WO2006054449A1

WO2006054449A1 - 生体分子の相互作用試験装置、生体分子の相互作用試験方法、生体分子の融解温度測定方法、核酸の配列検知方法、生体分子を相互作用させる方法、および、生体分子を移動させる方法

Info

Publication number: WO2006054449A1
Application number: PCT/JP2005/020295
Authority: WO
Inventors: Hideo Tashiro; Yasumitsu Kondoh; Satoru Hatakeyama; Tikara Koike; Takayuki Shimamura
Original assignee: RIKEN
Current assignee: RIKEN
Priority date: 2004-11-18
Filing date: 2005-11-04
Publication date: 2006-05-26
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Description

明細書

生体分子の相互作用試験装置、生体分子の相互作用試験方法、生体分子の融解温度測定方法、核酸の配列検知方法、生体分子を相互作用させる方法、および、生体分子を移動させる方法

技術分野

[0001] 本発明は、簡便かつ迅速に、ターゲット生体分子とプローブ生体分子との相互作用を試験し得る装置、および相互作用試験方法に関する。更に、本発明は、前記方法を用いる、生体分子の融解温度測定方法および核酸の配列検知方法に関する。更に、本発明は、基板上に固定化された生体分子と溶液に含まれる生体分子とを相互作用させる方法、および、溶液に含まれる生体分子を一方向に選択的に移動させる方法に関する。

背景技術

[0002] 遺伝子診断や病原菌の特定、あるいは一塩基多型の検出等、ある種の核酸 (ターゲット核酸)を検出する目的で、プローブ核酸とターゲット核酸とのハイブリダィゼーシヨンが利用されている。近年、多数のプローブ核酸を基板に固定した DN Aチップや DNAマイクロアレイが実用化されるようになり、ターゲット核酸の検出に使用されている。

[0003] DNAチップや DNAマイクロアレイの作製においては、基板に DNAを多数スポットとして整列させて固定ィ匕する必要がある。 DNAの固定化には、例えば、末端をチォール修飾した一本鎖 DNAを、例えば、金基板に固定ィ匕する方法が取られている。そして、固定ィ匕された DNAに被検体であるターゲット DNAを作用させ、ハイブリダィゼーシヨンの有無を検出する。ハイブリダィゼーシヨンの有無は、例えば、蛍光法を用いて、蛍光標識したターゲット DNAとハイブリダィズした固定化 DNAのスポットの蛍光を測定することによって検出することができる。

[0004] 基板上に固定化されたプローブ DNAと試料ターゲット DNAをハイブリダィゼーションさせるためには、例えば、プローブ DNAを固定化した DNAマイクロアレイ上に、タ一ゲット DNAを含むハイブリダィゼーシヨン溶液を滴下し、溶液が乾かなヽように力バーガラスをかけて密閉した湿箱に入れ、ターゲット DNAおよびプローブ DNAに合わせた適温でハイブリッド形成反応を行う方法が用いられている（特開 2003— 1564 42号公報 (以下、「文献 1」という）参照)。しかし、このような方法では、ハイブリッド形成をリアルタイムで観察することはな力つた。

[0005] それに対し、特表平 10— 505410号公報（以下、「文献 2」という）には、 DNAが固定ィ匕されたアレイをチャンバ一内に封入したバイオアレイチップ反応装置が開示されている。この装置は、チャンバ一内へ溶液の送液が可能な構造を有している。更に、文献 2には、この装置の基板またはカバーが透明であり得ることが記載されている。このような文献 2に記載の装置によれば、チャンバ一内へ溶液を送液しつつ、透明な基板側またはカバー側から、ハイブリッド形成をリアルタイムで観察することが可能であると考免られる。

[0006] し力し、プローブ DNAとターゲット DNAをハイブリダィゼーシヨンさせるためには、通常、十数時間を要し、し力も、多量の試料ターゲット DNAが必要とされる。そのため、文献 2に記載の装置において、ハイブリッド形成をリアルタイムで観察することができるとしても、ハイブリッド形成には長時間を要するため、迅速な観察を行うことは困難である。し力も、プローブ DNAとターゲット DNAをハイブリダィゼーシヨンさせるためには、多量の試料を調製しなければならな、。

[0007] また、プローブ DNAとターゲット DNAをハイブリダィゼーシヨンさせるためには、通常、十数時間を要し、し力も、多量の試料ターゲット DNAが必要とされる。そのため、前述の文献 1に記載の方法では、ハイブリッド形成には長時間を要するため、迅速な観察を行うことは困難である。し力も、プローブ DNAとターゲット DNAをハイブリダィゼーシヨンさせるためには、多量の試料を調製しなければならない。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明の第一の目的は、多量の試料および多くの時間と労力を必要とせず、生体分子間の相互作用を迅速に形成することができ、し力も、生体分子の相互作用をリアルタイムで検出することができる手段を提供することである。

本発明の第二の目的は、生体分子マイクロアレイにおける相互作用を促進し、反応の高速ィ匕および高感度化が可能な手段を提供することである。

課題を解決するための手段

上記第一の目的を達成するための本発明の第一の態様は、以下の通りである。

[1] 基板上に生体分子が固定化された生体分子マイクロアレイ（1)、および、前記マイクロアレイの生体分子が固定化された面に対向するように設けられた透明電極 (2)

(以下、「対向電極」 t 、う）を有する生体分子の相互作用試験装置であって、前記装置は、前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に、非導電性スぺーサ一（3)を有し、前記マイクロアレイ（1)、前記スぺーサー（3)、および前記対向電極（2

)によってキヤビティ (4)が形成されており、

前記マイクロアレイ（1)は、生体分子が固定化された面の少なくとも一部に導電性物質表面（6)を有し、かつ、前記キヤビティ (4)に通じる貫通孔（5)を 2つ有し、一方の貫通孔はキヤビティへ溶液を注入するための孔であり、他方の貫通孔はキヤビティ力も溶液を排出するための孔である、前記装置。

[2] 前記マイクロアレイ（1)の側から、前記マイクロアレイ（1)上の導電性物質表面（ 6)および対向電極 (2)と外部電源とを接続するための手段を有する、 [1]に記載の装置。

[3] 前記マイクロアレイ（1)上の導電性物質表面 (6)と少なくとも一部が接触し、かつ、前記対向電極 (2)とは接触しない導電性部材 (7)を更に有し、前記基板上の導電性物質表面 (6)は、前記導電性部材 (7)を介して外部電源と接続される、 [2]に記載の装置。

[4] 前記導電性部材 (7)を構成する導電性物質は、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、導電性酸化物、または導電性ブラスチックである、 [3] に記載の装置。

[5] 前記マイクロアレイは、前記導電性部材（7)に通じる貫通孔（8)および前記対向電極（2)に通じる貫通孔（9)を有する、 [3ほたは [4]に記載の装置。

[6] 前記非導電性スぺーサー（3)は、前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間隔が均一になるように配置される、 [1]〜[5]のいずれかに記載の装置。

[7] 前記マイクロアレイ（1)の生体分子が固定化された面と前記対向電極 (2)の前記マイクロアレイ（1)の生体分子が固定化された面と対向する表面との距離が、 10〜 300 μ mである、 [1]〜[6]のいずれかに記載の装置。

[8] 前記マイクロアレイ上の導電性物質表面を構成する導電性物質が、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチックである [1]〜[7]のいずれかに記載の装置。

[9] 前記基板は、基板全体が導電性物質からなるか、または、基板表面に導電性物質被覆層を有する、 [1]〜[8]のいずれかに記載の装置。

[10] 前記導電性被覆層を有する基板が、ガラス、石英、金属、シリコン、またはブラスチック力もなる [9]に記載の装置。

[11] 前記非導電性スぺーサー（3)は、その両面に接着剤層を有する、 [1]〜[10]のいずれかに記載の装置。

[12] 前記接着剤は、光硬化性榭脂を含む、 [11]に記載の装置。

[13] 温度制御手段を更に有する、 [1]〜[12]のいずれかに記載の装置。

[14] 前記基板は、基板表面から突出し、かつ頂上にスポット用平面を有する生体分子固定化用スポット（以下、「突出スポット部」と、う）を有し、

少なくとも前記突出スポット部は導電性物質表面を有し、

前記スポット用平面の導電性物質表面に生体分子が固定化されており、かつ前記基板は、前記基板上の突出スポット部以外の表面に、前記突出スポット部の導電性物質表面と通電可能な端子を有する、 [1]〜[13]のいずれかに記載の装置。

[15] 前記基板上の突出スポット部以外の表面は、導電性物質被覆層を有し、前記端子は、前記導電性物質被覆層に含まれるか、または、前記導電性物質被覆層と通電可能である、 [14]に記載の装置。

[16] 前記基板上の突出スポット部以外の表面は、導電性物質被覆層を有し、前記導電性物質被覆層と突出スポット部の導電性物質表面とは、一体の導電性物質被覆層として設けられている、 [14]または [15]に記載の装置。

[17] 前記基板が、少なくとも、前記突出スポット部周辺の基板表面、突出スポット部側面、およびスポット用平面が、導電性物質力もなる基板である、 [14]〜[16]のいずれかに記載の装置。 [18] 前記突出スポット部周辺の基板表面が、略 V字型底面を形成する、 [17]に記載の装置。

[19] 前記基板が、隣り合う突出スポット部が、突出スポット部側面によって隣接しており、かつ、少なくとも、前記突出スポット部側面およびスポット用平面が、導電性物質力もなる基板である、 [14]〜[16]のいずれかに記載の装置。

[20] 前記突出スポット部の高さ力 10〜500 111でぁる、[14]〜[19]のぃずれかに記載の装置。

[21] 前記突出スポット部頂上のスポット用平面と前記突出スポット部側面とのなす角が、 90度以上である、 [14]〜[20]のいずれかに記載の装置。

[22] 前記生体分子固定ィ匕用スポットが粗面化されている、 [14]〜[21]のいずれかに記載の装置。

[23] 前記生体分子は、 DNA、 RNA、 PNA、蛋白、ポリペプチド、糖化合物、脂質、天然低分子、および合成低分子力もなる群力も選ばれる少なくとも一種である、 [1] 〜[22]の、ずれかに記載の装置。

[24] 基板上に生体分子が固定化された生体分子マイクロアレイ（1)と前記マイクロアレイの生体分子が固定化された面に対向するように設けられた透明電極 (2) (以下、「対向電極」という）を有し、前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に、非導電性スぺーサー（3)を有し、前記マイクロアレイ（1)、前記スぺーサー（3)、および前記対向電極（2)によってキヤビティ (4)が形成されている装置を用いる、生体分子の相互作用試験方法であって、

前記マイクロアレイ（1)は、生体分子が固定化された面の少なくとも一部に導電性物質表面 (6)を有し、

前記マイクロアレイ（1)と対向電極 (2)との間に電界を印加すること、および、前記キヤビティ (4)へ、ターゲット生体分子を含む溶液および Zまたはターゲット生体分子を含まなヽ溶液を送液しながら、前記マイクロアレイ上の生体分子と前記ターゲット生体分子との相互作用を前記対向電極を通して光学的に検出すること、を含む、前記方法。

[25] 基板上に生体分子が固定化された生体分子マイクロアレイ（1)と前記マイクロアレイの生体分子が固定化された面に対向するように設けられた透明電極 (2) (以下、「対向電極」という）を有し、前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に、非導電性スぺーサー（3)を有し、前記マイクロアレイ（1)、前記スぺーサー（3)、および前記対向電極（2)によってキヤビティ (4)が形成されている装置を用いる、生体分子の相互作用試験方法であって、

前記マイクロアレイ（1)と対向電極 (2)との間に電界を印加すること、および前記キヤビティ (4)に、ターゲット生体分子を含む溶液を充填し、所定時間保持した後、前記溶液を排出することを含み、

前記溶液の保持中または排出後に、前記マイクロアレイ上の生体分子と前記ターゲット生体分子との相互作用を前記対向電極を通して光学的に検出する、前記方法

[26] 前記溶液を排出した後、または排出しながら、前記キヤビティ内にターゲット生体分子を含む溶液および Zまたはターゲット生体分子を含まない溶液を新たに充填することを含む、 [25]に記載の方法。

[27] 前記マイクロアレイ（1)の側から、前記マイクロアレイ（1)上の導電性物質表面 (6)および対向電極 (2)と外部電源とを接続し、前記マイクロアレイ（1)と対向電極 (2 )との間に電界を印加する、 [24]〜[26]のいずれかに記載の方法。

[28] 前記装置が、請求項 1〜23のいずれか 1項に記載の装置である、 [24]〜[27] のいずれかに記載の方法。

[29] 前記マイクロアレイ（1)が有する前記キヤビティに通じる貫通孔（5)を通して、前記キヤビティへ溶液を注入し、および Zまたは、前記キヤビティカゝら溶液を排出する、 [28]に記載の方法。

[30] 前記装置が、 [5]〜[23]のいずれかに記載の装置であり、前記導電性部材 (7) に通じる貫通孔（8)および対向電極 (2)に通じる貫通孔（9)を通して、前記導電性部材 (7)および対向電極 (2)と外部電源の端子とを接続する、 [24]〜[27]のいずれかに記載の方法。 [31] 前記マイクロアレイ（1)が有する前記キヤビティに通じる貫通孔（5)を通して、前記キヤビティへ溶液を注入し、および Zまたは、前記キヤビティカゝら溶液を排出する、 [30]に記載の方法。

[32] 前記マイクロアレイに固定された生体分子および Zまたは前記ターゲット生体分子が蛍光標識されており、かつ、前記マイクロアレイ上の生体分子とターゲット生体分子との相互作用を、蛍光によって検出する、 [24] [31]のいずれかに記載の方法

[33] [14] [23]のいずれかに記載の装置を用いる、生体分子の相互作用試験方法であって、

前記マイクロアレイ（1)と対向電極 (2)との間に電界を印加すること、および、前記キヤビティ (4) ターゲット生体分子を含む溶液および Zまたはターゲット生体分子を含まな溶液を送液しながら、前記マイクロアレイ上の生体分子と前記ターゲット生体分子との相互作用を前記対向電極を通して共焦点型検出器によって検出することを含む、前記方法。

[34] [14] [23]のいずれかに記載の装置を用いる、生体分子の相互作用試験方法であって、

前記溶液の充填中または排出後に、前記マイクロアレイ上の生体分子と前記ターゲット生体分子との相互作用を前記対向電極を通して共焦点型検出器によって検出する、前記方法。

[35] 前記溶液を排出した後、または排出しながら、前記キヤビティ内にターゲット生体分子を含む溶液および Zまたはターゲット生体分子を含まない溶液を新たに充填することを含む、 [34]に記載の方法。

[36] 前記マイクロアレイ上の生体分子および Zまたは前記ターゲット生体分子が蛍光標識されて、る、 [33] [35]の、ずれかに記載の方法。

[37] 前記共焦点型検出器によって、マイクロアレイ表面の突出スポット部とそれ以外の部分の高さおよび zまたは形状の差による反射光強度の相違から、マイクロアレィ上の前記突出スポット部を反射像として検出する、 [33]〜[36]のいずれかに記載の方法。

[38] 前記反射像として検出された突出スポット部力の蛍光を検出することによって、生体分子の相互作用を検出する、 [37]に記載の方法。

[39] 前記マイクロアレイ（1)が有する前記キヤビティに通じる貫通孔（5)を通して、前記キヤビティへ溶液を導入し、および Zまたは、前記キヤビティカゝら溶液を排出する、 [33]〜[38]のいずれかに記載の方法。

[40] 前記導電性部材（7)に通じる貫通孔（8)および対向電極 (2)に通じる貫通孔（ 9)を通して、前記導電性部材 (7)および対向電極 (2)と外部電源の端子とを接続する、 [33]〜[39]のいずれかに記載の方法。

[41] 前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に印加される電界力 0. 01-10 MVZmである、 [24]〜[40]のいずれかに記載の方法。

[42] 前記ターゲット生体分子を含む溶液力フエ-ルァラニン、ヒスチジン、カルノシン、およびアルギニン力なる群力選ばれる少なくとも 1つのバッファー物質を含む、 [24]〜[41]のいずれかに記載の方法。

[43] [24]〜[42]のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、生体分子の融解温度測定方法。

[44] [24]〜[42]のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、核酸の配列検知方法。

上記第二の目的を達成するための本発明の第二の態様は、以下の通りである。

[45] 基板表面に生体分子が固定化されたスポットを 1つ以上有する生体分子マイクロアレイと、前記基板表面と対向する電極 (以下、「対向電極」という）との間にターゲット生体分子を含む溶液を配置し、前記基板表面に固定化された生体分子とターゲット生体分子とを相互作用させる方法であって、

前記マイクロアレイは、生体分子が固定化された面の少なくとも一部に導電性物質表面を有し、

前記導電性物質表面と対向電極との間に、周波数 0. 01〜： LOHzで電圧を印加して、前記相互作用を促進することを特徴とする、前記方法。

[46] 少なくとも一部に導電性物質表面を有する基板と、前記導電性物質表面と対向する電極 (以下、「対向電極」という）との間に配置された溶液に含まれる生体分子を移動させる方法であって、

前記導電性物質表面と対向電極との間に、周波数 0. 01〜： LOHzで電圧を印加して、前記基板または対向電極に向けて前記生体分子を移動させることを特徴とする方法。

[47] 前記電圧が 0. 1〜4Vである、 [45]または [46]に記載の方法。

[48] 前記溶液は、カチオンを含む、 [45]〜[47]のいずれかに記載の方法。

[49] 前記カチオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、マグネシゥムイオン、カルシウムイオン、およびアルミニウムイオン力なる群力選ばれる少なくとも一種である、 [48]に記載の方法。

[50] 前記溶液中のカチオン濃度は、 1〜： LOOOmMの範囲である、 [48]または [49] に記載の方法。

[51] 前記電圧は、パルス直流電圧である、 [45]〜[50]のいずれかに記載の方法。

[52] 少なくとも前記基板表面が負に帯電するように電圧を印加することを含む、 [45 ]〜[51]のいずれかに記載の方法。

[53] 前記基板は、基板全体が導電性物質からなるか、または、基板表面に導電性物質被覆層を有する、 [45]〜[52]のいずれかに記載の方法。

[54] 前記導電性物質は、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチックである、 [45]〜[53]のいずれかに記載の方法。

[55] 前記対向電極は、電極全体が、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチックカゝらなるカゝ、または、前記基板の導電性物質表面と対向する表面に、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチックからなる導電性物質被覆層を有する、 [45]〜[54]のいずれか〖こ記載の方法。

[56] 前記対向電極は、透明電極である、 [45]〜[55]のいずれかに記載の方法。 [57] 前記基板と対向電極との間に非導電性スぺーサーを配置し、前記基板、対向電極、および非導電性スぺーサ一によつて囲まれた空間に、前記溶液を充填する、 [ 45]〜[56]の!、ずれかに記載の方法。

[58] 前記導電性物質表面と対向電極との間に電圧が印加されない間、前記溶液を攪拌することを含む、 [57]に記載の方法。

[59] 前記生体分子は、 DNA、 RNA、 PNA、蛋白、ポリペプチド、糖化合物、脂質、天然低分子、および合成低分子力もなる群力も選ばれる少なくとも一種である、 [45 ]〜[58]の、ずれかに記載の方法。

発明の効果

[0011] 本発明の第一の態様によれば、多量の試料および多くの時間と労力を必要とせず

、生体分子間の相互作用を迅速に形成することができ、し力も、生体分子の相互作用をリアルタイムで検出することができる。

更に、本発明の第一の態様によれば、生体分子の融解温度の測定および核酸の配列検知、例えば、一塩基多型の検出を行うことができる。

[0012] 本発明の第二の態様によれば、アレイ表面近傍にターゲット生体分子を濃縮し、生体分子の相互作用の高速化と高感度化を実現することができる。

発明を実施するための最良の形態

[0013] [第一の態様]

以下、本発明の第一の態様について更に詳細に説明する。

[生体分子の相互作用試験装置]

本発明の生体分子の相互作用試験装置について、図 1に基づいて説明する。図 1 は、本発明の装置の概略図である。

本発明の生体分子の相互作用試験装置は、基板上に生体分子が固定化された生体分子マイクロアレイ（1)、および、前記マイクロアレイの生体分子が固定ィ匕された面に対向するように設けられた透明電極 (2) (対向電極)を有し、前記マイクロアレイ（1) と対向電極（2)との間に、非導電性スぺーサー（3)を有し、前記マイクロアレイ（1)、前記スぺーサー（3)、および前記対向電極 (2)によってキヤビティ (4)が形成されており、前記マイクロアレイ（1)は、生体分子が固定化された面の少なくとも一部に導電性物質表面（6)を有し、かつ、前記キヤビティ (4)に通じる貫通孔（5)を 2つ有し、一方の貫通孔はキヤビティへ溶液を注入するための孔であり、他方の貫通孔はキヤビテイカ溶液を排出するための孔である。

[0014] 前記生体分子は、 DNA、 RNA、 PNA、蛋白、ポリペプチド、糖化合物、脂質、天然低分子、および合成低分子力なる群力選ばれる少なくとも一種であることができ、目的に応じて選択することができる。

ここで、糖ィ匕合物としては、例えば、単糖、オリゴ糖、多糖、糖鎖複合体、糖蛋白質、糖脂質、およびそれら誘導体などを挙げることができる。

脂質としては、例えば、脂肪酸、リン脂質、糖脂質、グリセリドなどを挙げることができる。

天然低分子としては、例えば、ホルモン分子や抗生物質、毒物、ビタミン類、生理活性物質、二次代謝産物などを挙げることができる。

合成低分子としては、例えば、天然低分子の合成物、およびそれら誘導体などを挙げることができる。

[0015] 本発明の装置によって試験され得る生体分子の相互作用としては、例えば、プロ一ブ核酸とターゲット核酸とのハイブリダィゼーシヨン、抗原抗体相互作用、レセプタ一一リガンド相互作用、タンパクータンパク相互作用、 DNA タンパク相互作用を挙げることができる。

[0016] 前記マイクロアレイ（1)は、基板上に生体分子を固定化することによって作製されるものであり、生体分子が固定化された面の少なくとも一部に導電性物質表面 (6)を有する。前記導電性物質表面 (6)を構成する導電性物質は、例えば、金属 (例えば、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム）、導電性酸ィ匕物（例えば、 In O ZSnO )および導電性プラスチック (例えば、ポリアセチレン)であ

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ることができる。なお、後述するように、前記基板が突出スポット部を有するものであり、反射像によって自動グリツティングを行う場合には、前記導電性物質は、光を反射する性質を有する物質から選択する。

また、金属とチオール基との結合を利用して、プローブ核酸の固定化を行う場合は、前記導電性物質は、チオール基と結合性を有する金属から選択する。 [0017] 前記基板は、基板表面から突出し、かつ頂上にスポット用平面を有する生体分子固定ィ匕用スポット（突出スポット部）を有し、少なくとも前記突出スポット部は導電性物質表面を有し、前記スポット用平面の導電性物質表面に生体分子が固定化されており、かつ前記基板は、前記基板上の突出スポット部以外の表面に、前記突出スポット部の導電性物質表面と通電可能な端子を有するものであることができる。前記基板上の突出スポット部以外の表面は、導電性物質被覆層を有することができ、前記端子は、前記導電性物質被覆層に含まれるか、または、前記導電性物質被覆層と通電可能であることができる。更に、この導電性物質被覆層と突出スポット部の導電性物質表面とは、一体の導電性物質被覆層として設けられていることが好ましい。そのような基板としては、少なくとも、前記突出スポット部周辺の基板表面、突出スポット部側面、およびスポット用平面が、導電性物質からなる基板 (以下、基板 Iという）、または、隣り合う突出スポット部は、突出スポット部側面によって隣接しており、かつ、少なくとも、前記突出スポット部側面およびスポット用平面力導電性物質からなる基板 (以下、基板 Πという）を挙げることができる。

[0018] 基板 Iおよび Πでは、生体分子固定化用スポットが、突出スポット部の頂上の平面に設けられている。そのため、基板 Iおよび Πでは、前記突出スポット部頂上のスポット用平面（生体分子固定ィ匕用スポット）は、前記突出スポット部周辺の基板表面より一段高い位置にあり、両者間に高低差が生じる。

[0019] 一方、本発明において、後述するように生体分子の相互作用の試験に用いられ得る共焦点型検出器は、試料上の焦点面からの反射光や蛍光を、光学系の結像面に置かれたピンホールに通して検出する。図 2に、共焦点型検出器 40の光学系の概略図を示す。図 2の実線 aは、入射光を表す。実線 bは、焦点面からの反射光または蛍光を表し、破線は、非焦点面からの反射光または蛍光を表す。共焦点型検出器 40 では、マイクロアレイ 41上の焦点面力も反射した反射光、および、試料上の焦点面から放出された蛍光は、対物レンズ 42を通ってビームスプリツター 43へ入射し、ビームスプリツター 43によって、検出レンズ 44へ垂直に入射するように光路が修正され、検出レンズ 44を経て、結像面 45へ入射する。共焦点型検出器 40は、試料上での焦点力結像面でも焦点となるように設計されている。よって、試料上の焦点面からの光は、結像面 45で焦点を結び、ピンホール 46を通過して、検出部 47で検出される。一方、試料上の非焦点面からの光は、結像面 45で焦点を結ばないため、大部分がピンホール 46を通過せず、検出部 7において検出されない。このように、共焦点型検出器によれば、焦点面からの光を、選択的に検出することができる。

[0020] 前記基板 Iでは、前記突出スポット部周辺の基板表面と、前記突出スポット部頂上のスポット用平面 (生体分子固定ィ匕用スポット）との高低差が、生体分子とターゲット生体分子との相互作用の検出において使用する共焦点型検出器の焦点深度以上であれば、共焦点型検出器の焦点を、突出スポット部頂上のスポット用平面の高さに合わせることにより、検出器において、突出部周辺の基板表面からの蛍光や反射光よりも、突出スポット部頂上のスポット用平面力もの蛍光や反射光を、より高い強度で検出することができる。従って、基板 Iの突出スポット部頂上のスポット用平面に生体分子を固定ィ匕したマイクロアレイを含む本発明の装置によれば、スポット上の情報、例えば、ターゲット生体分子との相互作用の有無を、高感度で検出することができる

[0021] 前記基板 IIは、隣り合う突出スポット部力突出スポット部側面によって隣接しており、かつ、少なくとも、前記突出スポット部側面およびスポット用平面が、導電性物質からなることを特徴とする。基板 IIの一例を、図 3に示す。

[0022] 前記基板 Iおよび Πにおいて、前記突出スポット部頂上のスポット用平面と前記突出スポット部側面とのなす角は、 90度以上であることが好ましい。好ましくは、 90〜135 度である。図 4 (a)は、そのような基板の一部の断面図である。ここで、「突出スポット部頂上のスポット用平面と突出スポット部側面とのなす角」とは、図 4 (a)における角度 Θをいう。角度 Θは、例えば、突出スポット部を、突出スポット部周辺の基板表面に対して垂直に切断し、その断面力求めることができる。

[0023] このように、基板 Iおよび Πにおいて、突出スポット部頂上のスポット用平面と突出スポット部側面とのなす角が 90度以上であることにより、即ち、突出スポット部底面の大きさ力突出スポット部頂上のスポット用平面の大きさ以上であることにより、グリツティングを自動で行って、生体分子固定ィ匕用スポットの位置および大きさを特定することができるという利点がある。以下に、この点について、詳述する。 [0024] 図 4 (a)に示すように、突出スポット部頂上のスポット用平面と突出スポット部側面とのなす角が 90度以上である場合、共焦点型の検出器を使用して反射光を検出する際に、突出スポット部頂上のスポット用平面に対して垂直な方向から照射した光（図 4 (a)に矢印で表される光）に対する突出スポット部側面力の反射光は、入射光と同一方向には反射しない。一方、突出スポット部頂上のスポット用平面からの反射光は、入射光と同一方向に反射する。このため、共焦点型検出器では、突出スポット部頂上のスポット用平面からの反射光のみが検出され、側面からの反射光は検出されない。こうして得られた反射像には、突出スポット部頂上のスポット用平面に相当する像 1S 反射像として得られ、突出スポット部側面に相当する部分は、反射光がほとんど検出されないので黒色の縁取りとして表れる。この反射像では、黒い縁取りの内部が生体分子スポットに相当するため、この反射像により、スポットの大きさおよび位置を特定することができる。本発明では、このような原理により、自動グリツティングを行うことが可能である。

[0025] また、基板 Iにおいて、突出スポット部の高さが相互作用の検出に使用する共焦点型検出器の焦点深度以上である場合は、共焦点型検出器の焦点を、突出スポット部頂上のスポット用平面の高さに合わせれば、突出スポット部周辺の基板表面力の反射光は、焦点が合わないため、突出スポット部頂上のスポット用平面からの反射光よりもはるかに弱い強度でし力、検出されない。本発明では、この高低差を利用して自動グリツティングを行うことも可能である。但し、前記突出スポット部の高さが相互作用の検出に使用する共焦点型検出器の焦点深度より小さい場合であっても、前述のように、反射像において、突出スポット部側面に相当する部分が黒色の縁取りとして表れれば、スポットの大きさおよび位置を特定することが可能である。

[0026] また、基板 Iでは、前記突出スポット部頂上のスポット用平面と突出スポット部側面とのなす角が 90度未満であっても、突出スポット部の高さが相互作用の検出に使用する共焦点型検出器の焦点深度以上である場合は、スポット用平面と、突出スポット部周辺の基板表面との高低差を利用して、反射像によって、スポット用平面の位置および大きさを特定し、自動でグリツティングを行うことができる。前記突出スポット部頂上のスポット用平面と突出スポット部側面とのなす角が 90度である場合、前記突出スポット部の形状は、例えば、円柱状または角柱状であることができる。

[0027] さらに、基板 Iは、前記突出スポット部頂上のスポット用平面と前記突出スポット部側面とのなす角が、 90度以上であり、かつ、前記突出スポット周辺の基板表面力略 V 字型底面を形成する基板であることもできる。このような基板では、共焦点型検出器で検出されるスポット用平面からの反射光強度力基板上のスポット用平面以外の部分からの反射光強度より強くなるため、この反射光強度の違いにより、スポット用平面の位置および大きさを特定することができる。図 5は、「略 V字型底面」を有する基板の一部の拡大図である。本発明において、「略 V字型底面」とは、例えば、隣り合う突出スポット部間の突出スポット部周辺の基板表面が平面ではなぐ図 5に示すように、略 V字を形成して、ることを、う。

[0028] 更に、基板 Iは、少なくとも、前記突出スポット部周辺の基板表面、突出スポット部側面、およびスポット用平面が、導電性物質からなる。製造の容易さや製造コストを考慮すれば、基板 Iは、基板上の、前記突出スポット周辺以外の基板表面も、導電性物質力もなるものであることが好ましい。また、基板 IIは、少なくとも突出スポット部側面および突出スポット部平面が、導電性物質からなる。

[0029] 本発明では、基板 Iにおいては、少なくとも、突出スポット部周辺の基板表面、突出スポット部側面、およびスポット用平面が、基板 II〖こおいては、少なくとも、突出スポット部側面およびスポット用平面が、導電性物質からなることにより、後述するように、基板上に生体分子を固定ィ匕することによって作製されたマイクロアレイ（1)に対向する電極を設け、電界を印加することによって、スポット用平面に固定化された生体分子とターゲット生体分子との相互作用を促進することができる。例えば、ターゲット生体分子の濃度が低い場合でも、良好な相互作用結果を得ることができ、また、濃度が同一の場合には、より短時間で所定の相互作用結果を得ることができる。

[0030] また、第一の態様では、前記導電性物質が、光を反射する性質を有するものであれば、反射光によって、生体分子固定化スポットの大きさおよび位置を特定し、自動でグリツティングを行うことができる。この点については後述する。

[0031] 本発明において、前記突出スポット部の高さは、相互作用の検出において使用する共焦点型検出器の焦点深度以上の高さになるように、適宜設定することができる。通常の共焦点型検出器の焦点深度を考慮すると、前記突出スポット部の高さは、例えば、 10〜500 mとすることができる。但し、前述のように、基板上の突出スポット部頂上のスポット用平面とそれ以外の部分との形状の差による反射光強度の相違を検出することによって自動グリツティングを行う場合は、前記突出スポット部の高さが相互作用の検出に使用する共焦点型検出器の焦点深度より小さくても、自動グリツテイングが可能である。この点については、後述する。

[0032] また、前記突出スポット部の高さを決定する際は、生体分子のスポット形成 (スタンピング）に使用するニードルの直径や、プローブ核酸等の生体分子溶液のスポット量も考慮する必要がある。例えば、直径 100 mの円形の突出スポット部に対して直径 1 30 m程度の-一ドルを用いて生体分子をスポットする場合、突出スポット部の高さ力 S 15 m以上であれば、表面張力のため、突出スポット部頂上のスポット用平面から生体分子溶液が流れ出すことなぐ固定ィ匕用スポットのみに、生体分子が固定化されるため、好ましい。

[0033] 突出スポット部を有する基板において、突出スポット部頂上のスポット用平面の形状は、スポットされた生体分子を保持し得る形状であれば、いずれの形状であることもでき、例えば、円形や正方形であることができる。前記スポット用平面の大きさは、スポットに用いる-一ドルやスポットする生体分子溶液の量に応じて適宜設定することができ、例えば、 10〜500 /ζ πιとすることができる。ここで、「スポット用平面の大きさ」とは、例えば、スポット用平面の形状が円形の場合は、その直径をいい、スポット用平面の形状が正方形の場合は、その一辺の長さをいう。

突出スポット部底面の形状は、特に限定されないが、製造の容易さ等を考慮すれば、スポット用平面と同様の形状であることが好ましい。図 4 (b)は、突出スポット部を有する基板上の突出スポット部の概略図である。ここで、「突出スポット部底面の形状」とは、図 4 (b)の斜線部をいう。

[0034] 前記突出スポット部頂上のスポット用平面は、粗面化されていてもよい。例えば、前記突出スポット部頂上のスポット用平面は、深さ方向と略水平方向に、相互作用の検出において使用する共焦点型検出器の焦点深度以内の深さの凹凸を有していてもよい。図 6に、粗面化されたスポット用平面の一例 (部分拡大図）を示す。粗面化されたスポット用平面の一例としては、図 6に示すような、数/ z m角の格子状の形状を設けたスポット用平面を挙げることができる。このように、スポット用平面が粗面化されていることにより、後述するように、電気泳動または誘電泳動によるターゲット生体分子の濃縮効果を得る場合に、凹凸の角（エッジ)部分に強電界が生じ、相互作用が更に促進されると、う利点がある。

[0035] スポット用平面の粗面化方法は特に限定されず、例えば、本発明で使用される基板がプラスチック成型基板の場合、フォトリソグラフィ一によりエッチングした母材を、電铸法により反転写した微細加工金型を用いることにより、スポット用平面が粗面化された基板を製作することができる。

[0036] 前記基板は、全体が導電性物質力もなるものであることができ、または、基板表面に導電性物質被覆層を有するものであることができる。また、金属とチオール基との結合を利用して、プローブ核酸の固定ィ匕を行う場合は、前記導電性物質は、チォール基と結合性を有する金属から選択する。

[0037] 導電性物質被覆層を有する基板としては、ガラス、石英、シリコン、プラスチック、具体的には、ポリプロピレン等の基板の表面に、前記導電性物質を被覆したものを挙げることができる。基板上の導電性物質被覆層の厚さは、特に限定されるものではなく、 f列えば、 0. 1〜： LO /z mとすること力 Sできる。

[0038] 前記基板が、前述のように、基板表面から突出し、かつ頂上にスポット用平面を有する生体分子固定ィ匕用スポット (突出スポット部）を有するものである場合の基板の製造方法について説明する。

前記基板が金属力なるものである場合は、所望の形状の突出スポット部に対応した凹部を有する铸型に、熔融した金属を注入して铸造することにより、本発明の基板を得ることができる。また、プレス成形によって、金属製基板を得ることもできる。本発明の基板は、金属カゝらなる基板の上に、導電性物質を被覆したものであることもできる。

本発明の基板が、シリコンまたはプラスチック製の基板上に導電性物質の被覆を有するものである場合は、例えば、所望の形状の突出スポット部に対応した凹部を有する成形型を用いてシリコンまたはプラスチックを成形し、そのシリコンまたはプラスチック製の基板上に、導電性物質を、蒸着、メツキ等によって被覆することにより、本発明の基板を得ることができる。

また、突出スポット部を有する基板は、平板状の基板上に導電性被覆層を被覆した後に、エッチング等により突出スポット部を形成することによって製造することもできる

また、突出スポット部を有さない基板は、公知の方法で製造することができ、また、市販品として入手可能なものもある。

[0039] 次に、突出スポット部を有する本発明の基板が、ガラス基板上に金被覆層を有するものである場合の、基板の製造方法の一例を説明する。但し、本発明はこの態様に限定されるものではない。

まず、スライドガラスの表面に、真空蒸着装置により、クロムを蒸着し、次いで、その上に金を蒸着する。この金蒸着スライドガラス上に、ポジ型レジストをスピンコーターで塗布し、例えば 60°Cでオーブンにより 1時間べ一キングする。

次いで、紫外線露光装置により、フォトマスクを通してスライドガラスに紫外線を照射する。このとき、フォトマスクとしては、所望の形状の突出スポット部に対応したパターンを有するものを使用する。紫外線照射後、現像液によって現像を行えば、金蒸着スライドガラス表面に、レジストパターンを形成することができる。

[0040] 次いで、レジストパターン周辺の金表面を、金エツチャントによってエッチングする。

金エッチング後の基板を超純水によって洗浄した後、金の下に蒸着されたクロムを除去するために、エツチャントにより更にエッチングを行い、超純水によって洗浄する。アセトン等によってレジストを溶解した後、超純水によって洗浄し、更に残っているレジストを完全に除去するために、ピラニア溶液 (硫酸：過酸化水素 = 1： 1)に 10分間漬けて、超純水で洗浄する。これにより、フォトマスクに対応した金パターンを有するガラス基板を得ることができる。

[0041] 次に、上記基板を、フッ化水素酸に浸漬し、露出しているガラス表面をエッチングする。このときに使用するフッ化水素酸の濃度および浸漬時間は、所望の突出スポット部の高さに応じて適宜設定することができる。

[0042] 次に、前述と同様に、金およびクロム等のエッチングを行った後、ピラニア溶液および超純水によって基板を洗浄し、所望の形状の突出スポット部を有するガラス基板を得ることができる。

このガラス基板に、前述と同様に、クロムを蒸着し、次いで、金を蒸着することによつて、突出部を有し、かつ、金被覆を有する基板を得ることができる。

[0043] 前述の基板全体の大きさ、基板上の突出スポット部の数および集積度は特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、本発明では、 10〜20, OOOmm²の大きさの基板上に、突出スポット部を、 10〜50, 000個程度有する基板を用いることができる。

[0044] 本発明では、基板上に固定化された生体高分子が核酸であり、かつ、前記導電性物質表面 (6)を構成する導電性物質が金属である場合、プローブ核酸を基板上に固定化するために、基板上の導電性物質表面 (6)を構成する金属と反応性を有する基を一端に有する核酸を含む溶液を、スポッティング溶液として用いることができる。そのような基としては、チオール基を挙げることができる。チオール基を有する核酸鎖の金属表面への固定化は、公知の方法によって行うことができ、例えば、 J.Am.Chem .Soc.1998,120,9787- 9792を参照することができる。

[0045] 金属表面への DNAの固定ィ匕方法としては、金属（表面酸化被膜を活性化させ水酸基を提示させたもの）に対して以下の処理を行う方法を用いることもできる。

(1)アミノシラン処理した基板表面に、 UV照射することにより、 DNAを固定ィ匕する。

(2)アミノシラン、 NHS (N-ヒドロキシスクシンイミド） -ピオチン、アビジンによって j噴次処理した基板表面に、ピオチンィ匕 DNAを固定ィ匕する。

(3)アミノシラン、マレイミド-ピオチン、アビジンによって順次処理した基板表面に、ビォチンィ匕 DNAを固定ィ匕する。

(4)アミノシラン、次いでダルタルアルデヒドによって処理した基板表面に、アミノ化 D NAを固定化する。

(5)アミノシラン、次いでカルポジイミドによって処理した基板表面に、アミノ化 DNAを固定化する。

(6)アミノシラン処理した基板表面に、カルボキシ化 DNAを固定ィ匕する。

(7)アミノシラン処理した基板表面に、リン酸化 DNAを固定化する。 (8)アミノシラン、次いで NHS—マレイミドィ匕合物によって処理した基板表面に、チォール化 DNAを固定化する。

(9)エポキシシラン処理した基板表面に、アミノ化 DNAを固定ィ匕する。

(10)チオールシラン処理した基板表面に、チオール化 DNAを固定ィ匕する。

[0046] また、 DNA以外の生体分子についても、上記のような、 UV照射による固定ィ匕や、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、リン酸基などの官能基を介しての固定化が可能である。

[0047] 前記導電性物質表面（6)への生体分子溶液のスポッティングは、常法により行うことができ、例えば、先端に生体分子溶液を保持した-一ドルを、基板表面の生体分子を固定化させたい位置に接触させることにより行うことができる。ここで、前記基板が突出スポット部を有する場合は、突出スポット部頂上のスポット用平面に接触させることにより、生体分子のスポッティングを行うことができる。ここで使用されるスポッティング用装置としては、例えば、特開 2001— 46062号公報および特開 2003— 5723 6号公報に記載の装置を挙げることができる。スポット量は、適宜調整することができ、前記基板が突出スポット部を有する場合は、スポット用平面力生体分子溶液が流れ出さないように、スポット用平面の大きさや、突出スポット部の高さに応じて、適宜設定することができる。

[0048] 本発明の装置には、前記マイクロアレイの生体分子が固定ィ匕された面に対向するように、透明電極（2) (対向電極）が備えられている。本発明では、マイクロアレイと対向電極との間に電界を印加することにより、生体分子が固定化された平面と、対向電極の前記平面と対向する面との間で電界密度が高まり、溶液中のターゲット生体分子が、電気泳動（直流電源を使用した場合)または誘電泳動（交流電源を使用した場合）によって、生体分子が固定化されたスポット近傍に濃縮される。これにより、基板上に固定化された生体分子と、ターゲット生体分子との相互作用を促進することができる。この効果は、前述の突出スポット部を有する基板を使用した場合に顕著である。特に、生体分子が固定化されたスポット平面が粗面化されている場合、例えば、スポット平面に、共焦点型検出器の焦点深度以内で深さ方向と略水平方向に凹凸を有する場合は、凹凸の角（エッジ)部分に強電界が生じ、相互作用が更に促進されるという利点がある。

[0049] 前記対向電極は、透明であり、かつ、前記生体分子マイクロアレイと対向電極との間に電界を印加することができるものであれば、特に制限はない。このように透明電極を用いることにより、キヤビティ内に溶液を送液または保持しながら、透明電極の上力も共焦点型検出器で反射光および Zまたは蛍光の検出を行うことができ、生体分子の相互作用をリアルタイムで検出することができる。

本発明において、対向電極は、透明な導電性物質、例えば、導電性酸化物、導電性プラスチック等力もなる基板であることができ、また、マイクロアレイと対向する面に、導電性物質被覆層を有する基板カゝらなるものであることもできる。前記対向電極は、好ましくは、 ITO (酸化インジウムスズ）、酸化スズなどの導電性酸ィ匕物力もなるものであることができる。

[0050] また、本発明の装置において、マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に電界を印加するための電源は、直流電源でも、交流電源でもよい。より好ましくは、交流電源が用いられる。直流電源を使用する場合は、高電圧をかけると、ターゲット生体分子溶液が高電圧により電気分解し、気泡等が発生しやすいという懸念があるため、低電圧を使用することが好ましい。ターゲット生体分子として DNAを使用する場合には、 D NAがマイナスに荷電されているため、直流電源を使用する場合は、突出スポット部側力プラスになるように電界を印加することが好ましい。交流電源を使用する場合は、その周波数は、例えば 10Ηζ〜1ΜΗζとすることができる。

[0051] 本発明の装置は、前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に、非導電性スぺーサー（3)を有し、前記マイクロアレイ（1)、前記スぺーサー（3)、および前記対向電極（2)によってキヤビティ (4)が形成されている。前記マイクロアレイ（1)は、前記キヤビティ (4)に通じる 2つの貫通孔（5)を有する。一方の貫通孔はキヤビティへ溶液を注入するための孔であり、他方の貫通孔はキヤビティカ溶液を排出するための孔である。本発明の装置は、以上の構成を有することにより、キヤビティ (4)内への送液が可能になる。これにより、生体分子の相互作用を、ターゲット生体分子を含む溶液を送液しながら透明電極（2)を通してリアルタイムで試験することが可能になる。また、溶液中のターゲット生体分子の濃度を変えながら送液しながら、または、ターゲット生体分子を含まな!/、溶液を送液して洗浄しながら、キヤビティ内の生体分子の相互作用の状態を観察することもできる。

[0052] 前記非導電性スぺーサ一は、例えば、ポリエチレンテレフタレート（PET)、ポリェチレンナフタレート（PEN)、シリコンフィルムからなるシートを、キヤビティ（4)に相当する空孔が形成されるように、所望の形状に型抜きすることによって作製することができる。但し、非伝導性スぺーサ一の材質は上記のものに限定されず、加工の容易性等を考慮して適宜選択することができる。

[0053] 本発明の装置では、マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との距離は、非導電性スぺーサー（3)の厚さによって制御することができる。電界印加によって生体分子の相互作用を促進するためには、前記マイクロアレイ（1)の生体分子が固定化された面と前記対向電極 (2)のマイクロアレイ（1)の生体分子が固定化された面と対向する表面との距離は、 10〜300 mとすること力好ましい。非導電性スぺーサー（3)の厚さは、前記マイクロアレイ（1)の生体分子が固定ィ匕された面と前記対向電極（2)のマイクロアレイ（1)の生体分子が固定化された面と対向する表面との距離を考慮して適宜設定することができ、例えば、 10〜300 mとすることができる。

[0054] 前記非導電性スぺーサ一は、その両面に接着剤層を有することができる。非導電性スぺーサ一は、この接着剤層によって、マイクロアレイ（1)と対向電極（2)と張り合わせることができる。このように非導電性スぺーサー（3)の一方の面にマイクロアレイ（ 1)を張り合わせ、他方の面に対向電極（2)を張り合わせることによって、前述のスぺーサーシールに設けた空孔部分に、キヤビティ (4)が形成される。これにより、マイクロアレイ（1)、非導電性スぺーサー（3)、および対向電極（2)とによって形成されたキャビティ (4)を有する、本発明の装置を構成することができる。

[0055] 前記接着剤層の接着剤は、光硬化性榭脂を含むことが好まヽ。光硬化性榭脂は、光を照射することによって硬化して接着力を失うため、前記接着剤が光硬化性榭脂を含むことにより、光照射すれば、非導電性スぺーサー（3)からマイクロアレイ（1)と対向電極 (2)とをはずすことができる。光硬化性榭脂としては、例えば紫外線硬化型榭脂などの公知の光硬化性榭脂を用いることができる。

[0056] 本発明の装置は、マイクロアレイ（1)の側から、前記マイクロアレイ（1)上の導電性物質表面 (6)および対向電極 (2)と外部電極とを接続するための手段を有する。本発明の装置は、前述のように、マイクロアレイ（1)にキヤビティ (4)に通じる 2つの貫通孔（5)を有し、それら貫通孔を通して送液することができる。更に、上記のようにマイクロアレイ側からマイクロアレイ（1)上の導電性物質表面（6)と対向電極 (2)との間に電界を印加できる構成を有することにより、送液 ·電界の印加をいずれもマイクロアレイ（ 1)側から行うことができるため、対向電極 (2)側力もの生体分子の相互作用の観察を妨げるものがなぐスムーズに観察を行うことができる。

[0057] そのような手段を有する装置の具体例としては、図 1に示すように、前記マイクロアレイ（1)上の導電性物質表面 (6)と少なくとも一部が接触し、かつ、前記対向電極 (2 )とは接触しなヽ導電性部材 (7)を更に有し、前記基板上の導電性物質表面 (6)は、前記導電性部材 (7)を介して外部電源と接続される構成を有する装置を挙げることができる。前記導電性部材 (7)を構成する導電性物質としては、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸ィ匕物（例えば、 In O ZS

2 5 ηθ )および導電性プラスチック (例えば、ポリアセチレン)を挙げることができる。

2

[0058] 上記の構成を有する装置において、マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に電界を印加するためには、図 1に示すように、前記マイクロアレイ（1)に、前記導電性部材（7)に通じる貫通孔（8)および前記対向電極 (2)に通じる貫通孔（9)を設けて、これら貫通孔 (8)、（9)を通して、マイクロアレイ（1)上の導電性物質表面 (6)と対向電極 (2)と外部電源とを接続すればよ！ヽ。

[0059] 前述の貫通孔は、例えばマイクロアレイ用基板を金型成形する場合には、成形時に設けることができる。また、貫通孔は型抜き等により設けることもできる。

[0060] 本発明の装置は、ヒーター等の温度制御手段を更に有することが好ましい。温度制御手段によって、生体分子周辺の環境を、相互作用に適した温度に制御することにより、相互作用を更に促進することができる。特に、温度制御手段は、マイクロアレイ側に設けることが好ましい。これにより、対向電極 (2)側からの観察を妨げることなぐ温度制御を行うことができる。

[0061] [生体分子の相互作用試験方法]

本発明の生体分子の相互作用試験方法の一態様 (以下、「試験方法 I」ともいう）は、基板上に生体分子が固定化された生体分子マイクロアレイ（1)と前記マイクロアレィの生体分子が固定化された面に対向するように設けられた透明電極 (2) (対向電極)を有し、前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に、非導電性スぺーサー（3 )を有し、前記マイクロアレイ（1)、前記スぺーサー（3)、および前記対向電極（2)によってキヤビティ (4)が形成されて!、る装置を用いる、生体分子の相互作用試験方法であって、

前記マイクロアレイ（1)と対向電極 (2)との間に電界を印加すること、および、前記キヤビティ (4)へ、ターゲット生体分子を含む溶液および Zまたはターゲット生体分子を含まなヽ溶液を送液しながら、前記マイクロアレイ上の生体分子と前記ターゲット生体分子との相互作用を前記対向電極を通して光学的に検出すること、を含む、前記方法である。

本発明の生体分子の相互作用試験方法の別の態様 (以下、「試験方法 II」ともいう）は、基板上に生体分子が固定化された生体分子マイクロアレイ（1)と前記マイクロアレイの生体分子が固定化された面に対向するように設けられた透明電極 (2) (対向電極)を有し、前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に、非導電性スぺーサー（3 )を有し、前記マイクロアレイ（1)、前記スぺーサー（3)、および前記対向電極（2)によってキヤビティ (4)が形成されて!、る装置を用いる、生体分子の相互作用試験方法であって、

前記溶液の保持中または排出後に、前記マイクロアレイ上の生体分子と前記ターゲット生体分子との相互作用を前記対向電極を通して光学的に検出する、前記方法である。 [0063] 試験方法 I、試験方法 IIの、ずれにお、ても、前述の本発明の生体分子の相互作用試験装置を用いることができる。

[0064] 試験方法 Iは、前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に電界を印加すること、および、前記キヤビティ (4)へ、ターゲット生体分子を含む溶液および Zまたはターゲット生体分子を含まな!/ヽ溶液を送液しながら、前記マイクロアレイ上の生体分子と前記ターゲット生体分子との相互作用を前記対向電極を通して光学的に検出することを含む。このように、試験方法 Iによれば、マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に電界を印加して生体分子の相互作用を促進しつつ、溶液を送液しながら生体分子の相互作用を、対向電極（2)を通してリアルタイムで観察することができる。また、電界を印加しながら、最初にターゲット生体分子を含む溶液を送液してマイクロアレイ上の生体分子とターゲット生体分子とを相互作用させ、次、でターゲット生体分子を含まな、溶液を送液することによりキヤビティ内を洗浄しながら、その間のキヤビティ内の生体分子の相互作用の状態を、対向電極を通して観察することもできる。更には、キヤビティ内に送液する溶液のターゲット生体分子の濃度を順次変更しながら、生体分子の相互作用の観察を行うこともできる。

[0065] 一方、試験方法 IIは、前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に電界を印加すること、および、前記キヤビティ (4)に、ターゲット生体分子を含む溶液を充填し、所定時間保持した後、前記溶液を排出することを含み、前記溶液の保持中または排出後に、前記マイクロアレイ上の生体分子と前記ターゲット生体分子との相互作用を前記対向電極を通して光学的に検出する。このように、試験方法 IIによれば、キヤビティ (4 )内にターゲット生体分子を含む溶液を充填して所定時間保持しながら、マイクロアレィ（1)と対向電極 (2)との間に電界を印カロして生体分子の相互作用を促進することができ、その相互作用を、ターゲット生体分子の保持中または排出後に、対向電極 (2) を通して観察することができる。また、試験方法 IIでは、ターゲット生体分子を含む溶液を排出した後、または排出しながら、前記キヤビティ内にターゲット生体分子を含む溶液および Zまたはターゲット生体分子を含まな、溶液を新たに充填して、キヤビティ内の溶液を交換することもできる。

[0066] 試験方法 Iおよび IIにおいて、マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に印加される電界は、マイクロアレイ（1)と対向電極 (2)との間の距離を考慮しつつ、電気泳動または誘電泳動によるターゲット生体分子の濃縮の効果が得られる範囲で適宜設定することができ、例えば、 0. 01〜： LOMVZmとすることができる。また、後述するように、タ一ゲット生体分子溶液に用いるバッファーの種類に応じて、高い相互作用促進効果が得られるように、印加電界を適宜設定することが好ましヽ。

[0067] 試験方法 Iおよび IIでは、マイクロアレイ（1)の側から、前記マイクロアレイ（1)上の導電性物質表面（6)および対向電極（2)と外部電源とを接続し、前記マイクロアレイ（1 )と対向電極（2)との間に電界を印加することが好ましい。前記導電性部材（7)に通じる貫通孔（8)および前記対向電極（2)に通じる貫通孔（9)を有する、本発明の生体分子相互作用試験装置を使用する場合、前記導電性部材 (7)に通じる貫通孔 (8 )および対向電極 (2)に通じる貫通孔（9)を通して、前記導電性部材（7)および対向電極 (2)と外部電源の端子とを接続することにより、マイクロアレイ（1)の側から、前記マイクロアレイ（1)上の導電性物質表面 (6)および対向電極 (2)と外部電源とを接続し、前記マイクロアレイ（1)と対向電極 (2)との間に電界を印加することができる。また、試験方法 Iおよび IIにおいて、本発明の生体分子相互作用試験装置を使用する場合、マイクロアレイ（1)が有する前記キヤビティに通じる貫通孔（5)を通して、前記キヤビティへ溶液を注入し、および Zまたは、前記キヤビティカゝら溶液を排出することがでさる。

このように、送液および外部電源との接続を、いずれもマイクロアレイ（1)側力も行うと、対向電極 (2)側には、対向電極 (2)側力もの生体分子の相互作用の観察を妨げるものがないため、スムーズに観察を行うことができる。

[0068] 前述のターゲット生体分子を含む溶液 (以下、「ターゲット生体分子溶液」とも!、う）はバッファーを含むことができる。ターゲット生体分子溶液に用いるバッファ一として、好ましいものとしては、約 6〜8付近の解離定数 (pKa)を有するものが挙げられる。プローブ核酸とターゲット核酸とのノ、イブリダィゼーシヨンを効率よく起こさせるためには、 pHが中性域であることが好ま、ため、中性域で緩衝能を有するバッファーを使用することが好ましい。具体的には、以下のバッファー物質を含むバッファーが挙げられる；フエ-ルァラニン、カルノシン、アルギニン、ヒスチジン、 MES (2-(N-モルホリン）エタンスルホン酸）、マレイン酸、 3,3-ジメチルダルタル酸、炭酸、 4-ヒドロキシメチルイミダゾール、クェン酸、ジメチルアミノエチルァミン、プロリン酸、グリセロール- 2-リン酸、 PIPES (ピペラジン- Ν,Ν'-ビス (2-エタンスルホン酸))、エチレンジァミン、イミダゾール、 MOPS (3- (N-モルホリン)プロパンスルホン酸)、リン酸、 TES (N-トリス (ヒドロキシメチル)メチル -2-アミノエタンスルホン酸）、 4-メチルイミダゾール、 HEPES (N- 2-ヒドロキシェチルピペラジン- N'-2-エタンスルホン酸)、 N-ェチルモルホリン、トリエタノールァミン、トリス (トリス (ヒドロキシメチル)ァミノメタン)。

[0069] ターゲット生体分子溶液に用いるバッファーの伝導率が過度に高いと、バッファー中のイオンの移動により、ターゲット生体分子の濃縮効果が低減するおそれがある。そこで、本発明では、伝導率が 10〜500 Ω— のバッファーを用いることが好ましぐ伝導率が 10〜： L00 Ω^_1Ζπιのバッファーを用いることが更に好ましい。バッファ一の伝導率が上記範囲内であれば、生体分子の相互作用を良好に促進することができる。また、ノッファーの濃度は、上記範囲内の伝導度が得られるように、適宜調整することが好ましい。

[0070] 以上の観点から、好まし、バッファーの具体例としては、バッファー物質として、フエ二ルァラニン、ヒスチジン、カルノシン、アルギニンを含むバッファーを挙げることができる。プローブ核酸とターゲット核酸とのハイブリダィゼーシヨンを、フエ二ルァラニンを含有するターゲット生体分子溶液を用いて行うと、特に高、ハイブリダィゼーシヨンシグナル強度を得ることができ、し力も、電界印加により、電界を印加しない場合と比ベて、例えば 2倍以上のハイブリダィゼーシヨンシグナル強度を得ることができる。このように、フ二ルァラニンは、電界を印加することにより生体分子の相互作用を促進する本発明にお、て、特に効果を発揮するバッファー物質である。

[0071] なお、マイクロアレイと電極との間に印加する電界は、高い生体分子相互作用促進効果が得られるように、使用するバッファーに応じて適宜設定することが好ましい。例えば、フエ-ルァラニンをバッファ一として用いる場合には、 0. 5〜1. 0MV/m、ヒスチジンの場合は、 0. 5〜1. OMV/m,カルノシンの場合は、 0. 25〜0. 75MV Zm、アルギニンの場合は、 0. 1〜0. 3MVZm、の範囲の電界を印加することが好ましい。 [0072] 試験方法 Iおよび IIでは、マイクロアレイ（1)上の生体分子とターゲット生体分子との相互作用を、対向電極（2)を通して光学的に検出する。光学的な検出方法としては、蛍光検出器、共焦点検出器、共焦点レーザ蛍光顕微鏡、蛍光顕微鏡を用いる方法を挙げることができる。中でも、共焦点検出器によって蛍光を検出することにより生体分子間の相互作用を検出するために、ターゲット生体分子は、蛍光標識されていることが好ましい。ターゲット生体分子の蛍光標識は、公知の方法で行うことができる。また、本発明では、マイクロアレイ（1)上に固定化される生体分子が、蛍光標識されていてもよい。マイクロアレイに固定される生体分子の蛍光標識も、公知の方法で行うことができる。

[0073] 更に、本発明の生体分子の相互作用試験方法では、前述の、基板上に突出スポット部を有する本発明の生体分子相互作用試験装置を使用することもできる。この場合、前記マイクロアレイ上の生体分子と前記ターゲット生体分子との相互作用を前記対向電極を通して共焦点型検出器によって検出することができる。共焦点型検出器による反射光および蛍光の検出原理については、前述の通りである。本発明の相互作用試験において、基板上に突出スポット部を有する本発明の生体分子相互作用試験装置を使用する場合、共焦点型検出器を用いて、前述の原理で反射像によってスポットの大きさおよび位置を特定することで、自動グリツティングを行うことができる。即ち、マイクロアレイ表面の突出スポット部とそれ以外の部分の高さおよび Zまたは形状の差による反射光強度の相違から、マイクロアレイ上の突出スポット部を、反射像として検出することができる。更に、共焦点型検出器によって、マイクロアレイからの蛍光を検出するときに、マイクロアレイ上の突出スポット部頂上のスポット平面の高さに、共焦点型検出器の焦点を合わせれば、突出スポット部からの蛍光、即ち、スポット平面上の蛍光標識された生体分子 (スポットに固定化された生体分子および Zまたはターゲット生体分子)力の蛍光を選択的に検出して、スポットに対応する蛍光像を得ることができる。本発明では、こうして得られた反射像と蛍光像を重ね合わせることによって、マイクロアレイ上の相互作用が起こって、るスポットを特定することができ、その蛍光強度により、相互作用の程度を測定することができる。なお、本発明では、二本鎖核酸を特異的に染色する蛍光インターカレーターを用いて、インターカレータ一からの蛍光を測定することによって相互作用を検出することもできる。

[0074] 特に、本発明では、反射光と蛍光とを同時に検出することができる共焦点型蛍光スキヤナーを用いることが好ましい。そのような装置の一例を、図 7に示す。図 7に示す装置では、励起光源 (レーザー） 21から発生した励起光はミラー 22、ダイクロックミラ一ミラー 23、ミラー 26、対物レンズ 24、を介して試料 (マイクロアレイ） 25に照射される。反射光は対物レンズ 24、ミラー 26、ダイクロックミラー 23 (反射光の一部を透過（数パーセント以下））、ダイクロックミラー 27、減光フィルター 28、検出レンズ 29、ピンホール 30を介して反射光検出部 31に導かれる。蛍光は 2つのダイクロックミラー 23、 27を透過し、ミラー 32にて反射しカットフィルター 33、検出レンズ 34、ピンホール 35 を介して蛍光検出部 36に導かれる。このような装置によれば、マイクロアレイ表面の突出スポット部とそれ以外の部分の高さおよび Zまたは形状の差による反射光強度の相違から、マイクロアレイ上の突出スポット部を反射像として検出し、同時に、そのスポットからの蛍光を検出することによって、生体分子の相互作用を検出することができる。

[0075] [生体分子の融解温度測定方法]

本発明は、更に、前述の本発明の生体分子の相互作用試験方法を用いることを特徴とする、生体分子の融解温度測定方法に関する。

生体分子、例えば核酸は、加熱していくとある温度で立体構造に大きな変化が起こり、あた力も相転移に相当するような変化が観察される。このときの温度を融解温度という。本発明の生体分子の融解温度測定方法では、例えば、生体分子が核酸である場合、キヤビティ内にターゲット核酸と二本鎖検出試薬を含む溶液を保持してマイクロアレイ上のプローブ核酸とターゲット核酸とを相互作用させ、キヤビティ内の温度を上昇させていき、対向電極を通して二本鎖検出試薬力もの蛍光を検出することによつて、キヤビティ内のターゲット核酸のプローブ核酸力の遊離状態をリアルタイムで観察することができ、これにより、核酸の融解温度を測定することができる。二本鎖検出試薬としては、ェチジゥムブロマイドを用いることができ、市販品としては、例えばタカラバイオ株式会社製 SYBR (商標） Green Iを用いることができる。また、二本鎖核酸検出試薬を用いずに、蛍光標識したターゲット DNA分子を使用することにより、融解温度を測定することもできる。

[0076] [核酸の配列検知方法]

本発明は、更に、前述の本発明の生体分子の相互作用試験方法を用いることを特徴とする、核酸の配列検知方法にも関する。

ターゲット核酸と完全相補性のプローブ核酸を基板上に固定ィ匕して、ターゲット核酸とプローブ核酸とをハイブリダィズさせた後に温度を上昇させた場合に観察される核酸の融解挙動は、ターゲット核酸と完全相補のプローブ核酸を用いた場合と、一部の塩基配列が異なるプローブ核酸とを用いた場合とで異なる。そこで、本発明では、この違いを利用して、本発明の生体分子の相互作用試験方法を用いて、ターゲット核酸とプローブ核酸とをノヽイブリダィズさせた後に、キヤビティ内の温度を上昇させていき、対向電極を通して、例えば蛍光を観察することによって、そのキヤビティ内でのターゲット核酸のプローブ核酸からの融解の挙動を観察し、それに基づ、てターゲット核酸の配列を検知することができる。このような本発明の核酸の配列検知方法によれば、完全相補配列からの塩基配列の違い、例えば、一塩基多型 (SNP)を検出することができる。

[0077] [第二の態様]

次に、本発明の第二の態様について更に詳細に説明する。

本発明の第二の態様は、

基板表面に生体分子が固定化されたスポットを 1つ以上有する生体分子マイクロアレイと、前記基板表面と対向する電極 (対向電極)との間にターゲット生体分子を含む溶液を配置し、前記基板表面に固定化された生体分子とターゲット生体分子とを相互作用させる方法であって、

前記導電性物質表面と対向電極との間に、周波数 0. 01〜： LOHzで電圧を印加して、前記相互作用を促進することを特徴とする、前記方法

に関する。

[0078] 前記生体分子および前記相互作用については、先に第一の態様について説明した通りである。

本発明の第二の態様において使用される生体分子マイクロアレイは、基板上に生体分子を固定ィ匕することによって作製されるものであり、生体分子が固定化された面の少なくとも一部に導電性物質表面を有する。前記基板は、基板全体が導電性物質カゝらなる基板であるか、または、基板表面に導電性物質被覆層を有する基板であることがでさる。

[0079] 前記導電性物質は、例えば、金属（例えば、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミユウム、ステンレス、銅、クロム）、導電性酸化物（例えば、 In O /SnO )、または導

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電性プラスチック (例えば、ポリアセチレン)であることができる。なお、前記導電性物質をチオールと結合性を有する金属力選択することにより、金属とチオールとの結合を利用して、プローブ核酸の固定ィ匕を行うことができる、また、後述するように、前記基板が突出スポット部を有するものであり、反射像によって自動グリツティングを行う場合には、前記導電性物質は、光を反射する物質から選択することができる。

[0080] 前記基板が、導電性物質被覆層を有する基板である場合、そのような基板は、ガラス、石英、シリコン、プラスチック、具体的には、ポリプロピレン等の基板の表面に、前記導電性物質を被覆したものを挙げることができる。基板上の導電性物質被覆層の厚さは、特に限定されるものではなぐ例えば、 0. 1〜： LO /z mとすることができる。このような基板は、公知の方法で作製することができ、また、市販品として入手可能なものもある。

[0081] 更に、第二の態様において使用される基板は、平らな表面を有する基板であることができる。また、第二の態様において使用される基板は、基板表面から突出し、かつ頂上にスポット用平面を有する生体分子固定ィ匕用スポット（突出スポット部）を有し、少なくとも前記突出スポット部は導電性物質表面を有し、前記スポット用平面の導電性物質表面に生体分子が固定化されており、かつ前記基板は、前記基板上の突出スポット部以外の表面に、前記突出スポット部の導電性物質表面と通電可能な端子を有するものであることもできる。前記基板上の突出スポット部以外の表面は、導電性物質被覆層を有することができ、前記端子は、前記導電性物質被覆層に含まれる力または、前記導電性物質被覆層と通電可能であることができる。更に、この導電性物質被覆層と突出スポット部の導電性物質表面とは、一体の導電性物質被覆層として設けられていることが好ましい。そのような基板としては、前述の基板 I、 IIを挙げることができる。その詳細は、先に説明した通りである。また、第二の態様における基板上への生体分子の固定ィ匕についても、先に第一の態様について説明した通りである

[0082] 第二の態様の生体分子を相互作用させる方法では、前記生体分子が固定化された基板表面に対向するように、電極 (対向電極)を配置する。前記方法では、基板の導電性物質表面と対向電極との間に電圧を印加して電界を生じさせることにより、基板と対向電極との間に配置された溶液に含まれるターゲット生体分子が、基板側に選択的に移動して基板表面近傍に濃縮される。このようにターゲット生体分子を基板表面近傍に濃縮することにより、基板上に固定化された生体分子と、ターゲット生体分子との相互作用を促進することができる。

[0083] 前記対向電極は、前記生体分子マイクロアレイと対向電極との間に電界を生じさせることができるものであれば、特に制限はない。前記対向電極は、電極全体が、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチック力もなるものであることができる。または、前記対向電極は、前記基板の導電性物質表面と対向する表面に、金、ニッケル、白金、銀、チタン、ァルミ-ゥム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチック力もなる導電性物質被覆層を有するものであることができる。本発明では、特に、前記対向電極が、例えば、 ITO (酸化インジウムスズ）、酸化スズなどの透明電極であれば、生体分子の相互作用中に、同時に、透明電極の上から、蛍光検出器等を用いて、生体分子の相互作用をリアルタイムで検出することができる。また、前記生体分子マイクロアレイを構成する基板が、光透過性のガラスやプラスチック上に、透明の導電性被覆層を設けたものである場合や、基板全体が透明の導電性物質カゝらなる場合も、同様に、相互作用をリアルタイムで検出することができる。

[0084] 前記方法では、前記導電性物質表面と対向電極との間に、周波数 0. 01〜： LOHz で電圧を印加する。このように電圧を印加して導電性物質表面と対向電極との間に電界を発生させることによって、溶液中のターゲット生体分子が基板側に選択的に移動して濃縮され、生体分子間の反応効率が高まり、生体分子の相互作用を促進することができる。

[0085] 前記方法において、基板の導電性物質表面と対向電極との間に印加する電圧の周波数は、 0. 01〜： LOHzである。周波数が 0. 01Hz未満であると、一定時間内のタ一ゲット生体分子を基板表面近傍に濃縮する回数が少なくなり、相互作用を促進させる効果が低下する。また、周波数が 10Hzを超えると、ターゲット生体分子を含む溶液が電気分解して気泡が発生するおそれがある。前記周波数は、好ましくは 0. 01〜 1Hzである。

[0086] 基板の導電性物質表面と対向電極との間で印加する電圧は、 0. 1〜4Vであることが好ましい。電圧が上記範囲内であれば、電気分解や発熱の問題なぐ生体分子の相互作用を促進することができる。前記電圧は、好ましくは 1〜3Vである。

[0087] 前記ターゲット生体分子を含む溶液は、カチオンを含むことが好ま、。これは、以下の理由による。

高周波交流電圧の印加による誘電泳動によって、溶液中の生体分子を一方向に選択的に移動させようとする場合、溶液にカチオンが含まれていると、電圧印加によりカチオンが優先的に移動して生体分子が移動しな、。

それに対して、本発明者らは、基板の導電性物質表面と対向電極との間に周波数 0. 01〜： LOHzで電圧を印加して電界を生じさせることにより、溶液がカチオンを含む場合でも、ターゲット生体分子を基板側に選択的に移動させて濃縮し、相互作用の反応効率を高めることができることを見出した。このように、溶液がカチオンを含む場合には、いわゆる電気浸透流 (Electroosmotic Flow: EOF)により、溶液中でターゲット生体分子が移動すると考えられる。即ち、溶液がカチオンを含む場合には、電圧印加により溶液中のカチオンが移動し、そのカチオンの移動により生じた溶液の流れに伴いターゲット生体分子が移動することにより、ターゲット生体分子を基板側に選択的に移動させることができると考えられる。

[0088] 更に、例えば、生体分子として核酸を用いる場合、生体分子間の相互作用、即ち、ターゲット核酸とプローブ核酸とのハイブリダィゼーシヨンの効率を高めるためには、ハイブリダィゼーシヨン溶液にカチオンが含まれていることが好ましい。これは、カチオンの正の電荷により、核酸のリン酸基の負の電荷が打ち消され、プローブ核酸とタ一ゲット核酸との反応性が高まるためである。よって、ターゲット核酸溶液にカチオンを添加すれば、電圧印加によるハイブリダィゼーシヨン促進効果に加えて、カチオンの効果によりハイブリダィゼーシヨン効率を更に高めることができる。

[0089] 前記方法において使用される電圧は、特に限定されず、サイン波交流電圧、矩形波交流電圧、定常波直流電圧、パルス波直流電圧などを用いることができる。直流電圧としては、パルス波直流電圧を用いることが好ましい。パルス波直流電圧を用いることにより、電圧の周期に合わせて周期的にターゲット生体分子を移動させ、生体分子の相互作用を効率的に促進することができる。電圧印加は、少なくとも基板表面が負に帯電するように電圧を印加する期間を含むように行うことが好ましく、直流電圧を使用する場合には、基板側が負に帯電するように電界を印加することが好ま、。これにより、溶液に含まれるカチオンが基板側に引き寄せられるため、カチオンの移動により生じた溶液流によって、ターゲット生体分子を基板側に選択的に移動させることができる。

[0090] 前記方法は、前記導電性物質表面と対向電極との間に電圧が印加されていない間、ターゲット生体分子を含む溶液を攪拌する操作を行うことが好ましい。例えば、パルス直流電圧を印加する場合、電圧印加の周期の間（電圧印加が行われていない間）に溶液を攪拌することができる。このように、電圧を印カロしない間に溶液を攪拌することにより、電圧印加により基板側に移動したカチオンを溶液内に拡散させることができる。その後、次の電圧印加が行われれば、溶液内に拡散したカチオンの移動に伴い、ターゲット生体分子を基板側に選択的に移動させることができる。このように、電圧の印加と溶液の攪拌を繰り返すことによって、ターゲット生体分子を基板側へ順次移動させて基板表面近傍に効率的に濃縮することができる。

溶液の攪拌方法としては、例えば、反応槽全体をロータリーオーブンで回転させる方法、チャンバ一内につながる送液口を設け、送液口とペリスタポンプ、ロータリーポンプ等のポンプをチューブでつなぎ、チャンバ一内の溶液を往復攪拌する方法を用いることがでさる。

[0091] 前記カチオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、マグネシウムィォン、カルシウムイオン、およびアルミニウムイオンからなる群力も選ばれる少なくとも一種であることができる。上記カチオンの中で好ましいものは、ナトリウムイオンおよびマグネシゥムイオンである。

[0092] 溶液中のカチオン濃度は、印加する電圧の種類や周波数等を考慮して、相互作用に最適な濃度に設定することが好ましぐ例えば、 1〜： LOOOmM、好ましくは 10〜50 OmMとすることができる。

[0093] ターゲット生体分子を含む溶液は、バッファーを含むことができる。バッファ一としては、中性域の pHの緩衝能を有するものを用いることが好ましいが、これに限定されるものではない。具体的には、バッファ一としては、例えば、 Tris— HC1バッファーを用いることがでさる。

[0094] ターゲット生体分子を含む溶液の温度は、相互作用に適した温度にすることが好ましぐ例えば、常温 (例えば 20°C程度）〜 70°Cとすることができる。ターゲット生体分子を含む溶液の温度を制御するために、ヒーター等の温度制御手段を用いることもできる。なお、過度に高い電圧を使用すると、発熱により溶液温度が高温になるため、温度制御を厳密に行う必要が生じる場合がある。それに対し、第一の態様の方法は、比較的低電圧により相互作用促進効果が得られるため、厳密な温度制御手段を使用しなくても実施できるという利点がある。

[0095] 前記基板と対向電極との間には、生体分子が固定化された領域が覆われないように、非導電性材料力もなるスぺーサーを挟むことができる。このように、基板と対向電極との間に非導電性スぺーサーを配置し、基板、対向電極、および非導電性スぺーサ一によつて囲まれた空間に、ターゲット生体分子を含む溶液を充填することができる。前記非導電性材料としては、例えば、シリコン、ゴム、ガラス、プラスチックを挙げることができる。本発明では、このスぺーサ一の厚さにより、基板と対向電極との距離を設定することができる。前記基板と対向電極との距離は、電界印加による生体分子の相互作用促進効果が得られる範囲で適宜設定することができ、例えば、 30-500 μ mとすることができる。

[0096] 前記非導電性スぺーサ一は、その両面に接着剤層を有することができ、接着剤層によって、基板と対向電極とを張り合わせることができる。前記接着剤層の接着剤は、光硬化性榭脂を含むことが好ましい。光硬化性榭脂は、光を照射することによって硬化して接着力を失うため、前記接着剤が光硬化性榭脂を含むことにより、光照射すれば、非導電性スぺーサ一から基板と対向電極をはずすことができる。光硬化性榭脂としては、例えば紫外線硬化型榭脂などの公知の光硬化性榭脂を用いることができる。

[0097] 前記相互作用は、対向電極が透明電極である場合には、対向電極を通してリアルタイムで検出することができる。また、前述のように、マイクロアレイを構成する基板が、光透過性のガラスやプラスチック上に、透明の導電性被覆層を設けた基板である場合や、基板全体が透明の導電性物質力もなる場合には、基板側力ものリアルタイム検出も可能である。相互作用の検出方法としては、蛍光検出器、共焦点検出器、共焦点レーザ蛍光顕微鏡、蛍光顕微鏡を用いる方法を挙げることができる。蛍光検出器により生体分子間の相互作用を検出するために、ターゲット生体分子は、蛍光標識されていることが好ましい。ターゲット生体分子の蛍光標識は、公知の方法で行うことができる。また、本発明では、基板表面に固定化されている生体分子が、蛍光標識されていてもよい。基板に固定される生体分子の蛍光標識も、公知の方法で行うことができる。

[0098] 更に、前述のように、突出スポット部を有する基板を用いる場合には、生体分子間の相互作用を、共焦点型検出器によって検出することができる。共焦点型検出器による反射光および蛍光の検出原理については、前述の通りである。突出スポット部を有する基板を用いる場合、共焦点型検出器を用いて、前述の原理で反射像によってスポットの大きさおよび位置を特定することで、自動グリツティングを行うことができる。その詳細は、先に説明した通りである。

[0099] 特に、本発明では、反射光と蛍光とを同時に検出することができる共焦点型蛍光スキヤナーを用いることが好ましい。その詳細は、先に説明した通りである。

[0100] 更に、本発明の第二の態様は、

少なくとも一部に導電性物質表面を有する基板と、前記導電性物質表面と対向する電極 (対向電極）との間に配置された溶液に含まれる生体分子を移動させる方法であって、前記導電性物質表面と対向電極との間に、周波数 0. 01〜： LOHzで電圧を印加して、前記基板または対向電極に向けて前記生体分子を移動させることを特徴とする方法

に関する。

前記方法において使用される基板、対向電極、生体分子、印加電界等の詳細は、先に生体分子を相互作用させる方法について述べた通りである。

[0101] 前述の生体分子を移動させる方法は、基板側に生体分子を選択的に移動させて基板表面近傍に濃縮するために用いることができ、または、対向電極側に生体分子を選択的に移動させて対向電極表面近傍に濃縮するために用いることができる。

[0102] 更に、前述の生体分子を移動させる方法は、核酸の配列を検知するために用いることができる。例えば、前述の生体分子を相互作用させる方法を用いて生体分子を相互作用させると、プローブ核酸と完全相補のターゲット核酸は、プローブ核酸と強固に相互作用する。それに対し、例えば、プローブ核酸と一部の配列がミスマッチなターゲット核酸は、プローブ核酸との相互作用が弱いため、逆向きに電界を印加すると、プローブ核酸から離れて対向電極側に移動する。このようにして、前述の生体分子を移動させる方法によれば、完全相補配列からの塩基配列の違い、例えば、一塩基多型 (SNP)を検出することができる。

実施例

[0103] 以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

第一の餱

[実施例 1]

誘電ハイブリダィゼーシヨン

(1)突出スポット部を有するマイクロアレイの作製

(i)アレイパーツの作製

フォトリソグラフィ一とマイクロミーリング技術を利用して、基板上に形成する突出スポット部に対応する凹部を有する金型を製作した。この金型を用いて、射出成形によつて、ポリカーボネート製のアレイパーツを作製した。突出スポット部の高さは 200 m、スポット用平面は一辺 90 mの正方形であり、スポット用平面と突出スポット部側面とのなす角度は 95° であった。突出スポット部の断面図を図 13に示す。

作成したアレイパーツを真空蒸着装置 (型番 KS— 807RK型、株式会社ケーサイエンス製）のベルジャーにセットし、 10x10— ⁴ Pa以下にベルジャー内を真空にした後

、クロムを 0. 08nmZsの速度で、 50nm厚まで蒸着し、引き続き、金を 0. 5nmZsの速度で、 500nm厚まで蒸着した。

以上の方法で、図 8に示すアレイパーツを作製した。

(ii) DNAスタンビング

45mer オリゴ DNAプローブ溶液（120 M in lx マイクロスポッティング溶液（テレケム社） +0. 1% Tween 20)を、 DNAアレイヤーにより、アレイパーツの突出スポット部頂上のスポット用平面へスタンプした。スタンプ金+の先端は、直径 130 m の円形のものを利用した。

プローブ DNAとしては、以下の 11種類の遺伝子配列である 45merオリゴ DNAを用いた

[化 1]

beta-actin, TTTTGTCCCCCCAACTTGATGTATGAAGGCTTTGGTCTCCCTGGG

NF-L, GGCCGTTCTGCTTACAGTGGCTTGCAGAGCAGCTCCTACTTGATG

Ubiquitin 2e, GTACCMCATTGCCTCCTAGCAGAGAAGTGTGTGTGTGAGMGCC

hsc70, CCTATGGTGCAGCTGTCCAGGCAGCCATTCTATCTGGAGACMGT

rpL3, GGTGAGGTGACCAATGACTTCATCATGCTCAAAGGCTGTGTGGTG

Akt, GCTGGACAAGGACGGGCACATCAAGATAACGGACTTCGGGCTGTG

Transthyretin, ACCATCGCAGCCCTGCTCAGCCCATACTCCTACAGCACCACGGCT

rpS5, CATTGCTGTGAAGGAGAAGTATGCCAAGTACCTGCCCCACAGTGC

HCN1, GTGCCACAGCGTGTCACCTTGTTCAGACAGATGTCCTCGGGAGCC

GAPDH, GCAGTGGCAAAGTGGAGATTG GCCATCAACGACCCCTTCATTG

LhblB2, ACTCAAGTTATCCTCATGGGAGCTGTTGMGGCTACAGAGTCGCC

[0104] (2)非導電性スぺーサ一の作製

90 m厚で両面に紫外線硬化性榭脂を含む接着剤層 (接着層は剥離シートで力バーした)を有する PEN製のシートを、びく型により型抜きし、図 9に示す非導電性スぺーサ一を作製した。

[0105] (3)対向電極の作製 ITOガラスを所定の寸法に切断して、対向電極を作製した。

[0106] (4)カバーパーツの作製

射出成形により、ポリカーボネート製カバーパーツを作製した。図 10に、カバーパーッの概略図を示す。カバーパーツには、対向電極をはめ込むために、くぼませた部分 (対向電極はめ込み部）、対向電極を通してキヤビティ内を観察するための空孔部 (観察窓）を設け、更に、導電性部材 (銅製部材に銀メツキを施した)をはめ込んだ

[0107] (5)生体分子の相互作用試験装置の組み立て

非導電性スぺーサ一の片側の剥離シートを剥がし、非導電性スぺーサ一の空孔内に、生体分子が固定ィ匕されたスポットおよびアレイパーツに設けられた 2つの送液用の貫通孔が収まり、かつ、アレイパーツ 2つの導通用貫通孔と、非導電性スぺーサーに設けられた 2つの貫通孔がそれぞれ一致するように、アレイパーツと非伝導性スぺ一サーを貼り付けた。カバーパーツの対向電極はめ込み部に対向電極をはめ込んだ。非導電性スぺーサ一の他方の剥離シートを剥がして、カバーパーツと非導電性スぺーサ一とを貼り付け、図 1に示す装置を作製した。この装置において、対向電極表面と DNAが固定ィ匕された面との間には、 30 mのギャップが形成された。

[0108] (6)誘電ハイブリダィゼーシヨン

マウス脳由来の mRNAをアマシャム社の Cyscribe cDNA post labeling kitにより標識した Cy3標識 cDNAをターゲット DNAとして用いた。このマウス脳由来 Cy3標識 cDNAタ一ゲットを、それぞれ 5 ng/ 1、 0.5 ng/ 1、 0.05 ng/ 1の濃度になるように、 50 mM L -ヒスチジン溶液に調製したものをハイブリダィゼーシヨン溶液として用いた。このハイブリダィゼーシヨン溶液は、 95°Cで 2分間熱変性させ、続いて 4°Cで 2分間急冷した後、ハイブリダィゼーシヨンに用いた。ハイブリダィゼーシヨンは、 1MHz 30Vp-pの高周波交流電場を印加した条件と、印カロしな力た条件で行った。結果を図 11に示す。図 11からわ力るように、電場を印加した場合、電場を印加しな力つた場合と比べて 10 倍以上の検出感度の向上が見られた。

[0109] [実施例 2]

融解温度の測定、 SNPの検出実施例 1で作製したマイクロアレイに、 PM (完全相補鎖の 20mer;配列 GGACATGG AGTTCCGCGACC)、 MM (PMに対して中央の 1塩基が異なっている 20mer;配列 GG ACATGGAGATCCGCGACC)の DNAプローブをスタンプおよび固定処理を行った。ターゲット DNAとして、 5'末端に Cy3標識された PMに対して相補鎖の 21mer (配列； G GTCGCGGAACTCCATGTCC)を用いた。

ハイブリダィゼーシヨン溶液は、 0.5 μ Μターゲット DNA, 50mMヒスチジンを用いた

1MHz, 30Vp-p (lMV/m)の交流電場を印加しながら、室温で 10分間ハイブリダィゼーシヨンを行った後、室温にて、洗浄液 2xSSC/0.1% SDSを、マイクロアレイに設けた送液口から注入し、 3回洗浄を行った。キヤビティ内に洗浄液が入っている状態で、蛍光顕微鏡下で室温力 68°Cまでキヤビティ内の溶液を加熱しながら、カバーパーッに設けた観察窓から、対向電極を通してリアルタイムでノヽイブリツドシグナルを検出し、 DNAハイブリッドの融解曲線を求めた。融解曲線を、図 12に示す。融解温度とは、二本鎖 DNAが 50%解離している温度を指す。図 12に示す融解曲線求めた PMの融解温度は約 61°Cであり、 MMの融解温度は約 59°Cであり、 PMと MMとの間で、融解温度に約 2°Cの差があった。この融解温度の違いを利用すれば、例えば一塩基多型などの変異を検出することができる。

第二の餱様

[実施例 3]

印加電圧の周波数と核酸濃縮との関係

表面に金をコートした DNAマイクロアレイ基板に、核酸溶液が入るように、両面接着性フィルムの中央をカットしたものを基板表面に貼付し、その上に ITO電極を電極面が基板と対向するように、貼り付けた。溶液が入る部分は、チャンバ一となるように作製してあり、接着性フィルムの一部力も溶液が注入できるようになつている。装置の概略図を図 14に示す。図 14に示す装置のチャンバ一に充填する核酸溶液として、 0 . Cy3標識オリゴ DNA (45mer)、 40 mM Tris— HC1 (pH 8. 3)、4 mM EDTA、400 mM NaClを用いた。この核酸溶液を上記のチャンバ一内に充填し、基板表面と ITO電極を交流電圧発生装置のそれぞれの極の端子と接続し、 3Vp— pの電圧で、サイン波の交流電圧を 10Hzから、 0. 01Hzまで周波数を変えながら、印加した。図 15のグラフで、矢印の位置が、それぞれの周波数を印力！]、または周波数を変えたポイントである。グラフのカーブは、共焦点レーザ蛍光顕微鏡により、アレイ表面近傍の核酸分子の量を蛍光標識の蛍光強度として測定したものである。蛍光強度が強いほど、アレイ表面近傍に核酸分子が濃縮されたことを意味する。本条件下では、特に、周波数 0. 1 Hz、 0. 01 Hzの場合に、印加電圧の周期に合わせた蛍光強度の増加、即ち、核酸の濃縮が観察された。

[0111] [実施例 4]

印加電圧の波形と核酸濃縮との関係

次に実施例 3と同様の装置を用いて、印加電圧の波形パターンをサイン波および矩形波にして、電圧のカーブと核酸濃縮との関係を調べた。実施例 3と同様に、核酸溶液として、 0. 1 /z M Cy3標識オリゴ DNA (45mer)、 40 mM Tris— HC1 (p H 8. 3)、4 mM EDTA、 400 mM NaClを用いた。印加電圧は、 3Vp— pとし、サイン波および矩形波で交流電圧を印加した。図 16に結果を示す。図 16に示すように、どちらの波形でも、電圧波形に応じた蛍光強度の増加が観察された。これにより、電圧印加により基板表面近傍に核酸が効率的に濃縮でき、また、波形の種類によらず、基板表面が負電荷を帯びたときに、核酸が基板表面近傍に集まり、濃縮されることが判明した。

[0112] [実施例 5]

パルス直流電圧による核酸の濃縮

次に実施例 3と同様の装置を用いて、アレイ表面が負電荷を帯びるように、パルス直流電圧を印加した。核酸溶液は、実施例 3と同様のものを用いた。—2Vの電圧を 0. 1Hzの周期で、 1秒間ずつ印加した。図 17に結果を示す。図 17に示すように、電圧の周期に合わせて蛍光強度の増加が見られた。これにより、パルス直流電圧の印加により、電圧の周期に合わせて核酸が濃縮されることが確認された。また、この結果によっても、負電荷をアレイ表面に印加することにより、ターゲット核酸が濃縮されることが示された。さらに、 2Vの電圧を 0. lHz (ls印加）、 1Ηζ (0. Is 印カロ）、 10 Hz (0. 01s 印カロ）の周期で印カロして、核酸濃縮の様子を観察した。その結果、図 1 8に示すように、いずれの場合にも、電圧の周期に合わせて蛍光強度が増加した（図 18中、矢印の位置は電圧印加開始点である）。これにより、電圧印加によって負に帯電した基板側へ核酸が移動して基板表面近傍に核酸が濃縮されることが確認された。また、周波数 0. 1 Hzの場合に最も蛍光強度が強ぐ周波数が高くなるにつれ、蛍光強度は低くなつた。これにより、本条件下では、周波数 0. 1Hzの場合に、核酸濃縮効果が最も顕著に得られることがわかる。

[実施例 6]

パルス直流電圧印加によるハイブリダィゼーシヨンの促進

実施例 3で用いた DNAマイクロアレイ基板に、 2種のプローブ DNA(GAPDH、 be ta-actin)溶液を等濃度でそれぞれ 10点ずつスタンプし、スタンプ後処理として基板を 600mj/cm²で UV照射し、 MQWで 5分間 2回洗浄した後乾燥させた。プロ一ブ DNAは、 5 '側にアレイ用リンカ一 (日清紡績 (株)）修飾を施したものを使用した。以下、 GAPDH由来のプローブ DNAをスタンプしたスポットを、 GAPDHスポット、 b eta— actin由来のプローブ DNAをスタンプしたスポットを、 beta— actinスポットと呼ターゲット DNA溶液として、 0. 01 μ Μの濃度の 5，末端 Cy 3蛍光標識オリゴ D NA(GAPDHと相補的な配列；溶液は、 40mM Tris HCl (pH 8. 3)、4 mM EDTA、400 mM NaCl)を用いた。実施例 5と同様の装置、同様の電圧印加条件にて、ハイブリダィゼーシヨンを行った。比較として、電圧を印加しない条件でもハイブリダィゼーシヨンを行った。共焦点レーザ蛍光顕微鏡により、ハイブリダィゼーション反応の過程でのスポット上の蛍光強度の変化をリアルタイムに計測した結果を、図 19に示す。ターゲット DNAと相補的な配列を有するプローブ DNAを含む GAPDH スポットは、電圧を印加した場合、非印加の場合に比べ、蛍光強度が急激に増加し、ノ、イブリダィゼーシヨン反応の速度力 20倍以上に促進された。それに対して、ターゲット DNAと相補的な配列を有するプローブ DNAを含まない beta— actinスポットでは、経時的な蛍光強度の増加は観察されな力つた。これは、 beta— actingポットでは、電圧を印カロしても非特異的な吸着が起こらなかったことを示している。 10分間ノヽイブリダイゼーシヨン反応を行った後、 2xSSC + 0. 1% Tween20、 lxSSC、 0. 2xSSCで順次洗浄を行い、その後、マイクロアレイスキャナーで画像を取得した（図 20)。比較のために、 16時間電圧を印加せずにハイブリダィゼーシヨンを行い、同様にスキャナーで画像を取得した。その結果、 10分間反応させた場合、電圧を印加した場合には、電圧を印加しなカゝつた場合と比べて、約 13倍蛍光強度が増加した。これは、電圧印加によりハイブリダィゼーシヨン反応が高感度化されたことを示す。さらに、電圧印加による 10分間の反応後、電圧を印加せずに 16時間反応させた場合と比べても、約 6倍蛍光強度が増加した。このように、本発明の方法により、ハイブリダィゼーシヨン反応の高速ィヒおよび高感度化が達成された。

実施例 6において使用した 2種のプローブ DNAの配列を以下に示す。

[0114] [表 1]

[0115] [実施例 7]

低周波交流電圧印加によるタンパク分子の濃縮

実施例 3と同様の装置を用いて、低周波交流電圧印加によるタンパク分子の濃縮について調べた。タンパク分子溶液として、： L M Cy 3標識ストレプトアビジン、 40 mM Tris-HCl (pH 8. 3)、4mM EDTA、 400mM NaClを用いた。印加電圧は、 3Vp— pとして 0. 1Hzの交流電圧を印加した。結果を図 21に示す。図 21に示すように、生体分子としてタンパク分子を用いた場合にも、電圧波形に応じた蛍光強度の増加を示し、電圧印加によりタンパク分子が基板表面近傍に濃縮されることが確認された。また、本実施例でも、基板側が負に帯電したときに、タンパク分子の移動、濃縮が観察された。

産業上の利用可能性

[0116] 本発明の第一の態様によれば、生体分子の相互作用を促進しつつ、生体分子の相互作用をリアルタイムで試験することができる。更に、本発明によれば、生体分子の融解温度の測定、一塩基多型などの変異の検出を容易かつ迅速に行うことができる。本発明の第二の態様によれば、生体分子の相互作用の高速化、高感度化を達成することができる。

図面の簡単な説明

圆 1]本発明の装置の概略図を示す。

圆 2]共焦点型検出器の光学系の概略図を示す。

圆 3]本発明にお、て使用される基板の一例を示す。

圆 4]基板上の突出スポット部の概略図を示す。

[図 5]略 V字型底面を有する基板の一部の拡大図を示す。

[図 6]粗面化されたスポット用平面の一例 (部分拡大図）を示す。

圆 7]反射光と蛍光とを同時に検出することができる共焦点型蛍光スキャナーの光学系の概略図を示す。

圆 8]実施例 1で作製したアレイパーツの概略図を示す。

圆 9]実施例 1で作製した非導電性スぺーサ一の概略図を示す。

[図 10]実施例で作製したカバーパーツの概略図を示す。

[図 11]実施例 1で得られた結果 (誘電ハイブリダィゼーシヨンおよび非誘電ハイブリダィゼーシヨンのハイブリダィゼーシヨン強度の散布図）を示す。

[図 12]実施例 2で得られた融解曲線を示す。

[図 13]実施例 1で作製したアレイパーツ上の突出スポット部の断面図を示す。

圆 14]実施例 3で使用した装置の概略図を示す。

[図 15]実施例 3で得られた結果 (印加電圧の周波数と核酸濃縮との関係)を示す。

[図 16]実施例 4で得られた結果 (印加電圧の波形と核酸濃縮との関係)を示す。

[図 17]実施例 5で得られた結果を示す。

[図 18]実施例 5で得られた結果を示す。

[図 19]実施例 6で得られた結果を示す。

[図 20]実施例 6で得られたマイクロアレイアレイスキャナーによる画像を示す。

[図 21]実施例 7で得られた結果を示す。

Claims

請求の範囲

[1] 基板上に生体分子が固定化された生体分子マイクロアレイ（1)、および、前記マイクロアレイの生体分子が固定化された面に対向するように設けられた透明電極 (2) (以下、「対向電極」 t 、う）を有する生体分子の相互作用試験装置であって、

前記装置は、前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に、非導電性スぺーサ一（3)を有し、前記マイクロアレイ（1)、前記スぺーサー（3)、および前記対向電極（2 )によってキヤビティ (4)が形成されており、

[2] 前記マイクロアレイ（1)の側から、前記マイクロアレイ（1)上の導電性物質表面（6)および対向電極（2)と外部電源とを接続するための手段を有する、請求項 1に記載の装置。

[3] 前記マイクロアレイ（1)上の導電性物質表面 (6)と少なくとも一部が接触し、かつ、前記対向電極 (2)とは接触しな!ヽ導電性部材 (7)を更に有し、前記基板上の導電性物質表面 (6)は、前記導電性部材 (7)を介して外部電源と接続される、請求項 2に記載の装置。

[4] 前記導電性部材 (7)を構成する導電性物質は、金、ニッケル、白金、銀、チタン、ァルミ-ゥム、ステンレス、銅、導電性酸化物、または導電性ブラスチックである、請求項 3に記載の装置。

[5] 前記マイクロアレイは、前記導電性部材（7)に通じる貫通孔（8)および前記対向電極

(2)に通じる貫通孔（9)を有する、請求項 3または 4に記載の装置。

[6] 前記非導電性スぺーサー（3)は、前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間隔が均一になるように配置される、請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の装置。

[7] 前記マイクロアレイ（1)の生体分子が固定化された面と前記対向電極 (2)の前記マイクロアレイ（1)の生体分子が固定ィ匕された面と対向する表面との距離が、 10〜300 μ mである、請求項 1〜6のいずれ力 1項に記載の装置。

[8] 前記マイクロアレイ上の導電性物質表面を構成する導電性物質が、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチックである請求項 1〜 7の、ずれ力ゝ 1項に記載の装置。

[9] 前記基板は、基板全体が導電性物質からなるか、または、基板表面に導電性物質被覆層を有する、請求項 1〜8のいずれ力 1項に記載の装置。

[10] 前記導電性被覆層を有する基板が、ガラス、石英、金属、シリコン、またはプラスチッタカなる請求項 9に記載の装置。

[11] 前記非導電性スぺーサー（3)は、その両面に接着剤層を有する、請求項 1〜10のいずれか 1項に記載の装置。

[12] 前記接着剤は、光硬化性榭脂を含む、請求項 11に記載の装置。

[13] 温度制御手段を更に有する、請求項 1〜12のいずれか 1項に記載の装置。

少なくとも前記突出スポット部は導電性物質表面を有し、

前記スポット用平面の導電性物質表面に生体分子が固定化されており、かつ前記基板は、前記基板上の突出スポット部以外の表面に、前記突出スポット部の導電性物質表面と通電可能な端子を有する、請求項 1〜13のいずれか 1項に記載の装置。

[15] 前記基板上の突出スポット部以外の表面は、導電性物質被覆層を有し、前記端子は

、前記導電性物質被覆層に含まれるか、または、前記導電性物質被覆層と通電可能である、請求項 14に記載の装置。

[16] 前記基板上の突出スポット部以外の表面は、導電性物質被覆層を有し、前記導電性物質被覆層と突出スポット部の導電性物質表面とは、一体の導電性物質被覆層として設けられている、請求項 14または 15に記載の装置。

[17] 前記基板が、少なくとも、前記突出スポット部周辺の基板表面、突出スポット部側面、およびスポット用平面が、導電性物質力もなる基板である、請求項 14〜16のいずれ力 1項に記載の装置。

[18] 前記突出スポット部周辺の基板表面が、略 V字型底面を形成する、請求項 17に記載の装置。

[19] 前記基板が、隣り合う突出スポット部が、突出スポット部側面によって隣接しており、かつ、少なくとも、前記突出スポット部側面およびスポット用平面力導電性物質からなる基板である、請求項 14〜16のいずれか 1項に記載の装置。

[20] 前記突出スポット部の高さ力 10〜500 μ mである、請求項 14〜19のいずれ力 1項に記載の装置。

[21] 前記突出スポット部頂上のスポット用平面と前記突出スポット部側面とのなす角が、 9

0度以上である、請求項 14〜20の、ずれか 1項に記載の装置。

[22] 前記生体分子固定ィ匕用スポットが粗面化されている、請求項 14〜21のいずれか 1 項に記載の装置。

[23] 前記生体分子は、 DNA、 RNA、 PNA、蛋白、ポリペプチド、糖化合物、脂質、天然低分子、および合成低分子力もなる群力も選ばれる少なくとも一種である、請求項 1 〜22の!、ずれか 1項に記載の装置。

[24] 基板上に生体分子が固定化された生体分子マイクロアレイ（1)と前記マイクロアレイの生体分子が固定化された面に対向するように設けられた透明電極 (2) (以下、「対向電極」という）を有し、前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に、非導電性スぺーサ一（3)を有し、前記マイクロアレイ（1)、前記スぺーサー（3)、および前記対向電極（2)によってキヤビティ (4)が形成されている装置を用いる、生体分子の相互作用試験方法であって、

[25] 基板上に生体分子が固定化された生体分子マイクロアレイ（1)と前記マイクロアレイの生体分子が固定化された面に対向するように設けられた透明電極 (2) (以下、「対向電極」という）を有し、前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に、非導電性スぺーサ一（3)を有し、前記マイクロアレイ（1)、前記スぺーサー（3)、および前記対向電極（2)によってキヤビティ (4)が形成されている装置を用いる、生体分子の相互作用試験方法であって、

[26] 前記溶液を排出した後、または排出しながら、前記キヤビティ内にターゲット生体分子を含む溶液および Zまたはターゲット生体分子を含まない溶液を新たに充填することを含む、請求項 25に記載の方法。

[27] 前記マイクロアレイ（1)の側から、前記マイクロアレイ（1)上の導電性物質表面（6)および対向電極（2)と外部電源とを接続し、前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に電界を印加する、請求項 24〜26のいずれか 1項に記載の方法。

[28] 前記装置が、請求項 1〜23のいずれ力 1項に記載の装置である、請求項 24〜27のいずれか 1項に記載の方法。

[29] 前記マイクロアレイ（1)が有する前記キヤビティに通じる貫通孔（5)を通して、前記キャビティへ溶液を注入し、および Zまたは、前記キヤビティカゝら溶液を排出する、請求項 28に記載の方法。

[30] 前記装置が、請求項 5〜23のいずれ力 1項に記載の装置であり、前記導電性部材（ 7)に通じる貫通孔（8)および対向電極 (2)に通じる貫通孔（9)を通して、前記導電性部材（7)および対向電極（2)と外部電源の端子とを接続する、請求項 24〜27のいずれか 1項に記載の方法。

[31] 前記マイクロアレイ（1)が有する前記キヤビティに通じる貫通孔（5)を通して、前記キャビティへ溶液を注入し、および zまたは、前記キヤビティカゝら溶液を排出する、請求項 30に記載の方法。

[32] 前記マイクロアレイに固定された生体分子および Zまたは前記ターゲット生体分子が蛍光標識されており、かつ、前記マイクロアレイ上の生体分子とターゲット生体分子との相互作用を、蛍光によって検出する、請求項 24〜31のいずれか 1項に記載の方法。

[33] 請求項 14〜23のいずれか 1項に記載の装置を用いる、生体分子の相互作用試験方法であって、

前記マイクロアレイ（1)と対向電極 (2)との間に電界を印加すること、および、前記キヤビティ (4)へ、ターゲット生体分子を含む溶液および Zまたはターゲット生体分子を含まなヽ溶液を送液しながら、前記マイクロアレイ上の生体分子と前記ターゲット生体分子との相互作用を前記対向電極を通して共焦点型検出器によって検出することを含む、前記方法。

[34] 請求項 14〜23のいずれか 1項に記載の装置を用いる、生体分子の相互作用試験方法であって、

[35] 前記溶液を排出した後、または排出しながら、前記キヤビティ内にターゲット生体分子を含む溶液および Zまたはターゲット生体分子を含まない溶液を新たに充填することを含む、請求項 34に記載の方法。

[36] 前記マイクロアレイ上の生体分子および Zまたは前記ターゲット生体分子が蛍光標識されて!/、る、請求項 33〜35の、ずれか 1項に記載の方法。

[37] 前記共焦点型検出器によって、マイクロアレイ表面の突出スポット部とそれ以外の部分の高さおよび Zまたは形状の差による反射光強度の相違から、マイクロアレイ上の前記突出スポット部を反射像として検出する、請求項 33〜36のいずれか 1項に記載の方法。

[38] 前記反射像として検出された突出スポット部からの蛍光を検出することによって、生体分子の相互作用を検出する、請求項 37に記載の方法。

[39] 前記マイクロアレイ（1)が有する前記キヤビティに通じる貫通孔（5)を通して、前記キャビティへ溶液を導入し、および Zまたは、前記キヤビティカゝら溶液を排出する、請求項 33〜38の!、ずれ力 1項に記載の方法。

[40] 前記導電性部材（7)に通じる貫通孔（8)および対向電極 (2)に通じる貫通孔（9)を通して、前記導電性部材 (7)および対向電極 (2)と外部電源の端子とを接続する、請求項 33〜39の!、ずれ力 1項に記載の方法。

[41] 前記マイクロアレイ（1)と対向電極（2)との間に印加される電界力 0. 01〜： LOMV

Zmである、請求項 24〜40のいずれ力 1項に記載の方法。

[42] 前記ターゲット生体分子を含む溶液力フエ-ルァラニン、ヒスチジン、カルノシン、およびアルギニン力もなる群力選ばれる少なくとも 1つのバッファー物質を含む、請求項 24〜41のいずれ力 1項に記載の方法。

[43] 請求項 24〜42のいずれか 1項に記載の方法を用いることを特徴とする、生体分子の融解温度測定方法。

[44] 請求項 24〜42のいずれか 1項に記載の方法を用いることを特徴とする、核酸の配列検知方法。

[45] 基板表面に生体分子が固定化されたスポットを 1つ以上有する生体分子マイクロアレィと、前記基板表面と対向する電極 (以下、「対向電極」という）との間にターゲット生体分子を含む溶液を配置し、前記基板表面に固定化された生体分子とターゲット生体分子とを相互作用させる方法であって、

[47] 前記電圧が 0. 1〜4Vである、請求項 45または 46に記載の方法。

[48] 前記溶液は、カチオンを含む、請求項 45〜47の、ずれか 1項に記載の方法。

[49] 前記カチオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、マグネシウムィォン、カルシウムイオン、およびアルミニウムイオンからなる群力も選ばれる少なくとも一種である、請求項 48に記載の方法。

[50] 前記溶液中のカチオン濃度は、 1〜： LOOOmMの範囲である、請求項 48または 49に記載の方法。

[51] 前記電圧は、パルス直流電圧である、請求項 45〜50のいずれ力 1項に記載の方法

[52] 少なくとも前記基板表面が負に帯電するように電圧を印加することを含む、請求項 45

〜51のいずれ力 1項に記載の方法。

[53] 前記基板は、基板全体が導電性物質からなるか、または、基板表面に導電性物質被覆層を有する、請求項 45〜52のいずれ力 1項に記載の方法。

[54] 前記導電性物質は、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチックである、請求項 45〜53のいずれ力 1項に記載の方法。

[55] 前記対向電極は、電極全体が、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチックカゝらなるカゝ、または、前記基板の導電性物質表面と対向する表面に、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニゥム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチック力もなる導電性物質被覆層を有する、請求項 45〜54のいずれ力 1項に記載の方法。

[56] 前記対向電極は、透明電極である、請求項 45〜55のいずれ力 1項に記載の方法。

[57] 前記基板と対向電極との間に非導電性スぺーサーを配置し、前記基板、対向電極、および非導電性スぺーサ一によつて囲まれた空間に、前記溶液を充填する、請求項

45〜56の!、ずれ力 1項に記載の方法。

[58] 前記導電性物質表面と対向電極との間に電圧が印加されない間、前記溶液を攪拌することを含む、請求項 57に記載の方法。

[59] 前記生体分子は、 DNA、 RNA、 PNA、蛋白、ポリペプチド、糖化合物、脂質、天然低分子、および合成低分子力もなる群力も選ばれる少なくとも一種である、請求項 45

〜58の!ヽずれか 1項に記載の方法。