定性の向上した抗体の製造方法であって、 該置換後の VL鎖のアミノ酸配列を含む該ヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体 フラグメントまたはヒト化抗体フラグメントのアミノ酸配列をコードする遺伝子を作製し、 該遺伝子を真核系または原核系生物の宿主に形質転換し、該宿主から該ヒト抗体ま たはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグメントを発現させ、 ついで該ヒト抗体またはヒト化抗体を回収することを含む方法。
[18] 請求項 17に記載の方法により製造された、発現量および Zまたは安定性の向上し たヒト抗体またはヒト化抗体、またはヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグメント。
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