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WO2006070718A1 - 全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患に対する薬剤及び、それら薬剤のスクリーニング方法 - Google Patents

全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患に対する薬剤及び、それら薬剤のスクリーニング方法 Download PDF

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WO2006070718A1
WO2006070718A1 PCT/JP2005/023734 JP2005023734W WO2006070718A1 WO 2006070718 A1 WO2006070718 A1 WO 2006070718A1 JP 2005023734 W JP2005023734 W JP 2005023734W WO 2006070718 A1 WO2006070718 A1 WO 2006070718A1
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WO
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gpbarl
bile acid
gene
test compound
disease
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PCT/JP2005/023734
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French (fr)
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Takaharu Maruyama
Kenichi Tanaka
Yoshitaka Tamai
Jun Suzuki
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MSD KK
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Banyu Phamaceutical Co Ltd
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Priority to EP05842245A priority patent/EP1837398A4/en
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis

Definitions

  • the present invention relates to a drug for a disease associated with an increase or decrease in the total amount of bile acid pool or a lipid metabolic disease, and a screening method for the drug.
  • the present invention relates to a test method and a test drug for a disease associated with an increase or decrease in the total bile acid pool amount or lipid i-ejection disease.
  • the present invention relates to a genetically modified non-human mammal characterized in that the expression of Gpbarl gene is artificially suppressed.
  • Bile acids are synthesized from cholesterol in the liver and play an extremely important role not only in the solubilization of fats in food, but also in the maintenance of bile acid and cholesterol homeostasis (non-patents). References 1, 2). It is well known that bile acids regulate many biosynthetic enzymes and transporters through the activation of phalnesoid X receptor (FXR) (Non-patent Documents 3 and 4). For example, cholesterol 7-hydroxylase (CYP7A), Na + -taurocholic acid cotransport polypeptide (NTCP), and bile acid excretion pump (BSEP), which are rate-limiting enzymes for bile acid synthesis. These enzymes and transporters are very important for bile acid homeostasis (Non-Patent Documents 5 to 9).
  • CYP7A cholesterol 7-hydroxylase
  • NTCP Na + -taurocholic acid cotransport polypeptide
  • BSEP bile acid excretion pump
  • Non-patent Documents 10 and 11 The regulation of various genes by classical genomic response through stimulation of steroid hormone power S and its nuclear receptor has been well studied (Non-patent Documents 10 and 11). However, there is substantial evidence that some steroid hormones stimulate second messengers with a rapid non-genomic response (12). Zhu et al. Identified a membrane progestin receptor (mPR) and revealed that it has a seven-transmembrane domain, which is a typical structure of a G-protein coupled receptor (GPCR) (Non-Patent Document 13, 14). In cells expressing mPR, progestin inhibited cAMP formation and the reaction was sensitive to pertussis toxin, suggesting that mPR is coupled to Gi / o protein. Similarly, bile acids activate nuclear receptors such as FXR, and some data indicate that c The existence of specific receptors for bile acids that stimulate AMP formation has been suggested (Non-patent Documents 15 and 16).
  • Non-Patent Literature 1 Russell, D. W., and Setchell, ⁇ ⁇ D. 1992. Bile acid biosynthesis. Bioc hemistry 31: 4737-4749
  • Patent Document 2 Dietschy, J. M. 1968. Mechanisms for the intestinal absorption of bile acids. J. Lipid Res. 9: 297-309
  • Non-Patent Literature 3 Russell, D. W. 2003. The enzymes, regulation, and genetics of bile ac id synthesis. Annu. Rev. Biochem. 72: 137-174
  • Non-Patent Document 4 Redinger, R. N. 2003.Nuclear receptors in cholesterol catabolism: molecular biology of the enterohepatic circulation of bile salts and its role in cholester ol homeostasis.J. Lab. Clin. Med. 142: 7-20.
  • Non-Patent Document 5 Sinal, CJ, Tohkin, M., Miyata, M., Ward, JM, Lambert, G., and Gonzalez, FJ 2000. Targeted disruptinon of the nuclear receptor FXR / BAR impai rs bile acid and lipid homeostasis Cell 102: 731-744
  • Non-Patent Document 6 Tu, ⁇ ⁇ , Okamoto, A. ⁇ ⁇ , and Shan, B. 2000. FXR, a bile acid receptor and biological sensor. Trends. Cardiovasc. Med. 10: 30-35
  • Non-Patent Document 7 Chiang, JY, Kimmel, R., Weinberger, C, and Stroup, D. 2000.
  • F arnesoid X receptor responds to bile acids and represses cholesterol 7alpha-hydrox ylase gene (CYP7A1) transcription.
  • CYP7A1 cholesterol 7alpha-hydrox ylase gene
  • Non-Patent Document 9 Grober, J., Zaghini, 1, Fujii, H., Jones, SA, Kliewer, SA, Willson, TM, ⁇ no, T., and Besnard, P. 1999. Identification of a bile acid -responsive elem ent in the human ileal bile acid-binding protein gene.J. Biol. Chem. 274: 29749-297 54
  • Patent Document 10 Beato, M. 1989. Gene regulation by steroid hormones. Cell 56: 335- Non-Patent Document 11: Aranda, A., and Pascual, A. 2001. Nuclear hormone receptors and gene expression. Physiol. Rev. 81: 1269-1304
  • Non-patent document 12 Norman, A. W., Mizwicki, M. ⁇ , and Norman, D. P. 2004. Steroid- hormone rapid actions, membrane receptors and a conformational ensemble model. Nat. Rev. Drug Discov. 3: 27-41
  • Non-Patent Document 13 Zhu, Y., Rice, CD, Pang, Y., Pace, M., and Thomas, P. 2003. Cloning, expression, and characterization of a membrane progestin receptor and eviden ce it is an intermediary in meiotic maturation of fish oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 100: 2231-2236
  • Patent Document 14 Zhu, Y., Bond, J., and Thomas, P. 2003. Identification, classification, and partial characterization of genes in humans and other vertebrates homologous to a fish membrane progestin receptor. Proc. Natl. Acad. Sci US A. 100: 2237-224 2
  • Non-Patent Document 15 Conley, DR, Coyne, MJ, Bonorris, GG, Chung, A., and Schoe nfield, LJ 1976.Bile acid stimulation of colonic adenylate cyclase and secretion in the rabbit. Am. J. Dig. Dis. 21: 453-458
  • Non-Patent Document 16 Potter, G. D., Sellin, J. H., and Burlingame, S. M. 1991. Bile acid st imulation of cyclic AMP and ion transport in developing rabbit colon. J. Pediatr. Gas troenterol. Nutr. 13: 335-341
  • Non-Patent Document 17 Maruyama, T., Miyamoto, Y., Nakamura, ⁇ , Tamai, ⁇ , Okada, H., Sugiyama, E., Nakamura, T., Itadani, H., and Tanaka, K. 2002. Identification of me mbrane-type receptor for bile acids (M-BAR). Biochem. Biophys. Res. And ommun. 29 8: 714-719
  • Gpbarl G protein-coupled bile acid receptor 1
  • Non-patent Document 17 Gpbarl is an intestinal component such as NCI-H716, STC_1, and GLUTag. It was expressed endogenously in cell lines. Bile acids were found to stimulate cAMP responses in cells expressing Gpbarl without activating FXR, the nuclear receptor for bile acids. Furthermore, the identification of Gpbarl has revealed the existence of a dual bile acid signal system, a GPCR-mediated system and a nuclear receptor-mediated system.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to clarify the physiological role of Gpbarl in the intestine and to apply the knowledge to medicine.
  • an object of the present invention is to provide a drug for a disease associated with an increase or decrease in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease, and a screening method for the drug.
  • it provides testing methods and screening agents for diseases associated with changes in the total bile acid pool or lipid metabolic diseases.
  • the present invention provides a genetically modified non-human mammal characterized in that Gpbarl gene expression is artificially suppressed.
  • the present inventors firstly disrupted the mouse Gpbarl gene by homologous recombination in order to clarify the physiological role of Gpbarl in vivo. Mice were made. Then, the total amount of bile acid pool and fecal bile acid excretion level in the Gpbarl-deficient mice were measured to examine whether Gpbarl is involved in the control of bile acid homeostasis.
  • the total bile acid pool amount can be determined by screening for the binding to Gpbar 1, the expression level of Gpbarl, and the activity of Gpbarl. It was found that it is possible to specify a drug for the treatment or prevention of diseases associated with increase or decrease in lipids or lipid metabolic diseases.
  • the present inventors have succeeded in developing a drug for a disease associated with increase or decrease in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease and a screening method for these drugs. Furthermore, a genetically modified non-human characterized in that the method for testing a disease associated with increase or decrease in the total bile acid pool amount or lipid metabolic disease, the test drug, and the expression of the Gpbarl gene are artificially suppressed. The present inventors have succeeded in developing mammals and completed the present invention.
  • the method for screening a candidate compound for a drug for the treatment or prevention of a disease associated with a decrease in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease comprises: (a) a test compound in Gpbal And (b) detecting the binding between the Gpbarl and the test compound, and (c) selecting the test compound that binds to the Gpbarl.
  • a compound for example, Gpbarl agonist
  • a compound that has been confirmed to have activity by this screening method can be a candidate for a therapeutic or prophylactic agent for a disease associated with a decrease in the total bile acid pool or a lipid-metabolizing disease.
  • Each step of the screening method includes (a) contacting a test compound with a cell expressing Gpbarl, (b) measuring the expression level of the Gpbarl, and (c) a test compound. This can be a step of selecting a test compound having an increased expression level of Gpbarl as compared to the case where no contact is made. Using this method, even compounds that do not act directly on Gpbarl can be screened for compounds that act on any molecule in the cell to enhance Gpbarl expression. it can.
  • Each step of the above screening method includes (a) providing a cell or cell extract having DNA to which a reporter gene is operably linked downstream of a region of a promoter of Gpbarl-encoding DNA; b) bringing the test compound into contact with the cells or the cell extract And (c) measuring the expression level of the reporter gene in the cell or cell extract, and (d) comparing the expression level of the reporter gene compared to the case where the test compound is not contacted. It can be set as the process of selecting the increased test compound. By using this method, even compounds that do not directly act on Gpbarl can be screened for compounds that act on the Gpbarl promoter and enhance the expression of Gpbarl.
  • Each step of the above screening method includes (a) contacting a test compound with a cell expressing Gpbarl on the cell surface in the presence of a ligand for Gpbarl, and (b) Gpbarl in the cell. And (c) a step of selecting a test compound having an increased activity compared to the case of not contacting the test compound.
  • a compound having an action of further enhancing the activity of Gpbarl in the presence of a ligand for Gpbarl can be selected.
  • Each step of the screening method includes the steps of (a) administering a test compound to a genetically modified non-human mammal characterized in that the expression of the Gpbarl gene is artificially suppressed; b) comparing the amount of total bile acid pool in the genetically modified non-human mammal, and (c) total bile in the genetically modified non-human mammal compared with the case where the test compound is not administered. It can be a step of selecting a compound that increases the amount of acid pool. If this method is used, a compound that enhances the expression of Gpbarl in vivo or a compound that increases the total bile acid pool without using Gpbarl should be selected and evaluated for its efficacy. Can do.
  • the present invention also provides a genetically modified non-human mammal characterized in that Gpbarl gene expression is artificially suppressed.
  • This non-human mammal can be used for screening a compound having an action of enhancing the expression of Gpbarl in vivo or a compound that increases the total bile acid pool amount without using Gpbarl.
  • the genetically modified non-human mammal can be prepared by inserting a foreign gene into one or both of the Gpbarl gene pair.
  • the present invention also provides a genetically modified mammalian cell characterized in that the expression of the Gpbarl gene is artificially suppressed.
  • Genetically modified mammalian cells are It can be used for screening drug candidate compounds for the treatment or prevention of diseases associated with a decrease in lipid levels or lipid metabolic diseases.
  • the genetically modified mammalian cell may be a cell derived from a genetically modified mammal characterized in that a foreign gene is inserted into one or both of the Gpbarl gene pair.
  • the present invention provides a drug for treating or preventing a disease associated with a decrease in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease, comprising DNA encoding Gpbarl protein as an active ingredient.
  • a disease associated with a decrease in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease can be treated or prevented.
  • the method for screening a candidate compound for a drug for the treatment or prevention of a disease associated with an increase in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease comprises: (a) a test compound is added to Gpbarl The step of contacting, (b) detecting the binding between the Gpbarl and the test compound, and (c) selecting the test compound that binds to the Gpbarl.
  • a compound for example, a Gpbarl antagonist
  • Compounds that show activity in this screening can be candidates for therapeutic or prophylactic agents for diseases associated with an increase in the total bile acid pool or lipid metabolic diseases.
  • Each step of the screening method includes (a) contacting a test compound with a cell expressing Gpbarl, (b) measuring the expression level of the Gpbarl, and (c) a test compound. Compared to the case where no contact is made, a test compound having a reduced expression level of Gpbarl can be selected. Using this method, even compounds that do not act directly on Gpbarl can be selected for compounds that act on intracellular molecules or any other molecule to suppress Gpbarl expression. be able to.
  • Each step of the screening method includes (a) a DNA promoter encoding Gpbarl, and a step of providing a cell or cell extract having a DNA to which a reporter gene is operably linked downstream of a region. (B) contacting the test compound with the cell or cell extract; and (c) expression level of the reporter gene in the cell or cell extract. The step of measuring the bell and (d) the step of selecting the test compound having a decreased expression level of the reporter gene compared to the case where the test compound is not contacted can be used. By using this method, even compounds that do not act directly on Gpbarl can be screened for compounds that act on the Gpbarl promoter and suppress the expression of Gpbarl.
  • Each step of the screening method includes (a) a step of bringing a test compound into contact with a cell in which Gpbarl is expressed on the cell surface, and (b) a step of measuring the activity of Gpbarl in the cell; (C) Compared with the case where the test compound is not contacted, the step of selecting the test compound having a decreased activity as described above can be employed. By using this method, a compound having an action of suppressing the activity of Gpbarl can be selected.
  • the present invention also provides a drug for treating or preventing a disease associated with an increase in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease, comprising a compound that decreases Gpbarl expression or activity as an active ingredient. .
  • a drug for treating or preventing a disease associated with an increase in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease comprising a compound that decreases Gpbarl expression or activity as an active ingredient.
  • the present invention provides a drug for increasing or decreasing the total bile acid pool amount or for treating or preventing a disease associated with a lipid metabolic disease, selected by each of the above screening methods.
  • These drugs can enhance or suppress signal transduction downstream of Gpbarl by a new mechanism that has not been known so far, and are associated with increases or decreases in the total bile acid pool amount or lipid metabolism disorders. Can be treated or prevented.
  • the present invention also provides a method for examining a disease associated with an increase or decrease in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease, comprising a step of measuring the expression level of a Gpbarl gene.
  • a test method it is possible to examine a disease associated with an increase or decrease in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease from a small amount of biological material (blood, etc.).
  • the detection method preferably includes a step of detecting a mutation in the Gpbarl gene region.
  • test for a disease associated with a decrease or an increase in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease which comprises an oligonucleotide having a chain length of at least 15 nucleotides, which hybridizes to the Gpbarl gene region. Medicine can be used.
  • the test method may include an antibody that binds to Gpbarl. Even a test drug containing an antibody that binds to Gpbarl can be used to test a disease or lipid metabolic disease associated with a decrease or increase in the amount of total bile acid pool from a small amount of biological material (blood, etc.)
  • the target disruption of Gpbarl in mice showed a decrease in the total amount of bile acid pool, suggesting that Gpbarl contributes to the regulation of bile acid homeostasis in vivo. Furthermore, by feeding a Gpbarl-deficient mouse with a high-fat diet, the weight of the mouse is significantly increased compared to a wild-type mouse fed with the same high-fat diet, and the loss of Gpbarl is reduced. It was suggested to cause abnormal lipid metabolism.
  • Gpbarl-deficient mice of the present invention can be useful in studies to elucidate the physiological role of Gpbarl.
  • the Gpbarl-deficient mice can be used to estimate side effects of drugs identified by the screening method of the present invention and Gpbarl inhibitors such as anti-Gpbarl antibodies or small Gpbarl antagonist molecules.
  • Gpbarl inhibitors such as anti-Gpbarl antibodies or small Gpbarl antagonist molecules.
  • Organizational power of genetically modified animals By using established cell lines, it is possible to examine in detail the side effects of drugs identified by screening methods in each tissue.
  • Gpbarl gene is inactivated in the genetically modified animal of the present invention, an antibody against a protein that binds to Gpbarl can be efficiently produced.
  • FIG. 1 is a graph showing the tissue distribution of mouse Gpbarl mRNA.
  • FIG. 2 is a diagram and a photograph showing the targeted disruption of the mouse Gpbarl gene.
  • FIG. 3 shows the total bile acid pool amount and fecal bile acid excretion in Gpbarl-deficient mice.
  • FIG. 4 is a graph showing changes in body weight of Gpbarl-deficient mice fed with normal food.
  • FIG. 5 A graph showing changes in body weight of Gpbarl-deficient mice fed a high-fat diet.
  • FIG. 6 shows the fat mass and lean body mass of Gpbarl-deficient mice fed a high-fat diet
  • the present invention relates to a method for screening drug candidate compounds for the treatment or prevention of diseases associated with increase or decrease in the total bile acid pool amount or lipid metabolic diseases.
  • Bile acid is a component of bile and is synthesized in the liver using cholesterol as a raw material. In addition to emulsifying fat to help digestion and absorption in the small intestine, it is also related to absorption of various vitamins. It is excreted through the bile duct into the intestine, but is almost reabsorbed from the intestinal tract centering on the terminal ileum, and has a very closed enterohepatic circulation that goes to the liver through the portal vein.
  • the disease associated with the increase or decrease in the total bile acid pool amount refers to a disease associated with a decrease in the total bile acid pool amount or a disease associated with an increase in the total bile acid pool amount, or a deviation.
  • diseases associated with a decrease in the total bile acid pool include digestive failure, decrease in hormones due to lower cholesterol, and damage to cell membranes of red blood cells and blood vessels.
  • arteriosclerosis due to an increase in blood cholesterol can be raised.
  • a lipid metabolic disease is a disease caused by abnormalities in lipid metabolism or a deviation.
  • diseases based on fat accumulation caused by abnormal lipid metabolism include metabolic syndromes such as obesity, diabetes, hyperlipidemia, and hypertension.
  • the nucleotide sequence of human-derived Gpbarl cDNA is represented by SEQ ID NO: 1, and the DNA strength S
  • the amino acid sequence of the encoded protein is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence of Gpbar 1 cDNA derived from mouse is shown in SEQ ID NO: 3
  • the amino acid sequence of Gpbarl encoded by the cDNA is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the nucleotide sequence of Gpbarl cDNA derived from rat is shown in SEQ ID NO: 5
  • the amino acid sequence of Gpbarl encoded by the cDNA is shown in SEQ ID NO: 6.
  • Gpbarl refers to all of human Gpbarl, mouse Gpbarl and rat Gpbarl unless otherwise specified.
  • Gpbarl used in the method of the present invention includes proteins functionally equivalent to the above-mentioned known Gpbarl protein.
  • proteins include, but are not limited to, Gpbarl protein mutants, alleles, variants, homologs, Gpbarl partial peptides or fusion proteins with other proteins.
  • the mutant Gpbarl in the present invention includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and Z or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6. And a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4 or 6.
  • the number of amino acids to be mutated is not particularly limited, but is usually within 30 amino acids, preferably within 15 amino acids, and more preferably within 5 amino acids (eg, within 3 amino acids). Conceivable.
  • the amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid that preserves the properties of the amino acid side chain.
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids with aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids with hydroxyl group-containing side chains (S, ⁇ , ⁇ ), sulfur atoms included Amino acids with side chains (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids with base-containing side chains (R, K, ⁇ ), aromatic-containing side Amino acids having a chain (H, F, Y, W) can be listed (the parentheses indicate single letter amino acids).
  • a certain amino acid sequence It is already known that a polypeptide having an amino acid sequence modified by deletion, addition and / or substitution by another amino acid residue of one or more amino acids maintains its biological activity.
  • “functionally equivalent” means that the target protein has the same biological function or biochemical function as the protein.
  • examples of the biological function and biochemical function of the protein include binding to bile acids.
  • Biological properties include the specificity of the expressed site and the expression level.
  • DNA that encodes a "functionally equivalent protein" of the protein of interest methods well known to those skilled in the art include hybridization techniques and polymerase chain reaction (PCR). There is a method using technology. That is, for those skilled in the art, oligos that specifically hybridize to Gpb arl (SEQ ID NO: 1, 3 or 5) using Gpb arl base sequence (SEQ ID NO: 1, 3 or 5) or a part thereof as a probe. It is usually possible to isolate DNA with high homology to Gpbarl using nucleotides as primers. Thus, DNA encoding a protein having a function equivalent to Gpbarl, which can be isolated by hybridization technology or PCR technology, is also included in the DNA of the present invention.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a hybridization reaction is preferably performed under stringent conditions.
  • stringent hybridization conditions refer to conditions of 6M urea, 0.4% SDS, 0.5xSSC, or equivalent hybridization conditions of stringency.
  • 6M urea, 0.4% SDS, O.lxSSC it is possible to expect higher homology and DNA isolation.
  • the isolated DNA is considered to have high homology with the amino acid sequence of the target protein at the amino acid level. High homology means that the entire amino acid sequence is at least 50% or more, more preferably 70% or more, more preferably 90% or more (eg, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more). ) Sequence identity.
  • Amino acid alignment and nucleotide sequence identity can be determined using the algorithm BLAST (Pro Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993) by Carlin and Arthur. .
  • Programs called BLASTN and BLASTX based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990).
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters of each program. Specific methods of these analysis methods are known.
  • the biological species from which Gpbarl used in the method of the present invention is derived is not limited to a specific biological species. Examples include humans, monkeys, mice, rats, guinea pigs, pigs, ushi, fermenters, insects, and the like.
  • the state of Gpbarl used in the first embodiment is not particularly limited, and may be, for example, a purified state, a state expressed in a cell, a state expressed in a cell extract, or the like.
  • Gpbarl can be performed by a well-known method.
  • Examples of cells expressing Gpbarl include cells expressing endogenous Gpbarl or cells expressing exogenous Gpbarl.
  • Examples of the cells expressing the endogenous Gpbarl include the ability to cite cultured cells.
  • the cultured cells for example, commercially available cells can be used without particular limitation.
  • Examples of the biological species from which cells expressing endogenous Gpbarl are derived include humans, monkeys, mice, rats, guinea pigs, pigs, ushi, yeast, insects and the like, which are not particularly limited.
  • the exogenous Gpbarl-expressing cell can be prepared, for example, by introducing a vector containing DNA encoding Gpbarl into the cell. Introduction of the vector into the cells can be performed by a general method such as calcium phosphate precipitation, electric pulse perforation, ribophetamine, microinjection and the like.
  • the exogenous Gpbarl-containing cells can be produced, for example, by introducing a DNA encoding Gpbarl into a chromosome by a gene transfer method using homologous recombination.
  • the biological species from which such exogenous Gpbarl-introduced cells are derived is not limited to mammals, and techniques for expressing foreign proteins in cells have been established. .
  • the cell extract expressing Gpbarl is, for example, one obtained by adding a vector containing DNA encoding Gpbarl to the cell extract contained in the in vitro transcription translation system. That power S.
  • the in vitro transcription / translation system it is possible to use a commercially available in vitro transcription / translation kit without particular limitation.
  • test compound in the method of the present invention is not particularly limited, for example, natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, single compounds such as peptides, compound libraries, Examples include gene library expression products, cell extracts, cell culture supernatants, fermentation microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, prokaryotic cell extracts, eukaryotic single cell extracts or animal cell extracts. be able to.
  • the test sample can be appropriately labeled and used as necessary. Examples of the label include a radiolabel and a fluorescent label. In addition to the test sample, a mixture of a plurality of these test samples is also included.
  • “contact” is performed according to the state of Gpbarl.
  • Gpbarl if Gpbarl is in a purified state, it can be carried out by adding a test sample to the purified sample. Moreover, if it is a state expressed in a cell or a state expressed in a cell extract, it can be carried out by adding a test sample to the cell culture solution or the cell extract, respectively.
  • the test sample is a protein
  • a vector containing DNA encoding the protein is introduced into a cell expressing Gpbarl, or the vector is added to a cell extract expressing Gpbarl. It is also possible to do this. For example, a two-hybrid method using yeast or animal cells can be used.
  • the binding between Gpbarl and the test compound is then detected.
  • the binding between Gpbarl and the test compound can be detected by, for example, a label attached to the test compound bound to the Gpbarl protein (for example, a label capable of quantitative measurement such as a radiolabel or a fluorescent label).
  • a change in Gpbarl activity caused by the binding of a test compound to Gpbarl can also be detected as an indicator.
  • test compound that binds to Gpbarl is then selected.
  • Selected compounds include compounds that promote or suppress Gpbarl activity, or compounds that increase or decrease Gpbarl expression, which result in an increase or decrease in the total bile acid pool level It is.
  • the expression level of Gpbarl is then measured.
  • the expression level of Gpbarl can be measured by methods known to those skilled in the art.
  • the level of transcription of the gene can be measured by extracting the mRNA of the gene according to a standard method and performing the Northern hybridization method or RT-PCR method using this mRNA as a cocoon.
  • the expression level of the gene can be measured using DNA array technology.
  • a fraction containing Gpbarl encoded by the gene is collected according to a standard method, and the expression level of the Gpbarl is detected by electrophoresis such as SDS-PAGE, thereby measuring the translation level of the gene. You can also. In addition, it is also possible to measure the translation level of a gene by performing Western blotting using an antibody against Gpbarl and detecting the expression of the Gpbarl.
  • the antibody used for detection of Gpbarl is not particularly limited as long as it is a detectable antibody.
  • both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies can be used.
  • the antibody can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • a polyclonal antibody can be obtained as follows. Sera are obtained by immunizing small animals such as rabbits with recombinant proteins or partial peptides expressed in microorganisms such as E. coli as a fusion protein with Gpbarl or GST. This is prepared by, for example, purification by ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, affinity column coupled with Gpbarl or synthetic peptide, and the like.
  • a monoclonal antibody for example, Gpbarl or a partial peptide thereof is immunized to a small animal such as a mouse, the spleen is removed from the mouse, and this is rubbed to separate cells, and the cells and the mouse are separated.
  • a myeloma cell is fused with a reagent such as polyethylene glycol, and a clone that produces an antibody that binds to Gpbar 1 is selected from the resulting fused cells (Neubridoma).
  • the obtained hyperidoma was transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites was collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody was obtained by, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, Purification using affinity columns coupled with Gpbarl or synthetic peptides Thus, it can be prepared.
  • test compound in the next step, is contacted with the test compound, and the test compound in which the expression level of the Gpb arl is reduced or increased as compared with the test compound is selected.
  • Selected compounds include those that increase or decrease the expression of Gpbarl, which results in an increase or decrease in the total bile acid pool.
  • a cell or a cell extract having DNA to which a reporter gene is operably linked downstream of a promoter region of DNA encoding Gpbarl is provided.
  • operably linked means that the promoter of the G pbarl gene is induced so that expression of the reporter gene is induced by binding of a transcription factor to the promoter region of the Gpbarl gene. The region and the reporter gene are bound together. Therefore, even when the reporter gene is bound to another gene and forms a fusion protein with another gene product, the transcription factor binds to the promoter region of the Gpbarl gene so that the fusion is performed. Any expression that induces protein expression is included in the meaning of “functionally linked”.
  • the reporter gene is not particularly limited as long as its expression is detectable.
  • a CAT gene for example, a lacZ gene, a luciferase gene, a ⁇ -glucuronidase gene ( GUS) and GFP genes.
  • the reporter gene also includes DNA encoding Gpbarl protein.
  • a cell or cell extract having a DNA having a reporter gene operably linked downstream of the promoter region of the DNA encoding Gpbarl can be prepared by the method described in the first embodiment.
  • test sample is then brought into contact with the cells or the cell extract.
  • expression level of the reporter gene in the cells or the cell extract is measured.
  • the expression level of the reporter gene can be measured by methods known to those skilled in the art depending on the type of reporter gene used. For example, if the reporter gene is CAT In the case of a gene, the expression level of the reporter gene can be measured by detecting acetylation of chloramphenicol by the gene product.
  • the reporter gene is a lacZ gene, by detecting the color development of the pigment compound by the catalytic action of the gene expression product, and when the reporter gene is a luciferase gene, the catalytic expression of the gene expression product
  • the fluorescence of the fluorescent compound and in the case of the ⁇ -gnorechronidase gene (GUS)
  • the luminescence of Glucuron (ICN) by the catalytic action of the gene expression product or 5-bromo-4- Expression level of the reporter gene by detecting the color of the black mouth -3-indolyl _ j3 _ dalcuronide (X-Glue)
  • X-Glue black mouth -3-indolyl _ j3 _ dalcuronide
  • the expression level of the gene can be measured by the method described in the second embodiment.
  • a test compound that decreases or increases the expression level of the reporter gene is then selected as compared to the case where the test compound is not contacted.
  • Selected compounds include compounds that increase or decrease the expression level of the reporter gene, which compounds result in an increase or decrease in the amount of total bile acid pool.
  • a test compound is contacted with a cell in which Gpbarl is expressed on the cell surface.
  • ligand refers to a molecule such as a random peptide or variable segment sequence that is recognized by a particular receptor.
  • a molecule (or macromolecular complex) as recognized by those skilled in the art can be both a receptor and a ligand.
  • a binding partner with a lower molecular weight is called a ligand
  • a binding partner with a higher molecular weight is called a receptor.
  • the activity of Gpbarl is then measured.
  • the activity of Gpbarl, binding activity with bile acids, synthetic activity of cAMP, can be mentioned binding activity, etc.
  • a test compound having a decreased or increased activity as compared with the case where the test compound is not contacted is selected.
  • Selected compounds have Gpbarl activity Compounds that increase or decrease are included, and those compounds result in an increase or decrease in the total bile acid pool.
  • the present invention relates to a genetically modified non-human mammal characterized in that Gpbarl gene expression is artificially suppressed.
  • the expression of Gpbarl gene is artificially suppressed usually means a gene such as nucleotide insertion, deletion, substitution, etc. in one or both gene pairs of Gpbarl gene. It refers to a state in which expression of the gene is suppressed by having a child mutation.
  • the expression of a mutant Gpbarl protein whose function as a normal Gpbarl protein is reduced or lost is also included in the “suppression of Gpbarl gene expression”.
  • the above “suppression” includes not only the case where the expression of the Gpbarl gene is completely suppressed, but also the case where the expression of only one gene of the gene pair of the gene is suppressed. In the present invention, it is preferable that the expression of the Gp barl gene is specifically suppressed.
  • the site where the gene mutation exists is not particularly limited as long as the gene expression is suppressed, and examples thereof include an exon site and a promoter site.
  • the animal that is subject to modification of the Gpbarl gene is usually a non-human animal, preferably a rodent such as a mouse, rat, hamster, and rabbit, and of these, a mouse is particularly preferable.
  • ES cells that are the target of modification of the Gpbarl gene are also preferably those derived from rodents, particularly those derived from mice.
  • the “knockout animal” generally referred to is also included in the genetically modified animal of the present invention.
  • the Gpbarl gene As a means for artificially suppressing the expression of the Gpbarl gene in the genetically modified non-human animal of the present invention (sometimes simply referred to as "genetically modified animal") and genetically modified ES cells, the Gpbarl gene
  • the method include deletion of the whole or a part thereof, and deletion of all or part of the expression control region of the Gpbarl gene.
  • one or both of the gene pairs of the Gpbarl gene are exogenous. This method inactivates the Gpbarl gene by inserting the gene. That is, in a preferred embodiment of the present invention, the genetically modified animal and the genetically modified ES cell are characterized in that a foreign gene is inserted into one or both of the Gpbarl gene pair.
  • the genetically modified animal of the present invention is generally known to those skilled in the art by genetic engineering techniques. Can be produced. For example, it is possible to create a genetically modified mouse as follows. First, DNA containing the exon part of the Gpbarl gene is isolated from a mouse, and an appropriate marker gene is inserted into this DNA fragment to construct a targeting vector. This targeting vector is introduced into a mouse ES cell line by the electopore position method or the like, and a cell line that has undergone homologous recombination is selected.
  • the marker gene to be inserted is preferably an antibiotic resistance gene such as a neomycin resistance gene.
  • cell lines that have produced homologous recombination can be selected simply by culturing in a medium containing antibiotics.
  • homologous recombinants can be assayed by PCR and Southern blotting to efficiently obtain a cell line in which one of the Gpbarl gene pairs is inactivated.
  • the obtained ES cell line can be injected into mouse blastoderm to obtain a chimeric mouse.
  • a mouse in which one of the Gpbarl gene pair is inactivated can be obtained.
  • the gene-modified mouse of the present invention can be produced according to the method described in the Examples described later. Genetic modification can also be carried out in the same manner in animals in which ES cells other than mice have been established.
  • an ES cell line in which both Gpbarl gene pairs are inactivated can be obtained by the following method. That is, by culturing an ES cell line in which one of the gene pair is inactivated in a medium containing a high concentration of antibiotics, the cell line in which the other gene pair is also inactivated, that is, the gene pair of the Gpbarl gene ES cell lines in which both of these are inactivated can be obtained. Alternatively, it can also be produced by selecting an ES cell line in which one of the gene pair is inactivated, introducing a targeting vector again into this cell line, and selecting a cell line that has undergone homologous recombination. Machines that purchase targeting vectors It is preferable to use one gene that is different from the above-mentioned marker gene.
  • the present invention also provides a genetically modified mammalian cell obtained from the genetically modified non-human animal of the present invention.
  • the genetically modified mammalian cells are also provided as cell lines established from there alone as primary cultured cells.
  • a method for establishing a cell line derived from the genetically modified animal of the present invention a known method can be used. For example, in rodents, a method of primary culture of fetal cells can be used.
  • the genetically modified mammalian cell in the present invention may be an ES cell.
  • the genetically modified animals, genetically modified mammalian cells of the present invention, cell lines established therefrom, and ES cells can be used for analysis of detailed functions of the Gpbarl gene. For example, it can be used to infer side effects of Gpbarl inhibitors such as anti-Gpbarl antibodies or small Gpbarl antagonist molecules. Since the genetically modified mice obtained in the present invention grew normally and did not die at least in the embryonic period, it is considered that the Gpbarl inhibitor (antagonist) has no lethal side effects. By examining the genetically modified animals of the present invention in detail, the side effects of Gpbarl inhibitors can be estimated.
  • Gpbarl inhibitors in each tissue can be examined in detail by using genetically modified mammalian cells and cell lines established therefrom.
  • cells blood, nerves, liver, viscera, etc. constituting various body tissues obtained by inducing differentiation from the ES cells of the genetically modified mammal of the present invention can reduce the total bile acid pool amount. It is suitable for screening candidate compounds for drugs for treatment or prevention of accompanying diseases or lipid metabolic diseases.
  • Gpbarl gene is inactivated in the genetically modified animal of the present invention, an antibody against a protein that binds to Gpbarl can be efficiently produced.
  • a monoclonal antibody or a polyclonal antibody against Gpbarl can be efficiently produced by immunizing Gpbarl to the genetically modified mouse of the present invention together with a complete Freundage band.
  • Gpbarl to be immunized may be derived from rats or humans in addition to those derived from mice.
  • the cause of the disease is Gpbarl dysfunction.
  • genetically modified mice or cells derived from the mice Observe the characteristic expression system and compare it with the symptoms of human disease. If more than half of the symptoms of the human disease are observed in the genetically modified mouse of the present invention, it can be estimated that the cause of the disease is Gpbarl dysfunction.
  • the genetically modified animal of the present invention can also be used as a model animal for a disease associated with a decrease in the total bile acid pool or a lipid metabolic disease.
  • screening of a candidate compound for a drug for the treatment or prevention of a disease associated with a decrease in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease is performed using the genetically modified non-human mammal. It is also possible.
  • a test compound is administered to a genetically modified non-human mammal characterized in that Gpbarl gene expression is artificially suppressed.
  • Administration of the test compound to the genetically modified animal can be performed orally or parenterally.
  • the total amount of bile acid pool in the genetically modified non-human mammal is measured.
  • To measure the total amount of bile acid pool first homogenize the tissues to be measured, and extract an aliquot with ethanol while perfusing those tissues. The total bile acid content in these extracts can then be measured by enzymatic methods as described by Kitada et al. (Kitada, Tsuji, Miyata, M., Nakamura, T., Tozawa, A. , Honma, W., Shimada, M., Nagat a, K., Israel, CJ, Guo, G., Gonzalez, FJ, and Yamazoe, Y. 2003. Protective role of hydroxysteroid sulfotransferase in lithocholic acid-induced liver toxicity. J Bio 1 Chem. 278: 17838-17844). This measurement can also be performed by the method specifically described in the examples.
  • test compound is administered, and a compound that increases the total bile acid pool amount in the genetically modified non-human mammal is selected.
  • Selected compounds include compounds that increase the amount of total bile acid pool and are considered useful as drugs for the treatment or prevention of diseases associated with a decrease in total bile acid pool or lipid metabolic diseases .
  • the present invention relates to a drug for treatment or prevention of a disease associated with an increase or decrease in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease, selected by the above screening method.
  • a drug containing a compound that decreases the expression or activity of Gpbarl as an active ingredient may be mentioned. I can do it. Any compound that decreases the expression or activity of Gpbarl can be used as long as it decreases the expression or activity of Gpbarl.
  • Examples of the compound that suppresses the expression of Gpbarl of the present invention include RNA complementary to the transcription product of DNA encoding Gpbarl or a ribozyme that specifically cleaves the transcription product.
  • DNA encoding Gpbarl DNA consisting of the base sequence IJ described in SEQ ID NO: 1, 3 or 5, DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4 or 6, and Includes naturally-occurring DNA that encodes a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, attached, and Z or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4 or 6. It is.
  • suppressing Gpbarl expression includes suppression of gene transcription and suppression of protein translation. It also includes a decrease in expression as well as complete cessation of DNA expression.
  • RNA complementary to the transcription product of Gpbarl-encoding DNA is an antisense RNA complementary to the transcription product of DNA encoding Gpbarl.
  • the antisense sequence used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the actions described above.
  • designing an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 ′ end of the mRNA of a gene would be effective for inhibiting translation of the gene.
  • a cage complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used.
  • the DNA containing the antisense sequence of the sequence of the untranslated region as well as the translated region of the gene is also included in the antisense DNA used in the present invention.
  • the antisense DNA to be used is linked downstream of an appropriate promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side.
  • the DNA thus prepared can be transformed into a desired plant by a known method.
  • the sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to the endogenous gene or a part thereof possessed by the plant to be transformed, but may be not completely complementary as long as the gene expression can be effectively inhibited. Good.
  • the transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more, and most preferably 95% or more, to the target gene transcript.
  • the length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, more preferably 500 bases or more. is there. Usually, the length of the antisense DNA used is shorter than 5 kb, preferably shorter than 2.5 kb.
  • RNAi is a phenomenon in which when a double-stranded RNA (hereinafter referred to as dsRNA) having the same or similar sequence as the target gene IJ is introduced into a cell, the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene are both suppressed. is there.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • Dicer RNaselll-like nuclease
  • siRNA short interference RNA
  • a protein specific to this siRNA binds to form a nuclease complex (RISC: RNA_induced silencing complex). This complex recognizes and binds to the same sequence as siRNA.
  • the target gene mRNA is cleaved at the center of the siRNA by RNaselll-like enzyme activity.
  • the antisense strand of siRNA binds to mRNA and acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RsRP) to synthesize dsRNA. It is also considered that this dsRNA is once again a dicer substrate, generating a new siRNA and amplifying the action.
  • RsRP RNA-dependent RNA polymerase
  • the RNA of the present invention is expressed from an antisense coding DNA encoding an antisense RNA for any region of the target gene mRNA and a sense coding DNA encoding a sense RNA of any region of the target gene mRNA. Can be made. DsRNA can also be prepared from these antisense RNAs and sense RNAs.
  • the dsRNA expression system of the present invention is configured such that a vector or the like retains the same vector force, anti-sense RNA, sense RNA, and a different vector from the same antisense RNA, Sense RNA may be expressed.
  • the antisense RNA and the sense RNA can be expressed from the same vector by combining an antisense coding DNA and a sense coding DNA upstream with a promoter capable of expressing RNA. It can be constructed by constructing a sense RNA expression cassette and a sense RNA expression cassette, respectively, and inserting these cassettes into the vector in the same direction or in the opposite direction.
  • RNA-encoding DNA double-stranded DNA
  • antisense RNA coding strand and a sense RNA coding strand are paired
  • antisense RNA and sense RNA are connected to each side from each strand.
  • a promoter is provided oppositely so that it can be expressed.
  • a terminator must be attached to the 3 ′ end of each strand (antisense RNA coding strand, sense RNA coding strand).
  • this terminator a sequence in which four or more A (adenine) bases are continued can be used.
  • siRNA may be used as dsRNA.
  • siRNA means a double-stranded RNA consisting of short strands that are not toxic in the cell, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, and more preferably Skill of 21-30 base pairs.
  • the siRNA to be expressed is transcribed and the length of the final double-stranded RNA portion is, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, more preferably 21 to 30 base pairs. can do.
  • the DNA used for RNAi need not be completely identical to the target gene, but is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95%. It has the above sequence homology.
  • the double-stranded RNA part of the dsRNA in which the RNAs are paired is not limited to a perfect pair, but is a mismatch (corresponding base is not complementary), bulge (corresponds to one strand)
  • the base may not contain any unpaired parts due to the fact that In the present invention, both bulges and mismatches may be contained in the double-stranded RNA region where RNAs in dsRNA pair with each other.
  • Ribozyme refers to an RNA molecule having catalytic activity. Some ribozymes have a variety of activities. Among them, research on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes for the purpose of site-specific cleavage of RNA. Some ribozymes have a group I intron type or a force hammerhead type or hairpin type having an active domain of about 40 nucleotides such as M1RNA contained in RNaseP having a size of 400 nucleotides or more.
  • the self-cleaving domain of hammerhead ribozyme cleaves on the 3 'side of C15 of G13U14C15, but it is important for U14 to base-pair with A at position 9 for activity.
  • This base is shown to be cleaved by A or U in addition to C.
  • Ribozyme substrate binding If the region is designed to be complementary to the RNA sequence in the vicinity of the target site, it is possible to create a restriction enzyme-like RNA cleavage ribozyme that recognizes the sequence UC, UU or UA in the target RNA.
  • Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention. Hairpin ribozymes are found, for example, in the minus strand of satellite RNA of tobacco ring spot virus (J.M.Buzayan Nature 323: 349, 1986). This ribozyme has also been shown to be designed to cause target-specific RNA cleavage.
  • the ribozyme designed to cleave the target is linked to a promoter such as the cauliflower mosaic virus 35S promoter and a transcription termination sequence so that it is transcribed in plant cells.
  • a promoter such as the cauliflower mosaic virus 35S promoter
  • a transcription termination sequence so that it is transcribed in plant cells.
  • ribozyme activity may be lost if extra sequences are added to the 5 'or 3' ends of the transcribed RNA.
  • another trimming ribozyme that acts as a cis for trimming is placed on the 5 'side or 3' side of the ribozyme portion in order to accurately cut out only the ribozyme portion from the RNA containing the transcribed ribozyme.
  • a compound that can be isolated by the screening of the present invention a compound encoding Gpbarl protein, or a compound that decreases the expression or activity of Gpbarl is used as a medicine for humans or other animals, these compounds themselves
  • a known pharmaceutical method for example, tablets, capsules, elixirs, and microcapsules with sugar coating as required, orally or aseptic solutions or suspensions with water or other pharmaceutically acceptable liquids It can be used parenterally in the form of injections.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium Body specifically sterilized water, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension agent, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, binder, etc. It may be formulated by mixing in unit dosage forms as required for generally accepted pharmaceutical practice. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, gum tragacanth and gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • swelling agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, akamono oil or cherry are used.
  • the dispensing unit form is a capsule, the above material can further contain a liquid carrier such as fats and oils.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • aqueous solutions for injection include isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride.
  • Adjuvants such as alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM), HCO-50 may be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizer.
  • buffer agents such as a phosphate buffer solution, sodium acetate buffer solution, a soothing agent, for example, hydrochloric acid pro-power-in, a stabilizer, for example, benzeno alcohol, phenol, and antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule.
  • intraarterial injection intravenous injection, subcutaneous injection, etc., as well as intranasal, transbronchial, intramuscular, percutaneous or oral methods known to those skilled in the art.
  • Can be done by The dosage varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dosage.
  • the compound can be encoded by DNA, the DNA is incorporated into a gene therapy vector and gene therapy is performed. It is also possible.
  • the dosage and administration method vary depending on the weight, age, symptoms, etc. of the patient. Those skilled in the art can select appropriately.
  • the dose of the compound varies depending on the symptoms, but in the case of oral administration, it is generally about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg per day for an adult (with a body weight of 60 kg). More preferred is considered to be about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, and administration method. For example, in the form of an injection, it is usually normal for an adult (with a body weight of 60 kg). It may be advantageous to administer about 0.01 force per day, 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, it is possible to apply an amount converted per 60 kg of body weight or an amount converted per body surface area.
  • the present invention relates to a method for examining a disease associated with an increase or decrease in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease.
  • Examples of the method include a method for examining a disease associated with a decrease or increase in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease, which comprises a step of measuring the expression level of a Gpbarl gene.
  • the expression level of the Gpbarl gene can be measured by the method described above.
  • the method can include a method for examining a disease associated with a decrease or increase in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease, which comprises a step of detecting a mutation in the Gpbarl gene region.
  • the Gpbarl gene region means a Gpbarl gene and a region that affects the expression of the gene.
  • the region affecting the expression of the gene is not particularly limited, and examples thereof include a promoter region.
  • the type, number, etc. of the mutation in the present invention are not limited as long as it is a mutation associated with a decrease or increase in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease. Change the expression level of the above genes, change properties such as mRNA stability, or There are no particular limitations on the mutations that often change the activity of the protein encoded by the gene. Examples of the type of mutation include deletion, substitution, and insertion mutation. The above mutations include mutations that cause amino acid substitution in the amino acid sequence of the protein, and mutations that do not cause amino acid substitution but cause base substitution in the base sequence.
  • a DNA sample is prepared from the subject.
  • the DNA sample was extracted from, for example, a subject's blood, skin, oral mucosa, hair, tissue or cells collected or excised by surgery or biopsy. It can be prepared based on chromosomal DNA or RNA.
  • DNA containing the Gpbarl gene region is then isolated.
  • the DNA can be isolated, for example, by PCR using a primer that hybridizes to the DNA containing the Gpbarl gene region and chromosomal DNA or RNA-derived cDNA.
  • the base sequence of the isolated DNA is then determined.
  • the determined DNA base sequence is then compared with a control.
  • the control refers to DNA containing a normal (more frequent or wild type) Gpbarl gene region.
  • the sequence of DNA containing the Gpbarl gene region of a healthy person is considered to be normal, so the above “comparison with the control” usually means the sequence of DNA containing the Gpbarl gene region of a healthy person. Means to compare.
  • Mutation detection in the present invention can also be performed by the following method. First, a DNA sample is prepared from a subject. Next, the prepared DNA sample is cut with a restriction enzyme. The DNA fragments are then separated according to their size. The size of the detected DNA fragment is then compared to a control. In another embodiment, first, a DNA sample is prepared from subject force. Next, DNA containing the Gpbarl gene region is amplified. In addition, the amplified DNA is cleaved with a restriction enzyme. The DNA fragments are then separated according to their size. The size of the detected DNA fragment is then compared to a control. [0129] Examples of such methods include a method using restriction fragment length polymorphism (RFLP) and a PCR-RFLP method.
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • the size of the fragment produced after the restriction enzyme treatment Changes compared to the control.
  • these mutations can be detected as a difference in mobility of bands after electrophoresis.
  • the presence or absence of mutation can be detected by treating chromosomal DNA with these restriction enzymes, performing electrophoresis, and performing Southern blotting using the probe DNA of the present invention.
  • the restriction enzyme used can be appropriately selected according to each mutation.
  • RNA prepared from a subject in addition to genomic DNA, can be converted to cDNA using reverse transcriptase, and this can be cleaved with a restriction enzyme and then subjected to Southern blotting. It is also possible to amplify DNA containing the Gpbarl gene region by PCR using this cDNA as a saddle, cleave it with a restriction enzyme, and examine the difference in mobility.
  • a DNA sample is first prepared from a subject.
  • DNA containing the Gpbarl gene region is amplified.
  • the amplified DNA is dissociated into single-stranded DNA.
  • the dissociated single-stranded DNA is then separated on a non-denaturing gel. The mobility of the separated single-stranded DNA on the gel is compared with the control.
  • PCR-SSCP single-strand conformation polymorphism
  • PCR-SSCP single-strand conformation polymorphism
  • This method is particularly suitable for screening a large number of DNA samples because it is relatively easy to operate and has the advantage of requiring a small amount of test sample.
  • the principle is as follows. When double-stranded DNA fragments are dissociated into single strands, each strand becomes Forms a unique higher-order structure depending on the base sequence. When the dissociated DNA strand is electrophoresed in a polyacrylamide gel that does not contain a denaturing agent, single-stranded DNA with the same complementary strand length moves to a different position depending on the difference in each higher-order structure. Substitution of single bases also changes the higher order structure of this single-stranded DNA, indicating different mobility in polyacrylamide gel electrophoresis. Therefore, by detecting this change in mobility, it is possible to detect the presence of mutations due to point mutations, deletions or insertions in DNA fragments.
  • DNA containing the Gpbarl gene region is amplified by PCR or the like.
  • a length of about 200 to 400 bp is usually preferable.
  • Those skilled in the art can perform PCR by appropriately selecting reaction conditions and the like.
  • the amplified DNA product can be labeled by using a primer labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or piotin.
  • the amplified DNA product can be labeled by adding a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or piotin to the PCR reaction solution.
  • labeling can also be performed by adding a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin to the amplified DNA fragment using a talenou enzyme or the like after the PCR reaction.
  • the labeled DNA fragment thus obtained is denatured by applying heat or the like and electrophoresed on a polyacrylamide gel containing no denaturing agent such as urea.
  • Electrophoretic conditions vary depending on the nature of each DNA fragment, but it is usually performed at room temperature (20 to 25 ° C).
  • a DNA sample is prepared from a subject. Then Gpba Amplify DNA containing the gene region of rl.
  • the amplified DNA is separated on a gel with an increasing concentration of DNA denaturing agent. The mobility of the separated DNA on the gel is then compared to the control.
  • Examples of such a method include denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE method).
  • the DGGE method is a method in which a mixture of DNA fragments is run in a polyacrylamide gel with a denaturing agent concentration gradient, and the DNA fragments are separated according to the difference in instability.
  • DGGE method is a method in which a mixture of DNA fragments is run in a polyacrylamide gel with a denaturing agent concentration gradient, and the DNA fragments are separated according to the difference in instability.
  • a mismatched unstable DNA fragment moves to a certain denaturant concentration in the gel, the DNA sequence around the mismatch is partially dissociated into single strands due to the instability.
  • the mobility of this partially dissociated DNA fragment is very slow and can be separated from the mobility of a complete double-stranded DNA without a dissociated part.
  • a DNA containing a Gpbarl gene region prepared from a subject and a substrate on which a nucleotide probe that hybridizes to the DNA is immobilized are provided.
  • the “substrate” means a plate-like material on which a nucleotide probe can be fixed.
  • nucleotides include oligonucleotides and polynucleotides.
  • the substrate of the present invention is not particularly limited as long as the nucleotide probe can be immobilized, but a substrate generally used in DNA array technology can be preferably used.
  • a DNA array consists of thousands of nucleotides printed on a substrate at high density. Usually, these DNAs are printed on the surface of a non-porous substrate.
  • the substrate surface can be a force permeable membrane, typically glass, such as a nitrocellulose membrane.
  • nucleotide immobilization (array) method developed by Aifymetrix
  • An array based on oligonucleotides can be exemplified.
  • the oligonucleotides are usually synthesized in situ.
  • in-situ synthesis methods of oligonucleotides using photolithographic technology (Affymetrix) and inkjet (Rosetta Inpharaiatics) technology for immobilizing chemical substances are already known.
  • in-situ synthesis methods of oligonucleotides using photolithographic technology (Affymetrix) and inkjet (Rosetta Inpharaiatics) technology for immobilizing chemical substances are already known.
  • the nucleotide probe immobilized on the substrate is not particularly limited as long as it can detect a mutation in the Gpbarl gene region. That is, the probe is, for example, a probe that hybridizes to DNA containing the Gpb arl gene region. If specific hybridization is possible, the nucleotide probe need not be completely complementary to DNA containing the Gpbarl gene region.
  • the length of the nucleotide probe to be bound to the substrate is usually 10 to 100 bases, preferably 10 to 50 bases, more preferably 15 to 25 bases when immobilizing oligonucleotides. is there.
  • the DNA is then brought into contact with the substrate.
  • DNA is hybridized to the nucleotide probe.
  • the reaction solution and reaction conditions for the hybridization may vary depending on various factors such as the length of the nucleotide probe immobilized on the substrate, but can generally be performed by methods well known to those skilled in the art.
  • the intensity of hybridization between the DNA and the nucleotide probe immobilized on the substrate is then detected.
  • This detection can be performed, for example, by reading the fluorescent signal with a scanner or the like.
  • DNA arrays DNA fixed on a glass slide is generally called a probe, while labeled DNA in a solution is called a target. Therefore, the nucleotide immobilized on the substrate is referred to as a nucleotide probe in the present specification.
  • the intensity of the detected hybrid is further compared with that of the control.
  • Examples of such a method include a DNA array method.
  • an allele specific oligonucleotide (ASO) hybridization method can be used for the purpose of detecting only a mutation at a specific position.
  • ASO allele specific oligonucleotide
  • TaqMan PCR method Acyclo Prime method, MALDI-TOF / MS method and the like can also be used.
  • the Invader method and the RCA method can also be used as a method for determining base species independent of PCR. These methods are briefly described below. Any of the methods described here can be applied to the determination of the base type of the mutation site in the present invention.
  • the principle of the TaqMan PCR method is as follows.
  • the TaqMan PCR method is an analysis method using a primer set that can amplify an allele-containing region and a TaqMan probe. TaqMan probes are designed to hybridize to the region containing the allele amplified by this primer set.
  • the hybridization efficiency of the TaqMan probe is significantly reduced due to the difference of one base group.
  • the extension reaction from the primer eventually reaches the hybridized TaqMan probe.
  • the TaqMan probe is degraded from its 5 ′ end by the 5′_3 ′ exonuclease activity of DNA polymerase. If the TaqMan probe is labeled with a reporter dye and a quencher, the degradation of the TaqMan probe can be followed as a change in fluorescence signal.
  • the TaqMan probe when the TaqMan probe is decomposed, the reporter dye is released and the fluorescent signal is generated by increasing the distance from the quencher. If the hybridization of the TaqMan probe decreases due to a single base difference, the TaqMan probe will not decompose and a fluorescent signal will not be generated.
  • a TaqMan probe corresponding to a mutation is designed and a different signal is generated by the decomposition of each probe, the base species can be simultaneously determined.
  • 6-carboxy-fluorescein (FAM) is used as the TaqMan probe of a certain allele Alenore A as a reporter dye
  • VIC is used as an allele B probe.
  • FAM 6-carboxy-fluorescein
  • the fluorescence signal generation of the reporter dye is suppressed by Quenchia .
  • a fluorescent signal corresponding to the hybrid is observed.
  • FAM or VIC signal is stronger than the other, it turns out that it is homologous to allele A or allele B.
  • both signals will be detected at approximately the same level.
  • TaqMan PCR By using TaqMan PCR, PCR and base species can be determined simultaneously for genome analysis without the power and time required for separation on a gel. Therefore, Ta qMan PCR method is useful as a method that can determine the base type for many subjects.
  • the Acyclo Prime method has also been put to practical use as a method for determining the base species using the PCR method.
  • the Acyclo Prime method uses one set of primers for genome amplification and one primer for detecting SNPs.
  • the region containing the mutation site in the genome is amplified by PCR. This process is the same as normal genomic PCR.
  • the PCR product obtained is annealed with primers for detecting SNPs, and an extension reaction is performed.
  • Primers for detecting SNPs are designed to anneal to the region adjacent to the mutation site to be detected.
  • nucleotide derivative labeled with a fluorescent polarizing dye and blocked with 3'-OH is used as a nucleotide substrate for the extension reaction.
  • FP fluorescence polarization
  • Incorporation of nucleotide derivatives into the primer can be detected by an increase in fluorescence polarization (FP) due to an increase in molecular weight. If two types of labels with different wavelengths are used for the fluorescent polarizing dye, it is possible to identify which of the two types of bases a particular SNP is. Since the level of fluorescence polarization can be quantified, a single analysis can determine whether the allele is homozygous or heterozygous.
  • Base species can also be determined by analyzing PCR products with MALDI-TOF / MS.
  • MALD ⁇ TOF / MS can be used in various fields as an analytical method that can clearly identify the slight differences in protein amino acid sequences and DNA base sequences because it can know the molecular weight with great accuracy.
  • Determination of base species by MALDI-TOF / MS First, the region containing the allele to be analyzed is amplified by PCR. The amplified product is then isolated and its molecular weight determined by MALDI-TOF / MS. Since the base sequence of the allele is known in advance, the base sequence of the amplification product is uniquely determined based on the molecular weight.
  • the determination of the base species using MALDKTOF / MS requires a PCR product separation step and the like. However, accurate base type determination can be expected without using labeled primers or labeled probes. It can also be applied to simultaneous detection of mutations at multiple locations.
  • the base type of the mutation site is determined using a lis type restriction enzyme.
  • a primer having a lis-type restriction enzyme recognition sequence is used for PCR.
  • a general restriction enzyme (type IV) used for gene recombination recognizes a specific base sequence and cleaves a specific site in the base sequence.
  • lis-type restriction enzymes recognize a specific base sequence and cleave a site away from the recognized base sequence. The number of bases between the recognition sequence and the cleavage site is determined by the enzyme. Therefore, if the primer containing the recognition sequence of lis type restriction enzyme is annealed at a position separated by the number of bases, the amplified product can be cleaved at the mutation site by lis type restriction enzyme.
  • a cohesive end containing the base of SNPs is formed at the end of the amplified product cleaved with the lis type restriction enzyme.
  • an adapter consisting of a base sequence corresponding to the sticky end of the amplification product is ligated.
  • the adapter 1 is composed of different base sequences including bases corresponding to mutations, and can be labeled with different fluorescent dyes.
  • the amplification product is labeled with a fluorescent dye corresponding to the base at the mutation site.
  • the amplification product is fluorescently labeled and immobilized using the capture primer. Can do.
  • the amplification product can be captured on avidin-bound beads. By tracking the fluorescent dye of the amplification product thus captured, the base species can be determined.
  • a technique capable of analyzing a plurality of alleles in parallel in a single reaction system is also known. Analyzing a plurality of alleles in parallel is called multiplexing.
  • a typing method using a fluorescent signal requires fluorescent components having different fluorescent wavelengths for multiplexing. There are not so many fluorescent components that can be used for actual analysis.
  • a plurality of types of fluorescent components are mixed in a resin or the like, a variety of fluorescent signals that can be distinguished from each other can be obtained even with limited types of fluorescent components.
  • a component that is magnetically adsorbed in the resin is added, it is possible to obtain beads that emit fluorescence and can be separated by magnetism. Multiplex mutation typing using such magnetic fluorescent beads has been devised (Bioscience and Bioindustry, Vol. 60 No. 12, 82 824).
  • a probe having a base complementary to the mutation site of each allele is immobilized on the magnetic fluorescent beads. The two are combined so that each allele corresponds to a magnetic fluorescent bead with a unique fluorescent signal.
  • a probe fixed to a magnetic fluorescent bead hybridizes to a complementary sequence, a fluorescently labeled oligo DNA having a base sequence complementary to an adjacent region on the allele is prepared.
  • the region containing the allele is amplified by asymmetric PCR, the above-described magnetic fluorescent bead-immobilized probe and fluorescently labeled oligo DNA are hybridized, and both are ligated.
  • the end of the magnetic fluorescent bead-immobilized probe has a base sequence complementary to the base at the mutation site, it is efficiently ligated.
  • the terminal bases are different due to mutation, the ligation efficiency of the two will decrease.
  • the fluorescently labeled oligo DNA binds to each magnetic fluorescent bead only when the sample is a base species complementary to the magnetic fluorescent bead.
  • the magnetic fluorescent beads are collected by magnetism, and the base species is determined by detecting the presence of fluorescently labeled oligo DNA on each magnetic fluorescent bead.
  • Magnetic fluorescent beads can analyze the fluorescence signal for each bead using a flow cytometer, so that separation of signals is easy even when multiple types of magnetic fluorescence beads are mixed. In other words, various types of mutation sites Thus, “multiplexing” is achieved, in which analysis is performed in parallel in a single reaction vessel.
  • the base type is determined using only three types of oligonucleotides, an allele probe, an invader probe, and a FRET probe, and a special nuclease called cleavase. Of these probes, only the FRET probe requires labeling.
  • the allele probe is designed to hybridize to a region adjacent to the allele to be detected. On the 5 'side of the allele probe, a flap consisting of a base sequence unrelated to the hybrid is connected.
  • the allele probe has a structure that hybridizes to the 3 ′ side of the mutation site and is linked to the flap on the mutation site.
  • the invader probe consists of a base sequence that hybridizes to the 5 'side of the mutation site.
  • the base sequence of the invader probe is designed so that the 3 'end corresponds to the mutation site by hybridization.
  • the base at the position corresponding to the mutation site in the invader probe is optional.
  • the base sequences of the invader probe and the allele probe are designed to hybridize adjacent to each other across the mutation site.
  • the mutation site is a base complementary to the base sequence of the allele probe
  • the invader probe is added to the base corresponding to the mutation site of the allele probe.
  • An invasion structure is formed.
  • the cleavase cleaves the strand on the invading side of the oligonucleotide that has formed the invading structure thus formed. Since the cut occurs on the intrusion structure, the result is that the allele probe flap is cut off.
  • the base at the mutation site is not complementary to the base of the allele probe, there is no competition between the invader probe and the allele probe at the mutation site, and no intrusion structure is formed. Therefore, the cleavase does not break the flap.
  • the FRET probe is a probe for detecting the flap thus separated.
  • the FRET probe has a self-complementary sequence at the 5 'end, and a single-stranded portion is placed at the 3' end. Make up a hairpin loop.
  • the single-stranded part arranged on the 3 ′ end side of the FRET probe is composed of a base sequence complementary to the flap, and it is possible to hybridize the flap here. Flap force When hybridized to the SFRET probe, both base sequences are designed so that a structure in which the 3 'end of the flap enters the 5' end of the self-complementary sequence of the FRET probe is formed. A cleavase recognizes and cleaves an invasion structure.
  • the FRET probe cleavage can be detected as a change in the fluorescence signal.
  • the flap should hybridize to the FRET probe even if it is not cut. In fact, there is a large difference in the binding efficiency to FRET between the cut flap and the flap that exists in the allele probe state. Therefore, it is possible to specifically detect the cut flap using the FR ET probe.
  • two types of allele probes including base sequences complementary to allele A and allele B may be prepared. At this time, the base sequences of the flaps are different. If two types of FRET probes for detecting flaps are prepared and each reporter dye can be identified, the base type can be determined based on the same concept as the TacMan PCR method.
  • the advantage of the Invader method is that only the FRET probe is required for labeling.
  • the FRET probe can use the same oligonucleotide regardless of the base sequence to be detected. Therefore, mass production is possible.
  • the reagent for dienotyping can be manufactured at low cost.
  • the RCA method can be cited as a method for determining the base species independent of the PCR method.
  • DNA polymerase with strand displacement action The rolling circle amplification (RCA) method is based on the reaction of synthesizing long complementary strands using circular single-stranded DNA as a cage (Lizardri PM et al ., Nature Genetics 19, 225, 1998).
  • a primer that anneals to circular DNA and initiates complementary strand synthesis and this primer
  • the amplification reaction is made up using a second primer that anneals to the long complementary strand
  • the RCA method uses a DNA polymerase having a strand displacement action. Therefore, the part that has become double-stranded by complementary strand synthesis is replaced by a complementary strand synthesis reaction initiated from another primer annealed to the 5 'side. For example, the complementary strand synthesis reaction using circular DNA as a saddle is not completed in one round. Complementation of complementary strands continues while replacing the previously synthesized complementary strand, producing long, single-stranded DNA. On the other hand, the second primer is annealed to the long, single-stranded DNA produced in a circular shape from the circular DNA, and complementary strand synthesis begins.
  • single-stranded DNA generated by the RCA method is a circular DNA
  • the base sequence is a repeat of the same base sequence.
  • continuous generation of long single strands results in continuous annealing of the second primer.
  • single-stranded portions that can anneal the primer are continuously generated without going through a denaturation step.
  • DNA amplification is achieved.
  • the base type can be determined using the RCA method.
  • a linear single-stranded padlock probe is used.
  • the padlock probe has complementary base sequences on both sides of the mutation site to be detected at the 5 ′ end and 3 ′ end. These base sequences are linked at a portion consisting of a special base sequence called a backbone.
  • the mutation site is a nucleotide sequence complementary to the end of the padlock probe, the end of the padlock probe hybridized to the allele can be ligated with DNA ligase.
  • the linear padlock probe is circularized and the reaction of the RCA method is triggered.
  • the reaction of DNA ligase is greatly reduced in the reaction efficiency when the terminal portion to be ligated is not completely complementary. Therefore, the base type of the mutation site can be determined by confirming the presence or absence of ligation by the RCA method.
  • the RCA method has the ability to amplify DNA.
  • the base species cannot usually be determined unless a reaction is performed for each allele.
  • a method in which these points are improved for the determination of the base species is known.
  • using a molecular beacon 1 tube based on the RCA method Can be used to determine postponement species.
  • the molecular beacon is a signal generation probe using a fluorescent dye and a quencher, as in the TaqMan method.
  • the molecular beacons are composed of complementary base sequences at the 5 'and 3' ends, and form a hairpin structure alone.
  • both ends are labeled with a fluorescent dye and a quencher, the fluorescence signal cannot be detected when the hairpin structure is formed. If a part of the molecular beacon is set as a complementary nucleotide sequence to the amplification product of the RCA method, the molecular beacon hybridizes to the amplification product of the RCA method. Since the hairpin structure is canceled by hybridization, a fluorescent signal is generated.
  • the advantage of the molecular beacon is that the base sequence of the molecular beacon can be made common regardless of the detection target by using the base sequence of the backbone portion of the padlock probe.
  • the base type can be determined in one tube. Since the cost of synthesis of fluorescently labeled probes is high, the ability to use a common probe regardless of the measurement target is an economic advantage.
  • the total bile acid pool amount is also decreased, and the disease is determined to be based on a decrease in the total bile acid pool amount. It is possible. Further, depending on the position of the mutation, it is considered that the total bile acid pool amount may increase. In this case, it can be determined that the disease is based on the increase in the total bile acid pool amount.
  • the present invention relates to a test agent for a disease associated with a decrease or increase in the total amount of bile acid pool or a lipid metabolic disease.
  • the screening agent may be hybridized to the Gpbarl gene region and at least 15 nucleotides.
  • a test agent for a disease associated with a decrease or increase in the total bile acid pool amount or a lipid metabolic disease comprising an oligonucleotide having a chain length.
  • the oligonucleotide of the present invention includes a polynucleotide.
  • the oligonucleotide of the present invention is a probe or primer used for detection or amplification of the DNA encoding the protein of the present invention, a probe or primer for detecting the expression of the DNA, or the expression of the protein of the present invention.
  • These can be used as nucleotides or nucleotide derivatives (for example, antisense oligonucleotides or ribozymes or DNAs encoding them).
  • the oligonucleotide of the present invention can be used in the form of a DNA array substrate.
  • oligonucleotide When the oligonucleotide is used as a primer, its length is usually 15 bp to 100 bp.
  • the primer is not particularly limited as long as it can amplify at least a part of the DNA of the present invention or its complementary strand.
  • the 3 'region can be complementary, and the 5' side can be attached with a restriction enzyme recognition sequence or tag.
  • the probe is not particularly limited as long as it specifically hybridizes to at least a part of the DNA of the present invention or its complementary strand.
  • the probe may be a synthetic oligonucleotide and usually has a chain length of at least 15 bp.
  • the oligonucleotide of the present invention is used as a probe, it is preferably used after being appropriately labeled.
  • T4 polynucleotide kinase is used to phosphorylate the 5 ′ end of the oligonucleotide with 32 P or the like, and a DNA polymerase such as talenoenzyme is used.
  • a method such as a random prime method
  • a substrate base labeled with an isotope such as 3 2 P
  • a fluorescent dye or piotin is incorporated using a nucleotide or the like as a primer.
  • the oligonucleotide of the present invention can be produced, for example, by a commercially available oligonucleotide synthesizer.
  • the probe can also be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
  • the screening agent includes a reduction in the amount of total bile acid pool including an antibody that binds to Gpbarl. Mention may be made of test agents for diseases associated with small or increased diseases or lipid metabolic diseases.
  • the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it recognizes the above Gpbarl, but is preferably an antibody that specifically recognizes Gpb arl.
  • the antibody used for detection of the protein is not particularly limited as long as it is a detectable antibody.
  • a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used.
  • a known antibody can be used.
  • an antibody can be prepared by a method known to those skilled in the art using the protein as an antigen.
  • a recombinant protein expressed in a microorganism such as Escherichia coli or a partial peptide thereof as a fusion protein with the protein or GST is immunized to a small animal such as a rabbit and serum is obtained.
  • This is prepared by, for example, purification using ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, affinity column coupled with the protein or synthetic peptide, or the like.
  • a monoclonal antibody for example, the protein or a partial peptide thereof is immunized to a small animal such as a mouse, and the spleen is removed from the mouse and ground to separate the cells.
  • a roman cell is fused with a reagent such as polyethylene glycol, and a clone that produces an antibody that binds to the protein is selected from the resulting fused cell (hypridoma).
  • a reagent such as polyethylene glycol
  • a clone that produces an antibody that binds to the protein is selected from the resulting fused cell (hypridoma).
  • the obtained hyperidoma was transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites was collected from the mouse, and the resulting monoclonal antibody was purified using, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, It can be prepared by purification using an affinity column coupled with the protein or synthetic peptide.
  • a polyclonal antibody can be obtained, for example, as follows.
  • the protein or fragment thereof is used as a sensitizing antigen and immunized according to a normal immunization method.
  • the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and a normal screening method is used. Screen for monoclonal antibody-producing cells (hybridoma).
  • Antigen preparation is performed using a known method such as baculovirus. Method (W098 / 46777 etc.).
  • Hypridoma can be prepared, for example, according to the method of Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C "Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46). If it is low, it may be immunized by binding to an immunogenic macromolecule such as albumin, etc. Then, the cDNA of the variable region (V region) of the antibody using reverse transcriptase from the mRNA of the hybridoma. If the sequence of the obtained cDNA is decoded by a known method.
  • a mouse antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, a Hedge antibody, a human antibody and the like which are not particularly limited as long as they bind to the protein, can be appropriately used.
  • genetically modified antibodies that have been artificially modified for the purpose of reducing the heterologous antigenicity to humans such as chimeric antibodies, humanized antibodies, and the like can also be used. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • the chimeric antibody is a mammal other than a human, for example, an antibody comprising a heavy chain and light chain variable region of a mouse antibody and a heavy chain and light chain constant region of a human antibody, and encodes the variable region of a mouse antibody.
  • DNA can be obtained by ligating DNA encoding the constant region of a human antibody, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it.
  • a humanized antibody is also called a reshaped human antibody, and a complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal such as a mouse is complemented by a human body. It is transplanted to the decision region, and its general gene recombination technique is also known. Specifically, several DNA sequences designed to link mouse antibody CDRs and human antibody framework regions (FR) with overlapping portions at the ends are prepared. The oligonucleotide is synthesized from the oligonucleotide by PCR. The obtained DNA is obtained by ligating with the DNA encoding the human antibody constant region, and then incorporating it into an expression vector and introducing it into a host for production (European Patent Application Publication No.
  • the human antibody FR to be ligated via CDR is selected such that the complementarity determining region forms a good antigen-binding site. If necessary, amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen binding site (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 85 to 856). [0188] A method for obtaining a human antibody is also known.
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with a desired antigen or cells expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, such as U266, to form a desired human antibody having an antigen-binding activity.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (International Patent Application Publication Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/2 5585, WO 96/34096, WO 96/33735).
  • variable region of a human antibody is expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • an appropriate expression vector having the sequence can be prepared and a human antibody can be obtained.
  • the antibody used in the present invention may be a conjugated antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substances, and toxins. Such a conjugated antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field.
  • the “antibody” in the present invention includes these conjugated antibodies.
  • test agents in addition to the active ingredient oligonucleotide or antibody, for example, sterile water, physiological saline, vegetable oil, surfactant, lipid, solubilizer, buffer, protein stability Agents (BSA, gelatin, etc.), preservatives, etc. may be mixed as necessary.
  • sterile water, physiological saline, vegetable oil, surfactant, lipid, solubilizer, buffer, protein stability Agents (BSA, gelatin, etc.), preservatives, etc. may be mixed as necessary.
  • Example 1 Elucidation of tissue distribution of mouse Gpbarl mRNA In order to clarify the tissue distribution of mouse Gpbarl mRNA, quantitative RT-PCR analysis was performed on various mouse tissues.
  • RNA derived from each tissue was quantified with ISOGEN (Nitsubon Gene, Tokyo). Total RNA derived from each tissue was quantified with a spectrophotometer, then a certain amount was reacted with reverse transcriptase, and the resulting cDNA was subjected to analysis by quantitative RT-PCR. Quantitative RT-PCR analysis was performed by TaqMan PCR method using PRISM 7900HT sequence detector (Applied Biosystems, USA). Primers and probes for detection of mouse G pbarl expression were purchased from Applied Biosystems using Assay on demand set (Atsusei ID: Mm00558112_sl).
  • mouse Gpbarl mRNA was strongly detected in the ileum and colon of male mice and in the colon of female mice, and was detected in lung, spleen, kidney, stomach, jejunum and white adipose tissue. was detected moderately regardless of gender (Fig. 1A, 1B). It was also detected moderately in the ileum of female mice. This indicates that Gpbarl mRNA is strongly expressed in the small and large intestines, suggesting that Gpbarl plays a major role in the intestine along with bile acids.
  • mice with the targeted disruption of the Gpbarl gene were prepared by the method described below and the targeting strategy described in Fig. 2A.
  • the black squares in Fig. 2A represent exons (E1 and E2), and the English symbols indicate restriction enzyme sites (H for HindIII, S for Sph I, A for Apa I, N force SNsi I, E for Represents EcoRI.)
  • exon 1 was screened by screening a 129 / Sv mouse genomic phage library (Stratagene) using a mouse Gpbarl / M-Bar 1.2 kb full-length cDNA (GenBank accession number AB086 170). A mouse genomic Gpbarl clone containing 2 and 2 was obtained.
  • the targeting vector was linearized at the sole sail site and introduced into the mouse embryonic stem (ES) cell, RW4, using the electro-poration method.
  • mice were individually housed in cages and fed individually as appropriate.
  • Total bile acids were extracted as described by Park et al. (Sinai, CJ, Tohkin, M., Miyata, M., Ward, JM, Lambert, G., and Gonz alez, FJ 2000. Targeted disruptinon of the nuclear receptor. FXR / BAR impairs bil e acid and lipid homeostasis. Cell 102: 731-744).
  • feces were collected from each mouse for 72 hours immediately before slaughter, dried, weighed and homogenized. An aliquot was extracted as in the total bile acid pool measurement.
  • Plasma triglycerides (TG) and total cholesterol were measured in homozygous and wild type mice. Plasma triglycerides (TG) and total cholesterol were measured using commercially available kits [Determ iner L-TG II and L TC II (Kyowa medex)].
  • Plasma triglyceride levels in homozygous mice were similar to wild-type mice, but plasma total cholesterol levels were significantly increased by 16% in male homozygous mice (p ⁇ 0.05) and in females. There was no increase (data not shown). These results suggest that Gpbarl may contribute to the regulation of plasma cholesterol levels in a sexually dimorphic manner.
  • mice in each group were managed under a 12-hour light / 12-hour light-dark cycle, and were high-fat diet (60% of calories were rad; RESEARCH DIETS, New Jersey, (US) was ingested freely. Body weight was measured once a week at 13:00.
  • FIG. Figures 5A and 5C show the body weight of each male or female group
  • Figures 5B and 5D show the change in body weight.
  • the white squares for the homozygous mouse group, heterozygous mouse group, and wild type mouse group, respectively. Black triangle, black circle.
  • FIGS. 6A and 6C show the fat mass of 18-week-old mice in each male or female group
  • FIGS. 6B and 6D show the lean body mass excluding the fat mass.
  • the homozygous mouse group, heterozygous mouse group, and wild type mouse group are represented by ⁇ / _, + / _, and + / +, respectively.
  • the expression level or activity of Gpbarl or the binding to Gpbarl can be used as an indicator for screening drugs for the treatment or prevention of diseases or lipid metabolic diseases associated with increases or decreases in the total bile acid pool level .
  • the Gpbarl-deficient mouse of the present invention can be used as a disease state model mouse for research to elucidate the physiological role of Gpbarl. It can be used to estimate the side effects.
  • cell lines established from tissue of genetically modified animals can be used to examine side effects of the above drugs and the like in an in vitro system.

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Abstract

　Gpbar1欠損マウスを作製し、Gpbar1が胆汁酸恒常性及び脂質代謝の制御に関与するか否かについて検討した結果、Gpbar1欠損マウスでは糞便中胆汁酸排泄レベルが変化することなく全胆汁酸プール量が減少した。また、高脂肪餌で飼育したGpbar1欠損雌性マウスの体重は、野性型マウスと比較して顕著に増加し、これは脂肪の増加によるものであった。これより、Gpbar1が胆汁酸恒常性及び脂質代謝の制御に寄与することが示唆された。

Description

明 細 書
全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患に対する薬剤 及び、それら薬剤のスクリーニング方法
技術分野
[0001] 本発明は全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患に対する薬剤 及び、それら薬剤のスクリーニング方法に関する。また、全胆汁酸プール量の増減に 伴う疾患又は脂質代 i射性疾患の検査方法及び検査薬に関する。さらに、 Gpbarl遺 伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物 に関する。
背景技術
[0002] 胆汁酸は肝臓においてコレステロールから合成され、食物中の脂肪の可溶化にお いてばかりでなく胆汁酸及びコレステロールの恒常性の維持においても、極めて重 要な役割を担っている（非特許文献 1， 2)。胆汁酸は、フアルネソイド X受容体 (FXR) の活性化を介して多くの生合成酵素及び輸送体を制御することがよく知られている（ 非特許文献 3， 4)。例えば、胆汁酸合成の律速酵素であるコレステロール 7ひ-水酸 化酵素（CYP7A)、 Na+-タウロコール酸共輸送ポリペプチド（NTCP)、及び胆汁酸排 出ポンプ (BSEP)。これらの酵素及び輸送体は、胆汁酸の恒常性にとって非常に重 要である（非特許文献 5〜9)。
[0003] ステロイドホルモン力 S、その核内受容体の刺激を介して古典的なゲノム応答により 様々な遺伝子を調節することは、よく研究されている（非特許文献 10, 11)。しかし、い くつかのステロイドホルモンは、迅速な非ゲノム応答により二次メッセンジャーを刺激 するこという実質的な証拠が存在する（非特許文献 12)。 Zhuらは膜プロゲスチン受容 体 (mPR)を同定し、これが G-タンパク共役型受容体 (GPCR)の典型的な構造である 7回膜貫通ドメインを有することを明らかにした (非特許文献 13， 14)。 mPRを発現して いる細胞では、プロゲスチンが cAMP形成を阻害し、その反応が百日咳毒素に感受 性であったことから、 mPRが Gi/oタンパク質と共役していることが示唆された。同様に 、胆汁酸は FXR等の核内受容体を活性化し、またいくつかのデータからは、迅速に c AMP形成を刺激する胆汁酸の特異的受容体の存在が示唆されていた (非特許文献 15， 16)。
非特許文献 1 : Russell, D. W.， and Setchell, Κ· D. 1992. Bile acid biosynthesis. Bioc hemistry 31 : 4737-4749
^特許文献 2 : Dietschy, J. M. 1968. Mechanisms for the intestinal absorption of bile acids. J. Lipid Res. 9: 297—309
非特許文献 3 : Russell, D. W. 2003. The enzymes, regulation, and genetics of bile ac id synthesis. Annu. Rev. Biochem. 72: 137 - 174
非特許文献 4 : Redinger, R. N. 2003. Nuclear receptors in cholesterol catabolism: m olecular biology of the enterohepatic circulation of bile salts and its role in cholester ol homeostasis. J. Lab. Clin. Med. 142: 7 - 20.
非特許文献 5 : Sinal， C. J., Tohkin, M., Miyata, M.， Ward, J. M., Lambert, G.， and Gonzalez, F. J. 2000. Targeted disruptinon of the nuclear receptor FXR/BAR impai rs bile acid and lipid homeostasis. Cell 102: 731-744
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^^特言午文献 8 : Ananthanarayanan, M. , Balasubramanian, N.， Makishima, M., Mangels dorf, D. J., and Suchy, F.， J. 2001. Human bile salt export pump promoter is transac tivated by the farnesoid X receptor/bile acid receptor. J. Biol. Chem. 276: 28857-2
8865
非特許文献 9 : Grober, J., Zaghini, 1·， Fujii, H.， Jones, S. A., Kliewer, S. A., Willson, T. M.，〇no， T.， and Besnard, P. 1999. Identification of a bile acid-responsive elem ent in the human ileal bile acid-binding protein gene. J. Biol. Chem. 274: 29749-297 54
^特許文献 10 : Beato， M. 1989. Gene regulation by steroid hormones. Cell 56: 335- 非特許文献 11： Aranda, A., and Pascual, A. 2001. Nuclear hormone receptors and g ene expression. Physiol. Rev. 81 : 1269-1304
非特許文献 12 : Norman, A. W.， Mizwicki, M. Τ· , and Norman, D. P. 2004. Steroid- hormone rapid actions, membrane receptors and a conformational ensemble model. Nat. Rev. Drug Discov. 3: 27-41
非特許文献 13 : Zhu， Y.， Rice, C. D.， Pang, Y.， Pace, M.， and Thomas, P. 2003. Clo ning, expression, and characterization of a membrane progestin receptor and eviden ce it is an intermediary in meiotic maturation of fish oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100: 2231-2236
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非特許文献 15 : Conley, D. R., Coyne, M. J., Bonorris, G. G.， Chung, A., and Schoe nfield, L. J. 1976. Bile acid stimulation of colonic adenylate cyclase and secretion in the rabbit. Am. J. Dig. Dis. 21 : 453-458
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発明の開示
発明が解決しょうとする課題
最近になって本発明者らは、新規 Gタンパク質共役胆汁酸受容体 1 (Gpbarl)を同 定した（非特許文献 17)。 Gpbarlは、 NCI-H716, STC_1、及び GLUTag等の腸内分 泌細胞株において、内因的に発現されていた。胆汁酸は、 Gpbarlを発現している細 胞において、胆汁酸の核内受容体である FXRを活性化することなぐ cAMP応答を刺 激することがわ力 ていた。さらに、 Gpbarlが同定されたことにより、胆汁酸の二重の シグナル系、 GPCRを介した系と核内受容体を介した系の存在が明らかにされた。
[0006] し力、しながら、 Gpbarlの腸内における正確な役割及び、 Gpbarlの欠損により引き起 こされる疾患は未だ解明されていない。
[0007] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、 Gpbarlの腸内における生 理的役割を明らかにし、その知見を医療に応用することを目的とする。
[0008] より具体的には、本発明は全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性 疾患に対する薬剤及び、それら薬剤のスクリーニング方法を提供することを目的とす る。また、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法及 び検查薬を提供する。さらに、 Gpbarl遺伝子の発現が人為的に抑制されていること を特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物を提供する。
課題を解決するための手段
[0009] 上記課題を解決するために、まず本願発明者らはインビボでの Gpbarlの生理的役 割を明らかにすることを目的として、相同的組換えによりマウスの Gpbarl遺伝子を破 壊し、 Gpbarl欠損マウスを作製した。そして、該 Gpbarl欠損マウスにおける全胆汁酸 プール量及び糞便中胆汁酸排泄レベルを測定し、 Gpbarlが胆汁酸恒常性の制御に 関与してレ、るか否力 ^検討した。
[0010] その結果、ホモ接合性マウスでは、糞便中胆汁酸排泄レベルは変化することなぐ 全胆汁酸プール量が野生型マウスと比較して有意に 21〜25%減少することがわかつ た。このことから Gpbarlが胆汁酸恒常性の制御に寄与することが示唆され、 Gpbarl欠 損マウスの解析は、胆汁酸の新たな生理的役割を明らかにする上で有用であること がわかった。
[0011] 次に、該 Gpbarl欠損マウスに高脂肪餌を与えて飼育し、 Gpbarlが脂質代謝の制御 に関与しているか否力を検討した。その結果、ホモ接合性マウスの体重は、同じ高脂 肪餌を与えて飼育した野性型マウスと比較して顕著に増加することがわかった。この 体重増加は、脂肪量の増加を示していることが判明し、 Gpbarlの欠損が脂質代謝の 異常を引き起こすことが示唆された。
[0012] Gpbarlが全胆汁酸プール量の増減及び脂質代謝異常に関係することから、 Gpbar 1への結合性、 Gpbarlの発現量、 Gpbarlの活性を標的としてスクリーニングを行えば 、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のため の薬剤を、特定することが可能であることがわかった。
[0013] すなわち、本発明者らは、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾 患に対する薬剤及びそれら薬剤のスクリーニング方法を開発することに成功した。さ らに、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法、該検 查薬、及び Gpbarl遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子 改変非ヒト哺乳動物についても開発することに成功し、これらにより本発明を完成す るに至った。
[0014] すなわち、本発明における、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性 疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法は、（a) Gpba rlに被検化合物を接触させる工程と、（b)該 Gpbarlと被検化合物との結合を検出す る工程と、 （c)該 Gpbarlと結合する被検化合物を選択する工程とを含むことを特徴と する。この方法を用いれば、 Gpbarlに結合し、胆汁酸と同様の生理作用を発揮し得 る化合物（例えば、 Gpbarlァゴニスト）を選別することができる。このスクリーニング方 法で活性が認められた化合物は、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代 謝性疾患の治療薬又は予防薬の候補とすることができる。
[0015] 上記のスクリーニング方法の各工程は、（a) Gpbarlを発現する細胞に被検化合物 を接触させる工程と、（b)該 Gpbarlの発現レベルを測定する工程と、（c)被検化合物 を接触させていない場合と比較して、該 Gpbarlの発現レベルを増加させた被検化合 物を選択する工程とすることができる。この方法を用いれば、 Gpbarlに直接作用しな レ、ィ匕合物であっても、細胞内のいずれかの分子に作用して Gpbarlの発現を亢進す る作用を有する化合物を選別することができる。
[0016] 上記のスクリーニング方法の各工程は、（a) Gpbarlをコードする DNAのプロモータ 一領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した DNAを有する細胞又は細胞 抽出液を提供する工程と、（b)該細胞又は該細胞抽出液に被検化合物を接触させる 工程と、（c)該細胞又は該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを 測定する工程と、 （d)被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター 遺伝子の発現レベルを増加させた被検化合物を選択する工程とすることができる。こ の方法を用いれば、 Gpbarlに直接作用しない化合物であっても、 Gpbarlのプロモー ターに作用して、 Gpbarlの発現を亢進する作用を有する化合物を選別することがで きる。
[0017] 上記のスクリーニング方法の各工程は、（a) Gpbarlに対するリガンドの存在下で、 G pbarlを細胞表面に発現させた細胞に被検化合物を接触させる工程と、 (b)該細胞 における Gpbarlの活性を測定する工程と、（c)被検化合物を接触させない場合と比 較して、上記活性を上昇させた被検化合物を選択する工程とすることができる。この 方法を用いれば、 Gpbarlに対するリガンドの存在下で、 Gpbarlの活性をさらに亢進 する作用を有する化合物を選別することができる。
[0018] 上記のスクリーニング方法の各工程は、（a)被検化合物を、 Gpbarl遺伝子の発現 が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物に投与する 工程と、（b)該遺伝子改変非ヒト哺乳動物における全胆汁酸プール量を測定するェ 程と、（c)被検化合物を投与していない場合と比較して、該遺伝子改変非ヒト哺乳動 物における全胆汁酸プール量を増加させる化合物を選択する工程とすることができ る。この方法を用いれば、 in vivoで Gpbarlの発現を亢進する作用を有する化合物又 は Gpbarlを介さずに全胆汁酸プール量を増加させる化合物を選別し、薬効の有無 につレ、て評価することができる。
[0019] また、本発明は、 Gpbarl遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする 遺伝子改変非ヒト哺乳動物を提供する。この非ヒト哺乳動物は、 in vivoで Gpbarlの発 現を亢進する作用を有する化合物又は Gpbarlを介さずに全胆汁酸プール量を増加 させる化合物のスクリーニングに使用することができる。
[0020] 上記遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、 Gpbarl遺伝子の遺伝子対の一方又は双方に 外来遺伝子を揷入して作成することができる。
[0021] また、本発明は、 Gpbarl遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする 遺伝子改変哺乳動物細胞を提供する。遺伝子改変哺乳動物細胞は、全胆汁酸ブー ル量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補 化合物のスクリーニングに使用することができる。
[0022] 上記遺伝子改変哺乳動物細胞は、 Gpbarl遺伝子の遺伝子対の一方又は双方に 外来遺伝子が揷入されていることを特徴とする遺伝子改変哺乳動物由来の細胞であ つてもよい。
[0023] また、本発明は、 Gpbarlタンパク質をコードする DNAを有効成分とする、全胆汁酸 プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤を提 供する。この薬剤を患者に投与し、該 DNAから Gpbarlタンパク質が作られれば、全 胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患を治療し又は予防すること ができる。
[0024] さらに、本発明における、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾 患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法は、（a) Gpbarl に被検化合物を接触させる工程と、（b)該 Gpbarlと被検化合物との結合を検出する 工程と、（c)該 Gpbarlと結合する被検化合物を選択する工程とを含むことを特徴とす る。この方法を用いれば、 Gpbarlに結合し、胆汁酸の生理作用を阻害し得る化合物（ 例えば、 Gpbarlアンタゴニスト）を選別することができる。このスクリーニングで活性が 認められた化合物は、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の 治療薬又は予防薬の候補とすることができる。
[0025] 上記のスクリーニング方法の各工程は、（a) Gpbarlを発現する細胞に被検化合物 を接触させる工程と、（b)該 Gpbarlの発現レベルを測定する工程と、（c)被検化合物 を接触させていない場合と比較して、該 Gpbarlの発現レベルを減少させた被検化合 物を選択する工程とすることができる。この方法を用いれば、 Gpbarlに直接作用しな レ、ィ匕合物であつても、細胞内のレ、ずれかの分子に作用して Gpbarlの発現を抑制す る作用を有する化合物を選別することができる。
[0026] 上記のスクリーニング方法の各工程は、（a) Gpbarlをコードする DNAのプロモータ 一領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した DNAを有する、細胞又は細 胞抽出液を提供する工程と、（b)該細胞又は該細胞抽出液に、被検化合物を接触さ せる工程と、 （c)該細胞又は該細胞抽出液における、該レポーター遺伝子の発現レ ベルを測定する工程と、（d)被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポ 一ター遺伝子の発現レベルを減少させた被検化合物を選択する工程とすることがで きる。この方法を用いれば、 Gpbarlに直接作用しない化合物であっても、 Gpbarlのプ 口モーターに作用して、 Gpbarlの発現を抑制する作用を有する化合物を選別するこ とができる。
[0027] 上記のスクリーニング方法の各工程は、（a) Gpbarlを細胞表面に発現させた細胞 に、被検化合物を接触させる工程と、 （b)該細胞における Gpbarlの活性を測定する 工程と、（c)被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を低下させた被検 化合物を選択する工程とすることができる。この方法を用いれば、 Gpbarlの活性を抑 制する作用を有する化合物を選別することができる。
[0028] また、本発明は、 Gpbarlの発現又は活性を低下させる化合物を有効成分とする、 全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のため の薬剤を提供する。この薬剤を患者に投与することにより、全胆汁酸プール量の増加 に伴う疾患又は脂質代謝性疾患を治療し又は予防することができる。
[0029] また、本発明は、上記の各スクリーニング方法により選択された、全胆汁酸プール 量の増減又は脂質代謝性疾患に伴う疾患の治療又は予防のための薬剤を提供する 。これらの薬剤は、これまで知られていなかった新たなメカニズムで、 Gpbarlの下流 のシグナル伝達を亢進又は抑止することが可能であり、全胆汁酸プール量の増減又 は脂質代謝性疾患に伴う疾患の治療し又は予防することができる。
[0030] また、本発明は、 Gpbarl遺伝子の発現量を測定する工程を含む、全胆汁酸プール 量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法を提供する。この検査方法に より、少量の生体材料 (血液等）から、全胆汁酸プール量の増減又は脂質代謝性疾 患に伴う疾患を検查することができる。
[0031] 上記検查方法は、 Gpbarl遺伝子領域における変異を検出する工程を含むことが好 ましい。
[0032] また、上記検査には、 Gpbarl遺伝子領域にハイブリダィズし、少なくとも 15ヌクレオ チドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、全胆汁酸プール量の減少又は増加 に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査薬を使用することができる。 [0033] 尚、上記検査方法は、 Gpbarlに結合する抗体を含むものであってもよい。 Gpbarl に結合する抗体を含む検査薬であっても、少量の生体材料 (血液等）から、全胆汁酸 プール量の減少又は増カロ、に伴う疾患又は脂質代謝性疾患を検査することができる
発明の効果
[0034] 本発明において、マウスでの Gpbarlの標的破壊により全胆汁酸プール量の減少が 示され、 Gpbarlがインビボでの胆汁酸恒常性の制御に寄与することが示唆された。さ らに、 Gpbarl欠損マウスに高脂肪餌を与えて飼育することにより、該マウスの体重は 同じ高脂肪餌を与えて飼育した野性型マウスと比較して顕著に増加し、 Gpbarlの欠 損が脂質代謝の異常を引き起こすことが示唆された。
[0035] このことより、 Gpbarlへの結合性、 Gpbarlの発現量、 Gpbarlの活性を標的として、 全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のため の薬剤のスクリーニングが可能になる。また、 Gpbarlの発現量や Gpbarl遺伝子の変 異を指標として、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査 が可能となる。
[0036] 本発明の Gpbarl欠損マウスの解析は、 Gpbarlの生理的役割を解明する研究にお いて有用なものとなり得る。また、該 Gpbarl欠損マウスは、本発明のスクリーニング方 法により特定された薬剤や、抗 Gpbarl抗体又は Gpbarlアンタゴニスト低分子等の Gp barl阻害剤の副作用を推測するために使用することができる。遺伝子改変動物の組 織力 樹立した細胞株を用いることで、各組織でスクリーニング方法により特定された 薬剤の副作用を詳細に検討することが可能である。
[0037] また、本発明の遺伝子改変動物は、生まれながらにして Gpbarl遺伝子が不活性化 されているため、 Gpbarlと結合するタンパク質に対する抗体を効率よく作製すること ができる。
[0038] さらに、本発明の遺伝子改変動物の症状を観察し、これまで原因の明らかでなかつ た疾患の症状と比較することで、疾患の原因が Gpbarlの機能不全であることを明らか にすることも可能である。
図面の簡単な説明 [0039] [図 1]マウス Gpbarl mRNAの組織分布を示す図である。
[図 2]マウス Gpbarl遺伝子の標的破壊を示す図及び写真である。
[図 3]Gpbarl欠損マウスにおける、全胆汁酸プール量及び糞便中胆汁酸排泄を示す 図である。
[図 4]通常餌を与えた Gpbarl欠損マウスの体重変動を示す図である。
[図 5]高脂肪餌を与えた Gpbarl欠損マウスの体重変動を示す図である。
[図 6]高脂肪餌を与えた Gpbarl欠損マウスの脂肪量及び除脂肪体重を示す図である
発明を実施するための最良の形態
[0040] 本発明は、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は 予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法に関する。
[0041] 胆汁酸は、胆汁の一成分であり、コレステロールを原料として肝臓で合成される。脂 肪を乳化し、小腸での消化吸収を助けるほか、各種ビタミンの吸収にも関係している 。胆管を経て腸に排出されるが、回腸末端部を中心とした腸管よりほとんど再吸収さ れ、門脈を経て肝臓にいく極めて閉鎖的な腸肝循環を行っている。
[0042] 本発明において、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患とは、全胆汁酸プール量の 減少に伴う疾患及び全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患のレ、ずれでもよレ、。全胆 汁酸プール量の減少に伴う疾患としては、消化不全、コレステロールの低下によるホ ルモンの減少、赤血球や血管の細胞膜の障害等を挙げることが出来る。また、全胆 汁酸プール量の増加に伴う疾患としては、血中のコレステロールの増加による動脈 硬化等を上げることが出来る。
[0043] 本発明において、脂質代謝性疾患とは、脂質の代謝に異常をきたすことを原因とす る疾患のレ、ずれでもよレ、。脂質の代謝異常により弓 Iき起こされる脂肪蓄積を基盤とす る疾患としては、例えば、肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧等のメタボリックシンドロ ームを挙げることができる。
[0044] 本発明のスクリーニング方法の第一の態様においては、まず、 Gpbarlに複数の被 験化合物を接触させる。
[0045] 本発明において、ヒト由来の Gpbarl cDNAの塩基配列を配列番号： 1に、該 DNA力 S コードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 2に示す。また、マウス由来の Gpbar 1 cDNAの塩基配列を配列番号： 3に、該 cDNAによりコードされる Gpbarlのアミノ酸配 列を配列番号: 4に示す。さらに、ラット由来の Gpbarlの cDNAの塩基配列を配列番 号： 5に、該 cDNAによりコードされる Gpbarlのアミノ酸配列を配列番号： 6に示す。尚 、本明細書において Gpbarlとは、特に断りがない限り、ヒト Gpbarl、マウス Gpbarl及 びラット Gpbarlの全てを指す。
[0046] また、本発明の方法に使用される Gpbarlには、上記の公知の Gpbarlタンパク質と 機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例えば、 Gpbarlタ ンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモログ、 Gpbarlの部分ペプチド又は他のタ ンパク質との融合タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。
[0047] 本発明における Gpbarlの変異体としては、配列番号： 2、 4又は 6に記載のアミノ酸 配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、揷入及び Z又は付加したアミ ノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号： 2、 4又は 6に記載のァ ミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることが出来る。ま た、配列番号： 1、 3又は 5に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下 でハイブリダィズする天然由来の DNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号 ： 2、 4又は 6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も 、 Gpbarlの変異体として挙げることができる。
[0048] 本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、 30アミノ酸以 内であり、好ましくは 15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 5アミノ酸以内（例えば、 3 アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の 性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖 の性質としては、疎水性アミノ酸 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水性アミノ酸（R、 D 、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、 A、 V、 L、 I、 P)、水 酸基含有側鎖を有するアミノ酸 (S、 Τ、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を 有するアミノ酸 (R、 K、 Η)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げる ことができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。あるアミノ酸配列に 対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び/又は他のアミノ酸による置換 により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持する ことはすでに知られている。
[0049] 本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、該タンパク質と同 等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。本発明において、該タンパ ク質の生物学的機能や生化学的機能としては、胆汁酸との結合等が挙げられる。生 物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれる。
[0050] 目的のタンパク質と「機能的に同等なタンパク質」をコードする DNAを調製するため に、当業者によく知られた方法としては、ハイブリダィゼーシヨン技術やポリメラーゼ連 鎖反応 (PCR)技術を利用する方法が挙げられる。すなわち、当業者にとっては、 Gpb arlの塩基配列（配列番号： 1、 3又は 5)若しくはその一部をプローブとして、また Gpb arl (配列番号： 1、 3又は 5)に特異的にハイブリダィズするオリゴヌクレオチドをプライ マーとして、 Gpbarlと高い相同性を有する DNAを単離することは通常行い得ることで ある。このようにハイブリダィズ技術や PCR技術により単離し得る Gpbarlと同等の機能 を有するタンパク質をコードする DNAもまた本発明の DNAに含まれる。
[0051] このような DNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリ ダイゼーシヨン反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン 条件とは、 6M尿素、 0.4%SDS、 0.5xSSCの条件又はこれと同等のストリンジエンシーの ハイブリダィゼーシヨン条件を指す。よりストリンジエンシーの高い条件、例えば、 6M 尿素、 0.4%SDS、 O.lxSSCの条件を用いることにより、より相同性の高レ、 DNAの単離を 期待すること力 Sできる。これにより単離された DNAは、アミノ酸レベルにおいて、 目的 タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミ ノ酸配列全体で、少なくとも 50%以上、さらに好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 9 0%以上（例えば、 95%，96%，97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配歹 や塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチユールによるアルゴリズム BLAST (Pro Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、 Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873， 1993 )を用いて決定できる。 BLASTのアルゴリズムに基づいた BLASTNや BLASTXと呼ば れるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990)。 BL ASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータ一は、例えば score = 100、 wo rdlength= 12とする。また、 BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメ 一ターは、例えば score = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラ ムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方 法の具体的な手法は公知である。
[0052] 本発明の方法に使用される Gpbarlが由来する生物種としては、特定の生物種に限 定されるものではなレ、。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ゥシ、酵 母、昆虫等が挙げられる。
[0053] 第一の態様に用いられる Gpbarlの状態としては、特に制限はなぐ例えば、精製さ れた状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態等であってもよい
[0054] Gpbarlの精製は周知の方法で行うことができる。また、 Gpbarlが発現している細胞 としては、内在性の Gpbarlを発現している細胞又は外来性の Gpbarlを発現している 細胞が挙げられる。上記内在性の Gpbarlを発現している細胞としては、培養細胞等 を挙げること力 Sできる力 これに限定されるものではなレ、。上記培養細胞としては、特 に制限はなぐ例えば、市販のものを用いることが可能である。内在性の Gpbarlを発 現している細胞が由来する生物種としては、特に制限はなぐヒト、サル、マウス、ラッ ト、モルモット、ブタ、ゥシ、酵母、昆虫等が挙げられる。また、上記外来性の Gpbarlを 発現している細胞は、例えば、 Gpbarlをコードする DNAを含むベクターを細胞に導 入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン 酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リボフエタミン法、マイクロインジェクション 法等によって実施することができる。また、上記外来性の Gpbarlを有する細胞は、例 えば、 Gpbarlをコードする DNAを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染 色体へ揷入することで作製することができる。このような外来性の Gpbarlが導入され る細胞が由来する生物種としては、哺乳類に限定されず、外来タンパク質を細胞内 に発現させる技術が確立されてレ、る生物種であればょレ、。
[0055] また、 Gpbarlが発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含ま れる細胞抽出液に、 Gpbarlをコードする DNAを含むベクターを添加したものを挙げる こと力 Sできる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなぐ市販の試験管内転 写翻訳キット等を使用することが可能である。
[0056] 本発明の方法における「被検化合物」としては、特に制限はなぐ例えば、天然化 合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化 合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発 酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽 出物若しくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じ て適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等 を挙げることができる。また、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混 合した混合物も含まれる。
[0057] また、本発明において「接触」は、 Gpbarlの状態に応じて行う。例えば、 Gpbarlが精 製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。 また、細胞内に発現した状態又は細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ 、細胞の培養液又は該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる 。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードする DNAを含む ベクターを、 Gpbarlが発現している細胞へ導入する、又は該ベクターを Gpbarlが発 現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母又 は動物細胞等を用いたツーハイブリッド法を利用することも可能である。
[0058] 第一の態様では、次いで、 Gpbarlと被験化合物との結合を検出する。検出方法とし ては、特に制限はない。 Gpbarlと被験化合物との結合は、例えば、 Gpbarlタンパク質 に結合した被験化合物に付された標識 (例えば、放射標識や蛍光標識等定量的測 定が可能な標識）によって検出することができる。また、 Gpbarlへの被験化合物の結 合により生じる Gpbarlの活性変化を指標に検出することもできる。
[0059] 本態様では、次いで、 Gpbarlと結合する被験化合物を選択する。選択された化合 物には、 Gpbarlの活性を促進又は抑制する化合物若しくは、 Gpbarlの発現を増加 又は減少させる化合物が含まれ、それらの化合物は結果として全胆汁酸プール量の 増加又は減少を引き起こすものである。
[0060] 本発明のスクリーニング方法の第二の態様としては、まず Gpbarlを発現する細胞に 被検化合物を接触させる。
[0061] 第二の態様では、次いで Gpbarlの発現レベルを測定する。 Gpbarlの発現レベルの 測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子の mRNA を定法に従って抽出し、この mRNAを錡型としたノーザンハイブリダィゼーシヨン法又 は RT-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができ る。さらに、 DNAアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能 である。
[0062] また、該遺伝子からコードされる Gpbarlを含む画分を定法に従って回収し、該 Gpba rlの発現を SDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベル の測定を行うこともできる。また、 Gpbarlに対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティ ング法を実施し、該 Gpbarlの発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定 を行うことも可能である。
[0063] Gpbarlの検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はない 力 例えばモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の両方を利用することができ る。該抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル 抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。 Gpbarl,あるいは GST との融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントタン パク質又はその部分ペプチドをゥサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例え ば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー 、 Gpbarlや合成ペプチドをカップリングしたァフィ二ティーカラム等により精製すること により調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、 Gpbarl又はその部分 ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行レ、、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつ ぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の 試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ノヽイブリドーマ）の中から、 Gpbar 1に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイプリドーマを マウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、 例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフ ィー、 Gpbarlや合成ペプチドをカップリングしたァフィ二ティーカラム等により精製す ることで、調製することが可能である。
[0064] 第二の態様では、次レ、で、被検化合物を接触させてレ、なレ、場合と比較して、該 Gpb arlの発現レベルを減少又は増加させた被検化合物を選択する。選択された化合物 には、 Gpbarlの発現を増加又は減少させる化合物が含まれ、それらの化合物は結果 として全胆汁酸プール量の増加又は減少を引き起こすものである。
[0065] 本発明のスクリーニング方法の第三の態様としては、まず、 Gpbarlをコードする DN Aのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した DNAを有する 細胞又は細胞抽出液を提供する。
[0066] 第三の態様において、「機能的に結合した」とは、 Gpbarl遺伝子のプロモーター領 域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、 G pbarl遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合してレ、ることをレ、う。従 つて、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タン パク質を形成する場合であっても、 Gpbarl遺伝子のプロモーター領域に転写因子が 結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機 能的に結合した」の意に含まれる。
[0067] 上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限さ れず、例えば、当業者において一般的に使用される CAT遺伝子、 lacZ遺伝子、ルシ フェラーゼ遺伝子、 β -グルクロニダーゼ遺伝子（GUS)及び GFP遺伝子等を挙げるこ とができる。また、上記レポーター遺伝子には、 Gpbarlタンパク質をコードする DNAも また含まれる。
[0068] Gpbarlをコードする DNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的 に結合した DNAを有する細胞又は細胞抽出液は、第一の態様において述べた方法 で調製することが可能である。
[0069] 第三の態様では、次いで、上記細胞又は上記細胞抽出液に被験試料を接触させ る。次いで、該細胞又は該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベル を測定する。
[0070] レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、 当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子が CAT 遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフエ二コールのァセチル化を検 出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポ一 ター遺伝子が lacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色 素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、 該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、 β -グノレクロニダーゼ遺伝子（GUS)である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用 による Glucuron (ICN社）の発光や 5-ブロモ -4-クロ口 -3-インドリル _ j3 _ダルクロニド（ X- Glue)の発色を検出することにより、さらに、 GFP遺伝子である場合には、 GFPタン パク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定する こと力 Sできる。
[0071] また、 Gpbarl遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、 第二の態様に記載された方法で行うことが出来る。
[0072] 第三の態様においては、次いで、被検化合物を接触させていない場合と比較して 、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少又は増加させた被検化合物を選択する。 選択された化合物には、該レポーター遺伝子の発現レベルを増加又は減少させる化 合物が含まれ、それらの化合物は結果として全胆汁酸プール量の増加又は減少を 引き起こすものである。
[0073] 本発明のスクリーニング方法の第四の態様としては、まず、 Gpbarlに対するリガンド の存在下で、 Gpbarlを細胞表面に発現させた細胞に被検化合物を接触させる。
[0074] 本明細書で使用される「リガンド」とは、特定の受容体によって認識されるランダムぺ プチド又は可変セグメント配列のような分子を示す。当業者が認識しているような分 子 (又は高分子複合体）は、受容体とリガンドの両方であることができる。一般的には 、より小さい分子量を持つ結合パートナーは、リガンドと呼ばれ、より大きい分子量を 持つ結合パートナーは受容体と呼ばれる。
[0075] 第四の態様では、次いで、上記 Gpbarlの活性を測定する。 Gpbarlの活性としては 、胆汁酸との結合活性、 cAMPの合成活性、 [3¾]GTP y Sの結合活性等を挙げること が出来る。次いで、被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を低下若 しくは増加させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、 Gpbarlの活性を 上昇又は低下させる化合物が含まれ、それらの化合物は結果として全胆汁酸プール 量の増加又は減少を引き起こすものである。
[0076] 本発明は、 Gpbarl遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝 子改変非ヒト哺乳動物に関する。
[0077] 本発明において「Gpbarl遺伝子の発現が人為的に抑制されている」とは、通常、 Gp barl遺伝子の遺伝子対の一方又は双方に、ヌクレオチドの揷入、欠失、置換等の遺 伝子変異を有することにより該遺伝子の発現が抑制されている状態を指す。正常な G pbarlタンパク質としての機能が減少又は喪失している変異 Gpbarlタンパク質が発現 している場合も、この「Gpbarl遺伝子の発現の抑制」に含まれる。上記「抑制」には、 Gpbarl遺伝子の発現が完全に抑制されてレ、る場合のほか、該遺伝子の遺伝子対の 一方の遺伝子の発現のみが抑制されている場合も含まれる。本発明においては、 Gp barl遺伝子の発現が特異的に抑制されていることが好ましい。また、遺伝子変異の 存在する部位は、該遺伝子の発現が抑制されるような部位であれば特に制限されず 、例えばェクソン部位、プロモーター部位等を挙げることができる。
[0078] 本発明において Gpbarl遺伝子の改変の対象となる動物は、通常、ヒト以外の動物 であり、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ゥサギ等のげつ歯類であり、その中でも 特にマウスが好ましい。本発明において Gpbarl遺伝子の改変の対象となる ES細胞も また、げっ歯類に由来するものが好ましぐ特にマウス由来が好ましい。尚、一般的に 称される「ノックアウト動物」も本発明の遺伝子改変動物に含まれる。
[0079] 本発明の遺伝子改変非ヒト動物（単に、「遺伝子改変動物」と記載する場合あり）及 び遺伝子改変 ES細胞において、 Gpbarl遺伝子の発現を人為的に抑制する手段とし ては、 Gpbarl遺伝子全体又はその一部を欠損させる方法や、 Gpbarl遺伝子の発現 制御領域の全部又はその一部を欠損させる方法等を例示することができるが、好ま しくは Gpbarl遺伝子の遺伝子対の一方又は双方に外来遺伝子を揷入することにより Gpbarl遺伝子を不活性化する方法である。すなわち、本発明の好ましい態様におい て、遺伝子改変動物及び遺伝子改変 ES細胞は、 Gpbarl遺伝子の遺伝子対の一方 又は双方に外来遺伝子が揷入されていることを特徴とする。
[0080] 本発明の遺伝子改変動物は、当業者においては一般的に公知の遺伝子工学技術 により作製することができる。例えば、以下のようにして遺伝子改変マウスを作製する こと力 Sできる。まず、マウスから Gpbarl遺伝子のェクソン部分を含む DNAを単離し、こ の DNA断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲッティングベクターを構築する 。このターゲッティングベクターをエレクト口ポレーシヨン法等によりマウスの ES細胞株 に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜する。揷入するマーカー遺伝子とし ては、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐 性遺伝子を揷入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組み換 えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためには、 ターゲッティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子等を結合させておくことも可能で ある。これにより、非相同組み換えを起こした細胞株を排除することができる。また、 P CR及びサザンブロットにより相同組み換え体の検定を行レ、、 Gpbarl遺伝子の遺伝子 対の一方が不活性化された細胞株を効率よく得ることもできる。
[0081] 相同組み換えを生じた細胞株を選抜する場合、相同組み換え箇所以外にも、遺伝 子挿入による未知の遺伝子破壊の恐れがあることから、複数のクローンを用いてキメ ラ作製を行うことが好ましい。得られた ES細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションし キメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、 Gpbarl遺伝子 の遺伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交 配させることで、 Gpbarl遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したマウスを取得する ことができる。より具体的には、後述の実施例に記載の方法に従って、本発明の遺伝 子改変マウスを作製することが可能である。マウス以外の ES細胞が樹立された動物 においても、同様の手法により、遺伝子改変を行うことができる。
[0082] また、 Gpbarl遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化した ES細胞株は、以下の方法 により取得することも可能である。すなわち、遺伝子対の一方を不活性化した ES細胞 株を高濃度の抗生物質を含む培地で培養することにより、遺伝子対のもう一方も不 活性化された細胞株、すなわち、 Gpbarl遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化した E S細胞株を得ることができる。また、遺伝子対の一方を不活性化した ES細胞株を選抜 し、この細胞株に再度ターゲッティングベクターを導入し、相同組換えを生じた細胞 株を選択することでも作製することができる。ターゲッティングベクターに揷入するマ 一力一遺伝子は、前出のマーカー遺伝子とは異なるものを使用することが好ましい。
[0083] また本発明は、本発明の遺伝子改変非ヒト動物から得られる遺伝子改変哺乳動物 細胞を提供する。遺伝子改変哺乳動物細胞は、初代培養細胞としてだけでなぐそ こから樹立された細胞株としても提供される。本発明の遺伝子改変動物由来の細胞 株を樹立する方法としては、公知の方法を利用することができる。例えば、げっ歯類 においては、胎仔細胞の初代培養の方法を用いることが可能である。さらに、本発明 における遺伝子改変哺乳動物細胞は、 ES細胞であってもよい。
[0084] 本発明の遺伝子改変動物、遺伝子改変哺乳動物細胞、そこから樹立した細胞株、 及び ES細胞は、 Gpbarl遺伝子の詳細な機能の解析に利用することができる。例えば 抗 Gpbarl抗体又は Gpbarlアンタゴニスト低分子等の Gpbarl阻害剤の副作用を推測 するために使用することができる。本発明で取得される遺伝子改変マウスは正常に生 育し、少なくとも胎生期に死亡することはなかったことから、 Gpbarl阻害剤（アンタゴニ スト）は致死性の副作用はないものと考えられる。本発明の遺伝子改変動物を詳細に 検討することにより、 Gpbarl阻害剤の副作用を推測することができる。また、遺伝子改 変哺乳動物細胞及びそこから樹立した細胞株を用いることで、各組織での Gpbarl阻 害剤の副作用を詳細に検討することが可能である。さらに、本発明の遺伝子改変哺 乳動物の ES細胞から分化誘導して得られる体の様々な組織を構成する細胞（血液、 神経、肝臓、勝臓等）は、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患 の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニングに好適である。
[0085] 本発明の遺伝子改変動物は、生まれながらにして Gpbarl遺伝子が不活性化されて レ、るため、 Gpbarlと結合するタンパク質に対する抗体を効率よく作製することができる 。例えば、完全フロインドアジュバンドとともに、 Gpbarlを本発明の遺伝子改変マウス に免疫することによって、 Gpbarlに対するモノクローナル抗体、あるいはポリクローナ ル抗体を効率よく作製することができる。この際、免疫する Gpbarlはマウス由来のも の以外に、ラットゃヒト由来であってもよい。
[0086] また、本発明の遺伝子改変動物の症状を観察し、これまで原因の明らかでなかつ た疾患の症状と比較することで、疾患の原因が Gpbarlの機能不全であることを明らか にすることも可能である。例えば、遺伝子改変マウスあるいは当該マウス由来細胞に 特徴的に現れる表現系を観察し、ヒトの疾患の諸症状と比較する。当該ヒト疾患の諸 症状のうち半分以上が本発明の遺伝子改変マウスで観察されれば、当該疾患の原 因が Gpbarlの機能不全であると推定することができる。本発明の遺伝子改変動物は 、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患のモデル動物としても 用いることが可能である。
[0087] また、該遺伝子改変非ヒト哺乳動物を利用して、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾 患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニン グを行うことも可能である。
[0088] 本方法においては、まず、被検化合物を Gpbarl遺伝子の発現が人為的に抑制さ れていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物に投与する。遺伝子改変動物 への被験化合物の投与は、経口的又は非経口的に行うことができる。
[0089] 次いで、該遺伝子改変非ヒト哺乳動物における全胆汁酸プール量を測定する。全 胆汁酸プール量を測定するには、まず測定したい組織をホモジナイズし、それらの組 織を灌流しながら、一定分量をエタノールで抽出する。次いで、これらの抽出物にお ける全胆汁酸含有量を、 Kitadaらの記載通り酵素的方法により測定することができる（ Kitada, Η·， Miyata, M., Nakamura, T.， Tozawa, A., Honma, W.， Shimada, M., Nagat a, K., Sinai, C. J., Guo, G.し， Gonzalez, F. J. , and Yamazoe, Y. 2003. Protective r ole of hydroxysteroid sulfotransferase in lithocholic acid-induced liver toxicity. J Bio 1 Chem. 278: 17838-17844)。本測定は、実施例に具体的に記載された方法でも行う ことが出来る。
[0090] 本方法は次レ、で、被検化合物を投与してレ、なレ、場合と比較して、該遺伝子改変非 ヒト哺乳動物における全胆汁酸プール量を増加させる化合物を選択する。選択され た化合物には、全胆汁酸プール量の増加する化合物が含まれ、全胆汁酸プール量 の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤として有用で あると考えられる。
[0091] 本発明は、上記のスクリーニング方法により選択された、全胆汁酸プール量の増減 に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤に関する。
[0092] 全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のため の薬剤としては、 Gpbarlタンパク質をコードする DNAを有効成分とする薬剤を挙げる こと力 S出来る。 Gpbarlタンパク質をコードする DNAは上記に記載の通りである。
[0093] また、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防 のための薬剤としては、 Gpbarlの発現又は活性を低下させる化合物を有効成分とす る薬剤を挙げることが出来る。 Gpbarlの発現又は活性を低下させる化合物としては、 結果として Gpbarlの発現又は活性を低下させるものであれば如何なるものでもよレ、。
[0094] 本発明の、 Gpbarlの発現を抑制する化合物としては、 Gpbarlをコードする DNAの 転写産物と相補的な RNA又は該転写産物を特異的に開裂するリボザィムを挙げるこ とができる。 Gpbarlをコードする DNAとしては配列番号： 1、 3又は 5に記載の塩基配 歹 IJからなる DNA、配列番号： 2、 4又は 6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコ ードする DNA、及び配列番号： 2、 4又は 6に記載のアミノ酸配列において 1又は複数 のアミノ酸が置換、欠失、付カロ、及び Z又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク 質をコードする天然由来の DNA等も含まれる。
[0095] 本発明の「Gpbarlの発現を抑制」という記載には、遺伝子の転写の抑制及びタンパ ク質への翻訳の抑制が含まれる。また、 DNAの発現の完全な停止のみならず発現の 減少も含まれる。
[0096] 本発明の「Gpbarlをコードする DNAの転写産物と相補的な RNA」の一つの態様は、 Gpbarlをコードする DNAの転写産物と相補的なアンチセンス RNAである。
[0097] アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数 の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメラーゼに よって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑 制、合成の進みつつある RNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとェキ ソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成 部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、 mRNAとのハイブリッド形成によ る核から細胞質への移行抑制、キヤッビング部位やポリ (A)付加部位とのハイブリッド 形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による 翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻 訳抑制、 mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド 鎖の伸長阻止、及び核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による 遺伝子発現抑制等である。これらは、転写、スプライシング又は翻訳の過程を阻害し て、標的遺伝子の発現を抑制する。
[0098] 本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発 現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻訳領域 に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。 しかし、コード領域若しくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配歹も使用し得る。このよう に、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む DN Aも、本発明で利用されるアンチセンス DNAに含まれる。使用されるアンチセンス DN Aは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを 含む配列が連結される。このようにして調製された DNAは、公知の方法で、所望の植 物へ形質転換できる。アンチセンス DNAの配列は、形質転換する植物が持つ内在性 遺伝子又はその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効 に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写された RNAは、標的とする遺 伝子の転写産物に対して好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の相補性を 有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、 アンチセンス DNAの長さは、少なくとも 15塩基以上であり、好ましくは 100塩基以上で あり、さらに好ましくは 500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンス DNAの長さ は 5kbよりも短ぐ好ましくは 2.5kbよりも短い。
[0099] 「Gpbarlをコードする DNAの転写産物と相補的な RNA」の他の一つの態様は、 Gpb arlをコードする DNAの転写産物と相補的な dsRNAである。 RNAiは、標的遺伝子配 歹 IJと同一若しくは類似した配列を有する二重鎖 RNA (以下 dsRNA)を細胞内に導入 すると、導入した外来遺伝子及び標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される 現象である。細胞に約 40〜数百塩基対の dsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメイン を持つダイサー (Dicer)と呼ばれる RNaselll様のヌクレアーゼが ATP存在下で、 dsRNA を 3'末端から約 21〜23塩基対ずつ切り出し、 siRNA (short interference RNA)を生じ る。この siRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（RISC : RNA_in duced silencing complex)が形成される。この複合体は siRNAと同じ配列を認識して結 合し、 RNaselll様の酵素活性によって siRNAの中央部で標的遺伝子の mRNAを切断 する。また、この経路とは別に siRNAのアンチセンス鎖が mRNAに結合して RNA依存 性 RNAポリメラーゼ (RsRP)のプライマーとして作用し、 dsRNAが合成される。この dsRN Aが再びダイサ一の基質となって、新たな siRNAを生じて作用を増幅する経路も考え られている。
[0100] 本発明の RNAは、標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンス RNA をコードしたアンチセンスコード DNAと、標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域のセン ス RNAをコードしたセンスコード DNAより発現させることができる。また、これらのアン チセンス RNA及びセンス RNAより dsRNAを作成することもできる。
[0101] 本発明の dsRNAの発現システムを、ベクター等に保持させる場合の構成としては、 同一のベクター力、らアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる場合と、異なるベクタ 一からそれぞれアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる場合がある。例えば、同 一のベクターからアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる構成としては、アンチセ ンスコード DNA及びセンスコード DNAの上流にそれぞれ ροΙΠΙ系のような短レ、 RNAを 発現し得るプロモータを連結させたアンチセンス RNA発現カセット、センス RNA発現 カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿 入することにより構成すること力 Sできる。また、異なる鎖上に対向するようにアンチセン スコード DNAとセンスコード DNAと逆向きに配置した発現システムを構成することもで きる。この構成では、アンチセンス RNAコード鎖とセンス RNAコード鎖とが対となった 一つの二本鎖 DNA (siRNAコード DNA)が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からァ ンチセンス RNA、センス RNAとを発現し得るようにプロモータを対向して備えられる。こ の場合には、センス RNA、アンチセンス RNAの下流に余分な配列が付加されることを 避けるために、それぞれの鎖（アンチセンス RNAコード鎖、センス RNAコード鎖）の 3' 末端にターミネータ一をそれぞれ備えることが好ましい。このターミネータ一は、 A (ァ デニン)塩基を 4つ以上連続させた配列等を用いることができる。また、このパリンドロ 一ムスタイルの発現システムでは、二つのプロモータの種類を異ならせることが好まし レ、。
[0102] また、異なるベクター力 アンチセンス RNA、センス RNAを発現させる構成としては、 例えば、アンチセンスコード DNA及びセンスコード DNAの上流にそれぞれ ροΙΠΙ系の ような短レ、 RNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンス RNA発現カセット、 センス RNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持さ せることにより構成すること力 Sできる。
[0103] 本発明の RNAiにおいては、 dsRNAとして siRNAが使用されたものであってもよレ、。 「 siRNA」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖 RNAを意味し、例え ば、 15〜49塩基対と、好適には 15〜35塩基対と、さらに好適には 21〜30塩基対とす ること力 Sできる。あるいは、発現される siRNAが転写され最終的な二重鎖 RNA部分の 長さが、例えば、 15〜49塩基対、好適には 15〜35塩基対、さらに好適には 21〜30塩 基対とすることができる。
[0104] RNAiに用レ、る DNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はなレ、が、少なくとも 70 %以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の 配列の相同性を有する。
[0105] dsRNAにおける RNA同士が対合した二重鎖 RNAの部分は、完全に対合しているも のに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ (一方の鎖に対応す る塩基がなレ、）等により不対合部分が含まれていてもよレ、。本発明においては、 dsRN Aにおける RNA同士が対合する二重鎖 RNA領域中に、バルジ及びミスマッチの両方 が含まれていてもよい。
[0106] 本発明の「Gpbarlの発現の抑制」は、また、リボザィムをコードする DNAを利用して 行うことも可能である。リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子のことをいう。リボザ ィムには種々の活性を有するものがあるが、中でも RNAを切断する酵素としてのリボ ザィムの研究により、 RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザィムの設計が可能 となった。リボザィムには、グループ Iイントロン型や、 RNasePに含まれる M1RNAのよう に 400ヌクレオチド以上の大きさのものもある力 ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼 ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある。
[0107] 例えば、ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15の C15の 3' 側を切断するが、活性には U14が 9位の Aと塩基対を形成することが重要とされ、 15位 の塩基は Cの他に A又は Uでも切断されることが示されている。リボザィムの基質結合 部を標的部位近傍の RNA配列と相補的になるように設計すれば、標的 RNA中の UC 、UU又は UAという配列を認識する制限酵素的な RNA切断リボザィムを作出すること が可能である。例えば、阻害標的となる本発明の Gpbarlのコード領域中には標的と なり得る部位が複数存在する。
[0108] また、ヘアピン型リボザィムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボ ザィムは、例えばタバコリングスポットウィルスのサテライト RNAのマイナス鎖に見出さ れる (J.M.Buzayan Nature 323:349, 1986)。このリボザィムも、標的特異的な RNA切断 を起こすように設計できることが示されてレ、る。
[0109] 標的を切断できるよう設計されたリボザィムは、植物細胞中で転写されるようにカリ フラワーモザイクウィルスの 35Sプロモーター等のプロモーター及び転写終結配列に 連結される。しかし、その際、転写された RNAの 5'末端や 3'末端に余分な配列が付加 されていると、リボザィムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写され たリボザィムを含む RNAからリボザィム部分だけを正確に切り出すために、リボザィム 部分の 5'側や 3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザィムを配置 させることも可能である (K.Taira et al. (1990) Protein Eng. 3:733、 A.M.Dzianottand J. J.Bujarski (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823、 C.A.Grosshansand R.T.Cech ( 1991) Nucleic Acids Res. 19:3875、 K.Taira et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:512 5)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断 できるようにして、より効果を高めることもできる (N.Yuyama et al. Biochem.Biophys.Re s.Commun. l86: 1271, 1992)0このようなリボザィムを用いて本発明で標的となる遺伝子 の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
[0110] 本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物、 Gpbarlタンパク質をコードする DN A又は Gpbarlの発現又は活性を低下させる化合物をヒトゃ他の動物の医薬として使 用する場合には、これらの化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤 学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣 を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、ある いは水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液又は懸濁液剤の 注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体若しくは媒 体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安 定剤、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認 められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化するこ とが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が 得られるようにするものである。
[0111] 錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーン スターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦 形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシゥ ムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、ァカモ ノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合 には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のた めの無菌組成物は注射用蒸留水のようなべヒクルを用いて通常の製剤実施に従って 処方すること力できる。
[0112] 注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む 等張液、例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙 げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコ ール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤 、例えばポリソルベート 80 (TM)、 HCO-50と併用してもよい。
[0113] 油性液としてはゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸 ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロ力イン、安定剤、例えばべンジノレアル コール、フヱノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当 なアンプノレに充填させる。
[0114] 患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内 的、経気管支的、筋内的、経皮的又は経口的に当業者に公知の方法により行い得る 。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適 当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物が DNAによりコードさ れ得るものであれば、該 DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行う ことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状等により変動する 力 当業者であれば適宜選択することが可能である。
[0115] 化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体 重 60kgとして)においては、 1日あたり約 0.1から 100mg、好ましくは約 1.0から 50mg、よ り好ましくは約 1.0から 20mgであると考えられる。
[0116] 非経口的に投与する場合は、その 1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与 方法によっても異なる力 例えば注射剤の形では通常成人（体重 60kgとして）におい ては、通常、 1日当り約 0.01力、ら 30mg、好ましくは約 0.1から 20mg、より好ましくは約 0.1 から 10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物 の場合も、体重 60kg当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投 与すること力 Sできる。
[0117] 本発明は、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法 に関する。
[0118] 該方法としては、 Gpbarl遺伝子の発現量を測定する工程を含む、全胆汁酸プール 量の減少又は増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法を挙げることが出来 る。 Gpbarl遺伝子の発現量の測定は上記に記載の方法で行うことが可能である。
[0119] Gpbarl遺伝子の発現量が増減した場合には、併せて全胆汁酸プール量も増減す るものと考えられ、全胆汁酸プール量の増減に基づく疾患であるかどうかを検査する ことが可能である。
[0120] さらに該方法には、 Gpbarl遺伝子領域における変異を検出する工程を含む、全胆 汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法を挙げる ことが出来る。
[0121] 本発明において、 Gpbarl遺伝子領域とは、 Gpbarlの遺伝子及び該遺伝子の発現 に影響する領域を意味する。該遺伝子の発現に影響する領域としては、特に制限は ないが、例えば、プロモーター領域等が例示できる。
[0122] また、本発明における変異は、全胆汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又は 脂質代謝性疾患に関与する変異であれば、その種類、その数等に制限はない。上 記遺伝子の発現量を変化させる、 mRNAの安定性等の性質を変化させる、あるいは 上記遺伝子によってコードされるタンパク質の有する活性を変化させるような変異で あることが多レ、が、特に制限されない。上記変異の種類としては、例えば、欠失、置 換又は挿入変異等が挙げられる。上記の変異には、該タンパク質のアミノ酸配列に おいてアミノ酸の置換が起こる変異、及びアミノ酸の置換は起こらないが、塩基配列 における塩基の置換が起こる変異が含まれる。
[0123] 以下、 Gpbarl遺伝子領域に生じた変異を検出する工程を含む検查方法の好まし い態様を記載するが、本発明の方法はそれらの方法に限定されるものではない。
[0124] 上記検查方法の好ましレ、態様にぉレ、ては、まず、被検者から DNA試料を調製する 。 DNA試料は、例えば被検者の血液、皮膚、 口腔粘膜、毛髪、手術やバイオプシー 等により採取あるいは切除した組織又は細胞から抽出した。染色体 DNA、あるいは R NAを基に調製することができる。
[0125] 本方法においては、次いで、 Gpbarlの遺伝子領域を含む DNAを単離する。該 DNA の単離は、例えば、 Gpbarlの遺伝子領域を含む DNAにハイブリダィズするプライマ 一を用いて、染色体 DNA、あるいは RNA由来 cDNAを铸型とした PCR等によって行う こと力 Sできる。
[0126] 本方法においては、次いで、単離した DNAの塩基配列を決定する。
[0127] 本方法においては、次いで、決定した DNAの塩基配列を対照と比較する。本発明 において、対照とは、正常な（より高頻度な、あるいは、野生型の） Gpbarlの遺伝子領 域を含む DNAを言う。一般に健常人の Gpbarlの遺伝子領域を含む DNAの配列は正 常であるものと考えられることから、上記「対照と比較する」とは、通常、健常人の Gpba rlの遺伝子領域を含む DNAの配列と比較することを意味する。
[0128] 本発明における変異の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず 、被検者から DNA試料を調製する。次いで、調製した DNA試料を制限酵素により切 断する。次いで、 DNA断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出された DNA 断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者 力、ら DNA試料を調製する。次いで、 Gpbarlの遺伝子領域を含む DNAを増幅する。さ らに、増幅した DNAを制限酵素により切断する。次いで、 DNA断片をその大きさに応 じて分離する。次いで、検出された DNA断片の大きさを、対照と比較する。 [0129] このような方法としては、例えば、制限酵素断片長変異（Restriction Fragment Leng th Polymorphism/RFLP)を利用した方法や PCR-RFLP法等が挙げられる。具体的 には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によつ て生じる DNA断片内に塩基揷入又は欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断 片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分を PCR法によって増幅し 、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンド の移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体 DNAをこれらの制限酵 素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブ DNAを用いてサザンブロッテ イングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、 それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノム DNA以外 にも被検者から調製した RNAを逆転写酵素で cDNAにし、これをそのまま制限酵素で 切断した後、サザンブロッテイングを行うことも可能である。また、この cDNAを錡型とし て PCRで Gpbarlの遺伝子領域を含む DNAを増幅し、それを制限酵素で切断した後、 移動度の差を調べることも可能である。
[0130] さらに別の方法においては、まず、被検者から DNA試料を調製する。次いで、 Gpba rl遺伝子領域を含む DNAを増幅する。さらに、増幅した DNAを一本鎖 DNAに解離さ せる。次いで、解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖 DNAのゲル上での移動度を対照と比較する。
[0131] 該方法としては、例えば PCR-SSCP(single- strand conformation polymorphism,一 本鎖局次構造変異)法 (Cloning and polymerase chain reaction-single-strand confer mation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomi cs. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、 Detection of p53 gene mutations in human brain tu mors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain react ion products. Oncogene. 1991 Aug 1 ; 6(8): 1313-1318.、 Multiple fluorescence-base d PCR-SSCP analysis with postlabeling.、 PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275 -282.)が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少な くて済む等の利点を有するため、特に多数の DNA試料をスクリーニングするのに好適 である。その原理は次の通りである。二本鎖 DNA断片を一本鎖に解離すると、各鎖は その塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離した DNA鎖を、変性 剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差 に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖 DNAが異なる位置に移動する。一塩基の置換 によってもこの一本鎖 DNAの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に おいて異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することにより DNA断 片に点突然変異や欠失、あるいは揷入等による変異の存在を検出することができる。
[0132] 具体的には、まず、 Gpbarlの遺伝子領域を含む DNAを PCR法等によって増幅する 。増幅される範囲としては、通常 200〜400bp程度の長さが好ましい。 PCRは、当業者 においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。 PCRの際に、 32P等のアイソ トープ、蛍光色素、又はピオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、 増幅 DNA産物を標識することができる。あるいは PCR反応液に32 P等のアイソトープ、 蛍光色素、又はピオチン等によって標識された基質塩基を加えて PCRを行うことによ り、増幅 DNA産物を標識することも可能である。さらに、 PCR反応後にタレノウ酵素等 を用いて、 32P等のアイソトープ、蛍光色素、又はビォチン等によって標識された基質 塩基を、増幅 DNA断片に付加することによつても標識を行うことができる。こうして得ら れた標識 DNA断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素等の変性剤を含まない ポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量 (5から 10%程度）のグリセロールを添加することにより、 DNA断片の分離の条件を改 善すること力 Sできる。また、泳動条件は各 DNA断片の性質により変動するが、通常、 室温（20から 25°C)で行い、好ましレ、分離が得られなレ、ときには 4から 30°Cまでの温度 で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、 DNA断片の移動度を、 X 線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナ一等で検出し 、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから 切り出し、 PCRによって再度増幅し、それを直接シークェンシングすることにより、変 異の存在を確認することができる。また、標識した DNAを使わない場合においても、 電気泳動後のゲルをェチジゥムブロマイドや銀染色法等によって染色することによつ て、バンドを検出することができる。
[0133] さらに別の方法においては、まず、被検者から DNA試料を調製する。次いで、 Gpba rlの遺伝子領域を含む DNAを増幅する。さらに、増幅した DNAを、 DNA変性剤の濃 度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離した DNAのゲル上での移動度を 対照と比較する。
[0134] このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（denaturant gradient gel ele ctrophoresis : DGGE法）等を例示することができる。 DGGE法は、変性剤の濃度勾配 のあるポリアクリルアミドゲル中で、 DNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定 性の違いによって DNA断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定な DNA断 片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺の DNA配列 はその不安定さのために、部分的に 1本鎖へと解離する。この部分的に解離した DN A断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖 DNAの移動度と 差がつくことから、両者を分離することができる。具体的には、 Gpbarlの遺伝子領域 を含む DNAを本発明のプライマー等を用いた PCR法等によって増幅し、これを尿素 等の変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなつているポリアクリルアミドゲル 中で電気泳動し、対照と比較する。変異が存在する DNA断片の場合、より低い変性 剤濃度位置で DNA断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動 度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。
[0135] さらに別の方法においては、まず、被検者から調製した Gpbarlの遺伝子領域を含 む DNA、及び、該 DNAにハイブリダィズするヌクレオチドプローブが固定された基板、 を提供する。
[0136] 本発明において「基板」とは、ヌクレオチドプローブを固定することが可能な板状の 材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド及びポリヌク レオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドプローブを固定することができれ ば特に制限はないが、一般に DNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いること ができる。一般に DNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチド で構成されている。通常これらの DNAは非透過性 (non_ porous)の基板の表層にプリ ントされる。基板の表層は、一般的にはガラスである力 透過性 (porous)の膜、例えば ニトロセルロースメンブレムを使用することができる。
[0137] 本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、 Aifymetrix社開発による オリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにお いて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ (in situ)で合成される。例えば、 photolith ographicの技術（Affymetrix社）、及び化学物質を固定させるためのインクジェット (Ros etta Inpharaiatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知 られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
[0138] 基板に固定するヌクレオチドプローブは、 Gpbarlの遺伝子領域の変異を検出する ことができるものであれば、特に制限されなレ、。すなわち該プローブは、例えば、 Gpb arlの遺伝子領域を含む DNAにハイブリダィズするようなプローブである。特異的なハ イブリダィズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、 Gpbarlの遺伝子領域を含む DNAに対し、完全に相補的である必要はない。本発明において基板に結合させるヌ クレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常 10〜100ベ ースであり、好ましくは 10〜50ベースであり、さらに好ましくは 15〜25ベースである。
[0139] 本方法においては、次いで、該 DNAと該基板を接触させる。この過程により、上記 ヌクレオチドプローブに対し、 DNAをハイブリダィズさせる。ハイブリダィゼーシヨンの 反応液及び反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因に より変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
[0140] 本方法においては、次いで、該 DNAと該基板に固定されたヌクレオチドプローブと のハイブリダィズの強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナ 一等によって読み取ることによって行うことができる。尚、 DNAアレイにおいては、一 般的にスライドガラスに固定した DNAをプローブといい、一方溶液中のラベルした DN Aをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書におい てヌクレオチドプローブと記載する。本方法においては、さらに、検出したハイブリダ ィズの強度を対照と比較する。
[0141] このような方法としては、例えば、 DNAアレイ法等が挙げられる。
[0142] 上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリ ゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide/ASO)ハイブリダィゼーシヨン法が利 用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、 これと DNAでハイブリダィゼーシヨンを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド 形成の効率が低下する。それをサザンプロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッド のギャップにインターカレーシヨンすることにより消光する性質を利用した方法等によ り検出すること力 Sできる。
[0143] また、本発明においては、 TaqMan PCR法、 Acyclo Prime法、及び MALDI-TOF/M S法等も使用することができる。また PCRに依存しない塩基種の決定法として Invader 法や RCA法も使用することができる。以下にこれらの方法について簡単に述べる。こ こに述べた方法は、いずれも本発明における変異部位の塩基種の決定に応用でき る。
[TaqMan PCR法]
[0144] TaqMan PCR法の原理は次のとおりである。 TaqMan PCR法は、アレルを含む領域 を増幅することができるプライマーセットと、 TaqManプローブを利用した解析方法で ある。 TaqManプローブは、このプライマーセットによって増幅されるアレルを含む領域 にハイブリダィズするように設計される。
[0145] TaqManプローブの Tmに近レ、条件で標的塩基配列にハイブリダィズさせれば、 1塩 基の相違によって TaqManプローブのハイブリダィズ効率は著しく低下する。 TaqMan プローブの存在下で PCR法を行うと、プライマーからの伸長反応は、いずれハイブリ ダイズした TaqManプローブに到達する。このとき DNAポリメラーゼの 5'_3'ェキソヌクレ ァーゼ活性によって、 TaqManプローブはその 5'末端から分解される。 TaqManプロ一 ブをレポーター色素とクェンチヤ一で標識しておけば、 TaqManプローブの分解を、 蛍光シグナルの変化として追跡することができる。つまり、 TaqManプローブの分解が 起きれば、レポーター色素が遊離してクェンチヤ一との距離が離れることによって蛍 光シグナルが生成する。 1塩基の相違のために TaqManプローブのハイブリダィズが 低下すれば TaqManプローブの分解が進まず蛍光シグナルは生成されない。
[0146] 変異に対応する TaqManプローブをデザインし、更に各プローブの分解によって異 なるシグナルが生成されるようにすれば、同時に塩基種の判定を行うこともできる。例 えば、レポーター色素として、あるアレルのァレノレ Aの TaqManプローブに 6-carboxy-f luorescein(FAM)を、アレル Bのプローブに VICを用いる。プローブが分解されない状 態では、クェンチヤ一によつてレポーター色素の蛍光シグナル生成は抑制されている 。各プローブが対応するアレルにハイブリダィズすれば、ハイブリダィズに応じた蛍光 シグナルが観察される。すなわち、 FAM又は VICのいずれかのシグナルが他方よりも 強い場合には、アレル A又はアレル Bのホモであることが判明する。他方、アレルをへ テロで有する場合には、両者のシグナルがほぼ同じレベルで検出されることになる。
TaqMan PCR法の利用によって、ゲル上での分離のような時間の力、かる工程無しで、 ゲノムを解析対象として PCRと塩基種の決定を同時に行うことができる。そのため、 Ta qMan PCR法は、多くの被検者についての塩基種を決定できる方法として有用である
[0147] [Acyclo Prime法]
PCR法を利用した塩基種を決定する方法として、 Acyclo Prime法も実用化されてい る。 Acyclo Prime法では、ゲノム増幅用のプライマー 1組と、 SNPs検出用の 1つのプラ イマ一を用いる。まず、ゲノムの変異部位を含む領域を PCRで増幅する。この工程は 、通常のゲノム PCRと同じである。次に、得られた PCR産物に対して、 SNPs検出用の プライマーをァニールさせ、伸長反応を行う。 SNPs検出用のプライマーは、検出対象 となっている変異部位に隣接する領域にァニールするようにデザインされている。
[0148] このとき、伸長反応のためのヌクレオチド基質として、蛍光偏光色素でラベルし、か つ 3'-OHをブロックしたヌクレオチド誘導体（ターミネータ一）を用いる。その結果、変 異部位に相当する位置の塩基に相補的な塩基力 S1塩基だけ取りこまれて伸長反応 が停止する。ヌクレオチド誘導体のプライマーへの取りこみは、分子量の増大による 蛍光偏光 (Fluorescence polarization;FP)の増加によって検出することができる。蛍光 偏光色素に波長の異なる 2種類のラベルを用いれば、特定の SNPsが 2種類の塩基の うちのいずれであるのかを特定することができる。蛍光偏光のレベルは定量すること ができるので、 1度の解析でアレルがホモかへテロかを判定することもできる。
[0149] [MALDト TOF/MS法]
PCR産物を MALDI-TOF/MSで解析することによって塩基種の決定を行うこともでき る。 MALD卜 TOF/MSは、分子量をきわめて正確に知ることができるため、タンパク質 のアミノ酸配列や、 DNAの塩基配列のわずかな相違を明瞭に識別することができる 解析手法として様々な分野で利用されている。 MALDI-TOF/MSによる塩基種の決 定のためには、まず解析対象であるアレルを含む領域を PCRで増幅する。次いで増 幅産物を単離して MALDI-TOF/MSによってその分子量を測定する。アレルの塩基 配列は予めわかっているので、分子量に基づいて増幅産物の塩基配列は一義的に 決定される。
[0150] MALDKTOF/MSを利用した塩基種の決定には、 PCR産物の分離工程等が必要と なる。しかし標識プライマーや標識プローブを使わないで、正確な塩基種の決定が 期待できる。また複数の場所の変異の同時検出にも応用することができる。
[0151] [lis型制限酵素を利用した SNPs特異的な標識方法]
PCR法を利用した更に高速な塩基種の決定が可能な方法も報告されている。例え ば、 lis型制限酵素を利用して変異部位の塩基種の決定が行われている。この方法に おいては、 PCRにあたり、 lis型制限酵素の認識配列を有するプライマーが用いられる 。遺伝子組み換えに利用される一般的な制限酵素 (Π型）は、特定の塩基配列を認識 して、その塩基配列中の特定部位を切断する。これに対して lis型の制限酵素は、特 定の塩基配列を認識して、認識塩基配列から離れた部位を切断する。酵素によって 、認識配列と切断個所の間の塩基数は決まっている。従って、この塩基数の分だけ 離れた位置に lis型制限酵素の認識配列を含むプライマーがァニールするようにすれ ば、 lis型制限酵素によってちようど変異部位で増幅産物を切断することができる。
[0152] lis型制限酵素で切断された増幅産物の末端には、 SNPsの塩基を含む付着末端 (c onhesive end)が形成される。ここで、増幅産物の付着末端に対応する塩基配列から なるアダプターをライゲーシヨンする。アダプタ一は、変異に対応する塩基を含む異 なる塩基配列からなり、それぞれ異なる蛍光色素で標識しておくことができる。最終 的に、増幅産物は変異部位の塩基に対応する蛍光色素で標識される。
[0153] 前記 lis型制限酵素認識配列を含むプライマーに、捕捉プライマー (capture primer) を組み合せて PCR法を行えば、増幅産物は蛍光標識されるとともに、捕捉プライマー を利用して固相化することができる。例えばピオチン標識プライマーを捕捉プライマ 一として用いれば、増幅産物はアビジン結合ビーズに捕捉することができる。こうして 捕捉された増幅産物の蛍光色素を追跡することにより、塩基種を決定することができ る。 [0154] [磁気蛍光ビーズを使った変異部位における塩基種の決定]
複数のアレルを単一の反応系で並行して解析することができる技術も公知である。 複数のアレルを並行して解析することは、多重化と呼ばれている。一般に蛍光シグナ ルを利用したタイピング方法では、多重化のために異なる蛍光波長を有する蛍光成 分が必要である。し力、し実際の解析に利用することができる蛍光成分は、それほど多 くない。これに対して、樹脂等に複数種の蛍光成分を混合した場合には、限られた種 類の蛍光成分であっても、相互に識別可能な多様な蛍光シグナルを得ることができ る。更に、樹脂中に磁気で吸着される成分を加えれば蛍光を発するとともに、磁気に よって分離可能なビーズとすることができる。このような磁気蛍光ビーズを利用した、 多重化変異タイピングが考え出された (バイオサイエンスとバイオインダストリ一， Vol.6 0 No.12, 82ト 824)。
[0155] 磁気蛍光ビーズを利用した多重化変異タイピングにおいては、各アレルの変異部 位に相補的な塩基を末端に有するプローブが磁気蛍光ビーズに固定化される。各ァ レルにそれぞれ固有の蛍光シグナルを有する磁気蛍光ビーズが対応するように、両 者は組み合せられる。一方、磁気蛍光ビーズに固定されたプローブが相補配列にハ イブリダィズしたときに、当該アレル上で隣接する領域に相補的な塩基配列を有する 蛍光標識オリゴ DNAを調製する。
[0156] アレルを含む領域を非対称 PCRによって増幅し、上記の磁気蛍光ビーズ固定化プ ローブと蛍光標識オリゴ DNAをハイブリダィズさせ、更に両者をライゲーシヨンする。 磁気蛍光ビーズ固定化プローブの末端が、変異部位の塩基に相補的な塩基配列で あった場合には効率的にライゲーシヨンされる。逆にもしも変異のために末端の塩基 が異なれば、両者のライゲーシヨン効率は低下する。その結果、各磁気蛍光ビーズに は、試料が当該磁気蛍光ビーズに相補的な塩基種であった場合に限り、蛍光標識 オリゴ DNAが結合する。
[0157] 磁気によって磁気蛍光ビーズを回収し、更に各磁気蛍光ビーズ上の蛍光標識オリ ゴ DNAの存在を検出することにより、塩基種が決定される。磁気蛍光ビーズは、フロ 一サイトメーターでビーズ毎に蛍光シグナルを解析できるので、多種類の磁気蛍光ビ ーズが混合されていてもシグナルの分離は容易である。つまり、多種類の変異部位 につレ、て、単一の反応容器で並行して解析する「多重化」が達成される。
[0158] [Invader法]
PCR法に依存しないジエノタイピングのための方法も実用化されている。例えば、 In vader法では、アレルプローブ、インベーダープローブ、及び FRETプローブの 3種類 のオリゴヌクレオチドと、 cleavaseと呼ばれる特殊なヌクレアーゼのみで、塩基種の決 定を実現している。これらのプローブのうち標識が必要なのは FRETプローブのみで ある。
[0159] アレルプローブは、検出すべきアレルに隣接する領域にハイブリダィズするようにデ ザインされる。アレルプローブの 5'側には、ハイブリダィズに無関係な塩基配列からな るフラップが連結されてレ、る。アレルプローブは変異部位の 3'側にハイブリダィズし、 変異部位の上でフラップに連結する構造を有する。
[0160] 一方インベーダープローブは、変異部位の 5'側にハイブリダィズする塩基配列から なっている。インベーダープローブの塩基配列は、ハイブリダィズによって 3'末端が 変異部位に相当するようにデザインされている。インベーダープローブにおける変異 部位に相当する位置の塩基は任意で良レ、。つまり、変異部位を挟んでインベーダー プローブとアレルプローブとが隣接してハイブリダィズするように両者の塩基配列は デザインされている。
[0161] 変異部位がアレルプローブの塩基配列に相補的な塩基であった場合には、インべ ーダープローブとアレルプローブの両者がアレルにハイブリダィズすると、アレルプロ ーブの変異部位に相当する塩基にインベーダープローブが侵入 (invasion)した構造 が形成される。 cleavaseは、このようにして形成された侵入構造を形成したオリゴヌタレ ォチドのうち、侵入された側の鎖を切断する。切断は侵入構造の上で起きるので、結 果としてアレルプローブのフラップが切り離されることになる。一方、もしも変異部位の 塩基がアレルプローブの塩基に相補的でなかった場合には、変異部位におけるイン ベーダープローブとアレルプローブの競合は無ぐ侵入構造は形成されない。したが つて cleavaseによるフラップの切断が起こらなレ、。
[0162] FRETプローブは、こうして切り離されたフラップを検出するためのプローブである。
FRETプローブは 5'末端側に自己相補配列を有し、 3'末端側に 1本鎖部分が配置さ れたヘアピンループを構成している。 FRETプローブの 3'末端側に配置された 1本鎖 部分は、フラップに相補的な塩基配列からなっていて、ここにフラップがハイブリダィ ズすること力 Sできる。フラップ力 SFRETプローブにハイブリダィズすると、 FRETプローブ の自己相補配列の 5'末端部分にフラップの 3'末端が侵入した構造が形成されるよう に両者の塩基配列がデザインされている。 cleavaseは侵入構造を認識して切断する。
FRETプローブの cleavaseによって切断される部分を挟んで、 TaqMan PCRと同様のレ ポーター色素とクェンチヤ一で標識しておけば、 FRETプローブの切断を蛍光シグナ ルの変化として検知することができる。
[0163] 尚、理論的には、フラップは切断されない状態でも FRETプローブにハイブリダィズ するはずである。し力 実際には、切断されたフラップとアレルプローブの状態で存 在しているフラップとでは、 FRETに対する結合効率に大きな差が有る。そのため、 FR ETプローブを利用して、切断されたフラップを特異的に検出することは可能である。
[0164] Invader法に基づいて塩基種を決定するためには、アレル Aとアレル Bのそれぞれ に相補的な塩基配列を含む、 2種類のアレルプローブを用意すれば良い。このとき 両者のフラップの塩基配列は異なる塩基配列とする。フラップを検出するための FRE Tプローブも 2種類を用意し、それぞれのレポーター色素を識別可能なものとしてお けば、 TacMan PCR法と同様の考え方によって、塩基種を決定することができる。
[0165] Invader法の利点は、標識の必要尚リゴヌクレオチドが FRETプローブのみであること である。 FRETプローブは検出対象の塩基配列とは無関係に、同一のオリゴヌクレオ チドを利用することができる。従って、大量生産が可能である。一方アレルプローブと インベーダープローブは標識する必要が無いので、結局、ジエノタイピングのための 試薬を安価に製造することができる。
[0166] [RCA法]
PCR法に依存しない塩基種の決定方法として、 RCA法を挙げることができる。鎖置 換作用を有する DNAポリメラーゼ力 環状の 1本鎖 DNAを铸型として、長い相補鎖を 合成する反応に基づく DNAの増幅方法が、 Rolling Circle Amplification(RCA)法であ る (Lizardri PM et al., Nature Genetics 19， 225, 1998)。 RCA法においては、環状 DNA にァニールして相補鎖合成を開始するプライマーと、このプライマーによって生成す る長い相補鎖にァニールする第 2のプライマーを利用して、増幅反応を構成している
[0167] RCA法には、鎖置換作用を有する DNAポリメラーゼが利用されている。そのため、 相補鎖合成によって 2本鎖となった部分は、より 5'側にァニールした別のプライマー から開始した相補鎖合成反応によって置換される。例えば、環状 DNAを錡型とする 相補鎖合成反応は、 1周分では終了しない。先に合成した相補鎖を置換しながら相 補鎖合成は継続し、長レ、 1本鎖 DNAが生成される。一方、環状 DNAを铸型として生 成した長レ、 1本鎖 DNAには、第 2のプライマーがァニールして相補鎖合成が開始す る。 RCA法において生成される 1本鎖 DNAは、環状の DNAを铸型としていることから、 その塩基配列は同じ塩基配列の繰り返しである。従って、長い 1本鎖の連続的な生 成は、第 2のプライマーの連続的なァニールをもたらす。その結果、変性工程を経る ことなく、プライマーがァニールすることができる 1本鎖部分が連続的に生成される。 こうして、 DNAの増幅が達成される。
[0168] RCA法に必要な環状 1本鎖 DNAが変異部位の塩基種に応じて生成されれば、 RC A法を利用して塩基種の決定をすることができる。そのために、直鎖状で 1本鎖のパド ロックプローブが利用される。パドロックプローブは、 5'末端と 3'末端に検出すべき変 異部位の両側に相補的な塩基配列を有している。これらの塩基配列は、バックボー ンと呼ばれる特殊な塩基配列からなる部分で連結されている。変異部位がパドロック プローブの末端に相補的な塩基配列であれば、アレルにハイブリダィズしたパドロッ クプローブの末端を DNAリガーゼによってライゲーシヨンすることができる。その結果 、直鎖状のパドロックプローブが環状化され、 RCA法の反応がトリガーされる。 DNAリ ガーゼの反応は、ライゲーシヨンすべき末端部分が完全に相補的でない場合には反 応効率が著しく低下する。従って、ライゲーシヨンの有無を RCA法で確認することによ つて、変異部位の塩基種の決定が可能である。
[0169] RCA法は、 DNAを増幅することはできる力 そのままではシグナルを生成しなレ、。ま た増幅の有無のみを指標とするのでは、アレル毎に反応を行わなければ、通常、塩 基種を決定することができなレ、。これらの点を塩基種の決定のために改良した方法が 公知である。例えば、モレキュラービーコンを利用して、 RCA法に基づいて 1チューブ で延期種の決定を行うことができる。モレキュラービーコンは、 TaqMan法と同様に、蛍 光色素とクェンチヤ一を利用したシグナル生成用プローブである。モレキュラービー コンの 5'末端と 3'末端は相補的な塩基配列で構成されており、単独ではヘアピン構 造を形成する。両端付近を蛍光色素とクェンチヤ一で標識しておけば、ヘアピン構 造を形成している状態では蛍光シグナルが検出できなレ、。モレキュラービーコンの一 部を、 RCA法の増幅産物に相補的な塩基配列としておけば、モレキュラービーコンは RCA法の増幅産物にハイブリダィズする。ハイブリダィズによってヘアピン構造が解 消されるため、蛍光シグナルが生成される。
[0170] モレキュラービーコンの利点は、パドロックプローブのバックボーン部分の塩基配列 を利用することによって、検出対象とは無関係にモレキュラービーコンの塩基配列を 共通にできる点である。アレル毎にバックボーンの塩基配列を変え、蛍光波長が異な る 2種類のモレキュラービーコンを組み合せれば、 1チューブで塩基種の決定が可能 である。蛍光標識プローブの合成コストは高いので、測定対象に関わらず共通のプロ ーブを利用できることは、経済的なメリットである。
[0171] これらの方法はいずれも多量のサンプノレを高速にジエノタイピングするために開発 された方法である。 MALDI-TOF/MSを除けば、通常、いずれの方法にも何らかの形 で標識プローブ等を用意する必要がある。これに対して、標識プローブ等に頼らない 塩基種決定法も古くから行われている。このような方法の一つとして、例えば、制限酵 素断片長変異（Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP)を利用した方法 や PCR-RFLP法等が挙げられる。
[0172] 本方法によって Gpbarl遺伝子の変異が確認された場合には、併せて全胆汁酸プ 一ル量も減少するものと考えられ、全胆汁酸プール量の減少に基づく疾患であると 判定することが可能である。また、変異の位置によっては、全胆汁酸プール量が増加 する場合があるものと考えられ、その場合には全胆汁酸プール量の増加に基づく疾 患であると判定することが可能である。
[0173] 本発明は、全胆汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の 検査薬に関する。
[0174] 該検查薬としては、 Gpbarl遺伝子領域にハイブリダィズし、少なくとも 15ヌクレオチ ドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、全胆汁酸プール量の減少又は増加に 伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査薬を挙げることが出来る。
[0175] 本発明のオリゴヌクレオチドには、ポリヌクレオチドが含まれる。本発明のオリゴヌク レオチドは、本発明のタンパク質をコードする DNAの検出や増幅に用いるプローブや プライマー、該 DNAの発現を検出するためのプローブやプライマー、本発明のタンパ ク質の発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体 (例えば、アンチセ ンスオリゴヌクレオチドゃリボザィム又はこれらをコードする DNA等）として使用するこ とができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、 DNAアレイの基板の形態で使用す ること力 Sできる。
[0176] 該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常 15bp〜100bp
であり、好ましくは 15bp〜30bpである。プライマーは、本発明の DNA又はその相補鎖 の少なくとも一部を増幅し得るものであれば、特に制限されなレ、。また、プライマーと して用いる場合、 3'側の領域は相補的とし、 5'側には制限酵素認識配列やタグ等を 付カロすること力 Sできる。
[0177] また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発 明の DNA又はその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダィズするものであれ ば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよぐ通常 少なくとも 15bp以上の鎖長を有する。
[0178] 本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いるこ とが好ましい。標識する方法としては、 T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌ クレオチドの 5'端を32 P等でリン酸化することにより標識する方法及びタレノウ酵素等の DNAポリメラーゼを用レ、、ランダムへキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして3 2P等のアイソトープ、蛍光色素又はピオチン等によって標識された基質塩基を取り込 ませる方法 (ランダムプライム法等）を例示することができる。
[0179] 本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製 すること力 Sできる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖 DNA断片 として作製することもできる。
[0180] また、該検查薬としては、 Gpbarlに結合する抗体を含む、全胆汁酸プール量の減 少又は増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査薬を挙げることが出来る。
[0181] 本発明の抗体は上記の Gpbarlを認識する限り特に限定されないが、特異的に Gpb arlを認識する抗体であることが好ましい。
[0182] 該タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限 はないが、例えばモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の両方を利用すること ができる。本発明の該タンパク質を認識する抗体は、既に公知の抗体を用いることが 可能であり、また、該タンパク質を抗原とし、当業者に公知の方法により抗体を作製し て用いることも可能である。
[0183] 具体的には、例えば、以下のようにして作製することができる。
[0184] 該タンパク質あるいは GSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発 現させたリコンビナントタンパク質又はその部分ペプチドをゥサギ等の小動物に免疫 し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEィ オン交換クロマトグラフィー、該該タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたァフィ 二ティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれ ば、例えば、該該タンパク質又はその部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行 レ、、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエ ローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた 融合細胞（ハイプリドーマ）の中から、該タンパク質に結合する抗体を産生するクロー ンを選択する。次いで、得られたハイプリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスよ り腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、 プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、該該タンパク質や合成ぺプ チドをカップリングしたァフィ二ティーカラム等により精製することで、調製することが可 能である。
[0185] また、ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。
該タンパク質若しくはその断片を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に したがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と 融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞 (ハイブリド 一マ）をスクリーニングする。抗原の調製は公知の方法、例えばバキュロウィルスを用 いた方法 (W098/46777等）等に準じて行うことができる。ハイプリドーマの作製は、た とえば、ミルスティンらの方法（Kohler. G. and Milstein, C" Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46)等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミ ン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。その後、ハイプリ ドーマの mRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域 (V領域）の cDNAを合成し 、得られた cDNAの配列を公知の方法により解読すればょレ、。
[0186] 該タンパク質を認識する抗体は、該タンパク質と結合する限り特に制限はなぐマウ ス抗体、ラット抗体、ゥサギ抗体、ヒッジ抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。 又、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝 子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric)抗体、ヒトイ匕（Humanized)抗体等も使用 できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体 は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の 重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体等であり、マウス抗体の可変領域をコードする D NAをヒト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターに組み込ん で宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
[0187] ヒト化抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえば マウス 体のネ目ネ ί十生決定領域 (CDR; complementarity determining region)をヒト 体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知ら れている。具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framewor k region ; FR)を連結するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラップする部 分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドから PCR法により合成する。得ら れた DNAをヒト抗体定常領域をコードする DNAと連結し、次いで発現ベクターに組み 込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号 E P 239400、国際特許出願公開番号 WO 96/02576参照）。 CDRを介して連結されるヒト 抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される 。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成する ように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al.， Cancer Res. (1993) 53, 85ト 856)。 [0188] また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球を in vitroで所望の 抗原又は所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、 例えば U266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもでき る（特公平 1-59878参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトラン スジエニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができ る（国際特許出願公開番号 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/2 5585, WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パ ンユングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域 を一本鎖抗体（scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、 抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解 析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定すること ができる。抗原に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列を有する適 当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる
[0189] 本発明に使用する抗体は、ポリエチレングリコール (PEG)、放射性物質、トキシン等 の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよレ、。このようなコンジュゲート抗体は、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。尚、抗体の修飾 方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれら のコンジュゲート抗体も包含される。
[0190] 上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド又は抗体以外に、例 えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タン パク質安定剤（BSAやゼラチン等）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。 実施例
[0191] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
[0192] 以下の実施例における全ての値は、平均値土標準誤差 (SE)として表す。これらの 値は、ポストホック Bonferroniテストと連関した ANOVA (StatView Windows (登録商標） 版、 ver5.0)により解析されたものである。
[0193] 〔実施例 1〕マウス Gpbarl mRNAの組織分布の解明 マウス Gpbarl mRNAの組織分布を明らかにするため、様々なマウス組織について、 定量的 RT-PCR解析を行った。
[0194] 6〜10週齢のC57BL/6Nマゥスから各組織(脳、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、胃、 空腸、回腸、結腸、骨格筋、褐色脂肪組織及び白色脂肪組織)を摘出し、そこから全 RNAを ISOGEN (二ツボンジーン社、東京）で抽出した。各組織由来の全 RNAは、分 光光度計で定量後、その一定量を逆転写酵素と反応させ、得られた cDNAを定量的 RT-PCRによる解析に供した。定量的 RT- PCRによる解析は、 PRISM 7900HT配列検 出装置（Applied Biosystems社、米国）を用い、 TaqMan PCR法により行った。マウス G pbarl発現の検出のためのプライマー及びプローブは、 Assay on demandセット（アツ セィ ID : Mm00558112_sl)を Applied Biosystems社から購入して用いた。
[0195] 定量的 RT-PCRの結果、マウス Gpbarl mRNAは、雄マウスの回腸及び結腸、並び に雌マウスの結腸で強く検出され、肺、脾臓、腎、胃、空腸及び白色脂肪組織にお いても、性別を問わず中程度に検出された（図 1A、 1B)。尚、雌性マウスの回腸でも、 中程度に検出された。このことより、 Gpbarl mRNAは、小腸及び大腸で強く発現する ことが判明し、 Gpbarlが胆汁酸と共に腸で主要な役割を担っていることが示唆された 。尚、ヒト GPBAR1 mRNAについても小腸及び大腸で発現していることがわかっている ため、ヒトとマウスの両者において共通の役割を担っているものと思われる（Maruyama , Τ·, Miyamoto, Y.， Nakamura, Τ·, ι amai, Υ·, Okada, H.， Sugiyama, E., Nakamura, T., Itadani, H., and Tanaka, K. 2002. Identification of membrane-type receptor for bile acids (M— BAR). Biochem. Biophys. Res. Commun. 298: 714—719)。但し、ヒト GP BAR1 mRNAは肝臓で検出されるのに対し、マウス Gpbarl mRNAの発現量は他の組 織と比べて肝臓で少量であった。
[0196] 〔実施例 2〕 Gpbarl欠損マウスの作製
インビボでの Gpbarlの生理的役割を調べるため、 Gpbarl欠損マウスを作製した。
[0197] Gpbarl遺伝子を標的破壊したマウスは、以下に記載の方法ならびに図 2Aに記載し たターグティング戦略により作製した。図 2A中の黒四角部分はェキソンを表し (E1及 び E2)、英記号はそれぞれ制限酵素部位を示した（Hが HindIII、 Sが Sph I、 Aが Apa I 、 N力 SNsi I、 Eが EcoRIを表す。）。 [0198] まず、マウス Gpbarl/M-Barの 1.2 kb全長 cDNA (GenBankァクセッション番号 AB086 170)を用いて 129/Svマウスゲノムえファージライブラリー（Stratagene)をスクリーニン グすることにより、ェキソン 1及び 2を含むマウスゲノム Gpbarlクローンを取得した。 Gpb arl遺伝子の ATGコドンを含むェキソン 2領域のほとんどを、 PGK_neoカセットで置換 した（図 2A)。ターグティングベクターを唯一の Sail部位で線状化し、エレクト口ポレー シヨン法によりマウス胚幹（ES)細胞、 RW4に導入した。
[0199] 次に、相同的組換え体（HR)を同定するため、 PCR法によりネオマイシン耐性により トランスフエクシヨンされた ES細胞をスクリーニングし、 672個のコロニーを拾った。プラ イマ一 BGEX2 (5'- CAGAGGAGCAGAGGGCAGAATC- 3' 配列番号： 7)及び PGKR (5'-CTAAAGCGCATGCTCCAGACT-3， 配列番号： 8)を用いて 94。Cで 30秒間、 68 。Cで 1.5分間、及び 72°Cで 2分間の 40サイクルの PCRを行うことによりこれらのクローン をスクリーニングし、 7個の陽性クローンを取得した。さらに、 Hindlll消化後にプローブ A及び Bそれぞれを用いてゲノムサザンブロット解析することにより、これらの陽性クロ ーンを解析した。
[0200] 相同的組換え体クローンを C57BL/6胚盤胞に注入し、偽妊娠マウスに移植した。キ メラの雄マウスを C57BL/6N雌マウスと交配させた所、生殖系列への伝達を示した 2匹 の雄マウスが作製された。 Gpbar座の遺伝子型は、 Hindlll消化したゲノム DNAを用い てサザンプロット解析により決定した（図 2B)。野生型のバンドは 11.7 kb長であり、組 換え体のバンドは 3.5 kb長であった。
[0201] Gpbarl mRNA発現の破壊は、ホモ接合性マウスの小腸から調製したポリ (A)RNAを 用いてノーザンプロット解析により解析した（図 2C)。解析前に、 4世代間、これらのマ ウスを C57BL/6Nマウスと戻し交配した。マウスは 12時間明 /12時間喑のサイクルで維 持し、標準的なげつ歯類固形飼料、 CA-l (Clea)を適宜与えた。 3匹の野生型マウス（ +/+)及び 3匹のホモ接合性マウス (-/_)の小腸から調製した一定分量（10 μ g)のポリ ( A)RNAをブロットし、マウス Gpbarl cDNAの [32P]標識プローブでハイブリダィズした（ 図 2C)。 Gpbarlは 1.5 kb長であり、 j3 -ァクチンを泳動コントロールとして用いた。
[0202] その結果、ホモ接合性マウスでは、 Gpbarlのバンドが観察されず、 Gpbarl mRNA 発現が破壊されてレ、ることが確認された。 [0203] ヘテロ接合性及びホモ接合性マウスは生存可能でありかつ生殖可能であり、標準 的なげつ歯類固形飼料での標準的な実験室条件下で正常と思われた。ヘテロ接合 性マウスの交雑により、野生型、ヘテロ接合性、及びホモ接合性マウスが期待される メンデル比で誕生した。
[0204] 〔実施例 3〕 Gpbarl欠損マウスの全胆汁酸プール量及び糞便中胆汁酸排泄レベルの 解析
Gpbarlが胆汁酸恒常性の維持において役割を果たしているか否力、を調べるため、 酵素的方法により、 Gpbarl欠損マウスの全胆汁酸プール量及び糞便中胆汁酸排泄 レベルを測定した。いずれの値も、それぞれ野生型 (+/+)、ヘテロ接合性 (+/_)及び ホモ接合性 (-/-)マウスのデータの平均値土標準誤差 (SE)として表した (n=7〜16)
[0205] 全胆汁酸プール量及び糞便中胆汁酸排泄レベルの測定では、マウスをケージ内 で個々に飼育し、適宜個々に食餌を与えた。全胆汁酸は、 Sinaiらによる記載通りに 抽出した（Sinai, C. J. , Tohkin, M.， Miyata, M., Ward, J. M.， Lambert, G.， and Gonz alez, F. J. 2000. Targeted disruptinon of the nuclear receptor FXR/BAR impairs bil e acid and lipid homeostasis. Cell 102: 731-744)。
[0206] 全胆汁酸プール量の測定においては、まず、肝臓、胆嚢、及び全小腸をホモジナ ィズした。そして、これらの組織を灌流しながら、一定分量をエタノールで 2回抽出し た。続いて窒素流下で抽出物を完全に乾燥させ、 50%エタノールに懸濁した。
[0207] 糞便中胆汁酸排泄レベルの測定においては、屠殺直前の 72時間にわたって各マ ウスから糞便を回収して乾燥させ、重さを量りホモジナイズした。全胆汁酸プール量 測定と同様に、一定分量を抽出した。
[0208] これらの抽出物における全胆汁酸含有量は、 Kitadaらの記載通り酵素的方法により 測定した（Kitada, Η·， Miyata, M.， Nakamura, Τ·， Tozawa, A" Honma, W" Shimada, M., Nagata, K., Sinai, C. J. , Guo, G.し， Gonzalez, F. J., and Yamazoe, Y. 2003. Pr otective role of hydroxysteroid sulfotransferase in lithocholic acid-induced liver toxi city. J Biol Chem. 278: 17838-17844)。
[0209] 上記の測定の結果、図 3A及び図 3Bに示すように、全胆汁酸プール量は野生型マ ウスと比較して、雄及び雌のホモ接合性マウスにぉレ、てそれぞれ有意に 25%及び 21% 減少していることがわかった。核内胆汁酸受容体 FXRがこの表現型に影響を及ぼし ているか否かを評価するため、 Gpbarl欠損マウスの肝臓及び小腸から調製した全 RN Aを用いてノーザンブロット解析を行った。 FXR mRNAの発現レベルは、 3つの遺伝子 型間で同程度であった（データは示さず）。これらのデータから、 Gpbarlは FXR遺伝 子発現に影響を及ぼさずに胆汁酸恒常性の制御に寄与することが示唆される。全胆 汁酸プール量が減少するにもかかわらず、糞便中胆汁酸排泄レベルは 3つの遺伝子 型間で同程度であった（図 3C、 3D)。胆汁酸合成は、ホモ接合性マウスにおいて胆 汁酸プールの減少（21〜25%)を補償するために誘導されるものではないことが示唆 された。
[0210] 〔実施例 4〕血漿トリグリセリド (TG)及び全コレステロールの測定
ホモ接合性マウス及び野生型マウスの、血漿トリグリセリド（TG)及び全コレステロ一 ルを測定した。血漿トリグリセリド（TG)及び全コレステロールは、市販のキット [Determ iner L-TG II及び L TC II (Kyowa medex) ]を用いて測定した。
[0211] ホモ接合性マウスの血漿トリグリセリドレベルは野生型マウスと同程度であつたが、 血漿全コレステロールレベルは雄のホモ接合性マウスでは有意に 16%増加し（p< 0.0 5)、雌では増加は見られなかった（データは示さず)。この結果より、 Gpbarlは性的二 型性様式で血漿コレステロール濃度の制御に寄与する可能性があることが示唆され た。
[0212] 〔実施例 5〕通常餌を与えた Gpbarl欠損マウスの体重変動
Gpbarl遺伝子欠損の影響を検討するため、通常餌を与えた Gpbarlホモ接合性マ ウス及びへテロ接合性マウスの体重変動を経時的に調べた (n=10)。その結果、雄性 及び雌性のホモ接合性マウスの体重は野性型マウスと異ならな力、つた（図 4)。
[0213] そこで、これらのマウスの血漿中の総胆汁酸及び脂質の濃度についても測定した。
その結果、総胆汁酸及びトリグリセリドの血漿濃度は野性型マウスとホモ接合性マウ スで異ならなかったが、血漿総コレステロール濃度については雄性マウスで有意に 増加した（16%、 pく 0.05) (データは示されず）。
[0214] 〔実施例 6〕高脂肪餌を与えた Gpbarl欠損マウスの体重変動及び体組成分析 Gpbarlの脂肪蓄積に及ぼす影響を検討するため、雄性又は雌性のホモ接合性マ ウス群、ヘテロ接合性マウス群及び野生型マウス群に高脂肪餌を与えて飼育し、各 群 (n=10)の体重変動を経時的に調べた。実験を通じ、各群のマウスは 12時間明 /12 時間暗の明暗周期下で管理し、 9週齢から 18週齢まで高脂肪餌 (カロリーの 60%がラ ード； RESEARCH DIETS社、ニュージャージー、米国）を自由に摂取させた。体重は 、週に 1回、 13時に測定した。
[0215] その結果を図 5に示した。図 5A及び 5Cは雄性又は雌性の各群のマウスの体重を、 図 5B及び 5Dはその体重変化量を示し、ホモ接合性マウス群、ヘテロ接合性マウス群 及び野性型マウス群についてはそれぞれ白四角、黒三角、黒丸で表した。
[0216] その結果、 12週齢からの雌性ホモ接合性マウス群の体重は野性型マウス群の変化 と比較して増加し、体重変化量については有意差が認められた（図 5C、 5D)。雌性へ テロ接合性マウス群にっレ、ては、体重及び体重増加量のレ、ずれにぉレ、ても野性型 マウス群に対して有意差は認められないものの、顕著な増加が認められた（図 5C、 5 D)。一方、雄性ホモ接合性マウス群及び雄性へテロ接合性マウス群の体重及び体 重増加量は、野性型マウス群と比較して増加する傾向が認められるものの、顕著なも のではなかった（図 5A、 5B)。
[0217] 次に、高脂肪餌を与えた Gpbarl欠損マウスの体重増加に脂肪の蓄積が寄与する か否かを検討するために、各群のマウスの体組成を核磁気共鳴により測定した。その 結果を図 6に示した。図 6A及び 6Cは雄性又は雌性の各群の 18週齢マウスの脂肪量 を、図 6B及び 6Dはその脂肪量を除いた除脂肪体重を示した。ホモ接合性マウス群、 ヘテロ接合性マウス群及び野性型マウス群については、それぞれ- /_、 +/_、 +/+で表 した。
[0218] その結果、雌性ホモ接合性マウス群及び雌性へテロ接合性マウス群の除脂肪体重 は雌性野性型マウス群とほぼ同じであるものの（図 6D)、脂肪量は雌性野性型マウス 群と比較して顕著に多レ、ものであった（図 6C)。雌雌性ホモ接合性マウス群の脂肪量 については、雌性野性型マウス群に対して、統計的有意差が認められた（図 6C)。一 方、雄性ホモ接合性マウス群及び雄性へテロ接合性マウス群の脂肪量は、野性型マ ウス群と比較して増加する傾向が認められるものの、顕著なものではなかった（図 6A) 。尚、雄性マウスの各群の除脂肪体重はほぼ同じであった（図 6B)。
産業上の利用可能性
Gpbarlの発現量若しくは活性又は Gpbarlに対する結合性は、全胆汁酸プール量 の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤のスクリー二 ング又は当該疾患の検査の指標として利用できる。
本発明の Gpbarl欠損マウスは、 Gpbarlの生理的役割を解明する研究の病態モデ ルマウスとして使用でき、本発明のスクリーニング方法により特定された薬剤、抗 Gpba rl抗体又は Gpbarlアンタゴニスト低分子等の Gpbarl阻害剤の副作用を推測するた めに利用できる。
さらに、遺伝子改変動物の組織から樹立した細胞株は、 in vitroの系で上記薬剤 等の副作用を検討するために利用できる。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代 謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
(a) Gpbarlに被検化合物を接触させる工程
(b)該 Gpbarlと被検化合物との結合を検出する工程
(c)該 Gpbarlと結合する被検化合物を選択する工程。
[2] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代 謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
(a) Gpbarlを発現する細胞に被検化合物を接触させる工程
(b)該 Gpbarlの発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物を接触させてレ、なレ、場合と比較して、該 Gpbarlの発現レベルを増加 させた被検化合物を選択する工程。
[3] 以下の（a)〜（d)の工程を含む、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代 謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
(a) Gpbarlをコードする DNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能 的に結合した DNAを有する細胞又は細胞抽出液を提供する工程
(b)該細胞又は該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
(c)該細胞又は該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定す る工程
(d)被検化合物を接触させてレ、なレ、場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レ ベルを増加させた被検化合物を選択する工程。
[4] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代 謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
(a) Gpbarlに対するリガンドの存在下で、 Gpbarlを細胞表面に発現させた細胞に被 検化合物を接触させる工程
(b)該細胞における Gpbarlの活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させなレ、場合と比較して、上記活性を上昇させた被検化合物 を選択する工程。
[5] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代 謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
(a)被検化合物を Gpbarl遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする 遺伝子改変非ヒト哺乳動物に投与する工程
(b)該遺伝子改変非ヒト哺乳動物における全胆汁酸プール量を測定する工程
(c)被検化合物を投与してレ、なレ、場合と比較して、該遺伝子改変非ヒト哺乳動物に おける全胆汁酸プール量を増加させる化合物を、選択する工程
[6] Gpbarl遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒ ト哺乳動物。
[7] Gpbarl遺伝子の遺伝子対の一方又は双方に外来遺伝子が揷入されてレ、ることを 特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
[8] 全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患のモデル動物である、 請求項 6又は 7に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
[9] Gpbarl遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変哺乳 動物細胞。
[10] Gpbarl遺伝子の遺伝子対の一方又は双方に外来遺伝子が挿入されてレ、ることを 特徴とする遺伝子改変哺乳動物細胞。
[11] Gpbarlタンパク質をコードする DNAを有効成分とする、全胆汁酸プール量の減少 に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤。
[12] 請求項 1〜5のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択された、全胆汁酸 プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤。
[13] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代 謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
(a) Gpbarlに被検化合物を接触させる工程
(b)該 Gpbarlと被検化合物との結合を検出する工程
(c)該 Gpbarlと結合する被検化合物を選択する工程。
[14] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代 謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。 (a) Gpbarlを発現する細胞に被検化合物を接触させる工程
(b)該 Gpbarlの発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物を接触させていない場合と比較して、該 Gpbarlの発現レベルを減少 させた被検化合物を選択する工程。
[15] 以下の（a)〜（d)の工程を含む、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代 謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
(a) Gpbarlをコードする DNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能 的に結合した DNAを有する細胞又は細胞抽出液を提供する工程
(b)該細胞又は該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
(c)該細胞又は該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定す る工程
(d)被検化合物を接触させてレ、なレ、場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レ ベルを減少させた被検化合物を選択する工程。
[16] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代 謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
(a) Gpbarlを細胞表面に発現させた細胞に被検化合物を接触させる工程
(b)該細胞における Gpbarlの活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させなレ、場合と比較して、上記活性を低下させた被検化合物 を選択する工程。
[17] Gpbarlの発現又は活性を低下させる化合物を有効成分とする、全胆汁酸プール量 の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤。
[18] 請求項 13〜： 16のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択された、全胆汁 酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤。
[19] Gpbarl遺伝子の発現量を測定する工程を含む、全胆汁酸プール量の減少又は増 加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法。
[20] Gpbarl遺伝子領域における変異を検出する工程を含む、全胆汁酸プール量の減 少又は増加に伴う疾患又は脂質代时性疾患の検査方法。
[21] Gpbarl遺伝子領域にハイブリダィズし、少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有するォ リゴヌクレオチドを含む、全胆汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又は脂質代 言时性疾患の検査薬。
Gpbarlに結合する抗体を含む、全胆汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又 は脂質代謝性疾患の検査薬。
PCT/JP2005/023734 2004-12-27 2005-12-26 全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患に対する薬剤及び、それら薬剤のスクリーニング方法 Ceased WO2006070718A1 (ja)

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