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WO2006064964A1 - 発現量多様性を有する遺伝子の同定法 - Google Patents

発現量多様性を有する遺伝子の同定法 Download PDF

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WO2006064964A1
WO2006064964A1 PCT/JP2005/023439 JP2005023439W WO2006064964A1 WO 2006064964 A1 WO2006064964 A1 WO 2006064964A1 JP 2005023439 W JP2005023439 W JP 2005023439W WO 2006064964 A1 WO2006064964 A1 WO 2006064964A1
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WO
WIPO (PCT)
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gene
polymorphism
cdna
responsiveness
phenotype
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2005/023439
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroyuki Aburatani
Shumpei Ishikawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HAPLOPHARMA Inc
University of Tokyo NUC
Original Assignee
HAPLOPHARMA Inc
University of Tokyo NUC
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Publication date
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Priority to AU2005314732A priority patent/AU2005314732B2/en
Priority to JP2006549018A priority patent/JP4111985B2/ja
Priority to US11/721,737 priority patent/US7794982B2/en
Priority to CA2591043A priority patent/CA2591043C/en
Publication of WO2006064964A1 publication Critical patent/WO2006064964A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a gene polymorphism search method for determining genes having different expression levels between alleles, and a gene polymorphism search method for a phenotype.
  • Non-Patent Document 1 Knight JC. Allele-specific gene expression ion uncovered. Trends Genet Mar; 20 (3): 113-6. PMID: 15049300, 2004).
  • Umprinted genes that are imprinted and non-imprinted genes that are not imprinted There are two types of genes that show different expression among alleles: Umprinted genes that are imprinted and non-imprinted genes that are not imprinted. The former is called imprinting. In a cell or tissue, when a single allele is inherited from parents, one of them is physiologically inactivated such as methylation and its expression is suppressed. It is. Even in the latter case, that is, non-imprinted genes, different expression differences may be seen between alleles. This is because genomic polymorphism within or between alleles within a gene acts as a cis-acting element that regulates the expression of nearby genes, resulting in differences in gene expression between alleles.
  • mature mRNA with p o l yA is an exon-only sequence after splicing, and there are few polymorphisms (S NPs) that can be evaluated in short length. Therefore, the available polymorphisms (SNPs) are limited, and it is difficult to find genes with different expression levels for each allele.
  • an object of the present invention is to provide a method for quickly and efficiently searching for a gene polymorphism capable of determining a gene whose expression level differs between alleles in view of the above-described actual situation.
  • Another object of the present invention is to provide a method for searching for a gene polymorphism involved in a phenotype using the gene polymorphism searched by the method.
  • the present inventor can efficiently find genes whose expression levels differ among alleles by using gene polymorphisms present on nuclear RNA. In the method for that, when a DNA polymerase that can selectively amplify nuclear RNA was selected, a gene polymorphism that can actually determine genes with different expression levels between alleles (S NP) was successfully identified and the present invention was completed.
  • the present invention includes the following.
  • a genetic polymorphism search method for determining genes having different expression levels between alleles including the following steps.
  • the amplified cDNA is labeled, hybridized using a gene polymorphism-specific probe, and the expression level from each allele based on the reaction. Preferably comprising comparing comparisons.
  • a single nucleotide polymorphism (SNP) can be used as a gene polymorphism.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • a method of searching for a gene polymorphism associated with a phenotype comprising examining the relationship between the gene polymorphism or the expression level of the gene and the phenotype using the gene polymorphism searched by the above search method.
  • phenotypes include disease state and severity of disease, risk of developing disease, responsiveness to drugs, responsiveness to food, responsiveness to chemical substances, and responsiveness to environmental factors.
  • a method for searching for a phenotype involved in a gene polymorphism comprising investigating the relationship between the gene polymorphism or the expression level of the gene and the phenotype using the gene polymorphism searched by the above search method.
  • phenotypes include disease state and severity of disease, risk of developing disease, responsiveness to drugs, responsiveness to food, responsiveness to chemical substances, and responsiveness to environmental factors.
  • the present invention provides a quick and efficient method for searching for gene polymorphisms that can determine genes whose expression levels differ between alleles.
  • the gene polymorphism thus searched can identify the expression level between alleles, and can therefore be an effective means for analyzing the phenotype involved in the gene.
  • the relationship between the gene polymorphism thus searched and the phenotype can be found, the cause of the disease and effective treatment methods can be examined. It is done. Brief Description of Drawings
  • Figure 1 is an electrophoretic photograph of cDNA obtained by amplification using ⁇ 29 DNA polymerase.
  • Figure 2 shows the frequency distribution of the signal ratio between cDNA and lymphocytes in lymphocyte BL 1 3 95, and the positional relationship between the genes in the genome where the polymorphism (probe set) exists. .
  • Figure 3 shows the frequency distribution of the signal ratio between cDNA and genome in lymphocyte B L 2 122 and the positional relationship between the gene on the genome where the gene polymorphism (probe set) exists.
  • FIG. 4 is a diagram showing a comparison of the cDNA / genome signal ratio between the expression analysis array U 1 3 3 p l u s 2 and the 100 K array (Xba l 50 K).
  • FIG. 5 is a diagram showing the positions of SNPs on the P PAR ⁇ gene.
  • Figure 6 shows an overview of the confirmation of S S using the direct sequence method.
  • FIG. 7 is a diagram showing the correlation between the expression level of PP ARG gene in peripheral blood lymphocytes of 30 Japanese and the typification of gene polymorphism.
  • Fig. 8 ⁇ and ⁇ show the expression level of PPARG gene in the peripheral blood lymphocytes of 30 Japanese, the frequency distribution of gene polymorphism tying (A), and haplotype M and m alleles .
  • the present invention provides a method for studying genes with different expression levels between alleles.
  • a gene whose expression level differs between alleles means a gene whose gene expression level from one allele differs from that of the other allele. Point to.
  • the gene expression from each allele can be identified using a specific gene polymorphism as an index, but not all gene polymorphisms can distinguish the difference in expression level between alleles. Therefore, the present invention provides a technique for quickly and efficiently searching for genetic polymorphisms that can determine the difference in expression level between such alleles.
  • nuclear RNAJ is the primary transc ript that has not been spliced after being transcribed from genomic DNA, and therefore has not been transferred to the cytoplasm.
  • nuclear RNA contains both exons and introns in the genome, and has a long chain length (for example, Human Genome Build34 (http: 2004) reported in April 2004).
  • the gene polymorphism is present on the gene transcript RNA.
  • the present inventor believes that the nuclear RNA is not spliced and thus has a long chain length and the expression level between alleles. It was thought that there were many gene polymorphisms that can distinguish different genes, for example, Human Genome Build34 (http: //genome.ucsc.
  • Edu / reported in April 2004
  • the 2 1 8 04 reference sequences on the row have an average mRNA length of 2, 7 5 7 bp and a median of 2, 3 1 6 bp, whereas the intron is included in the genome.
  • the average length is 85, 284 bp and the median is 2,2,855 bp, and a region of about 40 times can be evaluated without considering the polymorphism density.
  • the nuclear fraction is first extracted from the sample.
  • this method uses this method to search for gene polymorphisms to determine the genes whose expression levels differ between alleles.
  • samples derived from animals, plants, microorganisms (fungi, bacteria, etc.), commercially available cell lines, deposited cell lines, etc. are used. be able to.
  • the sample is preferably derived from mammals, particularly humans.
  • the form of the sample is not particularly limited. For example, in the case of a human-derived sample, blood, saliva, lymph, airway mucus, bone marrow, urine, peritoneal fluid such as peritoneal fluid, cells, tissues, etc. A sample of the form can be used.
  • Extraction of the nuclear fraction can be performed using methods known to those skilled in the art. For example, cells can be disrupted with a homogenizer, and nuclei can be separated by differential centrifugation or density gradient centrifugation (for example, Molecular cloning Chapter 17.8 Pre paration of nuclear extracts from Tissue / culture mammal ⁇ an cells. CSHL Press, ISBN 0-87969-577-3).
  • cDNA is synthesized from the nuclear RNA prepared as described above by reverse transcription using random primers.
  • cDNA can be synthesized from any sequence of RNA (nuclear RNA) present in the sample.
  • the reverse transcribed cDNA is amplified using random primers. Since nuclear RNA is not spliced, it has a long chain length and cannot be amplified by DNA polymerases generally used for amplification. Therefore, in this method, a DNA polymerase that performs strand displacement under isothermal reaction is used. Examples of the DNA polymerase having the above properties include, but are not limited to, ⁇ 29 ⁇ polymerase (Amersham Bioscience, trade name Genomiphi). Since this amplification reaction is very stable, this ⁇ 29 DNA polymerase can be directly used for amplification reaction using ⁇ 29 DNA polymerase without purifying the cDNA synthesized by reverse transcription reaction.
  • B st polymerase is also known as one having the above properties and is available from New England BioLab (Lage JM, Leamon JH, Pejovic T, Hamann S, Lacey M, Dilion D, Segraves R , Vossbrinck B, Gonzalez A, Pinkel D, Albertson DG, C osta J, Lizardi PM. Whole genome analysis of genetic alterations in smal 1 DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 2003 Feb; 13 (2): 294-307. PMID: 12566408).
  • total RNA (including nuclear RNA and mRNA) is prepared from the sample and reverse transcription using random primers from various RNA species.
  • DNA polymerase for example, ⁇ 29 DNA polymerase
  • cDNA derived from nuclear RNA can be selectively synthesized and amplified.
  • This amplification of cDNA from nuclear RNA is preferable in carrying out this method because the procedure for extracting only nuclear RNA can be omitted.
  • Total RNA can be extracted by methods known to those skilled in the art, such as the guanidine Z cesium method, the AG PC (acid guanidinium quinol-chloroform) method, and the like.
  • the expression level of the gene (amplified cDNA) derived from each allele is compared.
  • the expression levels are compared between heterozygous alleles. Alleles differ in two alleles of genomic DNA from alleles with heterozygous polymorphisms. It means having a genetic polymorphism. Therefore, in the case of having heterozygous alleles, it is possible to distinguish the amplified cDNA derived from each allele. If there is a significant difference in the expression level, the gene polymorphism can be selected as an index for determining genes with different expression levels between alleles.
  • gene polymorphism or “polymorphism” refers to the difference in genes that cause diversity in traits and morphology among individuals, such as single nucleotide polymorphism (SNP), haplotype, etc. Is included.
  • SNP refers to a single nucleotide nucleic acid mutation in a specific gene or group of genes. Such SNPs are known to cause a variety of traits and morphology among individuals.
  • haplodip indicates a polymorphism represented by the type and number of alleles at a plurality of mutation sites in a continuous gene region or gene group. Recombination frequency in haplotypes is lower than normal recombination frequency and tends to be genetically conserved.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the genetic polymorphisms that can be used are not particularly limited, and genetic polymorphism information can be easily obtained from public databases.
  • information on SNPs and haplotypes such as humans and mice can be obtained from the NCB I database (http: //www.ncb i. Nlra. Nih. Gov / SNP /), and information on human SNPs can be obtained from the J SNP database. (Http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index_en.html).
  • Other genetic polymorphism information can be easily obtained by those skilled in the art.
  • Detection of a gene polymorphism and measurement of the expression level from an allele containing the gene polymorphism can be performed using a technique known in the art.
  • detection of a gene polymorphism and measurement of the gene expression level from an allele can be performed by hybridization with a probe specific to one gene polymorphism.
  • the probe can be labeled with an appropriate means such as a fluorescent substance or a radioactive substance, if necessary.
  • the probe contains a gene polymorphism site and is unique with amplified cDNA As long as it can be hyper-hydidized, specific probe designs are known in the art.
  • the hybridization conditions only need to be sufficient to distinguish gene polymorphisms. For example, hybridization is performed in the case of one gene polymorphism, but in the case of other gene polymorphisms. Conditions that do not allow hybridization, such as stringent conditions, are known to those skilled in the art.
  • the probe can also be used as a DNA chip (microarray) with one end fixed to the substrate.
  • a probe corresponding to one gene polymorphism may be immobilized on the DNA chip, or probes corresponding to both gene polymorphisms may be immobilized. Detection of genetic polymorphism using such a DNA chip is described in, for example, “DNA microarray and latest PCR method”, supervised by Masaaki Muramatsu and Hiroyuki Nami, Shujunsha, 2000, Chapter 10.
  • GeneChip (registered trademark) Human Mapping 100K array is an array that includes two arrays and can detect more than 100,000 SNPs present on the genome.
  • cut the sample (genome, cDNA, etc.) with a restriction enzyme (XbaI or HindiII), attach an adapter, and use one kind of primer (XbaI, Hind) specific to the adapter.
  • XbaI or HindiII restriction enzyme
  • XbaI, Hind one kind of primer specific to the adapter.
  • the two arrays are designed to be complementary for each allele of each SNP.
  • the SNP of the sample is judged based on the signal, and the expression level of each allele is expressed as signal intensity or signal. Comparisons can be made based on the ratio.
  • Http //V/www.affymetrix.co.jp/products/arrays/specification/100k.
  • htmlhttp //www.affymetrix.co.jp/pdf/Mapping_100K.pdf Please refer to the product information and data sheets published in
  • the gene polymorphism can be detected by any method known to those skilled in the art other than those described above. Such methods include using a specific primer for gene polymorphism, using restriction fragment length polymorphism (RF LP), direct sequencing, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), Uses chemical cleavage of mismatch sites
  • RF LP restriction fragment length polymorphism
  • DGGE denaturing gradient gel electrophoresis
  • CCM primer extension method
  • Invader invader method
  • Taq Man method quantitative real-time PCR detection method
  • a DNA chip microarray
  • the gene expression level (signal strength) for each allele is examined based on the difference in the gene polymorphism. If the gene expression level from each allele is significantly different, the gene polymorphism is selected. Specifically, the ratio of the expression level of an allele having a high expression level to the allele having a low expression level is determined, and a gene polymorphism having the ratio of at least 1.3, preferably at least 1.5 is selected.
  • a ratio of 1 means that the expression levels of genes from both alleles are almost equal.
  • gene polymorphisms are used to compare the expression levels of alleles.
  • gene polymorphisms that differ in expression levels are used to determine genes with different expression levels between alleles. It can be selected as a gene polymorphism.
  • the gene polymorphism selected in this manner can be used to determine whether or not a sample has an allele with a high expression level only by detecting the gene polymorphism.
  • genes with different expression levels between alleles may be related to specific phenotypes. Therefore, using gene polymorphisms selected in this way, The relationship with the phenotype can be clarified.
  • genetic polymorphism is a genetic difference that causes diversity in traits and morphology among individuals, there is a possibility that genetic polymorphism and phenotype have some relationship.
  • genes with different expression levels between alleles may be associated with specific phenotypes. Therefore, expression levels differ between alleles searched by the above method. It is considered that a genetic polymorphism that can determine a gene is more likely to be related to a phenotype than other genetic polymorphisms.
  • the relationship between the gene polymorphism or the expression level of the gene and the phenotype is determined using the gene polymorphism searched by the above method. It is characterized by that.
  • the phenotype includes the presence of the disease (pathologic condition and severity), risk of developing the disease, responsiveness to drugs, responsiveness to food, responsiveness to chemical substances, environmental factors (for example, ultraviolet light, temperature, etc.) And so on.
  • the method can be performed based on association methods, disease sibling pairing methods, and the like well known in the art.
  • association method the occurrence frequency of the gene polymorphism searched for in the search method described above or the expression level of the gene using a subject showing a specific phenotype and a subject not showing it. Examine the relationship. For example, if the frequency of having a specific genetic polymorphism is significantly higher in a subject exhibiting a specific phenotype, the difference in the genetic polymorphism is the expression of the gene involved in the phenotype.
  • genes containing gene polymorphisms searched by the above method have different expression levels between alleles within the same individual, so the expression level among individuals depends on the type of allele (ie, the type of gene polymorphism). Is estimated to be different. Therefore, it is possible to measure the gene polymorphism and expression level in a large number of individuals and confirm that the expression level between individuals correlates with the gene polymorphism information.
  • gene polymorphisms involved in phenotype can be searched.
  • the genetic polymorphism searched in this way is useful for diagnosing the onset and risk of disease and for determining the responsiveness of drugs in advance.
  • the phenotype involved in the gene polymorphism can also be searched.
  • the phenotype changes depending on the genetic polymorphism on the gene. It is speculated that there is a difference (eg, ⁇ ARy is presumed to be involved in phenotypes related to lipid metabolism such as diabetes). Therefore, by actually evaluating the genetic polymorphism and phenotype (eg, comparing the responsiveness of the diabetic drug Actos in various individuals to the typing results of the PPARy gene polymorphism). Can actually confirm their involvement.
  • the inventor conducted the above-described method, and found that the expression level of human peroxisome proliferator-activated receptor ⁇ (PP AR ⁇ or PP ARG) gene was actually different between alleles. In addition, we were able to find genetic polymorphisms that can determine the difference in the expression level from each allele.
  • PP AR ⁇ or PP ARG human peroxisome proliferator-activated receptor ⁇
  • reverse transcriptase Invitrogen Superscriptlll RT enzyme
  • FIG. 1 shows the result of electrophoresis of cDNA amplified in this manner.
  • Lanes 1 and 2 in Figure 1 were prepared using phi 29 DNA polymerase as described above. Represents cDNA.
  • the reaction was started from 250 ng according to the 100 K array protocol (Affimetrix). Specifically, as described in Example 1, cDNA amplified with phi 29 and genomic DNA amplified with phi 29 were similarly amplified according to the usual 100 K protocol, and the signal was The intensity ratio (cDNA signal intensity / genomic DNA signal intensity) was taken and the frequency distribution was examined. By determining the ratio of signal intensities in this way, there are sequences that are likely to increase by phi 29 and those that are difficult to increase due to differences in secondary structure caused by sequence differences (amplification bias). Dividing the signal value by the signal value of the genome amplified with phi 29 can eliminate this amplification bias.
  • RNA of B L 2 122 was prepared and corner-analyzed according to a normal protocol using Affymetrix U133plus2.0 array. After averaging the entire signal so that the average signal value of about 54,000 probe sets is 100, the gene group (score 100 or higher) that seems to have high signal and high expression level, and low signal expression level 2 groups of genes that are thought to be low (less than 10), in the SNP probe of the 100 K array (here Xb al 5 OK array) in the genomic region including the intron of the gene, We examined the cDNAZ genomic signal ratio obtained from the above information and looked at the frequency distribution.
  • the ratio of cDNA and genomic signals is calculated as shown in (1) above. Measure the amount of B-derived RNA (cDNA), and determine the difference in the expression level between allele A and allele B. Two ratios (allele A cDNA / genome ratio and allele B) The ratio to the cDNA / genome ratio). Here, when the ratio is 1, the expression levels of both alleles are equal. As a result, imprinted physiologically As shown in Table 1, the X chromosome, which is well-known for the inactivation of unilateral alleles, is statistically significant between alleles compared to other autosomes (1.69 and 2.01).
  • P PARG Peroxisome Proliferation Activating Receptor ⁇
  • probe sets are designed at a total of 7 SNP positions in the P PARG gene region on the genome.
  • NNB lymphocyte BL 1 3 95 performed in Example 2
  • rs 1 05 1 041 1, rs 1 05 1 04 1 1 and rs 1 05 1 04 1 2 NCB
  • the three SNPs in the I db S NP database ID) were polymorphic in the genome typing (ie, the two alleles were distinguishable).
  • Figure 5 shows the positions of these three SNPs on the P PARG gene.
  • white stars are SNPs (informa tiveve SNPs) that can determine the difference in expression level between alleles of the PPARG gene.
  • rsl 051 041 0 in the BL 1 395 sample As shown in the figure, it is an A / C heterogeneity in the genomic DNA (c), which is phi 29 There was no change in the genomic DNA amplified in step 1.
  • the cDNA (a and b) amplified by phi 29 the signal from allele A decreases and the waveform is almost allele C.
  • rs 1 05 1 0410 on the genome is an AZ C heterozygous gene, but in the actually expressed gene, it can be seen that the expression level from the C allele is large. This result was consistent with the 50K X ba I array. No expression of PPARG gene was observed in BL 21 2 2 lymphocytes.
  • the samples were rsl 05 1 04 1 1, rsl 05 1 041 1 and rsl 05 depending on the frequency of presence in 30 Japanese. 1 04 1 2 C type, A type and A type low allele (m) homotype, rsl 05 1 041 1, rsl 05 1 04 1 1 and rsl 05 1 041 2 respectively It was possible to classify them into A, G and G homozygous alleles (M), which are frequently present, and heterotypes thereof.
  • the expression level of homozygous alleles with low frequency is higher than other types (mM and MM types) ( mm average value 1.58 vs. other than 0.80), 2 of the top 3 samples with particularly high expression
  • the body was mm.
  • this method searches for gene polymorphisms that can determine genes whose expression levels differ between alleles, and the gene polymorphisms thus searched are related to the gene expression levels. It was suggested that the phenotype may also be affected, and all publications, patents and patent applications cited in this specification are incorporated herein by reference in their entirety. Availability of.
  • the present invention provides a quick and efficient method for searching for gene polymorphisms that can determine genes whose expression levels differ between alleles.
  • the gene polymorphism thus searched can identify the expression level between alleles, and can therefore be an effective means for analyzing the phenotype involved in the gene.
  • the relationship between the gene polymorphism thus searched and the phenotype can be found, the cause of the disease and effective treatment methods can be examined. It is done. Sequence listing free text SEQ ID NOs: 1-3: Partial sequence of human peroxisome proliferator-activated receptor ((n in SEQ ID NO: 3 represents g or t)

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Abstract

本発明は、アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定するための遺伝子多型の検索方法、及び表現型に関与する遺伝子多型の検索方法に関する。より具体的には、本発明は、核内ＲＮＡ上に存在する遺伝子多型を利用して、アレル間で発現量が異なる遺伝子を効率的に判定する方法に関する。

Description

発現量多様性を有する遺伝子の同定法 技術分野
本発明は、 アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定するための遺伝子多型の検 索方法、 及び表現型に関与する遺伝子多型の検索方法に関する。 明
背景技術
ゲノムの同じ位置にある同じ遺伝子であっても、 それが異なるアレル上にある 書
場合にその遺伝子発現量に差が見られる現象は、 近年報告されている比較的新し い概念である (非特許文献 1 ： Knight JC. Al lele - spec if ic gene express ion u ncovered. Trends Genet. Mar ; 20 (3) : 113 - 6. PMID : 15049300、 2004年）。
アレル間で異なる発現を示す遺伝子というのは大きく分けて刷り込みを受ける 遺伝子 Umprinted gene) と刷り込みを受けない逾伝子 (non-imprinted gene) の 2種類がある。 前者は、 刷り込み （imprinting) といって、 ある細胞若しくは 組織において、 両親から片ァレルずつ受け継いだ場合にどちらか一方が生理的に メチル化などの不活化を受けて発現が抑制されるという現象である。 後者、 すな わち刷り込みを受けない遺伝子 （non- imprinted gene) においても、 アレル間で 異なる発現差が見られる場合がある。 これは、 遺伝子内若しくはそれに近接して いるアレル間のゲノムの多型が、近傍の遺伝子の発現を調節するシス作用領域（c is- act ing element) として働き、アレル間の遺伝子発現量の差を生み出すと考え られている。 後者に見られる、 ゲノム D N Aの配列の違いに起因するアレルごと の発現の変化は、 世代を超えて引き継がれる性質と考えられ、 個体間の遺伝子発 現量の差、 ひいては個人の体質の差、 病態とそのリスク、 また薬剤の応答性の違 いに影響することが考えられる。
アレル間の遺伝子発現量の差を測定するには、 同一細胞内において、 すなわち 同一環境条件下において測定するのが最も正確である。 またアレル間の遺伝子発 現量の差を測定する際に、 ある R N Aがどちらのアレル由来であるかを同定でき ることが重要である。 そのためには、 アレルを区別できる多型 （S N P等） 、 遺伝子の転写産物である RN Aの配列上にも存在することが必要であり、 それを 測定することにより可能となる。 この RNA上の多型 （S NP) を用いてアレル 間の発現量の差を測るという報告はこれまでにいくつかある （非特許文献 2〜 4 ： Cowles CR, Hirschhorn JN, Altshuler D， Lander ES. Detection of regul atory variation in mouse genes. Nat Genet. Nov;32 (3) :432 - 7. PMID: 124102 33、 2002年； Yan H, Yuan W， Velculescu VE, Vogelstein B， Kinzler KW. Rela ted Allelic variation in human gene expression. Science. Aug 16；297 (558 4) :1143. PMID: 12183620、 2002年； Bray NJ, Buckland PR, Owen MJ， 0' Donova n MC. Cis-acting variation in the expression of a high proportion of gen es in human brain. Hum Genet. 2003 Jul ;113 (2) :149-53. Epub May 01. PMI D: 12728311、 2003年）。
これらの報告はいずれも RT— P CR法とダイレク ト · シークェンス反応若し くは一塩基伸張反応を組み合わせたもの、 すなわち、 mRNAから c DNAを合 成し、 増幅した後、 任意に選択した多型を個々にタイピングするものであり、 多 くの遺伝子を同時に測定できる技術ではない。
S NPタイビング用マイクロアレイを用いて多くの遺伝子を網羅的に解析した 報告はこれまでに一報ある （Lo HS, Wang Z, Hu Y, Yang HH, Gere S, Buetow K H, Lee MP. Allelic variation in gene expression is common in the human g enome. Genome Res. Aug ; 13 (8) : 1855 - 62. PMID: 12902379、 2003 年）。 ここでは p o l y Tプライマーを用いた通常の RT法により p o 1 y Aのついた mRNA を c DNAに変換し、 通常のゲノム DNAタイビングと同様のプロトコールで多 数の特異的プライマーを用いたマルチプレックス P CR法によりサンプルを調製 し、 アレイにハイブリさせてそのシグナル比でアレルごとに異なる c DNA (m RNA) の発現量比を測定している。 しかしながら、 p o l yAのついた成熟型 mRNAでは、 スプライシングをうけたあとのェキソンのみの配列であり、 これ は長さが短く評価できる多型（S NP) も少ない。 そのため、利用可能な多型（S NP) が限定されてしまい、 アレル毎に発現量に差がある遺伝子を見出すことは 困難である。
一方、 遺伝子の多型と特定の形質発現 （例えば疾患、 薬剤の効き方の違い） と の関連性も着目されている。 しカゝし、 特定の遺伝子多型と形質発現との関連性を 調べるには、 例えばゲノム上の S NPの場合には多数の S NP (2004年 1 0 月に報告された NCBI dbSNP buildl23では約 1 000万） を個々の形質ごとに調 ベる必要があり、 すべてについて検討するのは困難である。
従って、 アレル間で形質発現が異なる遺伝子を迅速かつ効率的に選択し、 その ように選択された遺伝子の多型と形質発現との関連性を調べることができれば、 疾患の原因や有効な治療法などを検討することができると考えられる。 発明の開示
そこで、 本発明は、 上述した実状に鑑み、 アレル間で発現量が異なる遺伝子を 判定することができる遺伝子多型を迅速かつ効率的に検索する方法を提供するこ とを目的とする。 また本発明は、 当該方法により検索された遺伝子多型を利用し て、 表現型に関与する遺伝子多型を検索する方法を提供することを目的とする。 本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、 核内 RNA上に 存在する遺伝子多型を利用することによって、 効率的にアレル間で発現量が異な る遺伝子を見出すことができると考え、 そのための手法において、 核内 RNAを 選択的に増幅することができる DNAポリメラーゼを選択したところ、 実際にァ レル間で発現量が異なる遺伝子を判定することができる遺伝子多型 （S NP) を 同定することに成功し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 以下を包含する。
(1) 以下のステップを含む、 アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定するため の遺伝子多型の検索方法。
(a) 総 RNA又は核内 RNAからランダムプライマーを用いた逆転写反応によ り c DNAを合成するステップ、
(b) ランダムプライマー、 及び等温で反応する鎖置換型 DNAポリメラーゼを 使用して長い核内 RNA (—次転写産物） 由来の c DNAを選択的に増幅するス テツプ、
(c) 増幅した c DNAに存在する遺伝子多型を検出するステップ、
(d) ゲノム DNAの遺伝子多型がヘテロ接合型であるゲノム上の位置の各ァレ ルからの c DN Aの発現量を、 該遺伝子多型に基づいて比較するステップ、 (e) 各アレルからの c DNAの発現量が有意に異なる場合に、 比較に使用した 遺伝子多型を選択するステップ
上記検索方法において、 D N Aポリメラーゼとしては、 例えば (i> 2 9 D N Aポ リメラーゼを用いることができる。
またステップ （c ) 及ぴ （d ) は、 増幅した c D N Aを標識し、 遺伝子多型特 異的プロープを用いたハイブリダィゼーシヨンを行い、 その反応に基づいて各ァ レルからの発現量を比較を比較することを含むことが好ましい。
上記検索方法において、 遺伝子多型としては一塩基多型 （S N P ) を用いるこ とができる。 ( 2 ) 上記検索方法により検索された遺伝子多型を用いて、 遺伝子多型又は遺伝 子の発現量と表現型との関係を調べることを含む、 表現型に関与する遺伝子多型 の検索方法。
上記検索方法において、 表現型としては、 疾患の病態及び重症度、 疾患の発症 リスク、 薬剤に対する応答性、 食品に対する応答性、 化学物質に対する応答性、 並びに環境因子に対する応答性などが挙げられる。
( 3 ) 上記検索方法により検索された遺伝子多型を用いて、 遺伝子多型又は遺伝 子の発現量と表現型との関係を調べることを含む、 遺伝子多型に関与する表現型 の検索方法。
上記検索方法において、 表現型としては、 疾患の病態及び重症度、 疾患の発症 リスク、 薬剤に対する応答性、 食品に対する応答性、 化学物質に対する応答性、 並びに環境因子に対する応答性などが挙げられる。 本発明により、 ァレル間で発現量が異なる遺伝子を判定することができる遺伝 子多型を検索するための迅速かつ効率的な方法が提供される。 また、 そのように して検索された遺伝子多型は、 アレル間の発現量を識別することができるため、 その遺伝子が関与する表現型について解析するための有効な手段となり うる。 さ らに、 そのように検索された遺伝子多型と表現型 （疾患リスクや薬剤応答性） と の関係を見出すことができれば、 疾患の原因や有効な治療法などを検討すること ができると考えられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 φ 29 DNAポリメラーゼを用いた増幅により得られた c DNAの電 気泳動写真である。
図 2は、 リンパ球 B L 1 3 95における c DN Aとゲノムとのシグナル比の度 数分布と、 その遺伝子多型 （プローブセット） の存在するゲノム上の遺伝子との 位置関係を表す図である。
図 3は、 リンパ球 B L 2 1 22における c DNAとゲノムとのシグナル比の度 数分布と、 その遺伝子多型 （プローブセット） の存在するゲノム上の遺伝子との 位置関係を表す図である。
図 4は、発現解析用アレイ U 1 3 3 p l u s 2と 1 00Kアレイ（Xb a l 5 0 K) での c DNA/ゲノムのシグナル比の比較を示す図である。
図 5は、 P PAR γ遺伝子上の SNPの位置を示す図である。
図 6は、 ダイレク ト · シーケンス法を用いた S ΝΡの確認の概要を示す図であ る。
図 7は、 日本人 3 0人の抹消血リンパ球の P P ARG遺伝子の発現量と遺伝子 多型のタイビングとの相関を示す図である。
図 8 Α及び Βは、 日本人 3 0人の抹消血リンパ球の P PAR G遺伝子の発現量 と遺伝子多型のタイビングの度数分布（A)、及びハプロタイプ Mと mのアレルを 示す図である。 発明の実施をするための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。 本願は、 2004年 1 2月 1 7日に出願され た日本国特許出願第 2004-3 666 7 1号の優先権を主張するものであり、 上記特許出願の明細書及び Z又は図面に記載される内容を包含する。
1. アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定することができる遺伝子多型の検索 本発明は、 アレル間で発現量が異なる遺伝子について研究するための手法を提 供するものである。 ここで、 「アレル間で発現量が異なる遺伝子」 とは、 一方のァ レルからの遺伝子発現量ともう一方のアレルからの遺伝子発現量が異なる遺伝子 を指す。 各アレルからの遺伝子の発現は、 特定の遺伝子多型を指標として区別す ることができるが、 全ての遺伝子多型がァレル間の発現量の違いを区別できるも のではない。 そこで、 本発明においては、 そのようなアレル間での発現量の違い を判定することができる遺伝子多型を、 迅速かつ効率的に検索する手法を提供す る。
( 1 ) 核内 RNAからの c DNAの合成と増幅
本方法においては、核内 RNAから c DN Aを合成する。 ここで 「核内 RNAJ とは、 ゲノム DN Aから転写された後、 スプライシングを受けておらず、 そのた め細胞質には移行せず、 まだ核内に存在している一次転写産物 （primary transc ript) をいう。 すなわち、 核内 RNAは、 ゲノム上のェキソン及びイントロンの 両方を含み、 長い鎖長を有するものが多い （例えば、 2 0 0 4年 4月に報告され た Human Genome Build34 (http://geiiome. ucsc.edu/) の酉己歹 IJ上に る 2 1 8 0 4個の参照配列 （reference sequence) では平均長 8 5, 2 8 4 b p、 中央値 2 2, 8 5 5 b pであり、 5 0 0 0 b pより長いものは全体の約 8 4%を占める）。 アレル間の発現量の差を測定するには、 遺伝子の転写産物である RNA上に遺 伝子多型が存在することが必要である。 本発明者は、 核内 RN Aはスプライシン グを受けていないため鎖長が長く、 アレル間の発現量が異なる遺伝子を識別する ことができる遺伝子多型も多く含まれると考えた。 例えば、 2 0 04年 4月に報 告された Human Genome Build34 (http://genome.ucsc. edu/) の酉己列上にある 2 1 8 04個の参照配列 （reference sequence) では、 mRNAの平均長 2， 7 5 7 b p、 中央値 2， 3 1 6 b pであるのに対し、 そのイントロンを含めたゲノム 上の長さは平均長 8 5 , 2 8 4 b p、 中央値 2 2, 8 5 5 b pであり、 遺伝子多 型の密度を考えなくても約 4 0倍程度の領域が評価できることになる。
核内 RNAから c DNAを合成するためには、 試料から核内 RN Aのみを抽出 し、その核内 RN Aから c DN Aを合成する方法と、試料から総 RN Aを抽出し、 総 RNAから c DN Aを合成した後、 長い核内 RN Aに由来する c DNAのみを 増幅する方法の 2つの方法を使用することができる。
1つの方法においては、 まず試料から核画分を抽出する。 試料は、 本方法を用 いてアレル間で発現量が異なる遺伝子を判定するための遺伝子多型を検索しよう とするものに由来する試料であれば特に限定されるものではなく、例えば、動物、 植物、 微生物 （真菌、 細菌など） 由来の試料、 市販の細胞株、 寄託されている細 胞株などを用いることができる。 試料は、 哺乳動物、 特にヒ トに由来するものが 好ましい。 また試料の形態も特に限定されるものではなく、 例えばヒ ト由来の試 料の場合には、 血液、 唾液、 リンパ液、 気道粘液、 骨髄液、 尿、 腹腔液等の体液、 細胞、 組織等の形態の試料を使用することができる。
核画分の抽出は、 当業者に公知の方法を使用して行うことができる。 例えば、 細胞をホモジナイザーによって破砕し、 分画遠心法若しくは密度勾配遠心法によ つて核を分離することができる （例えば、 Molecular cloning Chapter 17.8 Pre paration of nuclear extracts from Tissue/ cultured mammal ι an cells. CSHL Press, ISBN 0-87969- 577- 3参照）。
次に、 上記のように調製した核内 RNAから、 ランダムプライマーを用いた逆 転写反応により c DNAを合成する。 ランダムプライマーの使用によって、 試料 中に存在する、 あらゆる配列の RNA (核内 RNA) から c DNAを合成するこ とができる。
続いて、 逆転写した c DNAをランダムプライマーを用いて増幅する。 核内 R N Aはスプライシングを受けていないため鎖長が長く、 一般的に増幅に使用され る DNAポリメラーゼでは増幅することができない。そこで、本方法においては、 等温度の反応条件 (isothermal reaction) で鎖置換 (strand displacement) を 行う DNAポリメラーゼを使用する。 上記の性質を有する DNAポリメラーゼと しては、 限定されるものではないが、 φ 2 9 ϋΝΑポリメラーゼ （Amersham Bio science, 商品名 Genomiphi) が挙げられる。 この ψ 2 9 D N Aポリメラーゼは、 その増幅反応が非常に安定しているため、 逆転写反応により合成した c DNAを 精製過程を行うことなくそのまま φ 2 9 DNAポリメラーゼを用いた増幅反応に 利用可能であり、 また μ gオーダーの収量が得られることから、 微量サンプルの 精製による損失を気にすることなく臨床検体などのきわめて微量なサンプルから も増幅することができるため、 本方法の実施に特に好ましい。 その他、 上記性質 を有するものとしては、 B s tポリメラーゼも知られており、 NewEngland BioLa bから発売されている (Lage JM, Leamon JH, Pejovic T， Hamann S， Lacey M, D i lion D, Segraves R， Vossbrinck B， Gonzalez A, Pinkel D, Albertson DG， C osta J, Lizardi PM. Whole genome analysis of genetic alterations in smal 1 DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 2003 Feb ; 13 (2) : 294- 307. PMID: 12566408)。
また、 このような DNAポリメラーゼは、 DNAを増幅する際に DNA断片の 末端において反応を停止するため、 末端付近は増幅率が著しく低下することとな るが、 短い DNA断片の増幅の場合には、 両末端間の距離が近いために断片全体 の増幅率が低下し、 結果として長い DNA断片、 すなわちスプライシングを受け ていない核内 RNAが選択的に増幅されることとなる （Lage JM, Leamon JH, Pe jovic T, Hamann S, Lacey M, Dillon D, Segraves R， Vossbrinck B， Gonzalez A, Pinkel D, Albertson DG， Costa J, Lizardi PM. Whole genome analysis o f genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand di splacement amplification and array-CGH. Genome Res. 2003 Feb ; 13 (2) : 294- 3 07. PMID: 12566408 ； General Amplification of Chromosomal DNA by phi29 DN A polymerase. Amersham Biosience)。
従って、 核内 RNAから c DNAを合成するための別の方法として、 試料から 総 RNA (核内 RNA及ぴ mRNAを含む） を調製し、 多様な RN A種からラン ダムプライマーを用いた逆転写反応により c DNAを合成し、 その後、 鎖長の長 い c DNA (すなわち、 長い核内 RNA由来の c DNA) を選択的に増幅しうる 上記の DNAポリメラーゼ （例えば φ 2 9 DNAポリメラーゼ） を用いて増幅す ることによって、 核内 RNAに由来する c DNAを選択的に合成し増幅すること ができる。 この核内 RNAからの c DNAの増幅は、 核内 RNAのみを抽出する 手順を省略することができるため、 本方法の実施において好ましい。 総 RNAの 抽出は、 当業者に公知の方法により行うことができ、 例えばグァニジン Zセシゥ ム法、 AG P C (酸グァニジゥムーフヱノールークロロホルム） 法などを用いる ことができる。
(2) 遺伝子多型とアレル発現量
続いて、 各アレルに由来する遺伝子 （増幅 c DNA) の発現量を比較する。 こ こで、 発現量の比較は、 ヘテロ接合型のアレル間で行う。 遺伝子多型がヘテロ接 合型のアレルとは、 ゲノム DN Aにおける 2つのアレルにおいて各アレルが異な る遺伝子多型を有することを意味する。 従って、 ヘテロ接合型アレルを有する場 合には、 各アレルに由来する増幅 cDNAを区別することができる。 そして、 上 記発現量に有意差があれば、 その遺伝子多型はァレル間で発現量の異なる遺伝子 を判定するための指標として選択することができる。
ここで、 「遺伝子多型」 又は 「多型」 とは、 個体間における形質や形態の多様性 を引き起こす遺伝子の差異をいい、 一塩基多型 (Single Nucleotide Polymorphi sm; SNP)、及ぴハプロタイプなどが含まれる。 SNPとは、 ある特定の遺伝子 又は遺伝子群における一塩基の核酸の変異をいう。 このような SNPは、 個体間 における形質や形態の多様性を引き起こすことがあることが知られている。また、 ハプロダイプとは、 連続した遺伝子領域又は遺伝子群中の複数箇所の変異部位に おけるァレルの種類と数とによって表される多型を示す。 ハプロタイプにおける 組換え頻度は通常の組換え頻度よりも低く、 遺伝的に保存される傾向がある。 従 つて、 多型と表現型との関連性を調べる場合には、 個々の変異との関連性だけで はなく、 特定のハプロタイプとの関連性を調べることも重要であると考えられて いる。 その他、 遺伝子多型には、 揷入/欠失型多型、 繰返し配列の繰返し回数の 違いによる多型、 制限断片長多型などが含まれる。 本方法においては、 多数の S N P検出手法が存在すること、 アレル間の区別を 1塩基の違いで容易に行うこと ができることなどから、 一塩基多型 （SNP) を利用することが好ましい。
利用可能な遺伝子多型は特に限定されるものではなく、 遺伝子多型情報は公共 のデータベースなどから容易に入手することができる。 例えば、 ヒ ト、 マウスな どの S N P及びハプロタイプの情報は、 NCB Iデータベース （http://www.ncb i. nlra. nih. gov/SNP/) より、 またヒ ト SNPの情報は、 J SNPデータベース （h ttp://snp. ims. u-tokyo. ac. jp/index_ja. html) より入手すること力 Sできる。その 他の遺伝子多型情報は、 当業者であれば容易に入手することができる。
遺伝子多型の検出及び遺伝子多型を含むアレルからの発現量の測定は、 当技術 分野で公知の手法を用いて行うことができる。
例えば、 遺伝子多型の検出及ぴアレルからの遺伝子発現量の測定は、 一の遺伝 子多型に特異的なプローブとのハイブリダィゼーションにより行うことができる。 プローブは、 必要に応じて、 蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識す ることができる。 プローブは、 遺伝子多型部位を含み、 増幅した c DNAと特異 的にハイプリダイズするものである限りいかなるものでもよく、 具体的なプロ一 ブの設計は当技術分野で公知である。 また、 ハイブリダイゼーシヨンの条件も、 遺伝子多型を区別するのに十分な条件であればよく、 例えば一の遺伝子多型の場 合にはハイブリダィズするが、 他の遺伝子多型の場合にはハイブリダィズしない ような条件、 例えばストリンジェントな条件であり、 このような条件は当業者に 公知である。
プローブは、 一端を基板に固定して DNAチップ （マイクロアレイ） として用 いることもできる。 この場合、 DN Aチップには、 一の遺伝子多型に対応するプ ローブのみが固定されていても、 両方の遺伝子多型に対応するプローブが固定さ れていてもよい。 このような DNAチップを用いた遺伝子多型の検出は、 例えば 「D N Aマイクロアレイ と最新 P C R法」、村松正明及び那波宏之監修、秀潤社、 2000年、 第 1 0章などに記載されている。
DN Aチップを用いた遺伝子多型の検出の具体的な例として、 Affymetrix社製 の GeneChip (登録商標） Human Mapping 100K arrayを用いる方法について説明す る。 GeneChip (登録商標） Human Mapping 100K array は、 2枚のアレイを含み、 ゲノム上に存在する 1 00， 000個を超える S NPの検出を行うことができる アレイである。 使用方法は、 試料 （ゲノム、 c DNAなど） を制限酵素 （Xb a I若しくは H i n d i I I ) で切断し、 アダプターをつけて、 そのアダプターに 特異的な 1種類のプライマー （Xb a I、 H i n d I I Iについてそれぞれ 1種 類ずつ） を用いて P CR反応により増幅し、 ラベリングを行う。 2枚のアレイは 各 SNPのアレルごとに相補的になるように設計されており、 ハイプリダイゼー シヨン後、 シグナルに基づいて試料の SNPを判定し、 また各アレルの発現量を シグナル強度又はシグナル比に基づいて比較することができる。 この D N Aチッ フの §キ糸口については、 http-V/www. affymetrix. co. jp/products/ arrays/ specific /100k.及ぴ htmlhttp://www. affymetrix. co. jp/pdf/Mapping_100K. pdf で公開さ れている製品情報及びデータシートを参照されたい。
また、 遺伝子多型は、 上述した以外にも、 当業者に公知のあらゆる方法によつ て検出することができる。 そのような方法としては、 遺伝子多型に特異的なブラ イマ一を用いる方法、 制限断片長多型 （RF L P) を利用する方法、 直接配列決 定法、 変性勾配ゲル電気泳動法 （DGGE) 、 ミスマッチ部位の化学的切断を利 用した方法 （C C M) 、 プライマー伸長法 （P E X) 、 インベーダー （I n v a d e r ) 法、 定量的リアルタイム P C R検出法 （T a q M a n法） 等を用いるこ とができる。
本方法においては、 簡便かつ迅速に、 できる限り多くの遺伝子多型の存在につ いて検出することができる D N Aチップ （マイクロアレイ） を使用することが好 ましい。 上述の通り、 遺伝子多型の違いに基づいて、 アレルごとの遺伝子発現量 （シグ ナル強度） を調べ、 各アレルからの遺伝子の発現量が有意に異なる場合に、 その 遺伝子多型を選択する。 具体的には、 発現量の低いアレルに対する発現量の高い アレルの発現量の比率を求め、 その比率が少なくとも 1 . 3、 好ましくは少なく とも 1 . 5である遺伝子多型を選択する。 ここで、 比率が 1とは、 両アレルから の遺伝子の発現量がほぼ等しいことを意味する。
上述のようにして、 遺伝子多型を利用して各アレルの発現量を比較し、 その結 果、 発現量に差異のある遺伝子多型は、 アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定 するための遺伝子多型として選択することができる。 このようにして選択した遺 伝子多型は、 以後、 その遺伝子多型を検出することのみで、 ある検体が発現量の 多いアレルを有するか否かなどを調べることが可能となる。 また、 後述するよう に、 アレル間で発現量が異なる遺伝子は、 特定の表現型と関係する可能性がある ため、 このようにして選択された遺伝子多型を利用して、 遺伝子の多型と表現型 との関係を明らかにすることができる。
2 . 表現型に関与する遺伝子多型の検索方法
遺伝子多型は、 個体間における形質や形態の多様性を引き起こす遺伝子の差異 であるため、 遺伝子多型と表現型とは何らかの関係を有する可能性がある。 しか しながら、 遺伝子多型は、 ゲノム上に存在する S N Pだけでも少なくとも約 1 0 0 0万 （2 0 0 4年 1 0月に報告された NCBI dbSNP buildl23) もあり、 このよ うな膨大な数の S N Pの中から特定の表現型に関与するものを選択することは困 難である。 一方、 アレル間で発現量が異なる遺伝子は、 特定の表現型と関係する 可能性がある。 従って、 上記方法により検索された、 アレル間で発現量が異なる 遺伝子を判定することができる遺伝子多型は、 他の遺伝子多型よりも表現型と関 係している可能性が高いと考えられる。
そこで、 本発明に係る表現型に関与する遺伝子多型の検索方法においては、 上 記方法により検索された遺伝子多型を用いて、 遺伝子多型又は遺伝子の発現量と 表現型との関係を詾ベることを特徴とする。 ここで、 表現型としては、 疾患の存 在 （病態及び重症度）、疾患の発症リスク、薬剤に対する応答性、食品に対する応 答性、 化学物質に対する応答性、 環境因子 （例えば紫外線、 温度等） などが挙げ られる。
具体的には、 本方法は、 当技術分野で周知のアソシエーション （関連） 法、 罹 患同胞対法などに基づいて行うことができる。 例えば、 ァソシエーション法にお いては、 特定の表現型を示す被験体と示さない被験体を用いて、 上記検索方法に おいて検索した遺伝子多型の出現頻度、 又は遺伝子の発現量との関係を調べる。 例えば、 特定の遺伝子多型を有している頻度が、 特定の表現型を示す被験体にお いて有意に高い場合には、 その遺伝子多型の差が、 表現型に関与する遺伝子の発 現量の量的調節に影響している、 又は、 遺伝子多型の遺伝暗号の変化によってァ ミノ酸に変化が生じ、 タンパク質の性質が変わったために、 それが表現型の発現 に影響している、などと判断することができる。また、罹患同胞対法においては、 同じ表現型 （例えば疾患） を有する家系 （兄弟姉妹） を比較して、 表現型関連遺 伝子の存在する染色体領域を特定する方法である。 これらの方法は、 例えば 「先 端のゲノム医学を知る」、 中村祐輔著、 羊土社、 2 0 0 0年、 第 1章などに記載さ れている。
例えば、 上記方法により検索された遺伝子多型を含む遺伝子は、 同一個体内の アレル間で発現量に差があるので、 そのアレルのタイプ （すなわち遺伝子多型の 種類） により個体間での発現量が異なることが推測される。 従って、 多数の個体 における遺伝子多型と発現量を測定し、 個体間の発現量が遺伝子多型情報と相関 することを確認することができる。
本方法により、 表現型に関与する遺伝子多型を検索することができる。 このよ うに検索された遺伝子多型は、 疾患の発症や発症リスクについて診断したり、 薬 剤の応答性を予め判定するために有用である。
また、 本発明においては、 上記方法により検索された遺伝子多型を用いて、 遺 伝子多型又は遺伝子の発現量と表現型との関係を調べることによって、 遺伝子多 型に関与する表現型を検索することもできる。
例えば、 ある遺伝子によりコードされるタンパク質が有する 「固有の性質」 （例 えば、 P PAR γが脂質代謝等に関与していることなど） により、 その遺伝子上 の遺伝子多型の違いにより表現型に違いがあることが推測される （例えば、 ΡΡ ARyについて、 糖尿病などの脂質代謝に関わる表現型に関与することが推測さ れる）。 従って、 実際に遺伝子多型と表現型とを評価 （validation) することによ り （例えば、 種々の個体における糖尿病薬ァクトスの反応性を、 P PARyの遺 伝子多型のタイピング結果と比較してみる）、実際にその関与を確認することがで きる。
本発明者は、 上述した方法を実施したところ、 実際に、 ヒ トのペルォキシソー ム増殖因子活性化受容体 γ (P P AR γ又は P P ARG) 遺伝子がアレル間で発 現量が異なることを見出し、 また、 各アレルからの発現量の違いを判定すること ができる遺伝子多型を見つけることができた。 実施例
以下、 実施例を用いて本方法をより詳細に説明するが、 本発明の技術的範囲は これら実施例に限定されるものではなレ、。
〔実施例 1〕
本実施例においては、 核内 RNAからの c DNA合成及ぴ増幅を行った。
Ε Βウィルスにて株化したリンパ球 B L 1 3 9 5 (ATCC CR L— 5 9 5 7)及ぴ B L 21 22 (ATCC CRL- 596 7) の総 RNAそれぞれ 1 n g を DNA a s e処理をした後に逆転写酵素 （Invitrogen社 Superscriptlll RT e nzyme)を用いて、添付プロトコールどおり逆転写して 1本鎖 c DNAを作製した。 得られた反応液 20 1 より 1 μ 1を精製なしに、 Amersham Bioscience より発 売されている商品名 Genomiphiのプロトコールどおりのランダムプライマー及ぴ p h i 29酵素の入った反応溶液に添加し、 30°Cにて 1 6時間の反応を行い、 それぞれ 2. 34 / g及び 2. 2 7 gの収量の c DNAを得た。
このようにして増幅した c DN Aの電気泳動を行った結果を図 1に示す。 図 1 のレーン 1及び 2は、 上述の通り p h i 2 9 DNAポリメラーゼを用いて調製し た c DNAを表す。
図 1に示すように、 1 OKb以上のところから約 8 Kbのあたりを中心に約 3 K bまでスメァを引く像が得られた （図 1のレーン 1〜2)。 これは、通常の mR N Aから合成した場合の c DNA長さの中央値が 2， 3 1 6 b pであることを考 えると、 長い c DNAだけが選択的に増幅されていることが示唆された。 すなわ ち、 p h i 2.9酵素を用いることにより、 鎖長の長い核内 RN Aからの c DNA を選択的に増幅できることが示された。
-〔実施例 2〕
本実施例においては、 実施例 1において調製した核内 RNAからの c DNAを 用いて、 S NPのタイビングと遺伝子発現量について実験を行った。
( 1 ) h i 29酵素を用いた核内 RNAからの c DNA増幅の確認
最初に、 実施例 1で増幅した c DN Aを用いて、 1 00 Kアレイのプロトコ一 ル（Affimetrix)にしたがって 2 50 n gから反応をスタートした。具体的には、 実施例 1に記載のように p h i 29で増幅した c DNAと、 同様に p h i 29で 増幅したゲノム DNAとを、 通常の 1 00 Kのプロトコールにしたがって増幅し た後、 そのシグナル強度の比 （ c DNAのシグナル強度/ゲノム DNAのシグナ ル強度） を取り、 その度数分布を調べた。 このようにしてシグナル強度の比を求 めることにより、 配列の差異が生み出す二次構造の差によって p h i 29によつ て増えやすい配列と増えにくい配列がある （増幅のバイアス） ί c DNAのシ グナル値を p h i 2 9で増幅したゲノムのシグナル値で割ることによって、 こう した増幅のバイアスを除くことができる。
その結果、 図 2及び 3に示すように、 シグナル比の低いところにはノイズと思 われる正規分布曲線に近い形があらわれ、 そこでは遺伝子のない領域 （図 2及ぴ 3における棒グラフの薄いグレー） に存在する遺伝子多型に基づくシグナル （プ ローブセット） が多かった。 一方、 図 2及び 3の右側に上述の正規分布曲線から 飛び出すようにシグナル比の強い部分が見られ（図 2及び 3中、矢印で示す部分）、 そこでは遺伝子のある （ほとんどはイントロン由来の） 領域に存在する遺伝子多 型に基づくシグナル （プローブセット） が多かった。 この度数分布の形及びプロ ーブセットとゲノム上の遺伝子との位置関係から、 このアツセィによって遺伝子 ( c DNA) 由来のシグナルとノイズが分離出来ており、 c DNAとゲノムとの シグナル比の測定によって、 シグナル比の高い部分を、 発現遺伝子 （主に核内 R NA由来の c DNA) によるシグナルであると考えてよいことがわかった。
また通常の発現解析用アレイ （Affymetrix U133plus2.0 array； http://www. a ffymetrix. co. jp/pdf/HG_DS. pdf)を用いて通常のマイクロアレイで測定される遺 伝子発現量と、 上記のように解析した c DNAとゲノム DNAのシグナル比に相 関があるか確かめた。
具体的には、 B L 2 1 22の総 RNAを調製し、 Affymetrix U133plus2.0 arr ayを用いて通常のプロ トコールどおりに角军析した。約 54000個のプローブセ ットの平均シグナル値を 1 00となるように全体を平均化した後、 シグナルが高 く発現量が高いと思われる遺伝子群 （スコア 1 00以上） とシグナルが低く発現 量が低いと思われる遺伝子群 （1 0以下） の 2群について、 その遺伝子のイント ロンを含めたゲノム上領域内にある 1 00 Kアレイ （ここでは Xb a l 5 OK アレイ） の SNPのプローブにおいて、 上述の情報によって得られた c DNAZ ゲノムシグナ 比を調べ、 その頻度分布を見た。
その結果、 図 4のように発現の低い （U 1 33 p l u s 2. 0でスコア 1 0以 下） ものは上記のノイズと思われる正規分布に近い形の部分にほとんどが入り、 逆に発現の高い （U 1 3 3 p l u s 2. 0でスコア 1 00以上） ものは大部分が 上記の右側の c DNA由来のシグナルを捕らえられていると考えられる部分に入 つていた。 以上より、 本実施例で測定した c DNA/ゲノム比の値と実際の遺伝 子発現量とには相関があり、 p h i 2 9により核内のスプライス前のイントロン を含む長い核内 RN Aをより選択に増幅できていると考えられた。
(2) アレル間における発現量の差異の検出
また B L 1 3 95及び B L 21 22 (女性由来）において各 2種類のアレル（A, B) ごとに、 上記 （1) のように cDNAとゲノムのシグナルの比を取ってァレ ル A及びアレル B由来の RN A ( c DNA) 量を測定し、 さらにアレル Aとァレ ル Bの間で発現量の違いがどれだけあるのかを二つの比 （アレル Aの c DNA/ ゲノム比とアレル Bの c DNA/ゲノム比との比) をとつた。 ここで、 比が 1の 場合には、 両アレルの発現量が等しいといえる。 その結果、 生理的に刷り込みに よる片側ァレルの不活化が良く知られている X染色体においては、 表 1に示すよ うに、 他の常染色体 （1. 6 9及び 2. 01) に比較して統計的に有意にアレル 間の発現差 （4. 24及び 5. 0 6) が見られた。 表
Figure imgf000017_0001
以上より、 p h i 29ポリメラーゼにより増幅された c DNAにおいて、 1 0 0Kアレイ （5 0K Xb a lアレイ） を試行して S NPに基づいてアレルの発 現量を調べることにより、 ァレル別の発現差を測定できることが確認された。
〔実施例 3〕
本実施例においては、 P PAR G遺伝子のアレル間の発現差を調べた。
実施例 2によってアレル間で発現差のあることが確認された遺伝子のうち、 P PARG (ペルォキシソーム増殖活性化受容体 γ) を選択することができた。
1 00Κアレイに含まれる 5 OK Xb a lアレイにはゲノム上の P PARG 遺伝子領域に合計 7箇所の S NPの位置にプローブセットが設計されている。 実 施例 2で行ったリンパ球 B L 1 3 95の解析では、 上流に近い 300 b p以内に 近接した r s 1 05 1 041 1、 r s 1 05 1 04 1 1及び r s 1 05 1 04 1 2 (NCB I d b S NPデータベース I D) の 3つの S N Pがゲノムのタイピ ングで多型で （すなわち二つのアレルが区別可能で） あった。 この 3つの SNP の P PARG遺伝子上の位置を図 5に示す。 図 5中、 白抜きの星印が、 P PAR G遺伝子のアレル間の発現量の差異を判定することができる SNP ( i n f o r m a t i v e SNP) である。
いずれの位置の S NPについても両アレル間の発現比 （アレル Aとアレル Bと の c DNAZゲノム比の比） は、 表 2に示すとおり 4倍以上であった。 表 2
Figure imgf000018_0001
この 3つの S NPを含む領域をダイレク ト ·シーケンス法によりァレルの存在 比を確認した。 その概要は図 6に示すが、 例えば B L 1 395のサンプルにおけ る r s l 051 041 0の場合には、 図のようにゲノム DNA ( c ) においては A/Cのへテロであり、 それは p h i 29で増幅されたゲノム DNAにおいても 変化はなかった。 一方、 p h i 29で増幅された c DNA ( a及び b ) において はァレル Aからのシグナルが低下しほぼァレル Cのみの波形になっている。 すな わち、 ゲノム上で r s 1 05 1 041 0は AZ Cのへテロであるが、 実際に発現 される遺伝子においては Cのアレルからの発現量が多いことがわかる。 この結果 は 50K X b a Iアレイの結果と一致していた。 B L 21 2 2のリンパ球では P PAR G遺伝子の発現は認められなかった。
またこの 3つの SNPについて、日本人 3 0人をダイレクト.シーケンス法によ つてタイピングし、抹消血リンパ球の P PARG遺伝子の発現との相関を調べた。 すなわち、 上記 3つの S NPのタイプと P PARG遺伝子の発現量との関係につ いて分析した。 P P AR G遺伝子の発現解析には Amersham Bioscience社発現解 析用アレイ C o d e L i n kを通常のプロトコ一ノレどおりに使用し、 各アレイの 総プローブのシグナルを中央値が 1となるように平均化した。
その結果、 図 7と図 8 A (表と度数分布） に示すように、 検体は、 日本人 30 人における存在頻度に応じて、 r s l 05 1 04 1 1、 r s l 05 1 041 1及 ぴ r s l 05 1 04 1 2においてそれぞれ C型、 A型及ぴ A型である存在頻度の 低いァレル （m) のホモ型、 r s l 05 1 041 1、 r s l 05 1 04 1 1及ぴ r s l 05 1 041 2においてそれぞれ A型、 G型及び G型である存在頻度の高 いアレル （M) のホモ型、 並びにこれらのヘテロ型に分類することができた。 存 在頻度の低いアレルのホモ型 （mm型とする。 図 7と図 8 Aで網掛けで表示） で はそれ以外 （mM及び MM型とする） のものに比して発現値が高く （mmの平均 値 1. 58に対しそれ以外 0. 80)、 特に発現の特に高い上位 3検体のうち 2検 体で mmであった。
以上の結果から、 これらの SNP (ハプロタイプ） の存在が P PAR G遺伝子 の発現量と相関し、 個人の P PARG活性、 P P ARGとの関連が示唆される病 気の診断、 スクリーニング及び P PARGを標的とする薬剤の応答性を調べるた めにこれらの S NPタイビングが有効であることが示された。
またこれらの 30人の検体で 3箇所の S NP (r s l 0 5 1 041 1、 r s l 05 1 04 1 1及ぴ r s l 05 1 04 1 2) においてメジャーアレル Mとマイナ 一アレル mの組み合わせが全て一致すること （図 7) より、 3つの SNPは完全 に連鎖不均衡の状態にあってハプロタイプを形成し、 図 8 Bに示すように二つの ハプロタイプ M及び mが存在しハプロタイプ mが P P AR Gの発現量の高いほう であると考えられた（図 7)。 このハプロタイプ内及びそれと連鎖不均衡にある周 辺の S NPを調べることによっても上記の目的が達成できると考えられた。 以上から、 本方法によって、 アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定 "ること ができる遺伝子多型を検索し、 そのようにして検索された遺伝子多型は、 遺伝子 の発現量と関係し、 そのため表現型にも影響を及ぼす可能性があることが示唆さ れた。 本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として 本明細書中にとり入れるものとする。 産業上の利用可能性.
本発明により、 アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定することができる遺伝 子多型を検索するための迅速かつ効率的な方法が提供される。 また、 そのように して検索された遺伝子多型は、 アレル間の発現量を識別することができるため、 その遺伝子が関与する表現型について解析するための有効な手段となり うる。 さ らに、 そのように検索された遺伝子多型と表現型 （疾患リスクや薬剤応答性） と の関係を見出すことができれば、 疾患の原因や有効な治療法などを検討すること ができると考えられる。 配列表フリーテキスト 配列番号 1〜 3：ヒ トペルォキシソーム増殖因子活性化受容体 Ύの部分配列（配 列番号 3における nは g又は tを表わす）

Claims

請 求 の 範 囲
1. 以下のステップ ：
(a ) 総 RN A又は核内 RN Aからランダムプライマーを用いた逆転写反応に より c DNAを合成するステップ、
(b) ランダムプライマー、 及び等温で反応する鎖置換型 DNAポリメラーゼ を使用して長い核内 RNA (—次転写産物） 由来の c DNAを選択的に増幅す るステップ、
(c) 増幅した c DNAに存在する遺伝子多型を検出するステップ、
(d) ゲノム DNAの遺伝子多型がヘテロ接合型であるゲノム上の位置の各ァ レルからの c DN Aの発現量を、 該遺伝子多型に基づいて比較するステップ、 (e) 各アレルからの c DNAの発現量が有意に異なる場合に、 比較に使用し た遺伝子多型を選択するステップ、
を含む、 アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定するための遺伝子多型の検索 方法。
2. DNAポリメラーゼが φ 29 DNAポリメラーゼである、 請求項 1記載の方 法。
3. ステップ （c) 及び （d) ヽ 増幅した c DNAを標識し、 遺伝子多型特異 的プローブを用いたハイブリダイゼーションを行い、 その反応に基づいて各ァ レルからの発現量を比較することを含む、 請求項 1又は 2記載の方法。
4. 遺伝子多型が一塩基多型 （SNP) である、 請求項 1〜 3のいずれか 1項に 記載の方法。
5. 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の方法により検索された遺伝子多型を用 いて、 遺伝子多型又は遺伝子の発現量と表現型との関係を調べることを含む、 表現型に関与する遺伝子多型の検索方法。
6.表現型が、疾患の病態及び重症度、疾患の発症リスク、薬剤に対する応答性、 食品に対する応答性、 化学物質に対する応答性、 並びに環境因子に対する応答 性からなる群より選択されるものである、 請求項 5記載の方法。
7. 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の方法により検索された遺伝子多型を用 いて、 遺伝子多型又は遺伝子の発現量と表現型との関係を調べることを含む、 遺伝子多型に関与する表現型の検索方法。
.表現型が、疾患の病態及び重症度、疾患の発症リスク、薬剤に対する応答性、 食品に対する応答性、 化学物質に対する応答性、 並びに環境因子に対する応答 性からなる群より選択されるものである、 請求項 7記載の方法。
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