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WO2006080314A1 - 白血病浸潤精巣に由来する細胞集団から白血病細胞を除去する方法、及びそれに用いられる試薬キット - Google Patents

白血病浸潤精巣に由来する細胞集団から白血病細胞を除去する方法、及びそれに用いられる試薬キット Download PDF

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Publication number
WO2006080314A1
WO2006080314A1 PCT/JP2006/301063 JP2006301063W WO2006080314A1 WO 2006080314 A1 WO2006080314 A1 WO 2006080314A1 JP 2006301063 W JP2006301063 W JP 2006301063W WO 2006080314 A1 WO2006080314 A1 WO 2006080314A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
cells
cell
sperm
fraction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2006/301063
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Akira Tsujimura
Kazutoshi Fujita
Kiyomi Matsumiya
Akihiko Okuyama
Hiroshi Ohta
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka University NUC filed Critical Osaka University NUC
Publication of WO2006080314A1 publication Critical patent/WO2006080314A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C12N5/0093—Purging against cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis

Definitions

  • the present invention relates to a method for completely removing leukemia cells from a cell population of male germ cells obtained with leukemia infiltrating testicular force.
  • the present invention also relates to a reagent kit suitably used for carrying out the above method.
  • the present invention relates to non-human male germ cells from which leukemia cells have been completely removed by the above method, and uses thereof.
  • cancer cells may be mixed with sperm cells and spermatogonia collected before treatment. Even if it is completely cured, there is a risk that the cancer will recur due to subsequent infertility treatment (intratubal transplantation). Thus, the conventionally proposed infertility treatment has a problem of contamination with cancer cells, which is a barrier to clinical application.
  • the purpose of the present invention is to obtain highly purified spermatogonia cells that are completely mixed with cancer cells (leukemia cells) as transplanted sperm cells used for the treatment of male infertility.
  • An object is to provide a method for completely removing leukemia cells from a cell population containing leukemia cells and spermatogonia.
  • Another object of the present invention is to provide a reagent that can be suitably used for carrying out the method.
  • an object of the present invention is to provide a non-human vertebrate sperm cell obtained by the above method and its use.
  • spermatogonial stem cell fraction a cell fraction containing spermatogonial stem cells (hereinafter also referred to as "spermatogonial stem cell fraction"). From the resulting spermatogonial stem cell fraction, cell sorting does not express to spermatogonia cells and is unreactive to both antibodies to surface markers and to surface markers expressed in leukemia cells. White blood by obtaining cell fraction We have found that leukemia cells can be completely isolated or removed from a population of test male germ cells containing diseased cells.
  • the present inventors have confirmed that male germ cells from which leukemia cells have been separated and removed by the above method have the ability to form sperm having normal fertility, and the male sex cells obtained by the method have been confirmed. I was convinced that germ cells could be used effectively to treat male infertility caused by chemotherapy.
  • the present invention has been completed based on strong knowledge.
  • the present invention includes the following embodiments:
  • Item 1 A method of separating or removing leukemia cells from a test male germ cell population containing leukemia cells, wherein the fraction contains spermatogonial stem cells from the test male germ cell population (spermatogonial stem cell fraction) Next, in the fraction, do not express in the spermatogonia !, and obtain a cell fraction that is non-reactive with both the antibody against the surface marker and the antibody against the surface marker expressed on the leukemia cell. Method.
  • Item 2 Surface marker power not expressed in spermatogonia MHC-class I, j8 2-myoglobulin, and Sea-Hari group force At least one selected and a surface marker expressed in leukemia cells Power CD2, CD7, CD10, CD13, CD3, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD33, CD34, CD38, CD45, CD54, CD56, CD65, HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP and Item 2. The method according to Item 1, wherein a group force consisting of TCR is also selected.
  • Item 3 A method performed by flow cytometry, wherein the antibody is directly or indirectly fluorescently labeled as an antibody against a surface marker that is not expressed on spermatogonia and an antibody against a surface marker that is expressed on leukemia cells.
  • Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein an antibody is used to obtain a fraction of cells that have not reacted with the antibody by fluorescence-active fluorescence cell sorting.
  • Item 4 The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the test male germ cell population containing leukemia cells is a population of germ cells obtained from testicular strength of a male vertebrate affected with leukemia.
  • Item 5 A reagent kit for separating or removing leukemic cells from a test male germ cell population containing leukemia cells, and at least as a fluorescently active antibody for cell sorting, it is not expressed in spermatogonia.
  • Antibodies to surface markers and expressed on leukemia cells A reagent kit comprising an antibody against a surface marker.
  • Item 6 Surface marker power not expressed in spermatogonia MHC-class I, j8 2-myoglobulin, and Sea-harness group power At least one surface marker expressed in leukemia cells Power CD2, CD3, CD7, CD10, CD13, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD33, CD34, CD38, CD45, CD54, CD56, CD65, HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP and Item 6.
  • Item 7 A non-human male male obtained by separating and removing leukemia cells from a test male germ cell population containing leukemia cells derived from a non-human male vertebrate by the method of any one of Items 1 to 4. Germ cells.
  • the non-human male germ cell according to Item 8. is transferred into the testes of a donor or similar recipient male vertebrate, and the male vertebrate is mated with a female vertebrate of that species.
  • Item 9 The method according to Item 8, wherein the male vertebrate is an azoospermia non-human male vertebrate.
  • Item 10 Mating is natural mating between a male vertebrate and a female vertebrate of that species, artificial insemination of a female vertebrate by a male vertebrate sperm, in vitro of a female vertebrate egg by a male vertebrate sperm Item 10.
  • Item 11 A method for restoring fertility of an azoospermic non-human male vertebrate, wherein the non-human male germ cell described in Item 7 is treated with an azoospermia donor or a non-human recipient of the same species. Transferring the testis of a male vertebrate.
  • leukemia malignant tumors
  • treated boys have male infertility at reproductive age. It causes great emotional distress to the patient, and urgent measures are urgently needed.
  • leukemia cells can be completely removed from the sperm cell population obtained from leukemia infiltrating testis, so that the sperm cells obtained by the method are used to treat male infertility caused by chemotherapy for boys. Can be suitably used.
  • the method for isolating or removing leukemia cells of the present invention is a method capable of completely isolating or removing leukemia cells from a test male germ cell population containing leukemia cells.
  • a fraction containing a spermatogonial stem cell is obtained from a test male germ cell population containing leukemia cells, and then further expressed from the fraction into a spermatogonia cell. This can be achieved by obtaining a cell fraction that is non-reactive with both the antibody against and the antibody against the surface marker expressed on leukemia cells.
  • the cell population (test cell population) targeted by the method of the present invention is a male germ cell in which leukemia cells are mixed. Usually, the test cell population can also acquire the testicular strength of male vertebrates affected by leukemia.
  • male germ cells include sperm cells and their progenitor cells.
  • Sperm progenitor cells include spermatogonia (including spermatogonial stem cells), spermatocytes, and sperm cells. Preferred are spermatogonia cells (including spermatogonial stem cells) or male germ cells containing at least this.
  • the target vertebrates include humans, non-human primates, dogs, cats, pigs, mice, rats, gerbils, mice, musters, usagis, marine mammals, pachyderms, horses, Mammals such as hidge, pig, and eagle; and birds including ducks, geese, turkeys, and birds.
  • test cell population can be obtained according to methods known in the art. For example, as will be described in detail in Examples described later, the test cell population can also acquire seminiferous tubule strength that can also obtain testicular strength of subjects (including test humans and non-human animals). Specifically, the seminiferous tubule obtained from testis tissue is cut and incubated in a solution containing an enzyme such as spleen trypsin, collagenase type I, or spleen deoxyribonuclease type I (eg, modified DMEM medium). A test cell population (germ cell population) can be obtained by releasing non-damaged cells through an enzymatic reaction.
  • an enzyme such as spleen trypsin, collagenase type I, or spleen deoxyribonuclease type I
  • the seminiferous tubules are prepared by peeling off the testis or a part of the tissue strength of the testis collected from the subject, or the collected testis tissue is collagenase or deoxyribo. It can be prepared from seminiferous tubule tissue obtained by treatment with an enzyme such as nuclease (DNAse).
  • DNAse nuclease
  • cell sorting and recovery techniques known in the art (for example, “The Handbook of Experimental Immunology, 1— 4 ⁇ : A. Radbrucn editors' “Flow Cytometry and ell sorting (Spring Verlag, 1992): and Olweus, J et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94: 1255 1-12556”) Can be used without restriction.
  • flow cytometry particularly flow cytometry with fluorescence active cell sorting is used. That is, the method of the present invention preferably includes the step of subjecting the test cell population prepared by the above method to flow cytometry.
  • the method of the present invention using flow cytometry can be carried out by performing the following steps (a) and (b):
  • test cell population is divided into antibodies against surface markers that are not expressed on spermatogonia (hereinafter “anti-non-progenitor cells-antibody” t) and antibodies against surface markers that are expressed on leukemia cells (hereinafter “pile”). -"Leukemia cells-antibodies”), and
  • MHC-class I labeling step
  • ⁇ 2-myoglobulin and Sca- 1
  • MHC-class J8 2-myoglobulin is a surface marker that is expressed on leukemia cells, but is not limited to CD2, CD3, CD7, CD10, CD13, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22.
  • CD45 is preferred.
  • a combination of a surface marker not expressed in spermatogonia and a surface marker expressed in leukemia cells a combination of MHC-class I and CD45, or a combination of 13 2-myoglobulin and CD45 can be preferably exemplified. .
  • Antibodies used in the present invention are polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies of any isotype (IgA, IgG, IgE, IgD, IgM) as long as they are antibodies against the various surface markers described above.
  • Humanized antibodies eg, Fab fragments containing antigen binding sites, F (ab ') fragments, Fab' fragments, Fv fragments such as scFv, isolated heavy chains (H chains) and light chains (
  • the various surface markers are all known and can be obtained commercially, for example, from BD Biosciences PharMingen .
  • the above step (a) (labeling step) consists of (0) an antibody against a surface marker not expressed in spermatogonia (stake-non-sperm cell-antibody) and an antibody against a surface marker expressed in GO leukemia cells (stake- In combination with leukemia cells-antibodies) and reacting the test cell population with both of these antibodies.
  • Anti-MHC-class I antibody / 3 antibody against 2-myoglobulin (anti- ⁇ 2-myoglobulin antibody), and antibody against Sca-1 (anti-Sca-1 antibody)
  • These can be used, but can also be used in combination of two or more, preferably an anti-MHC-class I antibody or an anti-j8 2-myoglobulin antibody.
  • Anti-leukemic cells-antibodies include the above-mentioned CD2, CD3, CD7, CD10, CD13, CD15, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD33, CD34, CD38, CD45, CD54, CD56, CD65, HLA Antibodies against -DR, HLA-DQ, HLA-DP or TCR (anti-CD2 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD7 antibody, anti-CD10 antibody, anti-CD13 antibody, anti-CD14 antibody, anti-CD15 antibody Anti-CD19 antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD21 antibody, anti-CD22 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD 34 antibody, anti-CD38 antibody, anti-CD45 antibody, anti-CD54 antibody, anti-CD56 antibody, anti-CD65 antibody, anti-HLA-DR antibody, anti-HLA-DQ antibody, anti-HLA-DP antibody or The ability to use any one of anti-TCR antibodies) It is also possible to use a combination of two
  • These antibodies are preferably labeled with a fluorescent dye in order to perform fluorescence active cell sorting.
  • a fluorescent dye those known in the art as fluorescent dyes for flow cytometry can be arbitrarily used.
  • fluorescein isothiocyanate FITC
  • PE phycoerythrin
  • PE-Cy5 PE-Cyanin5
  • PE-Cy5.5 PE-Cyanin5.5
  • PE-Cy5 PE-) Cyanin7
  • rhodamine isothiocyanate Texas Red, ECD (PE-Texas Red-x), Arophycosanine (APC), APC-Cy7 (APC-Cyanin 7, PharRed), Per—CP (Peridinin Chlorophyll Protein), and PerCP-Cy5.5 (Per-CP-Cyanin5.5).
  • the labeling can be performed by covalently binding the fluorescent dye to the antibody, and methods known in the art can be used for strong binding (for example, E. Har low & D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Old Spring Harbor Laboratory Presess, Cold Spring Harbor, New York, 1988)).
  • an antibody pre-labeled with a fluorescent dye for example, “fluorescent-labeled antibody for flow cytometry”
  • the antibody of the present invention is preferably labeled with a fluorescent dye, but it does not limit the use of other labels such as a chemiluminescent label or a bioluminescent label.
  • the above antibody may be labeled with a fluorescent dye, or may be one that can be labeled with a fluorescent dye.
  • a strong antibody include an antibody treated with piotin or streptavidin.
  • the antibody can be indirectly labeled with a fluorescent dye through a piotine avidin reaction by reacting with a fluorescent dye-conjugated streptavidin or piotin.
  • antibodies not labeled with fluorescent dyes Can be indirectly labeled with a fluorescent dye by reacting with the secondary antibody labeled with the fluorescent dye.
  • the reaction between the test cell population and the antibody consists of an antigen (surface marker) that is expressed on the cell surface and the antibody against it.
  • an antigen surface marker
  • a buffered saline solution such as a phosphate buffered saline solution that is isotonic or equivalent to the test cell can be used as a reaction solvent, although not particularly limited as long as this is the case.
  • step (b) flow cytometry step.
  • the flow cytometry process consists of b-1) gating the spermatogonial stem cell fraction (gating process), and b-2) gating the spermatogonial stem cell fraction.
  • gating process gating process
  • b-2 gating the spermatogonial stem cell fraction.
  • ”And“ stake-leukemia cell-antibody ”fractions that are non-reactive [stake-non-progenitor cell-antibody (1) Z anti-leukemia cell-antibody () fraction] It consists of at least two process powers (sorting process).
  • FSC Forward scatter
  • SSC Side s catter
  • a two-parameter histogram [linear 'scale (constant scale): X-axis and Y-axis are the measurement parameters FSC and SSC, respectively: X-axis : 0-1000, Y-axis: 0-1000] X-axis 50-1000, Y-axis force ⁇ -600, preferably X-axis 100-1000, Y-axis 0-500, more preferably X-axis 200-1000, Y-axis 0-400 Can be set as an area wear.
  • the sorting process is based on the results of the reaction with stake-non-spermatogonia cell-antibody and stake-leukemia cell-antibody obtained by flow cytometry for the spermatogonial stem cell fraction identified in the gating process. , “Stake-non-sperm cell-antibody” and “anti-leukemia cell-antibody”
  • This step can be preferably performed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • an antibody directly or indirectly labeled with a fluorescent dye is preferably used as the “stake-non-sperm cell-antibody” and “stake-leukemia cell-antibody”.
  • Fluorescence activated cell sorting is, for example, “Flow cytometry, actual battle protocol”, Hirokawa, Chemistry and Biological Experiment Line, MG Ormerod (Editing; “Flow ytometry ana Sorting (2nd Edition)” , Myron R. Melamed et al, Wiley-Liss, Inc. NY, 1990; "Flow cytometry one-technique and practice-" 2nd edition Supervised by Kazuo Ota, Sakai Shobo, 1988, etc. be able to.
  • FACS Fluorescence activated cell sorting
  • Fluorescence-activated cell sorting is specifically performed by the luminescence (fluorescence) of fluorescent dyes used for the labeling of “stake-non-sperm cell-antibody” and “stake-leukemia cell-antibody”. This is performed by at least two-dimensional analysis using the luminescence (fluorescence) of the fluorescent dye used for labeling as a parameter.
  • FACS Fluorescence-activated cell sorting
  • the classification into four fractions is based on the luminescence (fluorescence) of the spermatogonial stem cell fraction generated by the reaction with “stake-non-sperm cell-antibody” and “anti-leukemia cell-antibody”! Done.
  • cell sorting of 1) "stake-non-sperm cell-antibody (-) Z anti-leukemia cell-antibody (-) fraction refers to cells belonging to the fraction according to the conventional method of FACS. This can be done by separating electrostatically into individual liquid droplets that can be deflected into the tube.
  • the method of the present invention using flow cytometry may be any one having a to above (a) step (labeling step) and (b) as E (Flow Cytometry step), further, (a In step (labeling step), the test cell population is reacted with a dead cell stain, and in step (b) (flow cytometry step), the test cell labeled with the dead cell stain is removed. Even if it has a work.
  • the operation of reacting the test cell population with the dead cell stain can be performed under the condition that the cells are alive and the dead cells are stained with the stain, and so far, the conditions are not particularly questioned. Nah ...
  • the operation of removing the test cells labeled with the dead cell stain is preferably performed after (b) the gating step (b-1), for example, simultaneously with, and before or after the sorting step (b-2). Can do.
  • the sorting step (b-2) “stake-non-spermatogonia cell-antibody (-) z stake-non-sperm cell-antibody (-) fraction” and dead cells
  • sorting can be performed by sorting the fraction (dead cell stain ( ⁇ ) fraction) that is not labeled with a dead cell stain.
  • the dead cell stain is not particularly limited as long as it is a dye that specifically stains dead cells.
  • a dye that specifically stains dead cells For example, Trypan Blue, Erythrosin B, Propidium iodide (PI), and
  • fluorescent dyes such as 7-amino-actinomycin D can be used.
  • ( ⁇ ) Reagent kit The present invention also provides a reagent kit used to isolate or remove leukemic cells from a test male germ cell population containing leukemia cells.
  • the reagent kit contains at least (1) an antibody against a surface marker that is not expressed in spermatogonia and (2) an antibody against a surface marker that is expressed in leukemia cells in the same or separate container.
  • the antibody (1) include an antibody against MHC-class I (anti-MHC-class I antibody), an antibody against ⁇ 2-microglobulin (anti- ⁇ 2-microglobulin antibody), and Sca.
  • Antibody against -1 anti-Sca-1 antibody.
  • Anti-MHC-class I antibody or anti-j8 2-microglobulin antibody is preferred.
  • Anti-CD45 antibody is preferable.
  • the combination of antibody (1) (stake-non-sperm cell-antibody) and antibody (2) (anti-leukemia cell-antibody) is a combination of anti-MHC-class I antibody and anti-CD45 antibody. Or a combination of anti- ⁇ 2-myoglobulin antibody and anti-CD45 antibody.
  • antibodies (1) and (2) may be any isotype (IgA, IgG, IgE, etc.) as long as they are antibodies that specifically bind to the target antigen (cell marker).
  • IgD, IgM polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, antibody fragments (e.g., Fab fragments containing antigen binding sites, F (ab ') fragments, Fab' fragments, Fv such as scFv)
  • H chain isolated heavy chain
  • L chain light chain
  • antibodies (1) and (2) are not limited, but may be antibodies bound to a labeling agent (labeled antibodies).
  • the antibody label is not particularly limited as long as it is a detectable label.
  • non-radioactive isotopes, chemiluminescent labels, bioluminescent labels, and fluorescent labels can be listed.
  • fluorescent labeled antibody fluorescent labeled antibody
  • fluorescent dye those known in the art as fluorescent dyes for flow cytometry can be arbitrarily used.
  • fluorescein soyocyanate FITC
  • PE phycoerythrin
  • PE-Cy5 PE-Cyanin5
  • PE—Cy5.5 PE—Cyanin5.5
  • PE—Cy5 PE — Cyanin7
  • Rhodamine isothiocyanate Texas Red
  • ECD PE-Texas Red-x
  • Alophycosanine APC— Cy7 (APC— Cyanin 7, PharRed)
  • Per— CP Peridinin Chlorophylllin
  • PerCP-Cy5.5 Per-CP-Cyanin5.5
  • Labeling can be performed by covalently binding the above-described fluorescent dye to the aforementioned antibody using a known method (for example, E. Harlow & Dane, "Antibodies: A Laboratory Manual” ( Cold Spring Harbor Laboratory Press, old bpnng Harbor, New York, 198 8)) 0
  • a commercially available fluorescent dye-labeled antibody eg, “fluorescent-labeled antibody for flow cytometry”. You can also.
  • these antibodies (1) and (2) may not be fluorescent dye-labeled antibodies but may be those that can be labeled with a labeling agent such as a fluorescent dye.
  • a strong antibody include an antibody treated with piotin or streptavidin.
  • the antibody can be indirectly labeled with a labeling agent (fluorescent dye, etc.) via a piotine-avidin reaction by reacting with the streptavidin or piotin bound with a labeling agent such as a fluorescent dye. it can. Therefore, in this case, the reagent kit of the present invention preferably contains streptavidin or piotin bound with a labeling agent such as a fluorescent dye as another reagent component.
  • a secondary antibody that is labeled with a labeling agent such as a fluorescent dye as another reagent component in the reagent kit (each of the above antibodies and An antibody that specifically binds).
  • a labeling agent such as a fluorescent dye
  • the antibody (1) or (2) can be indirectly labeled with a labeling agent (fluorescent dye or the like) by reacting with the secondary antibody.
  • the reagent kit of the present invention has at least the antibody (1) and the antibody (2). Any other reagent may be contained in the same or separately separated container. Examples of other reagents that can be used include streptavidin or piotin bound with a labeling agent such as the above-described fluorescent dye, or a secondary antibody labeled with a labeling agent such as a fluorescent dye.
  • reagents include dead cell stains (eg, Trypan Blue, Erythrosin B, Propiaium iodide (PI), Ethidium bromiae (EB), i-amino-actinomycin D, etc.), reaction solvents (eg, phosphate Buffered saline such as buffered saline) and control reagents.
  • dead cell stains eg, Trypan Blue, Erythrosin B, Propiaium iodide (PI), Ethidium bromiae (EB), i-amino-actinomycin D, etc.
  • reaction solvents eg, phosphate Buffered saline such as buffered saline
  • control reagent include vertebrate sperm cells or mimics thereof. Examples of the mimics include beads having a sperm cell surface marker on the surface thereof.
  • the present invention also provides a non-human leukemia cell obtained by separating and removing leukemia cells from a test male reproductive cell population containing leukemia cells derived from a non-human male vertebrate by the method described in (I) above. Relates to the male germ cell population.
  • vertebrates include non-human primates, dogs, cats, pigs, mice, rats, gerbils, wild animals, mustards, usagis, marine mammals, pachyderms, horses, hidges, pigs, and Non-human vertebrates such as mammals such as duck; and birds including ducks, geese, turkeys, and birds.
  • it is a non-human vertebrate that is generally used in biological tests (preclinical tests, nonclinical tests) for confirming the efficacy and safety of drugs.
  • the non-human male germ cell population of the present invention is a collection of non-human sperm cells obtained by the method described in (I) above, wherein leukemia cells have been completely removed, and at least normal reproductive cells.
  • spermatogonia cells spermatogonial stem cells
  • the number of sperm cells constituting the sperm cell population is not particularly limited as long as it contains spermatogonia (spermatogonial stem cells) having the ability to form sperm having normal fertility.
  • the non-human male germ cell population can be used to produce normal offspring of allogeneic non-human vertebrates. Specifically, the production of such offspring begins by using the above-mentioned non-human male germ cell population (sperm cell population) as a donor or similar recipient male. This can be done by transferring into the vertebrate testis, maturing it into sperm, and mating the male vertebrate with a female vertebrate of the same species.
  • the sperm cell population can be transferred into the testis under conditions that allow the sperm cells to remain in the seminiferous tubule of the testis, and thus support Leydig cells or Sertoli cells in the seminiferous tubule. Under the action of cells, they mature into self-motile haploid cells (male gametes, sperm) that can fertilize eggs.
  • the sperm cell population can be transferred into the testis by direct injection, usually using a micropipette.
  • support cells such as Leydig cells or Sertoli cells, which are involved in spermatogonial stem cell sorting, may be transferred.
  • the cell concentration to be transferred is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be obtained, but a range of 1 ⁇ 10 5 to 10 ⁇ 10 5 cells / 10 ⁇ ⁇ can be exemplified.
  • the male vertebrate to be transplanted with the sperm cell population may be a donor male vertebrate derived from the sperm cell population or the same type of recipient male vertebrate.
  • male vertebrates to which the sperm cell population is transplanted are preferably azoospermic male vertebrates that have lost or reduced spermatogenic ability.
  • Is an azoospermic male vertebrate administered for example, to a male vertebrate with a cytotoxic alkyl agent (eg, busulfan, chlorambucil, cyclophosphamide, melphalan, ethylethanesulfonic acid, etc.) (chemical treatment)
  • a cytotoxic alkyl agent eg, busulfan, chlorambucil, cyclophosphamide, melphalan, ethylethanesulfonic acid, etc.
  • chemical treatment such as ⁇ irradiation.
  • the male vertebrate is mated with a female vertebrate of the same species, so that the male and female gametes combine to produce fertilization. After a certain gestation period, these vertebrate offspring are born.
  • Male and female gametes can be joined (mating) by natural mating (natural mating) or by in vitro or in vivo artificial mating means. Examples of powerful artificial mating means include, but are not limited to, artificial artificial sperm, artificial insemination, in vitro fertilization, intracytoplasmic sperm injection, subtropical sperm, or partial stratification.
  • the offspring thus born are normal without the onset of leukemia and can be equipped with normal reproductive functions to produce their subsequent generations (breeding).
  • the method of the present invention is suitable for chemical treatment of animals with malignant diseases other than humans (leukemia animals).
  • leukemia animals can be used to correct normal male infertility to restore normal reproductive function and obtain normal offspring, but also to treat human infertility, such as in preclinical studies It can also be used effectively for predictive evaluation of effects.
  • the non-human male germ cell population (sperm cell population) obtained by the method (I) can be effectively used to restore the fertility of allogeneic non-human vertebrates.
  • Such a method can be performed by transferring the non-human male germ cell population (sperm cell population) into the testis of an azoospermia donor or the same recipient non-human vertebrate. This method is suitably used for the treatment of non-human vertebrates having spermatogenic disorders.
  • the therapeutic effect on non-human vertebrates by the method of the present invention suggests the possibility of reproductive application of the method of the present invention to humans. Therefore, the method of the present invention can be effectively used for predicting and evaluating the therapeutic effects on human male infertility, such as in preclinical studies.
  • cell surface markers used to separate leukemia cells and sperm cells by flow cytometry fluorescence-activated cell sorting satisfy at least two conditions. Need to be. First, 100% pure sperm cells can be obtained without contamination with leukemia cells, and secondly, the obtained sperm cells contain spermatogonia that can form sperm after transplantation. Therefore, as a cell surface marker, using a CD4 5 and MHC class I [using MHC class I heavy chain (H-2K b / H- 2D b) ], it was examined their effectiveness.
  • C1498 cell line leukemia cell line of mouse of C57BL / 6 origin
  • sperm cells isolated from normal C57BL / 6 mouse testicular force were used as sperm cells.
  • sperm cells were prepared as follows. First, the testicular force was also removed from the white membrane, and the seminiferous tubule was buffered to pH 7.3 with 20 mM Hepes. modified Eagle's medium) and incubated at 37 ° C for 15 minutes with manual shaking for 5 minutes. The resulting seminiferous tubule was washed twice with calcium-free phosphate buffered saline (PBS) and then washed with 0.25% trypsin and DNase 1 (100 g / ml) (Sigma). Incubated in PBS containing 15 minutes at 37 ° C with shaking at 5 minute intervals. Add 1/2 volume of DMEM containing 10% fetal bovine serum (FBS), and filter the resulting cell suspension through a nylon mesh with a 30 m pore size. Was removed. The cell suspension thus obtained was used as sperm cells.
  • PBS calcium-free phosphate buffered saline
  • trypsin and DNase 1 100 g / m
  • each sperm cells described above were suspended in PBS (PBS / FBS) containing 0.5% FBS, for 20 minutes on ice, the anti-H- 2K b / H- 2D b having attached Piochin antibody (28- 8- 6; BD Biosciences Phar Mingen, San Diego (CA)) (hereinafter, "Piochin bond - anti H- 2K b / H- 2D b antibody" hereinafter) were cultured with co. Next, after washing twice with a large amount of PBS / FBS, the cells were fluorescently labeled for fluorescent activity cell sorting (FACS).
  • FACS fluorescent activity cell sorting
  • streptavidin conjugated with PE (phycoerythrin) (BD Biosciences PharMingen) (hereinafter referred to as “PE-bound streptavidin”) and anti-CD45 antibody conjugated with FITC (Fluorescein isothiocianate) (30- Fl l; BD Biosciences PharMingen) (hereinafter referred to as “FITC-conjugated anti-CD45 antibody”) for 20 minutes.
  • the first antibody Pieriotin binding-Pile H-2K b / H-2D b antibody
  • the second reagent PE binding-Streptavidin, FITC binding-Pile CD45 antibody
  • Cell sorting was performed using a FACS Ventage (BD Biosciences, San Jose) equipped with a 488 nm argon laser (250 mW).
  • Argon ion laser was used to excite the fluorescent dyes FITC, PE, and PI, and the fluorescence generated from FITC was collected and detected with a 530 nm filter, and the fluorescence generated from PE and PI was collected with a 575 nm filter. .
  • Each cell fluorescently labeled in (3) was subjected to flow cytometry.
  • FSC forward scattered light
  • SSC side-scattered light
  • G 1 gate the clusters in the FSC 1 " 811 and SSC lQW cell population area (G 1) ( Figure la, b), and for the resulting gate region cells (G1 fraction), then anti H-2K b / H_2D b antibody and anti-CD45 antibody is an antibody against the surface marker, as well as examined for labeling with PI.
  • Fig. 1 c and d show the analyzed histograms (quadrant regions) on the Y-axis, FITC fluorescence used for labeling the anti-CD45 antibody on the X-axis, and the analyzed region (quadrant region).
  • anti-H-2K b / H-2D b negative fraction for antibody and anti-CD45 antibodies [anti-H-2K b / H-2D b anti (-) / anti-CD45 antibody (-) fraction Min] (G2) did not contain any C1498 cells (Fig. Lc, d). Furthermore, the cells of the fraction (G2) were negative for PI as a dead cell stain.
  • the fraction positive for anti-H-2K b / H-2D b antibody and negative for anti-CD45 antibody contained 0.3% of C1498 cells.
  • the cells contained in the “anti-H-2K b / H-2D b antibody ( ⁇ ) / anti-CD45 ( ⁇ ) antibody fraction” (G3) are sperm cells. It was confirmed by showing a positive reaction to (specific marker for) (Tanaka, H. et al., Int J Androl 20, 361-366 (1997)).
  • sperm cells and leukemia cells can be rigorously used by combining two antibodies (antibody against CD45 and MHC class I heavy chain (H-2K b / H-2D b )). (Fig. 1).
  • anti-CD45 antibodies antibodies against CD45 [hereinafter referred to as “anti-CD45 antibodies”), antibodies against HLA-A, B, and C corresponding to human MHC class I [hereinafter antiantibodies] The effectiveness of HLA-A, B, and C antibodies) was investigated.
  • a Jurkat cell line (human leukemia cell line) was used as a human leukemia cell.
  • Immunostaining was performed according to the method of Kubota et al. In the same manner as in Example 1 (3). Specifically, the above human leukemia cells were suspended in PBS containing 0.5% FBS (PBS / FBS), and anti-HLA-A, B, C bound with PE (phycoerythrin) was used for flow cytometry.
  • PBS / FBS 0.5% FBS
  • PE phytoerythrin
  • Flow cytometry was performed in the same manner as in Example 1 (4). Specifically, each cell fluorescently labeled in (3) was subjected to flow cytometry.
  • Fig. 2a shows a two-parameter histogram obtained for human leukemia cells using forward-scattered light (FSC) and side-scattered light (SSC) as parameters.
  • FSC forward-scattered light
  • SSC side-scattered light
  • G1 gate clusters in the FSC high and SSC lQW cell population areas
  • G1 fraction gate region cells
  • the presence or absence of labeling with certain anti-HLA-A, B, C and anti-CD45 antibodies and PI was examined in the same manner as in Example 1.
  • Fig. 2b shows the analyzed histogram (quadrant region) on the Y-axis and the fluorescence of FITC used to label the anti-CD45 antibody on the X-axis.
  • 99.6% of cells in the gate region (FSC high and SSC lQW cell population area) (G1) responded to both anti-HLA-A, B, C and anti-CD45 antibodies (positive reaction) ).
  • the cell line human leukemia cells
  • the cells of the fraction (G2) were negative for PI as a dead cell stain.
  • a leukemia-affected mouse (leukemia mouse) was used (hereinafter also referred to as “donor mouse”).
  • the leukemia mice are C57BL / 6 mice (3 weeks old, obtained from Shizuoka Experimental Animal Center) or acrosin / eGFP (Acr3- EGFP) and pCX-EGFP (C57BL / 6 Recombinant mouse (6 weeks old) recombined to express GFP (Green Fluorescent Protein) by having TgN (acro / act-EGFP) OsbC3-N01-FJ002) (hereinafter referred to as “GFP mouse”) (Ohta, H., et al., Dev Growth Differ 42, 105-112 (2000); Nakanishi, T.
  • C1498 cells a mouse leukemia cell line of C57BL / 6 origin, obtained from ATCC
  • the optimal dose of C1498 cells was determined in advance in a preliminary test!
  • recipient male vertebrate As a recipient male vertebrate, a male mouse having lost spermatogenic ability was used (hereinafter referred to as “recipient 'mouse”).
  • the recipient mice were C57BL / 6 mice (4 weeks old, obtained from Shizuoka Experimental Animal Center), busulfan (40 mg / kg, Sigma) Chemical, an aralkylating agent used to treat chronic myeloid leukemia. (St. Louis, Inc.) was administered to eliminate the ability to form sperm.
  • Derna 1 'mice C1BL-injected C57BL / 6 mice, C1498-injected GFP mice prepared in (1) and testicular strength excised were also obtained.
  • normal C57BL / 6 mouse force testes were excised and sperm cells were obtained.
  • Dulbecco's modified eagle containing collagenase 'Type IV (lmg / m 1) (Sigma's Chemical), with the white membrane removed from each testis and the seminiferous tubule buffered to pH 7.3 with 20 mM Hepes.
  • the medium was placed in a medium (DMEM: Dulbecco's modified Eagle's medium) and cultured at 37 ° C for 15 minutes with hand shaking for 5 minutes.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the resulting seminiferous tubules were washed twice with calcium-free phosphate buffered saline (PBS) and then washed with PBS containing 0.25% trypsin and DNase 1 (100 g / ml) (Sigma). Incubated at 37 ° C for 15 minutes with shaking at 5 minute intervals. Add DMEM containing 1/2 volume of 10% fetal calf serum (FBS), and filter the resulting cell suspension through a nylon mesh with a 30 m pore size. The sperm cells were prepared by removing the cells.
  • PBS calcium-free phosphate buffered saline
  • FBS fetal calf serum
  • GFP sperm cells derived from GFP mice injected with C 1498 are referred to as “GFP sperm cells”, and sperm cells derived from C57BL / 6 mice injected with C 1498 and normal C57BL / 6 mice are referred to as “non-GFP fine cells”. To distinguish between the two.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1 (3), the sperm cells obtained in (2) were immunostained according to the method of Kubota et al.
  • each of the above sperm cells was suspended in PBS (PBS / FBS) containing 0.5% FBS, and bound with piotin for 20 minutes on ice.
  • PBS PBS / FBS
  • anti H-2K b / H-2D b antibody anti H-2K b / H-2D b antibody; and cultured with (28-8-6 BD Biosciences PharMingen, San Diego (CA)).
  • non-GFP sperm cells for fluorescence activity sorting (FACS), PE-conjugated-streptavidin (BD Biosciences PharMingen) and FITC-conjugated-anti-CD45 Incubated with antibody (30-Fll; BD Biosciences PharMingen) for 20 minutes.
  • FACS fluorescence activity sorting
  • PE-conjugated-streptavidin BD Biosciences PharMingen
  • FITC-conjugated-anti-CD45 Incubated with antibody (30-Fll; BD Biosciences PharMingen) for 20 minutes.
  • GFP sperm cells were cultured for 20 minutes with anti-CD45 antibody (30-Fll; BD Biosciences PharMingen) conjugated with PE-bound streptavidin and PE-Cy5.
  • the first antibody (Piotin binding-Pile H-2K b / H-2D b antibody) and the second reagent (PE binding streptavidin, FITC binding-anti-CD45 antibody or PE-Cy5 binding-anti-CD45 antibody) All were used at a concentration of 5 / zg / ml.
  • these sperm cells are finally washed and then resuspended in PBS / FBS containing 1 ⁇ g / ml of propidium iodide (PI: propidium iodideX Sigma Chemical), a dead cell stain. (4 ⁇ 10 6 cells / ml), stored on ice in a dark room until subjected to fluorescence activity sorting (FACS).
  • PI propidium iodideX Sigma Chemical
  • non-GFP sperm cells derived from C57BL / 6 mice (leukemia mice) injected with C1498 were subjected to flow cytometry in the same manner as in Example 1 (4).
  • the laser was used to excite FITC, PE, and PI, and the fluorescence generated from FITC was collected and detected with a 530 ⁇ m filter, and the fluorescence generated from PE and PI was collected with a 575 nm filter.
  • a two-parameter histogram of this non-GFP sperm cell by forward-scattered light (FSC) and side-scattered light (SSC) is shown in FIG.
  • FSC forward-scattered light
  • SSC side-scattered light
  • the G1 fraction of non-GFP sperm cells derived from C57BL / 6 mice shows the response to anti-H-2K b / H-2D b antibody, the response to anti-CD45 antibody and the response to PI in a three-parameter histogram The results are shown in Fig. 3b.
  • the cell population area (G3) (positive fraction) that reacts with anti-H-2K b / H-2 D b antibody and anti-CD45 antibody is gated and the cell fraction [anti-H-2K b / H- 2D b antibody (+) / anti-CD45 antibody (+)] (G3 fraction) was sorted as “leukemia cell fraction” (FIG. 3b).
  • the cells were sorted into a 5 ml tube containing 2 ml DMEM (DMEM / FBS) containing 10% FBS.
  • An FSC threshold was set to exclude cell debris.
  • the cells of the obtained G2 fraction and G3 fraction corresponded to 51.4% and 2.5% of the total non-GFP cells, respectively.
  • the sperm cell fraction (G2) and leukemia cell fraction (G3) cells sorted from non-GFP sperm cells of C57BL / 6 mice (leukemia mice) injected with C1498 were each 10 0 / zl PBS / Suspended in FCS.
  • the concentration of the sperm cell fraction was 2 ⁇ 10 6 cells / ml and the concentration of the leukemic cell fraction was approximately 1 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • a suspension of each cell was injected intraperitoneally into the recipient mouse.
  • 12 mice injected with sperm cell fraction (G2) cells were All survived for 300 days without developing leukemia.
  • mice injected with leukemia cell fraction (G3) cells all showed typical signs of end-stage leukemia with hemorrhagic ascites within 40 days and died (Figure 3c). This revealed that leukemia cells were mixed in the sperm cell fraction (G2)! / ,!
  • GFP sperm cells obtained from C 1498-injected GFP mice were subjected to flow cytometry according to the method described in (4).
  • the laser was used to excite PE, PE-Cy5 and PI, and the fluorescence generated from PE and PI was collected and detected with a 575 nm filter, and the fluorescence generated from PE-Cy5 was collected with a 682 nm filter.
  • the ratio of viable cells contained in the obtained sperm cell fraction (G2) was confirmed to be 95% or more by measuring trypan blue exclusion ability.
  • the cells of the washed sperm cell fraction (G2) were suspended in the injection medium to a concentration of 1 X 10 8 cells / ml, and this was used as a donor cell suspension.
  • the donor cell suspension thus obtained was administered to the testes of recipient mice at a ratio of approximately 101 per testis. Specifically, sperm formation ability by busulfan treatment
  • the sperm cell fraction (G2) obtained by cell sorting by the method of the present invention contains a sufficient number of spermatogonia having spermatogenic activity, and leukemic cells are It was confirmed that it was mixed.
  • the above recipient's testicular strength of the mouse The sperm obtained was able to talk about the power of normal reproductive ability.
  • a recipient transplanted with the above donor cell suspension obtained by cell sorting. From the testes of mice, spermatozoa were obtained 8 weeks after transplantation. Specifically, under a fluorescent stereomicroscope, the seminiferous tubes emitting green fluorescence were collected from the recipient's testis, cut with scissors, and suspended in Hepes-CZB medium (GFP semen suspension ).
  • Recipient ' contains approximately 2 ⁇ l of GFP semen suspension collected from mouse testis, containing 12% (w / v) polypyrrole pyrrolidone (PVP; Mr 360 000; Wako Pure Chemical Industries) Mixed with 1 drop of Hepes-CZB medium.
  • PVP polypyrrole pyrrolidone
  • the sperm head was separated from the tail
  • the oocytes thus obtained were cultured in CZB medium in air at 37 ° C. and 5% CO. 40 (95.2) of the 42 embryos formed
  • the two-cell embryo was transferred to the oviduct of 0.5-dpc pseudopregnant ICR female mice, resulting in a total of 12 mice (28.6%). Since hemizygous GFP transgenic mice were used, about half of the resulting pups (5) showed green fluorescence derived from GFP under excitation light. This indicates that fertilized spermatozoa are derived from transplanted GFP sperm cells. Because of this, the sperm cell fraction (G2) obtained by the recipient's testicular force cell sorting (G2) force The derived sperm has a normal reproductive ability, that is, included in the sperm cell fraction (G2). It has been confirmed that the sperm cells have sufficient spermatogenic ability.
  • testicular seminiferous tubules contain functional Sertoli cells after chemotherapy [Ohta, H., etal, Int J Androl 24, 15-23 (2001); Ohta, H., et al., Devel opment 127, 2125-2131 (2000)], by immature transplantation of spermatogonia and spermatocytes into the seminiferous tubule, immature sperm cells can be matured to sperm.
  • the remaining problem is to develop a first problem, a method that completely separates cancer cells from testicular sperm cells and prevents recurrence after transplantation. As shown in the above example, I That is, by cell sorting by flow cytometry,
  • the fraction (G1) is obtained, and this fractional force fluorescence activity cell sorting (FACS) is used to obtain anti-H-2K b / H- that does not react with anti-H-2K b / H-2D b antibody and anti-CD45 antibody.
  • FACS fractional force fluorescence activity cell sorting
  • 2D b antibody (-) / anti-CD45 antibody (-) fraction (G2) sperm cells with testicular strength and spermatogonia activity in leukemic mice are obtained completely separated from leukemia cells. Succeeded. By using these sperm cells as transplanted cells, the fertility of male mice that had been treated with busulfan (an alkylating agent used for the treatment of chronic myeloid leukemia) and lost spermatogenic activity was It succeeded in restoring without causing.
  • busulfan an alkylating agent used for the treatment of chronic myeloid leukemia
  • the recipient's mouse transplanted with the obtained sperm cells did not suffer from leukemia, formed normal sperm, and its normal sperm power was born, which is associated with anticancer treatment of childhood leukemia This shows that autotransplantation of sperm cells obtained by separating and removing leukemia cells by the method of the present invention is effective for the treatment of male infertility.
  • Figures a and c show the results of flow cytometry of leukemia cells (C1498 cells), and figures b and d show the flow of sperm cells (Germ cells) derived from normal C57BL / 6 mice. The results of cytometry are shown.
  • Figures a and b show two parameter histograms for forward scatten FSC and side scatter (SSC) obtained for leukemia cells (C 1498 cells) and sperm cells, respectively.
  • SSC side scatter
  • Figure c shows the FSC high and SSC 1 TM cell population fractions (G1 2 is a histogram showing the response of the (fraction) to anti-CD45 antibody, anti-H-2K b / H-2D b antibody, and PI (propidium iode).
  • Figure d shows the anti-CD45 antibody and anti-H-2K b / H_2D b antibody of the FSC high and SSC tow cell population fractions (G1 fraction) collected from the above two-parameter histogram for sperm cells. , And a histogram showing the response to PI (4 divisions).
  • Figures a and b show the results of flow cytometry of human leukemia cells (Jurkat cell line).
  • Figure a shows a two-parameter histogram for forward scatter (FSC) and side scatter (SSC) obtained for human leukemia cells.
  • Figure b shows the anti-CD45 antibody, anti-HLA-A, B, and FSC 1 " 8 * 1 and SS C lQW cell population fractions (G1 fraction) gated on human leukemia cells. It is a histogram which shows the reaction with respect to C antibody and PI (4 divisions).
  • FIG. 3 shows the results of flow cytometry performed in Example 3 (4).
  • Figure a is a two-parameter histogram of forward scatter (FSC) and side scatter (SSC) of mouse sperm cells (non-GFP sperm cells) injected with C1498.
  • FSC forward scatter
  • SSC side scatter
  • Response of anti-CD45 antibody, anti-H-2K b / H-2D b antibody, and PI (propidium iode) of FSChigh and SSClow cell population fractions (G1 fraction) gated with the above two-parameter histogram force (4 divisions).
  • H-2Kb / H-2Db (-) and CD45 (-) fractions are sperm cells
  • H-2Kb / H-2Db (+) and CD45 (+) fractions are Including leukemia cells.
  • Figure c shows the survival rate of the recipient mice after intraperitoneal injection of the G2 fraction (sperm cell fraction) (broken line) and G3 fraction (leukemia cells) (solid line) separated by FACS into the recipient mouse. (Survival (%)) is the figure which showed with time (days).
  • FIG. 5 shows the results of observing the testes of recipient mice after transplantation of sperm cells of leukemia GFP mice into the seminiferous tubules of azoospermia treated with busulfan.
  • Figures a and b show the results of staining testis sections of the recipient mice 2 weeks after transplanting non-cell sorted sperm cells with hematoxylone and eosin.
  • Figure c is the testis force of leukemia GFP mice Cell transplanted sperm cell fraction (G2 fraction) 8 weeks after transplanting recipient's mouse testis image
  • Figure d shows fluorescence detection It is an image.
  • Fig. E shows an image of the seminiferous tubule taken from the testes of the recipient's mouse
  • F shows an image obtained by fluorescence detection.
  • Transplanted donor sperm cells green are observed to accumulate in the recipient seminiferous tubule.
  • Figure g shows sperm cells isolated from recipient mouse testes.
  • Figures h and i are images of hematoxylon-stained ( Figure h) sections of recipient mouse testis transplanted with the sorted sperm cell fraction, and fluorescence-detected images ( Figure i). Note that the scale bar size in each figure is lmm for figures a, c, d, e, and f, 10 ⁇ for figure b, 20 m for figure g, and 100 m for figures h and i. In fc.
  • Fig. 6 shows the testicular strength of recipient mice transplanted with GFP sperm cells (donor sperm cells) obtained by cell sorting in Example 3 (6). The normal offspring (pups) born by injecting and mating are shown.
  • Figure b shows the result of observation under fluorescence. This shows that spermatozoa derived from transplanted donor sperm cells are normal.

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Abstract

　白血病細胞と精祖細胞を含有する細胞集団から、白血病細胞を完全に除去するための方法、及び当該方法の実施に好適に使用することのできる試薬を提供する。また、上記の方法で取得した非ヒト脊椎動物の精細胞、及びその用途を提供する。 　白血病細胞を含む被験雄性生殖細胞集団から精原幹細胞を含有する画分（精原幹細胞画分）を取得し、次いで当該画分から精祖細胞に発現しない表面マーカーに対する抗体及び白血病細胞に発現する表面マーカーに対する抗体の両方に対して非反応の細胞画分を取得する。

Description

明 細 書
白血病浸潤精巣に由来する細胞集団から白血病細胞を除去する方法、 及びそれに用いられる試薬キット
技術分野
[0001] 本発明は、白血病浸潤精巣力 得られる雄性生殖細胞の細胞集団の中から、白血 病細胞を完全に除去する方法に関する。また、本発明は上記方法の実施に好適に 使用される試薬キットに関する。さらに本発明は、上記方法によって白血病細胞が完 全に除去されてなる非ヒト雄性生殖細胞、及びその用途に関する。
背景技術
[0002] 小児の悪性疾患 (癌）の中でも最も多 ヽ白血病は、近年、放射線治療と抗癌剤投 与等の化学療法等を複数組み合わせて行う集学的治療により完治が期待できるよう になってきた。し力しながら、集学的治療により精巣内の生殖細胞は破壊され、第 2 次性徴以後にこうした集学的治療を行った患者の約 50%が男性不妊症になることが 報告されている (例えば、非特許文献 1等参照)。思春期以降の男性の場合は、射出 精子を凍結保存しておき、必要に応じて卵細胞質精子注入術を行うことにより、挙児 を得ることが可能であるが、思春期以前の小児では射出精子を得ることはできず、更 に精巣内でも精子形成が行われていないため、将来のために精子を取得し凍結保 存しておくことができない。このため、小児悪性疾患の治療後に生じ得る男性不妊症 を防止し、また治療する方法が求められている。
[0003] かかる小児悪性疾患治療による男性不妊症に対する治療法 (不妊治療）として、悪 性疾患に対する治療前に予め精巣から自己の精細胞を採取して凍結保存しておき 、悪性疾患治療後に、それを精細管内に自己移植し、造精能を回復する方法 (精細 管内移植法)、また治療前に予め自己の精巣から採取した精祖細胞を体外培養して 増殖させ、悪性疾患治療後に、それを精細管内に自己移植し、造精能を回復する方 法 (精祖細胞の体外培養及び精細管内移植)が提案されている (例えば、非特許文 献 2等参照)。し力しながら、これらの方法によれば、治療前に採取した精細胞や精 祖細胞に癌細胞が混入して 、る可能性があるため、悪性疾患治療によって悪性疾患 が完治しても、その後の不妊治療 (精細管内移植）によって癌が再発してしまう危険 性がある。このように、従来より提案されている不妊治療は癌細胞の混入という問題を 有しており、これが臨床応用に至る障壁となっている。
[0004] このため、移植細胞として、癌細胞を完全に除去して生殖細胞だけを取り出すこと のできる方法を開発することが急務となっている力 未だ報告がないのが現状である 非特許文献 1 : Thomson, A.B., Campbell, A.J., Irvine, D.C., Anderson.R.A., Kelnar, C.J., and Wallace, W.H.：〃 Semen quality and spermatozoal DNA integrity in survivo rs of childhood cancer: a case-control study." /Lancet/. 2002:360:3ol— 367 非特許文献 2 :Aslam I, Fishel S, Moore H, Dowell K, Thornton S., "Fertility preserv ation of boys undergoing anti-cancer therapy: a review of the existing situation and prospects for the luture." Hum Reprod. 2000 Oct;15(10):2154— 9
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 以上のように、小児白血病は、集学的治療によって完治するようになったものの、治 療後に男性不妊症になる確率が高ぐその治療方法が求められていた。そこで本発 明の目的は、当該男性不妊症の治療に使用する移植精細胞として、癌細胞（白血病 細胞）が全く混入して 、な 、精製度の高 ヽ精祖細胞を取得するために、白血病細胞 と精祖細胞を含有する細胞集団から、白血病細胞を完全に除去するための方法を 提供することを目的とする。また、本発明は当該方法の実施に好適に使用することの できる試薬を提供することを目的とする。さらに、本発明は上記の方法で取得した非 ヒト脊椎動物の精細胞、及びその用途を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、上記課題を解決すベぐ鋭意検討を重ねていたところ、フローサイト メトリーにおいて、精原幹細胞を含む細胞画分 (以下、「精原幹細胞画分」ともいう）を ゲーティングし、さらに得られた精原幹細胞画分から、セルソーティングにより、精祖 細胞に発現しな 、表面マーカーに対する抗体及び白血病細胞に発現する表面マー カーに対する抗体の両方に対して非反応の細胞画分を取得することによって、白血 病細胞を含む被験雄性生殖細胞の集団から白血病細胞を完全に分離または除去 することができることを見出した。更に、本発明者らは、上記方法によって白血病細胞 を分離除去した雄性生殖細胞は、正常な生殖能を有する精子を形成する能力を備 えて 、ることを確認し、当該方法によって得られた雄性生殖細胞が化学療法によって 生じる男性不妊治療に有効に利用できることを確信した。本発明は力かる知見に基 づ、て完成したものである。
[0007] すなわち、本発明は、下記の態様を包含するものである：
項 1. 白血病細胞を含む被験雄性生殖細胞集団から、白血病細胞を分離または除 去する方法であって、当該被験雄性生殖細胞集団から、精原幹細胞を含有する画 分 (精原幹細胞画分)を取得し、次 、で当該画分から精祖細胞に発現しな!、表面マ 一力一に対する抗体及び白血病細胞に発現する表面マーカーに対する抗体の両方 に対して非反応の細胞画分を取得する方法。
[0008] 項 2.精祖細胞に発現しない表面マーカー力 MHC-クラス I、 j8 2-ミオグロブリン、 及び Sea-はりなる群力 選択される少なくとも 1つであり、白血病細胞に発現する表 面マーカー力 CD2、 CD7、 CD10、 CD13、 CD3、 CD14、 CD15、 CD19、 CD20、 CD21 、 CD22、 CD33、 CD34、 CD38、 CD45、 CD54、 CD56、 CD65、 HLA- DR、 HLA-DQ, H LA-DPおよび TCRよりなる群力も選択される少なくとも 1つである、項 1記載の方法。
[0009] 項 3.フローサイトメトリーによって行う方法であって、精祖細胞に発現しない表面マ 一力一に対する抗体及び白血病細胞に発現する表面マーカーに対する抗体として、 直接又は間接的に蛍光標識された抗体を用いて、当該抗体に対して非反応の細胞 画分の取得を蛍光活性ィヒセルソーティングによって実施する項 1または 2記載の方法
[0010] 項 4. 白血病細胞を含む被験雄性生殖細胞集団が、白血病に罹患した雄性脊椎 動物の精巣力 取得した生殖細胞の集団である、項 1乃至 3のいずれかに記載する 方法。
[0011] 項 5. 白血病細胞を含む被験雄性生殖細胞集団から白血病細胞を分離または除 去するための試薬キットであって、少なくとも蛍光活性ィ匕セルソーティング用抗体とし て、精祖細胞に発現しない表面マーカーに対する抗体及び白血病細胞に発現する 表面マーカーに対する抗体を含む、試薬キット。
[0012] 項 6.精祖細胞に発現しない表面マーカー力 MHC-クラス I、 j8 2-ミオグロブリン、 及び Sea-はりなる群力 選択される少なくとも 1つであり、白血病細胞に発現する表 面マーカー力 CD2、 CD3、 CD7、 CD10、 CD13、 CD14、 CD15、 CD19、 CD20、 CD21 、 CD22、 CD33、 CD34、 CD38、 CD45、 CD54、 CD56、 CD65、 HLA- DR、 HLA-DQ, H LA-DPおよび TCRよりなる群力も選択される少なくとも 1つである、項 5記載の試薬キ ッ卜。
[0013] 項 7.非ヒト雄脊椎動物に由来する白血病細胞を含有する被験雄性生殖細胞集団 から、項 1乃至 4のいずれかの方法によって白血病細胞を分離除去することによって 得られる、非ヒト雄性生殖細胞。
[0014] 項 8.項 7記載の非ヒト雄性生殖細胞を、ドナーまたは同種のレシピエント雄脊椎動 物の精巣中に移入し、当該雄脊椎動物をその種の雌脊椎動物と交配して、非ヒトの 子孫脊椎動物を生産する方法。
[0015] 項 9.上記雄脊椎動物が無精子症の非ヒト雄脊椎動物である、項 8記載の方法。
[0016] 項 10.交配が、雄脊椎動物とその種の雌脊椎動物との自然交配、雄脊椎動物の 精子による雌脊椎動物の人工授精、雄脊椎動物の精子による雌脊椎動物の卵子の インビトロ受精、細胞質内精子注入、帯下状媒精、及び部分的帯層離断よりなる群か ら選択される方法によって達成される項 8または 9記載の方法。
[0017] 項 11.無精子症の非ヒト雄脊椎動物の生殖能力を回復する方法であって、項 7記 載の非ヒト雄性生殖細胞を、無精子症のドナーまたは同種のレシピエント非ヒト雄脊 椎動物の精巣中に移入することを含む、方法。
発明の効果
[0018] 悪性腫瘍（白血病）が発生した小児の約 70%が治療に成功し、長期生存するように なった現在、治療を受けた男児が生殖年齢時に男性不妊症になっていることは、患 者に大きな精神的苦痛を与えるものであり、早急な対策が切望されている。本発明の 方法によれば、白血病浸潤精巣から取得した精細胞集団から白血病細胞を完全に 除去することができるため、当該方法によって得られる精細胞は、男児に対する化学 療法により生じる男性不妊症の治療に好適に利用することができる。 発明を実施するための最良の形態
[0019] (I)白血病細胞の分離又は除去方法
本発明の白血病細胞の分離又は除去方法は、白血病細胞を含む被験雄性生殖 細胞集団の中から、白血病細胞を完全に分離または除去することのできる方法であ る。当該方法は、白血病細胞を含む被験雄性生殖細胞集団から、精原幹細胞を含 有する画分 (精原幹細胞画分)を取得し、次いで当該画分から更に、精祖細胞に発 現しな 、表面マーカーに対する抗体及び白血病細胞に発現する表面マーカーに対 する抗体の両方に対して非反応の細胞画分を取得することによって実施することが できる。
[0020] 本発明の方法が対象とする細胞集団 (被験細胞集団）は、白血病細胞が混在して なる雄性生殖細胞である。通常、当該被験細胞集団は、白血病に罹患した雄脊椎動 物の精巣力も取得することができる。ここで雄性生殖細胞としては、精子細胞及びそ の前駆細胞を挙げることができる。精子細胞の前駆細胞には、精祖細胞 (精原幹細 胞を含む）、精母細胞、及び精子細胞が含まれる。好ましくは精祖細胞 (精原幹細胞 を含む)またはこれを少なくとも含む雄性生殖細胞である。
[0021] ここで対象とする脊椎動物には、ヒト、非ヒト霊長類、ィヌ、ネコ、ブタ、マウス、ラット 、スナネズミ、ノ、ムスター、ゥサギ、海生哺乳類、厚皮動物、ゥマ、ヒッジ、ブタ、及び ゥシ等の哺乳類;及びァヒル、ガチョウ、シチメンチヨウ、 -ヮトリ等を含む鳥類が含ま れる。
[0022] 精巣力 被験細胞集団（生殖細胞集団）の取得は、当業界における公知の方法に 従って行うことができる。例えば後述する実施例に詳細に説明するように、被験細胞 集団は、被験者 (被験ヒトおよび非ヒト動物を含む)の精巣力も得られる精細管力も取 得することができる。具体的には、精巣組織から得られた精細管を裁断して、例えば 脾臓トリプシン、コラゲナーゼ I型、または脾臓デォキシリボヌクレアーゼ I型といった酵 素を含む溶液 (例えば修正 DMEM培地等）中でインキュベーション (酵素反応）して非 破損細胞を遊離させることによって、被験細胞集団（生殖細胞集団）を取得すること ができる。なお、精細管は、被験者力 採取した精巣またはその一部の組織力 白膜 を剥離して調製するか、または採取した精巣組織をコラゲナーゼまたはデォキシリボ ヌクレアーゼ (DNAse)といった酵素で処理し、得られた精細管組織から調製すること ができる。
[0023] 斯くして調製される被験細胞集団から白血病細胞を分離除去するには、当業界公 知の細胞選別及び回収技術（例えば、 D.N.Weir編者らの" The Handbook of Experim ental Immunology, 1—4卷 ： A. Radbrucn編者らの" Flow Cytometry andし ell sorting (Spring Verlag, 1992):および Olweus, Jら、 1997、 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94: 1255 1-12556など）を制限なく使用することができる。好ましくはフローサイトメトリー、特に 蛍光活性ィ匕セルソーティングを有するフローサイトメトリーが使用される。すなわち、 本発明の方法は、好適には上記の方法によって調製される被験細胞集団を、フロー サイトメトリーに供する工程を含む。
[0024] フローサイトメトリーを用いた本発明の方法は、具体的には、下記の（a)及び (b)の 工程を行うことによって実施することができる：
(a)被験細胞集団を、精祖細胞に発現しない表面マーカーに対する抗体 (以下、「抗 -非精祖細胞-抗体」 t 、う）及び白血病細胞に発現する表面マーカーに対する抗体 (以下、「杭-白血病細胞-抗体」という）と反応させる工程、及び
(b) (a)で処理した被験細胞集団をフローサイトメトリーに供し、
b-1).精原幹細胞画分をゲーティングする工程、
b-2).ゲーティングした精原幹細胞画分から、「杭-非精祖細胞-抗体」及び「杭-白血 病細胞-抗体」の両方に対して非反応の画分 (以下、「杭-非精祖細胞-抗体（一） Z 抗-白血病細胞-抗体（ ）画分」と 、う）をソーティングする工程。
[0025] 上記 (a)の工程 (標識工程）にお 、て、精祖細胞に発現しな!、表面マーカーとしては 、制限されないが、 MHC-クラス I、 β 2-ミオグロブリン、及び Sca-1を挙げることができ る [Kubota, H., et al" Proc Natl Acad Sci U S A 100, 6487-6492 (2003); Shinohara, T.， et al., Proc Natl Acad Sci U S A 97, 8346—8351 (2000); Koshimizu, U., et al.,Mo 1 Reprod Dev 40, 221-227 (1995); Moore, T.J., et al., Endocrinology 143, 3171—317 4 (2002)] o好ましくは MHC-クラスほたは j8 2-ミオグロブリンである。また、白血病細 胞に発現する表面マーカーとしては、制限されないが、 CD2、 CD3、 CD7、 CD10、 CD 13、 CD14、 CD15、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD33、 CD34、 CD38、 CD45、 CD54 、 CD56、 CD65、 HLA- DR、 HLA- DQ、 HLA- DPおよび TCR(T細胞レセプター）を挙 げることができる〔Hotta,C. et al. Immunogenetics 51, 624-631 (2000)〕。好ましくは C D45である。精祖細胞に発現しない表面マーカーと白血病細胞に発現する表面マー カーの組合せとしては、は MHC-クラス Iと CD45の組合せ、または 13 2-ミオグロブリンと CD45の組合せを好適に例示することができる。
[0026] 本発明で用いられる「抗体」は、上記の各種表面マーカーに対する抗体である限り 、任意のアイソタイプ（IgA、 IgG、 IgE、 IgD、 IgM)のポリクローナル抗体、モノクローナ ル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体フラグメント (例えば、抗原結合部位を含む Fab 断片、 F(ab')断片、 Fab'断片、 scFvのような Fv断片、単離された重鎖 (H鎖)や軽鎖（
2
L鎖)）等の別を問わない。好ましくは上記の各種表面マーカーに対するモノクローナ ル抗体またはその抗体フラグメントである。なお、上記の各種表面マーカー（MHC-ク ラス I、 β 2—ミオグロブリン、 Sea— 1、 CD2、 CD3、 CD7、 CD10、 CD13、 CD14、 CD15、 C D19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD33、 CD34、 CD45、 CD54 CD56、 CD65、 HLA- DR、 H LA-DQ、 HLA- DP、および TCR)に対するモノクローナル抗体はいずれも公知であり 、例えば、 BD Biosciences PharMingen社等から商業的に入手することができる。
[0027] 上記 (a)工程 (標識工程）は、（0精祖細胞に発現しない表面マーカーに対する抗体（ 杭-非精祖細胞-抗体)と GO白血病細胞に発現する表面マーカーに対する抗体 (杭- 白血病細胞-抗体）とを組み合わせて用い、被験細胞集団をこれらの抗体の両方と 反応させることによって実施することができる。杭-非精祖細胞-抗体としては、上記 M HC-クラス Iに対する抗体 (抗 -MHC-クラス I抗体）、 /3 2-ミオグロブリンに対する抗体（ 抗- β 2-ミオグロブリン抗体）、及び Sca-1に対する抗体 (抗- Sca-1抗体）の 、ずれか 1つを使用することもできるが、これらを 2種以上組み合わせて使用することもできる。 好ましくは抗 -MHC-クラス I抗体、または抗 - j8 2-ミオグロブリン抗体である。
[0028] 抗—白血病細胞—抗体としては、上記 CD2、 CD3、 CD7、 CD10、 CD13、 CD15、 CD14 、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD33、 CD34、 CD38、 CD45、 CD54、 CD56、 CD65、 HLA-DR、 HLA-DQ、 HLA-DPまたは TCRに対する抗体（抗- CD2抗体、抗 -CD3抗 体、抗 -CD7抗体、抗 -CD10抗体、抗 -CD13抗体、抗 -CD14抗体、抗 -CD15抗体、抗 -CD19抗体、抗 -CD20抗体、抗 -CD21抗体、抗 -CD22抗体、抗 -CD33抗体、抗 -CD 34抗体、抗 -CD38抗体、抗 -CD45抗体、抗 -CD54抗体、抗 -CD56抗体、抗 -CD65抗 体、抗- HLA- DR抗体、抗- HLA- DQ抗体、抗- HLA- DP抗体または抗- TCR抗体）の いずれか 1つを使用することもできる力 これらを 2種以上組み合わせて使用すること もできる。好ましくは抗 -CD45抗体である。
[0029] 杭-非精祖細胞-抗体と抗-白血病細胞-抗体との組み合わせとしては、抗 -MHC-ク ラス I抗体と抗 -CD45抗体との組み合わせ、または抗 - j8 2-ミオグロブリン抗体と抗 -C D45抗体との組み合わせを挙げることができる。
[0030] これらの抗体は、蛍光活性ィ匕セルソーティングの実施のために、蛍光色素で標識さ れていることが好ましい。かかる蛍光色素としては、当業界でフローサイトメトリー用蛍 光色素として公知のものを任意に使用することができる。好ましくは、フルォレセイン イソチオシァネート（FITC)、フィコエリスリン（Phycoerythrin： PE)、 PE- Cy5 (PE- Cyani n5)、 PE- Cy5.5 (PE- Cyanin5.5)、 PE- Cy5 (PE- Cyanin7)、ローダミンイソチオシァネ ート、テキサスレッド（Texas Red)、 ECD (PE- Texas Red- x)、ァロフィコサニン（APC) 、 APC-Cy7 (APC- Cyanin 7、 PharRed)、 Per— CP (Peridinin Chlorophyll Protein)、及 び PerCP— Cy5.5 (Per— CP— Cyanin5.5)等を挙げることができる。
[0031] 標識は、上記抗体に上記蛍光色素を共有結合で結合することによって行うことがで きるが、力かる結合には当業界で公知の方法を使用することができる（例えば、 E.Har low & D.Lane, Antibodys: A Laboratory Manual (し old Spring Harbor Laboratory Pr ess, Cold Spring Harbor, New York, 1988))。また、簡便には、商業的に入手できる、 予め蛍光色素で標識された抗体 (例えば「フローサイトメトリー用蛍光標識抗体」）を 用いることもできる。なお、本発明の抗体は、一般には、蛍光色素によって標識される ことが好ましいが、例えば化学発光標識や生物発光標識等の、他の標識の使用を制 限するものではない。
[0032] また上記の抗体は、蛍光色素で標識されて!、なくても、蛍光色素で標識できるもの であってもよい。力かる抗体としては、例えばピオチンまたはストレプトアビジンで処理 されてなる抗体を挙げることができる。この場合、蛍光色素を結合したストレブトァビジ ンまたはピオチンと反応させることによって、ピオチン アビジン反応を介して、抗体 を間接的に蛍光色素で標識することができる。また、蛍光色素で標識されていな抗体 は、蛍光色素で標識してなるその 2次抗体と反応させることによって、間接的に蛍光 色素で標識することができる。
[0033] (a)工程 (標識工程）にお 、て、被験細胞集団と抗体との反応は、被験細胞が生存し 、且つ細胞表面に発現している抗原 (表面マーカー）とそれに対する抗体とが抗原 抗体反応する条件下で行うことができる。この限りにおいて特に制限されないが、例 えば、反応溶媒として、被験細胞に等張またはそれに同等のリン酸緩衝ィ匕生理食塩 水などの緩衝ィ匕生理食塩水を用いることができる。
[0034] 斯くして (a)工程で得られた被験細胞集団は、次いで (b)工程 (フローサイトメトリーェ 程）に供される。当該フローサイトメトリー工程は、 b-1)精原幹細胞画分をゲーティン グする工程 (ゲーティング工程）、及び b- 2)ゲーティングした精原幹細胞画分から、「 杭-非精祖細胞-抗体」及び「杭-白血病細胞-抗体」の両方に対して非反応の画分〔 杭-非精祖細胞-抗体（一） Z抗-白血病細胞-抗体（ ）画分〕をソーティングするェ 程 (ソーティング工程)の少なくとも 2工程力 構成される。
[0035] (ゲーティング工程）
ゲーティング工程は、（a)工程 (標識工程)で得られた被験細胞集団に対するフロー サイトメトリーにおいて、前方散乱光（FSC:Forward scatter)と側方散乱光（SSC:Side s catter)で、死細胞やゴミを多く含む FSC1™領域及び体細胞 (セルトリ細胞など）を多く 含む
Figure imgf000010_0001
精原幹細胞を含む 画分 (精原幹細胞画分）にゲートをかけることによって実施することができる。なお、前 方散乱光 (FSC)は、レーザー光が被験細胞集団に当たったときに生じる散乱光であ つて細胞の大きさを反映し、側方散乱光 (SSC)は、レーザー光が被験細胞集団に当 たったときに生じる直角方向に散乱する光であって細胞の内部構造 (複雑さ）を反映 する。
[0036] 制限はされないものの、例えば図 1の a及び bに示すように、 X軸及び Y軸をそれぞ れ測定パラメーター FSC及び SSCとする 2パラメーターヒストグラム〔リニア'スケール（ 常数目盛り）： X軸： 0〜1000、 Y軸： 0〜1000〕において、
Figure imgf000010_0002
X 軸が 50〜1000、 Y軸力^〜 600の領域、好ましくは X軸が 100〜1000、 Y軸が 0〜500の 領域、より好ましくは X軸が 200〜1000、 Y軸が 0〜400の領域として設定することがで きる。
[0037] (ソーティング工程）
ソーティング工程は、上記ゲーティング工程によって特定した精原幹細胞画分につ いて、フローサイトメトリーによって得られる「杭-非精祖細胞-抗体」及び「杭-白血病 細胞-抗体」との反応結果から、「杭-非精祖細胞-抗体」及び「抗-白血病細胞-抗体
」の両方に対して反応しな！ヽ画分〔杭-非精祖細胞-抗体 (-) Z抗-白血病細胞-抗体（
-)画分〕を取得することによって実施される。当該工程は、好適には蛍光活性ィ匕セル ソーティング (FACS)を使用して行うことができる。この場合「杭-非精祖細胞-抗体」 及び「杭-白血病細胞-抗体」として好適には、上述するように、蛍光色素で直接また は間接的に標識された抗体が使用される。ここで、「杭-非精祖細胞-抗体」及び「杭- 白血病細胞-抗体」の標識には、互いに発光波長が重複しない、異なる蛍光色素を 用いることが好ましい。なお、蛍光活性ィ匕セルソーティング (FACS)は、例えば「フロ 一サイトメトリ一一実戦プロトコール」、広川、化学と生物実験ライン、 M.G. Ormerod ( 編集ノ ；「Flowし ytometry ana Sorting (2nd Edition)」 , Myron R. Melamed et al, Wiley -Liss, Inc. NY, 1990 ;「フローサイトメトリ一—手技と実際—」第 2版 太田和雄 監修 、蟹書房、 1988年などに記載される方法によって実施することができる。
[0038] 蛍光活性ィ匕セルソーティング (FACS)は、具体的には「杭-非精祖細胞-抗体」の標 識に使用した蛍光色素の発光 (蛍光）と「杭-白血病細胞-抗体」の標識に使用した蛍 光色素の発光 (蛍光)をパラメーターとする、少なくとも 2次元の分析によって行われる 。力かる分析によって精原幹細胞画分は 4つの画分に分画することができる。かかる 4つの画分は具体的に、 1)「杭-非精祖細胞-抗体」及び「杭-白血病細胞-抗体」の 両方に対して反応しな！、画分〔杭-非精祖細胞-抗体 (-) z杭-白血病細胞-抗体 (-) 画分〕、 2)「杭-非精祖細胞-抗体」に対して反応し、且つ「杭-白血病細胞-抗体」に 対して反応しな!ヽ画分〔杭-非精祖細胞-抗体 (+)Z抗-白血病細胞-抗体 (-)画分〕、 3 )「杭-非精祖細胞-抗体」に対して反応せず、且つ「杭-白血病細胞-抗体」に対して 反応する画分〔杭-非精祖細胞-抗体 (-) Z杭-白血病細胞-抗体 (+)画分〕、 4)「杭- 非精祖細胞-抗体」及び「杭-白血病細胞-抗体」の両方に対して反応する画分〔杭- 非精祖細胞-抗体 (+)z杭-白血病細胞-抗体 (+)画分〕に分類することができる。かか る 4画分への分類は、「杭-非精祖細胞-抗体」及び「抗-白血病細胞-抗体」との反応 によって生じる精原幹細胞画分の発光 (蛍光）に基づ!/、て行なわれる。
[0039] 斯くして、得られる 4画分のうち、 1)「杭-非精祖細胞-抗体」及び「杭-白血病細胞- 抗体」の両方に対して非反応の画分〔杭-非精祖細胞-抗体 (-) z杭-白血病細胞-杭 体 (-)画分〕をソーティングすることによって、被験細胞集団から白血病細胞を完全に 分離除去することができ、白血病細胞を含まない精原幹細胞画分を取得することが できる。
[0040] なお、 1)「杭-非精祖細胞-抗体 (-) Z抗-白血病細胞-抗体 (-)画分」のセルソーティ ングは、 FACSの慣用法に従って、当該画分に属する細胞を、静電気的にチューブ に偏向を受けられる個々の液体小滴の中に分離することによって行うことができる。
[0041] フローサイトメトリーを用いた本発明の方法は、前述する (a)工程 (標識工程)と (b)ェ 程 (フローサイトメトリー工程)を有するものであればよいが、さらに、（a)工程 (標識ェ 程）において、被験細胞集団を死細胞染色剤と反応させる操作、及び (b)工程 (フロ 一サイトメトリー工程）において、死細胞染色剤で標識された被験細胞を除去する操 作を備えるものであってもよ ヽ。ここで被験細胞集団を死細胞染色剤と反応させる操 作は、細胞が生存し、且つ死細胞が当該染色剤で染まる条件で行うことができ、この 限りにお 、て条件を特に問うものではな 、。死細胞染色剤で標識された被験細胞を 除去する操作は、好適には (b)のゲーティング工程 (b-1)後、例えばソーティング工程 (b-2)と同時、またその前後に行うことができる。具体的には、ソーティング工程 (b- 2) にお ヽて、「杭-非精祖細胞-抗体 (-) z杭-非精祖細胞-抗体 (-)画分」であって且つ 死細胞染色剤で標識されな 、画分 (死細胞染色剤 (-)画分)をソーティングするカゝ、ま たは「杭-非精祖細胞-抗体 (-) z杭-非精祖細胞-抗体 (-)画分」をソーティングする前 後に、死細胞染色剤で標識されな!ヽ画分 (死細胞染色剤 (-)画分)をソーティングす ること〖こよって行うことができる。
[0042] なお、ここで死細胞染色剤としては、死細胞を特異的に染色する色素であれば特 に制限はされないが、例えば Trypan Blue, Erythrosin B、 Propidium iodide (PI),及び
7-amino-actinomycin D等の公知の蛍光色素を用いることができる。
[0043] (Π)試薬キット 本発明は、また白血病細胞を含む被験雄性生殖細胞集団から白血病細胞を分離 または除去するために用いられる試薬キットを提供する。当該試薬キットは、同一また は分離した容器内に、少なくとも (1)精祖細胞に発現しない表面マーカーに対する抗 体、及び (2)白血病細胞に発現する表面マーカーに対する抗体を含むことを特徴とす る。
[0044] (1)の抗体としては、具体的には、 MHC-クラス Iに対する抗体 (抗 MHC-クラス I抗体） 、 β 2-ミクログロブリンに対する抗体 (抗 β 2-ミクログロブリン抗体）、及び Sca-1に対す る抗体 (抗 Sca-1抗体)を挙げることができる。好ましくは抗 MHC-クラス I抗体、または 抗 j8 2-ミクログロブリン抗体である。また (2)の抗体としては、具体的には、 CD2、 CD3 、 CD7、 CD10、 CD13、 CD14、 CD15、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD33、 CD34、 C D38、 CD45、 CD54、 CD56、 CD65、 HLA— DRゝ HLA— DQ、 HLA-DP,または TCRのい ずれかに対する抗体 (抗 -CD2抗体、抗 -CD3抗体、抗 -CD7抗体、抗 -CD10抗体、抗 -CD13抗体、抗 -CD14抗体、抗 -CD15抗体、抗 -CD19抗体、抗 -CD20抗体、抗 -CD 21抗体、抗 -CD22抗体、抗 -CD33抗体、抗 -CD34抗体、抗 -CD38抗体、抗 -CD45抗 体、抗 -CD54抗体、抗 -CD56抗体、抗 -CD65抗体、抗 -HLA- DR抗体、抗- HLA- DQ 抗体、抗 -HLA-DP抗体または抗 -TCR抗体)を挙げることができる。好ましくは抗 -CD 45抗体である。（1)の抗体 (杭-非精祖細胞-抗体)と (2)の抗体 (抗-白血病細胞-抗体 )との組み合わせとしては、抗 -MHC-クラス I抗体と抗 -CD45抗体との組み合わせ、ま たは抗- β 2-ミオグロブリン抗体と抗 -CD45抗体との組み合わせを挙げることができる
[0045] これらの抗体 (1)及び (2)は、対象とする抗原 (細胞マーカー）に対して特異的に結合 する抗体であればよぐその限りにおいて任意のアイソタイプ (IgA、 IgG、 IgE、 IgD、 Ig M)のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体フラグメ ント〔例えば、抗原結合部位を含む Fab断片、 F(ab')断片、 Fab'断片、 scFvのような Fv
2
断片、単離された重鎖 (H鎖)や軽鎖 (L鎖)〕等の別を問わない。好ましくはモノクロ一 ナル抗体、またはその抗体フラグメントである。
[0046] これらの抗体 (1)及び (2)は、制限はされないが、標識剤と結合した抗体 (標識抗体） であってもよい。抗体の標識は、検出可能な標識であれば特に制限されず、放射性 または非放射性同位体による標識、化学発光標識、生物発光標識、蛍光標識を挙 げることができる。
[0047] 蛍光活性ィ匕セルソーティングに使用する抗体には、蛍光色素と結合した標識抗体（ 蛍光標識抗体)を用いることが好ましい。かかる蛍光色素としては、当業界でフローサ ィトメトリー用蛍光色素として公知のものを任意に使用することができる。好ましくは、 フルォレセィンィソチォシァネート（FITC)、フィコェリスリン（Phycoerythrin: PE)、PE- Cy5 (PE-Cyanin5)、 PE— Cy5.5 (PE— Cyanin5.5)、 PE— Cy5 (PE— Cyanin7)、ローダミン イソチオシァネート、テキサスレッド（Texas Red)、 ECD (PE- Texas Red- x)、ァロフィ コサニン（APC)ゝ APC— Cy7 (APC— Cyanin 7、 PharRed)、 Per— CP (Peridinin Chloroph yllProtein)、及び PerCP- Cy5.5 (Per- CP- Cyanin5.5)等を挙げることができる。
[0048] 標識は、公知の方法を用いて、前述する抗体に上記蛍光色素を共有結合させるこ とによって行うことができる（例えば、 E.Harlow & D丄 ane,"Antibodys: A Laboratory Manual"(Cold Spring Harbor Laboratory Press, し old bpnng Harbor, New York, 198 8))0また、簡便には、商業的に入手できる蛍光色素標識抗体 (例えば「フローサイトメ トリー用蛍光標識抗体」）を用いることもできる。
[0049] またこれらの抗体 (1)及び (2)は、蛍光色素標識抗体でなくても、蛍光色素等の標識 剤で標識できるものであってもよい。力かる抗体としては、例えばピオチンまたはスト レプトアビジンで処理されてなる抗体を挙げることができる。この場合、当該抗体を、 蛍光色素等の標識剤を結合したストレプトアビジンまたはピオチンと反応させることに よって、ピオチン アビジン反応を介して、間接的に標識剤 (蛍光色素等)で標識す ることができる。従ってこの場合、本発明の試薬キットには、他の試薬成分として、蛍 光色素等の標識剤を結合したストレプトアビジンまたはピオチンを含むことが好ましい 。また、抗体 (1)または (2)として標識されていない抗体を使用する場合は、試薬キット に、他の試薬成分として蛍光色素等の標識剤で標識してなる 2次抗体 (上記各抗体 と特異的に結合する抗体)を含むことが好ましい。この場合、上記抗体 (1)または (2)を 、当該 2次抗体と反応させることによって、間接的に標識剤 (蛍光色素等)で標識する ことができる。
[0050] 本発明の試薬キットは、少なくとも上記 (1)の抗体及び (2)の抗体を有するものであれ ばよく、同一または別途分離された容器内に、他の試薬を含有するものであってもよ い。力かる他の試薬としては、例えば、前述する蛍光色素等の標識剤を結合したスト レプトアビジンまたはピオチン、または蛍光色素等の標識剤で標識してなる 2次抗体 を挙げることができる。また、他の試薬として、死細胞染色剤（例えば、 Trypan Blue, Erythrosin B、 Propiaium iodide (PI)、及び Ethidium bromiae (EB)、 i— amino- actinom ycin D等）、反応溶媒 (例えば、リン酸緩衝化生理食塩水などの緩衝化生理食塩水 など）、およびコントロール試薬を挙げることができる。なお、コントロール試薬としては 、具体的には、脊椎動物の精細胞またはその疑似物を挙げることができる。疑似物と しては、例えばその表面に精細胞の表面マーカーを有するビーズを挙げることができ る。
[0051] (III)非ヒト雄性生殖細胞集団及びその用途
本発明はまた、非ヒト雄脊椎動物に由来する、白血病細胞を含有する被験雄性生 殖細胞集団から、上記 (I)に記載する方法によって白血病細胞を分離除去することに よって得られる、非ヒト雄性生殖細胞集団に関する。
[0052] ここで脊椎動物としては、非ヒト霊長類、ィヌ、ネコ、ブタ、マウス、ラット、スナネズミ、 ノ、ムスター、ゥサギ、海生哺乳類、厚皮動物、ゥマ、ヒッジ、ブタ、及びゥシ等の哺乳 類;及びァヒル、ガチョウ、シチメンチヨウ、 -ヮトリ等を含む鳥類といったヒト以外の脊 椎動物を挙げることができる。好ましくは、一般的に薬物の有効性や安全性を確認す るための生物学的試験 (前臨床試験、非臨床試験）に使用される非ヒト脊椎動物であ る。本発明の非ヒト雄性生殖細胞集団は、上記 (I)に記載する方法によって得られる 非ヒト精細胞の集合物であって、白血病細胞が完全に除去されており、且つ少なくと も正常な生殖能を有する精子を形成する能力を有する精祖細胞 (精原幹細胞)を含 むことを特徴とする。なお、精細胞集団を構成する精細胞の数は、正常な生殖能を 有する精子を形成する能力を有する精祖細胞 (精原幹細胞）を含むものであれば、 特に制限されない。
[0053] 当該非ヒト雄性生殖細胞集団（精細胞集団）は、同種非ヒト脊椎動物の正常な子孫 を生産するために使用することができる。具体的には、かかる子孫の生産は、まず上 記の非ヒト雄性生殖細胞集団（精細胞集団）をドナーあるいは同種のレシピエント雄 脊椎動物の精巣内に移入し、その中で成熟させて精子とし、その雄脊椎動物を同種 の雌脊椎動物と交配することによって行うことができる。
[0054] 精細胞集団の精巣内への移入は、精細胞が精巣の精細管中に留まるような条件で 行われればよぐ斯くして、精細管中のライディヒ細胞またはセルトリ細胞等のサポー ト細胞の作用をうけて、卵子を受精し得る自己運動性の一倍体細胞 (雄性配偶子、 精子）に成熟する。精細胞集団の精巣内への移入は、通常マイクロピペットを使用す る直接注入法によって行うことができる。この際、併せて、精原幹細胞の分ィ匕に関わ るライディヒ細胞またはセルトリ細胞等のサポート細胞を移入してもよ ヽ。移入する細 胞濃度は、本発明の効果を得ることができれば特に制限されないが、 1 X 105〜10 X 1 05細胞 /10 μ ^¾体の範囲を例示することができる。
[0055] なお、精細胞集団を移植する対象の雄脊椎動物は、精細胞集団に由来するドナー 雄脊椎動物であっても、また同種のレシピエント雄脊椎動物であってもよい。また、制 限はされないが、当該精細胞集団を移植する対象の雄脊椎動物としては、好ましく は精子形成能が消失または低下した無精子症の雄脊椎動物を挙げることができる。 無精子症の雄脊椎動物は、例えば、雄脊椎動物に、細胞毒性アルキル剤（例えば、 ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスフアミド、メルファラン、ェチルエタンスルホン 酸等)を投与するか (化学的処理)、または当該化学的処理と γ照射などの放射線処 置とを併用することによって得ることができる。
[0056] 移入した精細胞を精巣内で精子まで成熟させた後、その雄脊椎動物を同種の雌脊 椎動物と交配することによって、雄性及び雌性配偶子が結合して受精が生起し、一 定の妊娠期間後、これらの脊椎動物の子孫が誕生する。雄性及び雌性配偶子の結 合 (交配）は、自然的交尾（自然交配）、またはインビトロまたはインビボの人工的交配 手段によって行うことができる。力かる人工的交配手段としては、制限されないが、例 えば人工媒精、人工授精、インビトロ受精、細胞質内精子注入、帯下状媒精、または 部分的帯層離断などを挙げることができる。斯くして誕生する子孫は、白血病の発症 なく正常であり、さらにその後続世代を産生する正常な生殖機能を備えることができ る (繁殖性)。
[0057] 従って、本発明の方法は、ヒト以外の悪性疾患動物（白血病動物）の化学的処理に よる雄性不妊症を矯正して正常な生殖機能を回復させ、正常な子孫を得るために使 用することができるが、さらに、例えば前臨床試験などのように、ヒトの雄性不妊症に 対する治療効果を予測評価するためにも有効に利用することができる。
[0058] また、 (I)の方法によって得られる非ヒト雄性生殖細胞集団（精細胞集団）は、同種 非ヒト脊椎動物の生殖能力の回復に有効に使用することができる。かかる方法は、上 記非ヒト雄性生殖細胞集団（精細胞集団）を、無精子症のドナーまたは同種のレシピ ェント非ヒト脊椎動物の精巣中に移入することによって行うことができる。当該方法は 、精子形成障害を有する非ヒト脊椎動物の治療に好適に用いられる。また本発明の 方法による非ヒト脊椎動物に対する治療効果は、本発明方法のヒトに対する生殖的 適用の可能性を示唆するものである。従って、本発明の方法は、例えば前臨床試験 などのように、ヒトの雄性不妊症に対する治療効果を予測評価するために有効に利 用することができる。
実施例
[0059] 以下に実施例を挙げて本発明の詳細を説明するが、本発明は実施例だけに限定 されるものではない。特に言及しない限り、下記の実施例において「％」は「w/w%」を 意味するものとする。なお、動物実験はすべて、国立大学法人大阪大学（日本)の実 験動物の注意および使用上のガイドラインに従って行った。
[0060] 実施例 1
マウス雄件牛. ¾t糸田 m から 糸田 を分 ¾ι· するために ) ¾する糸田 朐表面マーカーの確認
(1)本発明にお 、て、フローサイトメトリーによる蛍光活性ィ匕セルソーティング (FACS) によって、白血病細胞と精細胞とを分離するために用いる細胞表面マーカーは少な くとも 2つの条件を満たしている必要がある。第一に、白血病細胞の混入なく 100%純 粋な精細胞が取得できること、第二に、取得した精細胞が、移植後に精子形成するこ とのできる精祖細胞を含んでいることである。 そこで、細胞表面マーカーとして、 CD4 5と MHCクラス I〔MHCクラス I重鎖（H-2Kb/H-2Db)を使用〕を用いて、これらの有効性 を調べた。
[0061] (2)細胞の調製 具体的には、白血病細胞として C1498細胞株 (C57BL/6起源のマウスの白血病細 胞株)を、また精細胞として、正常な C57BL/6マウスの精巣力も単離した精細胞を使 用した。
[0062] なお、精細胞は下記のようにして調製した。まず精巣力も白膜を除き、精細管を、 20 mM Hepesで pH 7.3に緩衝ィ匕した、コラゲナーゼ 'Type IV(lmg/ml)(シグマ 'ケミカル 社)を含むダルベッコの修正イーグル培地（DMEM : Dulbecco's modified Eagle's medi um)に入れて、 5分間手で振盪しながら 15分間、 37°Cで培養した。得られた精細管を 、カルシウムフリーのリン酸塩緩衝ィ匕生理食塩水（PBS)で 2度洗浄し、次いでこれを 0. 25%のトリプシンおよび DNase 1(100 g/ml)(シグマ)を含む PBSの中で、 5分間隔で振 盪しながら、 37°Cで 15分間培養した。これに、 1/2容量の 10%の胎仔牛血清 (FBS)を 含む DMEMを加え、得られた細胞懸濁液を 30 m孔サイズを有するナイロン製のメッ シュでろ過し、大きな塊の細胞を除去した。斯くして得られた細胞懸濁液を精細胞と して使用した。
[0063] (3)細胞免疫染色
免疫染色は Kubotaらの方法（Kubota, H., Avarbock, M.R. & Brinster, R.L. Sperma togonial stem cells share some, but not all, phenotypic and lunctional characteristics with other stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 100, 6487-6492 (2003))に従って行 つた o
[0064] 具体的には、上記の各精細胞を、 0.5%の FBSを含む PBS(PBS/FBS)に懸濁し、氷上 で 20分間、ピオチンを結合した抗 H- 2Kb/H- 2Db抗体 (28- 8- 6; BD Biosciences Phar Mingen,サンディエゴ (CA)) (以下、「ピオチン結合-抗 H- 2Kb/H- 2Db抗体」という）と共 に培養した。次いで、多量の PBS/FBSで 2度洗浄した後、蛍光活性ィ匕セルソーティン グ（FACS)するために、蛍光標識した。具体的には PE (phycoerythrin)を結合したスト レプトアビジン (BD Biosciences PharMingen) (以下、 「PE結合-ストレプトアビジン」とい う）と FITC (Fluorescein isothiocianate)を結合した抗 CD45抗体 (30- Fl l; BD Bioscien ces PharMingen) (以下、「FITC結合-抗 CD45抗体」という）と共に 20分間培養した。な お、上記第 1抗体 (ピオチン結合-杭 H-2Kb/H-2Db抗体)および第 2の試薬 (PE結合- ストレプトアビジン、 FITC結合-杭 CD45抗体）はいずれも 5 g/mlの濃度で使用した。 [0065] 蛍光標識したこれらの細胞を最終洗浄した後、 1 μ g/mlヨウ化プロビジゥム (PI： pro pidium iodide) (シグマ ·ケミカル社)（死細胞染色剤）を含む PBS/FBSに再懸濁し (4 X 1 06細胞/ ml)、フローサイトメトリーに供するまで、暗室の氷上で保管した。
[0066] (4)フローサイトメトリーによる解析
セルソーティングは、 488nmのアルゴン 'レーザー (250mW)を装備した FACSヴアンテ ージ (BD Biosciences,サンホセ)を用いて行った。アルゴンイオンレーザーは、蛍光色 素 FITC、 PE、及び PIを励起するために使用し、 FITCから生じた蛍光は 530nmのフィ ルタ、及び PE及び PIから生じた蛍光は 575nmのフィルタで集め、検出した。
[0067] (3)で蛍光標識した各細胞をそれぞれフローサイトメトリーに供した。 C1498細胞（白 血病細胞)及び精細胞にっ 、て得られた、前方散乱光（FSC： Foward-scatter)及び 側方散乱光（SSC： Side-scatter)をパラメーターとする 2パラメーターヒストグラムを図 1 の a及び bにそれぞれ示す。各細胞について、 FSC1"811および SSClQW細胞集団エリア (G 1)内のクラスターをゲーティングし (図 la、 b)、得られたゲート領域の細胞 (G1画分）に ついて、次に、表面マーカーに対する抗体である抗 H-2Kb/H_2Db抗体及び抗 CD45 抗体、ならびに PIによる標識の有無を調べた。
[0068] なお、抗 H-2Kb/H-2Db抗体による標識の有無は、ピオチン-アビジン反応によって 抗 H-2Kb/H-2Db抗体に間接的に結合した PEの蛍光に基づ 、て、また抗 CD45抗体 による標識の有無は、抗 CD45抗体に結合した FITCの蛍光に基づ 、て評価した。
[0069] C1498細胞（白血病細胞)及び精細胞の各 G1画分について、測定パラメータ一とし て抗 H-2Kb/H-2Db抗体の標識に使用した PE、及び死細胞染色剤 (PI)の蛍光を Y軸 に、抗 CD45抗体の標識に使用した FITCの蛍光を X軸にとって、解析したヒストグラム (クオドラントリージョン)を図 1の c及び dにそれぞれ示す。
[0070] 図 lcに示すように、 C1498細胞については、ゲート領域 (FSChighおよび SSC1™細胞 集団エリア） (G1)内の細胞の 99.7%力 抗 H- 2Kb/H- 2Db抗体および抗 CD45抗体の 両方に反応した（陽性反応)。一方、図 Idに示すように、精細胞についてはゲート領 域 (FSChighおよび SSClQW細胞集団エリア) (G1)内の細胞の 93.5%力 抗 H- 2Kb/H- 2Db 抗体および抗 CD45抗体の両方に対して陰性であった。そして、抗 H-2Kb/H-2Db抗 体及び抗 CD45抗体に対する陰性画分〔抗 H-2Kb/H-2Db抗 (-)/抗 CD45抗体 (-)画 分〕（G2)には C1498細胞は一切含まれていな力つた (図 lc、 d)。さらに、当該画分 (G2 )の細胞は、死細胞染色剤である PIに対しても陰性を示した。
[0071] し力しながら、抗 H-2Kb/H-2Db抗体に対して陽性で抗 CD45抗体に対して陰性の画 分〔抗 H-2Kb/H-2Db抗体 (+)Z抗 CD45抗体 (-)画分〕（G4)には C1498細胞が 0.3%含 まれていた。なお、「抗 H-2Kb/H-2Db抗体 (-)/抗 CD45(-)抗体画分」（G3)に含まれ る細胞が精細胞であることは、 TRA 98(精細胞の核に対する特異マーカー)に対して 陽性反応を示すことから確認された（Tanaka, H. et al.， Int J Androl 20, 361-366 (19 97))。
[0072] 以上の結果から、 2つの抗体（CD45に対する抗体、 MHCクラス I重鎖 (H-2Kb/H-2Db )に対する抗体)を組み合わせて用いることによって、精細胞と白血病細胞とを厳格に 分離することができることが判明した (図 1)。
[0073] ¾細12
ヒト雄件 ^盲細g m から a rfn. 細g >¾ι·除 するために ^する細 面マーカーの確認
(1)ヒトの細胞を対象として、細胞表面マーカー（CD45に対する抗体 [以下、「抗 -CD 45抗体」という]、ヒト MHCクラス Iに相当する HLA-A,B,Cに対する抗体 [以下、抗 HLA- A,B,C抗体と 、う])の有効性を調べた。
[0074] (2)細胞の調製
ヒト白血病細胞として Jurkat細胞株 (ヒト白血病細胞株)を使用した。
[0075] (3)細胞免疫染色
免疫染色は、実施例 1 (3)と同様に Kubotaらの方法に従って行った。具体的には、 上記のヒト白血病細胞を 0.5%の FBSを含む PBS(PBS/FBS)に懸濁し、フローサイトメトリ 一するために、 PE (phycoerythrin)を結合した抗 HLA-A,B,C抗体（28-8-6; BD Biosc iences PharMingen,サンディエゴ (CA)) (以下、「PE結合-抗 HLA-A,B,C抗体」と FITC (Fluorescein isothiocianate を結合した饥じ045饥'体 (30— Fll; BD Biosciences Phar Mingen) (FITC結合-杭 CD45抗体）と共に 20分間培養した。蛍光標識したこれらの細 胞を最終洗浄した後、 1 μ g/mlヨウ化プロビジゥム（PI :propidium iodideXシグマ'ケミ カル社)（死細胞染色剤）を含む PBS/FBSに再懸濁し (4 X 106細胞/ ml)、フローサイトメ トリーに供するまで暗室の氷上で保管した。
[0076] (4)フローサイトメトリーによる解析
フローサイトメトリーは実施例 1 (4)と同様の方法で行った。具体的には、（3)で蛍光 標識した各細胞をそれぞれフローサイトメトリーに供した。ヒト白血病細胞について得 られた、前方散乱光（FSC： Foward- scatter)及び側方散乱光（SSC： Side-scatter)を パラメーターとする 2パラメーターヒストグラムを図 2の aに示す。各細胞について、 FSC highおよび SSClQW細胞集団エリア (G1)内のクラスターをゲーティングし (図 2a)、得られた ゲート領域の細胞 (G1画分）について、次に、表面マーカーに対する抗体である抗 H LA-A,B,C抗体及び抗 CD45抗体、ならびに PIによる標識の有無を、実施例 1と同様 の方法により調べた。
[0077] Jurkat細胞株（ヒト白血病細胞）の各 G1画分について、測定パラメータ一として抗 H LA-A,B,C抗体の標識に使用した PE、及び死細胞染色剤 (PI)の蛍光を Y軸に、抗 CD 45抗体の標識に使用した FITCの蛍光を X軸にとって、解析したヒストグラム (クオドラ ントリージョン)を図 2の bに示す。図 2bに示すように、ゲート領域 (FSChighおよび SSClQW 細胞集団エリア） (G1)内の細胞の 99.6%力 抗 HLA-A,B,C抗体および抗 CD45抗体 の両方に反応した（陽性反応)。一方、抗 HLA-A,B,C抗体及び抗 CD45抗体に対す る陰性画分〔抗 HLA-A,B,C抗体 (-) Z抗 CD45抗体 (-)画分〕（G2)には Jurkat細胞株（ ヒト白血病細胞）は一切含まれていな力つた (図 2b)。さらに、当該画分 (G2)の細胞は 、死細胞染色剤である PIに対しても陰性を示した。
[0078] 以上の結果から、 2つの抗体（CD45に対する抗体、ヒト MHCクラス I (HLA_A,B,C)に 対する抗体)を組み合わせて用いることによって、ヒト精細胞とヒト白血病細胞とを厳 格に分離することができることが判明した (図 2)。
[0079] 実施例 3
(1)ドナー雄脊椎動物およびレシピエント雄脊椎動物の調製
(1-1)ドナー雄脊椎動物の調製
ドナー雄脊椎動物として白血病に罹患したマウス（白血病マウス）を使用した (以下 、「ドナー ·マウス」ともいう）。当該白血病マウスは、 C57BL/6マウス (3週齢、静岡実験 動物センターより入手）または acrosin/eGFP(Acr3- EGFP)及び pCX- EGFP(C57BL/6 TgN(acro/act-EGFP)OsbC3-N01-FJ002)を有することによって GFP(Green Fluoresc ent Protein)を発現するように組み換えられた遺伝子組換えマウス (6週齢）（以下、「 GFPマウス」と称する）〔Ohta, H., et al., Dev Growth Differ 42, 105-112 (2000) ;Naka nishi, T. et al, FEBS Lett 449, 277-283 (1999)〕に、 200 μ 1の PBSで調製した 1 X 107 個の C1498細胞〔C57BL/6起源のマウスの白血病細胞株、 ATCCより入手〕を腹腔内 注入することによって作成した。なお、この C1498細胞（白血病細胞）の接種量は、予 備試験で予め最適量を決めてお!、た。
[0080] これらの白血病マウス（C57BL/6マウス、 GFPマウス）は、 C 1498細胞を注入してから 2週間後に白血病の末期症状である出血性腹水を発症して死亡した。死亡後、両方 の精巣を切除して取得した。
[0081] (1-2)レシピエント雄脊椎動物の調製
レシピエント雄脊椎動物として、精子形成能を消失させた雄マウスを使用した (以下 、 「レシピエント 'マウス」と称する）。当該レシピエント 'マウスは、 C57BL/6マウス（4週 齢、静岡実験動物センターより入手）に、慢性骨髄性白血病の治療に使用されるァ ルキル化剤であるブスルファン (40mg/kg、シグマ'ケミカル社、セントルイス)を投与す ることによって精子形成能を消失させて、作成した。
[0082] (2)ドナー雄脊椎動物からの雄性生殖細胞 (精細胞)の調製
(1)で作成したドナ一'マウス（C1498注入した C57BL/6マウス、 C1498注入した GFP マウス)力も切除した精巣力も精細胞を取得した。また比較対照用に、正常な C57BL /6マウス力もも精巣を切除し、精細胞を取得した。詳細には、まず各精巣から白膜を 除き、精細管を、 20mM Hepesで pH 7.3に緩衝ィ匕した、コラゲナーゼ 'Type IV(lmg/m 1)(シグマ'ケミカル社)を含むダルベッコの修正イーグル培地（DMEM : Dulbecco's mo dified Eagle's medium)に入れて、 5分間手で振盪しながら 15分間、 37°Cで培養した。 得られた精細管を、カルシウムフリーのリン酸塩緩衝ィ匕生理食塩水（PBS)で 2度洗浄 し、次いでこれを 0.25%のトリプシンおよび DNase 1(100 g/ml)(シグマ)を含む PBSの 中で、 5分間隔で振盪しながら、 37°Cで 15分間培養した。これに、 1/2容量の 10%の 胎仔牛血清 (FBS)を含む DMEMをカ卩え、得られた細胞懸濁液を 30 m孔サイズを有 するナイロン製のメッシュでろ過し、大きな塊の細胞を除去して、精細胞を調製した。 なお、以下、 C 1498注入した GFPマウスに由来する精細胞を「GFP精細胞」、 C 1498注 入した C57BL/6マウス及び正常な C57BL/6マウスに由来する精細胞を「非 GFP精細 胞」と称して両者を区別する。
[0083] (3)細胞免疫染色
実施例 1の（3)と同様に、 Kubotaらの方法に従って、（2)で取得した精細胞を免疫 染色した。
[0084] 具体的には、上記の各精細胞（非 GFP精細胞、 GFP精細胞）を、 0.5%の FBSを含む PBS(PBS/FBS)に懸濁し、氷上で 20分間、ピオチンを結合した抗 H-2Kb/H-2Db抗体（ 28-8-6; BD Biosciences PharMingen,サンディエゴ (CA))と共に培養した。次いで、 多量の PBS/FBSで 2度洗浄した後、蛍光活性ィ匕ソーティング (FACS)するために、非 GFP精細胞については、 PE結合-ストレプトアビジン (BD Biosciences PharMingen)と F ITC結合-抗 CD45抗体 (30- Fll; BD Biosciences PharMingen)と共に 20分間培養し た。また、 GFP精細胞については、 PE結合-ストレプトアビジンと PE-Cy5を結合した抗 CD45抗体 (30- Fll; BD Biosciences PharMingen)と共に 20分間培養した。なお、上 記第 1抗体 (ピオチン結合-杭 H-2Kb/H-2Db抗体)および第 2の試薬 (PE結合ストレブ トァビジン、 FITC結合-抗 CD45抗体または PE-Cy5結合-抗 CD45抗体）はいずれも 5 /z g/mlの濃度で使用した。
[0085] 反応後、これらの精細胞は最終洗浄した後、死細胞染色剤であるヨウ化プロピジゥ ム（PI :propidium iodideXシグマ'ケミカル社)を 1 μ g/ml含む PBS/FBSに再懸濁し (4 X 106細胞/ ml)、蛍光活性ィ匕ソーティング (FACS)に供するまで、暗室の氷上で保管し た。
[0086] (4)フローサイトメトリー及びセルソーティング
(3)で得られた精細胞のうち、 C1498注入した C57BL/6マウス（白血病マウス）に由 来する非 GFP精細胞を、実施例 1 (4)と同様にして、フローサイトメトリーに供した。レ 一ザ一は FITC、 PE、および PIを励起するために使用し、 FITCから生じた蛍光は 530η mのフィルタ、 PE及び PIから生じた蛍光は 575nmのフィルタで集め、検出した。この非 GFP精細胞の、前方散乱光（FSC： Foward- scatter)及び側方散乱光（SSC： Side-scat ter)による 2パラメーターヒストグラムを図 3の aに示す。これから、 FSChighおよび SSC1™ 細胞集団エリア (Gl)内のクラスターをゲーティングし (図 3a)、得られた細胞 (G1画分） について、実施例 1 (4)と同様にして、抗 H-2Kb/H-2Db抗体、抗 CD45抗体及び PIに よる標識の有無を調べた。なお、抗 H-2Kb/H-2Db抗体による標識の有無は、ビォチ ン-アビジン反応によって抗 H-2Kb/H-2Db抗体に間接的に結合した PEの蛍光に基づ いて、また抗 CD45抗体による標識の有無は、抗 CD45抗体に結合した FITCの蛍光に 基づいて評価した。 C57BL/6マウス（白血病マウス）に由来する非 GFP精細胞の G1 画分について、抗 H-2Kb/H-2Db抗体に対する反応、抗 CD45抗体に対する反応及び PIに対する反応を 3パラメーターヒストグラムで示した結果を図 3の bに示す。
[0087] 抗 H-2Kb/H-2Db抗体、抗 CD45抗体及び PIに反応しな 、細胞集団エリア (G2) (陰性 画分)をゲーティングし、当該細胞画分〔抗 H-2Kb/H-2Db抗体 (-)/抗 CD45抗体 (-) ZPI(-)画分〕（G2画分)を「精細胞画分」としてソーティングした。また、抗 H-2Kb/H-2 Db抗体及び抗 CD45抗体に反応する細胞集団エリア (G3) (陽性画分)をゲーティング し、当該細胞画分〔抗 H-2Kb/H-2Db抗体 (+)/抗 CD45抗体 (+)〕（G3画分)を「白血病 細胞画分」としてソーティングした（図 3b)。なお、細胞は 10%の FBSを含む 2ml DME M(DMEM/FBS)を入れた 5ml容量のチューブ内にソートした。 FSC閾値をセットして細 胞残屑を除外した。得られた G2画分及び G3画分の細胞は、それぞれ全非 GFP精細 胞の 51.4%及び 2.5%に相当した。
[0088] 斯くしてソーティングした各画分の細胞の生存能力をトリパンブルー排除能によって 評価した。 ソートした各細胞を遠心分離し、 10mlの冷 DMEM/FBSに再懸濁し、 5%の COでガス処理して、 4°Cで終夜保存した。
2
[0089] このようにして、 10,000例のデータを、 CELLQuestソフトウェア (BD Biosciences)で解 祈した。
[0090] (5)腹腔内への注入
(4)において、 C1498注入した C57BL/6マウス（白血病マウス）の非 GFP精細胞から ソーティングした精細胞画分 (G2)及び白血病細胞画分 (G3)の細胞を、それぞれ 10 0 /z l PBS/FCSに懸濁した。精細胞画分の濃度は 2 X 106細胞/ mlであり、白血病細胞 画分の濃度はおよそ 1 X 105細胞/ mlであった。各細胞の懸濁液を、レシピエント 'マウ スに腹腔内注入した。その結果、精細胞画分 (G2)の細胞を注入した 12匹のマウスは 全て 300日間白血病の発症なく生存した。一方、白血病細胞画分 (G3)の細胞を注入 した 12匹のマウスは全て 40日以内に出血性の腹水を有する末期白血病の典型的な 兆候を示し、死亡した（図 3c)。このことから、精細胞画分 (G2)には白血病細胞が混 入して!/、な!/、ことが判明した。
[0091] (6) C 1498注入した GFPマウスから単離した精細胞の移植
C 1498注入した GFPマウスから取得した GFP精細胞を、（4)に記載する方法に従つ て、フローサイトメトリーに供した。レーザーは PE、 PE-Cy5および PIを励起するために 使用し、 PE及び PIから生じた蛍光は 575nmのフィルタ、および PE-Cy5から生じた蛍光 は 682nmのフィルタで集めて検出した。まず FSChighおよび SSC1™細胞集団エリア (G1) 内のクラスターをゲーティングし、得られた細胞 (G1画分）について、上記 (4)と同様 にして、抗 H-2Kb/H_2Db抗体、抗 CD45抗体及び PIによる標識の有無を調べた。なお 、抗 H-2Kb/H-2Db抗体による標識の有無は、ピオチン-アビジン反応によって抗 H-2 Kb/H-2Db抗体に間接的に結合した PEの蛍光に基づ 、て、また抗 CD45抗体による 標識の有無は、抗 CD45抗体に結合した PE-Cy5の蛍光に基づいて評価した。 GFPマ ウスから取得した GFP精細胞は FITC陽性領域に位置するため、上記 (4)で使用した FITC結合-抗 CD45抗体の代わりに PE-Cy5結合-抗 CD45抗体を用いた。
[0092] 抗 H-2Kb/H-2Db抗体、抗 CD45抗体及び PIに反応しな 、細胞集団エリア (G2) (陰性 画分)をゲーティングし、当該細胞画分〔抗 H-2Kb/H-2Db抗体 (-)/抗 CD45抗体 (-) ZPI(-)画分〕（G2画分)を「精細胞画分」としてソーティングした。得られた精細胞画 分（G2)を、注入培地 (138mM NaCl、 8.1mM Na HPO、 2.7mM KC1、 l.lmM KH PO
2 4 2 4
、 O.lmM EDTA、 5.5mMグルコース、 5mg/mlゥシ血清アルブミン、 100 g/ml DNase I および 0.4mg/mlのトリパンブルー)で洗浄した〔Brinster, R.L. et al.， Proc Natl Acad S ci U S A 91, 11298-11302 (1994)〕。得られた精細胞画分（G2)に含まれる生細胞の 割合は、トリパンブルー排除能の測定により 95%以上であることが確認された。
[0093] 洗浄した精細胞画分 (G2)の細胞を、 1 X 108細胞/ mlの濃度になるように注入培地 に懸濁し、これをドナー細胞懸濁液とした。
[0094] 斯くして得られたドナー細胞懸濁液を、レシピエント 'マウスの精巣に、 1つの精巣当 たりおよそ 10 1の割合で投与した。具体的には、ブスルファン処理して精子形成能 を消失させたレシピエント 'マウス (ブスルファン処理後 4週間め）の精巣輸出管の中 に、上記ドナー細胞懸濁液を注入した (精細胞移植） [Ohta, H., et al, Dev Growth Differ 42, 105-112 (2000)〕。精細胞移植から 8週間後も、このレシピエント 'マウスが 全て (n=6)生存して ヽた（図 4)。
[0095] 一方、比較実験のため、同様にして、 C 1498注入した GFPマウスから、セルソーティ ングすることなく取得した精細胞 (GFP精細胞）を、同様にして移植したレシピエント · マウスは、移植から 2週間以内に全て (n=6)末期白血病の典型的な兆候を示した（図 4)。この末期白血病の兆候を示したマウスを移植力 2週間目に屠殺し、精巣を取得 し、分析に供した。具体的には、精巣を Bouinの溶液中に固定し、ノ ラフィンに埋め込 み、これから 5 m厚の切片を作成して、へマトキシロンとェォシンで染色した。その結 果、図 5a及び bに示すように、白血病細胞の混入が認められた。
[0096] 一方、セルソーティングして得られた上記ドナー細胞懸濁液を移植したレシピエント
'マウスの精巣を紫外線 (UV)光に曝露させて、オリンノ ス SZX- 12カメラで撮影した。 その結果、 12匹のレシピエント 'マウスのうち 11匹の精巣の精細管中に、移植したドナ 一精細胞 (GFPドナー精細胞）が観察された（図 5d〜； 0。そこでこのレシピエント 'マウ スの精巣を、エチレングリコール 'メタクリル酸塩 (Technovit 8100; Kultzer、 Wehrheim( ドイツ))に埋め込み、 4°Cで 4%のパラホルムアルデヒドに終夜固定し、 5 μ m厚の連続 切片を、 50 m間隔で調製した。調製した切片を GFP蛍光で観察した後、へマトキシ ロンで染色し、顕微鏡の下で観察した。その結果、図 5g〜iに示すように、 GFPドナー 精細胞を含む精細管中で、正常な精子形成及び成熟した精子が観察された。また、 その精巣には、組織学的分析によって、白血病細胞は認められな力つた。
[0097] 以上のことから、本発明の方法でセルソーティングによって得られた精細胞画分 (G 2)には、精子形成能を有する精祖細胞の十分な数を含んでおり、白血病細胞は混 入して 、な 、ことが確認された。
[0098] (7)卵細胞質内への精子注入
上記のレシピエント 'マウスの精巣力 得られた精子が、正常な繁殖能力を有する 力どう力を言周べた。
[0099] まず、セルソーティングにより得られた上記ドナー細胞懸濁液を移植したレシピエン ト 'マウスの精巣から、移植後 8週目に精子を取得した。具体的には、蛍光実体顕微 鏡の下で、緑の蛍光を発する精細管をレシピエントの精巣から集め、これをはさみで 裁断し、 Hepes-CZB培地中に懸濁した (GFP精液懸濁液)。
[0100] 一方、成熟した卵母細胞は雌性マウス (BDF1)から下記のようにして集めた。
[0101] まず雌性マウス (BDF1)に、 5IUの妊馬血清性性腺刺激ホルモン (帝国臓器社)を腹 腔内投与し、次いで 48時間後に 5IUのヒト絨毛性性腺刺激ホルモン (hCG;帝国臓器 社)を腹腔内投与することによって、過剰に排卵を誘導した。 hCG注入後 13-15時間 めに、卵管膨大部力も成熟した卵母細胞を集めた。集めた卵母細胞は、 Hepes-CZB 培地で調製した 0.1%の牛精巣のヒアル口-ダーゼ (シグマ)で処理することによって卵 丘細胞から遊離させた。得られた卵母細胞を洗浄し、精子注入まで 37°C、 5%の CO
2 条件下で、新鮮な CZB培地中で保存した。
[0102] レシピエント 'マウスの精巣から集められた GFP精液懸濁液の約 2 μ 1を、 12%(w/v)ポ リビュルピロリドン (PVP;Mr 360 000;和光純薬工業)を含む Hepes-CZB培地 1滴と混 合した。精子の頸部領域に圧電性のパルスを当てることによって、精子の頭部を、尾 咅 |5と分離し 、 Kimuraらの方法 (Kimura, Y. & Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sper m injection in the mouse. Biol Reprod 52, 709—720 (1995))に従って、上記で調製し た卵母細胞に注入した。斯くして得られた卵母細胞は、空気中、 37°Cおよび 5%の C 0の条件下、 CZB培地中で培養した。形成された 42の胚（ェンブリオ）のうち 40 (95.2
2
%)が培養 24時間以内に、 2細胞期に発展した。その 2細胞期の胚を、 0.5-dpcの偽妊 娠した ICR雌性マウスの卵管へ移植したところ、合計 12匹のマウス（28.6%)が生まれ た。へミ接合性の GFP遺伝子組換えマウスを使用したので、得られた仔マウスの約半 分 (5匹）が励起光の下で GFPに由来する緑色の蛍光を示した。これは受精した精子 が移植した GFP精細胞に由来することを示す。このこと力ら、レシピエント 'マウスの精 巣力 セルソーティングによって得られた精細胞画分 (G2)力 派生した精子が正常 な繁殖能力を有すること、すなわち当該精細胞画分 (G2)に含まれる精細胞は十分 な精子形成能を備えて ヽることが確認された。
[0103] <考察 >
今まで、小児癌に対する化学療法によって生じる無精子症の男性に、父親になる 機会を与える臨床技術はない。この問題を克服する方法として、精祖細胞および精 母細胞を有する思春期前の患者であれば、化学療法の前に精巣組織を取得して保 存しておく方法がある。精巣の精細管は化学療法の後も機能的なセルトリ細胞を含 んでいるので〔Ohta, H., etal, Int J Androl 24, 15-23 (2001) ; Ohta, H.， et al., Devel opment 127, 2125-2131 (2000)〕、精細管に精祖細胞や精母細胞を自家移植するこ とによって未熟な精細胞を精子まで成熟させることができる。 し力しながら、これを臨 床に応用するには、克服すべき 3つのハードルがある。 第 1に、再発を防止するため に、移植する精細胞力も癌細胞を一つ残らず除去しなければならな ヽ CJahnukainen, K., et al" Cancer Res 61, 706—710 (2001); Goldie, H" et al., Cancer Res 13, 125-1 29 (1953)〕。第 2に、一つの精巣はレシピエントの精巣として残しておかなければなら な 、から、もう一方の精巣から分離した少量の精細胞 (特に精祖細胞)を生体外で増 殖させなければならない。第 3に、単離した未熟な精細胞 (精祖細胞）は、自家移植 によって正常な精祖細胞となり、更に生じる成熟した精子が受胎可能となるようなもの でなければならない。
[0104] 上記の第 2番目のハードルに関しては、最近、精祖細胞が in vitroで培養でき、長 期間にわたり増殖生存することが報告された [Nagano, M., et al., Biol Reprod 68, 22 07-2214 (2003); Kanatsu— Shinohara, M. et al. Biol Reprod 69, 612—616 (2003)〕。精 祖細胞は、 5か月間の培養で、 1014倍に増殖する。また第 3番目のハードルに関して は、私たちは、既に、正常な精祖細胞を形成する精細胞の移植方法を確立し〔Brinst er, R丄. et al" Proc Natl Acad Sci U S A 91, 11298—11302 (1994);Brinster, R丄. et al" Proc Natl Acad Sci U S A 91, 11303-11307 (1994); Kanatsu— Shinohara, M. et al . Hum Reprod 18, 2660-2667 (2003)]、また移植された精細胞が正常な精子形成能 及び受胎能力を有することを報告した〔Ohta, H. et al., Int J Androl 24, 15-23 (2001 );Ohta, H" et al" Development 127, 2125—2131 (2000); Ohta, H., et al., Dev Grow th Differ 42, 105-112 (2000); Kimura, Y. et al" Biol Reprod 52, 709-720 (1995)〕。 これらの従来技術によって、上記の第 2と第 3のハードルは回避できる。
[0105] 残る問題は、第 1の問題、すなわち精巣の精細胞から癌細胞を完全に分離し、移 植後の再発を防止する方法を開発することである。上記の実施例に示すように、私た ちは、フローサイトメトリーによるセルソーティングにより、
Figure imgf000029_0001
分 (G1)を取得し、さらにこの画分力 蛍光活性ィ匕セルソーティング (FACS)により、抗 H-2Kb/H-2Db抗体および抗 CD45抗体と反応しない抗 H-2Kb/H-2Db抗体 (-)/抗 CD 45抗体 (-)画分 (G2)を取得することによって、白血病マウスの精巣力 精祖細胞活性 を有する精細胞を、白血病細胞と完全に分離して取得するのに成功した。そして、こ の精細胞を移植細胞として使用することで、ブスルファン (慢性骨髄性白血病の治療 に使用されるアルキル化剤)で処理して精子形成能を消失させた雄性マウスの生殖 能力を、白血病を引き起こすことなぐ復元することに成功した。
[0106] 以上説明するように、フローサイトメトリーにより、
Figure imgf000029_0002
（G1)の ゲーティングと、 2つの表面マーカー（H-2Kb/H-2Dbおよび CD45)を用いた FACSとを 組み合わせることによって、白血病細胞をすベて除去して精祖細胞活性を有する精 細胞画分 (G2)を取得することが可能になった。当該精細胞画分 (G2)を注入した 12匹 のマウスはすべて 300日間にわたり白血病の発症することなく生存した。予備試験に より 10個の C1498細胞の接種を受けたマウスが 40日以内で白血病になること、また、 わず力 1個の C1498細胞の接種を受けたマウスもまた白血病になることが確認されて いることから〔Goldie, H" et al.， Cancer Res 13, 125-129 (1953)〕、上記精細胞画分 ( G2)から白血病細胞が完全に除去されていることが示された。また、得られた精細胞 を移植したレシピエント 'マウスは白血病に罹患せず、正常な精子を形成して、その 精子力 正常なマウスが誕生した。このことは、小児白血病の抗癌治療に伴う男性不 妊の治療に、本発明の方法によって白血病細胞を分離除去して得られる精細胞の 自家移植が有効であることを示すものである。
図面の簡単な説明
[0107] [図 1]図 a及び cは、白血病細胞（C1498細胞）のフローサイトメトリーの結果を、図 b及 び dは正常な C57BL/6マウスに由来する精細胞（Germ cells)のフローサイトメトリーの 結果を示す。図 aと bは、それぞれ白血病細胞 (C 1498細胞)及び精細胞について得 られた、前方散乱光（Forward scattenFSC)及び側方散乱光（Side scatter:SSC)に対 する 2パラメーターヒストグラムを示す。図 cは、白血病細胞（C1498細胞）について上 記 2パラメーターヒストグラム力もゲーティングした FSChighと SSC1™の細胞集団画分 (G1 画分）の、抗 CD45抗体、抗 H-2Kb/H-2Db抗体、及び PI (propidium iode)に対する反 応を示すヒストグラムである（4分割)。図 dは、精細胞について上記 2パラメーターヒス トグラム力ゝらゲ一ティングした FSChighと SSCtowの細胞集団画分 (G1画分)の、抗 CD45抗 体、抗 H-2Kb/H_2Db抗体、及び PIに対する反応を示すヒストグラムである (4分割)。
[図 2]図 a及び bは、ヒト白血病細胞 (Jurkat細胞株）のフローサイトメトリーの結果を示 す。図 aはヒト白血病細胞について得られた前方散乱光（Forward scatter: FSC)及び 側方散乱光（Side scatter: SSC)に対する 2パラメーターヒストグラムを示す。図 bは、ヒ ト白血病細胞について上記 2パラメーターヒストグラム力 ゲーティングした FSC1"8*1と SS ClQWの細胞集団画分 (G1画分)の、抗 CD45抗体、抗 HLA-A,B,C抗体、及び PIに対す る反応を示すヒストグラムである（4分割)。
[図 3]実施例 3 (4)で行ったフローサイトメトリーの結果を示す図である。図 aは、 C1498 注入したマウスの精細胞（非 GFP精細胞）の、前方散乱光（Forward scatter:FSC)及 び側方散乱光（Side scatter: SSC)に対する 2パラメーターヒストグラムであり、図 bは、 上記 2パラメーターヒストグラム力もゲーティングした FSChighと SSClowの細胞集団画 分（G1画分）の、抗 CD45抗体、抗 H-2Kb/H-2Db抗体、及び PI (propidium iode)に対 する反応を示すヒストグラムである（4分割）。 H-2Kb/H-2Db (-)および CD45(-)画分（ G2画分）は精細胞を、 H-2Kb/H-2Db(+)および CD45(+)画分 (G3画分）は、白血病細 胞を含む。図 cは FACSによって分離した G2画分 (精細胞画分）（破線)及び G3画分（ 白血病細胞）（実線)をレシピエント 'マウスに腹腔内注入した後の当該レシピエント' マウスの生存率（survival (%))を経時的（days)に示した図である。
[図 4]C1498注入した GFPマウスに由来する GFP精細胞のうち、フローサイトメトリーに よってセルソーティングした G2画分の精細胞 (点線、 n=6)、またはセルソーティングし ないで取得した精細胞 (実線、 n=6)を、それぞれレシピエント 'マウスの精細管に移植 した後の、当該マウスの生存率（survival (%))を経時的（days)に示す図である。
[図 5]ブスルファンで処理した無精子症のレシピエント 'マウスの精細管に、白血病 GF Pマウスの精細胞を移植した後の、当該レシピエント 'マウスの精巣を観察した結果を 示す。図 a及び bは、セルソーティングしない精細胞を移植した後 2週間目のレシピエ ント ·マウスの精巣の切片をへマトキシロンおよびェォシンで染色した結果を示す。図 cは、白血病 GFPマウスの精巣力 セルソーティングした精細胞画分 (G2画分)を移 植した後 8週目のレシピエント 'マウスの精巣を示す画像であり、図 dはそれを蛍光検 出した画像である。図 eは、そのレシピエント 'マウスの精巣から取り出した精細管の画 像、及び図 fは、それを蛍光検出した画像である。移植したドナー精細胞 (緑)がレシ ピエントの精細管中に集積しているのが認められる。図 gは、レシピエント.マウスの精 巣から単離した精細胞を示す。 図 h及び iは、ソートされた精細胞画分を移植したレシ ピエント ·マウスの精巣の切片をへマトキシロン染色（図 h)した画像、それを蛍光検 出した画像（図 i)である。なお、各図のスケールバーの大きさは、図 a、 c、 d、 e、 fにつ いては lmm、図 bについては 10 πι、図 gについては 20 m、図 h、 iについては 100 mで fc 。
[図 6]図 aは、実施例 3 (6)においてセルソーティングして取得した GFP精細胞（ドナー 精細胞）を移植したレシピエント 'マウスの精巣力 得られた GFP精子を、卵母細胞質 内に注入して交配することによって誕生した正常な子孫 (仔マウス）を示す。 図 bは、 それを蛍光下で観察した結果である。これから移植したドナー精細胞に由来する精 子が正常であることがわかる。

Claims

請求の範囲
[1] 白血病細胞を含む被験雄性生殖細胞集団から、白血病細胞を分離または除去す る方法であって、当該被験雄性生殖細胞集団から、精原幹細胞を含有する画分 (精 原幹細胞画分)を取得し、次 、で当該画分から精祖細胞に発現しな 、表面マーカー に対する抗体及び白血病細胞に発現する表面マーカ一に対する抗体の両方に対し て非反応の細胞画分を取得する方法。
[2] 精祖細胞に発現しない表面マーカー力 MHC-クラス I、 β 2-ミオグロブリン、及び Sc a-はりなる群力 選択される少なくとも 1つであり、白血病細胞に発現する表面マー カー力 CD2、 CD3、 CD7、 CD10、 CD13、 CD14、 CD15、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22 、 CD33、 CD34、 CD38、 CD45、 CD54、 CD56、 CD65、 HLA- DR、 HLA-DQ, HLA- DP および TCRよりなる群力 選択される少なくとも 1つである、請求項 1記載の方法。
[3] フローサイトメトリーを用いて行う方法であって、精祖細胞に発現しない表面マーカ 一に対する抗体及び白血病細胞に発現する表面マーカーに対する抗体として、直 接又は間接的に蛍光標識された抗体を用いて、当該抗体に対して非反応の細胞画 分の取得を蛍光活性ィ匕セルソーティングによって実施する請求項 1または 2記載の方 法。
[4] 白血病細胞を含む被験雄性生殖細胞集団が、白血病に罹患した雄性脊椎動物の 精巣から取得した生殖細胞の集団である、請求項 1乃至 3のいずれかに記載する方 法。
[5] 白血病細胞を含む被験雄性生殖細胞集団から白血病細胞を分離または除去する ための試薬キットであって、少なくとも蛍光活性ィ匕セルソーティング用抗体として、精 祖細胞に発現しな 、表面マーカーに対する抗体及び白血病細胞に発現する表面マ 一力一に対する抗体を含む、試薬キット。
[6] 精祖細胞に発現しない表面マーカー力 MHC-クラス I、 β 2-ミオグロブリン、及び Sc a-はりなる群力 選択される少なくとも 1つであり、白血病細胞に発現する表面マー カー力 CD2、 CD3、 CD7、 CD10、 CD13、 CD15、 CD14、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22 、 CD33、 CD34、 CD38、 CD45、 CD54、 CD56、 CD65、 HLA- DR、 HLA-DQ, HLA- DP および TCRよりなる群力も選択される少なくとも 1つである、請求項 5記載の試薬キット
[7] 非ヒト雄脊椎動物に由来する白血病細胞を含有する被験雄性生殖細胞集団から、 請求項 1乃至 4のいずれかの方法によって白血病細胞を分離除去することによって 得られる、非ヒト雄性生殖細胞集団。
[8] 上記請求項 7記載の非ヒト雄性生殖細胞集団を、ドナーまたは同種のレシピエント 雄脊椎動物の精巣中に移入し、当該雄脊椎動物を同種の雌脊椎動物と交配して、 非ヒトの子孫脊椎動物を生産する方法。
[9] 上記レシピエント雄脊椎動物が無精子症の非ヒト雄脊椎動物である、請求項 8記載 の方法。
[10] 交配が、雄脊椎動物と同種の雌脊椎動物との自然交配、雄脊椎動物の精子による 雌脊椎動物の人工授精、雄脊椎動物の精子による雌脊椎動物の卵子のインビト口受 精、細胞質内精子注入、帯下状媒精、及び部分的帯層離断よりなる群から選択され る方法によって達成される請求項 8または 9記載の方法。
[11] 無精子症の非ヒト雄脊椎動物の生殖能力を回復する方法であって、請求項 7記載 の非ヒト雄性生殖細胞を、無精子症のドナーまたは同種のレシピエント非ヒト雄脊椎 動物の精巣中に移入することを含む、方法。
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