WO2006080434A1

WO2006080434A1 - 間葉系幹細胞を含む細胞シート

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Publication number: WO2006080434A1
Application number: PCT/JP2006/301307
Authority: WO
Inventors: Noritoshi Nagaya; Hidezo Mori; Yoshinori Miyahara
Original assignee: Japan Health Sciences Foundation
Current assignee: Japan Health Sciences Foundation
Priority date: 2005-01-27
Filing date: 2006-01-27
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2007-07-27
Also published as: US9782439B2; JP5671670B2; US20090053277A1; JPWO2006080434A1; JP2012205927A; JP5103626B2

Abstract

　間葉系幹細胞は，心筋細胞および血管内皮細胞に分化することができる多分化能を持った細胞である。本発明においては，間葉系幹細胞シートが，その多分化能およびin　situで自己成長しうる性質のため，高度に障害を受けた心臓の治療剤としての可能性を有していることを示す。脂肪組織由来の間葉系幹細胞を培養して間葉系幹細胞シートを作製した。ラットに心筋梗塞を作製し，その４週間後に間葉系幹細胞シートを心臓に移植した。間葉系幹細胞シートは瘢痕化した心筋表面に容易に定着し，in　situで徐々に成長し，4週間で厚い層（約600μm）を形成した。成長した移植間葉系組織は，新たに形成された血管，心筋細胞および未分化な間葉系細胞を含んでいた。定着した間葉系幹細胞は，心筋梗塞をもつラットにおいて，瘢痕領域の心筋壁の菲薄化を抑制し，心機能および生存率を改善した。すなわち，間葉系幹細胞シート移植は，心筋組織再生のための新規な治療方法でありうる。

Description

明細書

間葉系幹細胞を含む細胞シート技術分野

[0001] 本発明は心血管疾患を治療するための方法およびこの方法に用いる細胞シートに関する。

背景技術

[0002] 医学および外科手術の進歩にもかかわらず，うつ血性心不全はなお心血管疾患の罹患率および死亡率の主な原因である（Cohn, JN.. N. Engl. J. Med. 335, 490 -498 (1996))。心不全の主な原因である心筋梗塞は，心筋組織の喪失および左室機能の障害につながる。したがって，瘢痕化した心筋を修復することが，心不全治療には望ましい。心筋組織再生のために骨髄細胞を針で心筋内に注入することはこれまでも行われているが（Liu, J. et al" Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 28 7, H501-511 (2004); Reinlib, L. & Field, L., Circulation 101, El 82-187 ( 2000); Schuster, M.D. et al" Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, H 525-532 (2004); Kocher, A.A. et al., Nat. Med. 7,430-436 (2001); Bel, A. et al" Circulation 108, 11247-252 (2003); Ishida, M. et al" J. Heart Lun g Transplant. 23, 436-445 (2004)) ,心筋梗塞後に薄くなつた瘢痕領域において十分な厚みを持った組織を再生することは困難である。

[0003] 骨格筋芽細胞，胎児心筋細胞，および胚性幹細胞は，心筋組織再生における移植可能な細胞ソースであると考えられてきた（Herreros, J. et al., Eur. Heart. J.

24, 2012-2020 (2003); Skobel, E. et al" Tissue Eng. 10, 849-864 (2004) ； Hodgson, D.M. et al., Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 287, H471— 479 (2004)) oしかし，これらの細胞では血管網の形成がないために，多層の組織を構築することができない。

[0004] 心不全患者の治療法として，注射針を用いた細胞移植による心筋組織再生が行われるようになってきた。しかし，この方法は，厚みのある心筋糸且織を再生することができない。厚みのある心筋組織の再生には，細胞シートの多層構造体が必要であると考えられる。最近，岡野らは，温度応答性培養皿を用いた細胞シートを開発した。細胞シートは，トリプシンのような酵素処理が必要でないため，細胞と細胞との結合および接着蛋白が保持される（Shimizu, T. et al" Circ. Res. 90, e40- 48 (2002); Kushida, A. et al., J. Biomed. Mater. Res. 51, 216—223 (2000); Kushida, A. et al" J. Biomed. Mater. Res. 45, 355—362 (1999); Shimizu, T., Yamat o, M., Kikuchi, A. & Okano, T., Tissue Eng. 7, 141-151 (2001); Shimizu, T et al" J. Biomed. Mater. Res. 60,110—117(2002); Harimoto, M. et al" J. Biomed. Mater. Res. 62, 464-470 (2002))。このような細胞シート製造技術は，心筋組織の再生に有用であると期待される。ただし，これまでの細胞シートでは血管網の形成ができな、ため，十分な厚みのある組織の再生は困難であった (Shimi zu, T et al" J. Biomed. Mater. Res. 60,110—117(2002); Shimizu, T.， Yamat o, M., Kikuchi, A. & Okano, T., Biomaterials 24, 2309—2316 (2003))。

間葉性幹細胞 (MSC)とは，骨髄中に存在し，多分ィ匕能をもつ体性幹細胞である（M akino, S. et al" J. Clin. Invest. 103, 697—705 (1999); Pittenger, M.F. et al, Science 284, 143-147 (1999))。間葉系幹細胞は，骨芽細胞，軟骨細胞，神経細胞，および骨格筋細胞のみならず，血管内皮細胞（Reyes, M. et al, J. Clin . Invest. 109; 337-346 (2002))および心筋細胞（Toma, C, Pittenger, M.R, C ahill, K.S., Byrne B.J. & Kessler, P.D., Circulation 105, 93—98 (2002); Wa ng, J.S. et al" J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 120, 999—1005 (2000); Jiang, Y. et al., Nature 41S, 41-49 (2002))にも分化することができる。間葉系幹細胞は，造血性細胞とは異なり，付着能を持ち，容易に培養増殖させることができる。最近，間葉系幹細胞が脂肪組織力も分離されることが見出された (Rangappa, S., Fen, C, Lee, E.H., Bongso, A. & Wei, E.S., Ann. Thorac. Surg. 75, 775—779 (2003); Zuk, P.A. et al., Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002); Gaustad, K.G., Boquest, A.C., Anderson, B.E., Gerdes, A.M. & Collas, P., Bioche m. Biophys. Res. Commun. 314, 420-427 (2004); Planat— Benard, V. et al., Circulation 109, 656-663(2004))。脂肪組織は心血管疾患を有する肥満患者にとつては重荷にすぎな、ため，患者自身の脂肪組織力も分離した間葉系幹細胞を疾患の再生医療に用いることができれば，臨床上極めて有益であると考えられる。

[0006] 非特許文献 l :Toma, C, Pittenger, M.R, Cahill, K.S., Byrne B.J. & Kessler,

P.D., Circulation 105, 93—98 (2002)

非特許文献 2 : Wang, J.S. et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 120, 999-1005

(2000)

非特許文献 3 : Jiang, Y. et al., Nature 41S, 41-49 (2002)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 本発明は，心不全の新たな治療方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明は，間葉系幹細胞を含む移植用の細胞シートを提供する。好ましくは，間葉系幹細胞は骨髄または脂肪組織に由来するものである。好ましくは，細胞シート上の幹細胞は in situで成長して 100 mまたはそれ以上の厚さの層を形成する。また好ましくは，細胞シート上の幹細胞は in situで成長して心筋および新生血管を誘導する。また好ましくは，細胞シート上の幹細胞は， in situで心筋，血管内皮および血管平滑筋細胞に分化する。

[0009] 別の観点においては，本発明は，患者において心不全を治療する方法であって，患者の心臓に間葉系幹細胞を含む移植用の細胞シートを移植することを含む方法を提供する。

図面の簡単な説明

[0010] [図 1]図 1は，脂肪糸且織由来間葉系幹細胞と骨髄由来間葉系幹細胞の細胞表面マ一力一の比較を示す。

[図 2]図 1は，温度応答性培養皿上で培養した脂肪組織由来間葉系幹細胞を示す

[図 3-1]図 3— 1は間葉系幹細胞シートの定着と成長を示す。

[図 3-2]図 3— 2は間葉系幹細胞シートの定着と成長を示す。

[図 4]図 4は，成長した移植間葉系組織中の間葉系幹細胞の分化を示す。 [図 5]図 5は，間葉系幹細胞シートの移植後の心臓の構造および機能を示す。

[図 6]図 6は，未治療および間葉系幹細胞シート移植を施行した心不全ラットの生存曲線を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0011] 本発明においては，間葉性幹細胞シート移植が心筋梗塞後の心不全治療に有用であることが見出された。本明細書において，「間葉系幹細胞シート」とは，間葉系幹細胞を培養皿上で増殖させて得られる細胞シートをいう。本発明の間葉系幹細胞シートには，未分化の状態を保ったまま増殖した間葉系幹細胞に加え，間葉系幹細胞が分化した線維芽細胞，間質細胞，脂肪細胞，血管内皮細胞，血管内皮前駆細胞，平滑筋細胞， SP細胞および心筋細胞などの他の細胞や，間葉系幹細胞を採取する際に混入した間質細胞，線維芽細胞，脂肪細胞，血管内皮細胞，血管内皮前駆細胞，平滑筋細胞， SP細胞および心筋細胞などの細胞が含まれていてもよい。

[0012] 間葉性幹細胞とは，骨髄中に存在し，多分ィ匕能をもつ体性幹細胞である。間葉系幹細胞は，移植を受けるべき患者の骨髄，脂肪組織，その他の組織力細胞を採取し，慣用の方法により培養することにより，容易に調製することができる。間葉性幹細胞は好ましくは骨髄または脂肪組織力も採取する。細胞のソースとしては，自己成長する性質を有し，かつ心筋細胞および血管内皮細胞に分化しうる体性幹細胞が望ましい。また，移植の際の組織適合性および感染のリスクの観点から，患者の自己体性幹細胞が特に望ましい。

[0013] 培養液としては， 10〜15%の自己血清または牛胎児血清 (FBS)および抗生物質を補充した a -MEMや DMEMを用いることができる。必要に応じて線維芽細胞増殖因子 (bFGF)やアドレノメデュリンなどの成長因子をカ卩えることがある。培養は，哺乳動物の細胞の培養に適する任意の条件で実施することができるが，一般的には 37°C, 5 % COで数日間培養し，必要に応じて培地を交換する。間葉系幹細胞は培養基材

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に接着して増殖する性質を有するため，浮遊して増殖する造血性幹細胞と容易に分離することができる。間葉系幹細胞は， CD29, CD44, CD71, CD90, CD105等の細胞表面マーカーにより容易に確認することができる。また，培養した間葉系幹細胞は ,慣用の方法を用いて凍結保存することが可能である。 [0014] 間葉系幹細胞シートを作製するためには，上述のようにして分離'培養した間葉系幹細胞を数代継代し，トリプシン処理により細胞浮遊液とし，ポリスチレン製等の慣用の培養皿またはコラーゲンシート上に播種する。コンフルェントになるまで培養した後 ,レーザーブレードまたはピンセット等を用いて培養皿底面から間葉系幹細胞を剥がすことにより，間葉系幹細胞シートを作製することができる。

[0015] 温度応答性培養皿を用いて間葉系幹細胞シートを作製するためには，例えば， Shi mizu, T. et al., Circ. Res. 90, e40— 48 (2002); Kushida, A. et al., J. Bio med. Mater. Res. 51, 216—223 (2000); Kushida, A. et al" J. Biomed. Mat er. Res. 45, 355—362 (1999); Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A. & Oka no, T., Tissue Eng. 7, 141—151 (2001); Shimizu, T et al., J. Biomed. Mat er. Res. 60,110—117(2002); Harimoto, M. et al" J. Biomed. Mater. Res. 62 , 464-470 (2002))等に記載されている方法に従うことができる。簡単には， IPAAm モノマー溶液をポリスチレン性の培養皿上に広げ，電子線を照射して， IPAAmを培養皿底面で不動化させる。次に， PIPAAmグラフト表面を四角形のガラスの力バースリツプでマスクし，その表面にアクリルアミド (AAm)モノマー溶液を広げる。次に，電子線を照射して洗浄する。その結果，培養皿の四角形の領域は PIPAAmでグラフトされ（温度応答性），周囲はポリ AAmでグラフトされる（細胞非接着性)。この PIPAAmでダラフトした表面は 37°Cの培養条件では疎水性であり， 32°Cで可逆的に親水性となる。したがって，培養皿表面に付着した培養細胞は，温度を変化させることにより，グラフト表面から自然にはがれる。間葉系幹細胞をこの温度応答性培養皿に播種し，コンフルェントになるまで培養した後，培養温度を 37°C力 32°C以下に変化させることにより，細胞を培養皿力も容易に剥がして，間葉系幹細胞シートを作製することができる。

[0016] 上記のようにして作製した間葉系幹細胞シートは，開胸術中に心臓の心外膜面に貼付することにより，患者の心臓に移植することができる。

[0017] 下記の実施例に示されるように，本発明にしたがって脂肪組織由来の間葉系幹細胞を培養して間葉系幹細胞シートを作製し，この間葉系幹細胞シートをラット心筋梗塞誘発慢性心不全モデルの梗塞巣表面に貼付したところ，間葉系幹細胞は容易に心表面に生着し， in situで徐々に成長し，血管新生を伴いながら厚みのある組織（およそ 600 /z m)を形成した。成長した間葉系組織は，新たに形成された血管，心筋細胞，および未分ィ匕な間葉系細胞力も構成されていた。特に，成長した間葉系組織は多数の血管構造を含んでおり，間葉系幹細胞がシート中で新生血管形成を誘導しうることが見いだされた。このことにより，厚みのある組織の構築が可能となったと考えられる。これらの結果は，シート中の間葉系幹細胞が in situで成長して心筋および新生血管を誘導するとともに，心筋，血管内皮および血管平滑筋細胞に分化することを示す。

[0018] 本発明の間葉系幹細胞シートを移植したラットでは，瘢痕領域の心筋壁の菲薄化が抑制されており，心機能および生存率が改善した。すなわち，本発明にしたがう間葉系幹細胞シートの移植は，心筋組織再生のための新規な治療方法であると考えられる。間葉系幹細胞シート移植の利点は以下のとおりである。第 1に， in situで自己成長する性質のため，瘢痕化した心筋壁の上に厚い層が形成される。第 2に，間葉系幹細胞は多分ィ匕能に加えて血管新生を促進するサイト力インの分泌能力を有するため，心筋細胞へ分ィ匕するだけでなく，成長した間葉系組織内に血管形成が起こる。第 3に，移植された組織の実質的な部分は未分ィ匕な間葉系細胞であり，これはリモデリングの進行を阻害する。新生血管を有する厚い心筋組織が構築されることで，左室壁応力が低下し，心筋梗塞後の心機能が改善される。

[0019] 本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願 2005— 019802号および 2005— 212236号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。

[0020] 以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではな、。

実施例

[0021] 述

心不全モデノレ

すべ飞のプロトコノレ ίま, The National Cardiovascular Research Institute, The Animal Care Ethics Committieのガイドラインにしたがって行われた。体重 185- 220 gのラットを用いた。心筋梗塞モデルは左冠動脈の結紮術により作成した。ベントバルピタールナトリウム (30mg/kg)でラットを全身麻酔した後，人工呼吸下に左開胸切開を行い，心臓を露出させた。次に肺動脈円錐と左心房との間，つまり左冠動脈起始部から 2-3mmの部位を 6-0プロリンで結紮した。シャムコントロール群には，同様の開胸および心臓露出を行ったが，冠動脈結紮は行わな力た。手術後，ラットは標準的な餌および環境で飼育した。

[0022] 実験プロトコル

間葉系幹細胞シート移植を施行した心不全ラット (MSC群： η=14) ,移植を行わな!/ヽ心不全ラット（未治療群： η=14) ,および移植を行わな、シャムコントロールラット（シャム群: n=10)の 3群を用意した。左室全体の 25%以上の梗塞サイズを有するラットのみを慢性心不全モデルとして用いた。冠動脈結紮術の 4週間後， MSC群には瘢痕化した心臓前面に間葉系幹細胞シート移植を行った。他の 2群には，移植操作を伴わない開胸術を施行した。冠動脈結紮術の 4または 8週間後に心カテーテル検査，心ェコ一，および組織学的評価を行った。

[0023] H旨) からの細qの >¾l:feよび焙着

冠動脈結紮術の直後に，各ラットから 0.9— 1.2gの皮下脂肪組織を右風径部力採取した。鋏で脂肪組織を細断し，タイプ 1コラゲナーゼ溶液 (0.1mg/ml)で 37°Cの温浴槽で 1時間震盪した。メッシュフィルター（Costar 3480)で濾過し， 2000rpmで 8分間遠心した後，分離した細胞を 10%FCSおよび抗生物質を加えた a -MEMに浮遊させた。これを 100mmの培養皿に播種し， 5%CO , 37°Cの湿潤環境で培養した。

2

[0024] フローサイトメトリー

培養付着細胞をフローサイトメトリーで分析した。細胞をラット CD34 (ICO- 115) , CD 45 (OX- 1) ,および CD90 (OX- 7)に対する FITC付カ卩マウスモノクローナル抗体とともに 4°Cで 30分間インキュベートした。 FITC付加ノヽムスター抗ラット CD29モノクローナル抗体 (Ha2/5)およびゥサギ抗ラット c-Kitポリクローナル抗体 (C-19)を用いた。コントールとして，同じアイソタイプの抗体を用いた。

[0025] 間系榦細朐シートの調製

ラット脂肪組織由来の間葉系幹細胞を通常のポリスチレン製培養皿またはコラーゲンシート上にコンフルェントになるまで培養した後，レーザーブレードまたはピンセットを用いて培養皿底面から間葉系幹細胞シートとして回収した。

[0026] 温度答件焙着 I を用いた間榦細朐シートの作製

IPAAmモノマー溶液をポリスチレン培養皿上に広げ，電子線 (0.25MGy)を照射して IPAAmを表面に不動化させた後，蒸留水ですすぎ，窒素ガス中で乾燥させる。次に , PIPAAmグラフト表面を四角形のガラスカバースリップ（24x24mm)でマスクする。マスクした培養皿表面にアクリルアミド (AAm)モノマー溶液を広げる。次に，培養皿表面を電子線照射し，洗浄する。その結果，各培養皿の矩形領域は PIPAAmでグラフトされ (温度応答性），その周囲はポリ AAmでグラフトされる（細胞非接着性)。この PIPA Amでグラフトした表面は 37°Cの培養条件では疎水性であり， 32°C以下で可逆的に親水性となる。したがって，ディッシュ表面に付着した培養細胞は，酵素処理なしで回収される。間葉系幹細胞をこの温度応答性培養皿に播種し，コンフルェントになるまで培養した後，培養温度を 37°C力 32°C以下に変化させることにより間葉系幹細胞シートを作製することができる。

[0027] 3から 4継代した脂肪組織由来間葉系幹細胞をトリプシン処理により細胞浮遊液とし , 60mmの温度応答性培養皿に細胞密度 7xl0⁵個/ dishで播種し， 37°Cで培養した。 3 日後，温度応答性培養皿上でコンフルェントとなった間葉系幹細胞を 20°Cで培養した。 40分以内に間葉系幹細胞は自然に剥がれ，間葉系幹細胞シートとして培養液中に浮遊した。この後，間葉系幹細胞シートをピペットチップ内に穏やかに吸引し，ブラスチックシート上に移した。

[0028] 間榦細朐シートの移植

冠動脈結紮術の 4週間後，ラットをペントバルビタールナトリウムで麻酔し，左開胸下に心臓を注意深く露出させた後，間葉系幹細胞シートをプラスチックシート上からすべらせ，心前面の瘢痕上に置いた。移植 20分後に閉胸した。未治療群およびシャム群につヽては，グラフトなしで同じ手術操作を行った。

[0029] 心エコー檢杳

心エコー検査は，冠動脈結紮術の 4および 8週間後に行った。 7.5MHzトランスデューサを備えた心エコーシステムを用いて，乳頭筋レベルの Mモード画像を得た。拡張末期および収縮末期の前，後壁厚，左室拡張末期および収縮末期径，および左室 the American society for Echocardiographyの leading— edge method【こより， 3回の連続心サイクル力も測定した。左室壁応力は， 0.344x左室圧 x{左室径 / ( 1 +後壁厚 Z左室径）} (Douglas, P.S. et al. J. Am. Coll. Cardiol. 9, 945-95 1 (1987))とした。

[0030] 心カテーテル檢杳

心カテーテル検査は，冠動脈結紮術の 8週間後， 2回目の心エコーの後に行った。ペントバルビタールナトリウムで麻酔後， 1.5Fのマイクロマノメータカテーテルを，右総頸動脈を通して左心室に進め，圧を測定した。その後，左右心室および肺を切除し，重量を測定した。梗塞のサイズは，既存の手法を用いて（Chien, Y.W et al. Am. J. Physiol. 254, R185-191 (1988)) ,全左室面積に対する百分率として求めた（各群 n=5) ₀

[0031] 糸 ¾平

心筋の線維化を検出するために，左室心筋 (各群 n=5)を 10%ホルマリンで固定後，パラフィン包埋し，マッソン染色を施行した。また，新たに 5匹のラットを用いて，移植された間葉系幹細胞が血管内皮細胞および心筋細胞に分ィ匕する力否かを調べた。間葉系幹細胞を赤色蛍光色素 (PKH26)で標識し，間葉系幹細胞シートを作製，冠動脈結紮術の 4週間後に移植した。移植 4週間後に心臓を取り出し， OCTに包埋後，液体窒素中で凍結させ，切片を作成した。蛍光免疫染色は，ポリクローナルゥサギ抗フォンビルブラント因子抗体，モノクローナルマウス抗 a SMA,抗デスミン，抗ビメンチン，抗トロポニン Τおよび抗タイプ 1コラーゲン抗体を用いて行った。

[0032] 間葉系幹細胞の in vivoでの成長度を調べる為に， GFP遺伝子組換えラットの皮下脂肪組織から得た GFP発現間葉系幹細胞を用いた。 GFPを発現する間葉系幹細胞シートを，冠動脈結紮術の 4週間後にラットに移植した (n=9)。このラットから移植 4週間後まで毎週凍結切片を作製し， GFP陽性間葉系組織の厚さを蛍光顕微鏡下で測し 7こ。

[0033] サイト力インおよびホルモンの測定

冠動脈結紮術の 4および 8週間後に尾静脈力血液サンプルを採取し，酵素免疫抗体法により血漿 ANF濃度を測定した。間葉系幹細胞シートからの血管新生因子産生量を調べるために，培地交換の 24時間後に，培養液中の VEGFおよび HGFの濃度を酵素免疫抗体法により測定した。

[0034] 生存率

間葉系幹細胞シート移植が予後に及ぼす影響を調べるために， 43匹のラットを無作為に 2群に分けた (MSC群， n=21 ; 未治療群， n=22) _G生存率は，冠動脈結紮術の日力もラットの死亡または 8週間後までを評価した。

[0035] 統 f 学的分析

データは平均士標準誤差で示した。 3群間の多重比較は，一元配置分散分析 New man-Keul検定を施行した。反復を伴う多重比較には，二元配置分散分析と Newman- Keul検定を施行した。 2群間の比較は t検定により行った。 P値が 0.05未満を有意差ありとした。

[0036] ¾

H旨) ^ fe f¾H 糸田の rM^J 分析

細断した脂肪組織を 4日間培養した後，紡錘形の付着細胞が観察された。 3-4 1 代した後，ほとんどの付着細胞は CD29および CD90を発現していた。これに対し，付着細胞の大部分は CD34および CD45につ、て陰性であった。わずかの付着細胞が c -Kitを発現していた（図 la)。骨髄由来間葉系幹細胞もまた， CD29および CD90陽性であり， CD34および CD45は陰性であった（図 lb)。これらの結果は，脂肪組織由来の付着細胞 (間葉系幹細胞)の特徴が骨髄由来間葉系幹細胞と類似していることを示唆する。

[0037] 間榦細朐シートの作製

ラット脂肪組織由来の間葉系幹細胞を通常のポリスチレン製培養皿またはコラーゲンシート上にコンフルェントになるまで培養した後，レーザーブレードまたはピンセット等を用いて培養皿底面力も間葉系幹細胞シートとして回収した。

[0038] この間葉系幹細胞シートをラット心筋梗塞誘発慢性心不全モデルの梗塞巣表面に貼付したところ，間葉系幹細胞は容易に心表面に生着し，血管新生を伴いながら厚みのある組織を形成，移植細胞の一部は心筋細胞に分ィ匕した。 [0039] 移植後 4週間目に心機能を評価したところ，未治療群に比して有為に血行動態の改善を認めた。 MSC群は未治療群に比して有為な体重増力 tl,右室および肺重量の低下を認めており，心不全の進行が軽減していると考えられた。また，左室収縮力の指標である max LV dP/dtを増加させた。間葉系幹細胞シート移植は左室拡大および左室拡張末期圧の上昇を抑制し，梗塞により菲薄化した左室前壁を厚くして収縮能を改善することが明らかとなった。

[0040] [表 1] 表 1 .心筋梗塞誘発ラツト慢性心不全 (CHF)モデルにおける間葉系幹細胞 ( SC)シート移植の循環生理に及ぼす効果

データは平均土 s. e. m.で示される。 * ,対照群に対して Pく 0. 05。対照，未治療 CHFラット群；シート， MSCシート移植 CHFラット群；

治療前，心筋梗塞作製 4週間後：

治療後，移植 4週間後 (心筋梗塞作製 8週間後）。 [0041] [表 2] 表 2.心エコー検査に見られた MSCシート移植の効果

デ一タは平均 ± s. e. m。 *，対照群に対して Pく 0. 05 ; †，治療前に対して Pぐ 0. 05。

AWT,左室前壁厚； PWT,左室後壁厚；治療前，心筋梗塞作製 4週間後; 治療後，移植 4週間後（心筋梗塞作製 8週間後)。

[0042] 温度^容件焙尊 mi 用いた間蔞鈿胞シートの作脂肪組織由来間葉系幹細胞を温度応答性培養皿でコンフルェントとなるまで 3日間培養した。図 2は，播種の 2日後（a)および第 3日（b)における培養間葉系幹細胞を示す。間葉系幹細胞は PIPAAmをグラフトした領域（24x24mm)においてのみ増殖したが，この領域の外では細胞は認められな力つた。培養温度を 37°Cから 20°Cに下げると，細胞は培養皿底面から容易に剥離し (c) , 12x12mmの間葉系幹細胞シートとなった (d)。ピペット操作により間葉系幹細胞シートをプラスチックシートに移して広げた。剥がした後， PIPAAm—グラフト表面に細胞は残っていな力つた。図中， a-c,スケーノレノ一， 100 ^ m;d,スケーノレノ一， 50 mm。

[0043] 間葉系榦細朐シートからの血管新牛.闵子の分泌

24時間の培養中に，間葉系幹細胞シートは大量の血管新生因子および抗アポト一シス因子，例えば血管内皮成長因子 (VEGF=562±70 pg/ml)および肝細胞増殖因子 (HGF=834士 54 pg/ml)を培養液中に分泌した。一方， 10%FCSを補充した培養液自体にはこれらのいずれも 5 pg/ml未満しか含まれていなかった。これらの結果は，間葉系幹細胞自身が内皮細胞に分ィ匕する能力によるのみならず，成長因子によるパラクライン効果によっても，シート中で新生血管形成を誘導することを示唆する。移植された細胞の生存率が低いことが細胞移植による心筋再生治療の主要な問題点の 1つであることを考慮すると，間葉系幹細胞による新生血管形成が厚みのある組織の構築に寄与して、ると考えられる。

[0044] の定羞: よび

移植された間葉系幹細胞シートは，前壁の瘢痕領域に良好に定着した（図 3)。（a, b)移植された間葉系組織 (GFP,緑)および DNA(DAPI,青)。 (c, d)へマトキシリン —ェォシン染色 (a, bの連続切片)。（e) GFP陽性間葉系組織の成長の経時変化。 * ,第 1週における GFP陽性間葉系組織の厚さに対して有意差有り（Pく 0.05)。 (f, g) 写真は未治療群および MSC群の心筋組織切片マッソン染色像を示す。成長した間葉系組織中で多数の血管 (黒小矢印）および心筋構造（白小矢印）が認められる。（h , i)間葉系幹細胞シートの移植により左室拡大が抑制された。 a— d, f, g, xlOO ;h, i, x5。 E,心外膜側; I,心内膜側。大きい矢印は移植された間葉系組織の厚さを示す。 [0045] 蛍光顕微鏡で観察したところ， GFP発現間葉系幹細胞シートは in situで徐々に成長し， 4週間でホスト組織の上に約 600 μ mまでの厚い層として確認された（図 3a— e) 。マッソン染色では，成長した間葉系組織が多数の血管および若干の心筋構造を含むことを示した (図 3g)。定着した間葉系組織は，心臓の前壁厚を増加させ，心筋梗塞後の左室拡大を抑制した（図 3f— i)。ただし，梗塞サイズは未治療群と MSC群との間で有意な差は認めなかった (表 3)。

[0046] 心筋組織の再構築

移植 4週間後，赤色蛍光色素で標識した間葉系幹細胞は，ホスト心筋組織の上に厚い層として確認された (図 4)。（a—c)赤く蛍光標識された MSCが，心外膜側に厚い層として示される。成長した間葉系組織は，フォンビルブラント因子 (緑色）および a SMA (緑色）陽性の多数の血管構造を含んでいた。血管形成に関与しなかった間葉系幹細胞の大部分は，筋線維芽細胞のマーカーである a SMAが陰性であった。 ( d, e)成長した間葉系組織中のいくつかの間葉系幹細胞は，心筋マーカーであるトロポニン Tおよびデスミンが陽性であった (緑色)。これらの結果は，間葉系幹細胞が間葉系組織中で分化して心筋細胞となったことを示唆する。 (f)成長した間葉系組織のほとんどは，未分ィ匕な間葉系細胞のマーカーであるビメンチン (緑色）陽性であった。 (g)ほとんどの間葉系幹細胞は，タイプ 1コラーゲン (緑色）が陰性で，成長した間葉系組織の最外側縁においてのみ検出された。スケールバー， 100 m。 E,心外膜側 ;1,心内膜側。大きい矢印は，定着した間葉系組織の厚さを示す。

[0047] これらの結果は，成長した間葉系組織が多数の未分ィ匕な間葉系細胞を含むことを示唆する。すなわち，成長した間葉系組織は，新たに形成された血管，心筋細胞，および未分化な間葉系細胞から構成されて!、た。

[0048] 移植された間榦細朐シートが心 11蔵の構; ί告および機能にぼす影響

間葉系幹細胞シートの移植後の心臓の構造および機能を図 5に示す。（a— c)心力テーテル検査により得られたパラメータ。（d— f)心エコー所見。（g)血漿中の心房性ナトリウム利尿因子 (ANF)濃度。 LVEDP,左室拡張末期圧; AWT,前壁厚； LVDD, 左室拡張末期径;％FS,左室短縮率。治療前，冠動脈結紮術の 4週間後;治療後，移植手術の 4週間後 (冠動脈結紮術の 8週間後)。データは平均士標準誤差で表示。 * ,シャム群に対して有意差有り（Pく 0.05) ;†,未治療群に対して有意差あり（Pく 0.05 ) ; ί,治療前に対して有意差あり（Ρく 0.05)。

[0049] 左室拡張末期圧の増加および maximumおよび minimum LV dP/dtの低下によつて示されるように，冠動脈結紮術の 8週間後に慢性心不全が発症した。しかし，間葉系幹細胞シート移植は左室拡張末期圧を有意に低下させた（図 5a)。さらに， max L V dP/dtおよび min LV dP/dtは MSC群において有意に改善された（図 5b, c)。 M SC群は，移植の 4週間後に未治療群より有意に体重が増力!]していた (表 3)。平均動脈圧は， MSC群が未治療群より有意に高く，右心室および肺の重量は， MSC群が未治療群よりも有意に低力つた (表 3)。これらの結果は，慢性心不全ラットにおいて間葉系幹細胞シートが血行動態の改善効果を持つことを示唆する。

[0050] 心エコー検査では，間葉系幹細胞シート移植により梗塞を起こした前壁の拡張期壁厚を有意に増カロさせたことを示した（図 5d)。ただし，後壁については有意な相違はな力つた (表 4)。前壁および後壁の壁厚増加率は， MSC群において未治療群より有意に高力つた (表 4)。左室拡張末期径は MSC群では変化しな力つたが，未治療群においては増加する傾向にあった（図 5e)。その結果， 8週間後の左室拡張末期径は MSC群が未治療群よりも有意に小さかった。間葉系幹細胞シート移植は左室短縮率を有意に増力！]させた（図 5f)。拡張期左室壁応力は MSC群が未治療群よりも顕著に低力つた (表 4)。未治療群における血漿中の心房性ナトリウム利尿因子 (ANF)濃度は心筋梗塞の 8週間後に顕著に上昇した（図 5g)。しかし，間葉系幹細胞シート移植は血漿 ANFの増加を抑制した。

[0051] [表 3]

表 3 動物の特徴

シャム:第 1回および第 2回の手術で擬似手術を受けたラット;未治療，第 2回の手術で疑似手術を受けた CHFラット: MSC,単層 MSCを移植したラツト;治療前，冠動脈結紮術の 4 週間後；治療後，移植の 4週間後（冠動脈結紮術の 8週間後）。データは平均 ± s. e. m. で示される。 * ,シャム群に対して Pく 0. 05 ;†,未治療群に対して Pく 0. 05。 4]

表 4 心エコーのデータ

AWT,前壁厚; AW,前壁： PWT,後壁厚； PW，後壁；治療前，冠動脈結紮術の 4週間後：治療後，移植の⁴週間後（冠動脈結紮術の 8週間後）。データは平均士 s. e. m。 * ,シャム群に対して Pく 0. 05 ;†,未治療群に対して Ρ<0. 05 ; φ,治療前に対して Ρ<0. 05。心筋特異的トロポニン Τの免疫組織学的染色に示されるように，全体的な移植細胞の増殖と比較して心筋への分ィ匕はごくわずかであったにもかかわらず，間葉系幹細胞シートの移植により，心機能の顕著な改善が得られた。これらの結果は，梗塞領域の壁の厚さが増加し，これが壁応力の低下につながつたためであると考えられる。

[0053] 生存分析

キャプラン ·マイヤー生存曲線は，冠動脈結紮術後 4週間の生存率は未治療群と Μ SC群との間で有意に相違しなレ、ことを示した（図 6)。しかし，間葉系幹細胞シートの移植後にラットは死ななかった。

[0054] したがって， MSC群の移植後の生存率は，未治療群より顕著に高かった（100% 対 64%,移植の 4週間後の生存率，対数順位 (log-rank)検定， Pく 0.01)。この結果，冠動脈結紮術後の 8週間生存率は， MSC群が 67%であり，未治療群力 5%であった。産業上の利用可能性

本発明に従う間葉系幹細胞シート移植法は，間葉系幹細胞シートを貼付するのみで心筋組織を再生し，心不全の進行を軽減させる新ゝ治療法である。

Claims

請求の範囲

[1] 間葉系幹細胞を含む移植用の細胞シート。

[2] 前記細胞が骨髄または脂肪組織の由来である，請求項 1記載の細胞シート。

[3] 前記幹細胞が in situで成長して 100 mまたはそれ以上の厚さの層を形成する，請求項 1記載の細胞シート。

[4] 前記幹細胞が in situで成長して心筋および新生血管を誘導する，請求項 1記載の細胞シート。

[5] 前記幹細胞が in situで心筋，血管内皮および血管平滑筋細胞に分化する，請求項 1記載の細胞シート。

[6] 患者において心不全を治療する方法であって，前記患者の心臓に間葉系幹細胞を含む移植用の細胞シートを移植することを含む方法。